KR20230037503A

KR20230037503A - 무흔적 dna를 생성하기 위한 촉매적으로 제어된 합성에 의한 서열분석

Info

Publication number: KR20230037503A
Application number: KR1020227045198A
Authority: KR
Inventors: 카이틀린 푸글리제; 세르지오 페이사조비치; 제프리 맨델; 세스 맥도날드
Original assignee: 일루미나, 인코포레이티드
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2021-06-29
Publication date: 2023-03-16
Also published as: EP4172364A1; AU2021299216A1; US20210403993A1; WO2022006081A1; CA3177299A1; CN115997033A; JP2023532231A

Abstract

본 발명은 방법에 관한 것으로, 본 방법은 (a) 폴리머라제를 주형 폴리뉴클레오티드 및 복수의 유리 뉴클레오티드와 접촉시키는 단계 - 주형 폴리뉴클레오티드는 주형 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 단편에 의해 돌출된 3' 말단을 포함하는 상보적 폴리뉴클레오티드에 혼성화되고, 복수의 유리 뉴클레오티드는 하기 화학식 (I)의 화합물을 포함하고: 상기 접촉은 복합체화 조건 하에서 발생하고, 상기 복합체화 조건은 복합체를 형성하는 데는 효과적이지만 중합을 형성하는데 효과적이지 않고, 상기 복합체는 상기 폴리머라제, 상기 주형 폴리뉴클레오티드, 상기 상보적 폴리뉴클레오티드, 및 상기 주형 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 단편의 제1 뉴클레오티드에 상보적인 복수의 유리 뉴클레오티드 중 하나를 포함함 -; b) 형광 표지로부터 신호를 검출하는 단계; 및 c) 복합체를 중합 조건에 노출시키는 단계를 포함한다.

Description

무흔적 DNA를 생성하기 위한 촉매적으로 제어된 합성에 의한 서열분석

관련 출원의 상호 참조

본 출원은, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되고 2020년 6월 30일자로 출원된 미국 가특허 출원 제63/045,914호의 이익을 주장한다.

기술분야

본 발명은 대체적으로 무흔적(scarless) DNA를 생성하기 위한 촉매적으로 제어된 합성에 의한 서열분석(sequencing by synthesis, SBS)을 위한 방법에 관한 것이다.

많은 현재의 서열분석 플랫폼은 "합성에 의한 서열분석"("SBS") 기술 및 검출을 위한 형광 기반 방법을 사용한다. 더 비용 효과적이고, 신속하고, 편리한 서열분석 및 핵산 검출을 가능하게 하는 대안적인 서열분석 방법이 SBS에 대한 보완책으로서 바람직하다.

현재의 SBS 기술은 2개의 위치에서 변형된 뉴클레오티드를 사용한다: 1) 데옥시리보스의 3' 하이드록실(3'-OH), 및 2) 질소성 염기(nitrogenous base)(A, T, C, G)의 피리미딘의 5-위치 또는 퓨린의 7-위치. 3'-OH 기는 아지도메틸 기로 블로킹되어 가역적 뉴클레오티드 종결자를 생성한다. 이는 단일 뉴클레오티드의 부가 후에 추가의 신장을 방지할 수 있다. 각각의 질소성 염기는 형광단으로 개별적으로 변형시켜 형광 판독을 제공하며, 이러한 형광 판독은 단일 염기 도입을 식별한다. 후속으로, 3'-OH 블로킹 기 및 형광단이 제거되고 사이클이 반복된다.

데옥시리보스의 3'-OH 및 질소성 염기 둘 모두를 변형시키는 합성상의 어려움으로 인해, 변형된 뉴클레오티드의 현재 비용은 높을 수 있다. 변형된 뉴클레오티드의 비용을 감소시키는 몇몇 가능한 방법이 있다. 한 가지 방법은 판독 표지를 질소성 염기 대신에 5'-말단 포스페이트로 이동시키는 것이다. 하나의 예에서, 이는 별도의 절단 단계에 대한 필요성을 제거하고, 인입 뉴클레오티드의 실시간 검출을 가능하게 한다. 도입 동안, 태그와 함께 피로포스페이트가 신장 공정의 부산물로서 방출되며, 이에 따라 절단가능한 결합이 수반되지 않는다.

SBS에 사용되는 현재의 완전 작용화된 뉴클레오티드("ffN")는 핵염기 상에 염료 표지를 보유하며, 이는 각각의 사이클 동안 별개의 단계에서 절단될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 절단은 염료 표지가 부착된 곳에서 또는 그 근처에서 뉴클레오티드를 화학적으로 변형시켜, DNA 상에 "흔적"을 남길 수 있으며, 일부 경우에는, 아마도 SBS 폴리머라제, 하류 서열분석 메트릭(metric), 또는 SBS 공정의 다른 태양에 대한 생성된 DNA의 결합에 불리한 영향을 미칠 수 있다.

본 발명은 이들 및 다른 결함들을 당업계에서 극복하는 것에 관한 것이다.

제1 태양은 방법에 관한 것이다. 본 방법은 (a) 폴리머라제를 주형 폴리뉴클레오티드 및 복수의 유리 뉴클레오티드와 접촉시키는 단계 - 주형 폴리뉴클레오티드는 주형 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 단편에 의해 돌출된 3' 말단을 포함하는 상보적 폴리뉴클레오티드에 혼성화되고, 복수의 유리 뉴클레오티드는 하기 화학식 (I)의 화합물을 포함하고:

[화학식 (I)]

여기서, R₁은 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실로부터 선택되는 질소성 염기를 포함하고; R₂는 -O-R₂를 포함하고, 여기서 R₂는 H 또는 Z이고, Z는 아지도 기를 포함하는 제거가능한 보호기이고; R₃은 3개 이상의 포스페이트 기를 포함하는 링커를 포함하고; R₄는 형광 표지를 포함하고; 상기 접촉은 복합체화 조건 하에서 발생하고, 복합체화 조건은 복합체를 형성하는 데는 효과적이지만 중합을 형성하는데 효과적이지 않고, 복합체는 폴리머라제, 주형 폴리뉴클레오티드, 상보적 폴리뉴클레오티드, 및 주형 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 단편의 제1 뉴클레오티드에 상보적인 복수의 유리 뉴클레오티드 중 하나를 포함함 -; b) 형광 표지로부터 신호를 검출하는 단계; 및 c) 복합체를 중합 조건에 노출시키는 단계를 포함한다.

일 실시 형태에서, R₂는 -O-R₂로 이루어지고, 여기서 R₂는 H 또는 Z이고, Z는 아지도 기를 포함하는 제거가능한 보호기이다. 다른 실시 형태에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 기재에 부착된 복수의 주형 폴리뉴클레오티드 중 하나이다. 일 실시 형태에서, 기재에 부착된 복수의 주형 폴리뉴클레오티드는 라이브러리 폴리뉴클레오티드 카피의 클러스터를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 본 방법은 단계 a) 내지 단계 c)를 1회 이상 반복하는 단계를 추가로 포함한다.

일 실시 형태에서, 중합 조건은 Mg²⁺ 이온의 농도를 - Mg²⁺ 이온의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM 범위임 - 포함하거나, Mn²⁺ 이온의 농도를 - Mn²⁺ 이온의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM 범위임 - 포함한다. 다른 실시 형태에서, 복합체화 조건은 비-촉매 금속 양이온을 포함한다. 일 실시 형태에서, 비-촉매 금속 양이온은 Ca²⁺, Zn²⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Eu²⁺, Sr²⁺, Ba²⁺, Fe²⁺, 및 Eu²⁺ 중 하나 이상으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시 형태에서, 비-촉매 금속 양이온의 농도는 약 10 mM 이하이다.

일 실시 형태에서, 복합체화 조건은 킬레이트제를 포함한다. 일 실시 형태에서, 킬레이트제는 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N′,N′-테트라아세트산(EGTA), 니트릴로아세트산, 테트라소듐 이미노다이석시네이트, 에틸렌 글리콜 테트라아세트산, 폴리아스파르트산, 에틸렌다이아민-N,N'-다이석신산(EDDS), 메틸글리신다이아세트산(MGDA), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일 실시 형태에서, 복합체화 조건은 비-경쟁적 억제제, 경쟁적 억제제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 억제제를 추가로 포함한다. 다른 실시 형태에서, 복합체화 조건은 약 6 미만인 pH를 포함한다.

다른 실시 형태에서, 중합 조건은 약 6 이상인 pH를 포함한다. 일 실시 형태에서, 복합체화 조건은 비-경쟁적 억제제를 포함한다. 일 실시 형태에서, 비-경쟁적 억제제는 아미노글리코사이드, 피로포스페이트 유사체, 멜라닌, 포스포노아세테이트, 하이포포스페이트, 리파마이신, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일 실시 형태에서, 복합체화 조건은 경쟁적 억제제를 포함한다. 일 실시 형태에서, 경쟁적 억제제는 아피디콜린, 베타-D-아라비노푸라노실-CTP, 아밀로라이드, 데하이드로알테뉴신, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 복합체화 조건은 용매 첨가제를 포함한다. 일 실시 형태에서, 용매 첨가제는 에탄올, 메탄올, 테트라하이드로푸란, 다이옥산, 다이메틸아민, 다이메틸포름아미드, 다이메틸 설폭사이드, 리튬, L-시스테인, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시 형태에서, 복합체화 조건은 중수소를 포함한다.

일 실시 형태에서, 3'-하이드록시 블록킹 기는 가역적 종결자를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 가역적 종결자는 아지도메틸 기 또는 아세탈 기를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 본 방법은 상보적 폴리뉴클레오티드의 3' 말단이 링커의 포스페이트 기에 공유 결합된 후에 가역적 종결자를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 유리 뉴클레오티드는 비-가교 티올 또는 가교 질소를 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 폴리머라제는 돌연변이를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 돌연변이는 단계 a) 내지 단계 c) 중 하나 이상의 속도를 변경한다.

SBS에 사용되는 현재의 ffN은 핵염기 상에 염료 표지를 보유하며, 이는 각각의 사이클 동안 별개의 단계에서 절단되어야 한다. 이러한 절단은 DNA 상에 "흔적"을 남기고, SBS 폴리머라제 및 하류 서열분석 메트릭에 대한 생성된 DNA의 결합에 잠재적으로 영향을 미친다. 형광 태그(또는 임의의 다른 검출 태그)를 핵염기로부터 5' 말단 포스페이트로 이동시키고 효소 촉매작용을 조심스럽게 제어함으로써, 뉴클레오티드의 도입은 완전히 검출 태그의 방출을 야기하여 무흔적 DNA - 이는 달리 염료 표지의 제거에 기인할 그의 핵염기의 유해한 변형이 없는 DNA임 - 를 남긴다.

도 1a 내지 도 1f는 무흔적 SBS 사이클의 개략도를 도시한다. 도 1a는 폴리머라제가 플로우 셀 표면 상에 클러스터링된 프라이밍된 DNA에 결합되는 것을 도시한다. 도 1b에서, 5'-포스페이트 표지를 보유하는 뉴클레오티드 기재는 촉매작용을 제어하는 조건 하에 도입되어, 폴리머라제 도입 동력학을 일시정지시키고 5' 포스페이트 상에 표지를 유지시킨다. 검출 모드에 따라, 과량의 기재가 결합 후 세척될 수 있다. 뉴클레오티드는 촉매 조건의 도입 시 다수의 뉴클레오티드 도입 이벤트를 방지하기 위해 선택적으로 3'-블록을 보유할 수 있다. 도 1c에서, 촉매작용 전에 뉴클레오티드 기재 및 이의 5'-포스페이트 표지가 여전히 결합되어 있는 동안 클러스터마다 신호가 측정된다. 도 1d는 촉매작용이 촉진될 수 있도록 플로우 셀의 조건이 변경되고 5' 포스페이트 표지가 클러스터로부터 방출되는 것을 도시한다. 뉴클레오티드 결합 후에 과량의 기재를 세척하지 않는 실시 형태에서 3'-블록의 존재가 단일 연장 이벤트만을 가능하게 하기 위해 여기에서 필요할 것이다. 도 1e에서, 생성된 DNA 생성물은 천연 뉴클레오티드를 포함한다. 도 1f는 3'-블록을 갖는 뉴클레오티드 기재를 사용하는 일부 실시 형태에서, 후속 탈블록킹 단계가 후속 사이클 동안 클러스터를 제조하는 데 필요할 수 있다는 것을 도시한다.
아래에서 더 상세히 논의되는 전술한 개념들 및 추가의 개념들의 모든 조합은 (그러한 개념들이 상호 불일치하지 않는다면) 본 명세서에 개시된 발명 요지의 일부인 것으로 고려되고 본 명세서에서 설명되는 이익 및 이점을 달성하기 위해 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.

[화학식 (I)]

본 발명의 소정 태양, 모드, 실시 형태, 변형예, 및 특징부는 본 기술의 실질적인 이해를 제공하기 위해 상세사항의 다양한 레벨에서 후술된다는 것을 이해하여야 한다. 달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어들은 대체적으로 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 용어 "포함하는"뿐만 아니라 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다. 용어 "갖는"뿐만 아니라 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, 청구항의 전제부에서든 또는 본문에서든, 용어 "포함한다" 및 "포함하는"은 개방형(open-ended) 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 이 용어는 "적어도 갖는" 또는 "적어도 포함하는"과 동의어로 해석되어야 한다.

청구범위를 포함하여 본 발명 전반에 걸쳐 사용될 수 있는 용어 "실질적으로", "대략", "약", "상대적으로", 또는 다른 그러한 유사한 용어는, 예를 들어 기준 또는 파라미터로부터의 처리의 변화로 인한 작은 변동을 기술하고 설명하는 데 사용된다. 그러한 작은 변동은, 또한, 기준 또는 파라미터로부터의 0의 변동을 포함한다. 예를 들어, 변동은 ±10% 이하, 예를 들어 ±5% 이하, 예를 들어 ±2% 이하, 예를 들어 ±1% 이하, 예를 들어 ±0.5% 이하, 예를 들어 ±0.2% 이하, 예를 들어 ±0.1% 이하, 예를 들어 ±0.05% 이하를 지칭할 수 있다.

명확성을 위해 별도의 실시 형태의 맥락에서 설명되는 본 명세서에 기재된 소정 특징부들이 또한 단일 실시 형태에서 조합하여 제공될 수 있다는 점이 추가로 이해된다. 반대로, 간결성을 위해 단일 실시 형태의 맥락에서 설명되는 다양한 특징부들이 또한 별개로 또는 임의의 적합한 하위 조합으로 제공될 수 있다.

용어 "연결", "접촉" 및/또는 "결합"은 다양한 배열 및 조립체를 포함한다. 이들 배열 및 기술은 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: (1) 하나의 컴포넌트와 다른 컴포넌트의, 이들 사이에 개재 컴포넌트가 없는, 직접 결합(즉, 컴포넌트들은 직접적인 물리적 접촉 상태에 있음); 및 (2) 다른 컴포넌트에 "연결"되거나 "접촉"하거나 "결합"되는 하나의 컴포넌트가 어떻게든 다른 컴포넌트와 (예컨대, 전기적으로, 유체적으로, 물리적으로, 광학적으로 등) 작동 연통한다면(그들 사이에 하나 이상의 추가의 컴포넌트들이 존재함에도 불구하고), 하나의 컴포넌트와 다른 컴포넌트의, 이들 사이에 하나 이상의 컴포넌트들이 있는 결합. 서로 직접 물리적으로 접촉하는 컴포넌트들은 서로 전기적 접촉 및/또는 유체 접촉 상태에 있을 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 더욱이, 전기적으로 연결되거나, 전기적으로 결합되거나, 광학적으로 연결되거나, 광학적으로 결합되거나, 유동적으로 연결되거나, 유동적으로 결합되는 2개의 컴포넌트들은 직접적인 물리적 접촉 상태에 있을 수 있거나 그렇지 않을 수 있고, 하나 이상의 다른 컴포넌트들이 그들 두 개의 연결된 컴포넌트들 사이에 위치될 수 있다.

본 명세서에 기재되는 바와 같이, 용어 "어레이"는 하나 이상의 고상 기재에 부착할 수 있는 전도성 채널들 또는 분자들의 집단을 포함할 수 있는데, 이로써 전도성 채널들 또는 분자들은 그들의 위치에 기초하여 서로 차별화될 수 있게 되어 있다. 본 명세서에 기재되는 바와 같은 어레이는 고상 기재 상의 상이한 식별가능한 위치들에 (예를 들어, 상이한 전도성 채널들에) 각각 위치된 상이한 분자들을 포함할 수 있다. 대안적으로, 어레이는, 각각 상이한 분자를 갖는 별개의 고상 기재들을 포함할 수 있으며, 여기서 상이한 프로브 분자들은 고상 기재들이 부착한 표면 상의 고상 기재들의 위치에 따라 또는 유체 스트림과 같은 액체 중에서의 고상 기재들의 위치에 기초하여 식별될 수 있다. 별개의 기재가 표면 상에 위치되는 어레이의 예는, 모두가 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제6,355,431호, 미국 특허 출원 공개 제2002/0102578호 및 WO 00/63437호에 기재된 바와 같은 비드를 갖는 웰을 포함한다. 어레이의 분자들은 핵산 프라이머, 핵산 프로브, 핵산 주형 또는 핵산 효소, 예컨대 폴리머라제 및 엑소뉴클레아제일 수 있다.

본 명세서에 설명된 바와 같이, 용어 "부착된"은 2개의 물체가 서로 접합, 체결, 접착, 연결, 또는 결합된 경우를 포함할 수 있다. 폴리머라제와 같은 반응 성분은 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 전도성 채널과 같은 고상 구성요소에 부착될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 용어 "공유적으로 부착된" 또는 "공유 결합된"은 원자들 사이에 전자쌍을 공유하는 것을 특징으로 하는 하나 이상의 화학 결합을 형성하는 것을 지칭한다. 비공유 결합은 전자쌍의 공유를 수반하지 않는 것이며, 예를 들어 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘, 친수성 상호작용 및 소수성 상호작용을 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 임의의 "R" 기(들)는 표시된 원자에 부착될 수 있는 치환체를 나타낸다. R 기는 치환 또는 비치환될 수 있다. 2개의 R 기가 "이들이 부착되어 있는 원자와 함께" 고리 또는 고리 시스템을 형성하는 것으로 기재되는 경우, 이는 원자들의 집합적 단위, 개재 결합, 및 2개의 R 기가 언급된 고리임을 의미한다.

C₁ 내지 C₂₀ 탄화수소는 알킬, 사이클로알킬, 폴리사이클로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴 및 이들의 조합을 포함한다. 예에는 벤질, 페네틸, 프로파르길, 알릴, 사이클로헥실메틸, 아다만틸, 캄퍼릴 및 나프틸에틸이 포함된다. 탄화수소는 단지 원소 구성성분으로서 수소 및 탄소만으로 포함되는 임의의 치환체를 지칭한다.

용어 "알킬"은 사슬에 약 1 내지 약 23개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형일 수 있는 지방족 탄화수소 기를 포함한다. 예를 들어, 직쇄 또는 분지형 탄소 사슬은 1 내지 10개의 탄소 원자 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 분지형은 메틸, 에틸 또는 프로필과 같은 하나 이상의 저급 알킬 기가 선형 알킬 사슬에 부착된 것을 의미한다. 알킬은 완전히 포화된 (즉, 이중 또는 삼중 결합을 포함하지 않는) 탄화수소와 이들의 조합을 포함한다. (예를 들어, 1 내지 10개의 탄소 원자, 예컨대, 1 내지 6개의 탄소 원자). 알킬 기의 예에는 메틸, 에틸, 프로필, n-프로필, 아이소프로필, 부틸, 아이소부틸, n-부틸, s-부틸, t-부틸, n-펜틸, 및 3-펜틸이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 알킬 기는 1 내지 약 23개의 탄소 원자를 가질 수 있다(이것이 본 명세서에서 나타날 때마다, "1 내지 23"과 같은 수치 범위는 주어진 범위 내의 각각의 정수를 지칭하는데; 예를 들어, "1 내지 23개의 탄소 원자"는, 알킬 기가 1개의 탄소 원자, 2개의 탄소 원자, 3개의 탄소 원자, 4개의 탄소 원자, 5개의 탄소 원자 등, 및 23개를 포함하여 최대 23개의 탄소 원자로 이루어질 수 있다는 것을 의미하지만, 본 발명은 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "알킬"의 경우를 또한 포함한다). 예를 들어, "C₁-C₆ 알킬"은 알킬 사슬 내에 1 내지 6개의 탄소 원자가 있다는 것을 나타낸다(즉, 알킬 사슬은 메틸, 에틸, 프로필, 아이소-프로필, n-부틸, 아이소-부틸, sec-부틸, 및 t-부틸로 이루어진 군으로부터 선택됨).

