CN107385030A - 分子标签、接头及确定含有低频突变核酸序列的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供分子标签及其组合物、含有分子标签的接头及其组合物以及一种确定待测样本目标区域含有低频突变核酸序列的方法。其中所述分子标签上最多含有2个连续相同的碱基。本发明所提供的分子标签没有连续多个相同的碱基，避免由于多个连续碱基出现导致测序质量差的情况。并且分子标签内部各种标签的比例一致，避免出现优势标签的情况，能够最大程度发挥分子标签的效能。

Description

分子标签、接头及确定含有低频突变核酸序列的方法

技术领域

本发明涉及核酸测序技术领域，具体的，本发明涉及分子标签及其组合物、含有分子标签的接头及其组合物、确定待测样本目标区域含有低频突变核酸序列的方法。

背景技术

高通量测序是目前应用范围最广的测序技术，然而其在测序中仍不可避免的存在一些测序错误，发生率为0.1％～0.2％或者更高，并且PCR过程使用的DNA聚合酶也有错误率，错误率为10^-7～10^-5，特别是随着PCR循环数的增加错误率也有所增加。

为了检测低于0.1％的碱基突变(低频突变)或测序错误，学者发明了分子标签的方法，分子标签是在PCR之前给每个测序模板的一端或者两端加入一段特殊的序列。分子标签的每个位置可以是A、T、C、G 4种碱基中的1种，分子标签的长度根据实际的实验需要选择，根据分子标签的长度及4种碱基的变化，分子标签可以有4的n次方种类。如果原始模板的分子标签是完全随机分布的，那分子标签的多样性能够保证每个原始模板在原始文库中连上分子标签后是独一无二的，在之后的PCR过程中，每个原始模板会作为初始模板形成一簇“分子簇”，如果没有测序错误和PCR错误，这各簇中的分子序列都是初始模板正链和负链的无错误“复制链”。

理论上，分子标签的每个位置的碱基序列是完全随机分布的。然而，在引物合成过程中，合成某一碱基时，会加入等量的A、T、C、G四种碱基，由于这四种碱基合成所需的能量或者合成效率不一样，使得每个位置上A、T、C、G四种碱基的出现频率并不是完全相等的。这样会造成部分的碱基处于优势地位，导致了分子标签中并不是每个位置都遵循A、T、C、G四种碱基随机分布的概率，并且会出现优势分子序列，甚至会出现多个连续一样的碱基，例如8个A、8个G等，从而导致实际上得到的随机分子标签种类并没有理论上那么多。

多个连续一样的碱基不仅会增加测序错误的可能性，也会增加优势分子序列的比例。由于比例不随机，使得某几种甚至更多的分子连上了同一种标签序列。当这些连上同一种标签序列的分子属于同源性高或者序列十分相似的情况下，技术人员无法区别判断属于测序错误和低频突变的分子。更进一步的，当低频突变和正常丰度的序列连上一样的分子克隆时会导致将低频突变当成测序错误或PCR错误从而漏检。因此分子标签的不随机性会降低其效用，甚至限制了其应用。

发明内容

本发明的目的在于，通过优化分子标签的设计，提供一种碱基完全随机分布的分子标签，及每种分子标签的比例均为0.95～1.05:1的分子标签组合物，利用该分子标签及其组合物合成的接头进行文库构建并对其进行测序，从而有效地区分测序错误和低频突变。

本发明一方面提供一种分子标签，所述分子标签上最多含有2个连续相同的碱基。

本发明另一方面还提供一种分子标签组合物，含有上述分子标签，且每种分子标签的比例为0.95～1.05:1。

本发明另一方面还提供一种接头，所述接头含有上述分子标签，且所述分子标签位于所述接头除突出端“T”和非突出端末端20bp碱基以外的任意位置。

本发明另一方面还提供一种接头组合物，含有上述接头，且每种接头的比例为0.95～1.05:1。

本发明另一方面还提供一种确定待测样本目标区域含有低频突变核酸序列的方法，包括如下步骤：

S1、利用如上所述的接头，对待测样本目标区域核酸进行加接头反应，对加接头后的待测样本目标区域核酸进行PCR扩增，获得扩增产物，所述扩增产物构成所述待测样本的目标区域核酸测序文库；

