JP2023526322A - 病原体を検出するためのデバイスおよびアッセイ - Google Patents
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Abstract
本発明は、病原体の検出のためのデバイスおよびアッセイを提供する。本発明は、ウイルス核酸、抗原、および抗体に基づくウイルス検出および感染性疾患診断のためのラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）検査ストリッププラットフォームを提供する。上記検査ストリップは、ウイルス検出、特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはＣＯＶＩＤ－１９診断に関する使用が主に意図されるが、任意の他のウイルスおよび病原体、ならびに関連疾患を検出するためにそれを拡げ得る。
Description
本出願は、２０２０年５月１５日出願の米国仮特許出願第６３／０２５９１４号（その開示全体は、本明細書に参考として援用される）の優先権を主張する。別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似または等価な方法および材料が、本開示の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料が以下で記載される。その材料、方法、および例は、例証に過ぎず、限定であることは意図されない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許および他の文書は、それらの全体において参考として援用される。
分野
本発明の実施形態は、ラテラルフローデバイスを使用する生体分子検出に関する。
本発明の実施形態は、ラテラルフローデバイスを使用する生体分子検出に関する。
発明の背景
２０１９年１２月の中国、武漢におけるその最初のアウトブレイク以来、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、全世界で４００万人超の人々に感染し、結果的に、２０２０年５月１５日当時でＣＯＶＩＤ－１９が原因で３０００００人超が死亡した。ＰＣＲベースの核酸検査は、その感度に起因して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ための第１選択肢であった１。しかし、それは、高度に訓練された技術スタッフ、精巧な装置（米国ドルで２００００～５００００ドルのコスト）、およびある特定の施設を要求する。ＰＣＲ検査プロトコールはまた、複雑であり、これは、大きな集中診断検査室に主に適している。それは、代表的には、検査を完了するのに４～６時間かかるが、臨床サンプルを輸送する物流要件は、その所要時間がよくても２４時間であることを意味する２。これらの要因は、より長い所要時間、人件費、資本および消耗品、ならびに臨床サンプルを取り扱う際の持ち越し汚染およびバイオセーフティーの両方のリスクに寄与する。他に、ＰＣＲ単独では、上記疾患の感染性を効果的に決定できない。
２０１９年１２月の中国、武漢におけるその最初のアウトブレイク以来、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、全世界で４００万人超の人々に感染し、結果的に、２０２０年５月１５日当時でＣＯＶＩＤ－１９が原因で３０００００人超が死亡した。ＰＣＲベースの核酸検査は、その感度に起因して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ための第１選択肢であった１。しかし、それは、高度に訓練された技術スタッフ、精巧な装置（米国ドルで２００００～５００００ドルのコスト）、およびある特定の施設を要求する。ＰＣＲ検査プロトコールはまた、複雑であり、これは、大きな集中診断検査室に主に適している。それは、代表的には、検査を完了するのに４～６時間かかるが、臨床サンプルを輸送する物流要件は、その所要時間がよくても２４時間であることを意味する２。これらの要因は、より長い所要時間、人件費、資本および消耗品、ならびに臨床サンプルを取り扱う際の持ち越し汚染およびバイオセーフティーの両方のリスクに寄与する。他に、ＰＣＲ単独では、上記疾患の感染性を効果的に決定できない。
ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックのまっただ中に、多くのラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗体３， ４、ウイルスＲＮＡ５， ６、および抗原７の迅速検出に適用されている。ＬＦＡは、多くの利点： 低コスト、使用しやすさ、迅速現場応答、および視覚的読み取りを有する疾患検出に関するクロマトグラフィー技術である８。ＬＦＡは、迅速な結果を達成することが期待されることから特に有用であり、それらを臨床現場即時（ＰＯＣ）適用に理想的にしている。不運なことに、現在のＬＦＡベースの検査は、黄金律のＥＬＩＳＡと比較して、不満足な結果を生じた（これは、これらの製品の単純な表面化学現象に原因があるとされ得る）。