본 명세서에 기재된 바와 같이, "알케닐"은 하나 이상의 이중 결합을 포함하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 지칭한다. 알케닐 기는 약 2 내지 약 23개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 설명은 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "알케닐"의 경우를 또한 포함한다. 알케닐 기는 또한 2 내지 9개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기 알케닐일 수 있다. 알케닐 기는 또한 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 저급 알케닐일 수 있다. 예를 들어, "C₂-C₆ 알케닐"은 알케닐 사슬 내에 2 내지 6개의 탄소 원자가 존재하는 것을 나타내며, 즉, 알케닐 사슬은 에테닐, 프로펜-1-일, 프로펜-2-일, 프로펜-3-일, 부텐-1-일, 부텐-2-일, 부텐-3-일, 부텐-4-일, 1-메틸-프로펜-1-일, 2-메틸-프로펜-1-일, 1-에틸-에텐-1-일, 2-메틸-프로펜-3-일, 부타-1,3-다이에닐, 부타-1,2,-다이에닐, 및 부타-1,2-다이엔-4-일로 이루어진 군으로부터 선택된다. 전형적인 알케닐 기에는 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 및 헥세닐이 포함될 수 있지만, 이로 한정되지 않는다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, "알키닐"은 하나 이상의 삼중 결합을 포함하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 포함한다. 알키닐 기는 약 2 내지 약 23개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 설명은 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "알키닐"의 경우를 또한 포함한다. 예로서, "C₂-C₆ 알키닐"은 알키닐 사슬 내에 2 내지 6개의 탄소 원자가 있을 수 있다는 것을 나타낸다(즉, 알키닐 사슬은 에티닐, 프로핀-1-일, 프로핀-2-일, 부틴-1-일, 부틴-3-일, 부틴-4-일, 및 2-부티닐로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다). 전형적인 알키닐 기에는 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐, 및 헥시닐 등이 포함될 수 있지만, 이로 한정되지 않는다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, "헤테로알킬"은 사슬 골격 내에 하나 이상의 헤테로원자, 즉, 질소, 산소 및 황을 포함하지만 이로 한정되지 않는 탄소 이외의 원소를 포함하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 헤테로알킬 기는 1 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 발명은 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "헤테로알킬"의 경우를 또한 포함한다. 예를 들어, "C₄-C₆ 헤테로알킬"은 헤테로알킬 사슬 내에 4 내지 6개의 탄소 원자, 그리고 추가적으로 사슬의 골격 내에 하나 이상의 헤테로원자가 존재하는 것을 나타낼 수 있다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 방향족은 컨쥬게이트된 파이 전자 시스템을 갖는 고리 또는 고리 시스템을 지칭하며, 카르보사이클릭 방향족(예를 들어, 페닐) 및 헤테로사이클릭 방향족 기(예를 들어, 피리딘) 둘 모두를 포함한다. 방향족은 전체 고리 시스템이 방향족이라면, 모노사이클릭 또는 융합-고리 폴리사이클릭(즉, 인접한 원자쌍을 공유하는 고리) 기를 포함할 수 있다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 "아릴"은 고리 골격 내에 탄소만을 포함하는 방향족 고리 또는 고리 시스템(예를 들어, 2개의 인접한 탄소 원자를 공유하는 2개 이상의 융합된 고리)을 포함한다. 본 발명은 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "아릴"의 경우를 또한 포함한다. 일 실시 형태에서, 아릴 기는 6 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다. 아릴 기는, 예를 들어 "C₆-C₁₀ 아릴"로 지정될 수 있다. 대표적인 아릴 기에는 페닐, 나프틸, 아줄레닐, 및 안트라세닐이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 "아르알킬" 또는 "아릴알킬"은, 치환체로서, 알킬렌 기를 통해 연결된 아릴 기로서, 이는, 예를 들어 "C₇-C₁₄ 아르알킬" 등이며, 이에는 벤질, 2-페닐에틸, 3-페닐프로필, 및 나프틸알킬이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.

용어 "헤테로아릴"은, 약 5 내지 약 14개의 고리 원자, 바람직하게는 약 5 내지 약 10개의 고리 원자의 방향족 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭 고리 시스템을 포함하는데, 고리 시스템 내의 하나 이상의 원자는 탄소 이외의 원소(들), 예를 들어, 질소, 산소, 또는 황이다. 멀티사이클릭 고리 시스템의 경우, 고리 시스템이 "헤테로아릴"로 정의되기 위해, 고리들 중 하나만은 방향족일 필요가 있다 헤테로아릴 기는 5 내지 18개의 고리 구성원(즉, 탄소 원자 및 헤테로원자를 포함하는 고리 골격을 구성하는 원자의 수)을 가질 수 있지만, 본 발명은 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "헤테로아릴"의 경우를 또한 포함한다. 바람직한 헤테로아릴은 약 5 내지 10개의 고리 원자, 또는 약 5 내지 6개의 고리 원자를 포함한다. 헤테로아릴 앞의 접두사 아자, 옥사, 티아, 또는 티오는 적어도 질소, 산소, 또는 황 원자가, 각각, 고리 원자로서 존재하는 것을 의미한다. 헤테로아릴의 질소 원자는 선택적으로, 상응하는 N-옥사이드로 산화된다. 대표적인 헤테로아릴은 티에닐, 프탈라지닐, 피리디닐, 벤즈옥사졸릴, 벤조티에닐, 피리딜, 2-옥소-피리디닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 피라지닐, 트라이아지닐, 푸라닐, 피롤릴, 티오페닐, 피라졸릴, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 아이소옥사졸릴, 티아졸릴, 아이소티아졸릴, 트라이아졸릴, 옥사다이아졸릴, 티아다이아졸릴, 테트라졸릴, 인돌릴, 아이소인돌릴, 벤조푸라닐, 벤조티오페닐, 인돌리닐, 2-옥소인돌리닐, 다이하이드로벤조푸라닐, 다이하이드로벤조티오페닐, 인다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조옥사졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조아이소옥사졸릴, 벤조아이소티아졸릴, 벤조트라이아졸릴, 벤조[1,3]다이옥솔릴, 퀴놀리닐, 아이소퀴놀리닐, 퀴나졸리닐, 신놀리닐, 프탈라지닐, 퀴녹살리닐, 2,3-다이하이드로-벤조[1,4]다이옥시닐, 벤조[1,2,3]트라이아지닐, 벤조[1,2,4]트라이아지닐, 4H-크로메닐, 인돌리지닐, 퀴놀리지닐, 6aH-티에노[2,3-d]이미다졸릴, 1H-피롤로[2,3-b]피리디닐, 이미다조[1,2-a]피리디닐, 피라졸로[1,5-a]피리디닐, [1,2,4]트라이아졸로[4,3-a]피리디닐, [1,2,4]트라이아졸로[1,5-15 a]피리디닐, 티에노[2,3-b]푸라닐, 티에노[2,3-b]피리디닐, 티에노[3,2-b]피리디닐, 푸로[2,3-b]피리디닐, 푸로[3,2-b]피리디닐, 티에노[3,2-d]피리미디닐, 푸로[3,2-d]피리미디닐, 티에노[2,3-b]피라지닐, 이미다조[1,2-a]피라지닐, 5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[1,2-a]피라지닐, 6,7-다이하이드로-4H-피라졸로[5,1-c][1,4]옥사지닐, 2-옥소-2,3-다이하이드로벤조[d]옥사졸릴, 3,3-다이메틸-2-옥소인돌리닐, 2-옥소-2,3-다이하이드로-1H-피롤로[2,3-b]피리디닐, 벤조[c][1,2,5]옥사다이아졸릴, 벤조[c][1,2,5]티아다이아졸릴, 3,4-다이하이드로-2H-벤조[b][1,4]옥사지닐, 5,6,7,8-테트라하이드로-[1,2,4]트라이아졸로[4,3-a]피라지닐, [1,2,4]트라이아졸로[4,3-a]피라지닐, 3-옥소-[1,2,4]트라이아졸로[4,3-a]피리딘-2(3H)-일 등을 포함한다.

"헤테로아르알킬" 또는 "헤테로아릴알킬"은, 치환체로서, 알킬렌 기를 통해 연결된 헤테로아릴 기를 지칭한다. 예에는 2-티에닐메틸, 3-티에닐메틸, 푸릴메틸, 티에닐에틸, 피롤릴알킬, 피리딜알킬, 아이소옥사졸릴알킬, 및 이미다졸릴알킬이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.

달리 명시되지 않는 한, 용어 "카르보사이클"은 고리 원자가 모두 탄소이지만 임의의 산화 상태를 갖는 고리 시스템을 포함하는 것으로 의도된다. 카르보사이클릴이 고리 시스템인 경우에는, 2개 이상의 고리가 융합된, 가교된 또는 스피로-연결된 방식으로 함께 연결될 수 있다. 카르보사이클릴은 고리 시스템 내의 적어도 하나의 고리가 방향족이 아니면 임의의 포화도를 가질 수 있다. 따라서, 카르보사이클릴에는 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 사이클로알키닐이 포함된다. 카르보사이클릴 기는 3 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있고, 용어 "카르보사이클릴"의 본 사용은 수치 범위가 지정되지 않은 경우를 또한 포함한다. 따라서, (C₃-C₁₂) 카르보사이클은, 예를 들어, 비방향족 시스템 및 방향족 시스템 둘 모두를 지칭하며, 이에는 사이클로프로판, 벤젠 및 사이클로헥센과 같은 시스템이 포함된다. 달리 제한되지 않는 경우, 카르보사이클은 모노사이클, 바이사이클 및 폴리사이클을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "사이클로알킬"은 완전 포화 카르보사이클릴 고리 또는 고리 시스템을 의미한다. 사이클로알킬은 탄화수소의 하위세트이며, 3 내지 8개의 탄소 원자의 환형 탄화수소 기를 포함한다. 사이클로알킬 기의 예는 c-프로필, c-부틸, c-펜틸, 및 노르보르닐(예를 들어, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 및 사이클로헥실)을 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "C₁-C₆"은 C₁, C₂, C₃, C₄, C₅ 및 C₆, 및 임의의 이들 2개의 숫자에 의해 정의되는 범위를 포함한다. 예를 들어, C₁-C₆ 알킬은 C₁, C₂, C₃, C₄, C₅, 및 C₆ 알킬, C₂-C₆ 알킬, C₁-C₃ 알킬 등을 포함한다. 유사하게, C₂-C₆ 알케닐은 C₁, C₂, C₃, C₄, C₅, 및 C₆알케닐, C₂-C₅ 알케닐, C₃-C₄ 알케닐 등을 포함하고; C₂-C₆ 알키닐은 C₂, C₃, C₄, C₅, 및 C₆ 알키닐, C₂-C₅ 알키닐, C₃-C₄ 알키닐 등을 포함한다. C₃-C₅사이클로알킬은 각각 3, 4, 5, 6, 7 및 8개의 탄소 원자를 포함하는 탄화수소 고리, 또는 임의의 2개의 숫자에 의해 한정되는 범위, 예컨대 C₃-C₇ 사이클로알킬 또는 C₅-C₆ 사이클로알킬을 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "헤테로사이클릴" 또는 "헤테로사이클"은 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 내지 5개의 헤테로원자 및 탄소 원자로 구성된 안정한 3원 내지 18원 고리(라디칼)를 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, 헤테로사이클은 모노사이클릭, 또는 폴리사이클릭 고리 시스템일 수 있으며, 이는 융합, 가교 또는 스피로 고리 시스템을 포함할 수 있고; 헤테로사이클 내의 질소, 탄소 또는 황 원자는 선택적으로 산화될 수 있고; 질소 원자는 선택적으로 4급화될 수 있고; 고리는 부분적으로 또는 완전히 포화될 수 있다. 헤테로사이클릴은 고리 시스템 내의 적어도 하나의 고리가 방향족이 아니면 임의의 포화도를 가질 수 있다. 헤테로원자(들)는 고리 시스템 내의 비방향족 또는 방향족 고리 중 어느 하나에 존재할 수 있다. 헤테로사이클릴 기는 3 내지 20개의 고리 구성원(즉, 탄소 원자 및 헤테로원자를 포함하는 고리 골격을 구성하는 원자의 수)을 가질 수 있지만, 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "헤테로사이클릴"의 경우가 또한 포함된다. 이러한 헤테로사이클의 예는, 제한 없이, 아크리디닐, 카르바졸릴, 이미다졸리닐, 옥세파닐, 티에파닐, 다이옥소피페라지닐, 피롤리도닐, 피롤리다이오닐, 옥시라닐, 아제피닐, 아조카닐, 피라닐 다이옥솔라닐, 다이티아닐, 1,3-다이옥솔라닐, 테트라하이드로푸릴, 다이하이드로피롤리디닐, 데카하이드로아이소퀴놀릴, 이미다졸리디닐, 아이소티아졸리디닐, 아이소옥사졸리디닐, 모르폴리닐, 옥타하이드로인돌릴, 옥타하이드로아이소인돌릴, 2-옥소피페라지닐, 2-옥소피페리디닐, 2-옥소피롤리디닐, 2-옥소아제피닐, 옥사졸리디닐, 옥시라닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 4-피페리도닐, 피롤리디닐, 피라졸리디닐, 티아졸리디닐, 테트라하이드로피라닐, 티아모르폴리닐, 티아모르폴리닐 설폭사이드, 티아모르폴리닐 설폰, 및 테트라하이드로퀴놀린을 포함한다. 추가의 헤테로사이클 및 헤테로아릴은 문헌[Katritzky et al., eds., Comprehensive Heterocyclic Chemistry: The Structure, Reactions, Synthesis and Use of Heterocyclic Compounds, Vol. 1-8, Pergamon Press, N.Y. (1984)]에 기재되어 있고, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 명세서에 사용되는 용어 "모노사이클릭"은 하나의 고리를 갖는 분자 구조를 나타낸다.

본 명세서에 사용되는 용어 "폴리사이클릭" 또는 "다중-사이클릭"은 융합, 가교 또는 스피로 고리를 포함하지만 이로 한정되지 않는 2개 이상의 고리를 갖는 분자 구조를 나타낸다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "할로겐" 또는 "할로"는 원소 주기율표의 7열의 방사선-안정성(radio-stable) 원자, 예를 들어 불소, 염소, 브롬, 또는 요오드 중 임의의 하나를 포함할 수 있다.

원자의 "치환된" 또는 "치환"이라는 용어는, 지정된 원자의 정상 원자가가 초과되지 않는 경우, 지정된 원자 상의 하나 이상의 수소가 표시된 기로부터의 선택으로 대체되는 것을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 치환된 기는 비치환된 모 기(parent group) 내의 하나 이상의 수소 원자를 다른 원자 또는 기로 교환한 것으로부터 유도된다. 달리 표시내지 않는 한, 기가 "치환된" 것으로 간주되는 경우, 그 기는 하나 이상의 치환체로 치환된 것을 의미한다. 기가 "선택적으로 치환된"으로 기재되어 있는 경우에는 언제든지, 그 기는 상기 치환체로 치환될 수 있다.

"비치환된" 원자는 이의 원자가에 의해 지시된 모든 수소 원자를 갖는다. 치환체가 케토(즉, =0)인 경우, 원자 상의 2개의 수소가 대체된다. 치환체 및/또는 변수의 조합은 그러한 조합이 안정한 화합물을 생성하는 경우에만 허용가능하고; "안정한 화합물" 또는 "안정한 구조"는 반응 혼합물로부터 유용한 순도로 단리를 견뎌내기 위한 충분히 강인성인 화합물을 의미한다.

용어 "선택적으로 치환된"은, 지정된 원자의 정상 원자가가 초과되지 않고 각각의 치환체의 정체(identity)가 다른 것들과 독립적인 경우, 기가 (단일 원자 상에 하나 이상의 치환체를 포함하는) 기의 각각의 치환된 원자에서 치환체를 가질 수 있다는 것을 나타내는 데 사용된다. 각각의 잔기 중 최대 3개의 H 원자가 알킬, 할로겐, 할로알킬, 하이드록시, 저급알콕시, 카르복시, 카르보알콕시(알콕시카르보닐로도 지칭됨), 카르복사미도 (알킬아미노카르보닐로도 지칭됨), 시아노, 카르보닐, 니트로, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 메르캅토, 알킬티오, 설폭사이드, 설폰, 아실아미노, 아미디노, 페닐, 벤질, 헤테로아릴, 페녹시, 벤질옥시 또는 헤테로아릴옥시로 대체된다. "비치환된" 원자는 이의 원자가에 의해 지시된 모든 수소 원자를 갖는다. 치환체가 케토(즉, =0)인 경우, 원자 상의 2개의 수소가 대체된다. 치환체 및/또는 변수의 조합은 그러한 조합이 안정한 화합물을 생성하는 경우에만 허용가능하고; "안정한 화합물" 또는 "안정한 구조"는 반응 혼합물로부터 유용한 순도로 단리를 견뎌내기 위한 충분히 강인성인 화합물을 의미한다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "하이드록시"는 -OH 기를 포함한다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 또는 뉴클레오티드 유사체로부터 제조된 DNA 또는 RNA의 유사체를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 용어는 또한, 예를 들어 역전사효소의 작용에 의해 RNA 주형으로부터 생성된 상보적 또는 카피 DNA인 cDNA를 포함한다. 일 실시 형태에서, 예를 들어 설명된 시스템의 사용을 통한 서열분석에 의해 분석될 핵산은 기재(예를 들어, 플로우 셀 내의 기재 또는 플로우 셀과 같은 기재 상의 하나 이상의 비드 등) 상에 고정화된다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 고정화된은, 명시적으로 또는 맥락에 의해 달리 지시되지 않는 한, 직접 또는 간접, 공유 또는 비공유 부착을 포함하는 것으로 의도된다. 분석물(예를 들어, 핵산)은 핵산 서열분석을 필요로 하는 응용에서와 같이, 지지체를 사용하는 것으로 의도된 조건 하에서 지지체에 고정화되거나 부착된 상태로 유지할 수 있다. 일 실시 형태에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 기재에 부착된 복수의 주형 폴리뉴클레오티드 중 하나이다. 일 실시 형태에서, 기재에 부착된 복수의 주형 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 기재된 바와 같이 라이브러리 폴리뉴클레오티드 카피의 클러스터를 포함한다.

핵산은 천연 발생 핵산 또는 이의 기능적 유사체를 포함한다. 특히 유용한 기능적 유사체는 서열 특이적 방식으로 핵산에 혼성화될 수 있거나 특정 뉴클레오티드 서열의 복제를 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 천연 발생 핵산은 일반적으로 포스포다이에스테르 결합을 포함하는 골격을 갖는다. 유사체 구조는 펩티드 핵산(PNA) 또는 고정된 핵산(LNA)과 같은 당업계에 알려진 임의의 다양한 것들을 포함한 대안적인 골격 결합을 가질 수 있다. 천연 발생 핵산은 일반적으로 데옥시리보스 당(예를 들어, 데옥시리보핵산(DNA)에서 발견됨) 또는 리보스 당(예를 들어, 리보핵산(RNA)에서 발견됨)을 갖는다.