S2、对所述待测样本的目标区域核酸测序文库进行测序，获得测序后核酸序列；

S3、将所述测序后核酸序列按照所述接头中含有的分子标签进行分类，将携带有相同分子标签的所述测序后的核酸序列归类为同一核酸序列集；

S4、将所述核酸序列集内的测序后核酸序列进行相互比较，统计所述核酸序列集中每个碱基位置的碱基种类及其频率；

S5、根据所述核酸序列集中每个碱基位置的碱基种类及其频率，通过数据分析，得到所述核酸序列集中含有正确的碱基排列位置的核酸序列；

S6、将所述含有正确的碱基排列位置的核酸序列与所述核酸序列集中的其余的核酸序列或平行的核酸序列集中的核酸序列进行比较，得到含有低频突变的核酸序列。

本发明所提供的分子标签没有连续多个相同的碱基，避免由于多个连续碱基出现导致测序质量差的情况。并且分子标签内部各种标签的比例一致，避免出现优势标签的情况，能够最大程度发挥分子标签的效能。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中

图1为本发明实施例中完全互补双链接头中分子标签结构示意图。

图2为本发明实施例中一端互补一端开放的Y型接头中分子标签位于互补端的结构示意图。

图3为本发明实施例中一端互补一端开放的Y型接头中分子标签位于开放端的结构示意图。

图4为本发明实施例中分子标签不位于接头上，但可通过PCR引入接头的Y型结构的示意图。

图5为本发明实施例中确定待测样本目标区域含有低频突变核酸序列的方法流程图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

本发明提供一种分子标签，所述分子标签上最多含有2个连续相同的碱基。

根据本发明的实施例，所述分子标签为单链或反向互补的双链。

根据本发明的实施例，所述分子标签的碱基数目为6～24bp。

本发明还提供一种分子标签组合物，含有如上所述的分子标签，且每种分子标签的比例为0.95～1.05:1。

根据本发明的实施例，所述比例包括摩尔比、分子质量比、分子数比的至少之一。

根据本发明的实施例，所述分子标签的种类数包括4ⁿ，n等于6～24。例如根据实验需要，可以设计出4096、16384、65536、262144、16777216、268435456种，甚至更多的种类。

根据本发明的实施例，当分子标签是单链的结构，则将分子标签按照摩尔数0.95～1.05:1的比例，或分子质量0.95～1.05:1的比例，或分子数0.95～1.05:1的比例混合。优选的，当分子标签是单链的结构，则将分子标签按照摩尔数1:1的比例，或分子质量1:1的比例，或分子数1:1的比例混合。

当分子标签是双链的结构，先将单链的分子标签按照摩尔数0.95～1.05:1的比例，或分子质量0.95～1.05:1的比例，或分子数0.95～1.05:1的比例与对应的反向互补的序列进行退火互补形成双链结构的分子标签，再将这些双链分子标签按照0.95～1.05:1的比例混合。优选的，当分子标签是双链的结构，先将单链的分子标签按照摩尔数1:1的比例，或分子质量1:1的比例，或分子数1:1的比例与对应的反向互补的序列进行退火互补形成双链结构的分子标签，再将这些双链分子标签按照1:1的比例混合。

本发明还提供所述分子标签组合物，在纠正测序错误和PCR错误、检测低频突变、去冗余以及计算特定分子或携带有特定分子的细胞数量中的应用。

本发明另一方面提供一种接头，所述接头含有如上所述的分子标签，且所述分子标签位于所述接头除突出端“T”和非突出端末端20bp碱基以外的任意位置。

根据本发明的实施例，如图1所示，当所述接头为完全互补的双链结构时，所述分子标签“NNN…NNN”可位于接头完全互补双链中的3’端、5’端或中间，除突出端“T”和非突出端末端方框以外的任意位置，所述方框内为20bp碱基长度。