ＬＦＡは概して、カートリッジの中に組み立てられた検査ストリップで実施される。図１に示されるように、上記検査ストリップは、サンプルを載せるためのサンプルパッド、標識された親和性プローブを貯蔵するための結合体パッド、分子の相互作用が起こる場所である反応基材（代表的には、薄いニトロセルロース膜）、および廃棄物吸収のための吸収パッドからなる。上記サンプルパッド上に緩衝溶液を添加すると、毛細管力が、分析物を、上記基材を通過して上記吸収パッドに向かって流れるように駆動する。標的分子は、比色読み取りのために、シグナル伝達部分（例えば、金ナノ粒子）に結合された第２の親和性プローブとのサンドイッチ構造を形成するために、親和性プローブによって上記検査ラインの中で捕捉される。コントロールラインがまた、品質検査を確実にするために、検査ストリップの中に組み入れられることに注意のこと。ＬＦＡの成功は、上記親和性試薬が、反応基材および金ナノ粒子上でどのようにして固定化されるかに大きく依存する。通常は、従来のＬＦＡに関しては、親和性プローブ（例えば、抗体）は、ニトロセルロース表面にスポットされる。それは、ファン・デル・ワールス力、水素結合、または疎水性相互作用のような非共有結合的相互作用を介する物理的吸着によって接着する。物理的吸着に伴う主な課題は、それらの吸着された分子が表面から解離し得る９かまたはサンプル溶液からの分子によって容易に取って代わられ得る（ブローマン効果）１０ことである。これらの効果は、検出感度を低減し、製品信頼性の問題を引き起こす。ウイルスＲＮＡの検出のために、ＤＮＡ捕捉プローブは、通常はビオチン化され、ニトロセルロース（ＮＣ）膜表面上に物理的に吸着されたストレプトアビジンに結合される１１。この方法が、ストレプトアビジン分子の物理的吸着になお依拠することから、それは、上記で記載される同じ制限を受ける。あるいは、ＤＮＡプローブは、ＵＶ架橋を通じて、表面上に固定化され得る１２。しかし、このプロセスは、ランダムなプローブ配向をなお生じ、これは、上記プローブが、標的にハイブリダイゼーションしないように効果的に防止し、低減した検出感度を導き得る。全世界でのコロナウイルスパンデミックの経過に起因して、高感度かつ高特異度を有する信頼性の高い迅速ＬＦＡ検査製品が差し迫って必要である。
ＬＦＡは概して、カートリッジの中に組み立てられた検査ストリップで実施される。図１に示されるように、上記検査ストリップは、サンプルを載せるためのサンプルパッド、標識された親和性プローブを貯蔵するための結合体パッド、分子の相互作用が起こる場所である反応基材（代表的には、薄いニトロセルロース膜）、および廃棄物吸収のための吸収パッドからなる。上記サンプルパッド上に緩衝溶液を添加すると、毛細管力が、分析物を、上記基材を通過して上記吸収パッドに向かって流れるように駆動する。標的分子は、比色読み取りのために、シグナル伝達部分（例えば、金ナノ粒子）に結合された第２の親和性プローブとのサンドイッチ構造を形成するために、親和性プローブによって上記検査ラインの中で捕捉される。コントロールラインがまた、品質検査を確実にするために、検査ストリップの中に組み入れられることに注意のこと。ＬＦＡの成功は、上記親和性試薬が、反応基材および金ナノ粒子上でどのようにして固定化されるかに大きく依存する。通常は、従来のＬＦＡに関しては、親和性プローブ（例えば、抗体）は、ニトロセルロース表面にスポットされる。それは、ファン・デル・ワールス力、水素結合、または疎水性相互作用のような非共有結合的相互作用を介する物理的吸着によって接着する。物理的吸着に伴う主な課題は、それらの吸着された分子が表面から解離し得る９かまたはサンプル溶液からの分子によって容易に取って代わられ得る（ブローマン効果）１０ことである。これらの効果は、検出感度を低減し、製品信頼性の問題を引き起こす。ウイルスＲＮＡの検出のために、ＤＮＡ捕捉プローブは、通常はビオチン化され、ニトロセルロース（ＮＣ）膜表面上に物理的に吸着されたストレプトアビジンに結合される１１。この方法が、ストレプトアビジン分子の物理的吸着になお依拠することから、それは、上記で記載される同じ制限を受ける。あるいは、ＤＮＡプローブは、ＵＶ架橋を通じて、表面上に固定化され得る１２。しかし、このプロセスは、ランダムなプローブ配向をなお生じ、これは、上記プローブが、標的にハイブリダイゼーションしないように効果的に防止し、低減した検出感度を導き得る。全世界でのコロナウイルスパンデミックの経過に起因して、高感度かつ高特異度を有する信頼性の高い迅速ＬＦＡ検査製品が差し迫って必要である。
Gudbjartsson, D. F.; Helgason, A.; Jonsson, H.; Magnusson, O. T.; Melsted, P.; Norddahl, G. L.; Saemundsdottir, J.; Sigurdsson, A.; Sulem, P.; Agustsdottir, A. B.; Eiriksdottir, B.; Fridriksdottir, R.; Gardarsdottir, E. E.; Georgsson, G.; Gretarsdottir, O. S.; Gudmundsson, K. R.; Gunnarsdottir, T. R.; Gylfason, A.; Holm, H.; Jensson, B. O.; Jonasdottir, A.; Jonsson, F.; Josefsdottir, K. S.; Kristjansson, T.; Magnusdottir, D. N.; le Roux, L.; Sigmundsdottir, G.; Sveinbjornsson, G.; Sveinsdottir, K. E.; Sveinsdottir, M.; Thorarensen, E. A.; Thorbjornsson, B.; Loeve, A.; Masson, G.; Jonsdottir, I.; Moeller, A. D.; Gudnason, T.; Kristinsson, K. G.; Thorsteinsdottir, U.; Stefansson, K., Spread of SARS-CoV-2 in the Icelandic Population. New England Journal of Medicine 2020.
