KR102222191B1 - 돌연변이체 기공 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 CsgG의 돌연변이체 형태에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CsgG를 사용한 분석물질 검출 및 규명에 관한 것이다.
Description
본 발명은 CsgG의 돌연변이체 형태에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CsgG를 사용한 분석물질 검출 및 규명에 관한 것이다.
나노기공 센싱은 분석물질 분자와 수용체 사이의 개별적인 결합 또는 상호작용 사건의 관찰에 의존하는 센싱에 대한 접근법이다. 나노기공 센서는 절연막에서 나노미터 치수의 단일 기공을 배치하고, 분석물질 분자의 존재 하에 기공을 통한 전압 추진된 이온 수송을 측정함으로써 생성될 수 있다. 분석물질의 정체는 이의 구별되는 전류 서명, 특히 전류 블록의 기간 및 정도 및 전류 수준의 변동을 통해 밝혀졌다. 이러한 나노기공 센서, 예컨대 전자 칩으로 집적된 나노기공의 어레이를 포함하는, Oxford Nanopore Technologies Ltd에 의해 판매되는 MinION(상표명) 장치는 상업적으로 구입 가능하다.
넓은 범위의 분야에 걸쳐 신속하고 싼 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA) 서열분석 기술에 대한 수요가 현재 존재한다. 기존의 기술은 주로 많은 용적의 핵산을 생성하는 증폭 기법에 의존하고, 신호 검출을 위해 전문가 형광성 화학물질의 높은 분량을 요하므로 느리고 비싸다. 나노기공 센싱은 필요한 시약 및 뉴클레오타이드의 분량을 감소시킴으로써 신속하고 싼 핵산 서열분석을 제공할 가능성을 갖는다.
나노기공 센싱을 사용한 핵산을 서열분석하는 필수 성분 중 2개는 (1) 기공을 통한 핵산 이동의 제어 및 (2) 핵산 중합체가 기공을 통해 이동하면서 뉴클레오타이드의 구별이다. 과거에, 뉴클레오타이드 구별을 달성하기 위해, 핵산은 헤몰리신의 돌연변이체를 통해 통과하였다. 이것은 서열 의존적인 것으로 밝혀진 전류 서명을 제공한다. 헤몰리신 기공이 사용될 때 다수의 뉴클레오타이드가 관찰된 전류에 기여하여서, 관찰된 전류와 폴리뉴클레오타이드 도전과제 사이에 직접적인 관계를 만드는 것으로 또한 밝혀졌다.
뉴클레오타이드 구별을 위한 전류 범위가 헤몰리신 기공의 돌연변이를 통해 개선되지만, 뉴클레오타이드 사이의 전류 차이가 추가로 개선될 수 있는 경우 서열분석 시스템은 더 높은 성능을 가질 것이다. 게다가, 핵산이 기공을 통해 이동할 때, 몇몇 전류 상태가 높은 변동을 보인다는 것이 관찰되었다. 몇몇 돌연변이체 헤몰리신 기공이 다른 것보다 더 높은 변동을 나타낸다는 것이 또한 밝혀졌다. 이 상태의 변동이 서열 특이적 정보를 함유할 수 있지만, 시스템을 단순화하기 위해 낮은 변동을 갖는 기공을 제조하는 것이 바람직하다. 관찰된 전류에 기여하는 뉴클레오타이드의 수를 감소시키는 것이 또한 바람직하다.