根据本发明的实施例，如图2和3所示，当所述接头为一端互补一端开放的Y型结构时，所述分子标签“NNN…NNN”可位于接头Y型结构互补的一端、开放的一端或中间，除突出端“T”和非突出端末端20bp碱基以外的任意位置。

根据本发明的实施例，如图4所示，所述分子标签还可以不位于接头上，但可通过PCR引入接头的Y型结构中。

进一步的，根据本发明的实施例，所述分子标签还可以位于接头的2个或2个以上的位置。

根据本发明的实施例，所述接头还含有文库标签，所述文库标签与所述分子标签的3’端或5’端相连。

本领域技术人员可以理解的，所述文库标签用于区分不同样品文库，能够在进行PCR扩增后，将多个样本的PCR产物进行混合测序，进而基于文库标签的不同，对各序列的样本来源进行区分。

根据本发明的实施例，所述接头还含有识别性特征序列，所述识别性特征序列为4个不重复的碱基，例如：“ATCG”或“TGAC”，所述识别性特征序列与所述分子标签的3’端或5’端相连。

本发明另一方面还提供一种接头组合物，所述接头组合物含有如上所述的接头，且每种接头的比例为0.95～1.05:1。

根据本发明的一些具体示例，所述接头的种类包括：

如图1所示，含有分子标签的完全互补的双链接头；

如图2和3所示，含有分子标签的一端互补一端开放的Y型接头；

以及如图4所示，分子标签不位于接头上，但可通过PCR引入接头的Y型结构中。

根据本发明的实施例，还包括分子标签位于2个或2个以上的位置的接头。

根据本发明的实施例，所述接头的比例为各个种类的接头的摩尔比、分子质量比、分子数比的至少之一。

本发明再一方面还提供一种确定待测样本目标区域含有低频突变核酸序列的方法，如图5所示，包括如下步骤：

S1、利用如上所述的接头，对待测样本目标区域核酸进行加接头反应，对加接头后的待测样本目标区域核酸进行PCR扩增，获得扩增产物，所述扩增产物构成所述待测样本的目标区域核酸测序文库；

S2、对所述待测样本的目标区域核酸测序文库进行测序，获得测序后核酸序列；

S3、将所述测序后核酸序列按照所述接头中含有的分子标签进行分类，将携带有相同分子标签的所述测序后的核酸序列归类为同一核酸序列集；

S4、将所述核酸序列集内的测序后核酸序列进行相互比较，统计所述核酸序列集中每个碱基位置的碱基种类及其频率；

S5、根据所述核酸序列集中每个碱基位置的碱基种类及其频率，通过数据分析，得到所述核酸序列集中含有正确的碱基排列位置的核酸序列；

S6、将所述含有正确的碱基排列位置的核酸序列与所述核酸序列集中的其余的核酸序列或平行的核酸序列集中的核酸序列进行比较，得到含有低频突变的核酸序列。

根据本发明的实施例，所述步骤S6还包括过滤由PCR和测序带入的测序错误。

所述数据分析可采用本领域技术人员所熟知的统计学分析方法进行分析，例如Z检验、T检验、游程检验等。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面示例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。除另有交待，以下实施例中涉及的未特别交待的试剂、序列(接头、标签和引物)、软件及仪器，都是常规市售产品或者开源的。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

实施例一 检测低频突变基因

1、设计分子标签及含有该分子标签的接头

按照每个位置4种碱基随机分布的可能性设计分子标签，分子标签上最多含有2个连续相同的碱基。按照实验需要，设计不同种类的分子标签M种。分子标签序列的种类数包括4ⁿ，n等于6～24。如表1所示，16种分子标签：