Sheridan, C., Fast, portable tests come online to curb coronavirus pandemic. Nature Biotechnology 2020, 38, 509-522.
Adams, E. R.; Anand, R.; Andersson, M. I.; Auckland, K.; Baillie, J. K.; Barnes, E.; Bell, J.; Berry, T.; Bibi, S.; Carroll, M.; Chinnakannan, S.; Clutterbuck, E.; Cornall, R. J.; Crook, D. W.; De Silva, T.; Dejnirattisai, W.; Dingle, K. E.; Dold, C.; Eyre, D. W.; Farmer, H.; Hoosdally, S. J.; Hunter, A.; Jeffrey, K.; Klenerman, P.; Knight, J.; Knowles, C.; Kwok, A. J.; Leuschner, U.; Liu, C.; Lopez-Camacho, C.; Matthews, P. C.; McGivern, H.; Mentzer, A. J.; Milton, J.; Mongkolsapaya, J.; Moore, S. C.; Oliveira, M. S.; Pereira, F.; Peto, T.; Ploeg, R. J.; Pollard, A.; Prince, T.; Roberts, D. J.; Rudkin, J. K.; Screaton, G. R.; Semple, M. G.; Skelly, D. T.; Smith, E. N.; Staves, J.; Stuart, D.; Supasa, P.; Surik, T.; Tsang, P.; Turtle, L.; Walker, A. S.; Wang, B.; Washington, C.; Watkins, N.; Whitehouse, J.; Beer, S.; Levin, R.; Espinosa, A.; Georgiou, D.; Martinez Garrido, J. C.; Thraves, H.; Perez Lopez, E.; del Rocio Fernandez Mendoza, M.; Sobrino Diaz, A. J.; Sanchez, V., Evaluation of antibody testing for SARS-Cov-2 using ELISA and lateral flow immunoassays. medRxiv 2020, 2020.04.15.20066407.
Whitman, J. D.; Hiatt, J.; Mowery, C. T.; Shy, B. R.; Yu, R.; Yamamoto, T. N.; Rathore, U.; Goldgof, G. M.; Whitty, C.; Woo, J. M.; Gallman, A. E.; Miller, T. E.; Levine, A. G.; Nguyen, D. N.; Bapat, S. P.; Balcerek, J.; Bylsma, S. A.; Lyons, A. M.; Li, S.; Wong, A. W.-y.; Gillis-Buck, E. M.; Steinhart, Z. B.; Lee, Y.; Apathy, R.; Lipke, M. J.; Smith, J. A.; Zheng, T.; Boothby, I. C.; Isaza, E.; Chan, J.; II, D. D. A.; Lee, J.; Macrae, T. A.; Kyaw, T. S.; Wu, D.; Ng, D. L.; Gu, W.; York, V. A.; Eskandarian, H. A.; Callaway, P. C.; Warrier, L.; Moreno, M. E.; Levan, J.; Torres, L.; Farrington, L. A.; Loudermilk, R.; Koshal, K.; Zorn, K. C.; Garcia-Beltran, W. F.; Yang, D.; Astudillo, M. G.; Bernstein, B. E.; Gelfand, J. A.; Ryan, E. T.; Charles, R. C.; Iafrate, A. J.; Lennerz, J. K.; Miller, S.; Chiu, C. Y.; Stramer, S. L.; Wilson, M. R.; Manglik, A.; Ye, C. J.; Krogan, N. J.; Anderson, M. S.; Cyster, J. G.; Ernst, J. D.; Wu, A. H. B.; Lynch, K. L.; Bern, C.; Hsu, P. D.; Marson, A., Test performance evaluation of SARS-CoV-2 serological assays. 2020.
Broughton, J. P.; Deng, X.; Yu, G.; Fasching, C. L.; Servellita, V.; Singh, J.; Miao, X.; Streithorst, J. A.; Granados, A.; Sotomayor-Gonzalez, A.; Zorn, K.; Gopez, A.; Hsu, E.; Gu, W.; Miller, S.; Pan, C.-Y.; Guevara, H.; Wadford, D. A.; Chen, J. S.; Chiu, C. Y., CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nature Biotechnology 2020.
Rauch, J. N.; Valois, E.; Solley, S. C.; Braig, F.; Lach, R. S.; Baxter, N. J.; Kosik, K. S.; Arias, C.; Acosta-Alvear, D.; Wilson, M. Z., A Scalable, Easy-to-Deploy, Protocol for Cas13-Based Detection of SARS-CoV-2 Genetic Material. bioRxiv 2020, 2020.04.20.052159.
Vandenberg, O., Development and potential usefulness of the COVID-19 Ag Respi-Strip diagnostic assay in a pandemic context. medRxiv 2020, 2020.04.24.20077776.
Bahadir, E. B.; Sezgintuerk, M. K., Lateral flow assays: Principles, designs and labels. TrAC Trends in Analytical Chemistry 2016, 82, 286-306.