RNA에서, 당은 리보스이고, DNA에서는 데옥시리보스, 즉 리보스에 존재하는 하이드록실 기가 결여되어 있는 당이다. 질소 함유 헤테로사이클릭 염기는 퓨린 또는 피리미딘 염기일 수 있다. 퓨린 염기는 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 이의 변형 유도체 또는 유사체를 포함한다. 피리미딘 염기는 시토신(C), 티민(T), 및 우라실(U), 및 이들의 변형된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 데옥시리보스의 C-1 원자는 피리미딘의 N-1 또는 퓨린의 N-9에 결합될 수 있다.

핵산은 당업계에 알려진 이들 당 모이어티(moiety)의 임의의 다양한 유사체를 포함할 수 있다. 핵산은 천연 또는 비천연 염기를 포함할 수 있다. 천연 데옥시리보핵산은 아데닌, 티민, 시토신 또는 구아닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염기를 가질 수 있고; 리보핵산은 우라실, 아데닌, 시토신 또는 구아닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염기를 가질 수 있다. 핵산 내에 포함될 수 있는 유용한 비천연 염기는 당업계에 알려져 있다. 본 발명에서, R₁은 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실로부터 선택되는 질소성 염기를 포함한다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 용어 뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드, 이의 유사체, 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 다이데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드로 알려진 다른 분자를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 뉴클레오티드는 질소 함유 헤테로사이클릭 염기, 당, 및 하나 이상의 포스페이트 기를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는, 예를 들어 DNA 또는 RNA 가닥에 존재하는 하위단위를 식별하기 위한 핵산 서열의 단량체 단위일 수 있다. 뉴클레오티드는 또한 중합체에 반드시 존재하는 것은 아닌 분자, 예를 들어 폴리머라제에 의해 주형 의존적 방식으로 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있는 분자를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는, 예를 들어 5' 탄소 상에 0, 1, 2, 3개 또는 그 이상의 포스페이트를 갖는 뉴클레오시드 단위를 포함할 수 있다. 테트라포스페이트 뉴클레오티드, 펜타포스페이트 뉴클레오티드, 및 헥사포스페이트 뉴클레오티드가 유용할 수 있으며, 이는, 5' 탄소 상에 6개 초과의 포스페이트, 예컨대 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상의 포스페이트를 갖는 뉴클레오티드도 마찬가지일 수 있다. 천연 발생 뉴클레오티드의 예는, 제한 없이, ATP, UTP, CTP, GTP, ADP, UDP, CDP, GDP, AMP, UMP, CMP, GMP, dATP, dTTP, dCTP, dGTP, dADP, dTDP, dCDP, dGDP, dAMP, dTMP, dCMP, 및 dGMP를 포함한다.

비천연 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 천연 생물학적 시스템에 존재하지 않거나, 천연 환경에서, 예를 들어 폴리머라제를 발현시키는 비재조합 세포에서, 폴리머라제에 의해 폴리뉴클레오티드 내로 실질적으로 도입되지 않는 것들을 포함한다. 비천연 뉴클레오티드는 다른 뉴클레오티드, 예컨대 동일한 왓슨-크릭(Watson-Crick) 상보적 염기와 염기쌍을 형성하는 천연 뉴클레오티드가 폴리머라제에 의해 가닥 내로 도입되는 속도보다 실질적으로 더 빠르거나 더 느린 속도로 폴리머라제에 의해 폴리뉴클레오티드 가닥 내로 도입되는 것들을 포함한다. 예를 들어, 비천연 뉴클레오티드는, 천연 뉴클레오티드의 도입 속도와 대비하여, 적어도 2배 상이한, 5배 상이한, 10배 상이한, 25배 상이한, 50배 상이한, 100배 상이한, 1000배 상이한, 10000배 상이한, 또는 그 이상인 속도로 도입될 수 있다. 비천연 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 내로 도입된 후 추가로 연장될 수 있다. 예에는 3' 하이드록실을 갖는 뉴클레오티드 유사체 또는 3' 위치에 가역적 종결자 모이어티를 갖는 뉴클레오티드 유사체가 포함되며, 이들은 제거되어 뉴클레오티드 유사체가 도입된 폴리뉴클레오티드의 추가의 연장을 가능하게 할 수 있다. 가역적 종결자 모이어티의 예는, 예를 들어, 미국 특허 제7,427,673호, 제7,414,116호, 및 제7,057,026호뿐만 아니라 WO 91/06678호 및 WO 07/123744호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 일부 예에서, 3' 종결자 모이어티를 갖거나 3' 하이드록실이 결여되어 있는 뉴클레오티드 유사체(예컨대, 다이데옥시뉴클레오티드 유사체)가, 뉴클레오티드 유사체가 도입된 폴리뉴클레오티드가 추가로 연장되지 않는 조건 하에서 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 일부 예에서, 뉴클레오티드(들)는 가역적 종결자 모이어티를 포함하지 않을 수 있거나, 뉴클레오티드(들)는 비가역적 종결자 모이어티를 포함하지 않을 것이거나, 뉴클레오티드(들)는 어떠한 종결자 모이어티도 전혀 포함하지 않을 것이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "뉴클레오시드"는 뉴클레오티드와 구조적으로 유사하지만 포스페이트 모이어티가 누락되어 있다. 뉴클레오시드 유사체의 한 예는 표지가 염기에 연결되어 있고 당 분자에 부착된 포스페이트 기가 없는 것일 것이다. 용어 "뉴클레오시드"는 당업자에게 명백한 이의 통상적인 의미로 본 명세서에 사용된다. 예에는 리보스 모이어티를 포함하는 리보뉴클레오시드 및 데옥시리보스 모이어티를 포함하는 데옥시리보뉴클레오시드가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 변형된 펜토스 모이어티는 산소 원자가 탄소로 치환되고/되거나 탄소가 황 또는 산소 원자로 치환된 펜토스 모이어티이다. "뉴클레오시드"는 치환된 염기 및/또는 당 모이어티를 가질 수 있는 단량체이다.

용어 "퓨린 염기"는 당업자에게 명백한 이의 통상적인 의미로 본 명세서에 사용되며, 이의 호변이성질체를 포함한다. 유사하게, 용어 "피리미딘 염기"는 당업자에게 명백한 이의 통상적인 의미로 본 명세서에 사용되며, 이의 호변이성질체를 포함한다. 선택적으로 치환된 퓨린-염기의 비제한적인 목록은 퓨린, 아데닌, 구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, 알록산틴, 7-알킬구아닌(예를 들어, 7-메틸구아닌), 테오브로민, 카페인, 요산 및 아이소구아닌을 포함한다. 피리미딘 염기의 예에는 시토신, 티민, 우라실, 5,6-다이하이드로우라실 및 5-알킬시토신(예를 들어, 5-메틸시토신)이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, 용어 기재(또는 고체 지지체)는 예를 들어 유리 표면, 플라스틱 표면, 라텍스, 덱스트란, 폴리스티렌 표면, 폴리프로필렌 표면, 폴리아크릴아미드 겔, 금 표면, 및 실리콘 웨이퍼와 같은 핵산이 부착될 수 있는 임의의 불활성 기재 또는 매트릭스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 기재는 유리 표면(예를 들어, 플로우 셀 채널의 평면형 표면)일 수 있다. 일 실시 형태에서, 기재는, 예컨대, 폴리뉴클레오티드와 같은 분자에 대한 공유 부착을 허용하는 반응성 기를 포함하는 중간 재료의 층 또는 코팅을 적용함으로써, "작용화된" 불활성 기재 또는 매트릭스를 포함할 수 있다. 지지체는 유리와 같은 불활성 기재 상에 지지된 폴리아크릴아미드 하이드로겔을 포함할 수 있다. 분자(예를 들어, 폴리뉴클레오티드)는 중간 재료(예를 들어, 하이드로겔)에 직접 공유적으로 부착될 수 있다. 지지체는 상이한 부착된 분석물을 각각 갖는 복수의 입자 또는 비드를 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에 기재된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 "포함하는" 것으로 기재될 때, 그것은 본 명세서에 기재된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 공유 결합을 형성하는 경우를 포함한다. 유사하게, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 일부로서 기재될 때, 예컨대 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 "내로 도입된" 것으로 기재될 때, 그것은 본 명세서에 기재된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 공유 결합을 형성할 수 있다는 것을 의미한다. 일 실시 형태에서, 공유 결합은 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 3' 탄소 원자와 뉴클레오티드의 5' 탄소 원자 사이의 포스포다이에스테르 결합으로서, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 3' 하이드록시 기와 뉴클레오티드의 5' 포스페이트 기 사이에 형성된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유도체" 및 "유사체"는 변형된 염기 모이어티 및/또는 변형된 당 모이어티를 갖는 합성 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 유도체를 의미한다. 이러한 유도체 및 유사체는, 예를 들어 문헌[

, Nucleotide Analogs (John Wiley & Son, 1980)] 및 문헌[Uhlmann et al., "Antisense Oligonucleotides: A New Therapeutic Principle," Chemical Reviews 90:543-584 (1990)]에 논의되어 있으며, 이들 둘 모두는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 뉴클레오티드 유사체는 또한, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 알킬-포스포네이트, 포스포르아닐리데이트 및 포스포르아미데이트 결합을 포함한 변형된 포스포다이에스테르 결합을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유도체", "유사체" 및 "변형된"은 상호교환 가능하게 사용될 수 있으며, 본 명세서에 기재된 용어 "뉴클레오티드" 및 "뉴클레오시드"에 의해 포함된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포스페이트"는 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 이의 통상적인 의미로 사용되고, 이의 양성자화 형태를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "모노포스페이트", "다이포스페이트", 및 "트라이포스페이트"는 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 이들의 통상적인 의미로 사용되고, 양성자화 형태를 포함한다. 본 발명에서, R₃은 3개 이상의 포스페이트 기를 포함하는 링커를 포함한다.

본 발명에 따라 기술된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는, 예를 들어, 3'O 위치에서 공유 부착된 블록킹 기를 갖는 퓨린 또는 피리미딘 염기 및 리보스 또는 데옥시리보스 당 모이어티를 포함하며, 이는 분자가, 예를 들어 서열분석 반응, 폴리뉴클레오티드 합성, 핵산 증폭, 핵산 혼성화 검정, 단일 뉴클레오티드 다형성 연구, 및 다른 그러한 기술과 같은 추가 뉴클레오티드의 도입을 방지하기 위해 3'-OH 기의 블록킹을 필요로 하는 기술에 유용하게 만든다.

용어 "블록킹 기"가 본 발명의 맥락에서 본 명세서에 사용되는 경우, 이는 본 명세서에 기재된 "Z" 블록킹 기를 포함한다. 그러나, 본 명세서에 기재되고 청구된 방법에서, 뉴클레오티드의 혼합물이 사용되는 경우, 이는 동일한 유형의 블록킹, 즉 "Z"-블록킹되는 것을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. "Z"-블록킹된 뉴클레오티드가 사용되는 경우, 각각의 "Z" 기는 검출가능한 표지가 "Z" 기의 일부를 형성한다면 (즉, 염기에 부착되지 않는다면) 동일한 기이거나 아닐 수 있다.

일단 블록킹 기가 제거되었다면, 다른 뉴클레오티드를 유리 3'-OH 기에 도입시킬 수 있다.

분자는 바람직한 링커에 의해 염기를 통해 검출가능한 표지에 연결될 수 있으며, 이러한 표지는 예를 들어 형광단일 수 있다. 그 대신, 검출가능한 표지는, 원하는 경우, 화학식 "Z"의 블록킹 기 내로 도입될 수 있다. 링커는 산 불안정일 수 있거나, 광불안정일 수 있거나, 다이설파이드 결합을 포함할 수 있다. 다른 결합, 특히 포스핀-절단가능한 아지드 함유 링커가 사용될 수 있다. 표지 및 결합의 예는 WO 03/048387호에 개시된 것들을 포함하며, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "하이드록시"는 -OH 기를 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 R₂는 하이드록시(즉, -OH 기)를 포함하고/하거나 본 명세서에 기재된 바와 같은 R₂는 -O-R₂로 이루어질 수 있고, 여기서 R₂는 H 또는 Z이고, Z는 아지도 기를 포함하는 제거가능한 보호기이다. 일 실시 형태에서, R₂는 -O-R₂로 이루어지고, 여기서 R₂는 Z이고, Z는 아지도 기를 포함하는 제거가능한 보호기이다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 용어 "블록킹 기" 및 "블록킹 기들"은 분자 내의 기존의 기가 원치 않는 화학 반응을 거치는 것을 방지하기 위해 분자에 부가되는 임의의 원자 또는 원자들의 군을 지칭한다. 어구 "블록킹 기" 및 "보호기"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 단일 도입만이 발생하는 것을 보장하기 위해, 하나의 뉴클레오티드만이 도입되는 것을 보장하기 위해 성장하는 사슬에 첨가되는 임의의 표지된 뉴클레오티드에 구조적 변형("블록킹 기" 또는 "보호기")이 포함될 수 있다. 블록킹 기를 갖는 뉴클레오티드가 부가된 후, 이어서, 블록킹 기는 서열분석되는 DNA의 무결성을 방해하지 않는 반응 조건 하에서 제거될 수 있다. 이어서, 서열분석 사이클은 다음의 보호되고 표지된 뉴클레오티드의 도입으로 계속될 수 있다.

DNA 서열분석에 유용하기 위해, 통상 뉴클레오티드 트라이포스페이트인 뉴클레오티드는, 일단 뉴클레오티드 상의 염기가 부가되면, 폴리뉴클레오티드 사슬에 도입하는 데 사용되는 폴리머라제가 지속적으로 복제하는 것을 방지하기 위해 3'-하이드록시 블록킹 기를 포함할 수 있다. 블록킹 기는 추가 뉴클레오티드 분자가 폴리뉴클레오티드 사슬에 부가되는 것을 방지하는 한편, 동시에, 폴리뉴클레오티드 사슬에 손상을 야기하지 않으면서 당 모이어티로부터 용이하게 제거될 수 있어야 한다. 추가로, 변형된 뉴클레오티드는 폴리머라제 또는 폴리뉴클레오티드 사슬 내 도입하는데 사용되는 다른 적절한 효소와 호환가능할 수 있다. 이상적인 보호기는 장기 안정성을 나타내어야 하고, 폴리머라제 효소에 의해 효율적으로 도입되어야 하고, 이차 또는 추가 뉴클레오티드 도입의 블록킹을 야기하여야 하고, 바람직하게는 수성 조건 하에서, 폴리뉴클레오티드 구조에 손상을 야기하지 않는 온화한 조건 하에서 제거되는 능력을 가져야 한다.

본 발명에 따라 유용할 수 있는 3' 아세탈 블록킹 기의 예는, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 출원 제16/724,088호에 기재된 것들을 포함하지만, 이로 한정되지 않는다. 본 발명에 따라 유용할 수 있는 아지도메틸 블록킹 기의 예는, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 출원 제16/724,088호에 기재된 티오카르바메이트 블록킹 기 또는 아세탈(예를 들어, 3' 아세탈 블록킹 기 또는 AOM)을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 일 실시 형태에서, 3' -OH 블록킹 기는, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 WO 2004/018497호에 개시된 모이어티를 포함할 것이다. 블록킹 기는, 예를 들어, 아지도메틸(CH₂N₃) 또는 알릴일 수 있다.

일 실시 형태에서, 3'-하이드록시 블록킹 기는 가역적 종결자를 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 가역적 종결자 모이어티의 예는, 예를 들어, 미국 특허 제7,427,673호, 제7,414,116호, 및 제7,057,026호뿐만 아니라 WO 91/06678호 및 WO 07/123744호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 일부 예에서, 3' 종결자 모이어티를 갖거나 3' 하이드록실이 결여되어 있는 뉴클레오티드 유사체(예컨대, 다이데옥시뉴클레오티드 유사체)가, 뉴클레오티드 유사체가 도입된 폴리뉴클레오티드가 추가로 연장되지 않는 조건 하에서 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 일부 예에서, 3'-하이드록시 블록킹 기가 가역적 종결자 모이어티를 포함하지 않을 수 있거나, 3'-하이드록시 블록킹 기가 비가역적 종결자 모이어티를 포함하지 않을 것이거나, 3'-하이드록시 블록킹 기가 어떠한 종결자 모이어티도 전혀 포함하지 않을 것이다. 가역적 보호기는, 예를 들어, 문헌[Metzker et al., "Termination of DNA Synthesis by Novel 3'-modified-deoxyribonucleoside 5'-triphosphates," Nucleic Acids Research 22(20):4259-426 (1994)]에 기재되어 있으며, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되고, 도입 활성을 위한 2개의 DNA 주형 검정에서의 시험 및 8개의 3'-변형된 2-데옥시리보뉴클레오시드 5'-트라이포스페이트(3'-변형된 dNTP)의 합성 및 사용을 개시한다. 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 WO 2002/029003호는 폴리머라제 반응에서 DNA의 성장하는 가닥 상에 3'-OH 기를 캡핑하기 위해 알릴 보호기의 사용을 포함할 수 있는 서열분석 방법을 기술한다. 본 명세서에 기재된 방법에 의해 유용할 수 있는 가역적 종결자의 예는 아지도메틸 기, 아세탈 기, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.

일 실시 형태에서, 본 방법은 상보적 폴리뉴클레오티드의 3' 말단이 링커의 포스페이트 기에 공유 결합된 후에 가역적 종결자를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 3'-블록킹 기 및 형광 염료 화합물은 동시에 또는 순차적으로 제거되어 (즉, 탈보호되어) 추가의 뉴클레오티드 도입을 위해 신생 사슬을 노출시킬 수 있다. 전형적으로, 도입된 뉴클레오티드의 정체는 각각의 도입 단계 후에 결정되겠지만, 이것이 요구되지는 않는다. 유사하게, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제5,302,509호는 고체 지지체 상에 고정화된 폴리뉴클레오티드를 서열분석하는 방법을 개시한다. 블록킹 기의 제거는 추가 중합이 발생하게 한다.

본 발명은 본 명세서에 개시된 임의의 방법에 사용될 수 있는 형광 표지를 포함하는 뉴클레오티드를, 그 자체로 또는 더 큰 분자 구조 또는 접합체로 도입되거나 이와 회합되어 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 R₄는 형광 표지를 포함한다. 이와 관련하여, 형광 표지(또는 사용될 수 있는 임의의 다른 검출 태그)는 핵염기로부터 5' 말단 포스페이트로 이동되어, 효소 촉매작용의 신중한 제어를 허용한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 이러한 방식으로의 뉴클레오티드의 도입은 완전히 검출 태그의 방출을 야기하여, 무흔적 DNA를 남긴다.

형광 표지는 임의의 공지된 형광 종, 예를 들어 로다민 또는 시아닌으로부터 선택되는 화합물을 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 형광 표지는 뉴클레오티드 염기 상의 임의의 위치에 부착될 수 있고, 선택적으로 링커를 포함할 수 있다. 링커의 기능은 대체적으로 형광 표지의 뉴클레오티드에 대한 화학적 부착을 돕는 것이다. 특정 실시 형태에서, 왓슨-크릭 염기쌍 형성은 생성된 유사체에 대해 여전히 수행될 수 있다. 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드에 염료를 공유적으로 부착하는 데 링커 기가 사용될 수 있다. 링커 모이어티는, 화합물이 핵산 복제 효소에 의한 뉴클레오티드의 전체적인 결합 및 인식을 크게 방해하지 않도록 뉴클레오티드를 화합물에 연결하기에 충분한 길이를 가질 수 있다. 따라서, 링커는 또한 스페이서 단위를 포함할 수 있다. 스페이서는, 예를 들어 절단 부위 또는 표지로부터 뉴클레오티드 염기를 이격시킨다. 링커는 예를 들어 하나 이상의 헤테로원자 대체물을 선택적으로 갖는 알킬 사슬일 수 있다. 링커는 화학적 커플링 반응을 용이하게 하기 위해 아미드 또는 에스테르 기를 포함할 수 있다. 링커는 클릭 화학을 사용하여 합성될 수 있다. 링커는 트라이아졸 기를 포함할 수 있다. 링커는 다른 아릴 기를 포함할 수 있다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명은 무흔적 SBS의 생성을 가능하게 할 수 있는 서열분석 화학에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 일단 뉴클레오티드 및 폴리머라제가 주형 가닥과 반대인 클러스터링된 DNA에 결합되면, (본 명세서에서 예를 들어, 복합체화 조건, 비도입 조건, 및 촉매작용의 일시정지로 상호교환적으로 지칭되는) 실제 뉴클레오티드 도입 전을 제외하고는, 형광 신호의 검출이 발생할 수 있다. 본 태양은 복합체화 조건 동안 신호를 검출하고 정확한 염기를 호출하기 위해 뉴클레오티드의 화학적 도입이 충분히 길게 일시정지되거나 완전히 방지되는 제어된 촉매작용을 이용한다.

