CN118186063A - 用于对核酸加帽的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

一种用于鉴定核酸模板的方法，其包括(a)提供多种引物‑模板杂交体，其中多种杂交体中的第一杂交体包含与第一引物杂交的第一模板，并且其中多种杂交体中的第二杂交体包含与第二引物杂交的第二模板，第二引物在3’末端具有三元复合物抑制剂部分；(b)将聚合酶和核苷酸递送至所述多种杂交体，由此第一杂交体结合聚合酶和核苷酸以形成稳定的三元复合物，并且由此第二杂交体不结合聚合酶和核苷酸以形成稳定的三元复合物；以及(c)检测稳定的三元复合物以鉴定第一模板。

Description

用于对核酸加帽的方法和组合物
本申请为第201980099054.9号中国专利申请的分案申请，第201980099054.9号中国专利申请的申请日为2019年10月18日。
背景技术
本公开总体上涉及核酸的表征，并且对核酸测序具有特定的适用性。
使用并行处理的许多核酸的集合来执行几种商业核酸测序技术。例如，可将几种不同的核酸排列在表面上，并用测序试剂以多重方式处理。尽管多路复用(multiplexing)在用于处理大的核酸集合的时间和试剂成本方面提供了有利方面，但这种形式的缺点是阻碍了对集合中仅一种核酸或仅一个亚组的核酸的选择性操作。此外，阵列上一些物种的副反应或不完全反应会产生假象或背景信号，这对测序结果的质量或准确性产生不利影响。
许多商业核酸测序平台利用核酸系综(ensemble)。通常通过扩增技术产生所述系综，所述扩增技术产生作为整体被操作和检测的核酸拷贝的局部集合。用于创建系综的示例性技术包括Illumina平台(San Diego,CA)使用的桥式扩增技术、Ion Torrent平台(Thermo Fisher,Waltham MA)使用的乳液聚合酶链式反应技术和Complete Genomics平台(BGI,Shenzhen China)使用的滚环技术。与单分子测序技术相比，系综提供了更高信号幅度的益处，并最大限度地减少了操纵和检测单分子时随机噪声产生的假象(artifact)。
尽管广泛采用了基于系综的测序技术，但所谓的“定相(phasing)”限制了读取长度、总体通量和准确度。定相是系综内各个分子彼此失去同步的现象。定相可以表现为一个或多个引物分子的延伸落在系综中另外的引物分子的延伸后面，或者表现为一个或多个引物分子的延伸走在系综中另外的引物分子的延伸前面。定相是有害的并且是累积的。每个循环仅为0.5％的定相率导致120个循环后累积损失约一半的真实信号。该问题因背景噪声成比例增加而加剧，所述背景噪声是由异相的系综成员产生的虚假信号造成的。因为噪声会淹没信号，信噪比的累积损失导致对读取长度的限制(这进而导致测序通量减少)和误差增加(尤其是对于后面的循环)。
因此，需要例如通过抑制基于系综的测序平台中的定相来在多重测序平台中减少或防止假象的方法。本发明满足了这种需要并且还提供了其它有利方面。
发明内容
本公开提供了用于鉴定模板核酸中的核苷酸的方法。所述方法可包括以下步骤：(a)提供多种引物-模板核酸杂交体，其中所述引物具有可延伸的3’末端；(b)使所述多种引物与以下物质接触：(i)封闭的核苷酸，以产生第一亚组的在3’末端包含封闭的核苷酸的引物-模板核酸杂交体，和(ii)三元复合物抑制剂，以产生第二亚组的包含三元复合物抑制剂的引物-模板核酸杂交体；(c)形成三元复合物，所述三元复合物各自包括聚合酶、第一亚组的引物-模板核酸杂交体和同源核苷酸；以及(d)检测三元复合物，从而鉴定模板核酸中的核苷酸。任选地，封闭的核苷酸可以是可逆终止的核苷酸。
还提供了用于鉴定模板核酸中的核苷酸的方法，其包括以下步骤：(a)提供多种引物-模板核酸杂交体，其中所述引物具有可延伸的3’末端；(b)在第一亚组的引物-模板核酸杂交体的一种或多种引物的3’末端掺入封闭的核苷酸；(c)在第二个亚组的引物-模板核酸杂交体的一种或多种引物的3’末端掺入三元复合物抑制剂；(d)形成三元复合物，所述三元复合物各自包括聚合酶、第一亚组的引物-模板核酸杂交体和同源核苷酸；以及(e)检测三元复合物，从而鉴定模板核酸中的核苷酸。任选地，封闭的核苷酸可以是可逆终止的核苷酸。
本公开提供用于对模板核酸进行测序的方法。所述方法可包括以下步骤：(a)提供多种引物-模板核酸杂交体，其中所述引物具有可延伸的3’末端；(b)使所述多种引物与以下物质接触：(i)可逆终止的核苷酸，以产生第一亚组的在3’末端处包含可逆终止的核苷酸的引物-模板核酸杂交体，和(ii)三元复合物抑制剂，以产生第二亚组的包含三元复合物抑制剂的引物-模板核酸杂交体；(c)形成三元复合物，所述三元复合物各自包括聚合酶、第一亚组的引物-模板核酸杂交体和同源核苷酸；(d)检测三元复合物，从而鉴定模板核酸中的核苷酸；(e)使第一亚组中的引物-模板核酸杂交体3’末端处的可逆终止的核苷酸解封闭；以及(f)重复步骤(b)至(e)以对第一亚组中的模板核酸进行测序。
用于对模板核酸测序的方法可包括以下步骤：(a)提供多种引物-模板核酸杂交体，其中所述引物具有可延伸的3’末端；(b)在第一亚组的引物-模板核酸杂交体的一种或多种引物的3’末端掺入封闭的核苷酸；(c)在第二亚组的引物-模板核酸杂交体的一种或多种引物的3’末端掺入三元复合物抑制剂；(d)形成三元复合物，所述三元复合物各自包括聚合酶、第一亚组的引物-模板核酸杂交体和同源核苷酸；(e)检测三元复合物，从而鉴定模板核酸中的核苷酸；(f)使第一亚组中引物-模板核酸杂交体的3’末端的可逆终止的核苷酸解封闭；以及(g)重复步骤(b)至(f)以对第一亚组中的模板核酸进行测序。
本公开提供了用于鉴定核酸模板的方法。该方法可以包括以下步骤：(a)提供多种引物-模板杂交体，其中多种杂交体中的第一杂交体包括与第一引物杂交的第一模板，并且其中多种杂交体中的第二杂交体包括与第二引物杂交的第二模板，第二引物在3’末端具有三元复合物抑制剂部分；(b)将聚合酶和核苷酸递送至所述多种杂交体，由此第一杂交体结合聚合酶和核苷酸以形成稳定的三元复合物，并且由此第二杂交体不结合聚合酶和核苷酸以形成稳定的三元复合物；以及(c)检测稳定的三元复合物以鉴定第一模板。
用于鉴定核酸模板的方法可以任选地包括以下步骤：(a)提供多种核酸，所述多种核酸包括引物-模板杂交体；(b)用三元复合物抑制剂部分对引物加帽，从而形成加帽的引物-模板杂交体；(c)将引物与所述多种核酸中的第二模板杂交，由此所述多种核酸包括加帽的引物-模板杂交体和第二引物-模板杂交体；(d)将聚合酶和核苷酸递送至所述多种核酸，由此第二引物-模板杂交体结合聚合酶和核苷酸以形成稳定的三元复合物，并且由此加帽的引物-模板杂交体不结合聚合酶和核苷酸以形成稳定的三元复合物；以及(e)检测稳定的三元复合物以鉴定第一模板。该方法可以任选地进一步包括以下步骤：(f)延伸第二引物以在核酸上形成经修饰的第二杂交体；以及(g)对核酸的经修饰的第二杂交体重复(d)、(e)和(f)，从而确定第二模板的至少一部分的序列。
还提供了用于对核酸中两个模板区域进行测序的方法。该方法可以包括以下步骤：(a)沿着核酸的第一模板区域延伸引物，从而确定第一模板的至少一部分的序列；(b)用三元复合物抑制剂部分对延伸的引物加帽，从而在核酸上形成加帽的引物-模板杂交体；(c)将第二引物与核酸的第二模板区域杂交以形成包含加帽的引物-模板杂交体和第二引物-模板杂交体的核酸；以及(d)进行测序过程，其包括：(i)将第二杂交体与聚合酶和核苷酸结合以形成稳定的三元复合物；(ii)检测稳定的三元复合物以鉴定稳定的三元复合物中的核苷酸；(iii)延伸第二引物以在核酸上形成经修饰的第二杂交体；以及(iv)对核酸的经修饰的第二杂交体重复(i)、(ii)和(iii)，从而确定第二模板区域的至少一部分的序列。
在一些配置中，用于对核酸中的两个模板区域进行测序的方法可以包括以下步骤：(a)提供具有第一引物-模板杂交体和第二引物-模板杂交体的核酸，其中第一杂交体包括与第一引物杂交的第一模板区域，并且其中第二杂交体包括与第二引物杂交的第二模板区域，第二引物在3’末端具有三元复合物抑制剂部分；(b)进行测序过程，其包括：(i)将第一杂交体与聚合酶和核苷酸结合以形成稳定的三元复合物；(ii)检测稳定的三元复合物以鉴定稳定的三元复合物中的核苷酸；(iii)延伸第一引物以在核酸上形成经修饰的第一杂交体；以及(iv)对核酸的经修饰的第一杂交体重复(i)、(ii)和(iii)，从而确定第一模板区域的至少一部分的序列；(c)用第二三元复合物抑制剂部分对延伸的第一引物加帽；(d)从第二引物中除去三元复合物抑制剂部分，同时将第二三元复合物抑制剂部分保留在第一引物上；以及(e)延伸第二引物，从而确定第二模板区域的至少一部分的序列。
本公开还提供了包括多种引物-模板核酸杂交体的装置，其中第一亚组的引物-模板核酸杂交体在引物的3’末端具有封闭的核苷酸，并且其中第二亚组的引物-模板核酸杂交体在引物的3’末端具有三元复合物抑制剂。任选地，封闭的核苷酸可以是可逆终止的核苷酸。
附图说明
图1示出了将可逆终止的核苷酸添加到引物-模板杂交体的引物中，然后在杂交体上形成稳定的三元复合物的过程的示意图。
图2示出了用三元复合抑制剂对引物加帽的方法的示意图。
图3A至图3E示出了通过对用于相应区域的两个引物之一加帽来对核酸的两个模板区域进行测序的方法的示意图。
图4A至图4E示出了用于对核酸的两个模板区域进行测序的方法的示意图，所述方法通过对用于相应区域的两种引物加帽，并选择性地从其中一种引物中除去帽来进行。
图5示出了4种不同双脱氧核苷酸的结构，所述双脱氧核苷酸通过与碱基的键联附接于生物素配体。
图6示出了测序运行的结果，所述测序运行使用促进三种不同核酸模板中的每一种上的两个不同区域的测序的核酸加帽来进行。
具体实施方式
本公开提供了用于鉴定存在于引物-模板核酸杂交体中的询问位置(interrogation position)的核苷酸碱基的方法。被询问的位置是紧接模板中与引物3’端末杂交的碱基的5’的碱基。可在用于检测在引物-模板核酸杂交体、聚合酶和询问位置处的碱基的核苷酸同源物之间形成的三元复合物的检查步骤中鉴定存在于探询位置的核苷酸。聚合酶的功能是将同源核苷酸与模板的下一个碱基配对。通过区分三元复合物中存在的核苷酸的类型，并根据Watson Crick碱基配对推断与之杂交的模板碱基，可以确定询问位置处碱基的身份。核苷酸的鉴定可以通过在不向引物中添加核苷酸的情况下检测复合物来实现。因此，可以稳定复合物，使得聚合酶催化不会在检测之前或期间发生。
在特定的实施方案中，引物可以递增地延伸，以便沿着模板移动询问位置。例如，可通过一系列其中使引物延伸单个核苷酸以移至下一个要询问的模板位置并在新的询问位置进行检查的循环来确定模板的序列。不完全的延伸可导致测序错误或测序过程提前终止。例如，当将引物-模板核酸杂交体群体作为一个系综进行测序时，也会出现定相问题。
图1示出了用于将可逆终止的核苷酸添加到引物-模板杂交体的引物中，然后在杂交体上形成稳定的三元复合物的过程的示意图。在第一反应中，将具有可逆终止子部分的核苷酸(用带斜线的圆圈表示)通过聚合酶(用四分之三圆圈表示)掺入引物中。在第二反应中，当标记的核苷酸是模板下一个碱基的同源物时，在用于形成三元复合物的条件下，使可逆终止的杂交体与聚合酶和具有标记物的核苷酸(由多点星形表示)接触。
本公开提供了可用于例如在测序方法中改进核酸中碱基的鉴定的方法和组合物。可通过包括引物修饰方法来实现改进，所述引物修饰方法将不会随后被检测的引物加帽(cap)。例如，可以对引物延伸步骤中未延伸的引物加帽，使得未延伸的引物不会在后续检查步骤中导致错误。对于其中通过检查三元复合物鉴定模板核苷酸的实施方案，通过三元复合物抑制剂提供特别有用的加帽。三元复合物抑制剂可以是当与引物连接时阻止聚合酶和/或同源核苷酸参与在经修饰的引物末端处形成或维持三元复合物的部分。三元复合物抑制剂可存在于引物的末端，例如，作为对一种或多种组分产生空间阻断(否则所述组分会形成三元复合物)的部分，或者作为产生排斥一种或多种组分的电荷的部分。
举例来说，当引物完全延伸使得没有模板位置可用于形成三元复合物时，可导致三元复合物形成的抑制。完全延伸可表现为延伸的引物的3’末端与模板的5’末端退火。在这种构型中，三元复合物不能形成，因为双链延伸产物不含未配对的下一个模板碱基。在替代构型中，完全延伸可表现为引物被延伸，直至进一步延伸被延伸产物环境中的因素阻止。在这种构型中，模板可含有未配对的下一个模板碱基，但由于模板和延伸引物周围的环境，聚合酶无法接近下一个模板碱基(和/或无法接近下一个正确的核苷酸)。例如，可使模板的5’末端这样附接至固相表面，使得延伸引物的3’末端如此接近表面，以致不仅阻止聚合酶进一步延伸，而且还阻止其结合以形成三元复合物。在这两个实例中，完全延伸产生了寡核苷酸部分，其功能为延伸引物上的帽。
在一些构型中，三元复合物抑制剂部分可以是对第二结合配偶体(例如受体，诸如抗体)具有结合亲和力的第一结合配偶体(例如配体)。无论第一结合配偶体是否能够抑制三元复合物的形成，当第二结合配偶体与第一结合配偶体结合时，都可导致抑制。三元复合物抑制剂可以存在于引物的3’末端，例如，作为用核苷酸类似物延伸引物3’末端的结果，所述核苷酸类似物与第一结合配偶体连接。在这种构型中，第一结合配偶体与第二结合配偶体之间的复合物起着延伸引物上的帽的作用。
图2提供了用三元复合抑制剂对引物加帽的方法的示意性实例。在第一步骤中，聚合酶(用四分之三圆圈表示)催化核苷酸类似物加入到引物中。核苷酸类似物包括通过接头附接至核苷酸的配体(以三角形表示)。第一步骤的产物是具有附接至引物的3’末端的配体的引发的模板杂交体。在第二步骤中，受体(以八边形表示，其中配体结合位点以楔形表示)与配体结合以形成具有附接至引物的3’末端的受体的引发的模板杂交体。结合在引物3’末端的受体起着抑制在引物-模板杂交体上形成三元复合物(如存在“X”而非第三步的反应产物所指示的)的帽的作用。
引物加帽可以提供防止特定引物-模板杂交体在检查步骤中产生不想要的背景信号但不需要用于从模板中除去特定引物的程序的有利方面。避免去除引物的程序可以节省原本花费在化学变性剂和/或加热设备上的成本。此外，化学变性剂对环境有害，尽量减少其使用是有益的。
引物加帽对于避免来自假引物末端的信号也是有益的，假引物末端由于希望在样品中保留其它双链核酸结构诸如靶引物-模板杂交体而不容易从样品中除去。因此，样品中的假引物末端可被加帽，然后靶引物可以被添加到样品中。此类假引物末端包括形成发夹或错误引发的(misprimed)引物的引物。靶引物上三元复合物的后续形成和检测将对靶引物具有特异性，并且来自假引物的背景信号将被阻止。
在替代实施方案中，引物修饰方法可用于去除引物，使得其不参与随后的检测步骤。例如，在引物延伸步骤中未延伸的引物可被化学或酶促降解(例如，通过外切核酸酶)，使得未延伸的引物不形成在后续检查步骤中会导致错误的三元复合物。
本文提供了用于鉴定核酸模板的方法。该方法包括(a)提供多种引物-模板杂交体，其中所述多种杂交体中的第一杂交体包含与第一引物杂交的第一模板，并且其中所述多种杂交体中的第二杂交体包含与第二引物杂交的第二模板，第二引物在3’末端包含三元复合物抑制剂部分；(b)将聚合酶和核苷酸递送至所述多种杂交体，由此第一杂交体结合聚合酶和核苷酸以形成稳定的三元复合物，并且由此第二杂交体不结合聚合酶和核苷酸以形成稳定的三元复合物；以及(c)检测稳定的三元复合物以鉴定第一模板。任选地，该方法还包括(d)使所述多种引物与引物延伸试剂接触，由此通过延伸第一引物而不是第二引物来修饰所述多种引物-模板杂交体。任选地，该方法还包括对经修饰的多种引物-模板杂交体重复(b)、(c)和(d)，从而确定第一模板的至少一部分的序列。任选地，步骤(b)、(c)和(d)重复至少10次。任选地，该方法还包括将三元复合物抑制剂部分附接至第一引物。任选地，该方法还包括从第二引物中除去三元复合物抑制剂部分，同时将第二三元复合物抑制剂部分保留在第一引物上。任选地，该方法还包括延伸第二引物，从而确定第二模板的至少一部分的序列。任选地，第一模板和第二模板位于单独的核酸分子上或核酸分子的一条链上。任选地，第一模板和第二模板位于双链核酸分子的不同链上。任选地，在形成第二杂交体之前，第二引物包含三元复合物抑制剂部分。任选地，通过将前体引物与多种模板杂交，然后将三元复合物抑制剂部分附接至前体引物，形成第二杂交体。任选地，第二引物通过延伸前体引物以掺入包含配体的核苷酸，然后将配体与受体结合以形成三元复合物抑制剂部分而形成。任选地，在将三元复合物抑制剂部分附接至前体引物之前，在测序过程中延伸前体引物。
还提供了用于对核酸中的两个模板区域进行测序的方法。该方法包括(a)沿着核酸的第一模板区域延伸引物，从而确定第一模板区域的至少一部分的序列；(b)用三元复合物抑制剂部分对延伸的引物进行加帽，从而在核酸上形成加帽的引物-模板杂交体；(c)将第二引物与核酸的第二模板区域杂交以形成包含加帽的引物-模板杂交体和第二引物模板杂交体的核酸；以及(d)执行测序过程。测序过程包括(i)将第二杂交体与聚合酶和核苷酸结合以形成稳定的三元复合物；(ii)检测稳定的三元复合物以鉴定稳定的三元复合物中的核苷酸；(iii)延伸第二引物以在核酸上形成经修饰的第二杂交体；以及(iv)对核酸的经修饰的第二杂交体重复(i)、(ii)和(iii)，从而确定第二模板区域的至少一部分的序列。任选地，(a)包括(i)将引物与核酸的模板区域杂交以形成第一引物模板杂交体；(ii)将第一杂交体与聚合酶和核苷酸结合以形成稳定的三元复合物；(iii)检测稳定的三元复合物以鉴定稳定的三元复合物中的核苷酸；(iv)沿着核酸的第一模板区域延伸引物，以在核酸上形成经修饰的第一杂交体；以及(v)对核酸的经修饰的第一杂交体重复(ii)、(iii)和(iv)，从而确定第一模板区域的部分的序列。任选地，步骤(a)(v)包括对核酸的经修饰的第一杂交体重复(ii)、(iii)和(iv)至少10次，从而确定第一模板的部分的序列。任选地，步骤(a)包括在通过合成过程的测序或通过连接过程的测序中沿着第一模板区域延伸引物。任选地，步骤(d)(iv)包括对核酸的经修饰的第二杂交体重复(i)、(ii)和(iii)至少10次，从而确定第二模板的部分的序列。任选地，延伸引物的加帽包括掺入包含配体的核苷酸，然后将配体与受体结合以形成三元复合物抑制剂部分。