Holstein, C. A.; Keniston, K.; Fu, E.; Chevalier, A.; Olsen, C.; Baker, D.; Yager, P.; Bennett, S.; Li, B., Immobilizing affinity proteins to nitrocellulose: a toolbox for paper-based assay developers. Anal Bioanal Chem 2015.
Hirsh, S. L.; McKenzie, D. R.; Nosworthy, N. J.; Denman, J. A.; Sezerman, O. U.; Bilek, M. M., The Vroman effect: competitive protein exchange with dynamic multilayer protein aggregates. Colloids Surf B Biointerfaces 2013, 103, 395-404.
Gao, X.; Xu, H.; Baloda, M.; Gurung, A. S.; Xu, L. P.; Wang, T.; Zhang, X.; Liu, G., Visual detection of microRNA with lateral flow nucleic acid biosensor. Biosens Bioelectron 2014, 54, 578-84.
Rohrman, B. A.; Leautaud, V.; Molyneux, E.; Richards-Kortum, R. R., A Lateral Flow Assay for Quantitative Detection of Amplified HIV-1 RNA. PLOS ONE 2012, 7, e45611.
発明の要旨
本発明は、ウイルス核酸、抗原、および抗体に基づくウイルス検出および感染性疾患診断のためのラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）検査ストリッププラットフォームを提供する。上記検査ストリップは、ウイルス検出、特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはＣＯＶＩＤ－１９診断に関する使用が主に意図されるが、任意の他のウイルスおよび病原体、ならびに関連疾患を検出するためにそれを拡げ得る。これらを念頭に置くことによって、以下の実施形態は、例としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを検出することによって本発明を示す。
本発明は、ウイルス核酸、抗原、および抗体に基づくウイルス検出および感染性疾患診断のためのラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）検査ストリッププラットフォームを提供する。上記検査ストリップは、ウイルス検出、特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはＣＯＶＩＤ－１９診断に関する使用が主に意図されるが、任意の他のウイルスおよび病原体、ならびに関連疾患を検出するためにそれを拡げ得る。これらを念頭に置くことによって、以下の実施形態は、例としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを検出することによって本発明を示す。
本発明は、ＬＦＡ検査ストリップにおいてヒドロゲルポリマーを有する検査ラインを製作する方法に関する。図２に示されるように、各検査ラインは、ラテラルフロー検査ストリップにおいてポリマーを有する。これは、親和性分子とその同族との相互作用のために生物学的に優しい環境を提供する。ヒドロゲルポリマーは、化学的結合および物理的拘束によって、親和性分子の固定化を可能にし、親和性分子が表面から解離するリスク（これは、旧来の物理的吸着の大きな欠点である）を低減する。ヒドロゲルポリマーはまた、上記親和性分子が表面上に所定の配向で固定化することを可能にし、それらを標的分子とより効果的に相互作用させる、すなわち高感度を可能にする。
いくつかの実施形態において、本発明は、フォトリソグラフィーによって検査ストリップ上にヒドロゲルポリマー埋め込み検査ラインを製作するプロセスを提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、コロナウイルスを検出するために、ヒドロゲルポリマーパターンが形成されたラテラルフロー検査ストリップを利用するための例を提供する。ストレプトアビジンは、検査ラインまたはコントロールラインに結合した親和性分子の固定化を改善するために、ヒドロゲルの中に埋め込まれる。いくつかの実施形態において、本発明は、小さな非特異的ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓに由来するｓｓｏ７ｄ）へと遺伝的に融合させたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉに由来するストレプトアビジンからなる融合タンパク質を提供する。上記融合タンパク質は、さらに良好な固定化効果が理由で、ヒドロゲルの中に埋め込まれたストレプトアビジンの代わりに使用され得る。
詳細な説明
