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Vectores de expresion de insecto.
ES2239387T3
Spain
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English - Inventor
Thomas A. Grigliatti Dave A. Theilmann Thomas A. Pfeifer Dwayne D. Hegedus - Current Assignee
- University of British Columbia
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Application ES98913479T events
1998-01-28
2005-09-16
Application granted
2005-09-16
2018-03-26
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Expired - Lifetime
Description
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Vectores de expresión de insecto.
La invención se sitúa en el sector de los
vectores para la ingeniería genética. La invención se refiere a
vectores para dirigir la expresión de proteínas heterólogas en
células transformadas, particularmente en células de insecto
transformadas establemente, métodos para la utilización de dichos
vectores y células transformadas con dichos vecto-
res.
res.
La transformación de células cultivadas con
secuencias de ADN foráneo resulta útil en el estudio de la
expresión génica y en la producción de productos génicos
heterólogos, comercialmente importantes, como proteínas de valor. Se
pueden producir proteínas simples en células bacterianas. No
obstante, para funcionar adecuadamente, muchas proteínas
eucarióticas requieren modificaciones
post-traduccionales que no realizan las células
procarióticas. Existen otros problemas asociados con la expresión
de algunas proteínas en células procarióticas; p. ej. algunas
proteínas heterólogas expresadas se depositan como cuerpos de
inclusión insolubles en células procarióticas, dificultando la
recuperación de las proteínas. Muchas de las dificultades asociadas
con los sistemas de expresión procarióticos pueden superarse
utilizando sistemas de cultivo celular de mamífero transformados
para producir proteínas procesadas
post-traduccionalmente. Los cultivos celulares de
mamíferos pueden sin embargo resultar relativamente ineficaces
debido a que crecen lentamente y su mantenimiento resulta difícil y
costoso.
Los avances en el cultivo de células de insectos
y el desarrollo de los sistemas de expresión basados en baculovirus
han facilitado la expresión de proteínas heterólogas por líneas
celulares de insecto transformados (Luckow and Summers, Bio/Tech.,
6:47-55(1988); Miller, Annu. Rev. Microbiol.,
42:177-199(1988)). Hasta la fecha, la
expresión de proteínas heterólogas en líneas celulares de insectos
transformadas se ha realizado principalmente utilizando vectores
derivados del baculovirus Autographa californica, virus de
la polihedrosis nuclear multicápsida (AcMNPV) (Luckow and Summers,
Bio/Tech., 6:47-55(1988); Miller, Annu. Rev.
Microbiol., 42:177-199(1988)). Los
baculovirus son virus de ADN de doble cadena que matan por lisis
las células de insecto infectadas al final de un ciclo típico de
infección. Se conoce una variedad de baculovirus, cada uno de los
cuales es endémico de una especie particular de artrópodo. No se
tiene conocimiento de que los baculovirus sufran replicación en
animales fuera de los artrópodos. La comprensión del estado de la
técnica en este sector requiere tener en cuenta en alguna medida la
biología molecular de la infección por baculovirus.
La expresión génica durante la infección por
baculovirus natural de un insecto está altamente regulada y se
produce como una cascada ordenada. Los genes virales se pueden
clasificar en cuatro grupos diferentes, según el lugar que ocupan
en esta cascada de expresión génica: incipiente inmediato (ie),
incipiente demorado (de), tardío y muy tardío. La expresión génica
incipiente se produce antes del comienzo de la replicación de ADN
viral y parece ser esencial para la inducción de la expresión
génica viral tardía (Blissard and Rohrmann, Annu. Rev. Entomol.,
35:127-155(1990); Guarino and Summers, J.
Virol., 62:463-471 (1988); Miller et al.,
Virology, 126:376-380(1983)). Los datos
experimentales indican que los genes ie del baculovirus son
transcritos por la ARN polimerasa II anfitrión en la ausencia de
otros factores virales. Se entiende por lo tanto que los genes de
baculovirus ie tienen promotores reconocidos por la maquinaria de
transcripción de la célula anfitrión.
En el estado de la técnica, los sistemas de
expresión basados en derivados del AcMNPV, la expresión génica
foránea es dirigida por lo general por un promotor viral tardío muy
fuerte, como la polihedrina (pol) o p10 promotores. La expresión de
estos promotores tardíos de baculovirus depende sin embargo de la
ARN polimerasa codificada viral para la transcripción y se limita a
las células de lepidóptero permisivas, es decir a las células que
permiten la infección lítica por baculovirus (Carbonell et
al., J. Virol., 56:153-160(1985)). Se ha
diseñado un amplio conjunto de vectores de expresión de baculovirus
para optimizar la expresión, secreción y recuperación de proteínas
recombinantes producidas por dichos sistemas (O'Reilly et
al., Baculovirus Expression Vectors, W.H. Freeman and Company,
New York, NY USA (1992); U.S. Patent 5,179,007 para Jarvis y
Carrington; Lenhard et al., Gene, 169:
187-190 (1996)). Muchas modificaciones
postraduccionales que, como se sabe ocurren en sistemas mamíferos,
inclusive la glicosilación, ligada a N y O, la fosforilación, la
acilación, la proteolisis (Kidd and Emery, Appl. Biochem,
Biotechnol., 42:137-159(1993)) y la amidación
(Andersons et al., Biochem. J.,
280:219-224(1991) también se produce, hasta
cierto grado en líneas celulares de insectos infectadas con
derivados del AcMNPV.
Utilizando sistemas de expresión basados en
AcMNPV, las proteínas localizadas en el núcleo o en el citoplasma
se pueden expresar en cantidades adecuadas (patente US 5,179,007 de
Jarvis et al., concedida el 12 de enero de 1993). Las
proteínas que entran en las vías secretoras asociadas con el
retículo endoplasmático se expresan sin embargo frecuentemente a
niveles más bajos (Jarvis, Insect Cell Culture Engineering, Marcel
Dekker, In, New York, NY USA (1993)). Este subconjunto de proteínas
altamente modificadas, unidas a la membrana y segregadas incluye
especies bioactivas importantes tales como receptores superficiales
celulares (Chazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem.,
270:1543-1549(1995)), anticuerpos (Hsu et
al., Prot. Expr. Purif., 5:595-603(1994))
y componentes de vacunas segregados (Li et al., Virology,
204:266-278(1994)). Las proteínas de esta
clase se suelen expresar de forma relativamente pobre y heterogénea
en sistemas líticos basados en AcMNPV. Los niveles de expresión
reducida y las alteraciones en el proceso pueden ser el resultado
de un daño en la maquinaria de expresión proteínica normal de
células infectadas, causado por la progresión de la infección
lítica por baculovirus (Kretzchmar et al., J. Biol. Chem.,
375:323-327 (1994); Jarvis and Finn, Virology,
212:500-511(1995); Chazenbalk and Rapoport,
J. Biol. Chem., 270:1543-1549(1995)). Por
consiguiente, la investigación se ha dirigido hacia la generación de
vectores de baculovirus capaces de expresar proteínas de forma
temprana en el ciclo de la infección (Jarvis and Finn, Nature
Biotechnology, 14:1288-1292(1996); Jarvis
et al., Prot. Expr. Purif.,
8:191-203(1996)).
Para superar los problemas asociados con los
sistemas de expresión lítica de baculovirus, se han desarrollado
métodos para la transformación estable de líneas celulares de
insectos. Las células Schneider de la Drosophila
melanogaster se han transformado de forma estable con un
sistema que utiliza el promotor de metalotioneina D.
melanogaster para impulsar la expresión proteínica heteróloga y
la selección de higromicina para identificar los transformantes
(Johansen et al., Genes Develop.,
3:882-889(1989); Culp et al.,
Bio/Technology, 9:173-177(1991)). Se han
transformado establemente líneas celulares de dípteros (D.
melanogaster y Aedes albopictus, mosquito) con un sistema
que utiliza los promotores D. melanogaster hsp 70 o AcMNPV
ie1 para impulsar la expresión proteínica heteróloga y la selección
de metotrexato para identificar los transformantes (Shotkoski et
al., FEBS Lett., 380:257-262(1996)). Se
ha transformado establemente una línea celular de lepidóptero (Sf9,
derivada de la oruga negra Spodoptera frugiperda) con un
sistema que utiliza el promotor AcMNPV ie1 para impulsar la
expresión proteínica heteróloga y la selección de geneticina
(G-418) para identificar los transformantes, aunque
se ha visto que la expresión en este sistema es relativamente
ineficaz (Jarvis et al., Bio/Technology,
8:950-955(1990); patente US 5,077,214
concedida a Guarino y Jarvis el 31 de diciembre de 1991). En cada
uno de estos sistemas de transformación, el marcador seleccionable
en un vector fue co-transferido con un vector de
expresión separado, que llevaba el casete de expresión de la
proteína heteróloga. La utilización de plásmidos separados que se
tienen que co-transferir complica el procedimiento
de transformación, ya que alguna de las líneas celulares que
adquieren el marcador seleccionable, no adquirirán también el
vector de expresión deseado. Se necesita por lo tanto, en el estado
de la técnica, vectores capaces de proporcionar un marcador
seleccionable así como un casete de expresión.
También se necesitan, en el estado de la técnica,
promotores fuertes para dirigir la expresión de las proteínas
heterólogas en células de insectos transformadas establemente. En un
intento de satisfacer esta necesidad, se ha utilizado el elemento
potenciador hr para aumentar la expresión del promotor Ac ie1
(Shotkoski et al., FEES Lett.,
380:257-262(1996)). El potenciador hr existe
en forma de cinco grandes regiones homólogas dispersadas por el
genoma del baculovirus AcMNPV y sirve para activar la transcripción
de genes proximales (Leisy et al., Virology,
208:742-752(1995)). No obstante, pueden
surgir dificultades con la utilización de hr elementos en sistemas
de transformación, debido a que se puede necesitar factores
específicos celulares o baculovirus-codificados para
modular la acción de elementos hr (Glocker et al., J. Virol.,
66:3476-3484(1992); Choi y Guarino, J.
Virol., 69:4584-4551(1995); Rodems and
Friesen, J. Virol., 69:5368-5375(1995)).
Asimismo la adición de secuencias de potenciador a un promotor
puede aumentar notablemente el tamaño el promotor, dejando
necesariamente menos espacio en el vector relevante para el gen
heterólogo de interés.
Se necesita por lo tanto, en el estado de la
técnica, promotores que puedan dirigir niveles adecuados de
expresión proteínica heteróloga, inclusive expresión de marcador
seleccionable, sin necesidad de secuencias de potenciador.
Se han utilizado elementos transponibles como
vectores de transformación en cierto número de organismos. Los
elementos transponibles son segmentos móviles de ADN, que se
caracterizan por la aptitud para replicar de forma autónoma e
insertarse en una diversidad de sitios dentro del genoma de la
célula. Hay dos clases claramente diferentes de elementos
transponibles: 1) la clase de repetición invertida corta de
transposones de ADN ("elementos transponibles de ADN"); y, 2)
los retro-transposones que replican a través de un
intermediario de ARN y requieren actividad transcriptasa inversa
para la transposición (tal como se describe en la Patente
Internacional n° publ. WO 88/03169). Un aspecto de la presente
invención se refiere a la clase de repetición invertida corta, de
elementos de ADN transponibles, que se distingue de los
retro-transposones.
Un elemento transponible de ADN completo codifica
una enzima transposasa, que hace de mediador en la transposición del
elemento. La proteína transposasa interactúa con secuencias de ADN
cerca de los términos del elemento; se suelen necesitar términos
intactos (habitualmente de 150 a 250 pares de base aproximadamente)
para permitir que los elementos transponibles de ADN respondan a la
enzima transposasa.
Los elementos transponibles de ADN, P. hobo,
mariner, I, y Hermes (un elemento móvil similar al hobo de la
Musca domestica) se han utilizado todos para transformar la
mosca de la fruta D. Melanogaster (O'Brochta, et al.,
J. of Cell. Biochemistry-Keystone Symposia Suppl.,
21A:195(1995); Pritchard, et al. Mol. Gen. Genet.,
214:533-540(1988)). Se pueden colocar grandes
trozos de ADN foráneoo (> 12 kb) dentro de regiones no
codificadoras del elemento P sin impedir que puedan replicar por
transposición (Meister and Grigliatti, Genome,
36:1169-1175(1993)). El elemento transponible
de ADN Tcl se ha utilizado para transformar el gusano redondo
Caenorhabdites elegans. La selección de transformantes
deseados es una etapa importante en cualquier sistema de
transformación. Si bien se han diseñado diversos sistemas de
transformación, basados en complementación auxotrópica o selección
dominante, para su utilización en sistemas mamíferos, se han
adaptado relativamente pocos para células de insectos (Walker, Adv.
Cell Cult., 7:87-124(1989); Carlson et
al., Annu. Rev. Entomol.,
40:359-388(1995)). La transformación de
células de D. melanogaster para desarrollar la resistencia
al metotrexato utilizando un gen bacteriano dihidrofolato reductasa
(DHFR) ha sido descrito por vez primera por Bourouis and Jarry,
EMBO J. 2:10991104(1983). Posteriormente, Shotkoski and
Fallon, Insect Biochem. Molec. Biol.,
23:883-893(1993) describieron un gen
dihidrofolato reductasa de mosquito que funcionaba como marcador
seleccionable dominante en células de mosquito. En estos caso, el
ADN transformador se incorporó en el genoma como estructuras
repetitivas y como simples copias integradas aleatoriamente; sin
embargo, en ausencia de presión selectiva, se observó una perdida de
ADN transfectante (Shotkoski and Fallon, Insect Biochem. Molec.
Biol., 23:883-893(1993)). La resistencia a la
geneticina (G418) tras la introducción de gen bacteriano neomicina
fosfotransferasa, se puede atribuir a D. melanogaster
(Steller and Pirotta, EMBO J.
4:167-171(1985)) y sus líneas celulares
derivadas (Rio and Rubin, Mol. Cell. Biol.,
5:1833-1838(1985)), mosquitos (Maisonhaute
and Echalier, FEBS Lett., 197:45-49(1986);
Lycett and Crampton, Gene, 136: 129-136 (1993) y la
línea celular de lepidóptero Sf9 (Jarvis et al., Bio/Tech.,
8:950-955 (1990)). Sin embargo, la amplificación
génica derivada de la selección continuada y de las altas
frecuencias espontáneas de resistencia (McGrane et al., Am.
J. Trop. Med. Hyg., 39:502-510 (1988), socava la
utilización de este sistema de selección en ciertos casos. La
resistencia a la higromicina proporcionada por el gen bacteriano
higromicina B fosfotransferasa es, según se informa, más fiable y
la selección más rápida que en los sistemas de selección basados en
G418 (van der Straten et al., Invertebrate Cell System
Applications, CRC Press Inc., Boca Raton, FL USA (1989); CARLSON
et al., Annu. Rev. Entomol.,
40:359-388(1995)). Sin embargo, en líneas
celulares de mosquito transformadas para resistencia a la
higromicina, el plásmido introducido amplificó extensamente y estuvo
presente como un largo conjunto en tándem o pseudo cromosomas extra
cromosómicos auto replicantes (Monroe et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 89:5725-5792(1992). Cualquier
disposición genética, conjuntos en tándem o elementos extra
cromosómicos se presta a una pérdida rápida del gen de resistencia
una vez que se ha relajado la selección. Por consiguiente, se
necesita una estrategia y un sistema de selección mejorado para la
inserción eficaz de ADN en el genoma de las células anfitrión,
particularmente para utilizar en la selección de células de
insectos establemente transformados.
Zeocin es un elemento de la familia de la
bleomicina/fleomicina de antibióticos aislado del Streptomyces
verticillus (Berdy, Handbook of Antibiotic Compounds, Vol IV,
Part 1. Amino Acid and Peptide Antibiotics, CRC Press, Boca Raton,
FL, USA (1980)). Zeocin es una marca registrada de S.A.R.L. Cayla
de Toulouse, Francia, donde se puede adquirir. Zeocin es un
glucopéptido de quelato de cobre de fórmula
C_{55}H_{83}N_{19}O_{21}S_{2}Cu.
La resistencia a la familia bleomicina/fleomicina
de antibióticos puede ser conferida por una proteína 13.6 kDa, el
producto del gen Streptoalloteichus hindustanus ble gene que
liga el antibiótico de forma estequiométrica (Gatignol et
al., FEBS Lett., 230:171-175(1988)). El
gen de resistencia ble se ha utilizado con éxito en células de
mamífero (Mulsant et al., Somat. Cell Mol. Genet.,
14:243-252(1998)) y células vegetales (Perez
et al., Plant Mol. Biol.,
13:365-373(1989)) para conferirles
resistencia al Zeocin. El efecto de los antibióticos
bleomicina/fleomicina sobre células derivadas de otros géneros es
impredecible.
Cierto número de dificultades potenciales está
asociado con el uso de Zeocin como marcador seleccionable. La forma
de quelato de cobre del fármaco es inactiva. La comprensión
actualmente incompleta del mecanismo de actuación de Zeocin sugiere
que la activación sólo se produce si se encuentra en condiciones
adecuadas dentro de la célula diana para reducir el quelato de cobre
de Cu^{2+} a Cu^{1+}, de forma que el ión de cobre pueda ser
removido por compuestos de sulfidrilo en la célula. Altas
concentraciones de sal pueden activar el Zeocin. El fármaco también
se puede inactivar con soluciones ácidas o básicas (Invitrogen
Corporation "pZeoSV2(+) o pZeoSV2(-)" manual del producto,
versión C. San Diego, CA. EE.UU.).
Los sistemas de expresión de célula de insecto
presentan interés en gran parte debido a su aptitud para realizar
modificaciones pos traduccionales sofisticadas. No obstante, puede
existir variabilidad, de una línea celular a la otra, en la
naturaleza de la modificación post-traduccional
precisa en una proteína de interés. Por consiguiente, puede
resultar útil examinar cierto número de líneas celulares de insecto
transformadas de especies dispares para determinar qué línea
celular expresa mejor la proteína de interés. Para realizar un
procedimiento de reconocimiento de este tipo se necesita, en el
estado de la técnica, un vector de expresión capaz de transformar,
de forma estable, una gama de líneas celulares de insectos para
expresar fuertemente proteínas heterólogas.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
la utilización de Zeocin como sistema de selección en líneas
celulares de insectos. La utilización de la resistencia al Zeocin
como sistema de selección puede proporcionar ventajas importantes,
imprevistas con respecto a los sistemas de selección de insectos
del estado de la técnica. Estas ventajas pueden ser las siguientes:
se pueden necesitar concentraciones relativamente bajas del
antibiótico para la selección (con el resultado de un menor coste en
cuanto a cultivo celular); el mismo programa de selección es eficaz
tanto en los sistemas eucarióticos como en los procarióticos (de
modo que el vector sólo tiene que llevar un gen de resistencia,
reduciéndose al mínimo el tamaño del vector); y, el pequeño tamaño
del gen de resistencia ble (374 bp) permite el desarrollo de
vectores de clonación compactos (reduciendo así mismo al mínimo el
tamaño del vector y maximizando de este modo la capacidad del
vector para incorporar secuencias heterólogas); otra ventaja
indirecta es que la disponibilidad de los sistemas de selección de
resistencia al Zeocin, de acuerdo con la presente invención, se suma
al repertorio de programas de selección alternativos que se
utilizan con células de insectos. La utilización de sistemas de
selección alternativos puede resultar particularmente útil, por
ejemplo cuando se introducen constructos múltiples, ya sea colectiva
o secuencialmente, en una célula anfitrión especifica, donde cada
uno de estos constructos utiliza un sistema de selección diferente.
Una ventaja adicional que se deriva del sistema de selección
relativamente compacto de Zeocin es la posibilidad de añadir
secuencias de gen indicador no obstrusivo a los vectores de la
invención, tales como \beta-galactosidasa o genes
de proteína fluorescente verde.
Un aspecto de la presente invención contempla la
utilización de promotores derivados de un baculovirus promotor
incipiente inmediato, para controlar la expresión de un gen marcador
seleccionable que confiere resistencia a uno de los antibióticos
de la familia de antibióticos de tipo bleomicina/fleomicina. En un
aspecto, el gen marcador seleccionable puede ser el gen
Streptoalloteichus hindustanus ble que, según se ha visto
aquí, confiere resistencia al Zeocin en células de insectos. Los
promotores ie1 e ie2 derivados de los genes ie1 e ie2 del virus de
la polihedrosis núcleo multicápsido Orgya pseudotsugata
(OpMNPV) pueden estar operativamente ligados al gen marcador
seleccionable para controlar la transcripción del gen marcador
seleccionable. El promotor puede comprender secuencias homólogas a
porciones del promotor OpMNPV ie2, particularmente aquellas
porciones que incluyen un motivo de secuencia designado como
elemento IE2B o elemento GATA-IE2B emparejado.
Un aspecto de la invención es un vector de
expresión, que incluye un sitio de clonación múltiple para permitir
que una secuencia de codificación insertada esté operativamente
ligada a un promotor incipiente-inmediato de
baculovirus. Este vector de expresión se puede utilizar con otro
vector que confiere una ventaja de selección sobre una línea
celular de insecto, con el objeto de construir una línea celular de
insecto estable que produzca una proteína heteróloga.
