JP2006308292A

JP2006308292A - 標的分子の検出方法、遺伝子多型の検出方法、ならびにこれらの検出方法に用いられる基板およびキット

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Publication number: JP2006308292A
Application number: JP2005127488A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Takiguchi; 宏志瀧口; Shinobu Yokogawa; 忍横川
Original assignee: Seiko Epson Corp
Current assignee: Seiko Epson Corp
Priority date: 2005-04-26
Filing date: 2005-04-26
Publication date: 2006-11-09
Anticipated expiration: 2025-04-26
Also published as: JP4626377B2

Abstract

【課題】本発明は、固相表面への汚染物質の非特異的な付着を防止し、プローブ分
子等の生体分子をばらつき無く吸着固定させ、結果としてかかる固相基板を用いた検出・
測定方法を再現性良く行うことができる方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、標的分子を含む可能性を有する試料溶液と、該標的分子と
特異的に結合するプローブ分子が固定された固相表面と、を接触させて、試料溶液中の標
的分子を検出および／または定量する方法であって、前記固相表面に、該固相表面に対す
る親和性が前記プローブ分子より低い被膜形成分子からなる被膜を形成する工程と、前記
固相表面と、前記プローブ分子を含む液体とを接触させ、前記プローブ分子を前記被膜形
成分子と置換させ、固定する工程と、前記試料溶液と、前記プローブ分子が固定された前
記固相表面とを接触させる工程と、前記プローブ分子に結合した物質を検出および／また
は定量する工程と、を含む方法を提供し、上記目的を解決するものである。
【選択図】図１

Description

本発明は、試料溶液中の標的分子を検出および／または定量する方法、核酸における多
型を検出する方法、および当該方法に用いられる基板、キット等に関する。

従来、基礎研究や臨床分野における使用を目的として、試料溶液中における生体分子の
有無や濃度を検出・測定する種々の方法が提案されている。中でも、ＤＮＡやタンパク質
等の生体分子が、特定の分子と特異的に結合するという性質を利用したバイオチップが広
く開発されている。マイクロアレイ等の名称でも呼ばれるバイオチップは、標的分子と特
異的に結合するプローブ分子がその表面に固定されており、標的分子を含む試料溶液と接
触させ、必要に応じてインキュベートすることによって、標的分子をその表面に捕捉する
。

バイオチップ表面に捕捉された標的分子の検出・定量は、蛍光標識を用いる方法のほか
、表面プラズモン共鳴法（例えば、特許文献１を参照）、水晶振動子法（例えば、特許文
献２を参照）、電気化学的検出法等によって行うことができる。

表面プラズモン共鳴法とは、金属表面の電子波である表面プラズモンと、光を全反射さ
せることによって生じるエバネッセント光の共鳴現象であり、特定の波長の光を特定の角
度から金属の薄膜表面に当てると、光子のエネルギーが金属表面の電子に吸収されて反射
されなくなる現象を利用する方法である。金属薄膜が形成された基板表面にプローブ分子
を固定しておくと、標的分子が結合することによって、反射されなくなる入射角度（共鳴
角度）が変化するので、この変化を測定することにより、標的分子を検出・定量すること
ができる。

水晶振動子法は、固有の機械振動をもった水晶片に対して交互に一定の電圧を加えると
水晶が共振する現象を利用する方法である。水晶振動子の共振振動数は、表面に物質が結
合するとその質量によって変化することから、水晶振動子の表面にプローブ分子を固定し
ておくことにより、標的分子の結合の有無を共振振動数の変化で検出することができる。

また、電気化学的検出法は、電極基板表面に固定されたプローブ分子に、電気化学的に
活性な官能基で標識した標的分子が結合することによって、サイクリックボルタモグラム
などで当該標識の有無を検出する方法である。電気化学的に活性な官能基は、プローブ分
子および標的分子が核酸の場合、ハイブリダイゼーションを生じた後でインターカレータ
によって導入することもできる。

これらの検出方法では、それぞれの基板表面にプローブ分子を固定する方法として、プ
ローブ分子の自己組織化単分子膜（Self Assembled Monolayer; ＳＡＭ）を形成する方法
が用いられている。この方法によれば、まず、プローブ分子にチオール基等のＳＡＭを形
成しやすい官能基を付けておき、このようなプローブ分子を含む溶液に、金、銀、白金等
の金属薄膜を形成した基板を接触させることによって、迅速かつ容易にプローブ分子を固
定することができる。
特表２０００−５０８１６８号公報特開２０００−０６５７０８号公報