１つの実施形態において、本発明は、ニトロセルロース（ＮＣ）膜においてポリアクリルアミドヒドロゲルラインを製作するためのフォトリソグラフィープロセスを提供する。図３Ａで図示されるように、パターンが形成されたスペーサーは、先ず、ＮＣ膜上に配置され、続いて、アクリルアミドおよびビスアクリルアミドに光開始剤を加えた混合溶液の薄いフィルムでコーティングされる。ここでビスアクリルアミドの比は、約０％～１０％、好ましくは≦５％、最も好ましくは約≦１％であり；上記光開始剤は、全アクリルアミドの約０．０１％～１０％、好ましくは０．１％～１％である。上記フィルムを、フォトマスクを用いてＵＶ光によって底から照射して、ポリアクリルアミドヒドロゲルライン（またはパッド）を所定の位置に形成する。完了後に、上記ポリアクリルアミドを、アルデヒドおよびケトン官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を含む生体分子を結合させるために、ヒドラジンによって活性化し得る１３。同じようにして、上記ポリアクリルアミドヒドロゲルラインを製作して、Ｎ－アクリルオキシスクシンイミドを上述の溶液に添加することによってＮＨＳエステルを含め得る。従って、アミノ官能化生体分子が、上記ヒドロゲルラインに結合され得る。
１つの実施形態において、本発明は、ニトロセルロース（ＮＣ）膜においてポリアクリルアミドヒドロゲルラインを製作するためのフォトリソグラフィープロセスを提供する。図３Ａで図示されるように、パターンが形成されたスペーサーは、先ず、ＮＣ膜上に配置され、続いて、アクリルアミドおよびビスアクリルアミドに光開始剤を加えた混合溶液の薄いフィルムでコーティングされる。ここでビスアクリルアミドの比は、約０％～１０％、好ましくは≦５％、最も好ましくは約≦１％であり；上記光開始剤は、全アクリルアミドの約０．０１％～１０％、好ましくは０．１％～１％である。上記フィルムを、フォトマスクを用いてＵＶ光によって底から照射して、ポリアクリルアミドヒドロゲルライン（またはパッド）を所定の位置に形成する。完了後に、上記ポリアクリルアミドを、アルデヒドおよびケトン官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を含む生体分子を結合させるために、ヒドラジンによって活性化し得る１３。同じようにして、上記ポリアクリルアミドヒドロゲルラインを製作して、Ｎ－アクリルオキシスクシンイミドを上述の溶液に添加することによってＮＨＳエステルを含め得る。従って、アミノ官能化生体分子が、上記ヒドロゲルラインに結合され得る。
別の実施形態において、ヒドロゲルモノマーおよび光開始剤（例えば、上記の実施形態で言及されるもの）の混合溶液は、上記ヒドロゲルラインまたはパッドを形成するためにフォトマスクがＵＶ照射に必要とされないように十分に制御された様式で、ＮＣ基材上にプリントされる。
いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルポリマーラインは、上記ＮＣ膜上に直接プリントまたはスポットされ、上記ヒドロゲル重合は、光開始剤以外の化学物質（例えば、ポリアクリルアミドヒドロゲルのための過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）およびテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ））によって開始されるか、または化学開始剤の代わりに加熱することによって開始される（例えば、アガロースヒドロゲル）。
いくつかの他の実施形態において、上記ＬＦＡの膜は、酢酸セルロース、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）、電荷改変ナイロンおよびポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、繊維、またはウィッキングまたは毛細管流動効果を引き起こし得る他の多孔性材料を含む。
１つの実施形態において、本発明は、図３Ｂに図示されるように、ノズル式ディスペンサーを使用して、上記ヒドロゲルラインに親和性分子をプリントする方法を提供する。上記生体分子は、化学反応を通じて、共有結合によるか、または共有結合的によらないかのいずれかで、表面に結合される。
いくつかの実施形態において、本発明は、ウイルス核酸を検出する方法を提供する。図４は、ライゲーション－ローリングサークル増幅（ＬＲＣＡ）アッセイを使用してウイルスＲＮＡを検出するためのアッセイを示す。サーマルサイクリングの反復を要するＰＣＲとは異なり、ＲＣＡは、等温性の、室温ベースの増幅技術である。近年の進歩によって、ＲＣＡの検出限界は１０ａＭ未満になった１４。ウイルスＲＮＡを検出するために、パッドロックプローブは、先ず、そのＲＮＡ標的にハイブリダイズされ、次いで、ＤＮＡもしくはＲＮＡリガーゼのいずれかによって環状物へとライゲーションされる（図４Ａ）。ヌクレアーゼによって直線状ＤＮＡを消化した後に、上記環状ＤＮＡは、例えば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼによって、キロ塩基の長さを有するＤＮＡコンカテマーを生成するためにテンプレートとして使用される。ＬＦＡに関して、上記パッドロックは、２つのバーコードＢ１およびＢ２を有するように設計され（図４Ｂ）、これらバーコードは、ＬＲＣＡからの生成物を認識するために設計される。Ｐ１は、コントロールラインにおいて金ナノ粒子に結合体化されるように、ＤＮＡポリメラーゼのプライマーおよびシグナルプローブとして使用され得る。上記パッドロックベースの方法はまた、ＲＮＡの多重検出を可能にする１５。
いくつかの実施形態において、本発明は、ライゲーションの効率を改善するために、ユニバーサル塩基を上記パッドロックプローブに、ニック部位の近位において導入する。ユニバーサル塩基は、天然に存在する核塩基と無差別に塩基対を形成し得る。例えば、ユニバーサル塩基である３－ニトロピロールは、ライゲーション連鎖反応（ｌｉｇａｔｉｏｎ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＰＣＲ）の信頼性および速度を増大させる１６。それは、ＰＣＲおよびＳａｎｇｅｒ配列決定プライマーにおいて使用されており、９個までのユニバーサル塩基が、Ｓａｎｇｅｒ配列決定のための１７塩基のプライマーにおいて使用された１７。