본 발명자들은 놀랍게도 CsgG 및 이의 신규한 돌연변이체가 분석물질, 예컨대 폴리뉴클레오타이드를 규명하기 위해 사용될 수 있다는 것을 입증하였다. 본 발명은 돌연변이체 CsgG 단량체에 관한 것이다. 본 발명자들은 놀랍게도 신규한 돌연변이체 단량체를 포함하는 기공이 분석물질, 예컨대 폴리뉴클레오타이드의 서열의 특징을 예측하는 증대된 능력을 갖는다는 것을 입증하였다. 돌연변이체 기공은 놀랍게도 기공과 관련한, 예컨대 이를 통한 표적 폴리뉴클레오타이드의 더 일관된 이동을 제공한다. 돌연변이체 기공은 놀랍게도 개선된 규명 정확성을 나타낸다. 특히, 돌연변이체 기공은 놀랍게도 증가한 전류 범위(상이한 뉴클레오타이드 사이를 구별하는 것이 더 쉽게 함), 및 감소한 상태 변동(신호 대 노이즈 비율을 증가시킴)을 나타낸다. 게다가, 돌연변이체 기공은 놀랍게도 뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드를 더 쉽게 포획한다.
본 명세서에 개시된 모든 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가는, 반대로 설명되지 않는 한, 서열 번호 2에 기재된 서열의 변이체를 포함하는 돌연변이체 CsgG 단량체에 참조된다.
서열 번호 2에 기재된 서열의 변이체를 포함하는 돌연변이체 CsgG 단량체에 대한 언급은 하기 개시된 바대로 추가의 서열 번호에 기재된 바와 같은 서열의 변이체를 포함하는 돌연변이체 CsgG 단량체를 포함한다. 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가는, 서열 번호 2에 기재된 서열의 변이체를 포함하는 돌연변이체 CsgG 단량체를 참조하여, 본 명세서에 개시된 치환, 결실 및/또는 부가와 동등한 서열 번호 2에 기재된 것과 이외의 서열의 변이체를 포함하는 CsgG 단량체에 이루어질 수 있다.
돌연변이체 단량체는 단리된 단량체로서 고려될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 192번 위치에서의 아르기닌(R)이 아스파르트산(D), 글루타민(Q), 페닐알라닌(F), 세린(S) 또는 트레오닌(T)에 의해 치환된 돌연변이체 CsgG 단량체에 관한 것이다. 본 발명자들은 놀랍게도 이러한 단량체, 특히 R192D 치환을 포함하는 단량체가 192번 위치에서의 치환이 없는 단량체보다 발현시키기에 훨씬 더 쉽다는 것을 입증하였다.
일 실시형태에서, 본 발명은 94번 위치에서의 라이신(K)이 아스파르트산(N), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W), 류신(L) 또는 세린(S)에 의해 치환된 돌연변이체 CsgG 단량체에 관한 것이다. 본 발명자들은 놀랍게도 이러한 단량체, 특히 K94Q 또는 K94N 치환을 포함하는 단량체가 94번 위치에서의 라이신을 포함하는 달리 동일한 돌연변이체보다 덜 노이지하다는 것을 입증하였다.
따라서, 본 발명은 서열 번호 2에 기재된 서열의 변이체를 포함하는 돌연변이체 CsgG 단량체를 제공하고, 변이체는 (a) K94N/Q/R/F/Y/W/L/S, D43S, E44S, F48S/N/Q/Y/W/I/V/H/R/K, Q87N/R/K, N91K/R, K94N/Q/R/F/Y/W/L/S/N, R97F/Y/W/V/I/K/S/Q/H, E101I/L/A/H, N102K/Q/L/I/V/S/H, R110F/G/N, Q114R/K, R142Q/S, T150Y/A/V/L/S/Q/N, R192D/Q/F/S/T 및 D248S/N/Q/K/R의 하나 이상; 및/또는 (b) I41, R93, A98, Q100, G103, T104, A106, I107, N108, L113, S115, T117, Y130, K135, E170, S208, D233, D238, E244, Q42, E44, L90, N91, I95, A99, E101 및 Q114의 위치에서의 하나 이상의 돌연변이(즉, 이들 위치 중 하나 이상에서의 돌연변이)를 포함한다.