还提供了用于对核酸中两个模板区域进行测序的方法。该方法包括(a)提供包含第一引物-模板杂交体和第二引物-模板杂交体的核酸，其中第一杂交体包含与第一引物杂交的第一模板区域，并且其中第二杂交体包含与第二引物杂交的第二模板，第二引物在第二引物的3’末端包含三元复合物抑制剂部分；(b)进行测序过程，其包括(i)将第一杂交体与聚合酶和核苷酸结合以形成稳定的三元复合物；(ii)检测稳定的三元复合物以鉴定稳定的三元复合物中的核苷酸；(iii)延伸第一引物以在核酸上形成经修饰的第一杂交体；以及(iv)对核酸的经修饰的第一杂交体重复(i)、(ii)和(iii)，从而确定第一模板区域的至少一部分的序列；(c)用第二三元复合物抑制剂部分对延伸的第一引物进行加帽；(d)从第二引物中除去三元复合物抑制剂部分，同时将第二三元复合物抑制剂部分保留在第一引物上；以及(e)延伸第二引物，从而确定第二模板区域的至少一部分的序列。任选地，步骤(e)包括(i)将第二杂交体与聚合酶和核苷酸结合以形成稳定的三元复合物；(ii)检测稳定的三元复合物以鉴定稳定的三元复合物中的核苷酸；(iii)沿着核酸的第二模板区域延伸第二引物，以在核酸上形成经修饰的第二杂交体；以及(iv)对核酸的经修饰的第二杂交体重复(i)、(ii)和(iii)，从而确定第二模板区域的部分的序列。任选地，步骤(e)(iv)包括对核酸的经修饰的第二杂交体重复(i)、(ii)和(iii)至少10次，从而确定第二模板区域的部分的序列。任选地，步骤(e)包括在通过合成过程的测序或通过连接过程的测序中沿着第二模板区域延伸第二引物。任选地，步骤(a)(iv)包括对核酸的经修饰的第一杂交体重复(i)、(ii)和(iii)至少10次，从而确定第一模板区域的部分的序列。任选地，延伸的第一引物的加帽包括掺入包含配体的核苷酸，然后将配体与受体结合形成三元复合物抑制剂部分。
还提供了用于鉴定核酸模板的方法。该方法包括(a)提供多种核酸，所述多种核酸包含引物-模板杂交体；(b)用三元复合物抑制剂部分对引物进行加帽，从而形成加帽的引物-模板杂交体；(c)将引物与所述多种核酸的第二模板杂交，由此所述多种核酸包含加帽的引物-模板杂交体和第二引物-模板杂交体；(d)将聚合酶和核苷酸递送至所述多种核酸，由此第二引物-模板杂交体结合聚合酶和核苷酸以形成稳定的三元复合物，并且由此加帽的引物-模板杂交体不结合聚合酶和核苷酸以形成稳定的三元复合物；以及(e)检测稳定的三元复合物以鉴定第二模板。任选地，该方法还包括(f)延伸第二引物以在核酸上形成经修饰的第二杂交体；以及(g)对核酸的经修饰的第二杂交体重复(d)、(e)和(f)，从而确定第二模板的至少一部分的序列。
除非另有说明，否则本文使用的术语将被理解为采用它们在相关领域中的普通含义。本文使用的几个术语及其含义如下。
如本文中所用，术语“阵列”是指附接至一个或多个固体载体，使得一个特征处的分子可与其它特征处的分子区别开来的分子群体。阵列可包括不同的分子，所述不同的分子各自位于固体载体上不同的可寻址特征处。或者，阵列可包括单独的固体载体，每个固体载体起着承载不同分子的特性的作用，其中不同的分子可以根据固体载体在固体载体所附着的表面上的位置来鉴定，或者根据固体载体在液体诸如流体流中的位置来鉴定。阵列的分子可以是例如核苷酸、核酸引物、核酸模板或核酸酶，诸如聚合酶、连接酶、核酸外切酶或其组合。
如本文中所用，术语“封闭部分”，当用于指核苷酸时，意指在核酸聚合反应过程期间抑制或阻止核苷酸的3’氧与下一个正确的核苷酸形成共价键联的核苷酸的部分。“可逆终止的”核苷酸的封闭部分可以从核苷酸类似物中去除，或者以其它方式进行修饰，以允许核苷酸的3’-氧与下一个正确的核苷酸共价连接。这种封闭部分在本文中称为“可逆终止子部分”。美国专利第7,427,673号、第7,414,116号、第7,057,026号、第7,544,794号或第8,034,923号或PCT出版物WO 91/06678或WO 07/123744(其每一篇均通过引用并入本文)中阐述了示例性可逆终止子部分。具有封闭部分或可逆终止子部分的核苷酸可位于核酸(诸如引物)的3’末端，或者可以是未与核酸共价附接的单体。封闭部分不需要阻碍或排除在与封闭部分附接的核酸的3’末端处形成三元复合物。特别有用的封闭部分将存在于参与形成三元复合物的核酸的3’末端。
如本文中所用，术语“催化金属离子”是指促进聚合酶在核酸(例如，引物)的3’-氧与引入核苷酸的磷酸之间形成磷酸二酯键的金属离子。“二价催化金属阳离子”是具有二价的催化金属离子。催化金属离子可以以稳定聚合酶、核苷酸和引发的模板核酸之间的复合物形成的浓度(只要不发生磷酸二酯键形成，就称为金属离子的非催化浓度)存在。金属离子的催化浓度是指足以使聚合酶催化核酸(例如，引物)的3’-氧与引入核苷酸的磷酸基团之间的反应的金属离子的量。
如本文中所用，术语“共同序列”意指对于两个或更多个核酸分子相同的核苷酸序列。两个或更多个核酸共同的序列可包括被比较的核酸的全部或部分。共同序列的长度可为至少5个、10个、25个、50个、100个、250个、500个、1000个或更多个核苷酸。可选地或另外地，长度可以是至多1000个、500个、250个、100个、50个、25个、10个或5个核苷酸。
术语“包含”在本文中是开放式的，不仅包括例举的要素，还包括任何附加的要素
如本文中所用，术语“解封闭”意指除去或修饰核苷酸的可逆终止子部分以使该核苷酸可延伸。例如，核苷酸可存在于引物的3’末端，使得解封闭使引物可延伸。示例性解封闭试剂和方法阐述于美国专利第7,427,673号、第7,414,116号、第7,057,026号、第7,544,794号或第8,034,923号或者PCT公布WO 91/06678或WO 07/123744中，所述专利或PCT公布的每一篇通过引用并入。
如本文中所用，术语“作为系综检测”意指在不必将群体中的一个分子与群体中的其它分子区分开的条件下检测分子群体的特征。例如，在阵列的特征处被作为系综检测的核酸群体可产生表观特征，所述表观特征是该特征处的核酸的特征的组合。特征可以是发光信号，其为来自阵列特征处的多个发光体的发光的平均值。
如本文中所用，术语“每个”，当用于指项目集合时，旨在标识集合中的单个项目，但不一定指代集合中的每个项目。如果明确的公开或上下文清楚地另有规定，则可出现例外情况。
如本文中所用，术语“外源性的”，当用于指分子的一部分时，意指分子的天然类似物中不存在的化学部分。例如，核苷酸的外源标记物是天然存在的核苷酸上不存在的标记物。类似地，存在于聚合酶上的外源标记物不存在于在其天然环境中的聚合酶上。
如本文中所用，术语“延伸”，当用于指核酸时，意指在核酸的3’末端添加至少一个核苷酸的过程。当用于指核酸时，术语“聚合酶延伸”是指向核酸的3’末端添加至少一个核苷酸的聚合酶催化的过程。通过延伸而被添加到核酸中的核苷酸或寡核苷酸被认为掺入到核酸中。因此，术语“掺入”可用于指通过形成磷酸二酯键将核苷酸或寡核苷酸连接到核酸3’末端的过程。
如本文中所用，术语“可延伸的”，当用于指核苷酸时，意是指该核苷酸在3’位置具有氧或羟基部分，并且如果掺入到核酸中和当掺入核酸中时，能够与下一个正确核苷酸形成共价键。可延伸的核苷酸可以位于引物的3’位置，或者其可以是单体核苷酸。可延伸的核苷酸缺乏封闭部分，诸如可逆终止子部分。
如本文中所用，术语“特征”，当用于指阵列时，意指其中中存在特定分子的阵列中的位置。特征可以只包含单个分子，或者其可包含同一种类(即，分子的系综(ensemble))的几个分子的群体。或者，特征可包括不同种类的分子群体(例如，具有不同模板序列的三元复合物群体)。阵列的特征通常是离散的。离散特征可以是连续的，或者它们彼此之间具有间隔。本文中有用的阵列可具有例如间隔小于100微米、50微米、10微米、5微米、1微米或0.5微米的特征。可选地或另外地，阵列可具有间隔大于0.5微米、1微米、5微米、10微米、50微米或100微米的特征。每个特征的面积可以小于1平方毫米、500平方微米、100平方微米、25平方微米、1平方微米或更小。
如本文中所用，术语“标记物”是指提供可检测的特征的分子或其部分。可检测的特征可以是例如光信号，诸如辐射的吸收率、荧光发射、发光发射、荧光寿命、荧光偏振等；瑞利和/或米氏散射；对配体或受体的结合亲和力；磁性；电学特性；电荷；质量；放射性等。示例性标记物包括但不限于荧光团、发光体、生色团、纳米颗粒(例如，金、银、碳纳米管)、重原子、放射性同位素、质量标记、电荷标记、自旋标记、受体、配体等。
如本文中所用，“制造的容器”是人造的或人工修饰的容器，其功能是隔离一个化学过程(例如，结合事件；掺入反应；等等)与另一个化学过程隔离，或者提供化学过程可以发生的空间。与所公开的技术结合使用的制造的容器的非限制性实例包括：流动池、多孔板的孔；显微镜载玻片；管(例如，毛细管)；等等。待检查或检测的特征可包含在反应容器内。
如本文中所用，术语“下一个正确的核苷酸”是指将在引物的3’末端结合和/或掺入以补充与引物杂交的模板链中的碱基的核苷酸类型。模板链中的碱基被称为“下一个碱基”，并且正好在模板中与引物3’末端杂交的碱基的5’。下一个正确核苷酸可被称为下一个碱基的“同源物”，反之亦然。在三元复合物或双链核酸中彼此相互作用的同源核苷酸被称为彼此“配对”。具有与下一个模板碱基不互补的碱基的核苷酸被称为“不正确的”、“错配的”或“非同源的”核苷酸。
如本文中所用，术语“非催化性金属离子”是指当存在聚合酶时，不促进核苷酸化学掺入引物所需的磷酸二酯键形成的金属离子。非催化性金属离子可以与聚合酶相互作用，例如，通过与催化性金属离子相比的竞争性结合。因此，非催化性金属离子可充当抑制性金属离子。“二价非催化性金属离子”为化合价为2的非催化性金属离子。二价非催化性金属离子的实例包括但不限于Ca2+、Zn2+、Co2+、Ni2+和Sr2+。三价Eu3+和Tb3+离子是具有三价的非催化性金属离子。
如本文中所用，术语“核苷酸”可用于指天然核苷酸或其类似物。实例包括但不限于核苷酸三磷酸(NTP)诸如核糖核苷酸三磷酸(rNTP)、脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)或其非天然类似物，诸如二脱氧核糖核苷酸三磷酸(ddNTP)或可逆终止的核苷酸三磷酸(rtNTP)。
如本文中所用，术语“寡核苷酸部分”是指包含至少2个连续核苷酸的核酸部分。寡核苷酸部分可包含例如至少5个、8个、10个、15个、20个、25个、50个、100个或更多个连续核苷酸。可选地或另外地，寡核苷酸部分可包含至多100个、50个、25个、20个、15个、10个、8个、5个或2个连续核苷酸。在一些实施方案中，添加到引物-模板杂交体的寡核苷酸部分的长度可以等于模板从下一个模板核苷酸至模板5’末端的长度。
如本文中所用，术语“聚合酶”可用于指核酸合成酶，包括但不限于DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶、引发酶(primase)和转移酶。典型地，聚合酶具有一个或多个可在其上发生核苷酸结合和/或核苷酸聚合的催化的活性部位。聚合酶可以催化核苷酸聚合到双链核酸分子的第一链的3’末端。例如，聚合酶催化通过磷酸二酯键将下一个正确核苷酸添加到双链核酸分子的第一链的3’氧基团上，从而将核苷酸共价掺入双链核酸分子的第一链。任选地，在本文阐述的方法中使用的一种或多种条件下，聚合酶不需要能够掺入核苷酸。例如，突变型聚合酶可以能够形成三元复合物，但不能催化核苷酸掺入。
如本文中所用，术语“引物-模板核酸杂交体”或“引物-模板杂交体”是指这样的核酸，其具有双链区，使得其中一条链为引物并且另一条链为模板。两条链可以是连续核酸分子的一部分(例如发夹结构)，或者两条链可以是彼此不共价连接的可分离分子。
如本文中所用，术语“引物”是指具有与模板序列处或附近的核酸结合的序列的核酸。一般来说，引物以允许模板复制(例如，通过引物的聚合酶延伸)的构型结合。引物可以是与核酸分子的第二部分结合的该核酸分子的第一部分，第一部分是引物序列，第二部分是引物结合序列(例如发夹引物)。或者，引物可以是与具有模板序列的第二核酸分子结合的第一核酸分子。引物可由DNA、RNA或其类似物组成。引物可具有可延伸的3’末端、被阻断引物延伸的3’末端或被加帽而阻碍或排除三元复合物形成的3’末端。
如本文中所用，术语“固体载体”是指不溶于含水液体的刚性基板。基板可以是无孔的或多孔的。基板可以任选地能够吸收液体(例如，由于多孔性)，但通常具有足够的刚性，使得基板在吸收液体时基本上不膨胀，并且在通过干燥去除液体时基本上不收缩。无孔固体载体通常不透液体或气体。示例性固体载体包括但不限于玻璃和改性或功能化玻璃、塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯和苯乙烯与其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonTM、环烯烃、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷、树脂、Zeonor、二氧化硅或二氧化硅基材料(包括硅和改性硅)、碳、金属、无机玻璃、光纤束和聚合物。
如本文中所用，术语“亚组”表示一个或多个事物的集合，所有这些事物都包含在更大的事物集合中。较大的事物集合可被称为“组”。亚组可以至少包含1个、2个、10个、100个、1x 103个、1x 106个、1x 109个或更多事物。所述事物可以是例如核酸，诸如引物-模板核酸杂交体、三元复合物、聚合酶、核苷酸或本文阐述的其它组合物。
如本文中所用，术语“模板”意指具有核苷酸碱基序列的核酸或其部分，其用作用于产生序列的互补拷贝的模式。模板可以通过与模板杂交或在与模板相邻处杂交的引物的延伸来复制。延伸可以由聚合酶或连接酶介导。模板可由DNA、RNA或其类似物组成。
如本文中所用，术语“三元复合物”是指聚合酶、双链核酸和核苷酸之间的分子间缔合。通常，聚合酶促进下一个正确核苷酸与引发的核酸的模板链之间的相互作用。下一个正确核苷酸可通过沃尔森-克里克氢键合与模板链相互作用。术语“稳定的三元复合物”是指促进或延长存在的三元复合物或已抑制对其的破坏的三元复合物。一般来说，三元复合物的稳定化防止三元复合物的核苷酸组分共价掺入到三元复合物的引发的物核酸组分中。
如本文中所用，术语“三元复合物抑制剂”是指当存在于核酸中时阻碍或排除核酸与聚合酶和/或核苷酸结合形成三元复合物的部分。产生对三元复合物形成的空间阻断的部分是特别有用的，包括例如将引物延伸至与引物杂交的模板末端的聚合或连接产物。空间阻断的另一个实例是错配的核苷酸。部分也可用于引入正电荷或负电荷，从而阻碍或阻止三元络合物的形成。部分可以是将与阻碍或阻止三元复合物形成的受体结合的配体，诸如与链霉抗生物素蛋白(或其类似物)结合的生物素(或其类似物)、与抗体(或其功能片段)结合的表位、与凝集素结合的碳水化合物等。因此，三元复合物抑制剂可以是能够与受体(或其它分子)结合以形成抑制三元复合物形成的配体-受体复合物的配体(或其它)部分。可用作三元复合物抑制剂的部分的其它实例包括Turcatti等人Nucl.Acids.Res.36(4)e25(2008)中描述的碱基修饰和核苷酸类似物。
如本文中所用，术语“类型”用于标识具有相同化学结构的分子。例如，核苷酸的混合物可包括几个dCTP分子。dCTP分子将被理解为是彼此相同的类型，但与dATP、dGTP、dTTP等相比是不同类型。同样，核苷酸序列相同的单个DNA分子是同一类型，然而序列不同的DNA分子是不同类型。术语“类型”也可标识具有相同化学结构的部分。例如，模板核酸中的胞嘧啶碱基将被理解为彼此是相同类型的碱基，而与它们在模板序列中的位置无关。
根据以上定义，可以理解下面阐述的和权利要求中例举的实施方案。
本公开提供了用于鉴定模板核酸中的核苷酸的方法。所述方法可包括以下步骤：(a)提供多种引物-模板核酸杂交体，其中所述引物具有可延伸的3’末端；(b)使所述多种引物与以下物质接触：(i)封闭的核苷酸，以产生第一亚组的在3’末端包含封闭的核苷酸的引物-模板核酸杂交体，和(ii)三元复合物抑制剂，以产生第二亚组的包含三元复合物抑制剂的引物-模板核酸杂交体；(c)形成三元复合物，所述三元复合物各自包括聚合酶、第一亚组的引物-模板核酸杂交体和同源核苷酸；以及(d)检测三元复合物，从而鉴定模板核酸中的核苷酸。任选地，封闭的核苷酸可以是可逆终止的核苷酸。
本公开的方法可包括引物修饰方法，由此将核苷酸或其它部分添加到引物-模板核酸杂交体的引物组分中。引物修饰方法可用于制备用于检查过程的引物-模板核酸杂交体，由此检测模板核酸的下一个碱基。任选地，进行检查以检测在引物-模板核酸杂交体的下一个碱基、聚合酶和下一个碱基的同源核苷酸(即同源核苷酸也被称为下一个正确核苷酸)之间形成的三元复合物。有关检查过程的更多详情阐述于下文中。
回到引物修饰方法，导致引物延伸一个或多个核苷酸的修饰可用于改变下一步将要检查的模板核酸的位置。例如，延伸可用于向引物中添加一个核苷酸，从而将形成三元复合物的位置移动一个模板位置。可使用重复的循环对模板核酸进行测序，所述循环检查引物末端处(即在下一个模板碱基处)的三元复合物形成，然后延伸引物以移动检查位置。
在引物修饰方法中未能延伸引物可以例如由于关于在任何给定循环中模板的哪个位置实际上被检查的混淆，或例如当延伸不能进行时读取长度的减少而导致准确性的丧失。当检测引物-模板核酸杂交体的系综时，甚至相对较小的延伸效率低下也会导致定相问题，这将对读取精度和读取长度产生不利影响。
在本文所阐述的方法中使用的引物修饰方法可提供减轻原本将由延伸失败和低效引起的假象的手段。在特定实施方案中，引物修饰方法可包括至少两个步骤：(i)使引物-模板核酸杂交体和聚合酶与可逆终止的核苷酸接触，以产生第一亚组的在3’末端包含可逆终止的核苷酸的引物-模板核酸杂交体，以及(ii)使引物-模板核酸杂交体和聚合酶与三元复合物抑制剂接触，以产生第二亚组的包含三元复合物抑制剂的引物-模板核酸杂交体。步骤(i)可提供延伸引物，使得第一亚组的引物-模板核酸杂交体可继续参与提供序列信息的益处。例如，可以选择步骤(i)中使用的可逆终止的核苷酸以适应可逆终止的引物的三元复合物的后续形成和检查。步骤(ii)可提供将引物加帽，以防止它们在后续的检查步骤中参与三元复合物的形成的益处。这种加帽可以减少定相，提高碱基调用的准确性，并延长测序读取长度。通常，步骤(i)将在步骤(ii)之前进行。然而，所述步骤可以同时执行，或可以按相反的顺序执行。当连续执行时，其中一个步骤可以立即跟随另一个步骤，其中一个步骤可以在前一个步骤结束之前开始，或者另一个步骤可介于这两个步骤之间。