表1

设计含有上述任意一种分子标签的接头，其中分子标签可位于接头除突出端“T”和非突出端末端20bp碱基以外的任意位置。如图1、图2、图3、图4所示，NNN...NNN代表分子标签，接头的种类可以是，完全互补的双链结构、一端互补一端开放的Y型结构，或者可通过PCR将分子标签引入接头的Y型结构。分子标签可以仅位于接头的任意一端或中间，也可以分布于2个或者2个以上的位置，N的个数代表分子标签的碱基数目，需要的分子标签种类多就增加该位置的碱基个数，比如采用8bp、12bp、16bp、24bp或者更多的碱基个数。如表2所示，16种含有不同分子标签的接头：

表2

当接头如图1和图2及其类似的结构，需要同时设计含有分子标签反向互补的结构，如需要同时设计表2中的F向序列和R向序列，图3、图4及其类似的结构则只需要设计单链分子标签，如表2中的F向序列而不需要设计分子标签反向互补序列。

根据实验的需要，还可以在分子标签的3’或5’端添加识别性特征序列和/或文库标签。例如，使用illumina平台测序时，可以将识别不同样本的index序列加入其中。

2、合成含有分子标签的接头

根据所设计的接头序列，将设计出来的分子标签或及其对应的反向互补序列及其3'端、5'端的序列进行合成，得到含有分子标签的接头。本领域人员可以理解的，合成方法可采用本领域熟知的方法，也可委托给引物合成公司合成。

3、将得到的接头按比例混合，得到一组接头组合物

将合成的含有分子标签的接头按照不同的种类的摩尔数1:1的比例进行混合。

例如当如图1、图2、图3及其类似的结构的接头种类时，每种种类的接头按摩尔数1:1的比例混合。

当如图5及其类似的结构，将分子标签直接与Y型接头按照摩尔数1:1的比例混合，得到一组接头组合物。

4、提取样本DNA

抽取病人外周EDTA抗凝血10ml，并新鲜离心分离血浆，按照本领域技术人员熟知的方法提取血浆DNA。

5、DNA末端修复

将提取得到的DNA溶液和末端修复的试剂混合液混合，按照本领域技术人员熟知的末端修复的方法进行反应，反应结束后进行分离纯化。

5.1按如下反应体系在1.5mlEP管中配制：

室温混匀，轻微离心后，反应体系置于PCR仪中，20℃反应30分钟，反应结束后，使用AMpure XP磁珠纯化。

5.2在100ul体系反应产物中加入150ul磁珠，进行AMpure XP磁珠纯化后，反复用500ul 75％乙醇洗涤两次，弃上清液。37℃烘干，至磁珠干燥。加入34.5ul水，混匀磁珠，待澄清，吸取34ul上清液。

6、末端加“A”

将末端修复的DNA溶液和加“A”的试剂混合液混合，按照本领域技术人员熟知的末端加“A”的方法进行反应，反应结束后进行分离纯化。

6.1将5中得到的溶液按照以下体系配制反应液：

试剂	体积
		末端修复DNA	34
10×蓝色缓冲液	5
		dATP(1mM)	10
Klenow 3'-5'exo-	1
		总体积/ul	50

室温混匀，轻微离心后，反应体系置于PCR仪中，37℃反应30分钟，反应结束后，使用AMpure XP磁珠纯化。

6.2采用如5.2所示的方法进行磁珠纯化，其区别在于50ul体系反应产物中加入75ul磁珠。

7、加接头反应

将加“A”后的DNA溶液和步骤S3中得到的含有分子标签的接头、连接反应试剂混合液混合，按照本领域技术人员熟知的加接头的方法进行反应，反应结束后进行分离纯化。

7.1将6中得到的溶液按照以下体系配制反应液：

试剂	体积ul
		DNA	45
2×快速连接酶缓冲液	50
		T4DNA连接酶	4
3中设计的接头(20pmol/ul)	1
		总体积/ul	100

室温混匀，轻微离心后，反应体系置于PCR仪中，20℃反应15分钟，反应结束后，使用AMpure XP磁珠纯化。

7.2采用如5.2所示的方法进行磁珠纯化，其区别在于50ul体系反应产物中加入75ul磁珠。

8、PCR富集，构建测序文库

将加接头后的DNA和PCR反应试剂混合液混均，按照本领域技术人员熟知的方法进行PCR反应，反应结束后进行分离纯化，到此文库构建结束，对文库进行QC检测，检测合格后等待测序。