いくつかの実施形態において、上記ユニバーサル塩基は、異なるサンプルからのウイルスの改変体に対して高感度を有するようにアッセイを維持するために、標的中で変異が高頻度で起こる部位に近いその位置で、上記パッドロックプローブの中に配置される。
１つの実施形態において、本発明は、上記ヒドロゲルポリマー検査ストリップ上でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を検出するためにＤＮＡ－金ナノボールを提供する。図５Ａに示されるように、上記ナノボールは、多数のＤＮＡプローブ各々で標識された金ナノ粒子と複合体化しているＤＮＡコンカテマーから構成される（これは、文献１８中で報告される手順を使用して、ＬＲＣＡによって調製され得る）。
いくつかの実施形態において、本発明は、ヒドロゲルパターンが形成された検査ストリップ上でウイルス抗原を検出するためのアッセイを提供する。図５Ｂに示されるように、ＬＦＡは、一次抗体（抗スパイク＃２）を上記検査ラインに固定化することで始まり、二次抗体（抗スパイク＃１）は、上記ナノボールの金ナノ粒子に結合されたＤＮＡに相補的なＤＮＡプローブで標識され、上記結合体パッドに予め装填される。患者ぬぐい液のウイルスサンプルは、サンプルパッドへと添加され、次いで、ナノボール溶液で展開される。上記ウイルスは、先ず、結合体パッドへと移動して、抗スパイク＃１と複合体を形成し、次いで、検査ライン上の項スパイク＃２によって捕捉する。その間に、上記ナノボールは移動し、検査ライン上の項スパイク＃１と相互作用して、ウイルスの存在のシグナルを発する。
１つの実施形態において、本発明は、それらの固定化よび結合のために抗体を改変する方法を提供する。図６は、抗体を改変するプロセスを示す。第１に、上記抗体を、過ヨウ素酸ナトリウムで酸化して、そのＦｃドメインにおいてアルデヒド基を作製する。それは、酸化された抗体がヒドラジン活性化ポリアクリルアミドと容易に反応することを可能にする。上記酸化された抗体を、ＤＮＡへの結合体化のためにシクロオクチンでさらに官能化する（図６）。上記抗体ＢＣＮ－Ａｂは、アジド官能化ＤＮＡと自発的に反応する。
いくつかの実施形態において、本発明は、金ナノ粒子上に混合単層を形成して、非特異的吸着を防止する方法を提供する。図７は、これらの化学試薬の構造を示す。ＰＥＧ－アジド－１は、分子結合のためのリンカーとして機能し、ＰＥＧ－２は、非特異的吸着を防止するために金表面上に炭層を形成する１９。
いくつかの実施形態において、本発明は、ヒドロゲルポリマーパターンが形成された検査ストリップ上で抗ウイルス抗体を検出するアッセイを提供する。図８に示されるように、ＬＦＡは、抗原を検査ラインに固定化し、金ナノ粒子で標識した抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を結合体パッドに載せることで始まる。抗ウイルス抗体を含む患者の血清サンプルを、サンプルパッドに添加し、次いで、追跡緩衝液（ｃｈａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ）で展開する。上記抗ウイルス抗体を、先ず、結合体パッドに移動して、抗ヒトＩｇＧ抗体と複合体を形成し、次いで、検査ライン上の抗原によって捕捉する。陽性結果に関しては、検査ラインが光る。
いくつかの実施形態において、ストレプトアビジンは、上述の条件下で、ストレプトアビジンを含むアクリルアミド溶液を光重合することによって上記ラインの中に含まれる。次に、ビオチン化された親和性分子は、標的化分子を検出するために、ＬＦＡのための正確な位置で堆積される。
他の実施形態において、上記のストレプトアビジンは、光重合のために、小さなＤＮＡ結合タンパク質（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓに由来するｓｓｏ７ｄ）との遺伝的融合物（リスト１）として発現される。
総説：
本発明は、種々の実施形態の記載によって例証されており、これらの実施形態はかなり詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲の範囲をこのような詳細に制限する、または何らかの方法で限定することは、出願人の意図ではない。
さらなる利点および改変は、当業者に容易に明らかである。従って、その広い局面にある本発明は、特定の詳細、代表的な装置および方法、ならびに示されかつ記載される例証的な例に限定されない。よって、出願人の包括的な発明の概念の趣旨または範囲から逸脱することなく、このような詳細からの逸脱は行われ得る。
本発明は、種々の実施形態の記載によって例証されており、これらの実施形態はかなり詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲の範囲をこのような詳細に制限する、または何らかの方法で限定することは、出願人の意図ではない。
さらなる利点および改変は、当業者に容易に明らかである。従って、その広い局面にある本発明は、特定の詳細、代表的な装置および方法、ならびに示されかつ記載される例証的な例に限定されない。よって、出願人の包括的な発明の概念の趣旨または範囲から逸脱することなく、このような詳細からの逸脱は行われ得る。
Claims (48)