En un aspecto, los vectores transportadores de la
invención pueden incluir un sitio de clonación múltiple o una
secuencia de codificación heteróloga ligada operativamente a un
promotor incipiente inmediato de baculovirus. De acuerdo con este
aspecto de la invención, se pueden utilizar promotores homólogos a
los promotores OpMNPV ie1 o ie2 para impulsar la expresión de genes
heterólogos en líneas celulares dípteras y lepidópteras
transformadas.
Se presenta un vector transportador compacto, que
comprende un promotor bacteriano sintético Op ie hídrido, que puede
dirigir la expresión del gen de resistencia al Zeocin en líneas
celulares de insectos y en E. coli, para permitir la
selección de transformantes tanto eucarióticos como procarióticos.
Se presenta una serie de vectores de expresión versátiles que
utilizan el promotor OpMNPV ie2 para la expresión de proteína
constitutiva heteróloga en una amplia gama de células de insectos
dípteros y lepidópteros. En algunos aspectos, los vectores de la
invención comprenden el promotor metalo tioneina (Mtn) D.
melanogaster para la expresión de proteína inducible por metal
en líneas celulares dípteras. Otros aspectos de la invención
comprenden la utilización de componentes modificados lacI/O o tet
para la expresión de proteína inducible en células de insectos.
Se revelan ventajas inesperadas asociadas con la
utilización del promotor Op ie2, como la función en una amplia gama
de anfitriones celulares de insectos, la expresión restringida en
líneas celulares no pertenecientes a insectos, altos niveles de
expresión en ausencia de secuencias similares a potenciadores y
funcionalidad críptica de promotor procariótico.
Unos aspectos de la invención incluyen líneas
celulares transformadas para la expresión constitutiva e inducible
de genes heterólogos, inclusive la glucoproteina altamente
procesada, anclada en glucosilfosfatidilinositol, melanotransferrina
humana, el Factor X segregado y la hormona peptídica de transporte
de ión segregada (ITP) en líneas celulares de insectos
transformadas.
Los vectores de la invención pueden comprender
genes indicadores no obstrusivos, tales como
\beta-galactosidasa o genes de codificación de
proteínas fluorescente verde (GFP), útiles para evaluar la
capacidad de producción proteínica en líneas celulares transformadas
y facilitar de este modo la recuperación de líneas celulares
clonales o poblaciones celulares que expresan niveles elevados de
proteína heteróloga. Estos genes indicadores no obstrusivos se
pueden ligar por medio de fusiones proteínicas dentro del marco de
lectura (inframe) al gen de resistencia al antibiótico, como la
resistencia al Zeocin, permitiendo de este modo el análisis y la
selección de líneas celulares a través de la resistencia al
antibiótico y/o FACS.
Los vectores de la invención pueden incluir un
casete de expresión proteínica basado en transposón que comprende
elementos transponibles, que definen un transposón, encontrándose
dentro del transposón el gen marcador seleccionable y/o las
secuencias de codificación de proteína heteróloga. Estos vectores se
pueden introducir en líneas celulares que tienen una fuente de
transposasa. Se presentan diversos mecanismos para proporcionar una
fuente de transposasa. En una realización, se induce una línea
celular de insecto transgénico a proporcionar transposasa de un gen
transposasa genómico inducible. Cuando se expresa la transposasa, la
enzima dirige la entrada del transposón dentro del ADN genómico.
Mientras se expresa la transposasa, el número de copias del casete
de expresión basado en transposón puede aumentar con el tiempo por
vía de la transposición replicativa del casete a nuevos sitios
genómicos. La expresión de transposasa se puede modular para regular
el movimiento del transposón, controlando de este modo el número de
copias del transposón. El nivel de expresión de las proteínas
heterólogas específicas se puede optimizar, optimizando el número
de copias de los casetes de expresión basados en transposón que
lleva una línea celular.
En un aspecto de la invención, se puede utilizar
un casete de expresión basado en transposón P para transformar
líneas celulares SL2. El vector puede comprender los términos de
transposón repetidor invertido del elemento P que definen un
transposón y dentro del transposón: un gen transposasa inducible
(para controlar el movimiento), un marcador seleccionable (para
seleccionar únicamente células transformadas) y un casete de
expresión de proteína heteróloga (que puede incluir un sitio de
clonación múltiple). En una realización alternativa, el gen
transposasa se puede integrar establemente dentro del genoma de la
línea celular. Alternativamente, el gen transposasa se puede
incorporar dentro de un plásmido que ayuda a la transformación que
proporciona transposasa para mediar la integración, aunque por sí
solo es incapaz de integrarse dentro del genoma por
transposición.
La invención incluye una línea celular SL2 con el
gen de transposasa P integrado dentro del genoma, en el que el gen
transposasa tiene el tercer intrón removido
(\Delta2-3), lo cual permite que la transposasa
sea activa en células somáticas. En esta realización, el gen
transposasa \Delta2-3 se encuentra bajo el control
del promotor metalo tioneina (Mtn) (recibiendo la línea celular la
designación SL2MT\Delta2-3) de forma que se pueda
inducir la expresión de transposa-
sa.
sa.
En ciertas realizaciones, los elementos del
vector transposasa de la invención pueden combinarse para
proporcionar un mecanismo para identificar fácilmente los
transformantes, (como resistencia al Zeocin) un mecanismo para
inducir un incremento en el número de copias integradas
establemente del vector (transposasa inducible) y un mecanismo para
identificar fácilmente los clones con el potencial para expresión
proteínica heteróloga (un marcador no obstrusivo indicativo del
número de copias de secuencia heteróloga). En efecto, la nueva
combinación de las características estructurales en dicho vectores
contribuye a proporcionar ventajas funcionales importantes en
diversas etapas de la producción de proteínas heterólogas a partir
de células de insectos transformadas.
Figura 1a. Análisis de deleción del promotor
OpMNPV ie2 utilizando el constructo del gen indicador CAT
pIE2CAT. El gráfico muestra las velocidades relativas de dos experimentos de muestra representativos utilizando Sf9 (muestras A y B) y Kc1 (C). Todas las velocidades se dan con respecto a la deleción 275, a la que se dio un valor de 100%. Los números debajo del gráfico indican el extremo 5' de los constructos de deleción de promotor respecto del sitio de comienzo de transcripción. El esquema debajo del gráfico muestra un diagrama del promotor OpMNPV ie2 y la ubicación aproximada de motivos específicos que incluyen elementos GATA (círculos en negro), elementos IE2B (círculos abiertos), Repetición I B y Repetición II A y B (casillas sombreada), casilla TATA y sitios de comienzo de transcripción CAGT (casillas negras). La flecha sombreada representa el marco de lectura abierto CAT. Las líneas que conectan el gráfico con el esquema designan las ubicaciones aproximadas del extremo 5' de las deleciones en el promotor OpMNPV ie2.
pIE2CAT. El gráfico muestra las velocidades relativas de dos experimentos de muestra representativos utilizando Sf9 (muestras A y B) y Kc1 (C). Todas las velocidades se dan con respecto a la deleción 275, a la que se dio un valor de 100%. Los números debajo del gráfico indican el extremo 5' de los constructos de deleción de promotor respecto del sitio de comienzo de transcripción. El esquema debajo del gráfico muestra un diagrama del promotor OpMNPV ie2 y la ubicación aproximada de motivos específicos que incluyen elementos GATA (círculos en negro), elementos IE2B (círculos abiertos), Repetición I B y Repetición II A y B (casillas sombreada), casilla TATA y sitios de comienzo de transcripción CAGT (casillas negras). La flecha sombreada representa el marco de lectura abierto CAT. Las líneas que conectan el gráfico con el esquema designan las ubicaciones aproximadas del extremo 5' de las deleciones en el promotor OpMNPV ie2.
Figura 1b. Análisis de los constructos del
promotor OpMNPV ie2 sintético híbrido utilizando el constructor
indicador CAT. Un promotor de base designado
p2ZeoSyn-237 incluía todas las secuencias GATA e
IE-2B hasta el nucleótido-237. El
efecto de duplicar y triplicar estas secuencias se compara en las
líneas celulares Ld652Y, Sf9 y Kc1. Además, los efectos
posicionales de un potenciador (OpE) que resultó ser 3' respecto
del gen ie-2, se estudiaron con los resultados
comparativos en diversas líneas celulares mostradas en la
figura.
Figura 2a. Comparación de las secuencias de
promotor de OpMNPV ie2 y los genes AcMNPV ien (Krappa and
Knebel-Morsdorf, J. Virol.,
65:805-812(1991). Los sitios de comienzo de
transcripción se identifican mediante flechas, por encima y por
debajo de la secuencia del nucleótido. La alineación fue producida
por el programa de análisis de secuencia GAP (Devereux et
al., Nucl. Acids Res., 12:287-395(1984)
utilizando una penalización de intervalo de cero. Los elementos de
repetición identificados en el promotor OpMNPV ie2 aparecen
doblemente subrayados y marcados GATA e IEB2. Las repeticiones
invertidas en el promotor and Knebel-Morsdorf, J.
Virol., 65:805-812(1991) así como las
secuencias relacionadas en el promotor OpMNPV ie2 se ha subrayado y
marcado REPEAT I A, REPEAT I B, REPEAT II A y REPEAT II B. Las
líneas verticales identifican secuencias de nucleotídos idénticas.
También se muestra por encima de las secuencias la ubicación de los
extremos 5' de las deleciones del promotor IE-2CAT
mostradas en la figura 1.
Figura 2b. Alineación de las secuencias repetidas
de los elementos del promotor IE2B. La posición de los elementos
respecto del sitio de transcripción ie2 se indican mediante números.
Los elementos que se encuentran en orientación inversa son
designados R. La ubicación de las repeticiones A hasta I tal como
se muestra en las figuras 2b se identifican mediante letras de
referencia entre paréntesis en la figura 2a.
Figura 3. Vectores construidos para la expresión
de \beta-galactosidasa y el gen de resistencia al
Zeocin (ble) utilizando las regiones de los promotores de los genes
AC ie1^{hr}, Op ie1 y Op ie2. Las diferentes pautas de relleno
designan secuencias diferentes de ADN. Los constructos no están a
escala.
Figura 4a. Crecimiento de líneas celulares Kc1,
SL2 y Sf9 en concentraciones variables de Zeocin. Las
concentraciones de Zeocin (\mug/ml) se muestran en la figura para
cada línea celular.
Figura 4b. Viabilidad de líneas celulares Ld652Y
y Cfl en presencia de mayores concentraciones de Zeocin. Las
concentraciones de Zeocin (\mug/ml) se muestran en la figura para
cada línea celular.
Figura 5. Crecimiento de líneas celulares Kc1,
SL2 y Sf9 transformadas con pAcIE1^{tr}Zeo, pAcIE1ZeoB o
pOpIE2ZeoB en concentraciones variables de Zeocin. Los constructos
plasmídicos que lleva cada línea celular y las concentraciones de
Zeocin (\mug/ml) utilizadas se indican en la figura.
Figura 6. Análisis de transferencia Southern de
genoma de líneas celulares transformadas con vectores de
resistencia al Zeocin y cultivadas con concentraciones de Zeocin
crecientes. Por encima de cada auto radiografía se muestran la
línea celular y el vector de transformación (el vector se utilizó
también como sonda). Los números encima de las rutas indican la
concentración de Zeocin (\mug/ml) en el medio, indicando Kc1 una
ruta de control no transformada. Se indican al margen los
marcadores de peso molecular en kilo bases. Las cabezas de las
flechas indican el tamaño del gen de resistencia al Zeocin.
Figura 7. El vector de clonación/transportador
p2Zeoks. Los sitios de clonación 10 se muestra, indicando el
asterisco (*) BamHI que se segmenta dos veces dentro de esta
región.
Figura 8a. Vectores de expresión de proteína de
línea celular de insecto que contiene un casete transportador de gen
de resistencia al Zeocin. Cada plásmido se designa mediante un
acrónimo donde: p, plásmido; 1Z/2Z, promotor ie1 ó ie2 que dirige la
expresión del gen de resistencia al Zeocin; Op2, promotor ie2 en el
casete de expresión de proteína; Mtn, metalo tioneina abeja de la
miel. Los constructos no están a escala.
Figura 8b. Vectores de expresión de línea celular
de insecto especializados. Los constructos no están a escala. lacO,
secuencia identificada por polimerasa T7; lacR, fragmento que
codifica el gen lacl y una señal de localización nuclear; teto,
secuencia operador tetraciclina; tTA, activador de transcripción
tetraciclina; rTA, activador de transcripción tetraciclina inversa;
UAS, secuencia activador aguas arriba. Las otras designaciones son
las mismas que en al figura 8a.
Figura 9. Inducción de actividad de
\beta-galactosidasa con CuSO4 en líneas celulares
Kc1 y SL2 de D. melanogaster transformadas de forma
transitoria con p2ZMtnF\beta-Gal o
p2ZOp2A\beta-Gal; constructos de gen indicador. El
Panel A muestra la actividad enzimática presente en el nódulo
celular y el Panel B el análisis correspondiente de transferencia
Western.
Figura 10. Análisis de transferencia Southern del
genoma de líneas celulares de insecto estables, clonales y
policlonales transformadas con el constructor indicador
pZOp2A\beta-Gal. Las rutas que contienen ADN de
líneas clonales SL2 se designan SL-C.# y las líneas
celulares policlonales se designan -PC. El ADN de la línea celular
en cada ruta es el siguiente: Sf, Spodoptera frugiperda Sf9;
Lymantria dispar (lagarta) Ld652Y; SL, D. melanogaster
SL2. Las rutas que contienen ADN de SL2 (SL), Sf9 (Sf) y Ld652y
(Ld) no transformado son las indicadas. Las rutas 1 y 2 se refieren
a ADN EcoRI o PstI-SalI-digerido,
respectivamente. El panel B.2 es una exposición más larga de una
parte del panel B.1 para potenciar las bandas en las rutas
Sf-PC y Ld-PC. Las cabezas de las
flechas en el margen izquierdo indican la posición de la
\beta-galactosidasa (ruta 1) y genes de
resistencia al Zeocin (ruta 2).
Figura 11. Análisis de transferencia Western de
melano transferrina humana (p97) expresada transitoriamente (Panel
A) o en líneas celulares de insecto transformadas (Panel B) después
de la transformación con Mtn (p2ZMtn97), +/- inducción con 500
\muM CuSO_{4} o constructos de gen promotor -p97 ie2
(p2Zop2C97). La proteína de la línea celular en cada ruta es la
siguiente: Kc, D. melanogaster KC1, Sf, S. frugiperda
Sf9; Ld, L. dispar Ld652Y; y SL, D. melanogaster SL2.
La ruta de control p97 contiene proteína p97
expresada-baculovirus semipurificada.
Figura 12a. Localización por inmunofluorescencia
del recombinante humano melanotransferrina (p97) en la superficie de
células transformadas Sf9.
Figura 12b. Constructos de deleción a base de gen
melanotransferrina (p97) comparado con el constructo nativo p97 así
como con los homólogos gallinas.
Figura 12c. Análisis de transferencia Western de
constructos de deleción p97. El lado izquierdo de la transferencia
contiene muestras de nódulos mientras que el lado derecho de la
transferencia contiene las muestras sobrenadantes correspondientes.
La muestra 120.6 está presente en la muestra sobrenadante.
Figura 12d. Producción de p97 segregado durante
el crecimiento del constructo de deleción 120.6 cultivado en un
matraz giratorio de 100 ml. La viabilidad utiliza el eje vertical
del lado izquierdo donde 1 es igual a 100%.
Figura 12e. Análisis de transferencia Western de
muestras sobrenadantes tomadas durante la fase de crecimiento del
constructo de deleción 120.6 en la figura 12d. Sf, control
negativo; p97, control positivo.
Figura 13a. Actividad biológica de péptido de
transporte de ión recombinante expresado en varias líneas celulares
de insecto o baculovirus. La cantidad de sobrenadante utilizada en
los ensayos se indica entre paréntesis.
Figura 13b. Análisis de transferencia Western de
muestras sobrenadantes tomadas de líneas celulares policlonales
transitorias o estables transformadas con los constructos Factor
X.
Figura 14. Vectores basados en transposón para la
expresión de proteínas en líneas celulares de insecto. Las cabezas
de las flechas indican la dirección de las repeticiones
invertidas.
Figura 15. Representación esquemática de la
introducción del casete de expresión de proteína basada en
transposón y sistema de amplificación.
Figura 16a. Expresión continua de
(\beta-galactosidasa por líneas celulares
policlonales SL2 MT\Delta2-3 transformadas con el
vector indicador basado en transposón P pDM79OPIE2 durante un
período de varios meses. La producción de transposasa fue inducida
mediante exposición a 250 \muM CuSO4 antes de la transformación.
Posteriormente, se recogieron las células por centrifugación, se
transformaron y colocaron en TC-100 no complementado
+ 7,5% de medio de suero bovino fetal (-\Delta-) o un medio que
contiene 100 CuSO_{4} (-\Delta-), 100 CuSO_{4} + 1 mg/ml
(G.418 (-\blacksquare-), o 1 mg/ml G-418
(-\bullet-). A las 18 semanas se procedió al "split" de las
líneas celulares resistentes G-418 y se cultivaron
en presencia (-\blacksquare-, -\bullet-), o en ausencia
(-\Box-, -\circ-) de presión selectiva antibiótica.
Figura 16b. Secuencias de extremos de elemento P
rescatados de una línea celular estable transformados con el vector
pDM79IE2. Las secuencias en negrita son secuencias de vector
mientras que el tipo normal es ADN cromosómico de la línea celular.
El segmento subrayado es la región duplicada 8 bp. Ninguna de las
secuencias cromosómicas o no -P son del vector original, lo cual
demuestra que se ha producido una transposición.
Figura 17. Expresión de proteína fluorescente
verde por línea celular policlonal SL2 MT\Delta2,3 transformada
con el vector indicador basado en transposón P, pDM79IE2GFP.
Las líneas celulares de díptero (D.
melanogaster) Kc1 y SL2 y las líneas celulares de lepidópteros
Sf9 (S. frugiperda), Ld652Y (L. dispar) y Cf1
(Choristoneura fumeferana) se sometieron a prueba para
comprobar su sensibilidad al Zeocin y establecer si el Zeocin era
tóxico en condiciones de cultivo standard para líneas celulares de
estas órdenes de insectos dispares. Se piensa que el Zeocin ejerce
sus efectos tóxicos al unirse con el ADN para inducir rupturas de
cadenas dobles. Se piensa que esta segmentación de cadena inhibe el
crecimiento al interrumpir la replicación del ADN, que interfiere a
su vez con la división celular subsiguiente. Por consiguiente, las
células destinadas ya a la división no se esperarían que se viesen
afectadas por el Zeocin hasta la siguiente ronda de replicación de
ADN; se esperarla por consiguiente que las células tratadas con
Zeocin pudieran dividirse una vez pero que no pudieran experimentar
más divisiones mitóticas, ya que su ADN ya no estará intacto.
Según lo que se comprende actualmente del
mecanismo de actuación del Zeocin, la concentración inhibidora
mínima de Zeocin se describe aquí como la cantidad de antibiótico
necesario para limitar el cultivo a una duplicación. Las curvas de
crecimiento para la determinación de las concentraciones
inhibidoras de Zeocin en las líneas celulares Kc1, SL2 y Sf9 (figura
4a) se realizaron por rotación de tubos micro centrifugadores de 1,5
ml, que contenían 1 ml de medio completo TC-100
(pH=6.2.) con 10% de suero bovino fetal (Life Technologies,
Gaithersburg, MD, EE. UU.), 0,5-1,0 x 10^{6}
células y concentraciones variables de Zeocin (que se puede
adquirir en Invitrogen, San Diego, California ) a 27°C. Las
muestras se removieron diariamente, se tiñeron con 0,4% de azul
tripan y se determinó el número de células viables por
cuadruplicado utilizando un hemocitómetro. Las concentraciones
mínimas inhibidoras de Zeocin que afectan las líneas celulares
Ld652Y y Cfl se determinaron sembrando aproximadamente 5.000 células
en un volumen total de 200 \mul de medio completo
TC-100 + suero bovino fetal 10% + Zeocin en pocillos
de placas de micro valoración de 96 pocillos. Se sacrificaron
diariamente pocillos individuales y se tiñeron con 0,4% de azul
tripan para determinar la viabilidad celular (figura 4b).
Las líneas celulares SL2 y Kc1 de D.
melanogaster y la línea celular L. dispar Ld652Y eran
extremadamente sensibles al Zeocin y mostraron reducciones notables
en las tasas de crecimiento con concentraciones de Zeocin de 10
\mug/ml, si bien el crecimiento de la línea celular SL2 no se vió
tan gravemente inhibido como el de Kc1. Las concentraciones de
Zeocin superiores a 50 \mug/ml y 75 mg/ml inhibieron más de una
ronda de división celular con líneas celulares Cfl y SL2,
respectivamente. Las líneas celulares Sf9 y Cfl fueron menos
sensibles a Zeocin y necesitaron concentraciones de por lo menos 250
\mug/ml para inhibir completamente la división celular ulterior.
Se comprobó que concentraciones de Zeocin de 800 y 250 \mug/ml
inhibían el crecimiento de las líneas celulares de Hi5 (T.ni) y 6/36
(mosquito) respectivamente.