しかしながら、金属表面は非常に不安定で、プローブ分子以外の物質に対しても活性で
あり、短時間に大気や溶液中の汚染物質が非特異的に付着してしまうおそれがある。この
ような汚染物質の付着はプローブ分子の吸着を妨げる。バイオチップは、微量の標的物質
の検出を目的としているため、プローブ分子の吸着量にばらつきが生じると、バイオチッ
プとしての信頼性が大きく低下する。

また、標的分子を捕捉するためのプローブ分子以外にも、様々な検出、測定方法のため
に、生体分子を固相表面に固定する方法が必要とされる場合があり、固相表面の汚染によ
って生体分子が充分に固定されないという問題が生じることがある。

そこで、本発明は、固相表面への汚染物質の非特異的な付着を防止し、プローブ分子等
の固定すべき分子をばらつき無く吸着固定させ、結果としてかかる固相基板を用いた検出
・測定方法を再現性良く行うことができる方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明は、第１の態様として、標的分子を含む可能性を有
する試料溶液と、該標的分子と特異的に結合するプローブ分子が固定された固相表面と、
を接触させて、試料溶液中の標的分子を検出および／または定量する方法であって、前記
固相表面に、該固相表面に対する親和性が前記プローブ分子より低い被膜形成分子からな
る被膜を形成する工程と、前記固相表面と、前記プローブ分子を含む液体とを接触させ、
前記プローブ分子を前記被膜形成分子と置換させ、固定する工程と、前記試料溶液と、前
記プローブ分子が固定された前記固相表面とを接触させる工程と、前記プローブ分子に結
合した物質を検出および／または定量する工程と、を含むことを特徴とする、試料溶液中
の標的分子を検出および／または定量する方法を提供する。

このような方法によれば、まず基板表面に被膜が形成され、基板表面に対する汚染物質
の非特異的吸着が防止される。そして、被膜が形成された固相表面と、プローブ分子を含
む溶液とを接触させれば、プローブ分子より親和性の低い被膜形成分子に代わってプロー
ブ分子が固相表面に固定される。

上記プローブ分子としては、タンパク質や核酸が好ましい。タンパク質や核酸を固定す
ることにより、これらと生物学的特異性により結合する標的分子を高感度に検出・定量す
ることができる。

また、上記固相表面が金属からなり、上記プローブ分子がチオール基、モノスルフィド
基、またはジスルフィド基を有することが好ましい。金属表面を有する基板は、各種の検
出・定量方法に好適に用いられ、チオール基、モノスルフィド基、またはジスルフィド基
は、かかる金属表面に対して極めて短時間でＳＡＭを形成することができる。

また、上記被膜形成分子は、カチオン性官能基および／またはアニオン性官能基を有す
ることが好ましい。このような分子は、金属表面と非特異的に結合して汚染物質の付着を
防ぐことができる一方で、チオール基よりは金属表面に対する親和性が低く、チオール基
の金属表面への結合を妨げない。

また、上記被膜形成分子としては、カチオン性ポリマー、アニオン性ポリマーのほか、
ＤＮＡ等の核酸やタンパク質も好ましい。これらの核酸やタンパク質もアミノ基、リン酸
基をはじめとするカチオン性官能基およびアニオン性官能基を有するため、金属表面に非
特異的に吸着する一方で、基板に対してより親和性の強いチオール基への置換を阻害しな
い。

本発明に係る標的物質の検出・定量方法における検出および／または定量工程は、表面
プラズモン共鳴法、水晶振動子法、または電気化学検出法によって行われることが好まし
い。これらの方法によれば、金属表面を有する基板に固定されたプローブ分子と標的分子
との結合を、高精度かつ高感度に検出・定量することができる。

さらに、本発明は、第２の態様として、核酸における多型を検出する方法であって、一
端に測定用基板に結合可能な基板結合部位を有するプライマーであって、前記多型を含む
可能性を有する領域にアニーリング可能なプライマーを使用する方法であり、前記核酸と
、前記プライマーとを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う第１工程と、前記ポリメラーゼ
連鎖反応産物の基板結合部位と前記測定用基板とを結合させる第２工程と、前記測定用基
板に結合した前記プライマーの伸長反応の有無を測定することによって、多型の有無を検
出する第３工程と、を含み、前記第２工程に先立って、前記測定用基板表面に対する親和
性が前記基板結合部位より低い被膜形成分子からなる被膜を形成する、方法をも提供する
。

このような構成によれば、上記本発明の第１の態様と同様に、まず各種測定用基板表面
に被膜が形成され、該測定用基板表面に対する汚染物質の非特異的吸着が防止される。特
に、本多型検出方法では、基板結合部位を有しないＰＣＲ産物が電極表面に非特異的に吸
着するのを防ぐことができる。そして、基板結合部位を有するＰＣＲ産物のみが、被膜が
形成された基板表面において、被膜形成分子に代わって吸着固定される。