- 分析物の検出または同定のためのシステムであって、前記システムは、ラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）検査ストリップを含み、ここで前記検査ストリップは、１またはこれより多くの検査ラインおよび１またはこれより多くのコントロールラインを含み、ここで前記検査ラインまたはコントロールラインのうちの少なくとも１つは、ヒドロゲルパターンを含む、システム。
- 前記検査ストリップは、基材、サンプルパッド、プローブ結合体パッド、検出パッド、および吸収パッドを含み、ここで前記検出パッドは、前記検査ラインおよび前記コントロールラインを含み、前記パッドの各々は、ウィッキング材を含む、請求項１に記載のシステム。
- 前記ウィッキング材は、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）、電荷改変ナイロン、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ガラス繊維、多孔性材料、繊維性材料、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２に記載のシステム。
- ａ．前記分析物を捕捉するように構成された前記結合体パッド上の第１の親和性プローブ；
ｂ．結合体化された前記分析物を捕捉するように構成された前記検査ライン上の第２の親和性プローブ；および
ｃ．前記第１の親和性プローブを捕捉するように構成された前記コントロールライン上の第３の親和性プローブ、
をさらに含む、請求項２に記載のシステム。 - カートリッジをさらに含み、ここで前記検査ストリップは、前記カートリッジの中に組み立てられるかまたは封入される、請求項１に記載のシステム。
- 前記分析物は、ウイルス起原もしくは細菌起源またはこれらの組み合わせのいずれかの病原体または前記病原体の構成要素を含む、請求項１に記載のシステム。
- 前記分析物は、核酸、ウイルスもしくは細菌のＲＮＡもしくはＤＮＡのフラグメント、タンパク質、抗体、抗原、炭水化物、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される生体分子である、請求項１に記載のシステム。
- 前記ヒドロゲルパターンが形成されたラインは、フォトリソグラフィーによって製作されるか、または前記検査ストリップ上にプリントもしくはスポットされる、請求項１に記載のシステム。
- 前記親和性プローブは、天然の、合成されたか、または改変されたかのいずれかの、核酸、オリゴ、タンパク質、ペプチド、抗体、抗原、炭水化物、抗原、炭水化物、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される生体分子である、請求項４に記載のシステム。
- 前記第１の親和性プローブは、金ナノ粒子に、共有結合によるか、または共有結合的によらないかのいずれかで結合される、請求項４に記載のシステム。
- 前記金ナノ粒子は、ＰＥＧ分子の単層によって覆われる、請求項１０に記載のシステム。
- 前記第１の親和性プローブは、前記金ナノ粒子にリンカーを介して結合され、ここで前記リンカーは、ＰＥＧ分子を含む、請求項１０に記載のシステム。
- 前記抗体は、過ヨウ素酸ナトリウムおよびＢＣＮで改変される、請求項９に記載のシステム。
- 前記ヒドロゲルパターンが形成されたラインは、ポリ（アクリルアミド）またはポリ（ビスアクリルアミド）またはこれらの組み合わせから作製される、請求項１に記載のシステム。
- 前記ヒドロゲルパターンが形成されたラインは、ＮＨＳエステルを含む、請求項１４に記載のシステム。
- 前記ヒドロゲルパターンが形成されたラインは、天然の、合成されたか、または改変されたかのいずれかの、ストレプトアビジンもしくは融合タンパク質またはこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載のシステム。
- 前記融合タンパク質は、小さな非特異的ＤＮＡ結合タンパク質に融合されたストレプトアビジンを含む、請求項１６に記載のシステム。
- 各検査ラインまたは各コントロールラインは、親和性プローブで官能化され、ここで前記親和性プローブは、天然の、合成されたか、または改変されたかのいずれかの、核酸、オリゴ、タンパク質、ペプチド、抗体、抗原、炭水化物、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される生体分子である、請求項１に記載のシステム。
- 前記分析物は、比色読み取りによって特定される、請求項１に記載のシステム。
- 前記分析物は、ウイルスＲＮＡであり、パッドロックプローブに基づいて、ライゲーション－ローリングサークル増幅（ＬＲＣＡ）によって増幅される、請求項１に記載のシステム。
- 前記パッドロックプローブは、ユニバーサル塩基を含めることによって改変される、請求項２０に記載のシステム。
- 前記ユニバーサル塩基は、３－ニトロピロールを含む、請求項２１に記載のシステム。
- 分析物の検出または特定のための方法であって、前記方法は、ラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）検査ストリップを作製する工程であって、ここで前記検査ストリップは、１またはこれより多くの検査ラインおよび１またはこれより多くのコントロールラインを含み、ここで前記検査ラインまたはコントロールラインのうちの少なくとも１つは、ヒドロゲルパターンを含む工程を包含する方法。
- ａ．基材を提供する工程；
ｂ．サンプルパッドを提供する工程；
ｃ．プローブ結合体パッドを提供する工程；
ｄ．検出パッドを提供する工程；および
ｅ．吸収パッドを提供する工程、
を包含し；