Estos resultados muestran que Zeocin es un
antibiótico candidato para ser utilizado en un sistema de selección
para líneas celulares de insectos de órdenes dispares. La viabilidad
de dicho sistema de selección depende por supuesto de la
identificación, tratada anteriormente, de promotores que dirijan con
éxito la expresión adecuada en dichas líneas celulares a partir de
un gen heterólogo que confiere a dichas células resistencia al
Zeocin.
El gen indicador
\beta-galactosidasa se utilizó para evaluar la
eficacia de promotores seleccionados en una variedad de líneas
celulares de insectos dípteros y lepidópteros. Esto permitió la
evaluación y comparación de las resistencias de diversos promotores
diferentes en líneas celulares de insectos, antes de utilizarlos
para la expresión de genes que codifican la resistencia al
antibiótico u otras proteínas heterólogas.
Se construyeron vectores para probar la expresión
del promotor (mostrada en la figura 3) insertando el gen indicador
\beta-galactosidasa del plásmido pDM79 (Mismer and
Rubin, Genetics, 116:565-578(1987)) aguas
abajo del promotor derivado de diversos genes incipientes
inmediatos de baculovirus: el promotor Ac ie1 del gen Ac MNPV ie1
caracterizado en Cartier et al., J. Virol.,
68:7728-7737, (1994)); el promotor Op ie1 del gen
OpMNPV ie1 (caracterizado en Theilmann and Stewart, Virology,
180:492-508, (1991)); y el promotor OP ie2 del gen
OpMNPV ie2 (caracterizado en Theilmann and Stewart, Virology,
187:84-96,(1992)). Además, se comprobaron los
niveles de expresión en células de insectos de promotores virales
de mamífero de genes incipientes SV40 y CMV (obtenidos de vectores
comerciales que se pueden adquirir en Invitrogen, San Diego,
California). La construcción de estos vectores para comprobar la
expresión del promotor se examina a continuación.
El promotor Ac ie1 en el plásmido
pAcIE1^{hr}\beta-gal, que se construyó del
siguiente modo. Un fragmento 4,2 kb EcoRI del plásmido pDM79 que
contenía la región no traducida 5' alcohol de hidrogenosa D.
melanogaster y el sitio de comienzo de traducción AUG, el gen
\beta-galactosidasa y un terminador de
transcripción SV40 y señales de poliadenilación (pA) se subclonó en
el plásmido pBSIIKS (Stratagene Inc., La Jolla, CA, EE.UU). Después
de determinar la orientación se clonó un fragmento
PstI-SalI en el sitio PstI-SalI de
pIE1^{hr}/PA (Cartier et al., J. Virol.
68:7728-7737(1994)). Esto sitúa al promotor
Ac ie1 y a los elementos potenciadores (hr5) aguas arriba del gen
de fusión de transcripción de
\beta-galactosidasa.
Se probó el promotor Op ie2 en el plásmido
pOpIE2\beta-gal, que se construyó para contener
secuencias de promotor Op ie2 desde posiciones -661 a +315 respecto
del sitio de comienzo de la transcripción (véase figura 2a). En
este vector, los primeros 94 amino ácidos del gen OP ie2 se fusionan
al gen \beta-galactosidasa y 3' secuencias
derivadas de posiciones -95 a +131 respecto de la señal de
poliadenilación OP ie2 donde el primer A de SEQ ID 11: AATAAA se
designa como posición +1. Estas secuencias se clonaron en el sitio
PstI-EcoRI del vector pBSKS+ (Strategene, Inc, La
Jolla, CA, EE.UU.).
Se probó el promotor OP ie2 en el plásmido
pDM790pIE1, que se construyó insertando un fragmento de 598 bp
SalI-BamHI del gen OpMNPV ie1 que contenía el
promotor Op ie1, en el sitio SalI-BamHI de pDM79
(Mismer and Rubin, Genetics, 116: 565-578 (1987)
aguas arriba del gen \beta-galactosidasa.
Para facilitar la comparación directa con los
resultados del ensayo de expresión obtenidos del pDM790pIE1, se
colocó también el promotor Op ie2 en el fondo (background) del
vector pDM79. Este vector relevante, designado pDM790pIE2, se
construyó subclonando un fragmento 700 bp
HindIII-BamHI del gen OpMNPV ie2 que contenía el
promotor Op ie2 en pBSIIKS (Stratagene, Inc., La Jolla, CA.
EE.UU.). Este constructo se segmentó con SalI-BamHI
y el fragmento SalI-BamHI que contenía el promotor
Op ie2 se clonó en el sitio SalI-BamHI de
pDM79.
Se comprobaron las resistencias relativas de
diversos promotores de baculovirus en ensayos de expresión de
transformación transitoria,utilizando los constructos descritos
anteriormente: pAcIE1^{hr}\beta-gal,
pOpIE2\beta-gal, pDM79OpIE1, pDM79OpIE2. Se
transformaron con cada uno de estos vectores,líneas celulares de
díptero (D. melanogaster) Kc1 SL2 y líneas celulares de
lepidóptero Sf9 (S. frugiperda) y Ld652Y (L. dispar).
Las líneas celulares Kc1, SL2, Ld652Y y Sf9 se adquirieron en ATCC
(Rockville, MD, EE.UU.) y se mantuvieron en medio completo
TC-100 complementado con 10% de suero bovino fetal
(Life Technologies, Gaithersburg, MD, EE. UU.) a 27°C. La
transformación de las líneas celulares se realizó utilizando
Cellfectin (Life Technologies, Gaithersburg, MD, EE.UU.) siguiendo
los protocolos del fabricante. Se purificó en gradientes CsCl,
plásmido ADN para transformaciones de línea celular. Se prepararon
dos microgramos de plásmido ADN y 5 \mul de Cellfectin como
partes individuales de 0,5 ml en medio de insecto Grace no
complementado (Life Technologies, Gaithersburg, MD), se mezclaron y
luego se incubaron durante 30 minutos a 20°C. Se recolectaron
aproximadamente 1,0 x 10^{6} células, se granularon a 500 rpm en
una centrifugadora "benchtop" y se resuspendieron con cuidado
en 1,0 ml de solución Cellfectin/ADN en tubos de plástico 5,0 ml.
Los tubos e incubaron horizontalmente a 27°C durante 4 horas y
entonces se granularon las células y se resuspendieron en 3,0 ml de
TC-100, complementado con una mezcla
antibiótica-antimicótica de 10% FBS y 1X (Life
Technologies, Gaithersburg, MD).
Después de la transformación, las células se
llevaron a placas de cultivo tisular de 6 pocillos y se incubaron a
27°C. Aproximadamente 48 horas después de la introducción del
plásmido ADN se determinó la actividad
\beta-galactosidasa granulando 0,5 ml de células
a 500 rpm, resuspendiendo en 60 ml de 0,25 M
tris-HCl (pH 7.4) y
congelando-descongelando tres veces. Los residuos
celulares se granularon a 14.000 x g en una microcentrifugadora y
(Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, EE.UU (1972)). Los resultados de
los ensayos de \beta-galactosidasa se describen a
continuación y las tasas relativas de enzima se recogen en la Tabla
1.
Las líneas celulares Kc1, SL2 y Sf9 transformadas
con el vector de expresión pDM7OpIE1 produjeron
8-30 unidades de actividad de
\beta-galactosidasa. Las líneas celulares
transformadas con el vector de expresión pDM79OpIE1 produjeron
70-200 unidades de actividad de
\beta-galactosidasa. El resultado no previsto de
este ensayo es que el vector pDM79OpIE2 (con el promotor Op ie2)
produjo 5-10 veces más actividad que el vector
pDM79OpIE1 (con el promotor Op ie1).
El promotor Op ie2 fue incluso más activo en un
fondo vector diferente. Las líneas celulares transformadas con
pOpIE2\beta-gal produjeron 10-100
veces más actividad de \beta-galactosidasa que las
líneas celulares transformadas con pDM79OpIE2. Se encontraron
niveles de actividad de \beta-galactosidasa
cercanos a 800, 2.000 y 20.000 unidades en líneas celulares
transformadas de Ld652Y, D. melanogaster y Sf9
respectivamente. El constructo OpIE2\beta-gal
consiste en una fusión dentro del marco de lectura (inframe) entre
la región de codificación amino-terminal Op ie2 con
el gen de \beta-galactosidasa. El aumento de la
expresión de \beta-galactosidasa con
pOpIE2\beta-gal demuestra que las secuencias
inmediatamente proximales al sitio de comienzo de la traducción en
el gen Op ie2 son importantes en la mediación de niveles máximos de
expresión génica en células de lepidópteros (Tabla 1). Esta
secuencia proximal incluye un motivo CAGT, previamente identificado
en otros genes incipientes de baculovirus (Blissad and figura 2a
aunque también pueden participar secuencias que flanquean el sitio
de comienzo de traducción.
En las líneas celulares de D.
melanogaster, el promotor
potenciador-menos Op ie2 (en el vector
pZOp2A\beta-gal) hizo inesperadamente de mediador
de la expresión de niveles de \beta-galactosidasa
comparables al promotor Ac ie1 con el potenciador hr5 (en el
vector pIE^{hr}\beta-gal). Se obtuvo un
resultado similar con líneas celulares transformadas Sf9, en las
que el promotor potenciador - menos Op ie2 (en
pZOp2A\beta-gal) presentaba también niveles de
\beta-galactosidasa comparables al promotor Ac ie1
con el potenciador hr5. La actividad del promotor Op ie2 (en
(pOpIE2\beta-gal) fue 10 veces superior en la
línea celular Sf9 que en las líneas celulares de D.
melanogaster.
Cuando se utilizó el plásmido pZeoSVlacZ
(Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.) como vector de transformación,
se comprobó que el promotor/potenciador SV40 no tenía ninguna
actividad detectable en ninguna de las líneas celulares de insecto
sometidas a prueba. Esto se corresponde con estudios de
transformación previamente comunicados sobre línea celular de D.
melanogaster (Bourouis and Jarry, EMBO J.,
2:1099-1104(1983)). Además, las líneas
celulares utilizando el vector original pZeoSV (véase más abajo)
que utiliza el promotor CMV para impulsar la expresión del gen de
resistencia al Zeocin, no consiguió generar ninguna línea celular
de Sf9 o D. melanogaster resistente al Zeocin.
Al parecer, el promotor CMV de mamífero fue incapaz de dirigir la transcripción adecuada en el sistema del insecto.
Al parecer, el promotor CMV de mamífero fue incapaz de dirigir la transcripción adecuada en el sistema del insecto.
El comportamiento del promotor Op ie2 en líneas
celulares de mamífero se determinó transformando diversas líneas
celulares de mamífero obtenidas en ATCC (Rockville, MD, EE.UU.) con
el plásmido pOpIE2\beta-gal utilizando Cellfectin
(Life Technologies, Gaithersburg, MD, EE.UU.) según las
recomendaciones de los fabricantes. Estas líneas celulares se
mantuvieron en medio MEM o DMEM (Life Technologies, Gaithersburg,
MD, EE.UU.) completado con 10% FBS a 37°C bajo 5% de CO_{2}.
No se observó ninguna actividad de
\beta-galactosidasa 48 horas después de la
transformación de líneas humanas (CaCO-2 y
HEP-G2), caninas (MDCK) o de ratón (J774A10) con el
constructo pOpIE2\beta-gal. Por consiguiente,
dentro de los límites de los protocolos de transfección y ensayo de
\beta-galactosidasa, el promotor Op ie2 no
parece funcionar en estas líneas celulares de mamífero.
La figura 3 ilustra varias realizaciones de
vectores transportadores diseñados para la expresión del gen de
resistencia a ble Zeocin tanto en insectos como en bacterias. Estos
vectores transportadores se construyeron colocando un promotor
incipiente inmediato de baculovirus directamente aguas arriba del
promotor sintético bacteriano EM-7. El promotor
incipiente inmediato de baculovirus y el promotor procariótico
están ligados operativamente al gen ble aguas abajo (del vector
pZeoSV, obtenido en Invitrogen, San Diego, California). En estos
vectores transportadores nuevos, el promotor incipiente inmediato de
baculovirus dirige la expresión del gen ble en células de insecto
transformadas y el promotor procariótico dirige la transcripción en
un anfitrión procariótico adecuado, como E. coli. Otros
promotores procarióticos pueden sustituir el promotor
EM-7 en estos constructos. La construcción de los
vectores transportadores ilustrada en la figura 3 se describe a
continuación.
El término "ligado operativamente", cuando
se describe la relación entre dos regiones ADN, significa que están
funcionalmente relacionados entre sí. Por ejemplo, una secuencia de
promotor está ligada operativamente a otra secuencia si el promotor
controla la transcripción de la otra secuencia.
El plásmido pAcE1^{hr}Zeo se construyó clonando
un fragmento 50 bp PstI-SalI de pZeoSV que contenía
el promotor bacteriano sintético EM-7 y el gen de
resistencia a Zeocin en el sitio PstI-SalI de
pAcIE1^{hr}/PA (Cartier et al., J. Virol,
68:7728-7737).
El plásmido pAcIE1ZeoB se construyó del siguiente
modo. El plásmido pZeoSV fue digerido con BamHI para remover el
promotor/potenciador SV40 y el casete de expresión de señal de
poli-adenilación y se religó entonces para formar
pZeoB. Se colocó un fragmento 470 bp PstI-NheI (de
extremo embotado con nucleasa de judía de Mungo) de
pAcIE1^{hr}/PA que contenía el promotor AcIE-1
sin el elemento potenciador en el sitio PstI-SspI de
pZeoB aguas arriba del promotor EM-7 y del gen de
resistencia al Zeocin.
El plásmido pOpIE2ZeoB se construyó insertando un
fragmento 500 bp PstI-BspHI que contenía el
promotor OpIE2 en los sitios PstI-BspHI de pZeoB
aguas arriba del promotor EM-7 y del gen de
resistencia al Zeocin.
Se realizó en la forma descrita anteriormente la
transformación de líneas celulares con Cellfectin. Después de la
transformación, las células se llevaron a unas placas de cultivo
tisular de 6 pocillos y se incubaron durante otras 24 horas a 27°C.
En ese momento, las células se dividieron 1:10 y se eligieron líneas
celulares resistentes al Zeocin con la adición de 150 \mug/ml (Kc1
y SL2) ó 500 \mug/ml (Sf9) de Zeocin al medio. Estas
concentraciones representan un incremento de dos a tres veces por
encima de la concentración de inhibición mínima para estas líneas
celulares. Con respecto a las células de díptero, estas
concentraciones son similares a las utilizadas para la selección de
higromicina B (200 \mug/ml; Blochinger and Digglemann, Mol. Cell.
Biol., 4:2929-2931(1984)) y varias veces
inferiores a la que se utiliza habitualmente para la selección de
resistencia a G418 (500 a 1000 \mug/ml; Rio and Rubin, Mol. Cell.
Biol., 5:1833-1838(1985)).
Las observaciones microscópicas de la morfología
celular no transformada revelaron que las células afectadas
aumentaron exageradamente de tamaño y en algunos casos perdieron
integridad y experimentaron lisis. En el caso de las líneas
celulares Sf9 y Ld652Y, que suelen permanecer fijadas a la
superficie de la placa de cultivo tisular, la lisis fue precedida
por pérdida de fijación. Este fenotipo entre las células sensibles
al Zeocin resultó altamente ventajoso y ayudó al aislamiento
subsiguiente de colonias individuales transformadas resistentes, ya
que las células no transformadas fueron retiradas de la superficie
de la placa dejando las células transformadas libres para formar
colonias.
La frecuencia a la que se producen
espontáneamente células de insecto resistentes a Zeocin en el
cultivo es inesperadamente reducida. Las transformaciones Mock
realizadas en ausencia de plásmido ADN o con plásmidos que no
poseen el gen de resistencia no dieron como resultado células de
insecto resistentes a Zeocin. Esta característica inesperada y
ventajosa del sistema de selección de Zeocin de la invención
contrasta con las tasas de resistencia espontáneamente
relativamente elevadas que han sido comunicadas en sistema de
selección que emplean antibióticos tales como
G-418.
Se generaron poblaciones de células resistentes
dentro de las 3-4 semanas de la transformación. Las
células resistentes se quitaron de la selección durante varias
generaciones antes de volverlas a colocar en condiciones selectivas
a diversas concentraciones de Zeocin. No se aislaron clones
individuales resistentes a Zeocin; las células resistentes a Zeocin
se mantuvieron como cultivos policlonales.
En la figura 5 se muestran curvas de crecimiento
para líneas celulares transformadas. Las líneas celulares Kc1 y SL2
que poseen el constructo pAcIE1^{hr}Zeo eran resistentes a
Zeocin, a concentraciones superiores a 1,0 mg/ml. Las tasas de
crecimiento celular prácticamente no se pudieron distinguir al
aumentar las concentraciones del antibiótico. Esto representa un
aumento de resistencia de 10 a 100 veces por encima de la
concentración de inhibición mínima para estas líneas celulares. La
línea celular Kc1 transformada con el constructo promotor Ac ie1
que carecía de las secuencias de potenciador hr mostró niveles más
bajos de resistencia que las líneas celulares correspondientes que
poseen los elementos potenciadores. Lo anterior da a entender que
se podrían construir variaciones de la invención en las cuales los
elementos hr se combinan con el promotor Op ie 2. En líneas
celulares Kc1 transformadas con el promotor Ac ie1 que carece de
los elementos potenciadores, no se observó multiplicación celular si
las concentraciones de Zeocin excedían de 500 \mug/ml.
Para determinar la eficacia del promotor Op ie 2
en dirigir la transcripción del gen de resistencia a Zeocin, se
transformaron células Kc1 y Sf9 con el plásmido pOpIE2ZeoB. La línea
celular resultante Kc1 era resistente a concentraciones de Zeocin
superiores a 1,0 mg/ml. Las tasas de crecimiento con concentración
de antibiótico incrementada fueron similares a la línea celular Kc1
transformada con el constructo pAcIE1^{hr}Zeo. La línea celular
transformada Sf9 podía propagarse a niveles de Zeocin de hasta 1,5
mg/ml sin inhibición apreciable del crecimiento celular. Esto
muestra el resultado sorprendente de que el promotor
potenciador-menos Op ie2 funciona al igual que el
promotor Ac ie1 con elementos potenciadores hr acompañantes.
Según se ha indicado anteriormente, varios
sistemas de selección conocidos presentan la característica no
deseable de que las secuencias de transformación ADN se amplifican
con el tiempo en presencia de selección antibiótica. Estas
secuencias ADN amplificadas pueden ser inestables y pueden perderse
rápidamente en ausencia de selección continuada. Esta sección
describe experimentos que ponen de relieve la estabilidad de
secuencias de transformación en líneas celulares de insectos
transformadas en resistencia a Zeocin de acuerdo con la presente
invención.
Para evaluar la estabilidad de las secuencias ADN
de transformación en líneas celulares de la presente invención, se
eligieron líneas celulares transformadas en resistentes a Zeocin,
luego se hicieron crecer durante varias generaciones
(2-3 semanas) en ausencia de Zeocin y luego se
volvieron a colocar bajo selección a diversas concentraciones de
Zeocin y se hicieron crecer hasta fase estacionaria incipiente
(aproximadamente 6-8 días). Se utilizó entonces el
análisis Southern para evaluar la estabilidad de las secuencias ADN
transformadas.
Se aisló entonces el ADN genómico total de las
líneas celulares, de la siguiente forma: se granuló a baja
velocidad en una micro-centrifugadora durante 3
minutos una parte de 1,5 ml que contenía aproximadamente
5-10 x 10^{6} células; el gránulo celular se
resuspendió en 0,5 ml buffer HB [7 M urea, 2% SDS, 50 mM
Tris-HCl (pH = 7,5), 10 mM EDTA y 0,35 M NaCl]; la
solución resultante se extrajo tres veces con 0,5 ml de
fenol-cloroformo (1:1) y el ADN se precipitó
añadiendo 1/10 volumen de 3 M acetato sádico y 0,6 volúmenes de
isopropanol; el ADN se secó bajo vacío, se resuspendió en 100 \mul
de buffer TE [10 mM TrisHCl (pH = 0,8), 1 mM EDTA], y se trató con 1
\mul de 10 mg/ml RNAse A (Sigma, St. Louis, MO) durante 30 minutos
a 37ºC. Se reprecipitó el ADN, se lavó con etanol al 70%, se secó
bajo vacío y se resuspendió en 50 \mul de buffer TE.
Se procedió a la digestión de cinco migramos de
ADN genómico total con PstI y SalI, se separaron por electrofóresis
sobre gel agarosa y se transfirieron (blotted) sobre membranas de
nylon (Sambrook et al., 1989). Se realizó el análisis de
transferencia Southern con el sistema
quimio-luminiscente ECL (AMER sham, Inglaterra)
utilizando todos los constructos plásmidos de la invención como
sondas.
Las transferencias Southern de ADN línea celular
no transformada SL2 y Sf9 sondadas con el constructo Zeocin no
mostraron ninguna señal de hibridación. Los análisis de
transferencia Southern del ADN genómico total de líneas celulares
transformadas indican que el constructo de transformación se había
integrado de forma estable en el ADN genómico (figura 6). Debido a
la naturaleza policlonal de las líneas celulares, se observaron
diversas bandas en cada vía. Sin embargo, el número de bandas y la
intensidad sigue siendo constante al aumentar las concentraciones de
Zeocin, lo cual indica que la población policlonal es estable y que
la amplificación génica no se ha seleccionado para aumentar la
resistencia al Zeocin.