なお、「測定用基板」とは、プライマーの伸長反応の有無を測定することができる測定
方法に使用可能な基板を意味し、その材料、構成は特に限定されない。測定用基板として
は、各種の測定方法に応じて、光透過性を有するものや、電極基板、表面に金薄膜が形成
された基板等が用いられる。

ここで、測定用基板に結合したプライマーの伸長反応の有無は、表面プラズモン共鳴法
、水晶振動子法、電気化学的検出法により行うことが好ましい。これらの方法によれば、
伸長反応の有無を、基板表面の被膜の膜厚の変化や、質量の変化として高感度に検出する
ことが可能である。

本発明はまた、生体分子をその表面に固定して用いられる、表面プラズモン共鳴法用、
水晶振動子法用、若しくは電気化学検出法用の基板であって、前記基板表面に、前記基板
表面に対する親和性が前記生体分子より低い被膜形成分子からなる被膜が形成されている
基板を提供する。このような構成によれば、被膜により、大気中または溶液中の汚染物質
が非特異的に付着するのを防ぐことができる一方で、被膜形成分子より基板表面に対する
親和性の高い生体分子は基板表面に吸着させることができる。

基板表面は金属により構成されていることが好ましい。このような構成によれば、生体
分子にチオール基をつけておくことによって、当該生体分子を基板表面に容易に固定する
ことができる。

上述のように、生体分子をチオール基によって固定する場合は、被膜形成分子として、
カチオン性官能基および／またはアニオン性官能基を有する物質を用いることが好ましい
。そして、このような基板は、表面プラズモン共鳴法、水晶振動子法、若しくは電気化学
検出法に好適に用いられる。

本発明は、さらに、試料溶液中の標的分子を検出および／または定量するためのキット
であって、前記標的分子と特異的に結合するプローブ分子を固定して使用される基板と、
前記固相表面に対する親和性が前記プローブ分子より低い被膜形成分子と、を含むキット
をも包含する。このようなキットによれば、ユーザにおいて所望のプローブ分子を基板表
面に固定する際、予め基板表面に被膜を形成することによって、プローブ分子の固定作業
中に汚染物質が基板表面に付着するのを防ぐことができる。これによって、高感度に再現
性良く検出・定量を行うことができる。

また、本発明は、核酸における多型を検出するためのキットであって、前記多型を含む
可能性を有する領域にアニーリングし、その一端に電極結合部位を有するプライマーと、
ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬と、電極基板と、前記電極基板に対する親和性が前記
電極結合部位より低い被膜形成分子と、を含むキットをも提供する。このようなキットに
よれば、ユーザにおいて、予め電極表面に被膜を形成することによって、汚染物質の付着
によって妨げられることなく、電極結合部位を有するＰＣＲ産物を電極表面に固定するこ
とができる。これによって、高感度に再現性良く検出を行うことができる。

以下に、図面を参照して本発明の好ましい実施形態を詳細に説明する。
（第１の実施形態）

図１は、本発明に係る試料溶液中の標的分子を検出・定量する方法の一実施形態を示す
説明図である。まず、図１（Ａ）に示すように、基板１０の表面（固相表面）に、被膜形
成分子からなる被膜１２を形成する。被膜形成分子は、基板１０表面に非特異的に付着し
て被膜を形成でき、且つ、プローブ分子よりも基板１０表面に対する親和性が低く、プロ
ーブ分子の存在下ではプローブ分子の基板１０表面への吸着を妨げない、という条件を満
たす分子である限り、特に限定されず、種々の高分子化合物等を用いることができる。

バイオチップに頻繁に用いられるように、基板１０表面が金属により構成され、プロー
ブ分子がチオール基を有する場合、被膜形成分子としては、カチオン性官能基および／ま
たはアニオン性官能基を有する分子を用いることが好ましい。このような分子としては、
カチオン性ポリマー、アニオン性ポリマーのほか、ＤＮＡやタンパク質といった生体分子
も挙げられる。カチオン性ポリマーとしては、側鎖あるいは主鎖にアミノ基あるいはイミ
ノ基を有するポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン等の合成高分子
や、ポリオルニチン、ポリリジン等のポリアミノ酸、またはこれらの塩（塩酸塩等）を用
いることができる。一方、アニオン性ポリマーとしては、側鎖にカルボキシル基を有する
ポリカルボキシビニル、キサンタンガ、ポリアルギン酸等が用いられる。塩基部分にアミ
ノ基を、骨格部分にリン酸基を有するＤＮＡも本発明に被膜形成分子として好適である。