플로우 셀의 표면 상에 폴리머라제-P/T 복합체에 의한 형광 염료 표지를 보유하는 뉴클레오티드 기재의 안정한 결합은 다양한 조건 하에서 발생할 수 있다. 안정한 결합 후, 용액 중의 과량의 뉴클레오티드가 세척될 수 있다. 예로서, 플로우 셀의 표면 상에 형광 염료 표지를 보유하는 뉴클레오티드 기재의 결합은 비-촉매 조건 하에서 발생할 수 있다. 비-촉매 조건이 유지될 때, 뉴클레오티드-폴리머라제-P/T 3원 복합체는 안정화되고 본 명세서에 기재된 바와 같은 복합체화 조건을 유지할 수 있다. 질소성 염기가 이의 각각의 염료 표지에 의해 식별되는 동안, 그리고 일단 신호 검출(및 이에 따른 염기 호출)이 달성되었으면, 시스템은 용액을 교환함으로써 비도입 조건(즉, 본 명세서에 기재된 바와 같은 복합체화 조건)으로부터 도입 조건(즉, 본 명세서에 기재된 바와 같은 중합 조건)으로 전환할 수 있다.

조건의 변화는 복합체화 조건(본 명세서에서, 예를 들어, 복합체화 조건 및/또는 비도입 조건으로 상호교환적으로 지칭됨)으로부터 중합 조건(본 명세서에서, 예를 들어, 중합 조건, 도입 조건, 및/또는 촉매 조건으로 상호교환적으로 지칭됨)으로의 전이를 용이하게 할 수 있다. 촉매 조건의 존재 하에, DNA 폴리머라제는 뉴클레오티드를 DNA로 도입시켜, 형광 표지를 보유할 수 있는 이탈기(예를 들어, 뉴클레오티드의 5-프라임 폴리포스페이트)의 해리를 야기할 수 있다. 일 실시 형태에서, 5' 말단 포스페이트 변형에 더하여, 3' 가역적 종결자(예를 들어, AZM 기)를 포함할 수 있는 뉴클레오티드는 전통적인 SBS에서 현재 사용된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 이러한 방법은 뉴클레오티드 도입의 정확한 제어를 촉진하여, 특히 하기에서 설명될 추가의 실시 형태에서, 각각의 사이클에서 DNA 가닥당 단일 뉴클레오티드의 연장을 가능하게 한다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 복합체화 조건은 복합체를 형성하는 데 효과적이지만 중합을 형성하는데 효과적이지 않은 조건을 지칭한다. 일단 유리 뉴클레오티드 및 폴리머라제가 주형 폴리뉴클레오티드와 반대인 상보적 폴리뉴클레오티드에 결합되면, 실제 뉴클레오티드 도입 전을 제외하고는, 형광 신호의 검출이 발생할 수 있다(뉴클레오티드 도입 이전에 형성되는 이러한 복합체는 본 명세서에서, 예를 들어, 복합체화 조건으로 지칭된다). 본 명세서에 기재된 바와 같은 복합체화 조건은 신호를 검출하고 정확한 염기를 호출하기 위해 뉴클레오티드의 도입이 충분히 길게 일시정지되거나 완전히 방지되는 제어된 촉매작용을 이용할 수 있다. 따라서, 복수의 폴리머라제를 복수의 주형 폴리뉴클레오티드 및 복수의 유리 뉴클레오티드와 접촉시키는 단계는, 본 발명에 따라, 복합체화 조건 하에서 발생할 수 있는데, 여기서 적어도 하나의 주형 폴리뉴클레오티드는 상보적 폴리뉴클레오티드에 혼성화되며, 여기서 각각의 상보적 폴리뉴클레오티드는 주형 폴리뉴클레오티드의 5-프라임 말단에 의해 돌출된 3-프라임 말단을 포함할 수 있다. 복합체화 조건 동안 형성된 복합체는 폴리머라제, 주형 폴리뉴클레오티드, 상보적 폴리뉴클레오티드, 및 상보적 폴리뉴클레오티드 위로 돌출한 주형 폴리뉴클레오티드의 5-프라임 말단의 가장 3-프라임측 뉴클레오티드(most 3-prime nucleotide)에 상보적인 복수의 유리 뉴클레오티드 중 하나를 포함할 수 있다.

본 태양은 복합체화 조건 동안 신호를 검출하고 정확한 염기를 호출하기 위해 뉴클레오티드의 화학적 도입이 충분히 길게 일시정지되거나 완전히 방지되는 제어된 촉매작용을 이용한다. 일 실시 형태에서, 복합체화 조건은 비-촉매 금속 양이온을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-촉매 금속 양이온의 예는 Ca²⁺, Zn²⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Eu²⁺, Sr²⁺, Ba²⁺, Fe²⁺, Eu²⁺ 및 이들의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함하지만, 이로 한정되지 않는다. 존재하는 비-촉매 금속 양이온의 농도는 약 100 mM 이하이다. 예를 들어, 비-촉매 금속의 농도는 약 100 mM, 약 95 mM, 약 90 mM, 약 85 mM, 약 80 mM, 약 75 mM, 약 70 mM, 약 65 mM, 약 60 mM, 약 55 mM, 약 50 mM, 약 45 mM, 약 40 mM, 약 35 mM, 약 30 mM, 약 25 mM, 약 20 mM, 약 15 mM, 약 10 mM, 약 9 mM, 약 8 mM, 약 7 mM, 약 6 mM, 약 5 mM, 약 4 mM, 약 3 mM, 약 2 mM, 약 1 mM, 1 mM 미만, 또는 이들 사이의 임의의 양일 수 있다. 일 실시 형태에서, 복합체화 조건 동안 존재하는 비-촉매 금속 양이온의 농도는 약 10 mM 이하일 수 있다.

일 실시 형태에서, 복합체화 조건은 킬레이트제를 포함한다. 킬레이트제의 예는 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N′,N′-테트라아세트산(EGTA), 니트릴로아세트산, 테트라소듐 이미노다이석시네이트, 에틸렌 글리콜 테트라아세트산, 폴리아스파르트산, 에틸렌다이아민-N,N'-다이석신산(EDDS), 메틸글리신다이아세트산(MGDA), 및 이들의 조합을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.

일 실시 형태에서, 복합체화 조건은 비-경쟁적 억제제, 경쟁적 억제제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 억제제를 추가로 포함한다.

일 실시 형태에서, 복합체화 조건은 비-경쟁적 억제제를 포함한다. 비-경쟁적 억제제는, 예를 들어, 아미노글리코사이드, 피로포스페이트 유사체, 멜라닌, 포스포노아세테이트, 하이포포스페이트, 및 리파마이신 중 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 복합체화 조건에 유용할 수 있는 비-경쟁적 억제제의 예는 아바카비르 헤미설페이트(Abacavir hemisulfate)(역전사효소 억제제; 항레트로바이러스); 악티노마이신 D(Actinomycin D)(RNA 폴리머라제를 억제함); 아시클로비르(Acyclovir)(바이러스 DNA 폴리머라제를 억제함; 항헤르페스제); AM-TS23(DNA 폴리머라제 λ 및 β 억제제); α-아마니틴(Amanitin)(RNA 폴리머라제 II를 억제함); 아피디콜린(Aphidicolin)(DNA 폴리머라제 α, δ 및 ε 억제제); 아지도티미딘(Azidothymidine)(선택적 역전사효소 억제제; 항레트로바이러스); BMH 21(RNA 폴리머라제 1 억제제; 또한 p53 경로 활성화제); BMS 986094(HCV RNA 폴리머라제 억제제 2'-C-메틸 구아노신 트라이포스페이트의 전구약물; 강력한 HCV 복제 억제제); 델라비르딘 메실레이트(Delavirdine mesylate)(비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제); 엔테카비르(Entecavir)(강력하고 선택적인 B형 간염 바이러스 억제제); 미트라마이신 A(Mithramycin A)(DNA 및 RNA 폴리머라제의 억제제); 테노포비르(Tenofovir)(역전사효소 억제제); 및 티올루틴(Thiolutin)(박테리아 RNA 폴리머라제 억제제)을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.

일 실시 형태에서, 복합체화 조건은 경쟁적 억제제를 포함한다. 본 발명의 복합체화 조건에 유용할 수 있는 경쟁적 억제제의 예는 아피디콜린, 베타-D-아라비노푸라노실-CTP, 아밀로라이드, 데하이드로알테뉴신, 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.

복합체화 조건이 비-촉매 금속을 포함하는 경우, 그러한 비-촉매 금속은 Ca2+, Zn2+, Co2+, Ni2+, Eu2+, Sr2+, Ba2+, Fe2+, 및 Eu2+ 중 하나 이상으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 비-촉매 금속의 농도는 0 내지 100 mM일 수 있다. 예를 들어, 비-촉매 금속의 농도는 약 1 mM, 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM, 및 약 100 mM, 또는 이들 사이의 임의의 양일 수 있다. 일부 예에서, 비-촉매 금속의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 10 mM이다. 일 실시 형태에서, 비-촉매 금속의 농도는 최대 약 10 mM이다. 일 실시 형태에서, 복합체화 조건을 유지하기 위해 비-촉매 금속이 요구된다.

pH는 또한 복합체화 조건을 용이하게 하고/하거나 유지하도록 설정될 수 있다. 일 실시 형태에서, 복합체화 조건은 약 6 미만인 pH를 포함한다. pH는, 예를 들어 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 약 1, 또는 1 미만일 수 있다.

일 실시 형태에서, 복합체화 조건은 용매 첨가제를 포함한다. 본 발명의 복합체화 조건에 유용할 수 있는 용매 첨가제의 예는 에탄올, 메탄올, 테트라하이드로푸란, 다이옥산, 다이메틸아민, 다이메틸포름아미드, 다이메틸 설폭사이드, 리튬, L-시스테인, 및 이들의 조합을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 일 실시 형태에서, 복합체화 조건은 중수소를 포함한다.

조건의 변화는 복합체화 조건으로부터 중합 조건으로의 전이를 용이하게 할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 중합 조건은 복합체의 폴리머라제에 의해 상보적 폴리뉴클레오티드의 3-프라임 말단 상으로의 뉴클레오티드의 도입을 허용하는 복합체의 형성을 촉진한다. 복합체화 조건(본 명세서에서 비도입 조건으로 또한 지칭됨)으로부터 중합 조건(본 명세서에서 도입 조건으로 또한 지칭됨)으로의 전이는, 예를 들어, 비-촉매 조건으로부터 촉매 조건으로 전환함으로써 달성될 수 있어서, DNA 폴리머라제는 DNA에 뉴클레오티드를 도입시켜서, 그에 의해 부착된 형광 염료를 보유할 수 있는 이탈기의 해리를 야기할 수 있다. 중합 단계는 뉴클레오티드의 도입을 허용하기에 충분한 시간 동안 진행되도록 허용될 수 있다.

본 발명에 따른 폴리머라제는 포스페이트-표지된 뉴클레오티드의 도입을 견딜 수 있는 임의의 폴리머라제를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 유용할 수 있는 폴리머라제의 예는 phi29 폴리머라제, 클레나우(klenow) 단편, DNA 폴리머라제 I, DNA 폴리머라제 III, GA-1, PZA, phi15, Nf, G1, PZE, PRD1, B103, GA-1, 9oN 폴리머라제, Bst, Bsu, T4, T5, T7, Taq, Vent, RT, 폴 베타, 및 폴 감마를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 특정 특성을 갖도록 조작된 폴리머라제가 또한 사용될 수 있다.

중합 조건은 다양한 농도의 Mg²⁺ 이온 및/또는 Mn²⁺ 이온을 포함할 수 있다. 예를 들어, Mg²⁺이온의 농도는 약 1 mM, 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM, 및 약 100 mM, 또는 이들 사이의 임의의 양일 수 있다. 유사하게, Mn²⁺이온의 농도는 약 1 mM, 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM, 및 약 100 mM, 또는 이들 사이의 임의의 양일 수 있다. 일 실시 형태에서, 중합 조건이 Mg²⁺ 이온의 농도를 포함하는 경우에 Mg²⁺ 이온의 농도가 약 0.1 mM 내지 약 10 mM 범위일 수 있거나, Mn²⁺ 이온의 농도를 포함하는 경우에 Mn²⁺ 이온의 농도가 약 0.1 mM 내지 약 10 mM 범위일 수 있다.

pH는 또한 중합 조건을 용이하게 하도록 조정될 수 있다. 일 실시 형태에서, 중합 조건은 약 6 이상인 pH를 포함한다. pH는, 예를 들어, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 또는 약 14일 수 있다.

(a) 폴리머라제를 주형 폴리뉴클레오티드 및 복수의 유리 뉴클레오티드와 접촉시키는 단계 - 주형 폴리뉴클레오티드는 주형 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 단편에 의해 돌출된 3' 말단을 포함하는 상보적 폴리뉴클레오티드에 혼성화되고, 복수의 유리 뉴클레오티드는 하기 화학식 (I)의 화합물을 포함하고: 접촉은 복합체화 조건 하에서 발생하고, 복합체화 조건은 복합체를 형성하는 데는 효과적이지만 중합을 형성하는데 효과적이지 않고, 복합체는 폴리머라제, 주형 폴리뉴클레오티드, 상보적 폴리뉴클레오티드, 및 주형 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 단편의 제1 뉴클레오티드에 상보적인 복수의 유리 뉴클레오티드 중 하나를 포함함 -; b) 형광 표지로부터 신호를 검출하는 단계; 및 c) 복합체를 중합 조건에 노출시키는 단계는 1회 이상 반복될 수 있다.

유리 뉴클레오티드는, 일 실시 형태에서, 비-가교 티올 또는 가교 질소를 추가로 포함할 수 있다. 대체적으로, 뉴클레오티드의 비-가교 티올은, 하기 예에서와 같이, 뉴클레오티드의 5' 포스페이트 기들 사이의 포스포다이에스테르 결합에서 카르보닐 산소 대신 티올을 포함할 수 있다:

,

본 발명의 다른 태양에 따른 유리 뉴클레오티드의 추가 변형을 가짐. 그리고 대체적으로, 가교 질소는, 하기 예에서와 같이, 뉴클레오티드의 5' 포스페이트 기들 사이의 포스포다이에스테르 결합의 에테르에서 산소 대신 질소를 포함할 수 있다:

,

본 발명의 다른 태양에 따른 유리 뉴클레오티드의 추가 변형을 가짐.

폴리머라제는, 일 실시 형태에서, 돌연변이를 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 돌연변이는 (a) 폴리머라제를 주형 폴리뉴클레오티드 및 복수의 유리 뉴클레오티드와 접촉시키는 단계 - 주형 폴리뉴클레오티드는 주형 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 단편에 의해 돌출된 3' 말단을 포함하는 상보적 폴리뉴클레오티드에 혼성화되고, 복수의 유리 뉴클레오티드는 하기 화학식 (I)의 화합물을 포함하고: 접촉은 복합체화 조건 하에서 발생하고, 복합체화 조건은 복합체를 형성하는 데는 효과적이지만 중합을 형성하는데 효과적이지 않고, 복합체는 폴리머라제, 주형 폴리뉴클레오티드, 상보적 폴리뉴클레오티드, 및 주형 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 단편의 제1 뉴클레오티드에 상보적인 복수의 유리 뉴클레오티드 중 하나를 포함함 -; 및/또는 b) 형광 표지로부터 신호를 검출하는 단계; 및/또는 c) 복합체를 중합 조건에 노출시키는 단계 - 이들은 1회 이상 반복될 수 있음 - 의 속도를 변경한다.

설명된 바와 같이, 각각의 뉴클레오티드는 표적과 순차적으로 접촉될 수 있고, 다음 뉴클레오티드의 첨가 전에 비도입된 뉴클레오티드가 제거되고, 여기에서 표지 및 블록킹 기의 검출 및 제거는 각각의 뉴클레오티드의 첨가 후에, 또는 4개의 모든 뉴클레오티드의 첨가 후에 수행될 수 있다.

모든 뉴클레오티드는 표적과 동시에 접촉될 수 있으며, 즉, 모든 상이한 뉴클레오티드를 포함하는 조성물이 표적과 접촉될 수 있고, 비도입된 뉴클레오티드가 검출 전에 그리고 표지 및 블록킹 기의 제거 후에 제거될 수 있다.

라이브러리 제조

폴리뉴클레오티드를 포함하는 라이브러리는 올리고뉴클레오티드 어댑터를 표적 폴리뉴클레오티드에 부착시키는 임의의 적합한 방식으로 제조될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "라이브러리"는 주어진 공급원 또는 샘플로부터의 폴리뉴클레오티드의 집단이다. 라이브러리는 복수의 표적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "표적 폴리뉴클레오티드"는 서열에 요구되는 폴리뉴클레오티드이다. 표적 폴리뉴클레오티드는 기본적으로 공지된 또는 공지되지 않은 서열의 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 이는, 예를 들어, 게놈 DNA 또는 cDNA의 단편일 수 있다. 서열분석은 표적 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 일부의 서열을 결정할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 랜덤으로 단편화된 일차 폴리뉴클레오티드 샘플로부터 유래될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 각각의 표적 단편의 말단에서 범용 프라이머 서열의 배치에 의한 증폭에 적합한 주형으로 가공될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 또한 cDNA로의 역전사에 의해 일차 RNA 샘플로부터 얻어질 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용될 수 있고, 전형적으로 포스포다이에스테르 결합을 통해, 서로 공유 결합된 2개 이상의 뉴클레오티드 단량체를 포함하는 분자를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 올리고뉴클레오티드보다 더 많은 뉴클레오티드를 포함한다. 제한이 아닌 예시를 목적으로, 폴리뉴클레오티드가 15, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 그 초과의 뉴클레오티드를 포함하는 것으로 간주될 수 있는 한편, 올리고뉴클레오티드는 100, 50, 20, 15 또는 그 미만의 뉴클레오티드를 포함하는 것으로 간주될 수 있다.

폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)을 포함할 수 있다. 이 용어는 등가물로서, 뉴클레오티드 유사체로부터 제조된 DNA 또는 RNA의 유사체를 포함하고, 단일 가닥(예컨대, 센스 또는 안티센스) 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 적용가능한 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용되는 용어는 또한, 예를 들어 역전사효소의 작용에 의해 RNA 주형으로부터 생성된 상보적 또는 카피 DNA인 cDNA를 포함한다.

일차 폴리뉴클레오티드 분자는 이중 가닥 DNA(dsDNA) 형태(예를 들어, 게놈 DNA 단편, PCR 및 증폭 생성물 등)에서 유래될 수 있거나, DNA 또는 RNA로서 단일 가닥 형태로 유래될 수 있고, dsDNA 형태로 전환될 수 있다. 예로서, mRNA 분자는 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 이중 가닥 cDNA로 카피될 수 있다. 일차 폴리뉴클레오티드의 정확한 서열은 대체적으로 본 명세서에 제시된 개시내용에 필수적이지 않고, 알려져 있거나 또는 알려져 있지 않을 수 있다.