Se puede por lo tanto sacar la conclusión de que
los promotores Op ie2 y Ac ie1^{hr} utilizados para dirigir la
expresión del invención proporcionan un producto génico amplio para
la resistencia a concentraciones elevadas de Zeocin.
Estos resultados muestran una ventaja inesperada
de la presente invención, es decir estabilidad de las secuencias ADN
de transformación. La estabilidad de las secuencias ADN de
transformación en líneas celulares de la invención contrasta con las
comunicaciones del estado de la técnica, mencionadas anteriormente,
que describen la frecuencia con la cual puede producirse la
amplificación y la inestabilidad genómica concomitante cuando se
utilizan sistemas de selección del estado de la técnica.
El vector transportador de resistencia al Zeocin
p2Zeoks (figura 7) se construyó del siguiente modo: se insertó un
fragmento 83 bp ApaI-NotI que contenía una porción
del sitio de clonación múltiple de pBSIIKS en los sitios
ApaI-NotI de pZeoB, creando el plásmido pZeoBKS; el
plásmido pZeoBKS fue dirigido entonces con NotI y PstI y el
fragmento resultante de 750 bp se ligó al fragmento
NotI-PstI de 1340 bp de pOpIE2ZeoB, dando como
resultado el vector transportador p2Zeoks (figura 7).
El vector p2Zeoks utiliza el promotor génico Op
ie2 para impulsar la expresión del gen de resistencia a Zeocin ble
en células de insectos y el pequeño promotor procariótico sintético
EM-7, del vector original pZeoSV, para dirigir la
expresión en un anfitrión procariótico como E. coli. La
selección de clones transformados de E. coli puede
realizarse utilizando LB modificado (10 g/l de triptón, 5 g/l de
extracto de levadura, 5 g/l de cloruro sódico, pH 7.5) a
20-25 \mug/ml de Zeocin. La selección en líneas
celulares de insectos puede realizarse en presencia de 150
\mug/ml de Zeocin para líneas celulares de D. melanogaster
y 250 \mug/ml de Zeocin para células Sf9.
El vector p2Zeoks es relativamente pequeño (2090
bp), y maximiza el tamaño de secuencias heterólogas que se pueden
clonar en el vector. Estas secuencias heterólogas pueden insertarse
en el sitio de clonación múltiple que tiene 10 sitios únicos de
enzima de restricción (BamHI, XholI, ClaI, HindIII, EcoRV, EcoRI,
SpeI, XbaI, NotI y SacII) disponibles para la clonación.
Las series p2Z de vectores transportadores de
expresión de insecto constitutiva (figura 8a) se derivan de la
clonación y del vector transportador p2ZeoKS (figura 7). La serie
p2Z ilustra que los vectores de la invención pueden utilizar un
promotor compuesto constituido por un promotor incipiente inmediato
de baculovirus y un promotor procariótico, ambos ligados
operativamente a un gen marcador seleccionable. En las serie p2Z de
la figura 8, se combina un promotor Op ie2 u Op ie1 con el promotor
bacteriano sintético EM-7 para impulsar la
expresión del gen ble y conferir resistencia a Zeocin en las
células de insecto y E. coli. Este promotor híbrido es capaz
de actuar como mediador de la resistencia al Zeocin en una amplia
gama de anfitriones, inclusive E. coli, las líneas celulares
de D. melanogaster Kc1 y SL2, las líneas celulares de
lepidóptero Sf9 y Ld652Y así como líneas celulares de mosquito. La
construcción de la serie p2Z de los vectores se describe a
continuación.
Para construir p2ZOp2A se insertó un promotor
adicional Op ie2 en p2ZeopKS, del siguiente modo: el plásmido
p2ZeoB se segmentó con BamHI, el 5' saliente (verhang) se rellenó
(filled-in) utilizando polimerasa ADN Klenow con
dNTPs, y luego se segmentó con NotI; se subclonó un fragmento
HindiIII/BamHI de pOpIE-NbamHI (Theilmann and
Stewart, Virology, 187:84-96 1992) que contenía el
promotor Op ie2, en el sitio HindiIII/BamHI de pBKSII; este
constructo se segmentó con HindIII, se obtuvo extremo embotado
utilizando polimerasa ADN Klenow con dNTPs y luego se segmentó con
NotI; este fragmento que contenía el promotor Op ie2 se ligó al
vector pZeoB desde arriba para obtener p2ZOp2A. Este nuevo
constructo mantiene un sitio de clonación múltiple, que contiene
seis sitios únicos de enzima de restricción, aguas bajo del promotor
Op ie2. Este vector puede resultar adecuado para la expresión de
cDNAs de longitud completa o promotor-menos genes
que poseen una señal de poli-adenilación (pA) en
una amplia variedad de líneas celulares de insecto.
Para facilitar la expresión de genes que carecen
de señales pA o examinar el efecto de las señales estabilizadoras
mRNA sobre la expresión de gen heterólogo, creamos variantes del
vector p2ZOp2A que tenían la señal pA del gen incipiente SV40
(p2ZOp2C) o la señal pA del gen Op ie2 (p2ZOp2F).
Se construyó el plásmido p2ZOp2C insertando un
fragmento de EcoRI/SacII que contenía la secuencia de señal pA de
gen incipiente SV40 de pZeoSV en el sitio EcoRI/SacII de
p2ZOp2A.
El plásmido p2ZOp2F se construyó del siguiente
modo: la secuencia pA del gen OP ie2 se amplificó con PCR
utilizando los oligo-nucleótidos (designados 5' a
3') SEQ ID NO2: CGCGGATCGATATCTGACTAAATCTTAGTTTG
TATTGTCATGT y SEQ ID NO3: CGGGTGCGCACGCGCTTGAAAGGA; el producto PCR se clonó en el sitio SacII de p2ZOp2A que se había embotado utilizando polimerasa ADN T4; el sitio de clonación múltiple se expandió utilizando dos conjuntos de oligonucleótidos complementarios, el primer conjunto SEQ ID 4: ATACGTTGGTACCCTC
GAGCTAGCTAATTCTGGATTCCT y SEQ ID 5: CTAGAAGGATCCAGAATTCAGCTGAGCTCGAGGTACCAA
GCTTTA) se hibridó e insertó en el sitio EcoRI/XbaI y el segundo conjunto (SEQ ID 6: CTAGACCGGTCATATGCGG
GCCGCGGATCGATCGAT y SEQ ID 7: ATCGATCGATCCGCGGCCGCATATGACCGT) insertó en el sitio XbaI/
EcoRV.
TATTGTCATGT y SEQ ID NO3: CGGGTGCGCACGCGCTTGAAAGGA; el producto PCR se clonó en el sitio SacII de p2ZOp2A que se había embotado utilizando polimerasa ADN T4; el sitio de clonación múltiple se expandió utilizando dos conjuntos de oligonucleótidos complementarios, el primer conjunto SEQ ID 4: ATACGTTGGTACCCTC
GAGCTAGCTAATTCTGGATTCCT y SEQ ID 5: CTAGAAGGATCCAGAATTCAGCTGAGCTCGAGGTACCAA
GCTTTA) se hibridó e insertó en el sitio EcoRI/XbaI y el segundo conjunto (SEQ ID 6: CTAGACCGGTCATATGCGG
GCCGCGGATCGATCGAT y SEQ ID 7: ATCGATCGATCCGCGGCCGCATATGACCGT) insertó en el sitio XbaI/
EcoRV.
La presencia de secuencias homólogas en el mismo
vector, como las dos señales SV40 pA en p2ZOp2C indica la
posibilidad de que se puede producir la recombinación entre
secuencias homólogas SV40 pA, si bien esto no lo hemos encontrado
con los anfitriones habitualmente utilizados rec E. coli. Las
personas expertas en la materia entenderán que la utilización de
señales pA derivadas de insecto pueden resultar funcionalmente
ventajosas en células de insectos. Por consiguiente, se incorporó
un sitio de clonación múltiple expandido (MCS) con 13 sitios únicos
de enzima de restricción en los vectores derivados F que poseen las
secuencias de señal pA Op ie2. Además, estos vectores también
contienen codones de terminación de traducción en los tres marcos de
lectura para permitir la impresión de genes truncados. El cebador
SEQ ID 8:5'TCGGGTGCGCACGCGCTTGAAAGGA3', es específico de la
secuencia de señal pA Op ie2 y se puede utilizar para secuenciar la
región de fusión intra-marco y resulta útil para el
análisis de series de deleción 3' ordenadas.
Para seguir eliminando secuencias homólogas
dentro del mismo vector, se desarrollaron las series p1Z que
utilizan el promotor Op ie1 para impulsar el gen de resistencia al
Zeocin, haciendo que el promotor más activo Op ie2 sea el único
disponible para dirigir la expresión de gen ajeno. El vector
p1ZOp2A se generó clonando un fragmento SalI/BamHI de pOPIE1B74BamHI
(Theilmann and Stewart,
Virology,187:84-96(1992)) que contenía el
promotor Op ie1, se clonó en el sitio SalI/Bg/II de un vector de
transición. Ulteriormente se insertó un fragmento NruI/PstI en el
sitio BspHI (de extremo embotado utilizando polimerasa ADN Klenow
con dNTPs)/PstI de p2ZOp2A sustituyendo el promotor Op ie2 que
estaba dirigiendo el gen de resistencia a Zeocin.
Se creó el plásmido plZOp2F insertando un
fragmento 700 bp HaeII que contenía el MCS de p2ZOp2F en los sitios
HaeII de p1ZOp2A.
Para permitir la selección de líneas celulares
estables que produzca proteínas heterólogas bajo la transcripción
del promotor Opie2, pero sin la presencia del gen de resistencia a
Zeocin, se construyó otro vector. Este vector, designado pAmp2E se
construyó del siguiente modo (figura 8a). Un fragmento 1553 bp
BspHI de p2ZOp2E que contenía el promotor Opie-2,
sitio de clonación múltiple insecto poli A cola y sección ColEI se
ligó a un fragmento 1,0 kb BspHI de pBluescriptIIks que contenía el
gen de resistencia a la ampicilina. El gen
B-lactamasa proporciona la resistencia requerida
para la selección en bacteria bajo selección de ampicilina pero no
se proporciona ningún marcador seleccionable para la selección en
células de insectos. Este vector pAmp2E tiene la aptitud de dirigir
la expresión de proteína heteróloga y puede utilizarse con otros
vectores de selección como G418, higromicina, metotrexato u otros
vectores de selección, en experimentos de
co-transformación sin que esté presente el gen de
resistencia al Zeocin. En situaciones en las que no es posible la
selección de Zeocin, debido posiblemente a la previa selección de
una línea celular con el gen de resistencia a Zeocin, este vector
permitirá la producción de proteína heteróloga, seleccionando con
otros marcadores de selección disponibles para la transformación
estable de esta línea celular.
Permite también la mezcla de un vector de
producción de proteína heteróloga con cualquier vector de
selección, en proporciones tales que maximiza la producción de
proteína en una línea celular seleccionada estable. Estas
proporciones entre los vectores pueden incluir proporciones entre
el vector de expresión heterólogo y el vector de selección de: 1:1,
2:1, 5:1, 10:1 o cualquier otra combinación que selecciona una línea
celular estable y produce la máxima cantidad de proteína
heteróloga.
La aptitud para segregar una proteína heteróloga
en el medio de cultivo resulta beneficiosa para el procesamiento
aguas abajo de la proteína. Varios ejemplos en esta solicitud
demuestran que las células de insectos son capaces de segregar
grandes cantidades de proteínas heterólogas. Además de estas señales
de secreción ya demostradas en el texto
(melano-transferrina, transferrina, ITP), se
añadieron a los vectores las señales de secreción de bombixina y
melitina (figura 8a).
La señal de secreción de bombixina se preparó
hibridando los dos oligonucleótidos siguientes SEQ ID 14: BBXF
5'-AATTATGA-AGATACTCCTTGCTATTGCATTAATGTTGTCAACAGTAATGTGGGTGTCAACAAGCTTA-3'
y SEQ ID 15: BBXR
5'-CTAGTAAGCTTGTTGACACCCACATTACTGTTGACAACATTAA-TGCAATAGCAAGGA
GTA TCTTCAT. Este fragmento hibridado se insertó en el sitio EcoRI/BamHI de p2ZOp2D. Este intermedio se segmentó con HindIII/Pst y se hibridó al fragmento HindIII/PstI de p2ZOp2F que contenía el MCS, ori, y promotor ie-2 para crear p2ZOp2G.
GTA TCTTCAT. Este fragmento hibridado se insertó en el sitio EcoRI/BamHI de p2ZOp2D. Este intermedio se segmentó con HindIII/Pst y se hibridó al fragmento HindIII/PstI de p2ZOp2F que contenía el MCS, ori, y promotor ie-2 para crear p2ZOp2G.
La señal de secreción de melitina de la abeja de
la mie1 se quitó del vector pRSETB-HBM (Invitrogen,
EE.UU.) como un fragmento 50 bp NdeI (parcialmente relleno con dTNP
y Klenow)/Eco/RI. Esto se ligó a p2ZOp2F se segmento con HindIII
(parcialmente relleno con dATP, dGTP, dCTP y Klenow) y EcoRI y se
ligó al fragmento anterior para crear p2ZOp2I.
La expresión de proteínas foráneas,
particularmente aquellas que mantienen su función en las fronteras
de especies eucarióticas puede trastornar la fisiología celular
hasta tal extremo que se reduce considerablemente la expresión
proteínica total. Estas proteínas nocivas pueden producirse en
sistemas de líneas celulares que utilizan promotores inducibles
para mantener la cantidad de proteína dentro de niveles
fisiológicamente tolerables. Por ejemplo, se ha utilizado el
promotor hsp 70 para actuar como mediador de la expresión de
canales de iones de cloruro "gated" (Shotkoski et al.,
FEBS Lett.,380:257-262(1996)) y el promotor
Mtn se utilizó para controlar la expresión del oncógeno humano
H-ras (Johansen et al., Genes Develop.,
3:882-889 (1989)).
Para construir un vector transportador de
expresión de insecto inducible de la invención, se incorporó el
promotor Mtn en el vector p2ZMtnF insertando un fragmento 500 bp
SalI/EcoRI de pMT-1 (Kovach et al., Insect
Mol. Biol.,1:37:43 (1992) que contenía el promotor Mtn, cuyo extremo
se había embotado utilizando polimerasa ADN Klenow con dNTPs en el
sitio BamHI de p2ZeoB que se había embotado también. El vector
resultante p2ZMtn, se segmentó con XbaI, se embotó el extremo
utilizando polimerasa ADN Klenow con dNTP's y luego se volvió a
segmentar con PstI obteniéndose un fragmento que contenía el gen de
resistencia al Zeocin y el promotor Mtn. Este fragmento se ligó a
un fragmento PstI/HindIII (embotado utilizando polimerasa ADN
Klenow y dNTP2) de p2ZOp2F que contenía el MCS expandido y el
origen de replicación para obtener el vector p2ZMtnF. El vector
p2ZMtnF contiene un MCS expandido para la clonación eficaz así como
la señal pA de Op ie2 y puede proporcionar expresión transgénica
inducible regulada en líneas celulares de insectos, inclusive
líneas celulares de D. melanogaster y mosquito.
La utilización del promotor Mtn como el promotor
inducible en vectores de la invención puede presentar ciertas
ventajas con respecto a la utilización de los promotores hsp. Por
ejemplo, se puede producir de forma continua proteína a partir del
promotor Mtn utilizando bajos niveles de sales de cadmio o de cobre
para inducir el promotor sin efectos extremos sobre la fisiología
del anfitrión. En cambio, el promotor hsp 70 produce niveles bajos
de producto constitutivamente y la inducción requiere choques
térmicos periódicos (Berger and Rudolph, Invertebrate Cell System
Applications, CRS Press, Inc., Boca Raton, FL (1989) que puede
perjudicar el crecimiento celular.
Se construyó un vector de expresión inducible que
utiliza el sistema represor lac. Se construyeron dos vectores para
evaluar la efectividad de este sistema en células de insectos y
proporcionar un control estricto de proteínas extremadamente
tóxicas. El plásmido p2ZOp2J-1 se construyó clonando
un fragmento 235 bp BgIII/NotI de pET28a (Novagen) que contenía la
región lacO, un sitio de ligazón de ribosoma, un codón de
iniciación traduccional ATG seguido de His y marcas de proteína T7
(tags), dentro del sitio BamHI/NotI de p2ZOp2F. Para las proteínas
tóxicas, este vector proporciona también la regulación de la
actividad del promotor críptico ie-2 en la bacteria,
cuando está presente el represor lac.
El plásmido p2ZOp2J-3 se
construyó del siguiente modo. Se clonó un fragmento BgIII/NotI de
pOP13CAT que contenía un intron SV40 con tres regiones internas
lacO dentro del sitio BamHI/NotI de p2ZOp2A. Se aisló de este
intermediario un fragmento de PstI/NotI (embotado con Klenow y
dNTP's) que contenía la combinación SV40 intron/lacO y se ligó con
un fragmento de PstI/PvuII de p2ZOP2F para obtener
p2ZOp2J-3 9 (figura 8b).
Se construyó del siguiente modo un vector para
expresar el represor lac. Se amplificó un fragmento que contenía el
represor lac del vector pet2l (Novagen) que contenía el lacl
utilizando los siguientes cebadores SEQ ID 12:
5'-TCAGCTGCAG ATGAAGAGGC CTAGACCTAT GAAACCAGTA
ACGTTATACG ATGTC-3'; y SEQ ID 13:
5'-ACTTAAGCTT ATAGCGATGA CTGCCCGCTT TCCAGTCGGG
AAACCTGTCG-3'. El segundo cebador contiene la
secuencia de señal de localización unclear necesaria para dirigir la
proteína del represor lac hacia el núcleo. Este fragmento se
segmentó con PstI/HindIII y se insertó en el sitio PstI/HindIII de
pOp1/pA para obtener pOp1lacR (figura 8b).
El sistema Tet se basa en dos elementos
reguladores derivados del operón de resistencia a la tetraciclina
del transposón E. coli Tn 10: la proteína represora tet
(TetR) y la secuencia ADN Tet operador (tetO) con la que
interacciona TetR. Este sistema suele recibir el nombre de
Tet-Off ya que la adición de tetraciclina detiene
la transcripción. Un TetR alternativo contiene diversos cambios de
amino ácidos que causan la activación transcripcional en presencia
de tetraciclina. Este sistema recibe el nombre de
Tet-On.
El vector p2ZOp2T contiene un promotor híbrido
que consta del promotor Opie2 y siete copias de tetO. Se construyó
quitando el fragmento 300 bp XhoI/SacI (hecho remo utilizando T4
polimerasa y dNTP's) de pTRE (Clontech) e insertándolo en el sitio
Xhol/NarI (embotado con Klenow y dNTP's) de
pBKSOpIE-2. Esto sitúa al operador Tet aguas arriba
del elemento promotor mínimo del promotor Opie-2. A
partir de este intermediario de clonación se puso un fragmento 800
bp Xhol (embotado con Klenow y dNTP's)/ EcoRI que contenía el
promotor Tet/Op ie-2 en el sitio BspHI (embotado
con dNTP's)/EcoRI de plZOp2F para obtener plZOp2T (figura 8b).
El segundo componente clave del sistema es un
plásmido "regulador" que expresa una proteína híbrida conocido
como el activador transcripcional tet-controlado
(tTA). tTA liga la secuencia operador Tet (teto) y activa de este
modo la transcripción en ausencia de tetraciclina. Por
consiguiente, al añadirse tetraciclina al medio de cultivo, se
detiene la transcripción en función de la dosis. El fragmento 1 kb
EcoRI/BamHI que codifica tTA se quitó de prTt-Off
(Clontech, EE.UU.) y se clonó en el sitio EcoRI/BamHI de p2ZOp2D
obteniendo el plásmido p2ZOp2DtTA que es comparable al sistema
Tet-Off (figura 8b). El fragmento 1 kb EcoRI/BamHI
de Tet-On (Clontech) también se clonó en el sitio
EcoRI/BamHI de p2ZOp2D obteniendo el plásmido p2ZopDrtTA que es
comparable al sistema Tet-On (figura 8b).
El sistema de control ga14 permite el control muy
estricto de un gen utilizando un sistema de dos etapas. El gen
heterólogo se coloca detrás de un conjunto de secuencias
activadoras, aguas arriba (UAS), derivado de una familia de genes
gal 4 y un promotor mínimo derivado del gen hsp 70. La transcripción
requiere la presencia del producto génico gal 4, que es controlado
por el promotor mtn. Una vez activado el promotor mtn, se fabrica
gal 4 y éste a su vez fija los sitios UAS y activa la transcripción
del gen heterólogo.
El fragmento 3 kb NotI de pGaTN que contiene el
gen gal 4 se insertó en el sitio NotI de p2ZmtnF para obtener
p2ZmtnFgal4 (figura 8b). Este vector se utiliza para inducir la
expresión del producto génico gal 4 utilizando métodos descritos
anteriormente en esta patente y se utilizó para construir líneas
celulares que podían inducirse para expresar gal 4. También se
pueden utilizar otros sistemas promotores inducibles para impulsar
la producción de gal 4.