なお、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は非特異的な吸着の抑制に有効であり、上述
した高分子にＰＥＧ構造を含ませることにより吸着力の調整をすることも好ましい。

次に、図１（Ｂ）に示すように、被膜１２が形成された基板１０を、プローブ分子１４
を含む溶液１中に浸漬させる。プローブ分子１４は被膜１２よりも基板１０表面に対する
親和性が高く、被膜１２に取って代わって基板１０表面に吸着固定され、ＳＡＭ１８を形
成する。

続いて、図１（Ｃ）に示すように、プローブ分子１４が固定された基板１０表面を、標
的分子を含む可能性を有する試料溶液２と接触させる。図示されたように基板１０を溶液
２に浸漬させてもよいし、基板１０表面に試料溶液の液滴を配置してもよい。試料溶液２
中に標的分子２０が存在すれば、プローブ分子１４に特異的に結合し、基板１０表面に捕
捉される。プローブ分子１４に親和性を有しない分子２２は、溶液中に残る。

標的分子２０とプローブ分子１４との結合は、例えば、表面プラズモン共鳴法、水晶振
動子法、電気化学的検出法によって、検出・定量される。表面プラズモン共鳴法による場
合は、基板１０として表面に金薄膜が形成された透明基板が、水晶振動子法による場合は
、基板１０として水晶振動子が、電気化学的方法による場合は、基板１０として電極が用
いられる。
（第２の実施形態）

次に、上述した本発明に係る標的分子の検出・定量方法が好適に用いられるＳＮＰ（一
塩基多型）の検出方法を説明する。ＳＮＰとは、ＤＮＡの塩基配列に生じる多型のうち、
１つの塩基の置換によって起こる多型をいう。ＳＮＰの検出は、特定の疾患へのかかりや
すさや医薬品への反応に関する遺伝的な個人差を知る手がかりとなる。
＜ポリメラーゼ連鎖反応＞

ＳＮＰを検出するためには、まず、ＳＮＰが存在しうる部位を有するゲノムＤＮＡと、
上流プライマー及び下流プライマーからなる一対のプライマーと、Ｔａｑポリメラーゼと
、必要な成分を含む緩衝液と、ｄＮＴＰｓ（デオキシヌクレオチド三リン酸）を含む試料
溶液を調製する（詳細は下記参照）。この試料溶液に含まれる上流プライマー及び下流プ
ライマーのいずれか１種類のプライマーの末端にはチオール基（電極結合部位）が付加さ
れている。なお、以下の説明では下流プライマーの末端にチオール基が付加されている場
合を想定する。
試料溶液の組成
ｄＮＴＰｓ（終濃度０．２ｍＭ）
上流プライマー（終濃度１．０μＭ）
下流プライマー（２０塩基）（終濃度１．０μＭ）
１０×バッファー（終濃度１×バッファー）
Ｔａｑポリメラーゼ（終濃度２ｕｎｉｔ）
ゲノムＤＮＡ（終濃度０．１〜０．２μｇ）

試料溶液の調製後、当該試料溶液をＰＣＲ反応（各プライマーの伸長反応）が生じる条
件下におく。本実施形態では、各プライマーは、部位３０に変異を有しない場合のゲノム
ＤＮＡの塩基配列に相補的となるように構成されている。従って、部位３０にＳＮＰを有
するＤＮＡに対しては、当該プライマーはミスマッチを生じ、安定したハイブリダイゼー
ションを生じさせることができない。

図２は、ゲノムＤＮＡと各プライマーが相補的な場合（即ち、ＳＮＰを有しないゲノム
ＤＮＡを用いた場合）のＰＣＲ反応を説明するための図である。ＰＣＲ反応を生じさせる
ためには、以下に示す３段階の温度変化をｎ（例えば３０〜３５）サイクル繰り返し実行
する必要がある。具体的には、まず、図２（Ａ）および（Ｂ）に示すように、第１段階（
熱変性）の温度変化（例えば９４〜９６℃）によって標的となるＳＮＰ部位を含むゲノム
ＤＮＡ１００を熱変性し、一本鎖ＤＮＡ１１０、１２０を得る。ここで、一本鎖ＤＮＡ１
１０、１２０のうち、遺伝子情報を有するものをターゲットＤＮＡ１１０と呼び、遺伝子
情報を有しないものを相補鎖ＤＮＡ１２０と呼ぶ。