当用可逆终止的核苷酸进行延伸时，与延伸引物的3’末端相比，特别有用的加帽化学物质对非延伸引物的3’末端具有选择性。例如，加帽化学物质可对非封闭引物的3’端具有反应性，而对修饰封闭引物具有惰性。在这种构型中，加帽可用于清理扩展步骤。使用对引物的天然3’末端特异的酶的化学特别有用，包括例如连接酶和聚合酶。与封闭引物相比，在修饰天然3’引物末端方面更高效的加帽程序对许多应用是有益的。
在特定实施方案中，使用三元复合物抑制剂对引物进行加帽。可向引物中添加多种部分中的任一种部分，以阻碍或防止随后在引物的3’端形成三元复合物。例如，引物可经修饰而具有与之附接的寡核苷酸部分。寡核苷酸部分的长度可以至少与修饰引物之前为单链的模板区域一样长。例如，寡核苷酸部分可从引物的3’末端延伸至模板的5’末端。在另一个实例中，寡核苷酸部分可从引物的3’末端延伸至与模板区相邻的双链区的5’末端。在本实例中，双链区的5’末端形成模板区的边界。可存在其它边界，诸如结合的蛋白质、化学修饰、与固体载体的附着点等。寡核苷酸部分的长度可防止三元复合物与引物和边界之间的模板结合。当整个模板区域为双链时，可导致三元复合物抑制，从而去除其中可形成三元复合物的单链位置。
任选地，由于连接酶催化的寡核苷酸5’末端与引物3’末端的连接或由于聚合酶催化的利用一系列核苷酸对引物的延伸，引物可被附接至寡核苷酸部分。连接酶、聚合酶和修饰引物的其它酶可以是有用的。然而，化学技术也可用于在本文阐述的方法中修饰引物。与引物附接的寡核苷酸部分可由与模板形成天然Watson-Crick碱基对的完全天然的核苷酸组成。或者，寡核苷酸可包含一种或多种非天然核苷酸类似物。可根据其与模板形成碱基对的能力选择这些类似物，但也可使用不与模板配对的类似物。类似地，天然核苷酸可存在于寡核苷酸部分中形成错配的一个或多个位置，所述错配破坏寡核苷酸与模板之间的碱基配对。错配或非天然核苷酸类似物的一个特别有用的位置是在寡核苷酸部分的3’末端，在该位置其可以起到阻碍或排除随后的三元复合物形成的作用。
可添加至引物以阻碍或阻止在引物的3’末端随后形成三元复合物的有用部分的另一个实例是单核苷酸(例如天然核苷酸或非天然核苷酸类似物)。例如，可将错配的核苷酸附接至引物的3’末端以阻止三元复合物的形成。在Kwok等人，NucleicAcidsRes.18(4)：999–1005(1990)(其通过引用并入)中阐述了特别有用的错配和其识别错配的能力受到影响的聚合酶。错配核苷酸可存在于引物的3’末端，已通过添加至引物的寡核苷酸部分引入。在一些实施方案中，一系列两个或更多个错配的核苷酸可存在于引物的3’末端或其附近，以实现对三元复合物形成的抑制。
无论添加到引物3’末端的核苷酸是否与模板匹配，该核苷酸都可包含起三元复合物抑制剂作用的外源部分。所述外源部分可具有空间阻断效应，从而阻断聚合酶、核苷酸或两者形成三元复合物。所述部分可对三元复合物的形成具有其它影响，包括但不限于聚合酶或同源核苷酸的电荷排斥、引物-模板核酸杂交体结构的微扰、排斥聚合酶或同源核苷酸的极性等。外源部分可以通过接头连接至核苷酸，例如连接至位于引物3’末端的核苷酸上。特别有用的接头具有相对较短的长度，使得三元复合物抑制发生在引物的3’末端附近。例如，接头可以具有从单个共价键至2、5、10或15个共价键的长度。因此，接头可以保持至多为例如(埃)、/>或更小的核苷酸上的连接点与三元复合物抑制剂上的连接点之间的距离。相对缺乏柔性也是接头的一个有用特征，这样抑制剂部分将靠近引物的3’末端。因此，具有酰胺、酯、碳-碳双键、碳-碳三键、环结构和其它旋转受限键结构的接头是有用的。
特别有用的可连接至核苷酸的外源部分包括但不限于生物素或其它配体，其可阻碍或阻止三元复合物的形成，因为它们存在于3’末端或因为它们与抗生物素蛋白或其它受体的相互作用(这反过来防止三元复合物的形成)。可以使用的示例性生物素类似物包括但不限于生物素碳酸酯5或生物素氨基甲酸酯6(参见Yamamoto ChemAsian J.10:1071-1078(2015)，其通过引用并入本文)、2-亚氨基生物素、二氨基生物素或脱硫生物素。当在不使抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白变性的相对温和的条件下除去帽时，与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白可逆结合的生物素类似物可以是特别有用的。对链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白具有亲和力的肽也可以是有用的，诸如用于SBP-标签系统的肽(参见Keefe等人，Protein Expression and Purification 23:440-446(2001)，其通过引用并入本文)。
可用于形成三元复合物抑制剂的其它配体-受体对包括但不限于抗体(或其功能性片段，诸如Fab或ScFv)和表位；碳水化合物和凝集素；核酸(或其类似物)及其互补核酸(或其类似物)；或本文在第二标记物的背景中阐述的结合配偶体。可以使用多种功能性抗体片段中的任一种，包括例如单价种类诸如Fab或scFv或其它单价种类或其工程变体，诸如F(ab’)2、双抗体、三抗体、微型抗体或单结构域抗体(参见Holliger和Hudson，Nat.Biotechnol.23:1126-1136(2005)，其通过引用并入本文)。另一类特别有用的配体-受体对是当与重组蛋白及其结合配偶体融合时，通常用作纯化标签的肽。示例性肽包括，但不限于，与二价阳离子诸如Ni2+结合的聚组氨酸(即6个或更多个组氨酸的多肽序列)、与谷胱甘肽结合的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、与抗myc抗体结合的myc-标签(例如，具有序列：EQKLISEEDL(SEQ ID NO:1)的多肽)(可从University ofIowa的发育研究杂交瘤库获得)；与钙调素结合的钙调素结合肽(CBP，例如具有序列KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL(SEQ IDNO:2)的多肽)；与抗FLAG抗体结合的FLAG标签(例如具有肽序列：DYKDDDD(SEQ ID NO:3)或DYKDDDDK(SEQ ID NO:4)或DYKDDDK(SEQ ID NO:5))；或与直链淀粉或麦芽糖结合的麦芽糖结合蛋白。应当理解，当使用上述纯化标签系统时，肽或其所结合的分子可以共价连接至核苷酸或引物上。通常，优选通过接头将较小的配偶体与核苷酸连接，然后将其与较大的配偶体结合以形成三元复合物抑制剂。
使用配体-受体作为引物帽的有利方面是配体在结合到受体之前不需要抑制三元复合物的形成。例如，与配体附接的核苷酸可与聚合酶和引物-模板核酸结合，形成三元复合物，可将核苷酸掺入引物中，使配体位于引物的3’末端。然后受体可与引物3’末端的配体结合，以抑制三元复合物在引物3’末端的形成。
引物可用抑制三元复合物检测的部分进行加帽，即使三元复合物存在。例如，当使用发光标记物检测三元复合物形成时，帽可以是淬灭剂，其减少或阻止来自发光标记物的信号。通过更具体的实例，引物可以用淬灭部分加帽，并且在加帽的引物、聚合酶和发光标记的核苷酸之间可以形成三元复合物。由于淬灭剂和发光标记物的接近，可以阻止发光标记的核苷酸产生发光信号。另一个可用于抑制三元复合物检测而不必抑制三元复合物形成的部分是FRET对的成员，其可用于标记有FRET对的另一成员的三元复合物。FRET现象引起的信号偏移可有效降低预期信号，从而对信号产生明显抑制，而这种抑制本应由未加帽的引物产生。在FRET的情况下，可以检测位移信号以确定加帽的引物的存在。在某些情况下，可对偏移的FRET信号进行定量，以定量待检的样品中的加帽的引物。当特定标记物将用于检测三元复合物时，淬灭或修饰来自特定标记物的信号的其它部分可用作加帽部分。
在一些实施方案中，引物修饰方法可用于将聚合酶与核酸诸如引物(例如延伸引物或非延伸引物)的3’末端交联。条件可用于在具有天然3’羟基部分的引物的3’末端选择性地保留聚合酶，同时从在3’末端具有可逆终止子的引物中除去聚合酶。保留的聚合酶可与引发的-模板核酸杂交体交联，并抑制其随后与核苷酸结合形成三元复合物。抑制可以是使保留的聚合酶变性、在聚合酶的核苷酸结合位点交联或本领域已知的使聚合酶失活的其它化学或光化学修饰的结果。有用的交联试剂包括，例如，在Middaugh等人Biochemistry50:115-141(1983)(其通过引用并入本文)中阐述的光反应性、异双功能或同双功能试剂。零长度交联剂诸如碳二亚胺、过氧化氢、Cu2+(邻菲罗啉)或2-亚氨基四氢噻吩也可以是有用的。
根据本文的教导制备或使用的多种引物-模板核酸杂交体可包括第一亚组的具有可逆终止的引物的种类和第二亚组的具有诸如三元复合物抑制剂部分的帽的种类。第一亚组中的引物-模板核酸杂交体的数目可以小于所述多种引物-模板核酸杂交体的99％、90％、80％、70％、60％或51％。可选地或另外地，第一亚组中引物-模板核酸杂交体的数目可以是所述多种引物-模板核酸杂交体的至少50％、60％、70％、80％、90％或99％。在一些实施方案中，第二亚组中引物-模板核酸杂交体的数目为所述多种引物-模板核酸杂交体的至多1％、10％、20％、30％、40％、50％或更多。可选地或另外地，第二亚组中引物-模板核酸杂交体的数目可以是所述多种引物-模板核酸杂交体的至少50％、40％、30％、20％、10％、1％或更少。在上述每个实例中，可将所述多种引物-模板核酸杂交体附接至固体支持物，例如，作为系综存在于核酸阵列的特定特征处。
在采用系综的检测的测序实施方案中，第一亚组和第二亚组中引物-模板核酸杂交体的相对数目可随着测序的进行而改变。在此类情况下，可以允许继续进行测序，直至一个或两个亚组达到特定的阈值群体大小。阈值可以与上文阐述的那些阈值相同，或者阈值可以不同，以适应方法的特定用途。或者，可继续进行测序达预定循环数，或直至达到不同特性的阈值，诸如获取足够的序列信息以进行识别，或直至信噪比降至特定水平。
第一亚组和第二亚组的引物-模板核酸杂交体可以在其它方面不同。通常，第一个亚组的引物(例如通过添加可逆终止的核苷酸延伸的引物)将具有彼此相同的长度。当检测系综中模板核酸的下一个碱基时，这通常有利于提供均匀的相。然而，第二亚组的引物(例如具有三元复合物抑制剂的引物)的长度可以彼此不同。当群体中的种类因在测序方法的不同循环中加帽而产生时，可能会产生这种群体。任选地，第二亚组的引物比第一亚组的引物短。或者，第二亚组的引物可以比第一亚组的引物长。
在特定实施方案中，引物修饰方法可通过去除或降解非延伸的引物来减少由延伸失败和低效引起的假象。例如，引物修饰方法可包括至少两个步骤：(i)使引物-模板核酸杂交体和聚合酶与可逆终止的核苷酸接触，以产生第一亚组的引物-模板核酸杂交体，所述杂交体在3’末端处包含可逆终止的核苷酸，以及(ii)使引物-模板核酸杂交体与去除或降解引物的试剂接触，从而产生第二亚组的包括缺少功能性引物的模板核酸。步骤(i)可提供延伸引物，使得第一亚组的引物-模板核酸杂交体可继续参与提供序列信息的益处。步骤(ii)可以提供防止非延伸引物在随后的检查步骤中参与三元复合物的形成的益处。例如，在系综中不存在非延伸引物可减少定相，提高碱基调用的准确性，并延长测序读取长度。通常，步骤(i)将在步骤(ii)之前进行。然而，所述步骤可以同时执行，也可以按相反的顺序执行。当连续执行时，其中一个步骤可以立即跟随另一个步骤，其中一个步骤可以在前一个步骤结束之前开始，或者另一个步骤可以介于这两个步骤之间。
在特定实施方案中，用于降解特定引物(例如，非延伸引物)的试剂对缺乏存在于其它目标引物(例如延伸引物)中的封闭部分诸如可逆终止子部分的引物具有选择性。例如，引物降解可以使用核酸外切酶或化学试剂进行，所述核酸外切酶或化学试剂在降解在3’末端缺少封闭部分的引物(例如，未通过添加封闭的核苷酸而延伸的引物)方面是有活性的，但在其它引物(例如，已经延伸以在3’末端掺入封闭的核苷酸的引物)上因存在封闭部分而被抑制。3’至5’核酸外切酶可以是特别有用的，其实例包括但不限于具有3’核酸外切酶活性的聚合酶、Exo III或Exo VII。任选地，引物-模板核酸杂交体的模板组分的3’末端可以例如通过附着至固体载体或通过封闭部分的存在而被封闭，以防止不想要的模板降解。作为另外的选择，可封闭引物和/或模板的5’末端以防止不想要的降解。
多种模板核酸可包括与第一亚组的可逆终止的引物杂交的种类和第二亚组的不具有引物(例如由于引物已被去除或降解)的种类。第一亚组中引物-模板核酸杂交体的数目可以少于多种模板核酸的99％、90％、80％、70％、60％或51％。可选地或另外地，第一亚组中引物-模板核酸杂交体的数目可以是多种模板核酸的至少50％、60％、70％、80％、90％或99％。在一些实施方案中，第二亚组中模板核酸的数目为多种模板核酸的至多1％、10％、20％、30％、40％、50％或更多。可选地或另外地，第二亚组中模板核酸的数目可以少于多种模板核酸的50％、40％、30％、20％、10％、1％或更少。在上述每个实例中，多种模板核酸可以附接至固体载体，例如，存在于核酸阵列的特定特征处。
本文阐述的方法中使用的引物修饰方法不需要使用标记的聚合酶。例如，用于延伸步骤或用于加帽步骤的聚合酶不需要与外源标记物附接(例如共价地或以其它方式)。或者，用于引物延伸或加帽的聚合酶可包含外源性标记物，例如，在先前检查步骤中使用的标记物。
典型地，在本文阐述的方法中加入引物的可逆终止的核苷酸不具有外源标记物。这是因为在本文阐述的方法中不需要检测延伸的引物。然而，如果需要，可以例如通过附接至核苷酸的外源标记物来检测在本文阐述的方法中使用的一种或多种类型的可逆终止的核苷酸。示例性可逆终止子部分、将它们掺入引物的方法以及修饰引物以进一步延伸的方法(通常称为“解封闭”)阐述于美国专利第7,544,794号、第7,956,171号、第8,034,923号、第8,071,755号、第8,808,989号或第9,399,798号。另外的实例阐述于在Bentley等人，Nature 456:53-59(2008)，WO 04/018497；美国专利第7,057,026号、WO 91/06678、WO 07/123744、美国专利第7,329,492号、美国专利第7,211,414号、美国专利第7,315,019号、美国专利第7,405,281号和US2008/0108082(其每一篇均通过引用并入本文)中。
类似地，在本文阐述的方法中加入引物的三元复合物抑制剂或其它引物帽不需要具有外源性标记物。这是因为在本文阐述的方法中不需要检测包含帽诸如三元复合物抑制剂的引物-模板核酸杂交体。然而，如果需要，一种或多种类型的三元复合物抑制剂或本文阐述的方法中使用的其它帽可以例如通过与所述帽或三元复合物抑制剂附接的外源标记物来检测。
引物加帽过程可以与引物延伸过程同时进行，或者这两个过程可以通过本文阐述的其它过程分开。例如，引物延伸后可立即进行引物加帽。在另一个实例中，可在引物延伸过程与引物加帽过程之间进行检查。在一些实施方案中，引物加帽可以与检查同时进行(例如，可将引物加帽试剂与用于形成三元复合物的试剂一起递送至反应容器)。
本公开的方法可包括其中形成并检测三元络合物的检查步骤。所述方法的实施方案利用了聚合酶可利用来与引物-模板核酸和下一个正确核苷酸形成稳定的三元复合物的特异性。下一个正确核苷酸可以非共价结合至稳定的三元复合物，仅通过非共价相互作用与复合物的另外成员相互作用。用于形成稳定的三元复合物的有用方法和组合物更详细地阐述于下面和共同拥有的美国专利申请公布第2017/0022553A1号或美国专利申请序列第15/677,870号(公布为美国专利申请公布第2018/0044727A1号)；美国专利申请公布第2018/0187245A1号(其要求美国专利申请序列第62/440,624号的优先权)或美国专利申请公布第2018/0208983A1号(其要求美国专利申请序列第62/450,397的优先权)中，所述专利申请每一篇通过引用并入本文。
通常，检查与引物修饰分开且不连续地进行，例如，由于试剂交换或洗涤干扰了检查和修饰。或者，在一些实施方案中，检查和一个或多个引物修饰步骤可以在相同的混合物中进行。例如，检查和引物封闭可以在同一混合物中进行。作为替代或补充，检查和引物封闭可在同一混合物中进行。
虽然在某些催化金属离子(例如，Mg2+)不存在的情况下，聚合酶、引物-模板核酸杂交体和下一个正确核苷酸之间可以形成三元复合物，但在催化金属离子不存在的情况下，核苷酸的化学添加被抑制。催化金属离子水平低或不足，会导致稳定的三元复合物中下一个正确核苷酸的非共价螯合。本文公开的其它方法也可用于产生稳定的三元复合物。
任选地，当引物-模板核酸杂交体的引物包含封闭部分(例如可逆终止子部分)时，可以形成稳定的三元复合物，所述封闭部分阻止引入的核苷酸酶促掺入引物中。所述相互作用可以在稳定剂存在的情况下发生，从而聚合酶-核酸的相互作用在下一个正确核苷酸存在的情况下得以稳定。引物-模板核酸杂交体的引物可选地可为可延伸的引物，或为在其3’末端被阻止延伸的引物(例如，通过在引物的3’末端存在可逆终止子部分可以实现封闭)。当同源核苷酸的碱基与引物-模板核酸杂交体的下一个碱基互补时，引物-模板核酸杂交体、聚合酶和同源核苷酸能够形成稳定的三元复合物。
如上所述，有利于或稳定三元复合物的条件可通过封闭基团(例如引物的3’核苷酸上的可逆终止子部分)的存在或通过催化金属离子的不存在来提供，所述封闭基团阻止引入的核苷酸酶促掺入引物。其它有用的条件包括三元复合稳定剂诸如抑制核苷酸掺入或聚合的非催化性金属离子(例如，二价或三价非催化性金属离子)的存在。非催化性金属离子包括但不限于钙、锶、钪、钛、钒、铬、铁、钴、镍、铜、锌、镓、锗、砷、硒、铑、铕和铽离子。任选地，一种或多种单价阳离子和/或谷氨酸根阴离子的存在提供了不利于二元复合物(即聚合酶与引发的核酸之间的复合物，但缺乏同源核苷酸)或使所述二元复合物不稳定的条件。作为另外的选择，可使用经工程化阻止催化活性或阻止二元复合物形成倾向的聚合酶。