Se creó del siguiente modo el vector p2ZUASmPF
(figura 8b). Un fragmento 400 bp SphI (embotado con T4 y
dNTP's)/XbaI que contenía cinco UAS de pP[UAST] se insertó
en el sitio BspHI (embotado con Klenow y dNTP's)/
XbaI de p2ZOp2F. Este vector contiene los cinco UAS, un promotor mínimo, un sitio de clonación múltiple y permite la selección bajo Zeocin. Para crear un constructo indicador B-gal, el fragmento 3 kb EcoRI B-gal de p2ZmtnFB-gal se colocó en el sitio EcoRI para crear p2UASmPFB-gal.
XbaI de p2ZOp2F. Este vector contiene los cinco UAS, un promotor mínimo, un sitio de clonación múltiple y permite la selección bajo Zeocin. Para crear un constructo indicador B-gal, el fragmento 3 kb EcoRI B-gal de p2ZmtnFB-gal se colocó en el sitio EcoRI para crear p2UASmPFB-gal.
Se construyeron plásmidos que contenían casetes
indicadores de \beta-galactosidasa o proteína
fluorescente verde (GFP) (figura 8) para evaluar la utilidad de los
sistemas de expresión de la invención en una variedad de líneas
celulares de insecto. A continuación, se describe la construcción de
cada uno de los vectores de expresión proteínica.
El plásmido p2ZOp2A\beta-gal se
construyó insertando un fragmento 4.2 kb EcoRI de pDM79 que contenía
la región no traducida alcohol dehidrogenasa 5' de D.
melanogaster y el sitio de inicio de la traducción AUG, el gen
E. coli lacZ y un terminador de transcripción SV40 y la
señal de poli-adenilación (pA) en el sitio EcoRI de
p2ZOp2A.
El plásmido p2ZOp2C-GFP se creó
insertando un fragmento 800 bp EcoRI de pGFP 10:1 (Chalfie et
al., Science, 263: 802-805 (1994)) que contenía
la región codificadora GFP en el sitio EcoRI de p2ZOp2C.
El plásmido p2ZMtnF\beta-gal se
generó insertando el fragmento de gen 4.2 kb EcoRI
\beta-galactosidasa descrito anteriormente en el
sitio EcoRI de p2ZMtnF.
Como la actividad de
\mu-galactosidasa se puede determinar
cuantitativamente, el plásmido indicador
p2ZOp2A\beta-Gal se puede utilizar para predecir
la cantidad de proteína ajena que se puede producir en una línea
celular específica. Los análisis de expresión transitoria
utilizando 2 \mug de plásmido p2ZOp2A\beta-Gal y
10\mul de liposoma catiónico Cellfectin (Life Technologies,
Gaithersburg, MD) dieron rutinariamente como resultado niveles de
actividad de \beta-galactosidasa próximos a 800,
3.000 y 20.000 unidades en Ld652Y, líneas celulares D.
melanogaster y Sf9 respectivamente.
Como las líneas celulares muestran niveles de
moderado a elevado de actividad endógena de
\beta-galactosidasa, como Ld652Y, el plásmido
indicador GFP se puede utilizar para estimar la capacidad de
producción. Además este marcador no obstrusivo permite determinar
el nivel de expresión proteínica en células individuales. Este
pequeño casete indicador formado por el promotor Op ie2, la región
codificadora GFP y una terminación de transcripción y secuencia pA
se puede incorporar fácilmente en un vector de expresión proteínico
heterólogo o co-transformarse de concierto con el
vector de expresión proteínico heterólogo. Ulteriormente se pueden
seleccionar células individuales que muestran un alto grado de
fluorescencia y por consiguiente niveles más elevados de expresión
proteínica heteróloga utilizando un sistema de selección celular
activado por fluorescencia (FACS) sin destrucción irreversible de
fisiología celular.
La aptitud para incorporar un casete de selección
antibiótica, un casete de expresión proteínica heteróloga y un
casete indicador dentro del mismo vector resulta muy ventajosa y es
consecuencia de la forma en que se diseñaron los casetes y vectores
individuales de la invención. El pequeño tamaño de estos vectores
permite clonar genes relativamente grandes, manipularlos y
expresarlos sin necesidad de subclonación laboriosa o
reclasificación en vectores cósmidos y bacteriófagos. De lo anterior
se desprende que también podrían aplicarse al sistema de selección
de la invención otros marcadores no obstrusivos tales como
proteínas de membrana integral que se pueden detectar utilizando
anticuerpos marcados.
Se comprobó la expresión inducible mediada por
vectores de la invención en líneas celulares de D.
melanogaster en análisis de expresión transitorios utilizando
plásmido indicador p2ZMtn\betaGal (figura 9). Después de la
transformación, se produjo la inducción del promotor Mtn añadiendo
50-1000 \muM CuSO_{4} (concentración final) de
una solución de reserva (stock) de 100 mM. Las células se llevaron
a placas de cultivo tisular con seis pocillos y se incubaron durante
otras 48 horas a 27°C, recolectándose entonces las células,
granulándose a 4.000 x g en una micro-centrifugadora
y resuspendiéndose en 60 \mul de 0,25 M TrisHCl (pH 7.4). Las
células fueron lisadas tres veces por congelación/descongelación,
los residuos se granularon una vez más y se determinó
cuantitativamente la actividad de
\beta-galactosidasa en el sobrenadante según
métodos standard. Se realizó el análisis del método Western
separando electroforéticamente 10 \mug de proteína celular sobre
10% de geles SDS-PAGE y trasladando a una membrana
de nitrocelulosa. Se detectó la
\beta-galactosidasa utilizando
anti-\beta-galactosidasa
monoclonal de ratón (Promega, Madison, WI) como anticuerpo primario
con una dilución de 1/10000 y anticuerpo
antiratón-cabra conjugado con peroxidasa de rábano
picante (BioRad Richmond, CA) como secundario a una dilución de
1/20000, seguido de detección utilizando el sistema
quimio-luminiscente ECL (Amersham, Oakville,
ON).
En ausencia de inducción, la actividad de
\beta-galactosidasa solo fue ligeramente superior
(4-7 unidades) a la actividad endógena de base (2,5
unidades) y no se pudo detectar utilizando el análisis del método
Western. La adición de concentraciones crecientes de CuSO_{4} dio
como resultado unos aumentos respectivos en la producción de
\beta-galactosidasa según se comprobó 48 horas
después de la transformación. En los análisis transitorios
utilizando una concentración de CuSO4 de 1000 \muM, la inducción
de expresión de \beta-galactosidasa fue
aproximadamente de 5 a 10 veces inferior a la observada para líneas
celulares, en las cuales la expresión constitutiva fue mediada por
el promotor Op ie2. Dentro de los límites de sensibilidad del
análisis de \beta-galactosidasa, el promotor Mtn
dejó de funcionar, constitutivamente o con inducción en líneas
celulares Sf9 o Ld652Y.
El sistema inducible lacI/LacO también se puede
utilizar en líneas celulares de insecto. El análisis del método
Western de gránulos de células de insecto de 48 horas procedentes
de transformaciones con p2ZOp2FlacR o pOp1LacR, utilizando el
anticuerpo LacR disponible en el comercio (Stratagene, EE.UU.)
demostró que el represor Lac se había fabricado en células de
insecto. Para generar clones estables que expresen el represor Lac
se cotransfirió este clon dentro de líneas celulares de insectos con
la serie de vector p2ZOp2J. Se realizó la
co-transfección utilizando 1 \mug de p2ZOp2J y
pOp1LacR respectivamente con 10 \mul de Cellfectin.
Utilizando p2ZOp2J-1ó-3 con
\beta-galactosidasa como indicador en células Sf9
se comprobó que la represión del indicador B-gal se
producía con el constructo p2ZOp2J-1 (50 unidades),
aunque la represión era óptima con el constructo
p2ZOp2J-3 (10 unidades). La adición de un 1 mmol
IPTG (isopropil \beta-D-tio
galactosidasa) permitió la de-represión del sistema
y la producción de B-galactosidasa de 400 unidades a
partir de p2ZOp2J-1B-gal y 500
unidades de p2ZOp2J-3B-gal.
El análisis ulterior, utilizando otras líneas
celulares de insectos que incluían, sin que esto suponga
limitación, Ld652Y, Hi5 y Kc1, demostró que el sistema represor lac
trabajaba igualmente bien en estos sistemas.
El sistema tet se puede utilizar también en
células de insectos. Si bien la expresión de este sistema es
inferior a la del vector pariente p2ZOp2F debido a la creación de
un promotor mínimo, el vector tiene el beneficio añadido de una
estricta regulación, que desempeñará un papel importante en la
expresión de cascadas de enzimas. Utilizando B-gal
como indicador, se comprobó la aptitud de estos constructos para
controlar la expresión de B-galactosidasa. La
co-transfección de p2ZOp2TB-gal y
p2ZOp2DtTA (Tet-Off) en células de insecto demostró
que en presencia de doxiciclina (derivado de la tetraciclina) la
cantidad de B-galactosidasa producida no era
superior a los niveles de base. Al quitar la doxiciclina se produjo
un incremento 10 veces superior en la cantidad de
B-gal produci-
da.
da.
La co-transfección del vector
p2ZOp2TB-gal y p2ZOp2DrtTA (Tet-On)
en células de insecto demostró que en ausencia de doxiciclina
(derivado de la tetraciclina) la cantidad de
B-galactosidasa producida tampoco era superior a la
base. La adición de doxiciclina dio como resultado un incremento 4
veces superior en la cantidad de B-gal producida por
encima de la base.
Ambos experimentos demuestran que el sistema Tet
funciona como un sistema inducible en células de insec-
tos.
tos.
Para comprobar el sistema gal 4 en líneas
celulares de insecto se colocó el vector
p2ZUASmPFB-gal en líneas celulares de insecto que
albergaban el constructo p2ZmtnFgal4. Alternativamente, los
constructos se podían co-transfectar a líneas
celulares. No se detectó ninguna actividad B-gal en
líneas celulares de insecto transitorias y estables. Tras añadir 500
\muM de sulfato de cobre para inducir el mtn promotor, se encontró
que la expresión B-gal era superior a 100 unidades,
lo cual indica que este sistema de inducción resulta funcional en
células de insecto. La ventaja de este sistema de inducción con
respecto a los sistemas anteriores es el sistema de control de dos
etapas que puede ser crítico cuando se trata de cascadas de enzimas
o vías/vehículos de transducción de señales que requieren un control
preciso on/off (iniciación/parada). Proporciona también un tercer
sistema para introducir un producto génico inducible en células de
insectos. Esto resulta esencial cuando se estudian sistemas de
cascada que requieren puntos de control múltiple.
La capacidad de las líneas celulares
transformadas, estables de la invención para expresar proteínas
ajenas se examinó generando líneas celulares policlonales Sf9, SL2
y Ld652Y así como diversas líneas celulares clonales SL2 que
poseían el constructo pZOp2A\beta-Gal.
La transformación se realizó del siguiente modo.
Se transformaron aproximadamente 2 X 10^{6} células con 2 \mug
de plásmido células se llevaron a placas de cultivo tisular de 6
pocillos y se permitió la recuperación y expresión del marcador de
resistencia durante 48 horas. En ese momento, las células se
dividieron 1:10 y se seleccionaron líneas celulares policlonales
resistentes con la adición de 150, 250 y 1000 \mug de Zeocin
(Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.) con las líneas celulares Ld652Y,
de D. melanogaster y Sf9, respectivamente.
Las líneas celulares clonales SL2 se generaron
por dilución limitada, colocando 1 X 10^{3} células que se habían
dejado recuperar durante 48 horas en pocillos individuales de una
placa de microvaloración de 96 pocillos con 1 X 10^{4} células de
alimentación no transformadas. Aparecieron clones aislados en una
parte de los pocillos al cabo de 2-3 semanas.
Se aisló el ADN genómico total en la forma
descrita anteriormente. Se realizó la digestión de cinco microgramos
del ADN análisis de transferencia Southern se realizó con el
sistema quimio-luminiscente ECL (Amersham,
Inglaterra) utilizando todo el plásmido
pZOp2A\beta-Gal como sonda. La transferencia
Southern confirmó que las líneas clonales eran efectivamente
uniformes y habían sido transformadas con el vector. Según lo
esperado, las transferencias Southern sobre el ADN aislado de
líneas celulares de control no transformadas SL2 Sf9 y Ld652Y no
mostraron ninguna señal de hibridación.
Al mantenerse bajo selección constante, las
líneas celulares "policlonales" Ld652Y, Sf9 y SL2 expresaron
2,6 y 5500 unidades de \beta-galactosidasa,
respectivamente, después de 20 pasadas (aproximadamente 5 meses).
Las líneas clonales estables SL2 expresaron en 1000 y 4000 unidades
de \beta-galactosidasa. En ausencia de selección
antibiótica, la producción de \beta-galactosidasa
por la línea celular policlonal SL2 declinó, estabilizandose
eventualmente en unas 1000 unidades. El análisis de transferencia
Southern reveló que esta declinación en la producción enzimática no
era debida a una pérdida correspondiente de secuencias de vector.
Esto plantea la posibilidad de que el silenciamiento genómico de una
fracción de los casetes de expresión puede ocurrir en ausencia de
presión selectiva, como se ve muchas veces con transgénicos (Meyer,
TIBTECH, 13:332-337(1995)).
El análisis de transferencia Southern de las
líneas celulares clonales y policlonales de expresión
\beta-galactosidasa (figura 10) muestran que
existe una correlación entre el número de copias del vector y la
expresión de la enzima. La capacidad relativa de las líneas
celulares derivada de diferentes especies para expresar proteínas
heterólogas se puede potenciar desarrollando criterios para la
transformación y la selección que maximicen la absorción e
integración del vector ADN.
La caracterización del promotor Op ie2 indica que
contiene un número de elementos de secuencia funcional diferentes.
La información publicada con anterioridad así como la información
aquí revelada indican que se pueden construir según la presente
invención nuevos promotores que presentan homología con elementos de
secuencia funcionalmente importantes del promotor Op ie2.
Las secuencias del promotor de actuación 5' cis
de Op ie2 se analizaron inicialmente mediante análisis de deleción
grueso utilizando constructos indicadores de cloranfenicol acetil
transferasa (CAT) en líneas celulares de insecto lepidóptero Ld652Y
y Sf9 (Theilmann and Stewart, Virology,
187:84-96(1992)). Los niveles de expresión
CAT fueron mucho más elevados en células Sf9, lo cual permitió un
análisis más sensible del promotor Op ie2.
El análisis de deleción preliminar identificó dos
elementos repetidos que parecían estar involucrados en dirigir la
expresión desde el promotor Op ie2 ((Theilmann and Stewart,
Virology, 187:84-96(1992)). La secuencia de
consenso de los elementos repetidos son SEQ ID 9: CTTATCGG y SEQ ID
10: ACAGGACGC, designados los elementos GATA e IEB2. Los elementos
GATA e IEB2 se repiten siete y seis veces, respectivamente en el
promotor ie2. El elemento GATA es idéntico al que al parecer liga
los factores celulares en los promotores OpMNPV efg/gp64 y
AcMNPVpe38 (Krappa et al., J. Virol.
66:3404-3503(1992)). El elemento IEB2 no se
ha encontrado en ningún otro promotor de baculovirus. Los elementos
GATA e IEB2 se encuentran tres veces como elementos emparejados en
el promotor Op ie2 (figura 1a y 2).
Para el análisis de deleción se construyó un
plásmido indicador del promotor Op ie2, pIE-2CAT,
colocando el gen CAT 20 bp aguas abajo del sitio de comienzo de
transcripción Op ie2 utilizando ligantes BamHI. La región del 5'
promotor se derivó de las secuencias Op ie2 1-677 y
las secuencias 3' poliadenilación (pA) se derivaron de las
secuencias Op ie2 1865 a 2010 (Theilmann and Stewart, Virology,
187:84-96(1992)). El gen CAT se obtuvo como
el fragmento BamHI del plásmido pCAT (Mackett et al., J.
Virol., 949:857-864(1984)). Se generaron
subclones de deleción (5' a 30) de la región del promotor utilizando
ExoIII y judía de Mungo o Ba131 exonucleasa (Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY
(1989); Yanisch-Perron et al., Gene,
33:103-119(1985)). Los constructos de
deleción pIE-2CAT 5' a 3' se transfectaron a células
Sf9 y Kc1, se recolectaron las células y procesaron para los
análisis CAT (Neumann et al., BioTEchniques
5:444-448(1987) y los resultados se recogen
en la figura la. El promotor mínimo o basal necesario para obtener
niveles detectables de expresión CAT del promotor Op ie2 en células
Ld652Y, Kc1 y Sf9 era 125 bp, 46 bp y 98 bp aguas arriba del sitio
de iniciación de la transcripción, respectivamente (figura 1a). El
análisis de deleción fino de la región del promotor Op ie2 se
realizó para determinar la significación funcional de los elementos
reguladores específicos Op ie2. Las deleciones hasta el 177 bp no
afectaron de forma significativa la expresión máxima CAT en células
Sf9 y Ld652Y (la secuencia de IE-2 de -177 bp a 0
bp en la figura 2a corresponde a SEQ ID Nº: 1 de bp 351 a bp 527).
La deleción ulterior de 24 pares de base adicionales a la posición
- 152 da como resultado hasta un 75% de reducción de la expresión
de CAT. La región entre las posiciones -177 y -152 contiene un par
de elementos GATA e IE2B. La expresión se sigue reduciendo hasta
aproximadamente 10% de los niveles máximos cuando se procede a la
deleción de 30 bps adicionales de las posiciones -154 a -125. Esta
región contiene dos elementos IE2B. La deleción ulterior de pares de
base -125 a -114, que elimina la mayoría de una secuencia GATA en
un par de elementos GATA-IE2B da como resultado
niveles de expresión casi indetectables.
En algunas realizaciones, con células Kc1, puede
existir una correlación entre la declinación en la actividad del
promotor y el aumento en la deleción del 5' promotor (figura la).
Sin embargo, a diferencia de las líneas celulares de lepidóptero,
únicamente se necesita una sola secuencia GATA para la actividad de
promotor mínima detectable en células Kc1. La adición de más copias
de GATA aumenta la actividad del promotor en células Kc1, al igual
que ocurre con la inclusión de secuencias GATA-IE2B.
Se consigue en esta realización una actividad plena del promotor
cuando están presentes la Repetición IIA y B.
Estos resultados indican que los pares
GATA-IE2B son elementos reguladores del promotor
ie2. Estos datos sugieren que pueden construirse variaciones
funcionales del promotor Op ie2 de acuerdo con la presente
invención, que incluyen secuencias homólogas a las secuencias de Op
ie2 entre -177 a -114. En particular, se pueden diseñar nuevos
promotores funcionales que incluyen secuencias homólogas al par de
elementos GATA IE2B.
Se realizó un estudio de construcción de
promotores híbridos con el fin de aumentar la actividad del
promotor, utilizando componentes del promotor ie-2
(véase figura 1b). Utilizando el constructo de deleción -237 5' como
la base (p2ZS237) se realizó cierto número de combinaciones de
promotor híbrido sintético y se comprobaron en tres líneas
celulares utilizando el indicador CAT. La duplicación de la región
237 dio como resultado un aumento mínimo en la actividad del
promotor con respecto al constructo p2ZS237. La triplicación de la
región produjo un aumento de 1,8 y 1,5 veces el aumento en la
actividad de CAT en células Ld652Y y Sf9 respectivamente, mientras
que en las células Kc1 el resultado fue una disminución de la
actividad. Una secuencia de potenciador (OpE) identificada aguas
abajo del gen Opie-2 se añadió también al constructo
5' o 3' al gen base-promotor/CAT, en orientación
más o menos. La secuencia potenciador OpE se identifica como 12
repeticiones completas o parciales del elemento 66 bp SEQ ID 16
5'-CCTTT CAAGC GCGTGCGCAC CCGAAAAGCA GGGTCGCCGC
TGACGACTC CTAAAAATA GCACGCG-3' (Theilmann and
Stewart, Virology 187:97-106(1996)). En todos
los casos, la inclusión del potenciador OpE permitió un aumento
aproximadamente de la actividad dos veces superior al promotor de
base en células Ld652Y. Con células Sf9 únicamente cuando el
potenciador era 5' para el promotor en la orientación menos se pudo
ver un aumento en la actividad del promotor. Las células Kc1
mostraron un incremento de dos veces en la actividad del promotor
con el potenciador 5' para el promotor en cualquier orientación. La
orientación más del potenciador 3' para el gen dio un aumento de
1,5 veces la actividad mientras que en la orientación menos se
observó una disminución en la actividad del promotor.
Estos resultados contribuyen a demostrar que
varias combinaciones de promotor híbrido resultan útiles para
aumentar la producción de proteína de diversas líneas celulares; en
una realización, la combinación
p2ZS237-OpE5-proporciona la
actividad más potenciada en líneas celulares.