일부 실시 형태에서, 일차 표적 폴리뉴클레오티드는 RNA 분자이다. 이러한 실시 형태의 일 태양에서, 특정 샘플로부터 단리된 RNA는 먼저 당업계에 공지된 기술을 사용하여 이중 가닥 DNA로 전환된다. 이어서, 이중 가닥 DNA는 라이브러리 특이적 태그로 인덱스 태깅될 수 있다. 라이브러리 특이적 인덱스 태그를 포함하는 그러한 이중 가닥 DNA의 상이한 제제들은, 동시에, 상이한 공급원들 또는 샘플들로부터 단리된 RNA로부터 생성될 수 있다. 후속하여, 상이한 라이브러리 특이적 인덱스 태그를 포함하는 이중 가닥 DNA의 상이한 제제들이 혼합될 수 있고, 집단으로 서열분석될 수 있어서, 각각의 서열분석된 단편의 정체가 라이브러리에 대해 결정될 수 있는데, 여기서 각각의 서열분석된 단편은 라이브러리로부터 라이브러리 특이적 인덱스 태그 서열의 존재에 의해 단리/유래되었다.

일부 실시 형태에서, 일차 표적 폴리뉴클레오티드는 DNA 분자이다. 예를 들어, 일차 폴리뉴클레오티드는 유기체의 전체 유전적 보체를 나타낼 수 있고, 인트론 및 엑손 서열(코딩 서열) 둘 모두를 포함하는, 인간 DNA 분자와 같은 게놈 DNA 분자일뿐만 아니라, 프로모터 및 인핸서 서열과 같은 비-코딩 조절 서열이다. 그러나, 폴리뉴클레오티드 서열 또는 게놈 DNA의 특정 하위 세트, 예를 들어, 특정 염색체 또는 이의 일부가 또한 사용될 수 있다는 것이 예상될 수 있다. 많은 실시 형태에서, 일차 폴리뉴클레오티드의 서열은 공지되어 있지 않다. DNA 표적 폴리뉴클레오티드는 랜덤 단편화 공정과 같은 단편화 공정 전에 또는 후에, 그리고 어댑터 올리고뉴클레오티드의 라이게이션 전에, 동안에, 또는 후에, 화학적으로 또는 효소적으로 처리될 수 있다.

바람직하게는, 일차 표적 폴리뉴클레오티드는 서열분석에 적합한 적절한 길이로 단편화된다. 표적 폴리뉴클레오티드는 임의의 적합한 방식으로 단편화될 수 있다. 바람직하게는, 표적 폴리뉴클레오티드는 랜덤으로 단편화된다. 랜덤 단편화는, 예를 들어, 효소적, 화학적 또는 기계적 수단에 의한 비-정렬된 방식의 폴리뉴클레오티드의 단편화를 지칭한다. 그러한 단편화 방법은 당업계에 공지되어 있고, 표준 방법을 이용한다(전체적으로 참고로 포함된 문헌[Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, third edition]). 명확히 하기 위해, 폴리뉴클레오티드의 더 큰 조각의 더 작은 단편을 그러한 더 작은 단편의 특정 PCR 증폭을 통해 생성하는 것은 폴리뉴클레오티드의 더 큰 조각을 단편화하는 것과 동등하지 않은데, 이는 폴리뉴클레오티드의 더 큰 조각이 온전하게 남아있기 때문이다(즉, PCR 증폭에 의해 단편화되지 않기 때문이다). 더욱이, 랜덤 단편화는, 파단을 포함하고/하거나 이를 둘러싸는 뉴클레오티드의 서열 정체 또는 위치에 관계없이 단편을 생성하도록 설계된다.

일부 실시 형태에서, 랜덤 단편화는 약 50개 염기쌍 길이 내지 약 1500개 염기쌍 길이, 예컨대 50 내지 700개 염기쌍 길이 또는 50 내지 500개 염기쌍 길이의 단편을 생성하기 위해 분무화 또는 초음파처리와 같은 기계적 수단에 의한 것이다.

기계적 수단(예를 들어 분무화, 초음파처리 및 하이드로전단(Hydroshear))에 의한 폴리뉴클레오티드 분자의 단편화는 평활 및 3'- 및 5'-돌출 말단들의 불균질 믹스를 갖는 단편을 야기할 수 있다. 단편 말단은, 예를 들어, 클로닝 벡터의 평활 부위 내로의 삽입을 위해 최적인 말단을 생성하기 위해 당업계에 공지된 방법 또는 키트(예컨대, Lucigen DNA 종결자 말단 복구 키트)를 사용하여 복구될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 핵산 집단의 단편 말단은 평활 말단이다. 단편 말단은 평활 말단이고 인산화될 수 있다. 포스페이트 부분은 효소 처리를 통해, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 도입될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, 단일 데옥시뉴클레오티드, 예를 들어 데옥시아데노신(A)을, 예를 들어, PCR 생성물의 3' 말단에 부가하는 비주형 의존성 말단 트랜스퍼라제 활성을 갖는 Taq 폴리머라제 또는 클레노우 엑소 마이너스 폴리머라제와 같은 특정 유형의 DNA 폴리머라제의 활성에 의해 단일 돌출 뉴클레오티드로 제조된다. 이러한 효소는 표적 폴리뉴클레오티드 듀플렉스의 각각의 가닥의 평활 말단의 3' 말단에 단일 뉴클레오티드 'A'를 부가하는데 사용될 수 있다. 따라서, 'A'가 Taq 또는 클레노우 엑소 마이너스 폴리머라제와의 반응에 의해 표적 폴리뉴클레오티드 듀플렉스의 각각의 말단 복구된 듀플렉스 가닥의 3' 말단에 부가될 수 있는 한편, 어댑터 폴리뉴클레오티드 작제물은 어댑터 작제물의 각각의 듀플렉스 영역의 3' 말단에 존재하는 호환가능한 'T' 돌출부가 있는 T-작제물일 수 있다. 이러한 말단 변형은 또한, 조합된 라이게이션된 어댑터-표적 폴리뉴클레오티드의 형성을 향한 편향이 존재하도록 표적 폴리뉴클레오티드의 자가-라이게이션을 방지한다.

일부 실시 형태에서, 단편화는, 예를 들어, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 WO 2016/130704호에 기재된 바와 같은 태그멘테이션(tagmentation)을 통해 달성된다. 이러한 방법에서, 트랜스포사제는, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 단편화하고 범용 프라이머 서열을 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 하나의 가닥 내로 부착하는데 채용된다. 생성된 분자는, 부착된 범용 프라이머 서열에 상보적인 서열을 갖는 3' 말단 및 어댑터의 다른 서열을 포함하는 5' 말단을 포함하는 프라이머를 사용하여, 예를 들어 PCR 증폭에 의해, 갭-충전되고 연장될 수 있다.

어댑터는 임의의 다른 적합한 방식으로 표적 폴리뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 어댑터는 범용 프라이머 서열을 갖는 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 어댑터의 일부의 라이게이션을 수반하는, 2단계 공정과 같은, 다단계 공정으로 도입된다. 제2 단계는, 부착된 범용 프라이머 서열에 상보적인 서열을 갖는 3' 말단 및 어댑터의 다른 서열을 포함하는 5' 말단을 포함하는 프라이머를 사용하여, 예를 들어 PCR 증폭에 의해, 연장을 포함할 수 있다. 예로서, 이러한 연장은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제8,053,192호에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 생성된 이전에 연장된 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 추가적인 서열을 제공하기 위해 추가적인 연장이 수행될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 전체 어댑터는 단편화된 표적 폴리뉴클레오티드에 라이게이션된다. 바람직하게는, 라이게이션된 어댑터는 이중 가닥 표적 폴리뉴클레오티드에 라이게이션되는 이중 가닥 영역을 포함한다. 바람직하게는, 이중 가닥 영역은 기능 손실 없이 가능한 한 짧다. 이와 관련하여, "기능"은 표준 반응 조건 하에서 안정한 듀플렉스를 형성하는 이중 가닥 영역의 능력을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 표준 반응 조건은, 어댑터를 형성하는 2개의 가닥이 표적 분자에 대한 어댑터의 라이게이션 동안 부분적으로 어닐링된 채로 유지되도록, 숙련된 독자에게 공지되어 있을 효소-촉매된 폴리뉴클레오티드 라이게이션 반응에 대한 반응 조건(예를 들어, 효소에 대해 적절한 라이게이션 완충액 중 4℃ 내지 25℃ 범위의 온도에서 인큐베이션)을 지칭한다. 라이게이션 방법은 당업계에 공지되어 있고, 표준 방법을 이용할 수 있다(전체적으로 참고로 포함된 문헌[Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, third edition]). 이러한 방법은, 이러한 경우, 공유 연결이 형성되도록 어댑터 듀플렉스 올리고뉴클레오티드 및 표적 폴리뉴클레오티드 듀플렉스의 2개의 폴리뉴클레오티드 가닥의 말단의 결합을 달성하거나 촉매하기 위해 리가제 효소, 예컨대 DNA 리가아제를 이용한다. 어댑터 듀플렉스 올리고뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드 3'-OH에 대한 라이게이션을 용이하게 하기 위해 5'-포스페이트 모이어티를 포함할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 전단 공정으로부터의 잔류하거나 효소 처리 단계를 사용하여 첨가된 5'-포스페이트 모이어티를 포함할 수 있고, 말단 복구되고, 선택적으로, 돌출 염기 또는 염기들에 의해 연장되어, 라이게이션에 적합한 3'-OH를 제공하였다. 이와 관련하여, 부착은 이전에 공유적으로 결합되지 않았던 폴리뉴클레오티드 가닥의 공유 연결을 의미한다. 본 발명의 특정 태양에서, 이러한 부착은 2개의 폴리뉴클레오티드 가닥들 사이의 포스포다이에스테르 결합의 형성에 의해 일어나지만, 공유 결합의 다른 수단(예를 들어, 비-포스포다이에스테르 골격 결합)이 사용될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 어댑터의 라이게이션은, 예를 들어, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제8,053,192호에 더 상세히 기재되어 있다.

임의의 적합한 어댑터는 상기 논의된 것과 같은 임의의 적합한 공정을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 어댑터는 라이브러리-특이적 인덱스 태그 서열을 포함한다. 인덱스 태그 서열은 샘플이 서열분석을 위해 고정화되기 전에 각각의 라이브러리로부터 표적 폴리뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 인덱스 태그는 자체적으로 표적 폴리뉴클레오티드의 일부에 의해 형성되지 않지만, 증폭을 위한 주형의 일부가 된다. 인덱스 태그는 주형 제조 단계의 일부로서 표적에 부가되는 뉴클레오티드들의 합성 서열일 수 있다. 따라서, 라이브러리-특이적 인덱스 태그는, 존재가 표적 분자가 단리되었던 라이브러리를 나타내거나 그를 식별하는 데 사용되는 특정 라이브러리의 표적 분자 각각에 부착되는 핵산 서열 태그이다.

바람직하게는, 인덱스 태그 서열은 길이가 20개 이하의 뉴클레오티드이다. 예를 들어, 인덱스 태그 서열은 길이가 1 내지 10개의 뉴클레오티드 또는 4 내지 6개의 뉴클레오티드일 수 있다. 4개의 뉴클레오티드 인덱스 태그는 동일한 어레이에서 256개의 샘플을 다중화하는 가능성을 제공하고, 6개의 염기 인덱스 태그는 동일한 어레이에서 4,096개의 샘플을 처리할 수 있게 한다.

어댑터는 다중화 가능성이 증가될 수 있도록 하나 초과의 인덱스 태그를 포함할 수 있다.

어댑터는 바람직하게는 이중 가닥 영역 및 2개의 비-상보적 단일 가닥을 포함하는 영역을 포함한다. 어댑터의 이중 가닥 영역은 임의의 적합한 수의 염기쌍의 것일 수 있다. 바람직하게는, 이중 가닥 영역은 2개의 부분적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드 가닥의 어닐링에 의해 형성된, 전형적으로 5개 이상의 연속적인 염기쌍을 포함하는, 짧은 이중 가닥 영역이다. 어댑터의 이러한 "이중 가닥 영역"은 2개의 가닥이 어닐링되는 영역을 지칭하고 어떠한 특정 구조 입체형태도 암시하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 이중 가닥 영역은 20개 이하의 연속적인 염기쌍, 예컨대 10개 이하 또는 5개 이하의 연속적인 염기쌍을 포함한다.

이중 가닥 영역의 안정성은 증가될 수 있고, 따라서, 이의 길이는, 표준 왓슨-크릭 염기쌍보다 더 강한 염기쌍을 나타내는 비-천연 뉴클레오티드의 포함에 의해, 잠재적으로 감소될 수 있다. 바람직하게는, 어댑터의 2개의 가닥은 이중 가닥 영역에서 100% 상보적이다.

어댑터가 표적 폴리뉴클레오티드에 부착될 때, 비-상보적 단일 가닥 영역은 서열분석될 폴리뉴클레오티드의 5' 및 3' 말단을 형성할 수 있다. 용어 "비-상보적 단일 가닥 영역"은, 어댑터를 형성하는 2개의 폴리뉴클레오티드 가닥의 서열이 PCR 반응을 위한 표준 어닐링 조건 하에서 2개의 가닥이 서로 완전히 어닐링할 수 없도록 비-상보성 정도를 나타내는 어댑터의 영역을 지칭한다.

비-상보적 단일 가닥 영역은 이중 가닥 영역을 형성하는 동일한 2개의 폴리뉴클레오티드 가닥의 상이한 부분들에 의해 제공된다. 단일 가닥 부분의 길이에 대한 하한은 전형적으로, 예를 들어 프라이머 연장, PCR 및/또는 서열분석을 위한 프라이머의 결합에 적합한 서열을 제공하는 기능에 의해 결정될 것이다. 이론적으로, 예를 들어 부착 단계 또는 단계들 후에 어댑터-표적 작제물로부터 비결합 어댑터를 분리하는 것을 용이하게 하기 위해서, 대체적으로 어댑터의 전체 길이를 최소화하는 것이 유리한 것을 제외하고는, 비매칭 영역의 길이에 대한 상한은 없다. 따라서, 어댑터의 비-상보적 단일 가닥 영역은 길이가 50개 이하의 연속적인 뉴클레오티드, 예컨대 길이가 40개 이하, 30개 이하, 또는 25개 이하의 연속적인 뉴클레오티드인 것이 대체적으로 바람직하다.

라이브러리-특이적 인덱스 태그 서열은 단일 가닥, 이중 가닥 영역에 위치될 수 있거나, 또는 어댑터의 단일 가닥 및 이중 가닥 영역들에 걸쳐 있을 수 있다. 바람직하게는, 인덱스 태그 서열은 어댑터의 단일 가닥 영역에 있다.

어댑터는 인덱스 태그 서열에 더하여 임의의 다른 적합한 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 어댑터는, 전형적으로 서열분석을 위한 생성된 폴리뉴클레오티드 및 어댑터의 5' 또는 3' 말단에 위치된 범용 연장 프라이머 서열을 포함할 수 있다. 범용 연장 프라이머 서열은 고체 기재의 표면에 결합된 상보적 프라이머에 혼성화될 수 있다. 상보적 프라이머는 유리 3' 말단 - 이로부터 폴리머라제 또는 다른 적합한 효소가 주형으로서 혼성화된 라이브러리 폴리뉴클레오티드를 사용하여 서열을 연장시키기 위해 뉴클레오티드를 부가할 수 있음 - 을 포함하여, 고체 표면에 커플링되는 라이브러리 폴리뉴클레오티드의 역방향 가닥을 생성한다. 이러한 연장은 서열분석 런(run) 또는 클러스터 증폭의 일부일 수 있다.

일부 실시 형태에서, 어댑터는 하나 이상의 범용 서열분석 프라이머 서열을 포함한다. 범용 서열분석 프라이머 서열은 서열분석 프라이머에 결합하여 인덱스 태그 서열, 표적 서열, 또는 인덱스 태그 서열 및 표적 서열의 서열분석을 가능하게 할 수 있다.

어댑터의 정확한 뉴클레오티드 서열은 대체적으로 본 발명에 필수적이지 않고, 예를 들어, 범용 연장 프라이머 및/또는 서열분석 프라이머의 특정 세트에 대한 결합 부위를 제공하기 위해 어댑터로부터 유래된 주형 라이브러리의 공통 서열에 원하는 서열 요소가 궁극적으로 포함되도록 사용자에 의해 선택될 수 있다.

어댑터 올리고뉴클레오티드는 엑소뉴클레아제 내성 변형, 예컨대 포스포로티오에이트 결합을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 어댑터는 표적 폴리펩타이드의 양 말단에 부착되어 뉴클레오티드의 제1 어댑터-표적-제2 어댑터 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 생성한다. 제1 및 제2 어댑터는 동일하거나 상이할 수 있다. 바람직하게는, 제1 및 제2 어댑터는 동일하다. 제1 및 제2 어댑터가 상이한 경우, 제1 및 제2 어댑터 중 적어도 하나는 라이브러리-특이적 인덱스 태그 서열을 포함한다.

"제1 어댑터-표적-제2 어댑터 서열" 또는 "어댑터-표적-어댑터" 서열은 서로에 대한 그리고 표적에 대한 어댑터의 배향을 지칭하고, 서열이, 예를 들어, 링커 서열과 같은 추가 서열을 포함하지 않을 수 있다는 것을 반드시 의미하지는 않는다는 것을 이해할 것이다.

다른 라이브러리들이 유사한 방식으로 제조될 수 있는데, 각각은 적어도 하나의 라이브러리-특이적 인덱스 태그 서열 또는 인덱스 태그 서열과는 상이한 인덱스 태그 서열들의 조합 또는 다른 라이브러리로부터의 인덱스 태그 서열들의 조합을 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "부착된" 또는 "결합된"은 표적 서열에 대한 어댑터의 맥락에서 상호교환적으로 사용된다. 전술된 바와 같이, 어댑터를 표적 폴리뉴클레오티드에 부착하기 위해 임의의 적합한 공정이 사용될 수 있다. 예를 들어, 어댑터는 리가제와의 라이게이션; 프라이머가 어댑터의 추가 또는 나머지 부분을 포함하는 상태로, PCR과 같은 연장을 통한 어댑터의 추가 또는 나머지 부분의 부가와 어댑터의 일부의 라이게이션의 조합; 프라이머가 어댑터의 추가 또는 나머지 부분을 포함하는 상태로, PCR과 같은 연장을 통한 어댑터의 추가 또는 나머지 부분의 부가와 어댑터의 일부를 도입하기 위한 전위(transposition)의 조합 등을 통해 표적에 부착될 수 있다. 바람직하게는, 부착된 어댑터 올리고뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드에 공유 결합된다.

어댑터가 표적 폴리뉴클레오티드에 부착된 후, 생성된 폴리뉴클레오티드는 클린업(clean-up) 공정을 거쳐서, 비도입된 어댑터의 적어도 일부를 제거함으로써 어댑터-표적-어댑터 폴리뉴클레오티드에 대한 순도를 향상시킬 수 있다. 전기영동, 크기 배제 크로마토그래피 등과 같은 임의의 적절한 클린업 공정이 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 부착되지 않은 어댑터로부터 어댑터-표적-어댑터 폴리뉴클레오티드를 분리하기 위해 고상 역방향 고정화(solid phase reverse immobilization, SPRI) 상자성 비드가 채용될 수 있다. 이러한 공정이 생성된 어댑터-표적-어댑터 폴리뉴클레오티드의 순도를 향상시킬 수 있지만, 일부 부착되지 않은 어댑터 올리고뉴클레오티드는 남아있을 것이다.