次に、図２（Ｃ）に示すように、第２段階（アニーリング）の温度変化（例えば５５〜
６０℃）によって上流プライマー１３０はターゲットＤＮＡ１１０にアニーリングし、末
端にチオール基１５０が付加された下流プライマー１４０は相補鎖ＤＮＡ１２０にアニー
リングする。そして、図２（Ｄ）に示すように、第３段階（伸長反応）の温度変化（例え
ば７２〜７４℃）によって上流プライマー１３０、下流プライマー１４０は共に伸長され
る。このようなサイクルがｎサイクル繰り返されることにより、ターゲットＤＮＡ１１０
、相補鎖ＤＮＡ１２０は共に２ⁿ倍に増幅される。

一方、図３は、ゲノムＤＮＡと両プライマーの少なくともいずれか一方が非相補的な場
合、即ち、部位３０にＳＮＰを有する場合のＰＣＲ反応を説明するための図である。なお
、本実施形態では、ゲノムＤＮＡと下流プライマーが非相補的な場合を説明するが、ゲノ
ムＤＮＡと上流プライマーが非相補的な場合も同様である。

まず、図３（Ａ）および（Ｂ）に示すように、第１段階の温度変化によって標的となる
ＳＮＰ部位３０を有するゲノムＤＮＡ１００を熱変性し、ターゲットＤＮＡ１１０、相補
鎖ＤＮＡ１２０を得る。次に、図３（Ｃ）に示すように、第２段階の温度変化によって、
ターゲットＤＮＡ１１０および相補鎖ＤＮＡ１２０にプライマーをアニーリングさせる。
ここで、上流プライマー１２０はターゲットＤＮＡ１１０にアニーリングするが、下流プ
ライマー１４０は端部においてミスマッチ（具体的には、図３（Ｃ）に示す下流プライマ
ー１４０の塩基「Ｇ」と相補鎖ＤＮＡ１２０の塩基「Ｔ」）が生じているため、相補鎖Ｄ
ＮＡ１２０に完全な形でアニーリングできない。

図３（Ｄ）に示すように、不完全なアニーリングの結果、第３段階の温度変化によって
上流プライマー１３０は伸長されるものの、下流プライマー１４０は伸長されない。この
ようなサイクルがｎサイクル繰り返されることにより、ターゲットＤＮＡ１１０は２ⁿ倍
に増幅される一方、相補鎖ＤＮＡ１２０は増幅されない。

以上の説明から明らかなように、ゲノムＤＮＡにＳＮＰが存在しない場合は両プライマ
ーが伸長されるが、ＳＮＰが存在する場合、チオール基１５０が付けられたプライマー１
４０は伸長されない。

従って、チオール基１５０が付けられたプライマー１４０の伸長の有無を検出すること
ができれば、ＳＮＰの有無を確認することができる。本実施形態では、表面に金薄膜が形
成された電極に、チオール基１５０を結合させ、プライマー１４０からなるＳＡＭを形成
し、インピーダンスを測定することによって、プライマー１４０の伸長の有無を検出する
。
＜被膜の形成＞

ＰＣＲ産物と電極とを接触させて、チオール基１５０を電極表面に結合させる前に、電
極表面に被膜を形成し、汚染物質（本実施形態では特にチオール基を有しない伸長された
プライマー１３０）の非特異的な付着を防ぐ。

被膜形成分子として、ここでは分子内にカチオン性官能基（アミノ基）およびアニオン
性官能基（リン酸基）を含むＤＮＡを用いる。被膜形成分子として用いるＤＮＡの長さは
、上記ＰＣＲ法に用いられるプライマーの１〜２倍程度の長さとすることが好ましい。こ
のような長さとすることにより、ＰＣＲ後の溶液に含まれる最も短いＤＮＡの付着も効果
的に妨げることができるのと同時に、チオール基１５０を有するＰＣＲ産物の電極表面へ
の吸着は妨げない。

被膜は、上述のような最適な長さのＤＮＡを含む溶液に電極を浸漬または接触させるこ
とによって形成することができる。
＜チオール基を有するプライマーの電極表面への結合＞

続いて、図４（Ａ）および図５（Ａ）に示すように、被膜Ｂを形成した電極Ａをインピ
ーダンス測定溶液中に浸漬させる。測定溶液の組成を以下に示す。
測定溶液の組成
ＰＢＳ（ｐＨ７．０）（５０ｍＭ）
ＮａＣｌ（１Ｍ）
ＭｇＣｌ₂ （１０ｍＭ）
まず、上記測定溶液１０ｍｌを調製した後、測定溶液に被膜Ｂを形成した電極基板Ａ（
本実施形態では電極面積３ｍｍ程度の金電極基板）を５分程度浸漬させる。