ここで前記検出パッドは、前記検査ラインおよび前記コントロールラインを含み、前述のパッドの各々は、ウィッキング材を含む、請求項２３に記載の方法。 - 前記ウィッキング材は、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）、電荷改変ナイロン、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ガラス繊維、他の多孔性または繊維性材料、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
- ａ．前記結合体パッド上に第１の親和性プローブを堆積させる工程；
ｂ．前記検査ライン上に第２の親和性プローブを堆積させる工程；および
ｃ．前記コントロールライン上に第３の親和性プローブを堆積させる工程、
をさらに包含する、請求項２３に記載の方法。 - カートリッジを提供する工程をさらに包含し、ここで前記検査ストリップは、前記カートリッジの中に組み立てられるかまたは封入される、請求項２３に記載の方法。
- 前記分析物は、ウイルス起原もしくは細菌起源のいずれかの病原体または前記病原体の構成要素を含み、ここで前記構成要素は、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはタンパク質もしくは炭水化物分子またはこれらの組み合わせのいずれかを含む、請求項２３に記載の方法。
- 前記分析物は、核酸、タンパク質、抗体、抗原、炭水化物分子およびこれらの組み合わせからなる群より選択される生体分子を含む、請求項２３に記載の方法。
- 前記ヒドロゲルパターンが形成されたラインは、以下の工程：
ａ．パターンが形成されたスペーサーを提供し、前記分析物検出領域において前記膜と接触させる工程；
ｂ．アクリルアミドおよびビスアクリルアミドモノマー、ならびに光開始剤を含む溶液を提供する工程；
ｃ．前記パターンが形成されたスペーサーを前記溶液でコーティングする工程；ならびに
ｄ．ＵＶ照射をフォトマスクに印加して、パターンが形成されたポリアクリルアミドヒドロゲルラインを形成する工程、
を包含するフォトリソグラフィープロセスによって、前記検査ストリップの前記分析物検出領域上の所定の位置に製作される、請求項２３に記載の方法。 - 前記溶液は、パターンが形成されたスペーサーを使用せずに、前記膜上にプリントされるかまたはスポットされ、前記ＵＶ照射は、フォトマスクを使用せずに印加される、請求項３０に記載の方法。
- 前記溶液中のビスアクリルアミドの比は、約０％～１０％、好ましくは≦１％であり、前記光開始剤の比は、約０．０１％～１０％、好ましくは０．１％～１％である、請求項３０に記載の方法。
- 前記溶液は、Ｎ－アクリルオキシスクシンイミドをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
- 前記ポリアクリルアミドヒドロゲルをヒドラジンによって活性化する工程をさらに包含する、請求項３０に記載の方法。
- 前記溶液中の光開始剤は、化学開始剤によって置換され、前記ＵＶ照射は、前記パターンが形成されたポリアクリルアミドヒドロゲルラインの形成のために、化学反応または加熱によって置換される、請求項３１に記載の方法。
- 前記化学開始剤は、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）もしくはテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）またはこれらの組み合わせである、請求項３５に記載の方法。
- 前記親和性プローブは、天然の、合成されたか、または改変されたかのいずれかの、核酸、オリゴ、タンパク質、ペプチド、抗体、抗原、炭水化物分子、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される生体分子である、請求項２６に記載の方法。
- 前記第１の親和性プローブは、金ナノ粒子に、共有結合によるか、または共有結合的によらないかのいずれかで結合される、請求項２６に記載の方法。
- 前記金ナノ粒子は、ＰＥＧ分子の単層によって覆われる、請求項３８に記載の方法。
- 前記第１の親和性プローブは、前記金ナノ粒子にリンカーを介して結合され、ここで前記リンカーは、ＰＥＧ分子を含む、請求項３８に記載の方法。
- 前記抗体は、過ヨウ素酸ナトリウムおよびＢＣＮで改変される、請求項３７に記載の方法。
- 前記ヒドロゲルパターンが形成されたラインは、天然の、合成されたか、または改変されたかのいずれかの、ストレプトアビジンもしくは融合タンパク質またはこれらの組み合わせを含む、請求項２３に記載の方法。
- 前記融合タンパク質は、小さな非特異的ＤＮＡ結合タンパク質に融合されたストレプトアビジンを含む、請求項４２に記載の方法。
- 前記検査ラインおよびコントロールラインは各々、親和性プローブで官能化され、ここで前記親和性プローブは、天然の、合成されたか、または改変されたかのいずれかの、核酸、オリゴ、タンパク質、ペプチド、抗体、抗原、炭水化物分子、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される生体分子を含む、請求項２３に記載の方法。
- 前記分析物は、比色読み取りによって特定される、請求項２３に記載の方法。
- 前記分析物は、ウイルスＲＮＡであり、パッドロックプローブに基づいて、ライゲーション－ローリングサークル増幅（ＬＲＣＡ）によって増幅される、請求項２３に記載の方法。
- 前記パッドロックプローブは、ユニバーサル塩基を含めることによって改変される、請求項４６に記載の方法。
- 前記ユニバーサル塩基は、３－ニトロピロールを含む、請求項４６に記載の方法。
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