在特定实施方案中，通过Li+、甜菜碱或两者的存在来稳定三元络合物。例如，可使用美国专利第10,400,272号(序列号为16/355,361，其通过引用并入本文)中阐述的试剂和技术。还可将不混溶流体用于稳定三元复合物，包括例如美国专利申请序列公布第2019/0119740号(序列号为16/164,417，其通过引用并入本文)中阐述的不混溶流体。
三元复合物稳定条件可在不同核苷酸存在的情况下，例如，通过破坏二元复合物的稳定性，被进一步配制来增强聚合酶对引物-模板核酸杂交体的亲和力差异。任选地，在不同核苷酸存在的情况下，所述条件导致聚合酶对引物-模板杂交体的不同亲和力。举例来说，所述条件包括但不限于高盐和谷氨酸根离子。例如，盐可以溶解在水溶液中以产生单价阳离子，诸如单价金属阳离子(例如，钠离子或钾离子)。任选地，提供单价阳离子(例如，单价金属阳离子)的盐进一步提供谷氨酸根离子。任选地，谷氨酸根离子源可以是谷氨酸钾。在一些情况下，可用于改变引物-模板杂交体的聚合酶亲和力的谷氨酸钾的浓度从10mM扩展至1.6M的谷氨酸钾，或在10mM与1.6M之间的任何量。如上所述，高盐是指50mM至1.5M盐的盐浓度。
应当理解，本文阐述的用于稳定三元复合物的选项不需要相互排斥，而是可以以各种组合使用。例如，三元复合物可通过一种或多种手段的组合来稳定，包括但不限于聚合酶结构域交联、聚合酶与核酸的交联、稳定三元复合物的聚合酶突变、由小分子产生的变构抑制、反竞争性抑制剂(uncompetitive inhibitor)、竞争性抑制剂、非竞争性抑制剂、催化金属离子的不存在、引物上存在封闭部分以及本文阐述的其它手段。
稳定的三元复合物可以根据需要包括天然核苷酸、核苷酸类似物或经修饰的核苷酸，以适合方法的特定应用或配置。任选地，核苷酸类似物具有含氮碱基、五碳糖和磷酸基团，其中与天然核苷酸相比，核苷酸的任何部分都可以被修饰、去除和/或替代。核苷酸类似物可以是不可掺入的核苷酸(即不能与引物的3’氧反应形成共价键联的核苷酸)。此类不能掺入的核苷酸包括，例如，单磷酸和二磷酸核苷酸。在另一个实例中，核苷酸可包含对三磷酸基团的一个或多个修饰，使得核苷酸不可掺入。不可掺入的核苷酸的实例可见于美国专利第7,482,120号(其通过引用并入本文)中。在一些实施方案中，不可掺入的核苷酸可以随后被修饰成可掺入的。不可掺入的核苷酸类似物包括但不限于α-磷酸修饰的核苷酸、α-β核苷酸类似物、β-磷酸修饰的核苷酸、β-γ核苷酸类似物、γ-磷酸修饰的核苷酸或笼状核苷酸。核苷酸类似物的实例描述于美国专利第8,071,755号(其通过引用并入本文)中。
参与稳定的三元复合物或者通过聚合酶催化而被添加到引物的核苷酸类似物可以包括终止子，所述终止子在类似物已被掺入引物后可逆地阻止随后在引物3’末端的核苷酸掺入。例如，U.S.7,544,794和U.S.8,034,923(这些专利的公开内容通过引用并入本文)描述了其中3’-OH基团被3’-ONH2部分替代的可逆终止子。另一种类型的可逆终止子与如例如U.S.8,808,989(其公开内容通过引用并入本文)中所阐述的核苷酸的含氮碱基连接。可类似地结合本文所述方法使用的其它可逆终止子包括本文其它地方引用的参考文献中或U.S.7,956,171、U.S.8,071,755和U.S.9,399,798(这些美国专利的公开内容通过引用并入本文)中描述的那些终止子。在某些实施方案中，可在称为“解封闭”的过程中修饰除逆终止子部分或以从引物中去除逆终止子部分，从而允许随后的核苷酸掺入。在可逆终止子的背景下，在本文引用的参考文献中阐述了用于解封闭的组合物和方法。
参与稳定化的三元复合物或通过聚合酶催化而被添加到引物中的核苷酸类似物可包括三元复合物抑制剂，其可阻止在将类似物掺入引物后在引物的3’末端随后形成三元复合物。通常，三元复合物抑制剂，或用于结合起三元复合物抑制剂的作用的受体的配体，其功能为三元复合物抑制剂，可以使用接头和与标记核苷酸相关的领域内已知的化学方法连接至核苷酸。例如，三元复合物抑制剂可以通过键联连接至碱基部分、核糖部分的3’位置或核糖部分的2’位置。核苷酸类似物可包括封闭基团，诸如可逆终止子部分，但封闭基团不需要存在于含有三元复合物抑制剂或用于结合受体以形成三元复合物抑制剂的配体的核苷酸类似物上。核苷酸类似物可包括外源标记物，但本文使用的核苷酸类似物不需要包括标记物。
任选地，无论核酸类似物是否包括三元复合物抑制剂，它们都不可逆地阻止核苷酸掺入它们已被掺入其中的引物的3’-末端。不可逆的核苷酸类似物包括2’,3’-双脱氧核苷酸(ddNTP，诸如ddGTP、ddATP、ddTTP、ddCTP)。双脱氧核苷酸缺乏原本参与聚合酶介导的引物延伸的dNTP的3’-OH基团。因此，3’位置具有氢部分，而不是天然的羟基部分。不可逆终止的核苷酸对于基因分型应用或其它不需要引物延伸或沿模板核酸的序贯检测不是想要的应用是特别有用的。
在一些实施方案中，在本文方法中用于例如参与形成三元复合物的核苷酸可包括外源标记物。任选地，外源标记的核苷酸可包括可逆或不可逆的终止子部分，外源标记的核苷酸可以是不可掺入的，外源标记的核苷酸可以缺乏封闭部分，外源标记的核苷酸可以是可掺入的，或者外源标记的核苷酸可以是可掺入的和不可掺入的。当用于与非标记的聚合酶形成稳定的三元复合物时，外源标记的核苷酸可以特别有用。或者，核苷酸上的外源标记物可提供荧光共振能量转移(FRET)对中的一个配偶体，聚合酶上的外源标记物可提供该对的第二个配偶体。因此，FRET检测可用于鉴定包含两种配偶体的稳定的三元复合物。或者，参与形成三元复合物的核苷酸可缺乏外源标记物(即核苷酸可以是“非标记的”)。任选地，非标记的核苷酸可包括可逆或不可逆的终止子部分，非标记的核苷酸可以是不可掺入的，非标记的核苷酸可以缺乏终止子部分，非标记的核苷酸可以是可掺入的，或者非标记的核苷酸可以是可掺入的且非终止的。非标记的核苷酸可以包括三元复合物抑制剂部分或三元复合物抑制剂的前体，诸如对充当三元复合物抑制剂的受体具有亲和力的配体。当聚合酶上的标记物用于检测稳定的三元复合物时，非标记的核苷酸可以是有用的。非标记的核苷酸也可用于本文阐述的方法的延伸步骤。应当理解，关于核苷酸的部分或功能的不存在是指核苷酸不具有这样的功能或部分。还应当理解，可在本文阐述的方法或组合物中明确地省略关于核苷酸或其类似的本文阐述的或者关于核苷酸或其类似物的原本在本领域中已知的一种或多种功能或部分。
任选地，在形成稳定的三元复合物期间，混合物中存在核苷酸(例如天然核苷酸或合成的核苷酸类似物)。例如，可存在至少1种、2种、3种、4种或更多种核苷酸类型。可选地或另外地，至多可存在4种、3种、2种或1种核苷酸类型。类似地，存在的一种或多种核苷酸类型可以与模板核酸中的至少1种、2种、3种或4种碱基类型互补。可选地或另外地，存在的一种或多种核苷酸类型可以与模板核酸中至多4种、3种、2种或1种碱基类型互补。
不阻止参与三元复合物的任何核苷酸修饰都可用于本文公开的方法。核苷酸可以永久或短暂地与聚合酶结合。任选地，将核苷酸类似物例如通过共价接头与聚合酶融合。任选地，将多种核苷酸类似物与多种聚合酶融合，其中将每种核苷酸类似物与不同的聚合酶融合。任选地，存在于稳定的三元复合物中的核苷酸不是籍以稳定三元复合物的手段。因此，多种其它三元复合物稳定方法中的任一种都可组合在利用核苷酸类似物的反应中。
在特定的实施方案中，存在于稳定的三元复合物中的引物-模板核酸杂交体分子的引物链在本文阐述的方法的一个或多个步骤中未被存在的聚合酶化学改变。例如，引物不需要通过形成新的磷酸二酯键来延伸，也不需要在形成稳定的三元复合物的步骤中以及在检测稳定的三元复合物的步骤中，通过溶核降解来缩短。存在于稳定的三元复合物中的引物-模板杂交分子的引物链不需要化学修饰，例如，引物不需要被修饰以包含三元复合物抑制剂部分或其它引物加帽部分。
根据本公开制备或使用的三元复合物可以任选地包含一种或多种外源标记物。在形成三元复合物之前，可将标记物附接至三元复合物的组分(例如，附接至聚合酶、模板核酸、引物和/或同源核苷酸)。示例性的附接包括共价附接或非共价附接，诸如本文中、本文中引用的参考文献中所阐述的或本领域已知的那些。在一些实施方案中，将标记的组分在溶液中递送至附接至未标记的组分的固体载体上，由此通过形成稳定的三元复合物将标记物招募到固体载体上。因此，可基于对所招募的标记物的观察来检测或鉴定附接至载体的组分。无论是在溶液相中还是在固体载体上使用，外源标记物都可用于在检查步骤期间检测稳定的三元复合物或其单个组分。外源标记物可在组分与已经形成稳定的三元复合物的其它组分解离后保持附接至组分上。示例性标记物、用于附接标记物的方法和用于使用标记的组分的方法阐述于共同拥有的美国专利申请公布第2017/0022553 A1号或美国专利申请序列第15/677,870号(公布为美国专利申请公布第2018/0044727 A1号)、第15/851,383号(公布为美国专利申请公布第2018/0187245 A1号)、第15/873,343号(公布为美国专利申请公布第2018/0208983 A1号)、第62/450,397号或第62/506,759号，所述专利申请的每一篇通过引用并入本文。
有用的外源标记物的实例包括但不限于放射性标记部分、发光体部分、荧光团部分、量子点部分、生色团部分、酶部分、电磁自旋标记部分、纳米颗粒光散射部分以及本领域已知的各种其它信号生成部分中的任一种。合适的酶部分包括，例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。示例性荧光团部分包括，但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸盐、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、绿色荧光蛋白、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿、茋(stilbene)、luciferyellowTM、Cascade BlueTM、Texas RedTM、丹磺酰氯、藻红蛋白、藻蓝蛋白、荧光镧系元素络合物诸如包括铕和铽的那些、Cy3、Cy5、Cy7、Alexa染料以及本领域已知的其它染料，诸如在Principles of Fluorescence Spectroscopy,JosephR.Lakowicz(编辑),Plenum Pub Corp，第2版(1999年7月)和Richard P.Hoagland的MolecularProbes Handbook的第6版中描述的那些染料。
第二标记物可用于本公开的方法中。第二标记物是可与配偶体部分特异性地结合的结合部分。例如，可将配体部分连接至聚合酶、核酸或核苷酸，以允许通过对标记的受体的特异性亲和力进行检测。在本文所述的方法中不需要检测二级标记物。例如，二级标记物可以是位于引物的3’末端并与分子(例如受体)结合的部分(例如配体)，使得结合的分子抑制在标记的引物的3’末端处形成三元复合物。可使用的示例性结合部分对包括但不限于抗原和免疫球蛋白或其活性片段，诸如FAb；免疫球蛋白和免疫球蛋白(或分别的活性片段)；抗生物素蛋白和生物素，或其对抗生物素蛋白具有特异性的类似物；链霉抗生物素蛋白和生物素，或其对链霉抗生物素蛋白具有特异性的类似物；或碳水化合物和凝集素。可附接至核苷酸或引物的一类特别有用的表位是可针对其产生抗体(或其功能片段)以产生三元复合物抑制剂的肽。
在一些实施方案中，第二标记物可以是化学上可修饰的部分。在该实施方案中，具有反应性官能团的标记物可掺入稳定的三元复合物中。随后，官能团可与初级标记部分共价反应。合适的官能团包括但不限于氨基、羧基、马来酰亚胺基、氧代基和巯基。用于点击化学的官能团及其合成和使用的相关方法也可以是有用的。有用的点击化学试剂和方法阐述于美国专利第6,737,236号、第7,375,234号、第7,427,678号和第7,763,736号中，所述美国专利的每一篇通过引用并入本文。
在替代实施方案中，三元复合物可以缺乏外源标记物。例如，三元复合物和参与三元复合物的所有组分(例如聚合酶、模板核酸、引物和/或同源核苷酸)可缺乏本文描述的或上文并入的参考文献中描述的一个、几个或所有外源标记物。在此类实施方案中，可基于稳定的三元复合物的固有性质，诸如质量、电荷、固有光学性质等，来检测所述三元复合物。用于检测非标记的三元复合物的示例性方法阐述于共同拥有的美国专利申请公布第2017/0022553A1号、PCT申请序列第PCT/US16/68916号(公布为WO 2017/117243)或美国专利申请序列第62/375,379号或第15/677,870号(公布为美国专利申请公布第2018/0044727A1号)中，所述美国专利申请每一篇通过引用并入本文。
通常，检测可以在检查步骤中通过感知三元复合物或附接至其上的标记部分的固有性质的方法来实现。检测可基于的示例性性质包括但不限于质量、电导率、能量吸收率、发光等。发光的检测可使用本领域已知的与核酸阵列相关的方法来进行。发光体可基于多种发光特性中的任一种来检测，所述发光性质包括例如发射波长、激发波长、荧光共振能量转移(FRET)强度、淬灭、各向异性或寿命。可用于本文阐述的方法中的其它检测技术包括，例如，可用于感知质量的质谱法；可用于感知在表面上结合的表面等离子共振术；可用于感知标记物吸收的能量的波长的吸光度；可用于感知由于标记物的存在而引起的温度变化的量热法；可用于感知标记物的电特性的电导率或阻抗，或者其它已知的分析技术。可用于产生、操纵和检测稳定的三元复合物的试剂和条件的实例包括，例如，阐述于共同拥有的美国专利申请公布第2017/0022553A1号；PCT申请序列第PCT/US16/68916号(公布为WO 2017/117243)、或美国专利申请序列第15/677,870号(公布为美国专利申请公布第2018/0044727A1号)、美国专利申请序列第15/581,383号(公布为美国专利申请公布第2018/0187245A1号)；美国专利申请序列第第15/873,343号(公布为美国专利申请公布第2018/0208983A1号)；美国专利申请序列第62/450,397号或美国专利申请序列第62/506,759号)中，所述专利申请的每一篇通过引用并入本文。
本文阐述的方法的一些实施方案利用两种或更多种可区分的信号来彼此区分稳定的三元复合物和/或区分模板核酸中的一种碱基类型与另一种碱基类型。例如，可以基于独特的光学特性(诸如独特的激发波长或独特的发射波长)来彼此区分两种或更多种发光体。在特定实施方案中，方法可基于发光强度的差异来区分不同的稳定的三元复合物。例如，可在其中第一三元复合物比第二三元复合物发射更低强度的条件下检测第一三元复合物。这种强度缩放(有时称为“灰度缩放”)可利用任何可区分的强度差异。示例性差异包括特定的稳定的三元复合物具有与待检测的另一种稳定的三元复合物的强度相比为至多10％、25％、33％、50％、66％或75％的强度。
例如，强度差异可由使用不同的发光体产生，每种发光体具有不同的消光系数(即，导致不同的激发特性)和/或不同的发光量子产率(即，导致不同的发射特性)。或者，可使用相同的发光体类型，但其可以以不同的量存在。例如，第一三元复合物群体的所有成员都可用特定的发光体标记，而第二群体只有一半成员用所述发光体标记。在本示例中，第二群体预期将产生第一群体的一半信号。可以例如通过使用标记的核苷酸和未标记的核苷酸的混合物(与主要包含标记的核苷酸的第一群体相反)来产生第二群体。类似地，第二群体可以例如通过使用标记的聚合酶和未标记的聚合酶的混合物(与主要包含标记的聚合酶的第一群体相反)来产生。在替代标记方案中，第一三元复合物群体可包括具有多种产生特定发光信号的标记物的聚合酶分子，第二三元复合物群体可包括各自仅具有产生发光信号的标记物中的一种的聚合酶分子。
在一些实施方案中，检查步骤以推定至少一种核苷酸类型的身份的方式进行，例如，如共同拥有的美国专利第9,951,385号或美国专利申请序列第15/922,787号(作为美国专利第10,161,003号授予的)(其每一篇均通过引用并入本文)中所阐述的。作为使用插补的替代或补充，检查步骤可使用消歧来鉴定一种或多种核苷酸类型，例如，如共同拥有的美国专利第9,951,385号或美国专利申请序列第15/922,787号(作为美国专利第10,161,003号授予的)(其每一篇均通过引用并入本文)中所阐述的。
多种聚合酶中的任一种都可用于本文阐述的方法或装置中，例如以形成稳定的三元复合物或进行引物修饰。可使用的聚合酶包括天然存在的聚合酶及其修饰变体，包括但不限于突变体、重组体、融合体、遗传修饰体、化学修饰体、合成物和类似物。天然存在的聚合酶及其修饰变体不限于具有催化聚合反应能力的聚合酶。任选地，天然存在的和/或其经修饰的变体具有在至少一种条件下催化聚合反应的能力，所述条件在稳定的三元络合物的形成或检查期间不使用。任选地，参与稳定的三元络合物的天然存在和/或经修饰的变体具有改良的性质，例如，对核酸的增强的结合亲和力、对核酸的降低的结合亲和力、对核苷酸的增强的结合亲和力、对核苷酸的降低的结合亲和力、针对下一个正确核苷酸的增强的特异性、针对下一个正确核苷酸的降低的特异性、降低的催化速率、催化失活等。突变型聚合酶包括，例如，其中一个或多个氨基酸被其它氨基酸或一个或多个氨基酸的插入或缺失替代的聚合酶。可用于形成稳定的三元复合物的示例性聚合酶突变体包括，例如，美国专利申请序列第15/866,353号(公布为美国专利申请公布第2018/0155698A1号；美国专利申请公布第2017/0314072或序列为16/567,476的美国专利申请公布)中阐述的那些，所述美国专利申请序列或美国专利申请公布的每一篇均通过引用并入本文。
经修饰的聚合物包括含有可用于检测聚合酶的外源标记部分(例如，外源荧光团)的聚合酶。任选地，可以在已使用蛋白质分离技术至少部分纯化聚合酶后附接标记部分。例如，可使用聚合酶的游离巯基或游离胺部分共价地连接外源标记部分与聚合酶。这可涉及通过半胱氨酸残基的侧链或通过N末端的游离氨基与聚合酶的共价键联。外源标记部分还可通过蛋白质融合附接至聚合酶。可通过蛋白质融合附接的示例性标记部分包括例如绿色荧光蛋白(GFP)、藻胆蛋白(例如，藻蓝蛋白和藻红蛋白)或者GFP或藻胆蛋白的波长偏移变体。在一些实施方案中，聚合酶上的外源标记物可以作为FRET对的成员发挥作用。FRET对的另一个成员可以是附接至核苷酸的外源标记物，所述核苷酸与稳定的三元复合物中的聚合酶结合。因此，稳定的三元复合物可通过FRET检测或鉴定。