본 발명은 또한 서열 번호 2에 기재된 서열의 변이체를 포함하는 돌연변이체 CsgG 단량체를 제공하고, 변이체는 (a) R192, F193, I194, D195, Y196, Q197, R198, L199, L200 및 E201 위치의 하나 이상의 결실 및/또는 (b) V139/G140/D149/T150/V186/Q187/V204/G205, G137/G138/Q151/Y152/Y184/E185/Y206/T207 및 A141/R142/G147/A148/A188/G189/G202/E203의 하나 이상의 결실을 포함한다.
돌연변이체 CsgG 단량체는 서열 번호 2에 기재된 서열의 변이체를 포함할 수 있고, 변이체는 (a) K94Q, F191T 및 R192D/Q/F/S/T/N/E의 하나 이상; 및/또는 (b) V105, A106 및 I107의 결실을 포함한다.
돌연변이체 CsgG 단량체는 하기일 수 있다:
- R97W를 포함하는, 서열 번호 2에 기재된 서열의 변이체를 포함하는 돌연변이체 CsgG 단량체;
- R192D/Q/F/S/T를 포함하는, 서열 번호 2에 기재된 서열의 변이체를 포함하는 돌연변이체 CsgG 단량체;
- (a) R192D; (b) R97W/Y 및/또는 R93W/Y, 바람직하게는 R97W, R93W 또는 R93Y 및 R97Y; (c) K94Q/N; (d) G103K/R 및/또는 T104K/R; 및/또는 (e) F191T, V105, A106 및 I107의 결실 및/또는 F193, I194, D195, Y196, Q197, R198 및 L199의 결실을 포함하는, 돌연변이체 CsgG 단량체.
돌연변이체 CsgG 단량체는 바람직하게는 Y51A 및 F56Q를 추가로 포함한다.
본 발명에 의해 제공된 특정한 돌연변이체 CsgG 단량체는 하기 돌연변이를 포함하는 서열 번호 2에 기재된 서열의 변이체를 포함한다:
(1) Y51A, F56Q 및 R192D;
(2) Y51A, F56Q 및 R97W;
(3) Y51A, F56Q, R192D 및 R97W;
(4) Y51A, F56Q, R192D 및 R93W;
(5) Y51A, F56Q, R192D, R93Y 및 R97Y; 또는
(6) Y51A, F56Q, R192D 및 R93W;
(7) (1) 내지 (6) 중 임의의 하나의 돌연변이; 및
(a) V105, A106 및 I107의 결실;
(b) K94Q 또는 K94N;
(c) D195, Y196, Q197, R198 및 L199의 결실 또는 F193, I194, D195, Y196, Q197, R198 및 L199의 결실; 및/또는
(d) F191T.
(8) (1) 내지 (6) 중 임의의 하나의 돌연변이; 및
(ⅰ) K94Q 및 V105, A106 및 I107의 결실;
(ⅱ) K94N 및 V105, A106 및 I107의 결실;
(ⅲ) F191T 및 V105, A106 및 I107의 결실;
(ⅳ) K94Q 및 F191T;
(ⅴ) K94N 및 F191T;
(ⅵ) K94Q, F191T 및 V105, A106 및 I107의 결실; 또는
(ⅶ) K94N, F191T 및 V105, A106 및 I107의 결실.
(9) (1) 내지 (8) 중 임의의 하나의 돌연변이; 및
- T104K 또는 T104R;
- L90R;
- N91R;
- I95R;
- A99R;
- E101K, E101N, E101Q, E101T 또는 E101H;
- E44N 또는 E44Q; 및/또는
- Q42K.