La figura 2 muestra una alineación de las
secuencias del promotor del gen OpMNPV ie2 y el gen homólogo ien
del AcMNPV relacionado. La alineación se realizó utilizando el
programa UWGCG GAP (Devereux et al, Nucl. Acids Res.,
12:387-395(1984)). La alineación de
secuencia en la figura 2 muestra que la región -177 a -114 de Op
ie2, que es necesaria para la actividad máxima de Op ie2, no
contiene casi ninguna homología con el promotor AcMNPV ien. El
promotor ien no incluye el elemento IE2B del promotor Op ie2. Otra
distinción entre los promotores Op ie2 e ien se puede apreciar en
los resultados de la deleción de la zona Op ie2 -275 a -257. La
deleción Op ie2 -275 a -257 quita la Repetición IB que es altamente
homóloga a un elemento en el promotor AcMNPV ien, que resulta ser un
elemento regulador positivo de actuación cis para el promotor
AcMNPV ien en células Sf9 (Carson et al., J. Virol.,
65:945-951(1991). Los resultados de la
deleción que aquí se dan indican que no es esencial una copia
completa de la región Repetición IB para un alto nivel de expresión
de Op ie2 en células Sf9, distinguiendo funcionalmente el promotor
Op ie2 del promotor AcMNPV ien.
Se da un número de ventajas inesperadas asociado
con la utilización del promotor Op ie2 en vectores transportadores
de la presente invención. Según lo indicado anteriormente, en
vectores transportadores de la invención, el promotor Op ie2
presenta inesperadamente niveles más elevados de expresión génica
heteróloga que en el promotor potenciador-menos Ac
ie1 en líneas celulares de D. melanogaster o
Spodoptera. Además, los análisis de
\beta-galactosidasa de líneas celulares
transformadas, descritos aquí, indican que la actividad del
promotor Op ie2 se limita a células de insectos, sin que pueda
detectarse función alguna en las líneas celulares de mamíferos.
Este último dato resulta sorprendente, ya que se ha comunicado el
resultado opuesto para el promotor Ac ie1, es decir la función
activa en células de mamíferos (Carbonell et al., J. Virol.,
56:153-160(1985)).
El resultado inesperado de que el promotor Op ie2
no funciona en células de mamífero confiere a los vectores de la
presente invención una ventaja importante con respecto a los
vectores del estado de la técnica que utilizan promotores que pueden
funcionar en células de mamífero. La utilización de vectores de la
presente invención que incorporan el promotor Op ie2 minimiza el
potencial de transferencia accidental de genes heterólogos activos
a organismos no-diana. Por consiguiente, la
utilización de estos vectores de la presente invención puede salvar
la aplicación de las restricciones impuestas debidamente a los
estudios transgénicos, en los que la naturaleza de los constructos
génicos relevantes sugiere la posibilidad de que se pudieran
transferir genes heterólogos a anfitriones inesperados y expresarse
en los mismos.
Los elementos de la secuencia Op ie2
identificados aquí por el análisis de deleción puede ser
responsable de las propiedades inesperadas del promotor Op ie2:
actividad en una amplia gama de células de insectos permisivas y no
permisivas a replicación del baculovirus intacto; falta de
actividad detectable en células de mamífero; y niveles de expresión
que rivalizan con los de otros promotores relacionados aunque sin
el requisito de elementos potenciadores. Las personas expertas
reconocerán que la secuencia precisa del promotor Op ie2 que se
produce naturalmente se puede modificar hasta cierto grado para
proporcionar promotores que funcionan de la misma forma, para
ofrecer resultados similares, situándose dichas modificaciones
dentro del ámbito de la presente invención.
Tal como se utiliza aquí, en referencia a las
secuencias de ácido nucleico, los términos "homología" o
"homólogo" denotan un grado de identidad de secuencia y de
semejanza funcional. Las secuencias homólogas que se producen
naturalmente pueden estar relacionada evolutivamente en el sentido
de que comparten una secuencia ancestral común. Se pueden crear
también artificialmente secuencias homólogas mediante síntesis o
mutagénesis. En cualquier caso, las secuencias homólogas como las
identificadas aquí presentan un grado suficiente de identidad de
secuencia para conferir funciones biológicas similares a las
secuencias. El término "homología" se utiliza aquí para
referirse al grado de identidad de secuencia entre dos secuencias,
de tal modo que las secuencias homólogas pueden poseer grados
variables de homología, es decir de identidad de secuencia. Los
expertos reconocerán que las secuencias que tienen una homología
sustancial en segmentos funcionalmente importantes de una
secuencia, tales como los elementos de la secuencia GATA e IE2B Op
ie2 identificados aquí por análisis de deleción, pueden presentar
propiedades biológicas similares, incluso donde otras regiones de
dichas secuencia no muestran homología significante. Las secuencias
homólogas tienen de preferencia regiones de homología sustancial.
Homología sustancial entre secuencias o entre porciones de
secuencias significa por lo menos un 75% de identidad de secuencia,
de preferencia por lo menos 90% de identidad de secuencia y todavía
mejor por lo menos 95% de identidad de secuencia entre dichas
secuencias.
En una realización, la presente invención
comprende un promotor de insecto que tiene homología con, y es
capaz de funcionar como un promotor de baculovirus incipiente
inmediato. Dicho promotor puede presentar homología con cualquier
promotor de baculovirus incipiente inmediato que se produzca
naturalmente y sería capaz de funcionar en lugar de dicho promotor
para mediar en la expresión génica en el sistema de baculovirus.
Dichos promotores tienen una homología sustancial con un promotor
de baculovirus incipiente inmediato que se produce naturalmente en
regiones funcionalmente importantes de dicho promotor que se
produce naturalmente, como los elementos de la secuencia GATA e
IE2B Op ie2 identificados aquí por análisis de deleción.
Alternativamente, dichas secuencias de promotores pueden presentar
homología sustancial con un promotor de baculovirus incipiente
inmediato que se produce de forma totalmente natural, como Op ie2.
Alternativamente, un promotor de insecto que tiene homología con, y
es capaz de funcionar como un promotor de baculovirus incipiente
inmediato puede caracterizarse por la propiedad de hibridarse con
dicho promotor de baculovirus incipiente inmediato en condiciones
restrictivas. Las condiciones restrictivas para dicha hibridación
dependen de la secuencia y serán diferentes en circunstancias
diferentes. Por lo general, se eligen condiciones restrictivas
aproximadamente 5°C inferiores al punto de fusión térmica (T_{m})
para la secuencia específica a una resistencia iónica y pH
definidos. La T_{m} es la temperatura (bajo resistencia iónica y
pH definido) a la cual hibridan el 50% de secuencias perfectamente
ajustadas. En algunas realizaciones, las condiciones restrictivas
serán aquellas en las cuales la concentración de sal es
aproximadamente 0,02 molar o inferior a un pH 7 y la temperatura es
por lo menos en torno a 60°C para secuencias relativamente
cortas.
Se examinó la capacidad de los vectores de la
invención para dirigir la expresión de proteínas heterólogas
altamente modificadas generando constructos que contenían
melano-transferrina humana que codifica cADN
(también conocida como p97) bajo el control de los promotores
constitutivos (Op ie2) o inducibles (Mtn).
La melano-transferrina es una
sialo-glico-proteína que se
transporta a la superficie exterior de la célula, donde queda fijada
por medio de un anclaje de
glicosil-fosfatidil-inositol en
lugar de dominios transmembrana hidrófobos típicos (Food et
al., J. Biol. Chem.,
269:3034-3040(1994)). La proteína se
describió por vez primera como marcador de diagnóstico específico
de melanoma (Brown et al., Proc. Natl. Acad,. Sci. USA,
78:539-543(1981)) y se comprobó ulteriormente
que estaba presente en niveles elevados en los tejidos del cerebro
de pacientes de Alzheimer (Jefferies et al., Brain Res.,
712:122-126(1996)). Los constructos
inducible p2ZMtn97 y constitutivo p2ZOp2C97 se generaron clonando un
fragmento EcoRI-NruI de pA3-2 que
contenía toda la región codificadora de proteína de p97 cADN en el
sitio EcoRI-PvuII del vector de expresión de
mamífero pZeoSV para generar pZeoSV97. Posteriormente se subclonó un
fragmento EcoRI-BglII que contenía la región
codificadora p97 más una secuencia Sv40 pA de pZeoSV97 en el sitio
EcoRI-BamlHI de p2ZOp2A para generar p2ZOp2C97 (un
constructo de expresión constitutiva). En otra serie se subclonó un
fragmento SpeI-BglII de pZeoSV97 en el sitio
XbaI-BglII de p2ZMtn para generar p2ZMtn97 (un
constructo de expresión inducible). Las células se transformaron con
2 \mug de ADN purificado con CsCl y 10 \mul de Cellfectin como
se describe anteriormente. En análisis transitorios las células se
recolectaron 48 horas después de la transformación, se granularon a
4.000 x g en una micro-entrifugadora y se
resuspendieron en 50 \mul de buffer de lisis celular [20 mM
Tris-HCl (pH 7.2), 0,15 M NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP40 y
0,5 mM de fluoruro de
fenil-metil-sulfonilo]. Se
seleccionaron en la forma descrita anteriormente líneas celulares
clonales transformadas establemente, si bien Sf9 no necesitó la
adición de células de alimentación a los pocillos de
microvaloración. Se realizó el análisis de transferencia Western
por medio de electrofóresis, separando 10 \mug de proteína sobre
10% de geles SDS-PAGE no desnaturalizantes y se
transfirió a membranas de nitrocelulosa. Se detectó la proteína p97
utilizando el anticuerpo monoclonal L235 anti-p97
como anticuerpo primario con una dilución de 1/10 de sobrenadante de
cultivo en salino con tampón de fosfato y anticuerpo
anti-ratóncabra conjugado-peroxidasa
rábano picante (BioRad, Richmond, CA) como secundario con una
dilución de 1/20.000, seguido de detección con el sistema
quimio-luminiscente ECL (Amersham Oakville, ON).
El análisis de transferencia Western de líneas
celulares de insecto transformadas transitoriamente utilizando un
anticuerpo monoclonal p97- específico reveló que las líneas
celulares de Sf9 D. melanogaster y, en menor medida, Ld652Y
eran capaces de expresar niveles detectables de p97 (figura 11A).
Esto demuestra la necesidad de sistemas, como los que hemos
diseñado, capaces de expresión en una variedad de líneas celulares.
Se generaron líneas celulares clonales Sf9 y SL2, transformadas,
estables, que expresan p97 utilizando los promotores constitutivos
ie2 o inducibles Mtn, respectivamente (figura 11B). Estas líneas
celulares no mostraron, bajo selección, ninguna reducción en la
expresión de p97 después de 12 pasadas a lo largo de tres meses. Al
igual que ocurrió con las líneas celulares productoras de
\beta-galactosidasa, el análisis de transferencia
Southern mostró una correlación entre el número de copias de vector
y los niveles relativos de expresión de proteína. El peso molecular
de p97 producido por las células Sf9 era similar al de p97
baculovirus-expresado, siendo ligeramente inferior
el peso molecular del p97 producido a partir del mismo constructo
en células de D. melanogaster. El p97 derivado del sistema
baculovirus tenía un peso molecular ligeramente inferior al p97. Dos
electrofóresis dimensionales revelaron que la diferencia de peso
molecular entre el p97 expresado en células humanas y el p97
expresado por el baculovirus en células Sf9 se debe a la falta de
modificaciones de carbohidrato complejo. Finalmente, el anticuerpo
monoclonal L235 utilizado para detectar p97 es específico de un
epítopo que encierra un enlace cruzado disulfuro dentro de la
proteína. La proteína p97 no es solamente altamente procesada sino
también altamente plegada y por consiguiente la detección de
recombinante p97 en estas líneas celulares de insecto no solamente
refleja su capacidad para sintetizar el polipéptido sino también
para gestionar organizaciones estructurales secundarias y terciarias
complejas.
Dos formas de proteína p97 se presentan
naturalmente en los mamíferos. Aproximadamente el 80% del p97
humano fijado a la superficie celular por medio de un anclaje de
glicosil-fosfatidil-inositol (GPI)
con enlace covalente con el término carboxilo de la proteína. Una
segunda forma, que constituye aproximadamente el 20% del p97 total,
se exporta de la célula al interior del fluido extracelular
mediante un mecanismo desconocido hasta la fecha (Food et
al., J. Biol. Chem.,
269:3034-3040(1994)).
Se utilizó inmuno-fluorescencia
indirecta para determinar la localización celular precisa del p97
heterólogo expresado en líneas celulares de insecto. Se dejó que
las células transformadas se adhirieran a cubreobjetos de cristal
que habían sido revestidos previamente con una solución de 1 mg/ml
de poli-L-lisina (400.000 MW)
dejando secar durante 30 minutos. Los porta-objetos
se enjuagaron en salino con tampón de fosfato (PBS) y se fijaron
durante 5 minutos en para-formaldehído al 4%, recién
preparado, seguido de una incubación durante 45 segundos en una
solución 1:1 de metanol: acetona. Los portaobjetos se enjuagaron
tres veces en PBS, y luego se incubaron en 0,5% de Triton
X-100 en PBS durante 10 minutos seguido de tres
enjuagues adicionales en PBS. Las células se bloquearon durante 20
minutos en FATS (20% de suero fetal de ternera, 0,5%
Tween-20 en PBS) seguido de una incubación de 60
minutos con el anticuerpo monoclonal L235 anti-p97
(utilizando como sobrenadante hibridoma no diluido) en una cámara
humedecida. Los portaobjetos se lavaron tres veces en PBS durante
la tanda de 10 minutos y luego se incubaron con el anticuerpo
secundario (dilución 1/30 de fragmentos de Fab
cabraanti-ratón conjugado con FITC) durante 60
minutos. Los porta objetos se lavaron tres veces con PBS, se
montaron y visionaron utilizando un microscopio de fluorescencia o
confocal.
Estos experimentos indicaron que el p97 expresado
en las líneas celulares Sf9 estaba debidamente localizado en la
membrana exterior de la célula (figura 12a). Por el contrario, las
líneas celulares de SL2 o Kc1 transformadas no mostraron ninguna
fluorescencia en la superficie celular pese a producir cantidades
importantes de p97, tal como se indica en el análisis de
transferencia Western. Se observó ocasionalmente una coloración
puntiforme dentro de la células pero esto no se pudo localizar en
una región específica u organela y por lo tanto puede ser
citoplásmica. Este fenómeno puede estar relacionado con el tamaño
reducido del p97 expresado en cualquiera de las líneas celulares de
D. melanogaster, ya que es bien conocido que la adición
post-traducional de carbohidratos complejos a
proteínas en el retículo endoplásmico está asociada con
localización adecuada. Pese a una ligera reducción en el peso
molecular, las células de Sf9 son capaces, aparentemente, de
realizar suficientes modificaciones nucleares con esta proteína
particular para permitir al localización adecuada, mientras que las
líneas celulares D. melanogaster no lo son. Sin embargo,
esto puede suponer de por si una ventaja importante ya que la
purificación aguas abajo de las proteínas citoplásmicas es mucho
más sencilla que para las proteínas que se tienen que disociar de
componentes de membrana. Esto subraya nuevamente la necesidad de un
sistema de transformación de insecto que funcione en líneas
celulares derivadas de géneros diferentes de insectos, de modo que
las aptitudes de procesamiento post-traducional
específicas de estas líneas celulares diferentes se puedan analizar
de forma eficiente.
La cantidad de p97 producida por las líneas
celulares de insecto transformadas se determinó cuantitativamente
utilizando un análisis de inmuno-fluorescencia
indirecto. Se liberó primero el p97 de la superficie celular
mediante segmentación con la enzima GPI-específica
fosfatidilinositol fosfolipasa C (PI-PLC) y luego
se inmuno-precipitó del sobrenadante utilizando un
anticuerpo específico de p97. La cantidad de p97 en el precipitado
se determinó por incubación con un anticuerpo marcado (en este caso
cabra-anti-ratón-IgG-FITC)
y se cuantificó utilizando un fluorómetro. La utilización de
números equivalentes de células del clon Sf9 (C.16) dió como
resultado 4.000 unidades fluorómetricas de expresión p97 de
superficie celular, mientras que las células de ovario de hámster
chino (CHO) amplificadas seleccionadas recombinante FACS expresaron
aproximadamente 10.000 unidades en la superficie de la célula. Si se
tienen en cuenta el tamaño relativo y las superficies de las dos
líneas celulares, los niveles de expresión son comparables. Las
líneas celulares de insecto pueden crecer habitualmente hasta
alcanzar densidades mucho mayores que las líneas celulares de
mamíferos, lo cual sugiere que las líneas celulares de insecto
transformadas de la invención producirían tanto, si no más, p97 que
las células CHO amplificadas. La expresión de las células Sf9
transformadas se podría optimizar de muchas formas: fragmentando
grandes número de clones, por selección FACS, aumentando el número
de copias del casete de expresión mediante protocolos de
transformación modificados, analizando la expresión a través de la
fase de crecimiento para determinar el tiempo óptimo para la
recolecta celular o combinando estos enfoques. Según lo esperado, no
se liberó p97 de la superficie de líneas celulares transformadas de
D. melanogaster por segmentación PI-PLC.
La mayoría del p97 expresado a partir del
constructo cADN de longitud total en los clones transformados Sf9
se asoció con la pared celular. Para determinar si la producción
limitadora de etapa se encontraba en proceso y la fijación del
anclaje GPI, se generó una serie de deleciones del término
carboxilo para eliminar la región codificadora de secuencia de señal
GPI.
Las deleciones 3' anidadas (nested) se generaron
para eliminar la secuencia de señal p97 GPI utilizando el método de
exonucleasa 3/S1 nucleasa (Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual. Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
N.Y. 1989). Se procedió a la digestión de aproximadamente 10 mg del
plásmido pA3-2 con NruI, que segmenta 87 bp aguas
abajo del codón de terminación, y se sometió a tres tratamientos de
exo-uncleasa de 30 a 180 segundos con el fin de
eliminar los 25 amino ácidos terminales (aproximadamente 200 bp)
del sitio NruI. Los extremos se embotaron utilizando Klenow ADN
polimerasa y dNTPs, digerido con HindIII que se fragmenta 5' hacia
el codón de iniciación y los fragmentos agrupados de cada momento se
clonaron en el sitio HindIII-EcoRV de p2ZOp2F. Este
vector posee los codones de terminación en los tres marcos para
sustituir el codón de terminación eliminado al generar las 3'
deleciones.
En la figura 12b se muestran varias deleciones
pertinentes que se pueden categorizar respecto de la secuencia
amino ácido del homólogo pollo. La eliminación de los 16 amino
ácidos terminados (constructos -16 y -15) del p97 humano da lugar a
una proteína que es efectivamente análoga a la forma pollo
secretada [McNagny, K.M., Rossi, F., Smith, G. and Graf, T. 1996.
El antígeno de superficie celular
eosinófilo-específico, EOS47, es un homólogo pollo
del antógeno oncofetal melano-transferrina. Blood
87:1343-1352] que resulta del empalme diferencial
del transcripto mARN. Los constructos -20 y -21 han perdido la
mayoría de la secuencia de señal GPI pero han retenido el residuo
de alanina al que está fijado el GPI y el residuo de cisteína más
terminal para garantizar el pliegue correcto de la proteína. Por el
contrario, estos dos amino ácidos críticos han sido eliminados en
los constructos -35 y -37.
\newpage
La transformación de Sf9 con constructos de
deleción bajo el control del promotor constitutivo Op IE2 dió como
resultado muchos clones de expresión p97 resistentes. El análisis
de transferencia Western de gránulos celulares y la correspondiente
cantidad de sobrenadante de cultivo concentrado reveló que la
mayoría del p97 había sido secretado en el interior del medio de
cultivo (figura 12c). El gránulo de células transformadas con
constructos -15, -16, -20 y -21 mostró dos proteínas de pesos
moleculares ligeramente diferentes y que probablemente representan
intermediarios procedentes de la glicosilación o del procesamiento
del péptido de señal de secreción terminal amino. Únicamente se
observó de forma reproducible una sola banda nítida en muestras de
medio de cultivo. El constructo -35 que no contiene el residuo de
cisteína terminal fue secretado también activamente, aunque aparece
como una mayor banda difusa en las transferencias Western. Este
artefacto es debido al hecho de que se tiene que utilizar
SDS-PAGE no desnaturalizador cuando se realiza el
análisis de transferencia Western con L235 monoclonal, ya que el
epítopo que reconoce posee un enlace disulfuro de cisteína y por
consiguiente la proteína permanece parcialmente intacta. El
constructo -35 no contiene el residuo de cisteína terminal y por
consiguiente la porción carboxilo de la proteína permanece libre y
puede ligar más SDS dando como resultado una banda más grande pero
difusa. No obstante, la proteína es canalizada correctamente hacia
el exterior de la célula.
Cuando se transformó con los mismos constructos
constitutivos, ninguno de los clones de la línea celular drosófila
resistente mostró niveles detectables de expresión p97. En análisis
transitorios, se detectó expresión de p97 en el gránulo de la
célula y el sobrenadante en proporciones aproximadamente
equivalentes (no se ofrecen datos); no obstante, se puede concluir
que la proteína está siendo secretada, ya que el proceso de
transformación mismo permeabiliza la membrana celular y compromete
la integridad celular con el resultado de una pérdida de contenido
citoplásmico y/o muerte celular. La cantidad apreciable de p97 que
permanece asociado con el gránulo celular indicaría que éste es el
caso más probable.
Para determinar si la eliminación de la señal de
secuencia GPI, que da como resultado la secreción de p97, aumentaba
también la velocidad de síntesis, se realizó un experimento (figura
12d). La cantidad de p97 producida se determinó utilizando un
análisis de inmuno-fluorescencia indirecta (Kennard
et al., Biotechnol. Bioeng.