8.1在1个新的PCR管中按照以下体系配制反应液：

室温混匀，轻微离心后，反应体系置于PCR仪中，按照以下条件进行反应：

反应结束后，使用AMpure XP磁珠纯化。

8.2采用如5.2所示的方法进行磁珠纯化，其区别在于50ul体系反应产物中加入50ul磁珠。文库构建结束。

9、文库质检

对文库进行QPCR和Agilent 2100检测，质检合格文库安排上机。

10、对文库进行DNA测序

可使用Hiseq2000、Hiseq2500、Proton、Miseq、NS500等二代测序仪对文库进行测序。

11、分析测序结果

将测序后得到的DNA的测序结果进行分析，按照分子标签将得到的DNA序列进行分类，将携带有相同的分子标签的序列作为1个“分子簇”，这个分子簇是初始1个DNA分子通过PCR形成的1类DNA，即原始DNA分子的正链和负链的“复制链”。

统计“分子簇”内部每个碱基位置的碱基种类及其出现的频数。

根据数据分析，找出由于PCR和测序带入的错误并纠正。

从而得到原始DNA的正确序列，并通过分子簇内部和平行比较，找出真正的突变序列。

上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明技术方案所做出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种分子标签，其特征在于，所述分子标签上最多含有2个连续相同的碱基。

2.根据权利要求1所述的分子标签，其特征在于，所述分子标签为单链或反向互补的双链。

3.根据权利要求1所述的分子标签，其特征在于，所述分子标签的碱基数目为6～24bp。

4.一种分子标签组合物，其特征在于，含有如权利要求1～3任一项所述的分子标签，且每种分子标签的比例为0.95～1.05:1。

5.根据权利要求4所述的分子标签组合物，其特征在于，所述比例包括摩尔比、分子质量比、分子数比的至少之一。

6.一种接头，其特征在于，所述接头含有如权利要求1～3任一项所述的分子标签，且所述分子标签位于所述接头除突出端“T”和非突出端末端20bp碱基以外的任意位置。

7.如权利要求6所述的接头，其特征在于，所述接头还含有文库标签，所述文库标签与所述分子标签的3’端或5’端相连。

8.如权利要求6所述的接头，其特征在于，所述接头还含有识别性特征序列，所述识别性特征序列为4个不重复的碱基，所述识别性特征序列与所述分子标签的3’端或5’端相连。

9.一种接头组合物，其特征在于，所述接头组合物含有如权利要求6所述的接头，且每种接头的比例为0.95～1.05:1。

10.一种确定待测样本目标区域含有低频突变核酸序列的方法，包括如下步骤：

S1、利用如权利要求6所述的接头，对待测样本目标区域核酸进行加接头反应，对加接头后的待测样本目标区域核酸进行PCR扩增，获得扩增产物，所述扩增产物构成所述待测样本的目标区域核酸测序文库；

S2、对所述待测样本的目标区域核酸测序文库进行测序，获得测序后核酸序列；

S3、将所述测序后核酸序列按照所述接头中含有的分子标签进行分类，将携带有相同分子标签的所述测序后的核酸序列归类为同一核酸序列集；

S4、将所述核酸序列集内的测序后核酸序列进行相互比较，统计所述核酸序列集中每个碱基位置的碱基种类及其频率；

S5、根据所述核酸序列集中每个碱基位置的碱基种类及其频率，通过数据分析，得到所述核酸序列集中含有正确的碱基排列位置的核酸序列；

S6、将所述含有正确的碱基排列位置的核酸序列与所述核酸序列集中的其余的核酸序列或平行的核酸序列集中的核酸序列进行比较，得到含有低频突变的核酸序列。