서열분석을 위한 고정화 샘플의 준비

본 발명에 따르면, 하나 이상의 공급원으로부터의 복수의 어댑터-표적-어댑터 폴리뉴클레오티드 분자가 서열분석 전에 고정화되고 증폭된다. 하나 이상의 공급원으로부터의 어댑터-표적-어댑터 분자를 기재에 부착하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 마찬가지로, 고정화된 어댑터-표적-어댑터 분자를 증폭하는 방법은 가교 증폭 및 동력학적 배제(kinetic exclusion)를 포함하지만, 이로 한정되지 않는다. 서열분석 전에 고정화 및 증폭하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제8,053,192호, WO 2016/130704호, 미국 특허 제8,895,249호 및 미국 특허 제9,309,502호에 기재되어 있으며, 이들 모두는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

이어서, 풀링된 샘플을 포함하는 샘플이 서열분석에 대비하여 고정화될 수 있다. 서열분석은 단일 분자의 어레이로서 수행될 수 있거나, 서열분석 전에 증폭될 수 있다. 증폭은 하나 이상의 고정화 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다. 고정화 프라이머(들)는 평면 또는 비드 풀 상의 론(lawn)일 수 있다. 비드 풀은 에멀젼의 각각의 "컴파트먼트(compartment)" 내에 단일 비드를 갖는 에멀젼으로 단리될 수 있다. "컴파트먼트"당 단 하나의 주형의 농도에서, 단일 주형만이 각각의 비드 상에서 증폭된다.

본 명세서에 사용되는 용어 "고상 증폭"은 증폭 생성물의 전부 또는 일부가 형성될 때 고체 지지체 상에 고정화되도록 고체 지지체 상에 또는 이와 관련하여 수행되는 임의의 핵산 증폭 반응을 지칭한다. 특히, 이 용어는 순방향 및 역방향 증폭 프라이머 중 하나 또는 둘 모두가 고체 지지체 상에 고정화된 것을 제외하고는, 표준 용액상 증폭과 유사한 반응인 고상 폴리머라제 연쇄 반응(고상 PCR) 및 고상 등온 증폭을 포함한다. 고상 PCR은 하나의 프라이머가 비드에 고정되고 다른 하나가 자유 용액 중에 있는 에멀젼과 같은 시스템과, 하나의 프라이머가 표면에 고정되고 다른 하나가 자유 용액 중에 있는 고상 겔 매트릭스의 콜로니 형성을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 고체 지지체는 패턴화된 표면을 포함한다. "패턴화된 표면"은 고체 지지체의 노출된 층 내의 또는 그 상에서의 상이한 영역들의 배열을 지칭한다. 예를 들어, 영역들 중 하나 이상은 하나 이상의 증폭 프라이머(primer)들이 존재하는 특징부들일 수 있다. 특징부들은 증폭 프라이머들이 존재하지 않는 사이 영역(interstitial region)들에 의해 분리될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 패턴은 행(row) 및 열(column)로 있는 특징부의 x-y 포맷일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 패턴은 특징부 및/또는 사이 영역의 반복 배열일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 패턴은 특징부 및/또는 사이 영역의 랜덤 배열일 수 있다. 본 명세서에 제시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 예시적인 패턴화된 표면이 미국 특허 제8,778,848호; 제8,778,849호 및 제9,079,148호, 및 미국 특허 출원 공개 2014/0243224호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.

일부 실시 형태에서, 고체 지지체는 표면에 함몰부 또는 웰의 어레이를 포함한다. 이는, 포토리소그래피, 스탬핑 기술, 몰딩 기술 및 마이크로에칭 기술을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 기술을 사용하여 당업계에 일반적으로 알려진 바와 같이 제조될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 사용되는 기술은 어레이 기재의 조성 및 형상에 의존할 것이다.

패턴화된 표면에서의 특징부들은 유리, 규소, 플라스틱, 또는 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸)아크릴아미드-코-아크릴아미드)(PAZAM, 예를 들어, 각각이 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 공개 공보 제2013/184796호, WO 2016/066586호, 및 WO 2015-002813호 참조)와 같은 패턴화된 공유 결합된(covalently-linked) 겔이 있는 다른 적합한 고체 지지체들 상의 웰들(예컨대, 마이크로웰들 또는 나노웰들)의 어레이 내의 웰들일 수 있다. 프로세스는 다수의 사이클들을 갖는 서열분석 런들에 걸쳐서 안정적일 수 있는 서열분석을 위해 사용되는 겔 패드들을 생성한다. 웰들에 대한 중합체의 전자쌍 공유 결합은 다양한 사용들 동안 구조화된 기재의 수명 전체에 걸쳐서 구조화된 특징부들 내에 겔을 유지하는 데 도움이 된다. 그러나, 다수의 실시 형태에서, 겔은 웰에 공유 결합될 필요가 없다. 예를 들어, 일부 조건들에서, 구조화된 기재의 어떠한 부분에도 공유적으로 부착되지 않은 실란 무함유 아크릴아미드(SFA, 예를 들어, 전체가 참고로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제8,563,477호 참조)가 겔 재료로서 사용될 수 있다.

특정 실시 형태에서, 구조화된 기재는 고체 지지체 재료를 웰(예를 들어, 마이크로웰 또는 나노웰)로 패턴화하고, 패턴화된 지지체를 겔 재료(예를 들어, PAZAM, SFA 또는 이들의 화학적으로 변형된 변이체, 예컨대 SFA의 아지도 분해된(azidolyzed) 버전(아지도-SFA))로 코팅하고, 예를 들어, 화학적 또는 기계적 폴리싱을 통해서, 겔 코팅된 지지체를 폴리싱하여 웰 내에 겔을 보유시키지만 웰들 사이의 구조화된 기재의 표면 상의 사이 영역으로부터 실질적으로 모든 겔을 제거하거나 불활성화시킴으로써 제조될 수 있다. 프라이머 핵산은 겔 재료에 부착될 수 있다. 이어서, 표적 핵산(예를 들어 단편화된 인간 게놈)의 용액이 연마된 기재와 접촉될 수 있고, 따라서, 개별 표적 핵산이 겔 재료에 부착된 프라이머와의 상호작용을 통해 개별 웰을 시딩할 것이지만; 표적 핵산은 겔 재료의 부재 또는 비활동으로 인해 사이 영역을 점유하지 않을 것이다. 표적 핵산의 증폭은 사이 영역들 내에서의 겔의 부재 또는 비활동이 성장하는 핵산 콜로니의 외향 이동을 방지하기 때문에 웰들에 한정될 것이다. 공정은 편리하게 제조가능하여, 스케일링가능하고 통상적인 마이크로-제조 또는 나노-제조 방법들을 활용한다.

본 발명은 단 하나의 증폭 프라이머가 고정화되는 "고상" 증폭 방법을 포함하지만(다른 프라이머는 통상적으로 자유 용액 중에 존재함), 고체 지지체에는 고정화된 순방향 및 역방향 프라이머 둘 모두가 제공되는 것이 바람직하다. 실제로, 증폭 공정이 증폭을 지속하기 위해 과량의 프라이머를 필요로 하기 때문에, 고체 지지체 상에 고정화된 '복수'의 동일한 순방향 프라이머 및/또는 '복수'의 동일한 역방향 프라이머가 존재할 것이다. 순방향 및 역방향 프라이머에 대한 본 명세서에서의 언급은 따라서, 문맥이 달리 지시하지 않는 한, '복수'의 이러한 프라이머를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

숙련된 독자에 의해 이해되는 바와 같이, 임의의 주어진 증폭 반응은 증폭될 주형에 특이적인 적어도 하나의 유형의 순방향 프라이머 및 적어도 하나의 유형의 역방향 프라이머를 필요로 한다. 그러나, 특정 실시 형태에서, 순방향 및 역방향 프라이머는 동일한 서열의 주형 특이적 부분을 포함할 수 있고, 완전히 동일한 뉴클레오티드 서열 및 구조(임의의 비뉴클레오티드 변형을 포함함)를 가질 수 있다. 다시 말해서, 단 하나의 유형의 프라이머를 사용하여 고상 증폭을 수행하는 것이 가능하며, 이러한 단일 프라이머 방법은 본 발명의 범주 내에 포함된다. 다른 실시 형태는 동일한 주형 특이적 서열을 포함하지만, 일부 다른 구조적 특징이 상이한 순방향 및 역방향 프라이머를 사용할 수 있다. 예를 들어, 한 유형의 프라이머는 다른 유형에 존재하지 않는 비뉴클레오티드 변형을 포함할 수 있다.

본 발명의 모든 실시 형태에서, 고상 증폭을 위한 프라이머는 바람직하게는 프라이머의 5' 말단 또는 그 근처에서 고체 지지체에 단일점 공유결합에 의해 고정화되어, 프라이머의 주형 특이적 부분을 자유롭게 남겨두어 이의 동족 주형에 어닐링할 수 있으며, 프라이머 연장을 위해 3' 하이드록실기를 자유로운 상태로 존재하게 된다. 당업계에 알려진 임의의 적합한 공유 부착 수단이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 선택된 부착 화학은 고체 지지체의 성질, 및 그에 적용되는 임의의 유도체화 또는 작용화에 따라 좌우될 것이다. 프라이머 자체는 부착을 용이하게 하기 위해 비뉴클레오티드 화학적 변형일 수 있는 부분을 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 프라이머는 예를 들어, 5' 말단에 황 함유 친핵체, 예컨대 포스포로티오에이트 또는 티오포스페이트를 포함할 수 있다. 고체-지지된 폴리아크릴아미드 하이드로겔의 경우, 이러한 친핵체는 하이드로겔에 존재하는 브로모아세트아미드 기에 결합할 것이다. 프라이머 및 주형을 고체 지지체에 부착시키는 더 특별한 수단은, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 WO 05/065814호에 완전히 기재된 바와 같이, 중합된 아크릴아마이드 및 N-(5-브로모아세트아미딜펜틸)아크릴아미드(BRAPA)를 포함하는 하이드로겔에 대한 5' 포스포로티오에이트 부착을 통한 것이다.

본 발명의 특정 실시 형태는 예를 들어, 생체 분자, 예컨대 폴리뉴클레오티드에 대한 공유 부착이 가능한 반응성 기를 포함하는 중간 재료의 층 또는 코팅의 적용에 의해, "작용화된" 불활성 기재 또는 매트릭스(예를 들어, 유리 슬라이드, 폴리머 비드 등)를 포함하는 고체 지지체를 사용할 수 있다. 이러한 지지체의 예에는 유리와 같은 불활성 기재 상에 지지된 폴리아크릴아미드 하이드로겔이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 이러한 실시 형태에서, 생체분자(예를 들어, 폴리뉴클레오티드)는 중간 재료(예를 들어, 하이드로겔)에 직접 공유결합될 수 있지만, 중간 재료는 그 자체로 기재 또는 매트릭스(예를 들어, 유리 기재)에 비공유결합될 수 있다. 용어 "고체 지지체에 대한 공유 부착"은 따라서 이러한 유형의 배열을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

풀링된 샘플은 비드 상에서 증폭될 수 있으며, 여기서 각각의 비드는 순방향 및 역방향 증폭 프라이머를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 본 발명의 태양에 따라 제조된 주형의 라이브러리는 고상 증폭 및 더 구체적으로는 고상 등온 증폭에 의해, 각각이 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 제2005/0100900호, 미국 특허 제7,115,400호, WO 00/18957호 및 WO 98/44151호에 기재된 것과 유사한, 핵산 콜로니의 클러스터링된 어레이를 제조하는 데 사용된다. 용어 '클러스터' 및'콜로니'는 복수의 동일한 고정화된 핵산 가닥 및 복수의 동일한 고정화된 상보적 핵산 가닥을 포함하는 고체 지지체 상의 별개의 부위를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다. 용어 "클러스터링된 어레이"는 이러한 클러스터 또는 콜로니로부터 형성된 어레이를 지칭한다. 이와 관련하여, 용어 "어레이"는 클러스터의 규칙적인 배열을 필요로 하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

용어 "고상" 또는 "표면"은 프라이머를 평탄한 표면, 예를 들어 유리, 실리카 또는 플라스틱 현미경 슬라이드 또는 유사한 플로우 셀 장치에 부착하는 평면 어레이; 하나 또는 2개의 프라이머가 비드에 부착되고, 비드가 증폭되는 비드; 또는 비드가 증폭된 후 표면 상의 비드 어레이를 의미하도록 사용된다.

클러스터링된 어레이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 WO 98/44151호에 기재된 바와 같은 서모사이클링 공정, 또는 온도가 일정한 상태로 유지되는 공정 중 어느 하나를 사용하여 제조될 수 있으며, 연장 및 변성의 사이클은 시약의 변화를 사용하여 수행된다. 이러한 등온 증폭 방법은 WO 02/46456호 및 미국 특허 출원 공개 제2008/0009420호에 기재되어 있으며, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 명세서에 기재되거나 당업계에 일반적으로 공지된 임의의 증폭 방법은 범용 또는 표적 특이적 프라이머를 사용하여 고정화 DNA 단편을 증폭시킬 수 있음이 이해될 것이다. 증폭에 적합한 방법은, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제8,003,354호에 기재된 바와 같이, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 가닥 변위 증폭(SDA), 전사 매개 증폭(TMA) 및 핵산 서열 기반 증폭(NASBA)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 상기 증폭 방법은 하나 이상의 관심 핵산을 증폭시키기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 멀티플렉스 PCR을 비롯한 PCR, SDA, TMA, NASBA 등을 사용하여 고정화 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 관심 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 관련된 프라이머가 증폭 반응에 포함된다.

폴리뉴클레오티드의 증폭을 위한 다른 적합한 방법은 올리고뉴클레오티드 연장 및 라이게이션, 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification, RCA)(전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Lizardi et al., "Mutation Detection and Single-Molecule Counting Using Isothermal Rolling-Circle Amplification," Nat. Genet. 19:225-232 (1998)]) 및 올리고뉴클레오티드 라이게이션 검정(oligonucleotide ligation assay, OLA)(대체적으로, 각각이 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된, 미국 특허 제7,582,420호, 제5,185,243호, 제5,679,524호 및 제5,573,907호; EP 0 320 308 B1호; EP 0 336 731 B1호; EP 0 439 182 B1호; WO 90/01069호; WO 89/12696호; 및 WO 89/09835호 참조) 기술을 포함할 수 있다. 이러한 증폭 방법은 고정화 DNA 단편을 증폭시키도록 설계될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 증폭 방법은 관심 핵산에 특이적으로 관련된 프라이머를 포함하는 라이게이션 프로브 증폭 또는 올리고뉴클레오티드 라이게이션 검정(oligonucleotide ligation assay, OLA) 반응을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 증폭 방법은 관심 핵산에 특이적으로 관련된 프라이머를 포함하는 프라이머 연장-라이게이션 반응을 포함할 수 있다. 관심 핵산을 증폭시키도록 특이적으로 설계될 수 있는 프라이머 연장 및 라이게이션 프라이머의 비제한적인 예로서, 둘 모두가 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제7,582,420호 및 제7,611,869호에 의해 예시되는 바와 같이, 증폭은 골든게이트(GoldenGate) 검정에 사용되는 프라이머(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 Illumina, Inc.)를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 예시적인 등온 증폭 방법은, 예를 들어, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Dean et al., "Comprehensive Human Genome Amplification Using Multiple Displacement Amplification," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002)]에 의해 예시된 바와 같은 다중 변위 증폭(MDA) 또는 예를 들어, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제6,214,587호에 의해 예시된 등온 가닥 변위 핵산 증폭을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 다른 비-PCR-기반 방법은, 예를 들어, 모두가 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Walker et al., Molecular Methods for Virus Detection (Academic Press, Inc., 1995)]; 미국 특허 제5,455,166호 및 제5,130,238호, 및 문헌[Walker et al., "Strand Displacement Amplification--An Isothermal, in Vitro DNA Amplification Technique," Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992)]에 기재된 가닥 변위 증폭(SDA), 또는 예를 들어, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Lage et al., "Whole Genome Analysis of Genetic Alterations in Small DNA Samples Using Hyperbranched Strand Displacement Amplification and array-CGH," Genome Res. 13:294-307 (2003)]에 기재된 과분지형(hyperbranched) 가닥 변위 증폭을 포함한다. 등온 증폭 방법은 게놈 DNA의 랜덤 프라이머 증폭을 위해 가닥-변위 파이(Phi) 29 폴리머라제 또는 Bst DNA 폴리머라제 큰 단편, 5'->3' 엑소-와 함께 사용될 수 있다. 이들 폴리머라제의 사용은 그들의 높은 가공성 및 가닥 변위 활성을 활용한다. 높은 가공성으로 인해 폴리머라제는 길이가 10 내지 20 kb인 단편을 생성한다. 상기에 기술된 바와 같이, 클레노브(Klenow) 폴리머라제와 같이 낮은 가공성 및 가닥-변위 활성을 갖는 폴리머라제를 사용하여 등온 조건 하에서 더 작은 단편을 생성할 수 있다 증폭 반응, 조건 및 구성요소에 대한 추가 설명은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제7,670,810호의 개시 내용에 상세히 제시되어 있다.

본 발명에 유용한 다른 폴리뉴클레오티드 증폭 방법은, 예를 들어, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Grothues et al., "PCR Amplification of Megabase DNA With Tagged Random Primers (T-PCR)," Nucleic Acids Res. 21(5):1321-2 (1993), which is hereby incorporated by reference in its entirety.]에 기재된 바와 같은 불변 5' 영역 다음에 랜덤 3' 영역을 갖는 2-도메인 프라이머의 집단을 사용하는 태깅된 PCR이다. 랜덤으로 합성된 3'영역으로부터의 개별 혼성화에 기초하여 열 변성 DNA에 대한 다수의 개시를 허용하도록 제1 증폭 라운드가 수행된다. 3' 영역의 특성으로 인해, 개시 부위는 게놈 전체에 걸쳐 랜덤한 것으로 고려된다. 그 후에, 비결합 프라이머는 제거될 수 있고 불변 5' 영역에 상보적인 프라이머를 사용하여 추가의 복제가 일어날 수 있다.

일부 실시 형태에서, 등온 증폭은 배제 증폭(ExAmp)이라고도 지칭되는 동력학적 배제 증폭(kinetic exclusion amplification; KEA)을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 핵산 라이브러리는 증폭 시약을 반응시켜 부위를 시딩한 개별 표적 핵산으로부터의 앰플리콘의 실질적인 클론 집단을 각각 포함하는 복수의 증폭 부위를 생성시키는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 증폭 반응은 각각의 증폭 부위의 용량을 충전하기에 충분한 수의 앰플리콘이 생성될 때까지 진행된다. 이러한 방식으로 이미 시딩된 부위를 최대한으로 충전시키면, 표적 핵산이 그 부위에서 랜딩하고, 증폭하여 그 부위에서 앰플리콘의 클론 집단을 생성시키는 것을 방지한다. 일부 실시 형태에서, 제2 표적 핵산이 부위에 도달하기 전에 증폭 부위가 최대한으로 충전되지 않은 경우에도 명백한 클론성이 달성될 수 있다. 일부 조건 하에서, 제1 표적 핵산의 증폭은 부위로 수송되는 제2 표적 핵산으로부터의 카피의 생산을 효과적으로 능가하거나 압도하기에 충분한 수의 카피가 만들어지는 지점까지 진행될 수 있다. 예를 들어, 직경이 500 nm 미만인 원형 특징부 상에서 가교 증폭 공정을 사용하는 실시 형태에서, 제1 표적 핵산에 대한 14회 사이클의 지수함수적 증폭 후에, 동일한 부위에서 제2 표적 핵산으로부터의 오염은 Illumina 서열분석 플랫폼 상에서의 합성에 의한 서열분석 분석에 악영향을 미치기에 불충분한 수의 오염된 앰블리콘을 생성할 것임을 알았다.