42:480-486(1993)). La máxima velocidad global
de expresión se produjo en la fase incipiente-media
aunque siguió acumulando bien en la fase estacionaria y sólo cesó al
iniciarse la muerte celular. La acumulación máxima total en el
cultivo se acercó a 10 mg/ml, lo cual corresponde aproximadamente a
3,3 mg y 5 mg/106 células para Sf9 p97-16 y
p97-21, respectivamente. Si bien esta cantidad fue
producida por una baja densidad de células Sf9, representa un
incremento de 6 a 7 veces en producción si se compara con la forma
GPI-anclada, de longitud total expresada en células
transformadas Sf9 y su equivalente al baculovirus. Es evidente que
aumentando la densidad de la célula Sf9, se podían obtener
concentraciones cercanas a 50 mg/ml. No realizó ningún intento de
expresar la forma GPI-deficiente en células de
mamífero o utilizando el sistema de baculovirus, aunque se puede
esperar un aumento similar en productividad. El análisis de
transferencia Western reveló que la proteína permanecía intacta
durante varios días en el efluente de cultivo pese a haberse
iniciado la muerte celular y la lisis (figura 12e).
Estos resultados demuestran que unas
modificaciones mínimas de la proteína nativa pueden facilitar el
transporte a través de la célula y/o la secreción fuera de la
célula. Se pueden adaptar constructos similares para conferir
propiedades similares en sistemas de mamíferos. Esto incluye tanto
las células obtenidas en cultivo como los animales híbridos o
transgénicos utilizando vectores de expresión de mamífero
apropiados.
Para seguir ilustrando la utilidad del sistema de
expresión de proteína de insecto de la invención, se utilizó el
sistema para comprobar la aptitud de diversas líneas celulares de
insectos para expresar la hormona péptido de transporte de ión de
insecto secretada (ITP). La ITP in vivo es secretada por el
cuerpo cardiaco y promueve la readsorción de sal y de agua en el
locust (Shistocerca gregaria) ileum. Además de ser secretada,
la proteína también requiere un procesamiento amino y carboxil
terminal proteolítico extensivo, la formación de enlace de disulfuro
y la posible amidación en el término carboxilo para la activación
(Meredith et al., J. Exp. Biol.,
199:1053-1061(1996)).
Se construyó del siguiente modo un vector
plásmido, que contenía un casete de expresión ITP: se insertó un
fragmento 405 bp SmaI-EcoRI cADN que contenía la
región codificadora de ITP en el sitio ScaI-EcoRI
de pZeoSV. Este plásmido interior se segmentó entonces con HindIII y
los extremos se embotaron con Klenow ADN polimerasa y dNTPs seguido
de fragmentación con NotI para quitar un fragmento 630 bp que
contenía el marco de lectura abierto ITP fusionado con la
terminación transcripcional SV40 y la secuencia de señal pA. Este
fragmento se insertó en p2ZOp2A, que había sido fragmentado con
EcoRI, embotado con Klenow ADN polimerasa y dNTPs y luego
fragmentado nuevamente con NotI para generar plásmido
p2ZOp2C-ITP.
Se transformaron diversas líneas celulares de
insecto con 2 \mug de plásmido ADN purificado con CsCl y 10 \mul
de Cellfectin, tal como se describe más arriba. Aproximadamente 48
horas después de la transformación las células se centrifugaron a
baja velocidad (3.000 X g) y se analizó el sobrenadante para
comprobar la actividad biológica según Audsley et al., J.
Exp. Biol., 173:261-274(1992). Se detectaron
niveles elevados de actividad únicamente en los sobrenadantes de
líneas celulares transformadas D. melanogaster, Kc1 y SL2
(figura 13a). Se detectaron niveles de actividad muy inferiores en
la línea celular de lepidóptero, Sf9, sin actividad alguna presente
con Ld652Y o la línea celular Trichoplusia ni Hi5.
Cuando se expresó ITP en el sistema de expresión
de baculovirus AcMNPV, los niveles de actividad biológica eran
aproximadamente 100 veces inferiores a los observados con las líneas
celulares de D. melanogaster de la invención. Esto puede ser
debido a una variedad de factores, sin embargo, la secuenciación de
péptido de ITP baculovirus-expresado reveló que el
término amino del péptido había sido incorrectamente procesado, lo
cual dio como resultado una actividad reducida. Además generamos
varias líneas celulares transformadas establemente de Kc1, SL2 y
Sf9 que expresan recombinante ITP. Las líneas celulares de D.
melanogaster expresaron establemente y exportaron altos niveles
de ITP, sobre la base de análisis biológicos, produciendo las
líneas celulares Sf9 más niveles moderados de producto
biológicamente activo. Estos resultados demuestran que la aptitud
para el procesamiento post-traducional de líneas
celulares de insecto transformadas de la invención difiere
notablemente de la de un sistema de expresión baculovirus
lítico.
El sistema de expresión de insecto también se
utilizó para comprobar la aptitud de diversas líneas celulares de
insecto para dirigir la secreción de factor humano X utilizando una
señal de secreción de transferrina humana (Tf) El Factor X es una
plasma glicoproteína que participa en la cascada de coagulación de
la sangre (Davie et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol.
Biol., 48:277-318(1979)). Está compuesto por
una cadena ligera 16.9 kDa y una cadena pesada 42.1 kDa, mantenidas
juntas por un enlace disulfuro. El dominio E2 del Factor X contiene
el péptido de activación y el dominio catalítico y se define como
la secuencia ADN de 399 a 1456 del Factor X cADN humano (Leytus
et al., Biochem. 25:5098-5102 (1986)).
Se creó del siguiente modo un vector plásmido que
contenía el dominio E2 del Factor X. Se clonó un fragmento 1.2 kb
HindIII/EcoRI que contenía la señal de secreción Tf, el dominio E2
de FX y una histidina x6 tag en el sitio HindIII/EcoRI de
p2ZOp2F.
Se transformaron diversas líneas celulares de
insecto con 2 \mug de plásmido ADN purificado con Qiagen y 10
\mul de Cellfectin tal como se describe anteriormente.
Aproximadamente 48 horas después de la transformación, se recolectó
el cultivo y se quitaron las células por centrifugación a baja
velocidad (3.000 xg). Se realizó el análisis de transferencia
Western separando 20 \mul del sobrenadante en buffer de carga no
reductor sobre un gel de poli-acrilamida SDS 10% y
transfiriendo a nitrocelulosa. Se detectó la proteína del Factor X
utilizando un anticuerpo policlonal anti Factor X disponible en el
comercio como anticuerpo primario, con una dilución de 1/5000,
anticuerpo cabra anti conejo conjugado con peroxidasa rábano picante
(BioRad, Richmond, CA) como secundario a 1/20.000 seguido de
detección quimio-luminiscente ECL (Amersham
Oakville, ON).
El análisis de transferencia Western de las dos
líneas celulares policlonales transformadas transitoriamente y
establemente demostraron que el Factor X era secretado
eficientemente en el interior del medio utilizando la secuencia de
señal de transferrina en todas las líneas celulares probadas (figura
13b). Esto demuestra una vez más la versatilidad del promotor Op
ie-2 en la expresión de proteínas heterólogas de un
número de líneas celulares de insecto. También demuestra la aptitud
de las células de insecto para procesar correctamente una señal de
secreción de transferrina humana.
La proteína del Factor X producida se puede
recolectar del medio enlazando la secuencia histidina x6 con una
columna de agarosa Ni-NTA (Qiagen). Una vez que se
ha segmentado la proteína recolectada en el péptido de activación,
la proteína tiene una actividad similar al Factor X humano natural
activado. Esto indica que todas las modificaciones
post-traducionales adecuadas para el Factor X se
realizan adecuadamente en células de insecto.
Los vectores de expresión basada en transposón se
pueden construir de forma que comprendan partes del elemento ADN
transponible en orientación adecuada, funcionalmente equivalente a
las repeticiones terminales invertidas de transposón y las
secuencias ADN adyacentes que se requieren para la transposición. La
cantidad de secuencia adyacente requerida para la transposición
puede ser predeterminada mediante análisis bioquímicos, tales como
el análisis de pisada (footprinting) ADN utilizando la enzima
transposasa y/o mediante pruebas de función biológica. Los vectores
basados en transposón de la invención pueden contener un casete de
expresión de proteína heteróloga situado dentro de las regiones de
un elemento transponible que son esenciales para la
transposición.
Los vectores basados en transposón de la
invención pueden incluir o no la región de codificación de la
enzima transposasa. El gen transposasa puede colocarse bajo el
control de un promotor inducible. En una realización, el gen
transposasa se puede integrar en células de insecto anfitrión
previstas para recibir vectores de la invención. En una realización
alternativa, se puede colocar un gen transposasa inducible en un
segundo plásmido auxiliar que es co-transformado con
un transposón que contiene un casete de expresión de la invención.
En esta realización, el plásmido auxiliar con el gen transposasa
puede carecer de las repeticiones terminales invertidas opcionales
de los elementos transponibles y no poder por lo tanto integrarse en
el genoma anfitrión por medio de transposición.
Otra realización es la
co-transfección con ARN, producida en otro sistema
como el Sistema de Expresión Sindbis InvitroScript Cap System
(Invitrogen CA, EE.UU.) que contiene el mensaje transposasa que se
traduce fácilmente en la proteína transposasa dentro de la célula,
con el transposón que contiene el casete de expresión de la
invención. En otra realización, la proteína transposasa purificada
utilizando técnicas biológicas conocidas, se puede
co-transformar con el transposón que contiene el
casete de expresión de la invención.
Se conocen plásmidos ADN que contienen el
P-elemento, hobo, mariner y otros transposones
basados en insecto y que resultan fácilmente disponibles en una
variedad de formas. La presente invención comprende casetes de
invención basados en transposón en el P-elemento,
hobo, mariner y los elementos hobo se utilizan en células dípteras.
De acuerdo con otro aspecto la invención comprende vectores de
expresión de transposón basados en mariner y hobo que se utilizan
en un amplio grupo de líneas celulares. La invención se puede
adaptar para trabajar utilizando otros transposones capaces de
transposición en una célula de insecto. Todos estos vectores
comprenden las repeticiones invertidas terminales funcionalmente
involucradas en la transposición, y toda la información necesaria
para el funcionamiento en el casete de expresión está situada
dentro de los límites funcionales de las repeticiones
invertidas.
Para adaptar el sistema de selección de Zeocin de
la invención y utilizarlo en vectores de expresión basados en el
transposón de la invención, se construyeron vectores basados en
P-elemento. Los vectores son designados p2ZOp2A\pi
y p2ZOp2Bi\pi.
El vector p2ZOp2A\pi contiene un casete de
expresión dentro de los límites de los extremos del
P-elemento, construido del siguiente modo: se
insertó un fragmento 1.8 kb PvuII/NdeI de plásmido pDM26 (Mismer
and Rubin, Genetics, 116:565-578(1987)) que
contiene una porción del gen de D. melanogaster white,
flanqueado por las repeticiones del terminal invertido
P-elemento dentro del sitio SacII del casete de
expresión p2ZOp2A que había sido embotado utilizando T4 polimerasa.
El casete de expresión insertado de esta forma está flanqueado por
las repeticiones invertidas del P-elemento y tiene
tres únicos sitios enzimáticos de restricción para la inserción de
genes foráneos (figura 14).
El vector p2ZOp2B\pi contiene sitios
enzimáticos de restricción adicionales únicos para la inserción de
genes foráneos. Este vector fue construido insertando el casete de
expresión p2ZOp2A en orientación opuesta a su inserción en
p2ZOp2A\pi.
Los vectores transportadores basados en
transposón p2ZOp2A\pi y p2ZOp2B\pi se pueden utilizar para la
clonación y la manipulación génica en E. coli y para la
transformación de líneas celulares de insecto o insectos completos
(estos vectores se han utilizado para transformar D.
melanogaster completas) por medio de recombinación heteróloga o
si se encuentra presente una fuente de transposasa, por medio de
transposición. Los transformantes pueden ser seleccionados por
resistencia al Zeocin.
Los conocidos vectores transportadores basados en
P-elemento utilizan marcadores seleccionables
separados, eucarióticos y procarióticos, tales como los genes de
higromicina B de fosfo transferasa o neomicinfosfotransferasa bajo
el control de promotores de D. melanogaster para selección
eucariótica y marcadores seleccionables antibióticos tales como
resistencia a ampicilina o tetraciclina para la selección en
bacterias. La utilización de genes marcadores seleccionables
separados en un vector transportador aumenta considerablemente el
tamaño de estos vectores del estado de la técnica y limita su
utilidad para la manipulación y la inserción de genes grandes. La
presente invención supera este problema utilizando el promotor
híbrido Op ie2-EM 7 (o el promotor Op ie2 solo, con
promoción procariótica criptica desde dentro de la secuencia del
promotor Op ie2) para dirigir la expresión del gen de resistencia al
Zeocin para la selección en eucariotas y procariotas.
En un aspecto, la invención comprende un vector
de expresión de proteína de resistencia al Zeocin basado en el
elemento transponible hobo. El plásmido p1ZOp2Ahobo se construyó
insertando un fragmento NarI/PvuII de pUChobo que contenía las
repeticiones terminales invertidas hobo, en el sitio ScaII de
p1Zop2A, que se había embotado con T4 ADN polimerasa (figura 14).
En este vector, se dispone de tres sitios de restricción únicos
para la clonación de genes codificadores de proteína ajena para el
control del promotor ie2.
Para comprobar el sistema de expresión génica
basada en transposón de la invención, se crearon diversos
constructos indicadores (figura 14) según se indica a
continuación:
El plásmido pDM79IE1 se construyó insertando un
fragmento 650 bp SalI-BamHI de
pOPIE-1B74BamHI que contenía la región de promotor
Op ie1 dentro del sitio SalI-BamHI de pDM79.
El plásmido pDM79IE2 se construyó insertando
primero un fragmento 700 bp HindII-BamHI de
pOPIE-N\Delta BamHI que contenía la región de
promotor Op ie2 dentro de HindII-BamHI de pBSKII
para generar el intermediario pBKOpIE2 y colocar un sitio SalI en
la región proximal 5'. Se subclonó entonces un fragmento
SalI-BamHI en pDM79.
Para construir el plásmido pDM79IE2GFP, se
preparó por segmentación con SpeI un fragmento 810 bp de pGFP
(Clonetech, Palo Alto, California, EE.UU.) que contenía la región
codificadora de GFP. El overhang (saliente) se reparó parcialmente
con Klenow ADN polimerasa utilizando dCTP y dTTP, seguido de
segmentación con BamHI. El fragmento resultante se insertó dentro
de pAcIE1^{hr}/PA que había sido segmentado con HindIII,
parcialmente reparado con Klenow ADN polimerasa utilizando dATP y
dGTP, y luego segmentando con BglII. Este plásmido,
pAcIE1^{hr}GFP, se segmentó posteriormente con SalI, se embotaron
los extremos utilizando Klenow ADN polimerasa con dNTPs y luego se
religaron para quitar el sitio SalI y formar pAcIE1^{hr}GFPSal. El
gen indicador 4.0 kb \beta-galactosidasa en pDM79
se sustituyó por el gen indicador GFP insertando un fragmento 850 bp
de KpnI-EcoRI de pAcIE1^{hr}GFPS al que codifica
el marco de lectura abierto GFP seguido de un fragmento 200 bp EcoRI
que contenía el terminador transcripcional SV40. Finalmente, se
insertó el promotor Op ie2 como fragmento 750 bp
SalI-BamHI de pBKOpIE2 en el sitio
SalI-BamHI para generar pDM79GFP.
Para construir el plásmido
pDM79IE-2-Gal, se insertó un
fragmento 500 bp SalI/Xhol que contenía un segmento del gen Ga14 en
el sitio Sail de pDM79IE-2. Este vector resulta útil
para detectar el elemento móvil en la línea celular SL2delta2.3 por
medio de análisis Southern, ya que la señal de fondo de la sonda,
con el segmento gal4 se puede despreciar, si se compara con otras
sondas utilizadas para detectar el elemento.
El plásmido p1ZOp2AhoboGFP se construyó
insertando un fragmento 800 bp EcoRI de pGFP10.1 que contenía la
región codificadora GFP en el sitio EcoRI de p1Zopp2Ahobo.
La introducción de un casete de expresión basado
en transposón, plenamente funcional, capaz de integración en el ADN
genómico por transposición y de ulterior
re-movilización, queda facilitado si la enzima
transposasa está presente dentro del núcleo celular en el momento
del suministro (delivery) del vector ADN. Esto es importante, ya
que, en ausencia de transposasa, es más probable que el vector se
integre aleatoriamente por medio de recombinación heteróloga en el
ADN celular, en lugar de integrarse por transposición. La
integración aleatoria puede destruir la integridad del transposón.
Además, los plásmidos ADN que se han integrado por medio de
recombinación heteróloga pueden ser inestables y proclives a la
excisión del genoma, a no ser que se apliquen fuertes presiones de
selección.
La enzima transposasa se puede hacer disponible
en el momento del suministro del vector ADN de muchas formas,
inclusive:
1) por medio de la incorporación estable de una
versión modificada del gen transposasa en el genoma de la línea
celular antes de la transformación, en cuyo caso, el promotor de
transposasa constitutiva nativa puede ser sustituido por un promotor
regulable;
2) por co-transformación con el
vector y un plásmido auxiliar, siendo capaz el plásmido auxiliar de
expresar el gen de transposasa, aunque incapaz de transposición en
el genoma;
3) por co-transformación con el
vector y la enzima transposasa misma;
4) por co-transformación con el
vector y el mARN que codifica la transposasa, que una vez traducida
producirá la enzima transposasa; o
5) por co-transfección previa
con un virus de insecto defectivo que expresa la transposasa. Este
virus es incapaz de replicar y por lo tanto se puede utilizar para
suministrar ADN o ARN a la célula.
Estos y otros enfoques se pueden utilizar para
hacer que se encuentre disponible transposasa dentro del núcleo
celular, en el momento de suministro del vector ADN, para dirigir
la integración del casete basado en transposón por medio de
transposición.
Un aspecto de la invención comprende una línea
celular transgénica, que puede ser inducida para producir
transposasa antes de la transformación con el casete de expresión
(figura 15). Este método se puede utilizar para maximizar la
probabilidad de que se produzca la integración por medio de la
transposición, ya que la expresión de transposasa puede inducirse en
dichas células de forma relativamente rápida, por lo general en
cuestión de horas.
La forma nativa del P-elemento
transposasa mARN está procesada incorrectamente en tejido somático y
por consiguiente el gen de transposasa natural no funcionaria en
líneas celulares inmortalizadas. En un aspecto de la invención, se
ha utilizado una fuente de P-elemento transposasa
que ha sido modificado para la deleción del intron entre exon 2 y
exon 3 para producir un gen, designado \Delta2-3,
capaz de producir transposasa activa en tejidos somáticos y de línea
germinal. De acuerdo con este aspecto de la invención, la producción
de transposasa se puede controlar utilizando un promotor inducible
regulado, por ejemplo los promotores sensibles a la galactosa (gal)
o la metalotioneina (mtn) sensible a los metales de D.
melanogaster. La utilización de promotores inducibles favorece
la producción de niveles elevados de transposasa en respuesta a la
inducción y facilita la represión de la expresión en ausencia de
inductor. Por ejemplo, el promotor mtn puede regular eficientemente
el gen transposasa \Delta2-3 incluso si hay más de
100 copias del gen por célula.
Se pueden utilizar otras proteínas de transposasa
para movilizar los casetes de expresión basados en transposón junto
con otros elementos transponibles. Por ejemplo, se pueden utilizar
otras transposasas junto con los elementos disponibles hobo, hermes,
minos o mariner. En cada caso, el gen transposasa se puede colocar
inmediatamente aguas abajo de un promotor regulable. El promotor se
puede enlazar también operativamente con un casete de expresión que
contiene un marcador de resistencia seleccionable para antibióticos
como higromicina B, G-418, metotrexato o Zeocin. El
vector que contiene transposasa se puede transfectar en la línea
celular adecuada y aplicar la selección. La producción y regulación
de la transposasa se puede controlar y seguir mediante el análisis
de transferencia Western o Northern o mediante análisis funcionales
de transposición utilizando plásmidos indicadores de excisión
basados en transposón.
Una línea celular SL2 D. melanogaster (MT
\Delta2-3) que expresa el
P-elemento transposasa bajo el control del promotor
mtn ha sido realizada previamente y se puede obtener en American
Type Culture Collection, ATCC CRL-1091 (Kaufman
et al., Cell, 59:359-371(1988)). La
forma en que este gen transposasa se insertó en el constructo de
expresión y el gran número de constructos integrados en el genoma de
la línea celular da como resultado cantidades detectables de
expresión de gen transposasa en ausencia de inducción. Las líneas
celulares como las que expresan constitutivamente transposasa pueden
no ser los anfitriones más ventajosos para crear líneas celulares de
expresión proteínica, inducibles, transformadas de acuerdo con la
invención. La utilización de esta línea celular de acuerdo con la
invención demuestra sin embargo la utilidad del sistema de la
invención para introducir y amplificar un casete de expresión basado
en transposón.
De acuerdo con otros aspectos de la invención, se
han creado constructos de transposasa e insertado en líneas
celulares SL2 con número de copia muy inferiores a lo que ocurre en
las líneas ATCC CRL-10901, para proporcionar una
regulación más estricta de producción de transposasa en una nueva
línea celular designada SL2MT\Delta2-3. Para
construir esta línea celular, se amplificó con PCR un gen 2.4 kb
\Delta2-3 P-elemento transposasa y
se insertó directamente aguas abajo del promotor mtn contenido en el
vector pMT-2 (Kovach et al., Insect Mol.