次に、図４（Ｂ）および図５（Ｂ）に示すように、電極Ａが浸漬された測定溶液中にＰ
ＣＲ反応終了後の試料溶液を投入し、チオール基により伸長された／またはされなかった
プライマーを電極表面に結合させる。

図４は、伸長反応が起きた試料溶液の場合、即ち、ＳＮＰが存在しない場合を示し、図
５は、伸長反応が起こらなかった場合、即ち、ＳＮＰが存在した場合を示す。

図４（Ｃ）および図５（Ｃ）に示すように、チオール基１５０を有する伸長された／ま
たはされなかったプライマー１４０のみが電極Ａの表面に吸着固定され、チオール基を有
しないＰＣＲ産物１３０は、被膜に妨げられて電極Ａの表面には付着せず、溶液中に残る
。
＜電気的測定＞

本実施形態では、図４および図５に示すように、上記結合の前後にわたって、電極基板
Ａに接続されたインピーダンス測定装置５０を利用してインピーダンスの容量成分Ｚ’’
（イマージナリーパート）を測定する。測定開始から５００秒経過後、測定溶液中に各試
料溶液（１μＭ、１００μｌ）を投入し（図４（Ｂ）、図５（Ｂ）参照）、３０００秒経
過するまでの間、１００Ｈｚで１０秒に１回の割合でインピーダンスの容量成分Ｚ’’の
測定を行う。

前述したように、チオール基１５０を有するプライマー１４０のみが電極基板Ａの表面
に固定化される。

図６は、インピーダンスの容量成分Ｚ’’の測定結果を示す図である。なお、図６では
伸長反応が起こった場合の測定結果を一点鎖線で示し、伸長反応が起こらなかった場合の
測定結果を点線で示している。また、比較のため、２０塩基長のオリゴＤＮＡを電極基板
に固定化し、上記と同じ条件でインピーダンスの容量成分Ｚ’’の測定（比較実験）を行
ったときの測定結果を太実線で示している。

図６に示すように、伸長反応が起こらなかった場合のインピーダンスの容量成分Ｚ’’
と伸長反応が起こった場合のインピーダンスの容量成分Ｚ’’は大きく異なっている。具
体的には、伸長反応が起こらなかった場合は比較実験とほぼ同様な結果が得られるのに対
し（図５に示す点線、太実線参照）、伸長反応が起こった場合は比較実験と大きく異なる
結果が得られる(図５に示す一点鎖線、太実線参照)。このように、得られるインピーダン
スの容量成分Ｚ’’の大きさを適宜比較することで、伸長反応が起こったか否か（ここで
は特定の塩基配列が存在するか否か）を精度良く検出することができる。

以上説明したように、上記方法によれば、チオール基１５０を有しないＰＣＲ産物等の
汚染物質が電極Ａ表面に非特異的に付着するのを妨げることができるので、伸長反応の有
無を高感度に再現性良く検出することができ、ＳＮＰタイピングに基づいた薬の投与とい
ったテーラーメイド医療に活用することができる。

また、本実施形態では、電極基板として金電極基板を使用したが、他の金属によって形
成された電極を用いても良い。かかる場合には、例えばアミノ基など、電極基板の種類等
に応じて固定化に必要な官能基（電極結合部位）をプライマーの末端に付加すれば良い。

また、本実施形態では、インピーダンスの容量成分Ｚ’’を測定（電気的測定）するこ
とで伸長反応が生じたか否か（ＳＮＰ部位に特定の塩基配列が存在するか否か）を検出し
たが、インピーダンスに限らず、電流測定（電気的測定）によって得られる電流値や電荷
量測定（電気的測定）によって得られる電荷量を比較することによって伸長反応が生じた
か否か等を検出するようにしても良い。なお、表面プラズモン共鳴法や水晶振動子法によ
って電極表面の屈折率変化や質量変化を捉えることでプライマー末端に伸張反応が生じた
か否かを検出することも可能であり、さらに、ＰＣＲ反応時に蛍光分子を取り込ませれば
蛍光観察によって伸長反応が生じたか否か等を光学的に検出することも可能である。
（第３の実施形態）

図７に本発明に係る第３の実施形態である、生体分子を固定して用いられる各種基板を
示す。図７（Ａ）は、表面プラズモン共鳴法に用いられる基板７００を示す概略断面図で
あり、ガラス等からなる光透過性基板７０の表面に金薄膜７２が形成され、さらに、被膜
形成分子からなる被膜７４が形成されている。基板７０に図中下方から光を照射すると金
薄膜７２により反射されるが、特定の角度から照射すると共鳴により反射されなくなる現
象が起こる。被膜により金薄膜７２に汚染物質が付着するのを妨げることができる一方、
被膜形成分子よりも金薄膜７２に対する親和性の高いプローブ分子は固定することができ
る。金薄膜７２にプローブ分子が固定され、さらに標的分子がプローブ分子に結合すると
、反射されなくなる入射角度（共鳴角度）が変化するので、この変化を測定することによ
り、結合の有無や結合した物質の質量を検出・測定することができる。