어레이 내의 증폭 부위는 특정 실시 형태에서 완전히 클론성일 수 있지만, 그럴 필요는 없다. 그 보다는, 일부 응용을 위해서, 개별 증폭 부위는 제1 표적 핵산으로부터의 앰플리콘이 우세하게 존재할 수 있고, 제2 표적 핵산으로부터의 저레벨의 오염 앰플리콘을 또한 가질 수 있다. 어레이는 오염 레벨이 어레이의 후속 사용에 허용 가능하지 않은 영향을 갖지 않는 한, 저레벨의 오염 앰플리콘을 갖는 하나 이상의 증폭 부위를 가질 수 있다. 예를 들어, 어레이를 검출 응용에서 사용하려는 경우, 허용 가능한 레벨의 오염은 검출 기술의 신호 대 노이즈 또는 분해능에 허용될 수 없는 방식으로 영향을 주지 않는 레벨일 것이다. 따라서, 명백한 클론성은 일반적으로 본 명세서에 언급된 방법에 의해 제조된 어레이의 특정 용도 또는 응용에 관련될 것이다. 특정 응용을 위해 개별 증폭 부위에서 허용 가능할 수 있는 예시적인 오염 레벨은 최대 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10% 또는 25%의 오염 앰플리콘을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 어레이는 이러한 예시적인 레벨의 오염 앰플리콘을 갖는 하나 이상의 증폭 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 어레이 내의 증폭 부위 중 최대 5%, 10%, 25%, 50%, 75% 또는 심지어 100%가 일부 오염 앰플리콘을 가질 수 있다. 부위의 어레이 또는 다른 집합체에서, 부위의 적어도 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상이 클론이거나 명백히 클론일 수 있음이 이해될 것이다.

일부 실시 형태에서, 또 다른 이벤트 또는 공정이 일어나는 것을 효과적으로 배제하기에 충분히 신속한 속도로 공정이 일어나는 경우 동력학적 배제가 일어날 수 있다. 예를 들어, 핵산 어레이의 제조를 고려하여, 어레이의 부위가 용액으로부터의 표적 핵산으로 랜덤으로 시딩되고, 표적 핵산의 카피가 증폭 공정에서 생성되어 시딩된 부위 각각을 최대한으로 충전시킨다. 본 발명의 동력학적 배제 방법에 따라, 시딩 및 증폭 공정은 증폭 속도가 시딩 속도를 초과하는 조건 하에서 동시에 진행될 수 있다. 이와 같이, 카피가 제1 표적 핵산에 의해 시딩된 부위에서 제조되는 비교적 빠른 속도는 제2 핵산이 증폭을 위해 부위를 시딩하는 것을 효과적으로 배제시킬 것이다. 동력학적 배제 증폭 방법은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 제2013/0338042호의 개시내용에 상세히 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.

동력학적 배제는 증폭을 개시하기 위한 비교적 느린 속도(예를 들어, 표적 핵산의 제1 카피를 제조하는 느린 속도) 대 표적 핵산의 (또는 표적 핵산의 제1 카피의) 후속 카피를 제조하기 위한 비교적 빠른 속도를 이용할 수 있다. 이전 단락의 예에서, 동력학적 배제는 표적 핵산 시딩의 비교적 느린 속도(예를 들어, 비교적 느린 확산 또는 수송) 대 증폭이 일어나서 부위를 핵산 시드의 카피로 충전시키는 비교적 빠른 속도로 인해 일어난다. 다른 예시적인 실시 형태에서, 동력학적 배제는 부위를 시딩한 표적 핵산의 제1 카피의 형성의 지연(예를 들어, 지연된 또는 느린 활성화) 대 후속 카피가 제조되어 그 부위를 충전시키는 비교적 빠른 속도로 인해 일어날 수 있다. 이러한 예에서, 개별 부위는 몇몇의 상이한 표적 핵산으로 시딩될 수 있다(예를 들어, 몇몇 표적 핵산이 증폭 이전에 각각의 부위에서 존재할 수 있다). 그러나, 임의의 주어진 표적 핵산을 위한 제1 카피 형성은 랜덤으로 활성화될 수 있어서, 제1 카피 형성의 평균 속도는 후속 카피가 생성되는 속도에 비해 상대적으로 느리다. 이러한 경우, 개별 부위가 몇몇 상이한 표적 핵산으로 시딩될 수 있었지만, 동력학적 배제는 이러한 표적 핵산 중 단지 하나만이 증폭되게 할 것이다. 더 구체적으로, 일단 제1 표적 핵산이 증폭을 위해 활성화되면, 그 부위는 이의 카피로 신속하게 최대한으로 충전되어, 제2 표적 핵산의 카피가 그 부위에서 제조되는 것을 방지할 것이다.

증폭 시약은 앰플리콘 형성을 용이하게 하고, 일부 경우에 앰플리콘 형성의 속도를 증가시키는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예로는 재조합효소가 있다. 재조합효소는 반복된 침입/연장을 허용함으로써 앰플리콘 형성을 용이하게 할 수 있다. 더 구체적으로, 재조합효소는 앰플리콘 형성을 위한 주형으로서 표적 핵산을 사용하여 폴리머라제에 의한 프라이머의 연장 및 폴리머라제에 의한 표적 핵산의 침입을 용이하게 할 수 있다. 이러한 공정은 침입/연장의 각 라운드로부터 생성된 앰플리콘이 후속 라운드에서 주형으로서 작용하는 연쇄 반응으로서 반복될 수 있다. 이러한 공정은 표준 PCR보다 더 신속하게 일어날 수 있는데, 그 이유는 (예를 들어, 가열 또는 화학적 변성을 통한) 변성 사이클이 필요하지 않기 때문이다. 이와 같이, 재조합효소 촉진성 증폭은 등온적으로 수행될 수 있다. 증폭을 용이하게 하기 위해 재조합효소 촉진성 증폭 시약에 ATP 또는 다른 뉴클레오티드(또는 일부 경우에 이의 비가수분해성 유사체)를 포함하는 것이 일반적으로 바람직하다. 재조합효소와 단일 가닥 결합(SSB) 단백질의 혼합물은 SSB가 증폭을 더욱 용이하게 할 수 있기 때문에 특히 유용하다. 재조합효소 촉진성 증폭의 예시적인 제형은 TwistDx(영국 캠브리지 소재)에 의해 TwistAmp로서 시판되는 것을 포함한다. 재조합효소-촉진된 증폭 시약의 유용한 성분 및 반응 조건은 미국 특허 제5,223,414호 및 제7,399,590호에 제시되어 있으며, 이들 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

앰플리콘 형성을 용이하게 하기 위해 그리고 일부 경우에 앰플리콘 형성의 속도를 증가시키기 위해 증폭 시약에 포함될 수 있는 성분의 다른 예는 헬리카제이다. 헬리카제는 앰플리콘 형성의 연쇄 반응을 가능하게 함으로써 앰플리콘 형성을 용이하게 할 수 있다. 이러한 공정은 표준 PCR보다 더 신속하게 일어날 수 있는데, 그 이유는 (예를 들어, 가열 또는 화학적 변성을 통한) 변성 사이클이 필요하지 않기 때문이다. 이와 같이, 헬리카제 촉진성 증폭은 등온적으로 수행될 수 있다. 헬리카제와 단일 가닥 결합(SSB) 단백질의 혼합물은 SSB가 증폭을 더욱 용이하게 할 수 있기 때문에 특히 유용하다. 헬리카제 촉진성 증폭의 예시적인 제형은 Biohelix(미국 매사추세츠주 베버리 소재)로부터 IsoAmp 키트로서 시판되는 것들을 포함한다. 또한, 헬리카제 단백질을 포함하는 유용한 제형의 예는 미국 특허 제7,399,590호 및 제7,829,284호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

앰플리콘 형성을 용이하게 하기 위해 그리고 일부 경우에 앰플리콘 형성의 속도를 증가시키기 위해 증폭 시약에 포함될 수 있는 성분의 또 다른 예는 기원 결합 단백질이다.

서열분석 시 사용

어댑터-표적-어댑터 분자를 표면에 부착한 후, 고정화 및 증폭된 어댑터-표적-어댑터 분자의 서열이 결정된다. 서열분석은 임의의 적합한 서열분석 기술을 사용하여 수행될 수 있고, 가닥 재합성을 포함한 고정화 및 증폭된 어댑터-표적-어댑터 분자의 서열을 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제8,053,192호, WO 2016/130704호, 미국 특허 제8,895,249호, 및 미국 특허 제9,309,502호에 기재되어 있으며, 이들 모두는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 명세서에 기재된 방법은 다양한 핵산 서열분석 기술과 함께 사용될 수 있다. 특히 적용가능한 기술은 핵산이 어레이 내의 고정된 위치에 부착되어, 이의 상대 위치가 변화하지 않고, 어레이가 반복적으로 이미징되는 것이다. 예를 들어, 하나의 뉴클레오티드 염기 유형을 다른 것과 식별하는데 사용되는 다른 표지와 일치하는 다른 색상 채널에서 이미지가 획득되는 실시 형태가 특히 적용가능하다. 일부 실시 형태에서, 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법은 자동화 방법일 수 있다. 바람직한 실시 형태는 합성에 의한 서열분석("SBS") 기술을 포함한다.

SBS 기술은 일반적으로 주형 가닥에 대한 뉴클레오티드의 반복적 부가를 통한 신생 핵산 가닥의 효소적 연장을 수반한다. 기존의 SBS 방법에서, 단일 뉴클레오티드 단량체가 각각의 전달에서 폴리머라제의 존재 하에 표적 뉴클레오티드에 제공될 수 있다. 그러나, 본 명세서에 기재된 방법에서, 하나 초과의 유형의 뉴클레오티드 단량체가 전달에서 폴리머라제의 존재 하에 표적 핵산에 제공될 수 있다.

SBS는 종결자 모이어티를 갖는 뉴클레오티드 단량체 또는 임의의 종결자 모이어티가 없는 뉴클레오티드 단량체를 이용할 수 있다. 종결자가 없는 뉴클레오티드 단량체를 사용하는 방법은 예를 들어, 하기에 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, γ-포스페이트 표지화된 뉴클레오티드를 사용하는 서열분석 및 파이로서열분석(pyrosequencing)을 포함한다. 종결자가 없는 뉴클레오티드 단량체를 사용하는 방법에서, 각각의 사이클에서 첨가되는 뉴클레오티드의 수는 일반적으로 가변적이며, 주형 서열 및 뉴클레오티드 전달 방식에 따라 달라진다. 종결자 부분을 갖는 뉴클레오티드 단량체를 이용하는 SBS 기술에서, 종결자는 다이데옥시뉴클레오티드를 이용하는 기존의 Sanger 서열분석의 경우와 같이, 사용된 서열분석 조건 하에서 실질적으로 비가역적일 수 있거나, 종결자는 Solexa(현재, Illumina, Inc.)에 의해 개발된 서열분석 방법의 경우와 같이 가역적일 수 있다.

본 명세서에 개시된 바와 같이, 뉴클레오티드 단량체는 뉴클레오티드의 5-프라임 폴리포스페이트를 통해 뉴클레오티드에 부착된 표지 모이어티 또는 염료 표지를 포함한다. 따라서, 표지의 형광과 같은 표지의 특징에 기초하여 도입 이벤트가 검출될 수 있다. 2종 이상의 상이한 뉴클레오티드가 서열분석 시약 중에 존재하는 실시 형태에서, 상이한 뉴클레오티드는 서로 구별 가능할 수 있거나, 대안적으로 2개 이상의 상이한 표지가 사용되고 있는 검출 기술 하에서 구별 가능하지 않을 수 있다. 예를 들어, 서열분석 시약 중에 존재하는 상이한 뉴클레오티드는 상이한 표지를 가질 수 있고, 이것은 Solexa(현재 Illumina, Inc.)에 의해 개발된 서열분석 방법에 의해 예시된 바와 같은 적절한 광학 장치를 사용하여 구별될 수 있다.

이미지는 배열된 핵산 특징부의 복합체 내로의 표지된 뉴클레오티드의 도입 후에 캡처될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 각각의 사이클은 어레이에 4종의 상이한 뉴클레오티드 유형을 동시에 전달하는 것을 포함하고, 각각의 뉴클레오티드 유형은 스펙트럼적으로 구별되는 표지를 갖는다. 이어서 각각 4개의 상이한 표지 중 하나에 대해 선택적인 검출 채널을 사용하여 4개의 이미지가 얻어질 수 있다. 복합체화 조건 동안, 기재-결합 폴리뉴클레오티드의 다음의 이용가능한 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드는 표면-결합 폴리뉴클레오티드, 기재-결합 폴리뉴클레오티드에 상보적인 프라이머 또는 신생 가닥, 및 폴리머라제와 복합체로 될 수 있다. 복합체화 조건은 유리 뉴클레오티드에 부착된 염료 표지의 복합체의 형성을 허용하지만 해리는 허용하지 않는데, 이는 동력학적 조건이 뉴클레오티드로부터 5-프라임 폴리포스페이트의 절단에 불리하고 표면-부착된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 신생 가닥의 3-프라임 말단에 뉴클레오티드를 부착하기 때문이다. 염료 표지에 의해 방출된 형광 또는 다른 신호는 복합체화 조건 동안 광학적으로 캡처될 수 있다. 중합 조건으로의 후속 전환 시, 뉴클레오티드의 5-프라임 폴리포스페이트 및 부착된 염료 표지는 뉴클레오티드가 기재-부착된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 신생 가닥의 3-프라임 말단에 부착됨에 따라 폴리머라제에 의해 뉴클레오티드로부터 절단될 것이다.

일 예에서, 상이한 뉴클레오티드 유형은 순차적으로 부가될 수 있으며, 각각의 부가 단계들 사이에서 어레이의 이미지가 얻어질 수 있다. 이러한 실시 형태에서, 각각의 이미지는 특정 유형의 뉴클레오티드가 도입된 핵산 특징을 나타낼 것이다. 상이한 특징부는 각각의 특징부의 상이한 서열 콘텐츠로 인해 상이한 이미지에 존재하거나 존재하지 않을 것이다. 그러나, 특징부의 상대적인 위치는 이미지에서 변하지 않은 채로 있을 것이다.

특정 실시 형태에서, 뉴클레오티드 단량체의 일부 또는 전부는 가역적 종결자를 포함할 수 있다. 이러한 실시 형태에서, 가역적 종결자/절단가능한 형광단은 3' 에스테르 연결을 통해 리보스 모이어티에 연결된 형광단을 포함할 수 있다(전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Metzker, "Emerging Technologies in DNA Sequencing," Genome Res. 15:1767-1776 (2005)]). 다른 접근법은 형광 표지의 절단으로부터 종결자 화학을 분리하였다(전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Ruparel et al., "Design and Synthesis of a 3'-O-allyl Photocleavable Fluorescent Nucleotide as a Reversible Terminator for DNA Sequencing by Synthesis," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:5932-37 (2005)]). Ruparel 등은 작은 3'알릴기를 사용하여 연장을 차단하지만, 팔라듐 촉매를 사용한 짧은 처리에 의해 쉽게 탈블록킹될 수 있는 가역적 종결자의 개발을 기술하였다. 형광단은 장파장 UV 광에 30초 노출에 의해 쉽게 절단될 수 있는 광절단가능한 링커를 통해 염기에 부착되었다. 따라서, 다이설파이드 환원 또는 광절단 중 어느 하나가 절단가능한 링커로서 사용될 수 있다. 가역적 종결에 대한 다른 접근법은 dNTP 상에 벌키한 염료를 배치한 후에 일어나는 자연 종결의 사용이다. dNTP 상의 하전된 벌키한 염료의 존재는 입체 및/또는 정전기 장애를 통해 효과적인 종결자로서 작용할 수 있다. 하나의 도입 이벤트의 존재는 염료가 제거되지 않는 한, 추가 도입을 방지한다. 염료의 절단은 형광단을 제거하고, 종결을 효과적으로 역전시킨다. 변형된 뉴클레오티드의 예는 또한 미국 특허 제7,427,673호 및 제7,057,026호에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 명세서에 기재된 방법 및 시스템과 함께 이용될 수 있는 추가의 예시적인 SBS 시스템 및 방법은 미국 특허 출원 공개 제2007/0166705호, 제2006/0188901호, 제2006/0240439호, 제2006/0281109호, 제2012/0270305호, 및 제2013/0260372호, 미국 특허 제7,057,026호, WO 05/065814호, 미국 특허 출원 공개 제2005/0100900호, WO 06/064199호 및 WO 07/010,251호에 기재되어 있으며, 이들 개시내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

일부 실시 형태는 4개 미만의 상이한 표지를 사용하는 4개의 상이한 뉴클레오티드의 검출을 이용할 수 있다. 예를 들어, SBS는 미국 특허 출원 공개 제2013/0079232호에 포함된 문헌에 기술된 방법 및 시스템을 사용하여 수행될 수 있으며, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 첫 번째 예로서, 한 쌍의 뉴클레오티드 유형이 동일한 파장에서 검출될 수 있지만, 그 쌍의 하나의 구성원에 대해 다른 구성원과 비교한 세기의 차이에 기초하여, 또는 그 쌍의 다른 구성원에 대해 검출된 신호와 비교한, 명백한 신호가 나타나거나 사라지게 하는 (예를 들어, 화학적 변형, 광화학적 변형 또는 물리적 변형을 통한) 그 쌍의 하나의 구성원에 대한 변화에 기초하여 구별될 수 있다. 두 번째 예로서, 4개의 상이한 뉴클레오티드 유형 중 3개가 특정 조건 하에서 검출될 수 있는 반면, 제4 뉴클레오티드 유형은 그러한 조건 하에서 검출가능한 표지가 결여되어 있거나, 그러한 조건 하에서 최소한으로 검출된다(예를 들어, 배경 형광 등으로 인한 최소 검출). 핵산 내로의 처음 3개의 뉴클레오티드 유형의 도입은 이의 각각의 신호의 존재를 기반으로 결정될 수 있고, 핵산 내로의 제4 뉴클레오티드 유형의 도입은 임의의 신호의 부재 또는 최소 검출을 기반으로 결정될 수 있다. 세 번째 예로서, 하나의 뉴클레오티드 유형은 2개의 상이한 채널에서 검출되는 표지(들)를 포함할 수 있는 반면, 다른 뉴클레오티드 유형은 단 하나의 채널에서만 검출된다. 상술한 3개의 예시적인 구성은 상호 배타적인 것으로 간주되지 않으며, 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 모든 3개의 예를 조합한 예시적인 실시 형태는 제1 채널에서 검출되는 제1 뉴클레오티드 유형(예를 들어, 제1 여기 파장에 의해 여기되는 경우 제1 채널에서 검출되는 표지를 갖는 dATP), 제2 채널에서 검출되는 제2 뉴클레오티드 유형(예를 들어, 제2 여기 파장에 의해 여기되는 경우 제2 채널에서 검출되는 표지를 갖는 dCTP), 제1 채널 및 제2 채널 둘 모두에서 검출되는 제3 뉴클레오티드 유형(예를 들어, 제1 여기 파장 및/또는 제2 여기 파장에 의해 여기되는 경우 두 채널 모두에서 검출되는 적어도 하나의 표지를 갖는 dTTP) 및 어느 하나의 채널에서도 검출되지 않거나 최소한으로 검출되는 표지가 결여된 제4 뉴클레오티드 유형(예를 들어, 표지를 갖지 않는 dGTP)을 사용하는 형광 기반 SBS 방법이다.

또한, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 제2013/0079232호에 포함된 문헌에 기술된 바와 같이, 서열분석 데이터는 단일 채널을 사용하여 획득될 수 있다. 이러한 소위 1 염료 서열분석 접근법에서, 제1 뉴클레오티드 유형은 표지화되지만, 표지는 제1 이미지가 생성된 후에 제거되고, 제2 뉴클레오티드 유형은 제1 이미지가 생성된 후에만 표지화된다. 제3 뉴클레오티드 유형은 제1 이미지 및 제2 이미지 둘 모두에서 이의 표지를 보유하고, 제4 뉴클레오티드 유형은 두 이미지에서 표지화되지 않은 상태로 유지된다.