或者，参与稳定的三元复合物或用于修饰引物的聚合酶不需要附接至外源标记物。例如，聚合酶不需要共价附接至外源标记物。相反，聚合酶可以没有任何标记，直至其与标记的核苷酸和/或标记的核酸(例如标记的引物和/或标记的模板)结合。
可在本文所阐述的方法中利用聚合酶的不同活性。聚合酶可用于例如引物修饰方法，诸如引物延伸步骤或引物加帽步骤、检查步骤或其组合。不同的活性可以由结构的差异产生(例如，通过天然活性、突变或化学修饰)。然而，聚合酶可以从各种已知来源获得，并根据本文阐述的教导和公认的聚合酶活性来应用。有用的DNA聚合酶包括但不限于细菌DNA聚合酶、真核DNA聚合酶、古生菌DNA聚合酶、病毒DNA聚合酶和噬菌体DNA聚合酶。细菌DNA聚合酶包括大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I、II和III、IV和V、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段、粪堆梭菌(Clostridium stercorarium)(Cst)DNA聚合酶、热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)(Cth)DNA聚合酶和硫磺矿硫化叶菌(Sso)DNA聚合酶。真核DNA聚合酶包括DNA聚合酶α、β、γ、δ、€、η、ζ、λ、σ、μ和к，以及Revl聚合酶(末端脱氧胞苷基转移酶)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。病毒DNA聚合酶包括T4DNA聚合酶、phi-29DNA聚合酶、GA-1、phi-29样DNA聚合酶、PZA DNA聚合酶、phi-15DNA聚合酶、Cpl DNA聚合酶、Cp7 DNA聚合酶、T7DNA聚合酶和T4聚合酶。其它有用的DNA聚合酶包括热稳定性和/或嗜热DNA聚合酶，例如水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶、丝状栖热菌(Thermusfiliformis)(Tfi)DNA聚合酶、Thermococcus zilligi(Tzi)DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(Tth)DNA聚合酶、黄栖热菌(Thermusflavusu)(Tfl)DNA聚合酶、沃氏火球菌(Pyrococcuswoesei)(Pwo)DNA聚合酶、激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)(Pfu)DNA聚合酶和Turbo PfuDNA聚合酶、滨海嗜热球菌(Thermococcus litoralis)(Tli)DNA聚合酶、火球菌属某种GB-D(Pyrococcus sp.GB-D)聚合酶、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)(Tma)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bst)DNA聚合酶、超嗜热火球菌(PyrococcusKodakaraensis)(KOD)DNA聚合酶、Pfx DNA聚合酶、热球菌属某种JDF-3(Thermococcus sp.JDF-3)(JDF-3)DNA聚合酶、古股纳斯热球菌(Thermococcus gorgonarius)(Tgo)DNA聚合酶、嗜酸热球菌(Thermococcusacidophilium)DNA聚合酶、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)DNA聚合酶、热球菌属某种go N-7(Thermococcus sp.go N-7)DNA聚合酶、隐蔽热网菌(Pyrodictiumoccultum)DNA聚合酶、沃氏甲烷球菌(Methanococcus voltae)DNA聚合酶、热自养甲烷球菌(Methanococcus thermoautotrophicum)DNA聚合酶、詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)DNA聚合酶、硫还原球菌属(Desulfurococcus)菌株TOK DNA聚合酶(D.TokPol)；激烈火球菌DNA聚合酶、极端嗜热火球菌(Pyrococcus horikoshii)DNA聚合酶、冰岛火球菌(Pyrococcus islandicum)DNA聚合酶、烟生热球菌(Thermococcusfumicolans)DNA聚合酶、敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)DNA聚合酶和异二聚体DNA聚合酶DP1/DP2。工程化和经修饰的聚合酶也可与所公开的技术结合使用。例如，可使用极端嗜热海洋古菌热球菌属种9°N的改良形式(例如，来自New England BioLabs Inc.；Ipswich,MA的TherminatorDNA聚合酶)。其它有用的DNA聚合酶，包括3PDX聚合酶，公开于U.S.8,703,461(其公开内容通过引用并入本文)中。
有用的RNA聚合酶包括但不限于病毒RNA聚合酶，诸如T7RNA聚合酶、T3聚合酶、SP6聚合酶和Kll聚合酶；真核生物RNA聚合酶，诸如RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、RNA聚合酶IV和RNA聚合酶V；以及古生菌RNA聚合酶。
另一种有用类型的聚合酶是逆转录酶。示例性逆转录酶包括，但不限于，来自人免疫缺陷病毒1型(PDB 1HMV)的HIV-1逆转录酶、来自人免疫缺陷病毒2型的HIV-2逆转录酶、来自莫洛尼鼠白血病病毒的M-MLV逆转录酶、来自禽成髓细胞瘤病毒的AMV逆转录酶和维持真核染色体端粒的端粒酶逆转录酶。
对于一些实施方案，具有内在3'-5’校对外切核酸酶活性的聚合酶可以是有用的。基本上缺乏3'-5’校对外切核酸酶活性的聚合酶在一些实施方案中，例如，在大多数基因分型和测序实施方案中也是有用的。核酸外切酶活性的不存在可以是野生型特性或者可以是变体或工程化聚合酶结构赋予的特性。例如，外切负(exo minus)Klenow片段是Klenow片段的突变形式，其缺乏3’-5’校对外切核酸酶活性。Klenow片段及其外切负变体可用于本文阐述的方法或组合物。
在本文的方法或组合物中使用的核酸可以是DNA，诸如基因组DNA、合成DNA、扩增的DNA、互补DNA(cDNA)等。还可使用RNA，诸如mRNA、核糖体RNA、tRNA等。核酸类似物也可在本文中用作模板。因此，本文使用的模板核酸可来源于生物来源、合成来源或扩增产物。本文使用的引物可以是DNA、RNA或其类似物。
特别有用的核酸模板是基因组片段，其各自包括与基因组的一部分相同的序列。基因组片段的群体可覆盖特定基因组的全部或部分序列。例如，基因组片段的群体可包括基因组的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的序列。基因组片段可具有例如与基因组的至少约25个、50个、70个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个或更多个连续核苷酸基本相同的序列。可选地或另外地，基因组片段可具有与基因组的不超过1x 105个、1x 104个、1x 103个、800个、600个、400个、200个、100个、75个、50个或25个连续核苷酸基本相同的序列。基因组片段可以是DNA、RNA或其类似物。
核酸可源自其的示例性生物体包括，例如，来自哺乳动物的那些，诸如啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、有蹄动物、马、羊、猪、山羊、母牛、猫、狗、灵长类动物、人或非人类灵长类动物；植物，诸如拟南芥、玉米、高粱、燕麦、小麦、水稻、芸苔或大豆；藻类，诸如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)；线虫，诸如秀丽隐杆线虫；昆虫，诸如黑腹果蝇、蚊子、果蝇、蜜蜂或蜘蛛；鱼类，诸如斑马鱼；爬行动物；两栖动物，诸如青蛙或非洲爪蟾；盘状网柄菌(dictyostelium discoideum)；真菌，诸如卡氏肺孢子虫(pneumocystis carinii)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)，酵母，酿酒酵母或粟酒裂殖酵母；或者恶性疟原虫。核酸还可源自原核生物，诸如细菌：大肠杆菌(Escherichia coli)、葡萄球菌属(staphylococci)或肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae)；古菌(archae)；病毒，诸如丙型肝炎病毒或人免疫缺陷病毒；或者类病毒。核酸可源自上述生物体的同质培养物或群体，或者可选地来自几个不同生物体的集合，例如，在群落或生态系统中。可使用本领域已知的方法，包括例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第3版，Cold SpringHarborLaboratory,New York(2001)或Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley和Sons,Baltimore,Md.(1998)(其每一篇均通过引用并入本文)中描述的那些来分离核酸。
模板核酸可通过制备方法诸如基因组分离、基因组片段化、基因克隆和/或扩增获得。模板可通过扩增技术诸如聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、多重置换扩增(MDA)等获得。用于分离、扩增和片段化核酸以产生用于阵列分析的模板的示例性方法阐述于美国专利第6,355,431号或第9,045,796号(其每一篇均通过引用并入本文)中。扩增也可使用Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory,New York(2001)或Ausubel等人，CurrentProtocols in MolecularBiology,John Wiley和Sons,Baltimore,Md.(1998)(其每一篇均通过引用并入本文)中阐述的方法来进行。
可用于基于聚合酶的引物延伸步骤的试剂和条件的实例包括，例如，共同拥有的美国专利申请公布第2017/0022553A1或美国专利申请序列第15/677,870号(公布为美国专利申请公布第2018/0044727A1号)、美国专利申请序列第15/851,383号(公布为美国专利申请公布第2018/0187245A1)或美国专利申请公布第2018/0208983A1号(其要求美国专利申请序列第62/450,397和62/506,759的优先权)(所述美国专利申请公布或专利申请序列的每一篇通过引用并入本文)中阐述的那些。用于基于聚合酶的引物延伸的其它有用试剂和条件阐述于Bentley等人，Nature456:53-59(2008)、WO 04/018497、WO 91/06678；WO 07/123744、美国专利第7,057,026号、第7,329,492号、第7,211,414号、第7,315,019号或第7,405,281号和美国专利申请公布第2008/0108082A1号(所述文献、专利和专利申请公布中的每一篇通过引用并入本文)中。
在特定实施方案中，在与引物-模板杂交体形成稳定的三元复合物的步骤之前，将在引物修饰步骤(例如通过添加核苷酸延伸引物或通过添加三元复合物抑制剂部分对引物加帽)中使用的试剂从与引物-模板杂交体的接触中除去。例如，当混合物中的一种或多种类型的核苷酸会干扰后续检查步骤中三元复合物的形成或检测时，去除用于延伸步骤的核苷酸混合物可以是所需要的。类似地，可能需要除去引物修饰步骤中使用的聚合酶或辅因子，以便防止在随后的检测步骤中不想要的催化活性。然而，如果需要，来自延伸步骤的核苷酸可以被除去，而来自延伸步骤的聚合酶被保留并进行到形成三元复合物的步骤。因此，在检查步骤中检测的三元复合物可以包括在先前引物延伸步骤中使用的聚合酶分子。反应组分去除之后可进行洗涤步骤，其中使用惰性流体来清除用于引物修饰的试剂混合物的残留组分的引物-模板杂交体。
试剂去除和洗涤程序可以在本文阐述的各种步骤的任何步骤之间进行。此类程序可用于去除反应容器中或固体载体上存在的一种或多种试剂。例如，试剂去除或洗涤步骤可用于将分离引物-模板杂交体与在三元复合物稳定化条件下与引物-模板杂交体接触的其它试剂分离。在特定实施方案中，通过将目标试剂(诸如引物-模板杂交体)附接至固体载体并从与固体载体的接触中除去流体来促进试剂的分离。可根据需要将本文阐述的一种或多种试剂附接至固体载体或以溶液形式提供，以适合本文所述方法或装置的特定用途。
试剂去除或洗涤程序可用于去除一种或多种试剂，使其不干扰混合物的检查，或者不污染将在之前与第一混合物接触的基板上(或容器中)上形成的第二混合物。例如，可将引物-模板核酸杂交体与聚合酶和至少一种核苷酸类型接触，以在三元复合物稳定化条件下形成第一混合物，并且可以检查第一混合物。任选地，可在检测前进行洗涤，以便除去不参与稳定的三元复合物形成的试剂。可选地或另外地，可在检测步骤之后进行洗涤，以从引物-模板杂交体中除去第一混合物的一种或多种组分。然后，可在三元复合物稳定化条件下，将引物-模板杂交体与聚合酶和至少一种其它核苷酸接触，以形成第二混合物，并且可检查第二混合物的三元复合物形成。如前所述，可在第二次检查之前进行任选的洗涤，以除去不参与稳定的三元复合物形成的试剂。
在特定实施方案中，引物加帽步骤在引物延伸后进行。引物延伸步骤中存在的一种或多种试剂可在引入用于引物加帽步骤的试剂之前去除。例如，可使附接至固体载体的引物-模板核酸杂交体与包含一种或多种聚合酶和一种或多种核苷酸的延伸混合物接触，然后可以从固体载体中除去延伸混合物，然后可将用于对引物加帽的试剂递送至固体载体。可将清洗液在延伸过程与加帽过程之间递送至固体载体。这有助于在递送加帽试剂之前去除延伸混合物中的残留组分。
在替代实施方案中，可使用于引物延伸和引物加帽的试剂同时彼此接触。例如，可使附接至固体载体的引物-模板核酸杂交体与引物修饰混合物接触，所述引物修饰混合物包括一种或多种聚合酶、一种或多种具有可逆终止子部分(即用于延伸引物)的核苷酸和三元复合物抑制剂部分(即用于对非延伸引物加帽)的核苷酸。延伸试剂和加帽试剂不必同时递送至固体载体。相反，试剂可以以系列方式递送，使得它们在进行累积递送后同时存在。可在后续步骤(诸如检查或解封闭步骤)之前移除延伸试剂和加帽试剂。在后续步骤之前，可以任选地采用洗涤来除去残留的延伸试剂和加帽试剂。
如果将检查步骤中存在的核苷酸带入引物修饰方法(诸如引物延伸过程或引物加帽过程)，则可能会导致不必要的副反应，诸如核苷酸掺入反应。因此，可在引物修饰步骤之前采用试剂去除或洗涤步骤。任选地，可例如通过诸如磷酸酶等的酶、通过化学修饰或通过物理技术来修饰游离核苷酸或其它检查试剂或使所述游离核苷酸或其它检查试剂失能。
本文阐述的方法的特定实施方案包括形成包含若干组分的混合物的步骤。例如，可在引物-模板核酸杂交体、聚合酶和一种或多种核苷酸类型之间形成混合物。可将混合物的各组分任何所需顺序递送至容器中，或者可同时递送它们。此外，可将一些组分彼此混合以形成第一混合物，随后使所述第一混合物与其它组分接触以形成更复杂的混合物。以形成包含引物-模板核酸杂交体、聚合酶和多种不同核苷酸类型的混合物的步骤为例，可以理解，在与引物-模板核酸杂交体接触之前，可使所述多种核苷酸中的不同核苷酸类型彼此接触。或者，可将两种或更多种核苷酸类型分别递送至引物-模板杂交体和/或聚合酶。因此，在与第二核苷酸类型接触之前，可使第一核苷酸类型与引物-模板杂交体接触。可选地或另外地，可使第一核苷酸类型在与第二核苷酸类型接触之前与聚合酶接触。
可将稳定的三元复合物，或能够形成(即参与形成)三元复合物的组分附接至固体载体。固体载体可由用于分析生物化学的多种材料中的任一种制成。合适的材料可包括玻璃、聚合材料、硅、石英(熔凝硅石(fused silica))、硼浮法玻璃(borofloat glass)、二氧化硅、硅基材料、碳、金属、光纤或光纤束、蓝宝石或塑料材料。可根据特定用途所需的性质来选择材料。例如，对所需辐射波长透明的材料对于利用该波长的辐射的分析技术是有用的。相反，可能需要选择不透过某一波长的辐射的材料(例如为不透明的、吸收性的或反射性的)。可利用的材料的其它性质是对下游工艺中使用的某些试剂诸如本文阐述的那些的惰性或反应性，或操作的容易性，或低制造成本。
特别有用的固体载体是颗粒，诸如珠粒或微球。珠粒群体可用于稳定的三元复合物群体或能够形成复合物的组分(例如聚合酶、模板、引物或核苷酸)的附接。在一些实施方案中，使用其中每个珠粒具有单一类型的稳定的三元复合物或单一类型的能够形成复合物的组分的配置可能是有用的。例如，可使单个珠粒附接至单一类型的三元复合物、单一类型的引物-模板核酸杂交体、单一类型的引物、单一类型的模板、单一类型的聚合酶或单一类型的核苷酸。或者，不同类型的组分无需逐个珠粒地分开。这样，单个珠粒可以携带多种不同类型的三元复合物、模板核酸、引物、引物-模板核酸杂交体和/或核苷酸。珠粒的组成可以变化，例如，取决于要使用的格式、化学和/或附接方法。示例性珠粒组合物包括用于蛋白质和核酸捕获方法的固体载体和赋予其的化学功能性。此类组合物包括，例如，塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、三聚氰胺、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、顺磁性材料、氧化钍溶胶、碳石墨、二氧化钛、胶乳或交联葡聚糖，诸如SepharoseTM、纤维素、尼龙、交联胶束和TeflonTM，以及在Bangs Laboratories,Fishers Ind的"Microsphere Detection Guide”(其通过引用并入本文)中阐述的其它材料。