図７（Ｂ）は水晶振動子法に用いられる基板を示す概略断面図であり、水晶基板８０の
両面に一対の電極８２ａおよび８２ｂが対向して取り付けられ、電極８２ａおよび８２ｂ
の表面に被膜８４ａおよび８４ｂが形成されている。被膜８４ａおよび８４ｂにより、電
極８２ａおよび８２ｂに汚染物質が付着するのを妨げることができる一方、被膜形成分子
よりも電極８２ａおよび８２ｂに対する親和性の高いプローブ分子は固定することができ
る。電極表面にプローブ分子が固定され、さらに標的分子がプローブ分子に結合すると、
水晶振動子８０の振動数がその質量によって変化し、この変化を検出することによって、
結合の有無等を検出・測定することができる。

図７（Ｃ）は、電気化学的検出用基板９００の一例の概略を示す斜視図である。電気化
学的検出用基板９００は、複数の検出部位９０と、検出回路９２とを備えており、検出部
位９０にはカウンター電極および参照電極が備えられ、これらの電極がそれぞれ個別に検
出回路９２に電気的に接続されている。検出部位９０の表面は金属からなり、この表面に
それぞれ被膜が形成されている。被膜により、電極表面への汚染物質の付着を妨げること
ができる一方、皮膜形成分子よりも電極表面に親和性の高いプローブ分子は結合させるこ
とができる。電流、電荷量、インピーダンスの変化を検出して、プローブ分子の結合やプ
ローブ分子に対する標的分子の結合を検出・測定することが可能である。
（第４の実施形態）

本発明に係る第４の実施形態は、標的分子を検出および／または定量するためのキット
、および核酸における多型を検出するためのキットである。これらは上述した、第３の実
施形態における基板に被膜を形成される前のものと、被膜を形成するための被膜形成分子
とを含む。このようなキットによれば、ユーザにおいて、被膜形成分子を含む溶液を調製
し、これに、基板（電極基板を含む）を浸漬させることによって、容易にその表面に被膜
を形成することができる。被膜が形成された基板を用いれば、表面に汚染物質が付着する
のを防ぎ、プローブ分子等必要な分子のみを吸着固定させることが可能である。

本実施例では、カチオン性官能基を有する被膜形成物質により基板表面に被膜を形成し
、この被膜がチオール基を有する分子に置換されることを確認した。

まず、表面に金薄膜が形成された基板を、アミノ基を有する被膜形成分子として下記式
［１］に示すVeratrylamineを含む1mM水溶液に浸漬し、Veratrylamineによる被膜を形成
した。

このときのＩＲデータを図８に実線で示す。矢印１、２で示されるピークから、Veratr
ylamineによる被膜が形成されたことが確認された。

続いて、同基板をプローブ分子のモデルとして、チオール基を有するＰＥＧを含む1mM
水溶液に30分浸漬させた。ＰＥＧは非特異的な吸着をおこしにくく、水溶性の原子団であ
るためモデルとして適している。チオール基を有するＰＥＧとしては、ＨＯ−（ＣＨ₂−
ＣＨ₂−Ｏ）₇−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＳＨを用いた。

図８に、浸漬後30分のＩＲデータを点線で、示す。また、参考のために、チオール基を
有するＰＥＧによる皮膜のＩＲデータを一点鎖線で示す。浸漬30分後のＩＲデータでは、
Veratrylamineを示すピークが小さくなり、代わって、ＰＥＧを示すピーク（矢印３、４
）が出現することが確認され、Veratrylamineによる被膜がＰＥＧに置換されることが示
された。

本実施例では、アニオン性官能基を有する被膜形成物質により基板表面に被膜を形成し
、この被膜がチオール基を有する分子に置換されることを確認した。

まず、表面に金薄膜が形成された基板を、アニオン基を有する被膜形成分子として酢酸
（ＣＨ₃ＣＯＯＨ）を含む5％水溶液に15分浸漬し、被膜を形成した。

このときのＩＲデータを図９に一点鎖線で示す。矢印５、６で示されるピークから、酢
酸による被膜が形成されたことが確認された。

図９に、浸漬後30分のＩＲデータを実線で示す。また、参考のために、チオール基を有
するＰＥＧによる皮膜のＩＲデータを一点鎖線で示す。浸漬30分後のＩＲデータでは、酢
酸を示すピークが小さくなり、代わって、ＰＥＧを示すピーク（矢印７）が出現すること
が確認され、酢酸による被膜がＰＥＧに置換されることが示された。