상기 SBS 방법은 멀티플렉스 포맷으로 유리하게 수행되어 다수의 상이한 표적 핵산이 동시에 조작될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상이한 표적 핵산이 일반적인 반응 용기에서 또는 특정 기재의 표면 상에서 처리될 수 있다. 이것은 멀티플렉스 방식으로 서열분석 시약의 편리한 전달, 미반응 시약의 제거 및 도입 이벤트의 검출을 가능하게 한다. 표면 결합된 표적 핵산을 사용한 실시 형태에서, 표적 핵산은 어레이 포맷으로 존재할 수 있다. 어레이 포맷에서, 표적 핵산은 전형적으로 공간적으로 구별가능한 방식으로 표면에 결합될 수 있다. 표적 핵산은 직접 공유 부착, 비드 또는 다른 입자에 대한 부착 또는 표면에 부착된 폴리머라제 또는 다른 분자에 대한 결합에 의해 결합될 수 있다. 어레이는 각각의 부위(특징부라고도 지칭됨)에서 표적 핵산의 단일 카피를 포함할 수 있거나, 동일한 서열을 갖는 다수의 카피가 각각의 부위 또는 특징부에 존재할 수 있다. 다수의 카피는 하기에 더욱 상세하게 기술된 바와 같은 증폭 방법, 예컨대 가교 증폭 또는 에멀젼 PCR에 의해 생성될 수 있다.

본 명세서에 기재된 방법은 예를 들어, 적어도 약 10개의 특징부/㎠, 100개의 특징부/㎠, 500개의 특징부/㎠, 1,000개의 특징부/㎠, 5,000개의 특징부/㎠, 10,000개의 특징부/㎠, 50,000개의 특징부/㎠, 100,000개의 특징부/㎠, 1,000,000개의 특징부/㎠, 5,000,000개의 특징부/㎠ 또는 그 이상을 포함하는, 다양한 밀도들 중 임의의 밀도의 특징부를 갖는 어레이를 사용할 수 있다.

본 명세서에 제시된 방법의 이점은 이들이 병렬로 복수의 표적 핵산의 신속하고 효율적인 검출을 제공한다는 것이다. 따라서, 본 발명은 상기에 예시된 것과 같은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 핵산을 제조 및 검출할 수 있는 통합 시스템을 제공한다. 따라서, 본 발명의 통합 시스템은 증폭 시약 및/또는 서열분석 시약을 하나 이상의 고정된 DNA 단편으로 전달할 수 있는 유체 구성요소를 포함할 수 있으며, 시스템은 펌프, 밸브, 저장소, 유체 라인 등과 같은 구성요소를 포함한다. 플로우 셀은 표적 핵산의 검출을 위한 통합된 시스템으로 구성되고/되거나 사용될 수 있다. 예시적인 플로우 셀은, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제2010/0111768호 및 미국 특허 제8,951,781호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 플로우 셀에 대해 예시된 바와 같이, 통합 시스템의 유체 구성요소들 중 하나 이상이 증폭 방법 및 검출 방법에 사용될 수 있다. 핵산 서열분석 실시 형태를 예로 들면, 통합된 시스템의 하나 이상의 유체 구성요소가 본 명세서에 제시된 증폭 방법 및 상기 예시된 것과 같은 서열분석 방법에서의 서열분석 시약의 전달을 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 통합 시스템은 증폭 방법을 수행하기 위해 그리고 검출 방법을 수행하기 위해 별개의 유체 시스템을 포함할 수 있다. 증폭된 핵산을 생성하고 또한 핵산의 서열을 결정할 수 있는 통합 서열분석 시스템의 예는, 제한 없이, MiSeq^TM 플랫폼(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 Illumina, Inc.) 및 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제8,951,781호에 개시된 장치를 포함한다.

다른 태양에서, 본 발명은 (a) 본 명세서에 기재된 복수의 상이한 개별 뉴클레오티드 및 (b) 이를 위한 패키징 재료를 포함하는 키트를 제공한다. 이러한 키트는 (a) 본 명세서에 기재된 것들에 따른 개별 뉴클레오티드 - 각각의 뉴클레오티드는 선택적으로 절단가능한 링커를 통해 화학식 Z의 블록킹 기에 결합된 검출가능한 표지, 또는 절단가능한 링커를 통해 검출가능한 표지에 결합된 염기를 가질 수 있고, 각각의 뉴클레오티드에 결합된 검출가능한 표지는 다른 3개의 뉴클레오티드에 사용된 검출가능한 표지로부터의 검출 시 구별될 수 있음 -, 및 (b) 이를 위한 패키징 재료를 포함할 수 있다. 키트는, 동일한 화학적 처리 단계에서 제거될 수 있는 블록킹 기 및 검출가능한 표지의 제거를 위한 적절한 화학물질에 더하여, 상보적 뉴클레오티드 사슬 내로 뉴클레오티드를 도입하기 위한 효소 및 효소의 작용에 적절한 완충액을 포함할 수 있다.

본 명세서에 더 상세히 논의되는 전술한 개념들 및 추가의 개념들의 모든 조합은 (그러한 개념들이 상호 불일치하지 않는다면) 본 명세서에 개시된 발명 요지의 일부인 것으로 고려됨이 이해되어야 한다. 특히, 본 명세서의 끝부분에 나타나는 청구된 발명 요지의 모든 조합은 본 명세서에 개시된 발명 요지의 일부인 것으로 고려된다.

본 발명에서, 본 명세서의 일부를 형성하고, 실시될 수 있는 특정 실시 형태가 실례로서 도시되어 있는 첨부 도면을 참조한다. 이들 실시 형태는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있게 하기 위해 상세히 설명되고, 다른 실시 형태가 이용될 수 있고 구조적, 논리적 및 전기적 변화가 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서 이루어질 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 예시적인 실시 형태에 대한 하기 설명은 제한된 의미로 취해지지 않아야 한다.

본 발명은 하기 실시예를 참조하여 추가로 예시될 수 있다.

실시예

하기 실시예는 예시하고자 하는 것이지만, 첨부된 청구범위에 제시된 바와 같은 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1 - 무흔적 SBS를 가능하게 하는 서열분석 화학.

여기서, 무흔적 SBS를 가능하게 하는 서열분석 화학이 제안된다. 이 도식에서, 일단 뉴클레오티드 및 폴리머라제가 주형 가닥과 반대인 클러스터링된 DNA에 결합되면, 실제 뉴클레오티드 도입 전을 제외하고는, 형광 신호의 검출이 발생할 수 있다(도 1a 내지 도 1f). 본 방법은 신호를 검출하고 정확한 염기를 호출하기 위해 뉴클레오티드의 화학적 도입이 충분히 길게 일시정지되거나 완전히 방지되는 제어된 촉매작용을 이용한다.

도입 전에, 뉴클레오티드 결합 단계 동안 일시정지함으로써 촉매작용을 제어하는 능력은 단일-분자 서열분석에 또한 유용할 수 있으며, 여기서 고속의 도입 동력학은 짧은 펄스 폭을 통하든 짧은 펄스간 거리를 통하든지 간에 누락된 호출로 이어질 수 있다.

일 실시예에서, 플로우셀의 표면 상의 폴리머라제-P/T 복합체에 의한 염료 표지를 보유하는 뉴클레오티드 기재의 안정한 결합은 비-촉매 조건 하에서 발생한 후, 용액 중의 과량의 뉴클레오티드를 세척한다. 유지된 비-촉매 조건은 뉴클레오티드-폴리머라제-P/T 3원 복합체를, 염기가 이의 각각의 염료 표지에 의해 식별되는 동안, 안정화시키고, 일단 신호 검출(및 이에 따른 염기 호출)이 달성되었다면, 시스템은 용액을 교환함으로써 비도입 조건으로부터 도입 조건으로 전환시킨다. 복합체화 (예를 들어, 비-촉매) 조건 및 중합 (예를 들어, 촉매) 조건의 예가 본 명세서에 기재되어 있다. 촉매 조건의 존재 하에, DNA 폴리머라제는 뉴클레오티드를 DNA로 도입시켜, 형광 염료를 보유한 이탈기의 해리를 야기한다(도 1a 내지 도 1f). 원칙적으로, 5' 말단 포스페이트 변형에 더하여, 3' 가역적 종결자(예를 들어, AZM 기)를 포함하는 뉴클레오티드는, 전통적인 SBS에서 현재 사용되는 바와 같이, 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 뉴클레오티드 도입의 정확한 제어는, 특히 도 1a 내지 도 1f에 기재되는 추가의 실시 형태에서, 각각의 사이클에서 DNA 가닥당 단일 뉴클레오티드의 연장을 가능하게 하는 것이 가능하다.

무흔적 SBS 사이클의 개략도가 도 1a 내지 도 1f에 도시되어 있다. 폴리머라제는 플로우셀 표면 상에 클러스터링된 프라이밍된 DNA에 결합된다(도 1a). 5'-포스페이트 표지를 보유하는 뉴클레오티드 기재는 촉매작용을 제어하는 조건 하에 도입되어, 폴리머라제 도입 동력학을 일시정지시키고 5' 포스페이트 상에 표지를 유지시킨다(도 1b). 검출 모드에 따라, 과량의 기재가 결합 후 세척될 수 있다. (특히 과량의 기재가 검출 전에 세척되지 않은 경우) 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드는 촉매 조건의 도입 시 다수의 뉴클레오티드 도입 이벤트를 방지하기 위해 3'-블록을 보유할 수 있다. 뉴클레오티드 기재 및 이의 5'-포스페이트 표지가 촉매작용 전에 여전히 결합되어 있는 동안 클러스터마다 신호가 측정된다(도 1c). 촉매작용이 촉진될 수 있도록 플로우셀의 조건이 변경되고 5' 포스페이트 표지가 클러스터로부터 방출된다(도 1d). 다시, 뉴클레오티드 결합 후에 과량의 기재를 세척하지 않는 실시 형태에서 3'-블록의 존재가 단일 연장 이벤트만을 가능하게 하기 위해 여기에서 필요할 것이다. 생성된 DNA 생성물은 천연 뉴클레오티드를 포함한다(도 1e). 일부 실시 형태는 3'-블록을 갖는 뉴클레오티드 기재를 사용하며, 이러한 경우에 후속 탈블록킹 단계가 후속 사이클 동안 클러스터를 제조하는 데 필요하다(도 1f).

촉매작용의 신중한 제어를 가능하게 하기 위해, 다수의 접근법이 사용될 수 있다. 촉매 사이클의 일시정지는 비-촉매 금속(예를 들어, Ca2+, Zn2+, Co2+, Ni2+, Eu2+, Sr2+, Ba2+, Fe2+, Eu2+ 및 이들의 혼합물), 비-경쟁적 억제제, 경쟁적 촉매 억제제, 화학을 느리게 하거나 방지하기 위한 뉴클레오티드 기재에 대한 변화(비-가교 티올 또는 가교 질소, 억제제 표지), 특정 조건 하에 화학을 느리게 하거나 방지하기 위한 효소 돌연변이, 용매 첨가제(에탄올, 메탄올, THF, 다이옥산, DMA, DMF, DMSO), D2O 및 이들의 비율, pH 및 온도에 의해 생성될 수 있는 비도입 조건을 필요로 한다.

신호 검출 후, 비도입 조건을 없애고 표지의 방출을 가능하게 하는 도입 조건이 도입될 수 있다. Mn2+ 및/또는 Mg2+를 포함하는 촉매 금속이 촉매작용을 촉진할 것이다.

가역적 알로스테릭(allosteric) 억제제 또는 비-경쟁적 폴리머라제 억제제가 포함될 수 있다. 이는 촉매 금속의 오염된 양으로부터의 염료 표지의 방출에 대한 제어로 3원 복합체의 안정한 형성을 가능하게 함으로써 3' 가역적 종결자의 포함과 유사한 이점을 제공할 수 있다. 알로스테릭/비-경쟁적 억제제의 사용은 촉매 금속 이온을 오염시키는 것으로부터 촉매작용을 감소시키거나 "녹아웃(knock-out)" 시킬 수 있다. 부착된 억제제의 국소 농도는 매우 높을 것이어서, 그렇지 않으면 약한 억제제가 매우 효과적인 억제를 제공할 수 있다. 아마도 억제는 다양한 전략을 사용하여 극복될 수 있다. 예를 들어, 하나의 이러한 억제제가 pH-의존적이어서, 억제와 일치하는 pH는 검출을 위해 칼슘과 함께 사용될 수 있고, 이어서, pH는 Mg2+와 같은 촉매 금속의 도입과 함께 비억제 상태로 변경될 수 있다. 구체적으로, 억제는 pH 의존적이었고, 경쟁적 방식으로 Mg(II) 이온에 의해 방출될 수 있어서, 이는 정전기 상호작용이 억제에 중요하다는 것을 그리고 아미노글리코사이드에 대한 결합 부위가 Mg(II) 이온 결합 부위와 중첩하는 것을 시사한다. 둘 모두가 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Thuresson et al., "Inhibition of Poly(A) Polymerase by Aminoglycosides," Biochimie 89:1221-27 (2007)] 및 문헌[Ren et al., "Inhibition of Klemow DNA Polymerase and poly(A)-Specific Ribonuclease by Aminoglycosides," RNA 8:1393-400 (2002)]을 참조한다. 동력학적 분석은 네오마이신 및 카나마이신 패밀리의 아미노글리코사이드가 혼합된 비-경쟁적 억제제로서 거동하는 것을 밝혀내었다. 둘 모두가 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Thuresson et al., "Inhibition of Poly(A) Polymerase by Aminoglycosides," Biochimie 89:1221-27 (2007)] 및 문헌[Ren et al., "Inhibition of Klemow DNA Polymerase and poly(A)-Specific Ribonuclease by Aminoglycosides," RNA 8:1393-400 (2002)]을 참조한다. 다른 잠재적 억제제는 피로포스페이트 유사체, 예컨대, 멜라닌을 포함한다.

감마 포스페이트는 가역적이지 않고, 고정된 3원 복합체를 생성하면서, 폴리머라제 분자에 (그것을 비활성화하는) 도입 후 결합하는 억제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 억제제는 도입 후 효소 활성 부위 근처에서 시스테인에 결합할 수 있다. 비가역적 억제는 또한 3'-OH와 인입 뉴클레오티드 사이의 비-가수분해성 결합의 결과로서 발생할 수 있다. 이러한 경우, 표지는 효과적으로 폴리머라제로 전달되거나 도입된 뉴클레오티드로부터 방출되는 것이 방지되어, 해리되지 않는 복합체를 생성하면서 검출을 허용한다. 이러한 실시 형태에서, 가혹한 화학적 처리에 이어진 폴리머라제-P/T 복합체 재생이 사이클을 완료하는데 요구될 수 있고 후속 염기가 도입되는 것을 가능하게 할 수 있다.

또한, 전촉매 복합체 형성을 안정화시키기 위해 감마 포스페이트에 부착되지 않은 (비-촉매 금속 이외의) 억제제의 용도가 본 발명에 포함된다. 이는 더 완전한 제어를 위해 비-촉매 금속 대신 또는 이에 더하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기에 논의된 바와 같이, pH, 아미노글리코사이드, 피로포스페이트 유사체 및 멜라닌에 대한 변화가 사용될 수 있다.

이러한 전략은 무흔적, 단일-분자 SBS 시스템을 가능하게 하도록 확장될 수 있다.

Claims

방법으로서,
a) 폴리머라제를 주형 폴리뉴클레오티드 및 복수의 유리 뉴클레오티드와 접촉시키는 단계 - 상기 주형 폴리뉴클레오티드는 상기 주형 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 단편에 의해 돌출된 3' 말단을 포함하는 상보적 폴리뉴클레오티드에 혼성화되고, 상기 복수의 유리 뉴클레오티드는 하기 화학식 (I)의 화합물을 포함하고:
[화학식 (I)]

여기서, R₁은 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실로부터 선택되는 질소성 염기를 포함하고; R₂는 -O-R₂로 이루어지고, 여기서 R₂는 H 또는 Z이고, Z는 아지도 기를 포함하는 제거가능한 보호기이고; R₃은 3개 이상의 포스페이트 기를 포함하는 링커를 포함하고; R₄는 형광 표지를 포함하고;
상기 접촉은 복합체화 조건 하에서 발생하고, 상기 복합체화 조건은 복합체를 형성하는 데는 효과적이지만 중합을 형성하는데 효과적이지 않고, 상기 복합체는 상기 폴리머라제, 상기 주형 폴리뉴클레오티드, 상기 상보적 폴리뉴클레오티드, 및 상기 주형 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 단편의 제1 뉴클레오티드에 상보적인 복수의 유리 뉴클레오티드 중 하나를 포함함 -;
b) 상기 형광 표지로부터 신호를 검출하는 단계; 및
c) 상기 복합체를 중합 조건에 노출시키는 단계를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, R₂는 -O-R₂로 이루어지고, 여기서 R₂는 Z이고, Z는 아지도 기를 포함하는 제거가능한 보호기인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 주형 폴리뉴클레오티드는 기재에 부착된 복수의 주형 폴리뉴클레오티드 중 하나인, 방법.
제3항에 있어서, 상기 기재에 부착된 상기 복수의 주형 폴리뉴클레오티드는 라이브러리 폴리뉴클레오티드 카피의 클러스터를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서,
단계 a) 내지 단계 c)를 1회 이상 반복하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 중합 조건은 Mg²⁺ 이온의 농도를 - Mg²⁺ 이온의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM 범위임 - 포함하거나, Mn²⁺ 이온의 농도를 - Mn²⁺ 이온의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM 범위임 - 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 복합체화 조건은 비-촉매 금속 양이온을 포함하는, 방법.
제7항에 있어서, 상기 비-촉매 금속 양이온은 Ca²⁺, Zn²⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Eu²⁺, Sr²⁺, Ba²⁺, Fe²⁺, 및 Eu²⁺ 중 하나 이상으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제7항에 있어서, 상기 비-촉매 금속 양이온의 농도는 약 10 mM 이하인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 복합체화 조건은 킬레이트제를 포함하는, 방법.
제10항에 있어서, 상기 킬레이트제는 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N′,N′-테트라아세트산(EGTA), 니트릴로아세트산, 테트라소듐 이미노다이석시네이트, 에틸렌 글리콜 테트라아세트산, 폴리아스파르트산, 에틸렌다이아민-N,N'-다이석신산(EDDS), 메틸글리신다이아세트산(MGDA), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제10항에 있어서, 상기 복합체화 조건은 비-경쟁적 억제제, 경쟁적 억제제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 억제제를 추가로 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 복합체화 조건은 약 6 미만인 pH를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 중합 조건은 약 6 이상인 pH를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 복합체화 조건은 비-경쟁적 억제제를 포함하는, 방법.
제15항에 있어서, 상기 비-경쟁적 억제제는 아미노글리코사이드, 피로포스페이트 유사체, 멜라닌, 포스포노아세테이트, 하이포포스페이트, 리파마이신, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 복합체화 조건은 경쟁적 억제제를 포함하는, 방법.
제17항에 있어서, 상기 경쟁적 억제제는 아피디콜린, 베타-D-아라비노푸라노실-CTP, 아밀로라이드, 데하이드로알테뉴신, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 복합체화 조건은 용매 첨가제를 포함하는, 방법.
제19항에 있어서, 상기 용매 첨가제는 에탄올, 메탄올, 테트라하이드로푸란, 다이옥산, 다이메틸아민, 다이메틸포름아미드, 다이메틸 설폭사이드, 리튬, L-시스테인, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 복합체화 조건은 중수소를 포함하는, 방법.
제2항에 있어서, 3'-하이드록시 블록킹 기는 가역적 종결자를 포함하는, 방법.
제22항에 있어서, 상기 가역적 종결자는 아지도메틸 기 또는 아세탈 기를 포함하는, 방법.
제22항에 있어서,
상기 상보적 폴리뉴클레오티드의 3' 말단이 상기 링커의 포스페이트 기에 공유 결합된 후에 상기 가역적 종결자를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 유리 뉴클레오티드는 비-가교 티올 또는 가교 질소를 추가로 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 폴리머라제는 돌연변이를 포함하는, 방법.
제26항에 있어서, 상기 돌연변이는 단계 a) 내지 단계 c) 중 하나 이상의 속도를 변형시키는, 방법.