颗粒诸如珠粒或微球的几何形状也可对应于各种不同的形式和形状。例如，颗粒可呈对称形状(例如，球形或圆柱形)或不规则形状(例如受控孔隙玻璃)。另外，颗粒可以是多孔的，因此增加了可用于捕获三元复合物或其组分的表面积。本文中使用的珠粒的示例性尺寸范围可以从纳米变化至毫米或者从约10nm变化至1mm。
在特定实施方案中，可以排列珠粒，或以其它方式在空间上区分珠粒。可使用的示例性基于珠粒的阵列包括但不限于可从Illumina,Inc.(San Diego,CA)获得的BeadChipTM阵列或诸如美国专利第6,266,459号、第6,355,431号、第6,770,441号、第6,859,570号或第7,622,294或PCT公布号WO 00/63437(其每一篇均通过引用并入)中描述的那些等的阵列。珠粒可以位于固相载体上的离散位置，诸如孔，由此每个位置容纳单个珠粒。或者，珠粒所在的离散位置可以各自包括多个珠粒，如例如美国专利申请公布第2004/0263923A1号、第2004/0233485A1号、第2004/0132205A1号或第2004/0125424A1号(其每一篇均通过引用并入本文)中所描述的。
如将从上述珠粒阵列实施方案中可认识到的，本公开的方法可以以多重形式进行，由此在本文阐述的方法中并行检测多种不同类型的核酸。尽管也可以使用本文阐述的方法的一个或多个步骤来连续处理不同类型的核酸，但并行处理可以节省成本、节省时间以及提供条件的一致性。本公开的装置或方法可包括至少2种、10种、100种、1x103种、1x 104种、1x 105种、1x 106种、1x 109种或更多种不同的核酸。可选地或另外地，本公开的装置或方法可包括至多1x 109种、1x 106种、1x 105种、1x 104种、1x 103种、100种、10种、2种或更少种的不同核酸。因此，可使本文阐述的可用于装置或方法的各种试剂或产物(例如，引物-模板核酸杂交体或稳定的三元复合物)多重化，以在这些范围内具有不同的类型或种类。阵列中存在的不同核酸可位于阵列的不同特征处。因此，从特征获得的信号将指示特征处存在的特定核酸序列。
可使用的商购可得的阵列的另外实例包括，例如，Affymetrix GeneChipTM阵列。还可根据一些实施方案使用斑点阵列(spotted array)。典型的斑点阵列是可从AmershamBiosciences获得的CodeLinkTM阵列。另一个有用的阵列是使用喷墨打印方法，诸如可从AgilentTechnologies获得的SurePrintTM技术制造的阵列。
其它有用的阵列包括用于核酸测序应用的那些阵列。例如，用于附接基因组片段的扩增子(通常称为簇)的阵列可以是特别有用的。可用于本文的核酸测序阵列的实例包括在以下文献中描述的那些阵列：Bentley等人，Nature 456:53-59(2008),PCT公布号WO 91/06678、WO 04/018497或WO07/123744、美国专利第7,057,026号、第7,211,414号、第7,315,019号、第7,329,492号或第7,405,281号或者美国专利申请公布第2008/0108082号，其每一篇均通过引用并入本文。
可以以在单分子水平或系综水平上提供检测的方式将核酸附接至载体。例如，可以以这样的方式将多种不同的核酸附接至固体载体，即在载体上的一个核核酸分子上形成的单个稳定的三元复合物的可以与在载体的核酸分子上形成的所有相邻的三元复合物区分开来。这样，可以以这样的形式将一种或多种不同的模板附接至固体载体，所述格式以将单分子从固体载体上的所有其它分子解析的方式对每个单分子模板物理隔离并检测。
或者，可针对一个或多个核酸系综进行本公开的方法，系综是具有共同模板序列的核酸群体。系综可包括，例如，至少2个、10个、50个、100个、500个、1000个或更多个具有共同模板序列的核酸。可选地或另外地，系综可包括至多1000个、500个、100个、50个、10个或2个具有共同模板序列的核酸。存在于阵列的特征处的系综可以是克隆的，使得该特征处的基本上所有的核酸具有共同的模板序列。然而，特征不需要包含核酸的克隆群体。相反，特征可包括核酸的混合群体，其中特定模板序列存在于大多数核酸中。例如，具有特定特征的核酸群体可包括至少51％、60％、75％、90％、95％或99％或更多的具有特定模板序列的种类。可在允许群体作为系综被检测的条件下检测具有核酸的非克隆群体的特征，由此从特征获得的总信号代表由非克隆群体产生的信号的平均值。只要污染性核酸作为少数存在于目标特征处，平均信号就可提供表征该特征处的大多数模板核酸的手段。
聚类方法可用于将一个或多个系综附接至固体载体。这样，阵列可具有多个系综，每个系综在该格式中被称为簇或阵列特征。可使用本领域已知的方法诸如桥式扩增或乳液PCR来形成簇。有用的桥式扩增法描述于例如美国专利第5,641,658号或第7,115,400号、或美国专利公开第2002/0055100A1号、第2004/0002090A1号、第2004/0096853A1号、第2007/0128624A1号或第2008/0009420A1号中。乳液PCR法包括，例如，以下文献中描述的方法：Dressman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:8817-8822(2003)、WO 05/010145或美国专利公布第2005/0130173A1号或第2005/0064460A1号，其每一篇均通过引用整体并入本文。另一种用于扩增表面上的核酸的有用方法是滚环扩增(RCA)，例如，如Lizardi等人，Nat.Genet.19:225-232(1998)或US2007/0099208 A1(其每一篇均通过引用并入本文)中所描述的。
在特定的实施方案中，将稳定的三元复合物、聚合酶、引物、模板、引物-模板核酸杂交体或核苷酸附接至流动池表面或流动池中的固体载体。流动池允许通过将溶液进出接触结合载体的三元复合物的流体室来方便地进行流体操作。流动池还提供对流体操纵组分的检测。例如，检测器可以定位成检测来自固体载体的信号，诸如来自由于形成稳定的三元复合物而被募集到固体载体上的标记物的信号。可使用的示例性流动池描述于例如美国专利申请公布第2010/0111768A1号、WO 05/065814或美国专利申请公布第2012/0270305A1号(其每一篇均通过引用并入本文)中。
本公开提供了用于对模板核酸进行测序的方法。所述方法可包括以下步骤：(a)提供多种引物-模板核酸杂交体，其中所述引物具有可延伸的3’末端；(b)使所述多种引物-模板核酸杂交体与以下物质接触：(i)可逆终止的核苷酸，以产生第一亚组的在3’末端处包含可逆终止的核苷酸的引物-模板核酸杂交体，和(ii)三元复合物抑制剂，以产生第二亚组的包含三元复合物抑制剂的引物-模板核酸杂交体；(c)形成三元复合物，所述三元复合物各自包括聚合酶、第一亚组的引物-模板核酸杂交体和同源核苷酸；(d)检测三元复合物，从而鉴定模板核酸中的核苷酸；(e)使第一亚组中的引物-模板核酸杂交体3’末端处的可逆终止的核苷酸解封闭；以及(f)重复步骤(b)至(e)以对第一亚组中的模板核酸进行测序。
当包括在本文阐述的方法中时，解封闭过程可促进引物-模板核酸杂交体的测序。解封闭过程可用于将可逆终止的引物转化为可延伸的引物。然后可使用引物延伸将三元复合物形的成位点沿模板核酸移动到不同位置。延伸、检查和解封闭的重复循环可用于揭示模板核酸的序列。每个循环显示模板核酸中的后续碱基。示例性可逆终止子部分、将它们掺入引物的方法和修饰引物以进一步延伸的方法(通常称为“解封闭”)阐述于美国专利第7,427,673号、第7,414,116号、第7,544,794号、第7,956,171号、第8,034,923号、第8,071,755号、第8,808,989号或第9,399,798号中。其它实例阐述于Bentley等人，Nature456:53-59(2008)、WO 04/018497、美国专利第7,057,026号、WO 91/06678、WO 07/123744、美国专利第7,329,492号、美国专利第7,211,414号、美国专利第7,315,019号、美国专利第7,405,281号和US2008/0108082，所述专利或文献的每一篇通过引用并入本文。
经修饰以阻碍或排除三元复合物的后续形成的引物无需进行处理以逆转修饰。因此，加帽的引物可在循环方法诸如测序方法的几个循环(以及在一些情况下，所有循环)中保持加帽。例如，循环过程可包括对可逆终止的引物解封闭的过程，并且加帽的引物可对解封闭过程呈惰性。
测序方法可包括如本文阐述的多次重复的循环或循环内的步骤。例如，检查和引物修饰步骤可以重复多次，在各个步骤之间对引物解封闭或洗去不想要的反应物或产物的任选步骤也可以重复多次。因此，引物-模板核酸杂交体可经历至少2个、5个、10个、25个、50个、100个、150个、200个或更多个重复循环的本文阐述的方法。当需要更短的读取长度时，可以执行更少的循环。因此，引物-模板核酸杂交体可经历至多200个、150个、100个、50个、25个、10个、5个或2个循环的本文阐述的方法。循环数的上述范围可适用于本文阐述的其它测序过程，诸如下文阐述的循环可逆终止子过程。
在一些实施方案中，可将测序方法进行预定次数的重复循环。或者，可以重复所述循环，直至达到特定的经验观察状态。例如，只要信号高于可观察阈值、噪声低于可观察的阈值或者信噪比高于可观察的阈值，就可以重复循环。
在另一个实例中，只要一个或多个系综(例如，阵列中的一个或多个簇或特征)具有期望的组成，就可重复循环。随着一个或多个系综进行整个测序循环，其组成可发生变化。将单个系综视为一组模板核酸，各自具有在3’端具有可逆终止的核苷酸的引物的模板的第一亚组的数目可以随着循环的进行而减少，并且各自具有具有三元复合物抑制剂的引物(或各自没有引物)的模板核酸的第二亚组的数目可以随着循环的进行而增加。所述测序方法可以继续，直至第一亚组达到特定阈值和/或直至第二亚组达到特定阈值。更具体地，可以重复所述循环，直至第一亚组中引物-模板核酸杂交体的数目少于所检测的多种模板核酸的99％、90％、80％、70％、60％或51％。可选地或另外地，只要第一亚组中引物-模板核酸杂交体的数目是所检测的多种模板核酸的至少50％、60％、70％、80％、90％或99％，就可重复所述循环。在一些实施方案中，可重复所述循环直至第二亚组中的模板核酸的数目为所检测的多种模板核酸的至多1％、10％、20％、30％、40％、50％或更多。可选地或另外地，只要所述第二亚组中的模板核酸的数目是所检测的多种模板核酸的至少50％、40％、30％、20％、10％或1％，就可重复所述循环。
应当理解，并非本文阐述的所有步骤都需要重复，重复的步骤也不需要在每次重复中以相同的顺序发生。
本公开提供了用于以使得核酸模板可以与可能存在的其它模板区分开来的方式鉴定核酸模板的方法。这种区分可以通过对引物-模板杂交体的差异加帽结合随后对优先在非加帽的引物上形成的三元复合物的检测来实现。更具体来说，样品中的一种或多种引物-模板杂交体可以用三元复合抑制剂来进行加帽，而样品中的目标引物-模板杂交体可以不存在抑制剂。因此，在形成三元复合物的条件下，将聚合酶和核苷酸递送至样品，并随后检测形成的复合物，将导致优先检测非加帽的引物-模板杂交体，因为加帽的杂交体将被抑制形成可检测的三元复合物。
引物加帽过程可用于在随后的检查步骤中去除不想要的核酸3’末端，使其不能作为可检测的“引物”。例如，核酸样品可以含有假引物末端(组成已知或未知的)，在将目标引物引入样品之前，可对这些末端加帽。不想要的核酸3’末端可以包括由样品中的引物或核酸分子形成的发夹。不想要的3’末端也可因引物错误地结合到样品中不期望的核酸分子(换句话说，错误引发的引物)上而产生的。通过对不想要的核酸3’末端加帽，随后的检查步骤然后将从目标引物产生信号，而没有来自假引物末端的显著背景信号。
因此，本公开提供了用于鉴定核酸模板的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供多种核酸，所述多种核酸包括引物-模板杂交体；(b)用三元复合物抑制剂部分对引物进行加帽，从而形成加帽的引物-模板杂交体；(c)将引物与所述多种核酸的第二模板杂交，由此所述多种核酸包括加帽的引物-模板杂交体和第二引物-模板杂交体；(d)将聚合酶和核苷酸递送至多种核酸，由此第二引物-模板杂交体结合聚合酶和核苷酸以形成稳定的三元复合物，并且由此加帽的引物-模板杂交体不结合聚合酶和核苷酸以形成稳定的三元复合物；以及(e)检测稳定的三元复合物以鉴定第一模板。该方法可以任选地还包括以下步骤：(f)延伸第二引物以在核酸上形成经修饰的第二杂交体；以及(g)对核酸的经修饰的第二杂交体重复(d)、(e)和(f)，从而确定第二模板的至少一部分的序列。
选择性引物加帽也可用于对较大核酸分子的配对区域进行测序，以确定基因组中两个区域之间的结构关系。选择性引物加帽也可以允许对靶序列和相关标签序列进行单独测序。示例性标签包括但不限于附加到靶序列上以鉴定靶序列来源的核酸序列(即，特定标签序列被唯一地附加至从特定细胞、组织或其它样品中收获的靶核酸)。标签也可用于将样品提取和制备程序过程中引入的错误与生物学上(例如临床上)感兴趣的突变或多态性区分开来。此类标签通常被称为唯一分子标识符(UMI)。
因此，用于鉴定核酸模板的方法可以包括以下步骤：(a)提供多种引物-模板杂交体，其中所述多种杂交体中的第一杂交体包括与第一引物杂交的第一模板，并且其中所述多种杂交体中的第二杂交体包括与第二引物杂交的第二模板，第二引物在3’末端具有三元复合物抑制剂部分；(b)将聚合酶和核苷酸递送至所述多种杂交体，由此第一杂交体结合聚合酶和核苷酸以形成稳定的三元复合物，并且由此第二杂交体不结合聚合酶和核苷酸以形成稳定的三元复合物；以及(c)检测稳定的三元复合物以鉴定第一模板。
通常，对于被配置成使用多种引物-模板杂交体的方法，第一模板可以具有不同于第二模板的核苷酸序列。然而，在一些配置中，第一和第二模板没有不同的核苷酸序列。无论两种或更多种引物-模板杂交体的模板在序列上是否不同，引物都可以具有彼此不同的序列，或者，引物可以具有相同的序列。例如，两种或更多种引物-模板杂交体可以具有相同的引物结合位点序列，使得共同的引物与两个引物结合位点杂交。当然，两种不同的引物可以共享共同的序列(即共同引物结合位点的互补序列)，并且这两种引物在其序列的其它地方可以不同。例如，两种引物的5’端可以具有不同的序列，诸如不同的标签序列或其它引物的不同结合位点。
在本文方法的一些配置中，第一模板和第二模板存在于单独的核酸分子上。例如，第一模板可以是第一核酸分子的全部或部分，并且第二模板可以是第二核酸分子的全部或部分，第一核酸分子缺少第二模板，并且第二核酸分子缺少第一模板。因此，本公开的方法可用于与第二核酸分子相比可区分地鉴定第一核酸分子。单独的分子可以存在于溶液中，也可以附着在固相上。例如，单独的分子可以附着至阵列的不同特征上。
或者，第一和第二模板可以存在于同一核酸分子上。例如，第一模板可以是核酸分子的一条链上的第一区域，并且第二模板可以是链上第一区域上游或下游的第二区域。在另一种配置中，引物与之杂交的第一模板区域可以位于双链核酸分子的第一链上，并且第二引物与之杂交的第二模板区域可以位于双链核酸分子的第二链上。因此，本公开的方法可用于与核酸分子上的第二模板区域相比可区分地鉴定核酸分子的第一模板区域。
三元复合物抑制剂部分可以以本文阐述的多种方式中的任一方式添加到引物或其它核酸中。例如，可在将引物与模板杂交之前，向引物中添加三元复合物抑制剂部分。例如，三元复合物抑制剂部分可以通过合成技术添加。或者，可以将前体引物与模板杂交，然后将前体引物修饰成含有三元复合物抑制剂部分。任选地，可将前体引物延伸以掺入含有配体的核苷酸，然后配体可以结合至作为三元复合物形成抑制剂的受体。在一些配置中，掺入具有配体的核苷酸的步骤可以在将其它核苷酸掺入引物前体(诸例如在核酸测序过程中进行的核苷酸掺入步骤)之后进行。
在另一个实例中，引物可具有可与另一种试剂反应形成三元复合物抑制剂部分的化学修饰部分。引物可以在与模板杂交之前具有化学可修饰部分，或者，在引物与模板杂交之后，引物可被延伸以掺入具有化学可修饰部分的核苷酸。随后，化学可修饰部分可以共价反应，以将三元复合物抑制剂与引物连接。合适的化学可修饰部分可以包括诸如氨基、羧基、马来酰亚胺基、氧代基或巯基等官能团。用于点击化学的官能团及其合成和使用的相关方法也可以是有用的。US专利第6,737,236号、第7,375,234号、第7,427,678号和第7,763,736号(所述专利中的每一项通过引用并入本文)中阐述了有用的点击化学试剂和方法。
在特定配置中，可以从核酸(例如引物或引物延伸产物)中去除三元复合物抑制剂，以允许随后通过三元复合物的形成来检测核酸并且/或者允许随后延伸引物。例如，用于鉴定核酸模板的方法可以包括以下步骤：(a)提供多种引物-模板杂交体，其中所述多种杂交体中的第一杂交体包括与第一引物杂交的第一模板，并且其中所述多种杂交体中的第二杂交体包括与第二引物杂交的第二模板，第二引物在3’末端具有三元复合物抑制剂部分；(b)将聚合酶和核苷酸递送至所述多种杂效体，由此第一杂交体结合聚合酶和核苷酸以形成稳定的三元复合物，并且由此第二杂交体不结合聚合酶和核苷酸以形成稳定的三元复合物；(c)检测稳定的三元复合物以鉴定第一模板；(d)从第二引物中除去三元复合物抑制剂部分；以及(e)在第二杂交体上形成第二稳定的三元复合物或延伸第二引物。