本発明に係る標的分子の検出・定量方法の一実施形態を示す説明図である。本発明に係る多型検出法のためのＰＣＲ反応を説明する図である。本発明に係る多型検出法のためのＰＣＲ反応を説明する図である。本発明に係る多型検出法の電気的測定を示す説明図である。本発明に係る多型検出法の電気的測定を示す説明図である。本発明に係る多型検出法の測定結果の一例を示す図である。本発明に係る基板の例を示す概略図である。カチオン性官能基を有する被膜を、チオール基を有する分子で置換したことを示す測定結果である。アニオン性官能基を有する被膜を、チオール基を有する分子で置換したことを示す測定結果である。

符号の説明

１…プローブ分子を含む液体、２…試料溶液、１０…基板、１２…被膜、１４…プロー
ブ分子、１８…プローブ分子によるＳＡＭ、２０…標的分子、３０…多型が存在する可能
性を有する部位、１１０、１２０…一本鎖ＤＮＡ、１３０、１４０…プローブ、１５０…
チオール基、５０…インピーダンス測定装置、７００…表面プラズモン共鳴用基板、８０
０…水晶振動子用基板、９００…電気化学測定用基板

Claims

標的分子を含む可能性を有する試料溶液と、該標的分子と特異的に結合するプローブ分
子が固定された固相表面と、を接触させて、試料溶液中の標的分子を検出および／または
定量する方法であって、
前記固相表面に、該固相表面に対する親和性が前記プローブ分子より低い被膜形成分子
からなる被膜を形成する工程と、
前記固相表面と、前記プローブ分子を含む液体とを接触させ、前記プローブ分子を前記
被膜形成分子と置換させ、固定する工程と、
前記試料溶液と、前記プローブ分子が固定された前記固相表面とを接触させる工程と、
前記プローブ分子に結合した物質を検出および／または定量する工程と、を含む方法。
前記プローブ分子が、核酸またはタンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載
の方法。
前記固相表面が金属からなり、前記プローブ分子がチオール基、モノスルフィド基、ま
たはジスルフィド基を有することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
前記被膜形成分子が、カチオン性官能基および／またはアニオン性官能基を有すること
を特徴とする、請求項３に記載の方法。
前記被膜形成分子が、核酸またはタンパク質であることを特徴とする、請求項４に記載
の方法。
前記検出および／または定量が、表面プラズモン共鳴法、水晶振動子法、または電気化
学検出法によって行われることを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載の方
法。
核酸における多型を検出する方法であって、
一端に測定用基板に結合可能な基板結合部位を有するプライマーであって、前記多型を
含む可能性を有する領域にアニーリング可能なプライマーを使用する方法であり、
前記核酸と、前記プライマーとを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う第１工程と、
前記ポリメラーゼ連鎖反応産物の基板結合部位と前記測定用基板とを結合させる第２工
程と、
前記測定用基板に結合した前記プライマーの伸長反応の有無を測定することによって、
多型の有無を検出する第３工程と、を含み、
前記第２工程に先立って、前記測定用基板表面に対する親和性が前記基板結合部位より
低い被膜形成分子からなる被膜を形成する、方法。
前記第３工程における測定が、表面プラズモン共鳴法、水晶振動子法、または電気化学
検出法によって行われることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
前記基板が電極基板である、請求項７または８に記載の方法。
生体分子をその表面に固定して用いられる、表面プラズモン共鳴法用、水晶振動子法用
、または電気化学検出法用の基板であって、
前記基板表面に、前記基板表面に対する親和性が前記生体分子より低い被膜形成分子か
らなる被膜が形成されている基板。
前記基板表面が金属からなることを特徴とする、請求項１０に記載の基板。
前記被膜形成分子が、カチオン性官能基および／またはアニオン性官能基を有すること
を特徴とする、請求項１１に記載の方法。
試料溶液中の標的分子を検出および／または定量するためのキットであって、
前記標的分子と特異的に結合するプローブ分子を固定して使用される基板と、
前記固相表面に対する親和性が前記プローブ分子より低い被膜形成分子と、を含むキッ
ト。
核酸における多型を検出するためのキットであって、
前記多型を含む可能性を有する領域にアニーリングし、その一端に電極結合部位を有す
るプライマーと、
ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬と、
電極基板と、
前記電極基板に対する親和性が前記電極結合部位より低い被膜形成分子と、を含むキッ
ト。