Biol.,1: 37-43 (1992)). Este plásmido contiene un
marcador de resistencia a la higromicina-B. El
vector resultante se utilizó para transformar líneas celulares de
D. melanogaster SL2. Se seleccionaron líneas celulares con
números reducidos de copia del constructo mtn transposasa. Se
generó antisuero policlonal contra la proteína P transposasa, que
se utilizó para mostrar que la línea celular
SL2MT\Delta2-3 produce transposasa de peso
molecular correcto y, su expresión es inducible. Se verificó la
función transposasa transformando la línea celular
SL2MT\Delta2-3 con un plásmido indicador de
excisión, en el cual la excisión precisa de un mini P elemento da
como resultado la producción de colonias azules en lugar de
blancas. Se seleccionó la movilización del P elemento y se verificó
por secuenciación ADN.
Se pueden crear líneas celulares de producción de
transposasa inducible para un amplio espectro de transposasas,
inclusive hobo, mariner, minos y piggyBac, así como para
retro-transposones que necesitan transcriptasa
inversa para la movilidad, como copia, gipsy y Ty.
Para insertar constructos ADN diseñados en el
genoma por medio de transposición, se crearon transposones
marcados, en los cuales un casete informador de Op ie1 o Op ie2
promotor-\beta-galactosidasa, el
gen de resistencia bacterial ampicilina, un origen de replicación y
un casete marcador seleccionable de neomicina
fosfotransferasa-promotor de choque térmico,
estuvieron todos ellos flanqueados por las repeticiones invertidas P
elemento. Este constructo se introdujo en la línea celular
SL2MT\Delta2-3 bajo selección
G-418 y se controló y siguió la expresión del gen
indicador \beta-galactosidasa.
La integración del casete de expresión basado en
transposón por medio de transposición en la línea celular
SL2MT\Delta2-3 se realizó cultivando las células
hasta la fase mid-log e induciendo la expresión de
transposasa con la adición de 0,25 mM de sulfato de cobre 48 horas
antes de la transformación. Se granularon aproximadamente 4 x
10^{6} células mediante centrifugación a baja velocidad, se
resuspendieron en 1,0 ml de medio mínimo traces, que contiene 10
\mul de liposomas y 2 \mug de vector ADN basado en transposón.
La suspensión celular se incubó durante 4 horas y entonces se
añadieron dos mis de medio completo TC-100. Las
células se incubaron otras 48 horas y luego se aplicó la selección
para aislar líneas celulares clonales o policlonales, en la forma
descrita anteriormente.
El constructo de casete de expresión se integró
dentro de un número de sitios independientes dentro del genoma. El
rescate plasmídico de secuencias que flanquean las repeticiones
terminales de transposón indicó que se había insertado una gran
fracción de los constructos en el genoma celular por medio de
transposición y no por recombinación. La introducción de los
constructos por medio de transposición es importante para
proporcionar estabilidad a las secuencias de transformación de ADN.
De esta forma, se habrán integrado en sitios independientes,
ampliamente separados por todo el genoma y estarán menos sometidas a
efectos desestabilizadores, como amplificación génica o pérdida
debida a recombinación inducida por repetición tándem. Las líneas
celulares son estables y la expresión de proteína heteróloga sigue
sin desaparecer en ausencia de selección antibiótica durante
centenares de generaciones de células. Otros sistemas similares
basados en otros transposones como elementos mariner o hobo se
encuentran dentro del ámbito de la invención.
La integración de los casetes de transposón en
ADN genómico de línea celular SL2 MT\Delta2-3 se
verificó por rescate plasmídico de inserciones genómicas
individuales, seguido de análisis de secuencia del único ADN
genómico que flanquea las repeticiones terminales invertidas de
transposón (figura 16b). En estos experimentos, se aisló ADN de una
línea celular policlonal SL2 MT\Delta2-3 que había
sido transformada con pDM79OPIE2. Se rescataron las secuencias que
flanquean las repeticiones 5' invertidas por digestión de un
microgramo de ADN genómico con XhoI, religación de fragmentos de
ADN digerido en concentraciones cada vez más diluidas, seguido de
transformación de E. coli DH10B con el ADN religado y
cultivando en placa E. coli transformado sobre medio LB
complementado con 100 \mug/ml de ampicilina y 50 \mul de una
solución 20 mg/ml del sustrato cromogénico
\beta-galactosidasa, X-gal por
placa. Las colonias resistentes a la ampicilina (es decir que
contenían gen de \beta-galactosidasa presente en
pDM79) y tenían un aspecto azul (como resultado de la transcripción
del gen \beta-galactosidasa en E. coli de
un sitio de promotor bacteriano críptico en el promotor Op ie2
fueron aisladas y se analizó el plásmido ADN. La existencia de este
promotor bacteriano críptico produce el resultado sorprendente y
totalmente inesperado de que en algunas realizaciones, el promotor
EM7 no es en absoluto necesario en vectores transportadores de la
invención, debido a que el promotor bacteriano críptico en el
promotor Op ie2 realiza la misma función en su lugar. Aparecieron
también colonias blancas, resistentes a la ampicilina como resultado
del rescate del constructo utilizado para introducir el casete
mtn-transposasa. Se analizó el ADN que flanqueaba
los sitios de inserción 3' por digestión con XbaI, ligación,
transformación de E. coli DH10B y cultivo en placa sobre
medio LB complementado con 100 \mug/ml de ampicilina y 50
\mug/ml de kanamicina. Se identificaron y analizaron las colonias
que eran resistentes a la ampicilina y a la kanamicina (debido a la
transcripción del gen de neomicina fosfo transferasa en E.
coli de un promotor críptico situado en secuencias aguas
arriba). Se aisló el plásmido ADN y se digirió con HindIII que
libera un gen blanco 500 bp que sirve de espaciador entre las
repeticiones invertidas 5' y 3' en los vectores pDM79 y se pierde
durante la transposición. Ninguno de los plásmidos ADN rescatados
de la línea celular transformada SL2 MT\Delta2-3
mostraron este fragmento espaciador 50 bp que indica que la
integración se produjo por transposición y no por recombinación
heteróloga. El análisis de secuencia reveló que los transposones se
habían integrado en sitios independientes dentro del genoma por
medio de transposición "precisa". Diversos transposones de
integraron en regiones bien caracterizadas del genoma D.
melanogaster inclusive el locus de choque térmico, regiones
heterocromáticas, así como en otros transposones pDM79OpIE2. Estas
regiones bien caracterizadas representan claramente regiones
diferentes del genoma D. melanogaster, lo cual confirma la
integración en sitios independientes.
La estabilidad de las líneas celulares SL2
MT\Delta2-3 transformadas con pDM79OpIE1 o
pDM79OpIE2 se midió por sub-cultivo continuo
(aproximadamente 30 pasadas) durante 26 semanas. Las poblaciones de
células que habían sido seleccionadas con un 1 mg/ml
G-418 en presencia o en ausencia de 100 \muM
CuSO_{4} produjeron de forma continua
\beta-galactosidasa durante todo el período, con
variaciones muy pequeñas de una semana a otra (figura 16a). Como
indicación adicional de estabilidad, la eliminación del antibiótico
selectivo no produjo la pérdida de producción enzimática, como se
había observado con constructos introducidos por medio de
recombinación heteróloga. De acuerdo con un aspecto de la
invención, si disminuye la producción de proteína heteróloga
después de un período grande de tiempo, como resultado por ejemplo
de silenciamiento génico o algún fenómeno relacionado, la expresión
proteínica se puede reactivar induciendo la transposición de los
casetes de expresión en nuevos sitios genómicos
transcripcionalmente activos.
Los ciclos subsiguientes de congelación
descongelación de las líneas celulares demostraron también la
estabilidad de la producción. Las muestras se colocaron en
nitrógeno líquido durante varias semanas, se recogieron y analizaron
para la producción de \beta-galactosidasa. No se
observó ninguna reducción en los niveles de
\beta-galactosidasa tras varios ciclos de
congelación-descongelación. Por consiguiente, si
disminuyen los niveles de producción de proteína heteróloga después
de sub-cultivo continuo durante largos períodos,
sería posible reestablecer los cultivos a partir de las partes
previamente congeladas.
Para evaluar la heterogeneidad global de líneas
celulares policlonales transformadas con un vector transposón de la
invención y para determinar qué proporción de dichas células
contiene números amplificados de casetes de expresión, se
transformó la línea celular SL2 MT\Delta2-3 con el
plásmido indicador pDM79IE2GFP. El examen de las líneas celulares
indicó que aproximadamente el 20-30% de las células
expresan niveles notablemente superiores de GFP que el resto de la
población (figura 17). Estas células amplificadas se podían separar
del resto de las células de pobre expresión utilizando un sistema
de separador-escogedor celular activado por
fluorescencia o por análisis de dilución y selección manual. Si el
transposón modificado contiene también un casete para otro gen
heterólogo, de ello se sigue que la expresión de esta proteína
estaría estrechamente correlacionada con la producción de GFP. En
efecto, la presente invención permite la utilización de un marcador
no obstrusivo como GFP para facilitar la identificación de líneas
celulares transformadas que probablemente proporcionen un incremento
en la proporción de una proteína heteróloga de interés. Dentro de
este contexto "no obstrusivo" significa que el gen marcador no
es notablemente nocivo para la célula transformada cuando se
expresa el marcador no obstrusivo. Este enfoque también permite la
transformación, selección y amplificación del casete de expresión
sin la utilización de antibióticos en ninguna etapa del proceso.
La expresión de células transformadas, aisladas
durante la ronda inicial de selección puede potenciarse además
mediante inducción ulterior del mecanismo de transposición. En
algunas realizaciones, la expresión de la encima transposasa bajo el
control del promotor Mtn se puede inducir con 0,5 mM CuSO_{4}
durante 24 horas, la transposasa identificará los transposones
específicos y mediante transposición replicativa amplificará e
insertará copias adicionales del casete de transposón en otras
posiciones genómicas. Se establecen, vuelven a seleccionar y
analizan las líneas celulares clonales o policlonales. Este proceso
se puede repetir varias veces hasta que se obtiene un número óptimo
de copias del casete de transposón. Las líneas celulares con copias
óptimas de casetes de transposón se pueden aumentar gradualmente
para una producción continua de proteínas.
\newpage
Se realizó del siguiente modo otra evaluación de
amplificación de genes. El transposón que contiene el casete de
expresión pDM79IE-2gal se transformó en las líneas
celulares SL2 MTdelta2-3 del siguiente modo. Se
cultivaron en placas células SL2 MTdelta2-3 (1 x
10^{6} células) en cada pocillo de una placa de cultivo de
células de 6 pocillos, en 1 ml de medio de Grace. Se dejó que las
células se fijaran durante 30 minutos y se añadió CuSO_{4} hasta
una concentración final de 500 mM. Las células se incubaron durante
3 horas, después de lo cual se quitó el medio y las células se
lavaron una vez con 2 ml de medio de Grace. Un ml de medio de Grace
que contenía 1 \mug (P1), 100 ng (P2), 10 ng (p3) ó 1 ng (P4) de
plásmido ADN y 10 \mul de Cellfectin se preparó en la forma
descrita anteriormente, se aplicó a las células SL2
MTdelta2-3 y las células se incubaron a 27°C durante
4 horas. Transcurrido este tiempo, se quitó el medio de las células
y se sustituyó por un medio TC que contenía 5% FBS, 250 \mug/ml
G418, 200 \mug/ml higromicina y las células se incubaron durante
40 horas. Cada pocillo que contenía una cantidad diferente de ADN de
transformación se estableció como línea celular policlonal. Después
de tres transferencias (aproximadamente 2 semanas) a nuevos
frascos, se quitó una muestra para analizar el ADN y la
\beta-galactosidasa. Se sometió entonces otra
muestra durante 3 horas a 400 mM de CuSO_{4}, se lavó con 2 ml de
Grace, se dejó recuperar durante 2 días y luego se colocó sobre 500
\mug/ml G418, 200 \mug/ml higromicina. Después de tres
transferencias (aproximadamente 2 semanas) se tomó una muestra para
el análisis de ADN y de \beta-galactosidasa.
Los resultados se muestran en la tabla 2, donde
las líneas celulares iniciales son las líneas policlonales
establecidas después de la primera transformación y las líneas
celulares inducidas son líneas celulares policlonales establecidas
después de la inducción de dicha línea celular policlonal inicial
particular. P0 es una línea celular que se transformó con 1 \mug
del plásmido pDM79IE-2gal-HdIIIdel.
Este plásmido es el pDM79IE-2gal con un fragmento
eliminado 500 bp HindIII que contiene las repeticiones invertidas P
elemento necesarias para la transposición. Según lo esperado, no se
observó ningún aumento en la actividad de
\beta-galactosidasa con esta línea celular
policlonal tras la inducción de la transposasa.
Estos resultados demuestran que la inducción de
una transposasa en una línea celular que contiene un casete de
expresión dentro de un transposón puede conducir a una línea celular
capaz de mayor producción de la proteína recombinante contenida en
el casete de expresión.
Según podrán apreciar los expertos en la materia
a la vista de lo indicado anteriormente, son posibles muchas
alteraciones o modificaciones en la práctica de la presente
invención sin apartarse del espíritu o del ámbito de la misma. Las
variaciones de la invención pueden entenderse a partir de las
enseñanzas de las referencias aquí citadas y todas estas
referencias se incorporan aquí a modo de referencia. En algunas
realizaciones, los vectores de la invención se pueden adaptar para
utilizarlos con una variedad de esquemas de selección de
antibióticos. Se pueden utilizar elementos promotores adicionales
de acuerdo con la invención para potenciar la expresión de
promotores incipientes inmediatos de baculovirus. Los genes Op ie1 y
Op ie2 codifican factores de transcripción que transactivan los
suyos propios así como otros promotores de baculovirus tempranos y
trempano-retardados (Theilmann and Stewart,
Virology, 180:492-508(1991); Theilmann and
Stewart, Virology, 180:492-508 (1992)). Se ha
identificado además un elemento potenciador adyacente al 3' extremo
de la región codificadora ie2 que funciona junto con el producto
génico ie1 para aumentar la expresión génica trempana del
constructo indicador de 10 a 17 veces en células Ld652Y y Sf9
respectivamente (Theilmann and Stewart, Virology,
187:97-106 (1992)). Las líneas celulares estables
que expresan estos activadores transcripcionales pueden potenciar la
expresión por estos promotores o ampliar el espectro de líneas
celulares en los cuales los promotores funcionan de forma
ineficiente. En algunas realizaciones, otros elementos
transponibles más promiscuos se pueden adaptar para transferir los
casetes de expresión en líneas celulares derivadas de una mayor
variedad de especies. Por consiguiente, el ámbito de la invención
se tiene que interpretar de acuerdo con la sustancia definida por
las reivindicaciones que vienen después del Listado de
Secuencias.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: The University of British Columbia, Research Administration, Room 331, IRC Building
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 2194 Health Sciences Mall
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Vancouver
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: British Columbia
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Canada
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): V6T 1Z3
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TÉLEFONO: (604) 822-8596
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- FAX: (604) 822-8589
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vectores de Expresión de insecto
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 16
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS / MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- INFORMACIÓN DEL AGENTE OFICIAL DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Smart & Biggar
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REFERENCIA: 80021-46
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA. SEQ ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 564 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO:poli hedro virus nuclear multicápsida
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Orgyia pseudotsugata
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO:poli hedro virus nuclear multicápsida
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Orgyia pseudotsugata
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº. 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGCGGATCG ATATCTGACT AAATCTTAGT TTGTATTGTC ATGT
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO:poli hedro virus nuclear multicápsida
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Orgyia pseudotsugata
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGGTGCGCA CGCGCTTGAA AGGA
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ED Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº. 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTTAAACG TTGGTACCCT CGAGCTCAGC TGAATTCTGG ATCCT
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº. 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SEQ ID Nº. 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGAAGGAT CCAGAATTCA GCTGAGCTCG AGGTACCAAG CTTTA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N°. 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SEQ ID Nº. 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGACCGGT CATATGCGGG CCGCGATCG ATCGAT
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N°. 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SEQ ID Nº. 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCGATCGAT CCGCGGCCGC ATATGACCGT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº. 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SEQ ID Nº. 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGGGTGCGC ACGCGCTTGA AAGGA
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº. 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SEQ ID Nº. 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTATCGG
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº. 10
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SEQ ID Nº. 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGGAGGC
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº. 11
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SEQ ID Nº. 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTAAA
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº. 12
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 55 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SEQ ID Nº. 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCAGCTGCAG ATGAAGAGGC CTAGACCTAT GAAACCAGTA ACGTTATACG ATGTC
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº. 13
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SEQ ID Nº. 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACTTAAGCTT ATAGCGATGA CTGCCCGCTT TCCAGTCGGG AAACCTGCG
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº. 14
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 67 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SEQ ID Nº. 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTATGAAG ATACTCCTTG CTATTGCATT AATGTTGTCA ACAGTAATGT GGGTGCAAG
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGCTTA
\hfill67
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº. 15
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 67 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SEQ ID Nº. 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº. 16
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 66 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SEQ ID Nº. 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTTTCAAGC GCGTGCAC CCGAAAAGCA GGGTCGCCGC TGACGCACTG CTAAAAATAG
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACGCG
\hfill66
Claims (21)
Hide Dependent
translated from
Claims (21)
Hide Dependent
translated from
1. Vector transportador para transformar células
de insectos, que comprende:
a. un origen procariótico de replicación;
b. un promotor de insecto que tiene homología
con, y es capaz de funcionar como promotor de baculovirus
incipiente inmediato;
c. una secuencia de promotor procariótico;
d. un gen marcador seleccionable capaz de
conferir resistencia a un antibiótico de tipo bleomicina/feomicina
bajo el control transcripcional del promotor de insecto y la
secuencia de promotor procariótico, en células de insecto y
procarióticas respectivamente.
2. El vector transportador de la reivindicación
1, en el que la secuencia del promotor procariótico es un promotor
críptico dentro del promotor de insecto.
3. El vector transportador de la reivindicación
2, en el que el antibiótico de tipo bleomicina/fleomicina es
Zeocin.
4. El vector transportador de las
reivindicaciones 2 ó 3, que comprende además un sitio de inserción
para ADN heterólogo.
5. El vector transportador de la reivindicación
4, en el que el sitio de inserción para ADN heterólogo se encuentra
bajo el control transcripcional de un segundo promotor de
insecto.
6. El vector transportador de la reivindicación
5, que comprende además una secuencia de ADN heterólogo insertada en
el sitio de inserción y bajo el control transcripcional del segundo
promotor de insecto.
7. El vector transportador según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que el promotor de insecto
comprende un elemento IE2B prácticamente homólogo a SEQ ID Nº:
10.
8. El vector transportador de la reivindicación
7, en el que el promotor de insecto comprende un par de elementos
GATA-IE2B prácticamente homólogo a SEQ ID Nº: 9 y
SEQ ID Nº: 10.
9. El vector transportador de la reivindicación
8, en el que el promotor de insecto comprende una secuencia
prácticamente homóloga a SEQ ID Nº: 1 de bp 351 a bp 527.
10. El vector transportador de la reivindicación
9, en el que el promotor de insecto comprende una secuencia
prácticamente homóloga a SEQ ID Nº: 1.
11. El vector transportador según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, que comprende además elementos ADN
transponibles que definen un transposón.
12. El vector transportador de la reivindicación
11, en el que el gen marcador seleccionable está dentro del
transposón.
13. El vector transportador de la reivindicación
12, que comprende además un sitio de inserción para ADN heterólogo
dentro del transposón.
14. El vector transportador de la reivindicación
13, que comprende además una secuencia ADN heteróloga insertada en
el sitio de inserción y bajo el control transcripcional de un
segundo promotor de insecto.
15. El vector transportador de la reivindicación
11, que comprende además un gen transposasa inducible dentro del
transposón.
16. Células de insecto transformadas con el
vector transportador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
10.
17. Células de insecto transformadas con el
vector transportador según cualquiera de las reivindicaciones 11 a
15.
18. Método de transformación de células de
insecto que comprende:
a. la inducción de las células de insecto para
que reciban un vector transportador de insecto que comprende un gen
marcador seleccionable bajo el control transcripcional de un
promotor de insecto, siendo capaz el gen marcador seleccionable de
conferir resistencia a un antibiótico del tipo
bleomicina/fleomicina, y teniendo homología el promotor de insecto
con, y siendo capaz de funcionar como un promotor de baculovirus
incipiente inmediato; y,
b. la selección de células transformadas
resistentes al antibiótico de tipo bleomicina/fleomicina.
19. Células de insecto recombinantes
transformadas con el vector transportador según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, que expresan una proteína heteróloga
seleccionada dentro del grupo formado por melanotransferrinas y
derivados biológicamente activos de las mismas.
20. Células de insecto recombinantes
transformadas con el vector transportador según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, que expresan una proteína heteróloga
seleccionada dentro del grupo formado por hormonas péptido de
transporte de ión de insecto y derivados biológicamente activos de
las mismas.
21. Insectos que comprenden células establemente
transformadas con el vector según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15.