两种或更多种不同类型的三元复合抑制剂可用于本文阐述的方法中。例如，可以使用正交处理去除不同的抑制剂。所述处理被认为是正交的，达到去除第一类型的抑制剂的处理不去除第二类型的抑制剂的程度。任选地，正交性也可以包括相反的情况，由此去除第二类型的抑制剂的处理不去除第一类型的抑制剂。例如，用于鉴定核酸模板的方法可以包括以下步骤：(a)提供多种引物-模板杂交体，其中多种杂交体中的第一杂交体包括与第一引物杂交的第一模板，并且其中多种杂交体中的第二杂交体包括与第二引物杂交的第二模板，第二引物在3’末端具有三元复合物抑制剂部分；(b)将聚合酶和核苷酸递送至所述多种杂交体，由此第一杂交体结合聚合酶和核苷酸以形成稳定的三元复合物，并且由此第二杂交体不结合聚合酶和核苷酸以形成稳定的三元复合物；(c)检测稳定的三元复合物以鉴定第一模板；(d)将第二三元复合物抑制剂部分连接至第一引物；(e)从第二引物中除去三元复合物抑制剂部分，同时将第二三元复合物抑制剂部分保留在第一引物上；以及(f)在第二杂交体上形成第二稳定的三元复合物或延伸第二引物。
可以利用两种三元复合抑制剂之间的各种差异中的任一差异来提供去除它们的正交方法。在一些配置中，差异去除可以利用抑制剂与引物之间的键联的差异。例如，不同的抑制剂可以通过与不同切割处理反应的可切割接头连接。不同处理的实例包括用酶、亲核/碱性试剂、还原剂、光照射、亲电/酸性试剂、有机金属和金属试剂、氧化剂进行的切割。第一种接头可以与第一类处理反应，并且对第二类是惰性的，有用的正交接头可以是对第一类处理是惰性的并且对第二类是反应性的接头。应当理解，正交性可以存在于上述类别中。例如，第一接头可与第一种酶(例如具有第一识别序列的蛋白酶)反应，第二接头可与第二种酶(例如具有第二识别序列的蛋白酶)反应，其中第一种酶和第二种酶对各自的序列是特异性的。可使用的接头和切割处理的实例在Leriche等人Bioorganic&MedicinalChemistry 20(2):571-582(2012)中进行了阐述，所述文献通过引用并入本文。
两种三元复合物抑制剂(所述三元复合物抑制剂可被利用来提供去除它们的正交方法)之间的另一种差异是受体对配体的特异性。例如，链霉抗生物素蛋白可以通过对生物素类似物的亲和力连接至第一引物，抗体可以通过对表位的亲和力连接至第二引物。第二引物可以通过使用与溶液中的游离表位的竞争洗脱抗体而正交脱帽。类似地，可通过经由与溶液中的生物素类似物的竞争洗脱链霉抗生物素蛋白来对第一引物正交脱帽。
用于去除三元复合抑制剂的另外的正交方法是利用化学稳定性的差异。例如，链霉抗生物素蛋白是众所周知的稳定蛋白，其可在使抗体和其它受体变性的条件下仍能保持结合功能。因此，可以采用相对温和的变性条件从第一引物中除去抗体，同时保留第二引物上的链霉抗生物素蛋白。
本公开的方法可用于确定核酸模板的序列。例如，该方法可以包括以下步骤：(a)提供多种引物-模板杂交体，其中所述多种杂交体中的第一杂交体包括与第一引物杂交的第一模板，并且其中所述多种杂交体中的第二杂交体包括与第二引物杂交的第二模板，第二引物在3’末端具有三元复合物抑制剂部分；(b)将聚合酶和核苷酸递送至所述多种杂交体，由此第一杂交体结合聚合酶和核苷酸以形成稳定的三元复合物，并且由此第二杂交体不结合聚合酶和核苷酸以形成稳定的三元复合物；(c)检测稳定的三元复合物以鉴定第一模板；以及(d)使所述多种引物-模板杂交体与引物延伸试剂接触，由此通过延伸第一引物而不是第二引物来修饰所述多种引物-模板杂交体。任选地，所述步骤可以以循环方式(例如，通过对经修饰的多种引物-模板杂交体重复(b)、(c)和(d))进行，从而确定第一模板的至少一部分的序列。
用于对核酸的两个模板区域进行测序的示例性方法如图3A至图3E所示。如图3A所示，第一引物可以与第一模板区域(由黑色区域指示的)杂交，并且如图3B所示，引物可以在对第一模板区域测序的同时延伸。一旦第一个模板区域的测序过程完成，引物就可以用三元复合物抑制剂(由灰色八边形指示的)进行加帽，如图3C所示。如图3D所示，第二引物可以与第二区域(由灰色区域指示的)杂交，然后第二引物可以在对第二模板区域测序的过程中延伸。以这种方式使用三元复合物抑制剂的有利方面是，当对第二模板区域测序采用第二引物的三元复合物的形成时，不需要从样品中除去第一引物，以防止不想要的背景。应当理解，同一核酸分子上模板区域的存在是示例性的。当第一模板区域和第二模板区域位于样品中单独的核酸上时，可以类似地采用该方法。
本公开提供了用于对核酸中的两个模板区域进行测序的方法。该方法可以包括以下步骤：(a)沿着核酸的第一模板区域延伸引物，从而确定第一模板的至少一部分的序列；(b)用三元复合物抑制剂部分对延伸的引物进行加帽，从而在核酸上形成加帽的引物-模板杂交体；(c)将第二引物与核酸的第二模板区域杂交以形成包含加帽的引物-模板杂交体和第二引物-模板杂交体的核酸；以及(d)进行测序过程，其包括：(i)将第二杂交体与聚合酶和核苷酸结合以形成稳定的三元复合物；(ii)检测稳定的三元复合物以鉴定稳定的三元复合物中的核苷酸；(iii)延伸第二引物以在核酸上形成经修饰的第二杂交体；以及(iv)对核酸的经修饰的第二杂交体重复(i)、(ii)和(iii)，从而确定第二模板区域的至少一部分的序列。
多种测序技术中的任一种都可用于本文阐述的方法中，例如，在上述方法的步骤(a)中。任选地，上述方法的步骤(a)可以包括以下步骤：(i)将引物与核酸的模板区杂交以形成第一引物模板杂交体；(ii)将第一杂交体与聚合酶和核苷酸结合以形成第二稳定的三元复合物；(iii)检测第二稳定的三元复合物以鉴定第二稳定的三元复合物中的核苷酸；(iv)沿着核酸的第一模板区域延伸引物，以在核酸上形成经修饰的第一杂交体；以及(v)对核酸的经修饰的第一杂交体重复(ii)、(iii)和(iv)，从而确定第一模板区域的至少一部分的序列。
其它有用的测序过程包括，例如，采用试剂递送的重复循环的循环过程。每个循环可以包括一个步骤或多个步骤。例如，每个循环可以包括检测模板核酸中单个核苷酸位置所需的所有步骤。一些测序过程采用循环可逆终止子(CRT)化学，其中每个循环包括以下步骤：(i)添加单个可逆终止的核苷酸，以将新生引物增加到待检测的核苷酸位置；(ii)检测单核苷酸位置处的核苷酸，以及(iii)对新生引物解封闭以允许返回步骤(i)以开始后续循环。例如，用于执行步骤(a)的测序过程的上述选择可以使用可逆终止的核苷酸进行延伸并在每个循环中使用解封闭步骤来进行。
有用的CRT测序过程是合成测序SBS通常涉及新生引物的酶促延伸，通过针对与引物杂交的模板链重复添加核苷酸。简言之，SBS可以通过将靶核酸与一个或多个标记的核苷酸、DNA聚合酶等接触来引发。使用靶核酸作为模板延伸的引物将掺入可检测的标记的核苷酸。任选地，标记的核苷酸还可括可逆终止子，一旦核苷酸被添加到引物中，该终止子终止进一步的引物延伸。例如，可以将具有可逆终止子部分的核苷酸类似物添加到引物中，使得在解封闭剂被递送以去除该部分之前不会发生后续延伸。因此，对于使用可逆终止的实施方案，可以将解封闭试剂递送至血管(在检测发生之前或之后)。洗涤可以在不同的递送步骤之间进行。该循环可进行n次，以将引物延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。可容易地适用于本公开的方法、系统或设备的示例性SBS程序、试剂和检测组分描述于，例如，Bentley等人，Nature 456:53-59(2008)、WO 04/018497、WO91/06678、WO07/123744、美国专利第7,057,026号、第7,329,492号、第7,211,414号、第7,315,019号或第7,405,281号以及美国专利申请公布第2008/0108082 A1号中，所述文献中的每一份通过引用并入本文。
一些SBS实施方案不使用可逆终止子核苷酸。特别有用的方法包括检测核苷酸掺入延伸产物时释放的质子。例如，基于释放的质子的检测的测序可以使用试剂和电检测器，所述试剂和电检测器可从Thermo Fisher(Waltham,MA)商购获得或描述于美国专利申请公布第2009/0026082 A1号、第2009/0127589 A1号、第2010/0137143 A1号或第2010/0282617A1号中，所述文献中的每一篇通过引用并入本文。
可以使用其它循环测序过程，诸如焦磷酸测序。焦磷酸测序检测无机焦磷酸(PPi)的释放，因为核苷酸被掺入与模板核酸链杂交的新生引物中(Ronaghi等人，AnalyticalBiochemistry 242(1),84-9(1996)；Ronaghi,Genome Res.11(1),3-11(2001)；Ronaghi等人Science 281(5375),363(1998)；美国专利第6,210,891号、第6,258,568号和第6,274,320号，所述文献中的每一篇通过引用并入本文)。在焦磷酸测序中，释放的PPi可以通过被ATP硫酸化酶转化为三磷酸腺苷(ATP)来检测，并且所得的ATP可以通过荧光素酶产生的光子来检测。
连接测序反应也是有用的，包括例如Shendure等人Science309:1728-1732(2005)；美国专利第5,599,675号或美国专利第5,750,341中描述的那些，所述文献中的每一篇通过引用并入本文。一些实施方案可包括例如在Bains等人JournalofTheoreticalBiology135(3),303-7(1988)；Drmanac等人，Nature Biotechnology 16,54-58(1998)；Fodor等人，Science 251(4995),767-773(1995)；或WO 1989/10977(所述文献中的每一篇通过引用并入本文)中描述的杂交测序程序。在连接测序和杂交测序程序中，与核酸模板杂交的引物通过寡核苷酸连接进行重复的延伸循环。典型地，例如，使用本文阐述的系统或方法荧光标记寡核苷酸，并检测以确定模板的序列。
可用于本文阐述的方法中的测序方法的其它实例包括在由以下公司商业化的平台上采用的方法：IlluminaTM,Inc.(例如HiSeqTM、MiSeqTM、NextSeqTM或NovaSeqTM系统)、Life TechnologiesTM(例如ABIPRISMTM或SOLiDTM系统)、Pacific Biosciences(例如使用SMRTTM Technology的系统，诸如SequelTM或RS IITM系统)、MGI Tech(DNBSEQ-T7、MGISEQ-2000、MGISEQ-200或BGISEQ-500)或Qiagen(例如GenereaderTM系统)。
图4A至图4E提供了用于测序方法的另一种配置的示意性实例。图4A显示了具有两个模板区域(分别用黑色和灰色区域指示的)的核酸，每个所述模板区域都与引物杂交。其中一种引物(黑色)用三元复合抑制剂(填充的灰色八角形)进行加帽。如图4B所示，另一种引物(灰色)可以例如在测序过程中被延伸。然后如图4C所示，延伸的引物可用三元复合抑制剂(空心的灰色八边形)进行加帽。黑色引物和延伸的灰色引物上的三元复合物抑制剂可以彼此正交，使得可以从黑色引物上除去帽或以其它方式修饰帽，以使黑色引物能够通过聚合酶或连接酶的催化作用参与三元复合物的形成或延伸。如图4D所示，可使用正交处理将帽从黑色引物上移除，所述正交处理将帽保持在延伸的灰色引物上。然后如图4E所示，黑色引物可以例如在测序过程中被延伸。
因此，对核酸中两个模板区进行测序的方法可以包括以下步骤：(a)提供具有第一引物-模板杂交体和第二引物-模板杂交体的核酸，其中第一杂交体包括与第一引物杂交的第一模板区域，并且其中第二杂交体包括与第二引物杂交的第二模板，第二引物在3’末端具有三元复合物抑制剂部分；(b)进行测序过程，其包括：(i)将第一杂交体与聚合酶和核苷酸结合以形成稳定的三元复合物；(ii)检测稳定的三元复合物以鉴定稳定的三元复合物中的核苷酸；(iii)延伸第一引物以在核酸上形成经修饰的第一杂交体；以及(iv)对核酸的经修饰的第一杂交体重复(i)、(ii)和(iii)，从而确定第一模板区域的至少一部分的序列；(c)用第二三元复合物抑制剂部分对延伸的第一引物进行加帽；(d)从第二引物中除去三元复合物抑制剂部分，同时将第二三元复合物抑制剂部分保留在第一引物上；以及(e)延伸第二引物，从而确定第二模板区域的至少一部分的序列。
上述方法的步骤(e)可以使用多种测序方法中的任一种，包括但不限于上面举例说明的那些。举例来说，步骤(e)可以包括以下步骤：(i)将第二杂交体与聚合酶和核苷酸结合以形成第二稳定的三元复合物；(ii)检测第二稳定的三元复合物以鉴定第二稳定的三元复合物中的核苷酸；(iii)沿着核酸的第二模板区域延伸第二引物以在核酸上形成经修饰的第二杂交体；以及(iv)对核酸的经修饰的第二杂交体重复(i)、(ii)和(iii)，从而确定第二模板区域的至少一部分的序列。
本公开还提供了包含多种引物-模板核酸杂交体的装置，其中所述第一亚组的引物-模板核酸杂交体在所述引物的3’末端具有封闭的核苷酸，并且其中所述第二亚组的引物-模板核酸杂交体在所述引物的3’末端具有三元复合物抑制剂。任选地，封闭的核苷酸可以是可逆终止的核苷酸。在另一种配置中，装置可以包括第一亚组的具有可延伸引物的引物-模板核酸杂交体和第二亚组的具有三元复合物抑制剂部分的引物-模板核酸杂交体。
任选地，在本公开的装置中将多种引物-模板核酸杂交体附着至固体载体上。固体载体可包括本文阐述的各种材料中的任一种，包括例如本文在核酸阵列的背景中阐述的材料。所述多种引物-模板核酸杂交体可以附接至所述阵列的特征，并且任选地，附接至所述特征的模板可具有相同的序列。可将本文阐述的各种试剂中的任一种附接至固体载体而非引物-模板核酸杂交体或者，可选地除了附接至附接的引物-模板核酸杂交体以外，还附接至固体载体。在特定实施方案中，本公开的装置不需要包括任何类型的附接试剂。
在特定实施方案中，本公开的装置包括容器，诸如制造的容器。容器可包含多种引物-模板核酸杂交体以及参与本文阐述的方法的其它试剂或反应产物。特别有用的制造的容器是流动池，其实例阐述于上文中。
本公开的装置可以是更大系统的组分。例如，所述系统可包括(a)包括多种引物-模板核酸杂交体的装置，其中第一亚组的引物-模板核酸杂交体在所述引物的3’末端具有可逆终止的核苷酸，并且其中第二亚组的引物-模板核酸杂交体在所述引物的3’末端具有三元复合物抑制剂；以及(b)配置成检测所述多种引物-模板核酸杂交体的检测器。任选地，所述系统还可包括(c)包含含有聚合酶和核苷酸的储库的流体系统，其中所述储库与所述多种引物-模板核酸杂交体流体连通。在类似的配置中，引物-模板核酸杂交体的第一亚组可以在引物的3’末端具有可延伸的核苷酸，而不是在引物的3’末端具有可逆终止的核苷酸。
本公开的系统可被配置成例如使用本文阐述的方法检测核酸。例如，系统可被配置成产生和检测在核苷酸存在的情况下在聚合酶与引物-模板核酸杂交体之间形成的三元复合物，以鉴定模板核酸序列中的一个或多个碱基。任选地，所述系统包括用于执行本文阐述的一个或多个步骤的组分和试剂，包括但不限于在引物-模板核酸杂交体、聚合酶和下一正确核苷酸之间形成至少一种稳定的三元复合物；检测稳定的一种或多种三元复合物；修饰(例如，通过引物加帽或引物延伸过程)每个引物-模板杂合体的引物；对可逆终止的引物解封闭；从引物除去三元复合物抑制剂；和/或鉴定模板中存在的核苷酸、核苷酸序列或一系列碱基多重体。
本公开的系统可包括用于进行核酸检测方法的容器、固体载体或其它装置。例如，所述系统可包括阵列、流动池、多孔板或其它方便的装置。所述装置可以是可移除的，从而允许将其放入系统或从系统中移除。这样，系统可被配置成顺序或并行地处理多个装置(例如容器或固体载体)。所述系统可包括流体组件，所述流体组件具有用于容纳一种或多种本文阐述的试剂(例如用于形成三元复合物的聚合酶、引物、模板核酸、一种或多种核苷酸、用于引物延伸的核苷酸、解封闭试剂、三元复合物抑制剂或此类组分的混合物)的容器。流体系统可被配置成例如经由通道或液滴转移装置(例如电润湿装置)将试剂递送至容器或固体载体。多种检测装置中的任一种都可被配置成检测与试剂相互作用的容器或固体载体。实例包括发光检测器、表面等离子共振检测器和本领域已知的其它检测器。具有可被容易地修改以用于本文的系统的流体和检测组件的示例性系统包括但不限于美国专利申请公布第2018/0280975A1号(其要求美国专利序列第62/481,289的优先权)、美国专利第8,241,573号、第7,329,860号或第8,039,817号、或美国专利申请公布第2009/0272914A1号或第2012/0270305A1号(其每一篇均通过引用并入本文)中描述的那些。
任选地，本公开的系统还包括被配置为操作系统组件的计算机处理单元(CPU)。相同或不同的CPU可以与系统交互，以获取、存储和处理信号(例如，在本文阐述的方法中检测到的信号)。在特定实施方案中，CPU可用于根据信号确定存在于模板核酸中的特定位置处的核苷酸的身份。在一些情况下，CPU将根据检测到的信号鉴定模板的核苷酸序列。
有用的CPU可包括个人计算机系统、服务器计算机系统、瘦客户机、胖客户机、手持或膝上型设备、多处理器系统、基于微处理器的系统、机顶盒、可编程消费电子产品、网络PC、小型计算机系统、大型计算机系统、智能电话和包括任何上述系统或设备的分布式云计算环境等中的一种或多种。CPU可包括一个或多个处理器或处理单元、可以包括RAM和非易失性存储器的存储器架构。存储器结构还可包括可移动/不可移动、易失性/非易失性计算机系统存储介质。另外，存储器架构可包括一个或多个用于从不可移动、非易失性磁介质读取和向其写入的读取器，诸如硬盘驱动器、用于从可移动、非易失性磁盘读取和向其写入的磁盘驱动器和/或用于从可移动、非易失性光盘读取或向其写入的光盘驱动器，诸如CD-ROM或DVD-ROM。CPU还可包括各种计算机系统可读介质。这种介质可以是云计算环境可访问的任何可用介质，诸如易失性和非易失性介质，以及可移动和不可移动介质。
存储器构架可包括至少一个程序产品，该程序产品具有至少一个被实现为可执行指令的程序模块，该程序模块被配置为执行本文阐述的方法的一个或多个步骤。例如，可执行指令可包括操作系统、一个或多个应用程序、其它程序模块和程序数据。通常，程序模块可以包括例程、程序、对象、组件、逻辑、数据结构等，它们执行本文阐述的特定任务。
CPU的组件可通过内部总线耦合，所述内部总线可被实现为若干类型的总线结构中的任何一种或多种，包括存储器总线或存储器控制器、外围总线、加速图形端口以及使用各种总线架构中的任一种的处理器或本地总线。作为实例而非限制，此类架构包括工业标准架构(ISA)总线、微通道架构(MCA)总线、增强型ISA(EISA)总线、视频电子标准协会(VESA)本地总线和外围部件互连(PCI)总线。
CPU可以任选地与一个或多个外部设备诸如键盘、指向设备(pointing device)(例如鼠标)、显示器(诸如图形用户界面(GUI))或便于与核酸检测系统交互使用的其它设备通信。类似地，CPU可与其它设备通信(例如，通过网卡、调制解调器等)。这种通信可以通过I/O接口进行。此外，本文中的系统的CPU可通过合适的网络适配器与一个或多个网络诸如局域网(LAN)、广域网(WAN)和/或公共网络(例如，因特网)通信。
本公开还提供了用于表征核酸的试剂盒。任选地，试剂盒可包括用于实施本文阐述的一种或多种方法的试剂。例如，试剂盒可包括当与一种或多种引物-模板核酸杂交体混合时用于产生稳定的三元复合物的试剂。除了核苷酸混合物以外，试剂盒还可包括能够形成稳定的三元复合物的聚合酶和/或用于引物修饰步骤的聚合酶。试剂盒中还可包括用于引物修饰的其它试剂，诸如可逆终止的核苷酸或三元复合抑制剂。试剂盒中包括的试剂，诸如一种或多种核苷酸、一种或多种聚合酶或两者，可包括外源标记物，例如，如本文在各种方法的背景中阐述的。
因此，用于实施本文阐述的方法的任何组分或制品都可被有效地包装成试剂盒。例如，试剂盒可被包装成包括一些、许多或所有用于实施本文阐述的方法的组分或制品。示例性组分包括，例如，标记的核苷酸(例如，可延伸的标记的核苷酸)、聚合酶(标记的或未标记的)；具有终止子部分的核苷酸(例如，未标记的、可逆终止的核苷酸)、如本文中和本文引用的参考文献中阐述的解封闭试剂、三元复合物抑制剂等。任何此类试剂可包括，例如，用于实施一个或多个用于分析引发的模板核酸的后续步骤的一些、许多或所有缓冲液、组分和/或制品。试剂盒不需要包括引物或模板核酸。相反，试剂盒的使用者可以提供通过用户与试剂盒组分组合的一种或多种引物-模板核酸杂交体。
试剂盒中还可包含一种或多种辅助试剂。此类辅助试剂可包括上面举例说明的任何试剂和/或可用于实施本文阐述的方法的其它类型的试剂。试剂盒中还可包括说明书。所述说明书可包括，例如，用于制备本文阐述的方法中使用的任何组分或制品、执行本文阐述的方法的任何实施方案的一个或多个步骤的程序，和/或用于使用引物-模板核酸杂交体执行任何后续分析步骤的说明。
在特定实施方案中，试剂盒可包括本文所述的装置，诸如流通池或固体载体。任选地，试剂盒包括盒，所述盒具有用于容纳试剂的容器，并且还具有用于将试剂从容器转移到检测仪器的流体组分。例如，流体组件可被配置成将试剂转移到流动池，在所述流动池中检测稳定的三元复合物。可包含在本公开的试剂盒(或系统)中的示例性流体盒描述于美国专利申请序列第15/922,661号(公布为美国专利申请公布第2018/0280975A1号，其通过引用并入本文)中。
实施例I
使用溢流引物延伸(Run-OffPrimer Extension)进行引物加帽
本实施例演示了在扩增引物群体时改善定相的技术。通过对非延伸引物进行加帽以阻止加帽的引物在后续检查步骤中形成三元复合物，来改善定相。
以多孔板形式使用采用生物层干涉法测量光纤吸头表面的结合反应的(Menlo Park,CA)Octet仪。通过在含有5’生物素化的模板核酸的孔中于37℃孵育吸头5分钟，将模板核酸附接至链霉抗生物素蛋白功能化的吸头。通过将吸头与0.1MNaOH接触，吸干吸头，然后在PRE(50mM KCl,50mM Tricine,pH 8.42,0.1％Tween-80,0.1％羟胺，0.1mM EDTA)中洗涤吸头，来去除未结合的模板核酸。通过在PRE中于37℃孵育5分钟，将引物与吸头结合的模板杂交。
然后在Octet仪上将吸头经历30次引物延伸循环。每个循环包括以下步骤：将吸头转移到以下试剂中孵育如下的时间：(1)在PRE中持续5秒；(2)在RTS(PRE,5mM MgCl2,10U/mL Therminator,25μMrtNTP(在3’位上具有氨基氧基可逆终止子部分的可逆终止的脱氧核苷酸))持续10秒；(3)在可变溶液中持续30秒；(4)在ESB(1M GdSCN,0.1mM HEPES pH 7.5,0.1％Tween-80,0.1％羟胺，2mM EDTA)中持续5秒；(5)在PRE中持续5秒；(6)在CLV(0.25M醋酸钠pH4.8，0.7M亚硝酸钠)中持续5秒；(7)在PRE中持续5秒。可变溶液包含以下试剂：
a)PRE
b)PRE+10u/mTherminator
c)PRE+10u/mlTherminator+5mg Mg+2
d)PRE+10u/ml Therminator+5mg Mg+2+100μM dNTP
e)PRE+10u/ml Therminator+5mg Mg+2+30μM dNTP
f)PRE+10u/ml Therminator+5mg Mg+2+10μM dNTP
g)PRE+10u/ml Therminator+5mg Mg+2+3μM dNTP
h)PRE+10u/ml Therminator+5mg Mg+2+1μM dNTP
在Octet循环后，从吸头附接的模板上剥离引物链，并用毛细管电泳(CE)染料孵育。然后使用CE分析确定引物的长度。通过检查每个峰并记录n和n-1峰面积来分析CE结果。使用以下公式评估引物延伸的效率：[(循环次数)×(n/n-1比率)]÷[(循环次数)×(n/n-1比率)+1]。
结果概述于表1中。延伸引物的CE迁移率与预期长度(n＝59个核苷酸)一致。对照条件(即a)、b)和c))下的n/n-1比率最低，当存在核苷酸时该比值增加。当引物延伸所需的所有组分都存在时，全长延伸的效率也增加。
表1CE的结果
结果表明，使用可逆终止的核苷酸进行延伸后(在RTS中)，仅当引物延伸所需的所有成分(dNTP、Therminator和Mg)均存在时，才发生进一步的引物延伸。这表明保留了未封闭的3’末端，RTS后的溢流延伸可用于使引物完全延伸通过模板区域。
预计完全延伸的引物在随后的检查步骤中不可用于形成三元复合物，导致信噪比提高、读取长度更长和测序准确度更高。
实施例II
通过向引物中加入生物素化的核苷酸并将链霉抗生物素蛋白与生物素化的引物结合来进行引物加帽
本实施例演示了通过将生物素化的核苷酸掺入引物延伸产物的3’末端，然后将链霉抗生物素蛋白与引物延伸产物的3’末端处的生物素部分结合来对核酸进行加帽。本实施例还演示了引物加帽允许对模板核酸上的两个不同区域进行可区分的测序的用途。
材料和方法
如下制备含有引发的模板核酸的流动池。制备在3次PCR反应中合成的模板核酸链，然后将其独立地与珠粒结合。这产生了3种珠粒类型的群体，其中每种珠包含3种模板链(即“模板1”、“模板2”和“模板3”)之一的同质集合。接着将含有固定模板链的珠粒附着在流动池的内表面。然后，使第一组测序引物流入流动池，并使其与三种固定模板链的每一个上的第一区域杂交以形成固定的引物-模板杂交体。
循环地进行Sequencing By BindingTM(SBBTM)法，其中每个循环包括以下步骤：(i)延伸：向固定的引物-模板杂交体的引物中添加可逆终止的核苷酸，(ii)检查：在可逆终止的固定的引物-模板杂交体上形成稳定的三元复合物并对其进行检测，以及(iii)活化：从延伸的引物中切割可逆终止子。每个循环导致单个核苷酸的添加和后续核苷酸位置的检测。
测序循环是通过在固定的引物-模板杂交体的引物3’末端掺入可逆终止子核苷酸开始的。这通过延伸步骤来实现，在该步骤中，使流动池在M15聚合酶(描述于序列号为16/567,476的美国专利申请中，所述美国专利申请通过引用并入本文)存在的情况下与dATP、dGTP、dCTP和dTTP的未标记的可逆终止的核苷酸类似物接触。在该说明性程序中使用的可逆终止子核苷酸包括3’-ONH2可逆终止子部分。这种可逆终止子核苷酸的描述可见于美国专利第7,544,794号中，所述美国专利通过引用并入本文。
接下来，进行洗涤步骤以从RTS溶液中除去dNTP并洗涤流动池。洗涤溶液含有异丙醇、Tween-80、羟胺和EDTA。洗涤步骤保留了M15聚合酶(描述于序列号为16/518,321的美国专利申请中，所述美国专利申请通过引用并入本文)。
然后循环继续进行检查子程序，其中四种不同核苷酸中的每一种被分别递送至流动池(Cy5标记的dTTP、Cy5标记的dATP、Cy5标记的dCTP和Cy5标记的dGTP)，系统暂停流体流动以允许三元复合物的形成，通过递送成像流体从流动池中除去游离核苷酸，然后在固定的引物-模板杂交体处检查流动池中三元复合物的形成。成像液包括LiCl、甜菜碱、Tween-80、KCl、硫酸铵、羟胺和EDTA，所述成像剂在除去游离核苷酸后稳定三元复合物(参见美国专利第10，400，272号，所述美国专利通过引用并入本文)。将流动池通过荧光显微镜成像以检测三元复合物，所述复合物包含标记的核苷酸，所述核苷酸是每个模板核酸中下一个正确核苷酸的同源物。引物链的3’核苷酸上的可逆终止子部分排除了三元复合物形成和检测步骤期间的核苷酸掺入。
在检查子程序之后，用清洗液冲洗流动池，以清除流动池中来自检查子程序的核苷酸。然后测序循环继续进行切割步骤，其中使用乙酸钠和亚硝酸钠从引物中除去可逆终止子部分，如美国专利第7,544,794号(其通过引用并入本文)所述。然后除去切割试剂，并用成像液洗涤流动池，以除去来自检查步骤的残留聚合酶。然后，通过返回到下一个测序循环的第一步，测序过程进行到下一个核苷酸位置。
在进行12个循环的上述SBBTM方法后，如下对测序反应产生的延伸引物进行加帽。制备加帽试剂以包含50mM三羟甲基甘氨酸(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、2μM的图5所示的四种生物素化双脱氧核苷酸中的每一种(MyChem,San Diego,CA)、0.1mM的用于阻断流动池中已经存在的任何痕量链霉抗生物素蛋白的生物素(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、50mM KCl(Teknova,Hollister,CA)、0.1％Tween-80(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、5mMMgCl2(Invitrogen,Carlsbad,CA)、40U/ml M15 DNA聚合酶(参见序列为16/567,476的美国专利申请，其通过引用并入本文)和0.1mM EDTA(Invitrogen,Carlsbad,CA)。将加帽试剂引入流动池，并在55℃下进行2分钟。除去加帽试剂，用高盐洗涤流动池以除去任何结合的DNA聚合酶。加帽过程中的下一步骤是生物素化引物延伸产物与链霉抗生物素蛋白的孵育。链霉抗生物素蛋白混合物包含50mM三羟甲基甘氨酸(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、0.076mg/ml链霉抗生物素蛋白(New England Biolabs,Ipswich,MA)、50mM KCl(Teknova,Hollister,CA)、0.1％Tween-80(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、5mM MgCl2(Invitrogen,Carlsbad,CA)和0.1mM EDTA(Invitrogen,Carlsbad,CA)。将链霉抗生物素蛋白混合物引入流动池，并允许结合在55℃下进行2分钟。
加帽后，使流动池再进行9个循环的相同的加帽反应前使用的SBBTM方案。
接下来，将第二组测序引物流入流动池，并使其与三条固定的模板链中的每一条链上的第二区域杂交以形成固定的引物-模板杂交体。第二组引物被设计成在加帽引物下游的位置与三种模板中的每一种杂交。
在第二引物杂交步骤之后，使流动池进行另外6个循环的SBBTM方案。
结果
如下分析上述测序过程的结果。追踪“开启”强度(在给定检查步骤中从给定珠粒获得的最亮核苷酸的信号强度)以监测第一组引物上三元复合物的形成和随后第二组引物的测序。图6示出了y轴上归一化的“开启”强度的百分位数50和x轴上循环数的曲线图。将来自三个模板的数据分别绘制为单独的线。结果清楚地显示，在引物加帽步骤之后的第13个循环开始，“开启”强度急剧下降。“开启”强度在第13个至21个循环保持较低，表明引物帽具有鲁棒性。该图还示出了由于引入第二组引物和随后在第22-27个循环中检测到三元复合物形成而导致的“开启”信号的成功返回。
数据表明，当生物素化的核苷酸连接至链霉抗生物素蛋白上时，生物素化的核苷酸可以作为有效的引物帽来防止形成可检测的三元复合物。该数据还证明了对一个引物末端的选择性加帽，以便选择性检测来自第二非加帽引物的三元复合物的形成。
贯穿本申请，参考了各种出版物、专利和/或专利申请。这些文件的公开内容据此通过引用整体并入本申请。
已经描述了许多实施方案。然而，应当理解，可以进行各种修改。因此，其它实施方案在所附权利要求的范围内。

Claims (14)

1.一种用于对核酸中两个模板区域进行测序的方法，所述方法包括：
(a)沿着核酸的第一模板区域延伸引物，从而确定所述第一模板区域的至少一部分的序列；
(b)用三元复合物抑制剂部分对所述延伸的引物加帽，从而在所述核酸上形成加帽的引物-模板杂交体；
(c)将第二引物与所述核酸的第二模板区域杂交以形成包含所述加帽的引物-模板杂交体和第二引物-模板杂交体的核酸；以及
(d)进行测序过程，其包括：
(i)将所述第二杂交体与聚合酶和核苷酸结合以形成稳定的三元复合物；
(ii)检测所述稳定的三元复合物以鉴定所述稳定的三元复合物中的核苷酸；
(iii)延伸所述第二引物以在所述核酸上形成经修饰的第二杂交体；以及
(iv)对所述核酸的所述经修饰的第二杂交体重复(i)、(ii)和(iii)，从而确定所述第二模板区域的至少一部分的序列。
2.如权利要求1所述的方法，其中(a)包括：
(i)将所述引物与所述核酸的所述模板区杂交以形成第一引物模板杂交体；
(ii)将所述第一杂交体与聚合酶和核苷酸结合以形成所述稳定的三元复合物；
(iii)检测所述稳定的三元复合物以鉴定所述稳定的三元复合物中的核苷酸；
(iv)沿着所述核酸的所述第一模板区域延伸所述引物，以在所述核酸上形成经修饰的第一杂交体；以及
(v)对所述核酸的所述经修饰的第一杂交体重复(ii)、(iii)和(iv)，从而确定所述第一模板区域的所述部分的所述序列。
3.如权利要求2所述的方法，其中(a)(v)包括对所述核酸的所述经修饰的第一杂交体重复(ii)、(iii)和(iv)至少10次，从而确定所述第一模板的所述部分的所述序列。
4.如权利要求1所述的方法，其中(a)包括在通过合成过程的测序或通过连接过程的测序中沿着所述第一模板区域延伸所述引物。
5.如权利要求1所述的方法，其中(d)(iv)包括对所述核酸的所述经修饰的第二杂交体重复(i)、(ii)和(iii)至少10次，从而确定所述第二模板的部分的序列。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述延伸引物的所述加帽包括掺入包含配体的核苷酸，然后将所述配体与受体结合以形成所述三元复合物抑制剂部分。
7.一种用于对核酸中两个模板区域进行测序的方法，所述方法包括：
(a)提供包含第一引物-模板杂交体和第二引物-模板杂交体的核酸，其中所述第一杂交体包含与第一引物杂交的第一模板区，并且其中所述第二杂交体包含与第二引物杂交的第二模板，所述第二引物在所述第二引物的3’末端包含三元复合物抑制剂部分；
(b)进行测序过程，其包括：
(i)将所述第一杂交体与聚合酶和核苷酸结合以形成稳定的三元复合物；
(ii)检测所述稳定的三元复合物以鉴定稳定的所述三元复合物中的所述核苷酸；
(iii)延伸所述第一引物以在所述核酸上形成经修饰的第一杂交体；以及
(iv)对所述核酸的所述经修饰的第一杂交体重复(i)、(ii)和(iii)，从而确定所述第一模板区域的至少一部分的序列；
(c)用第二三元复合物抑制剂部分对所述延伸的第一引物进行加帽；
(d)从所述第二引物中除去所述三元复合物抑制剂部分，同时将所述第二三元复合物抑制剂部分保留在所述第一引物上；以及
(e)延伸所述第二引物，从而确定所述第二模板区域的至少一部分的序列。
8.如权利要求7所述的方法，其中(e)包括：
(i)将所述第二杂交体与聚合酶和核苷酸结合以形成稳定的三元复合物；
(ii)检测所述稳定的三元复合物以鉴定所述稳定的三元复合物中的所述核苷酸；
(iii)沿着所述核酸的所述第二模板区域延伸所述第二引物，以在所述核酸上形成经修饰的第二杂交体；以及
(iv)对所述核酸的所述经修饰的第二杂交体重复(i)、(ii)和(iii)，从而确定所述第二模板区域的所述部分的所述序列。
9.如权利要求8所述的方法，其中(e)(iv)包括对所述核酸的所述经修饰的第二杂交体重复(i)、(ii)和(iii)至少10次，从而确定所述第二模板区域的所述部分的所述序列。
10.如权利要求7所述的方法，其中(e)包括在通过合成过程的测序或通过连接过程的测序中沿着所述第二模板区域延伸所述第二引物。
11.如权利要求7所述的方法，其中(a)(iv)包括对所述核酸的所述经修饰的第一杂交体重复(i)、(ii)和(iii)至少10次，从而确定所述第一模板区域的所述部分的所述序列。
12.如权利要求7所述的方法，其中所述延伸的第一引物的所述加帽包括掺入包含配体的核苷酸，然后将所述配体与受体结合以形成所述三元复合物抑制剂部分。
13.一种用于鉴定核酸模板的方法，所述方法包括：
(a)提供多种核酸，所述多种核酸包含引物-模板杂交体；
(b)用三元复合物抑制剂部分对所述引物进行加帽，从而形成加帽的引物-模板杂交体；
(c)将引物与所述多种核酸的第二模板杂交，由此所述多种核酸包含所述加帽的引物-模板杂交体和第二引物-模板杂交体；
(d)将聚合酶和核苷酸递送至所述多种核酸，由此所述第二引物-模板杂交体结合聚合酶和核苷酸以形成稳定的三元复合物，并且由此所述加帽的引物-模板杂交体不结合聚合酶和核苷酸以形成稳定的三元复合物；以及
(e)检测所述稳定的三元复合物以鉴定所述第二模板。
14.如权利要求13所述的方法，所述方法还包括：
(f)延伸所述第二引物以在所述核酸上形成经修饰的第二杂交体；以及
(g)对所述核酸的所述经修饰的第二杂交体重复(d)、(e)和(f)，从而确定所述第二模板的至少一部分的序列。
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