본 발명은 또한 하기를 제공한다:
- 2개 이상의 공유 결합으로 부착된 CsgG 단량체를 포함하는 작제물(여기서, 단량체 중 적어도 하나는 본 발명의 돌연변이체 단량체임);
- 본 발명의 돌연변이체 단량체 또는 본 발명의 작제물을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드;
- 본 발명의 동일한 돌연변이체 단량체 또는 본 발명의 동일한 작제물을 포함하는 CsgG로부터 유래된 동종올리고머 기공;
- 적어도 하나의 본 발명의 돌연변이체 단량체 또는 적어도 하나의 본 발명의 작제물을 포함하는 CsgG로부터 유래된 이종올리고머 기공;
- 하기를 포함하는, 표적 분석물질의 존재, 부재 또는 하나 이상의 특징을 결정하는 방법:
(a) 표적 분석물질이 기공과 관련하여 이동하도록 표적 분석물질을 본 발명의 기공과 접촉시키는 단계; 및
(b) 분석물질이 기공과 관련하여 이동하면서 하나 이상의 측정을 하고, 이로써 분석물질의 존재, 부재 또는 하나 이상의 특징을 결정하는 단계;
- 본 발명의 기공과 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질 사이에 복합체를 형성하고, 이로써 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하기 위한 센서를 형성하는 단계를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하기 위한 센서를 형성하는 방법;
- 본 발명의 기공과 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질 사이의 복합체를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하기 위한 센서;
- 표적 분석물질의 존재, 부재 또는 하나 이상의 특징을 결정하기 위한 본 발명의 기공의 용도;
- (a) 본 발명의 기공 및 (b) 막의 성분을 포함하는, 표적 분석물질을 규명하기 위한 키트;
- (a) 복수의 본 발명의 기공 및 (b) 복수의 막을 포함하는, 샘플에서 표적 분석물질을 규명하기 위한 장치;
- 하기를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하는 방법:
a) 포스페이트 표지된 종이 중합효소에 의해 표적 폴리뉴클레오타이드에 순차적으로 첨가되도록 폴리뉴클레오타이드를 본 발명의 기공, 중합효소 및 표지된 뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계(여기서, 포스페이트 종은 각각의 뉴클레오타이드에 특이적인 라벨을 함유함); 및
b) 기공을 사용하여 포스페이트 표지된 종을 검출하고, 이로써 폴리뉴클레오타이드를 규명하는 단계; 및
- 적합한 숙주 세포에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 발현시키고, 이로써 본 발명의 돌연변이체 단량체 또는 작제물을 제조하는 단계를 포함하는, 본 발명의 돌연변이체 단량체 또는 본 발명의 작제물을 제조하는 방법.
도 1: 이. 콜라이로부터의 CsgG를 예시한다.
도 2: CsgG의 치수를 예시한다.
도 3: 10Å/ns에서의 단일 G 전좌를 예시한다. CsgG-Eco에서의 F56 고리로의 구아닌의 진입을 위한 큰 장벽이 있다. * = G는 F56 고리에 들어간다. A = G는 56 고리와의 상호작용을 중단시킨다. B = G는 55 고리와의 상호작용을 중단시킨다. C = G는 51 고리와의 상호작용을 중단시킨다.
도 4: 100Å/ns에서의 ssDNA 전좌를 예시한다. CsgG-Eco에 대한 수축을 통해 DNA를 당기기 위해 더 큰 힘이 필요하다.
도 5: 10Å/ns에서의 ss DNA 전좌를 예시한다. CsgG-F56A-N55S 및 CsG-F56A-N55S-Y51A 돌연변이체 둘 다는 ssDNA 전좌에 대해 더 낮은 장벽을 갖는다.
도 6 내지 8: 야생형(WT)과 비교된 증가한 범위를 보여주는 돌연변이체 기공.
도 9 및 도 10: 야생형(WT)과 비교된 증가한 처리량을 보여주는 돌연변이체 기공.
도 11 및 도 12: 야생형(WT)과 비교된 증가한 삽입을 보여주는 돌연변이체 기공.
도 13: 실시예 2에서 사용된 DNA 작제물 X를 보여준다. 1 표지된 영역은 30개의 SpC3 스페이서에 상응한다. 2 표지된 영역은 서열 번호 42에 상응한다. 3 표지된 영역은 4개의 iSp18 스페이서에 상응한다. 4 표지된 영역은 서열 번호 43에 상응한다. 5 표지된 부문은 4개의 5-나이트로인돌에 상응한다. 6 표지된 영역은 서열 번호 44에 상응한다. 7 표지된 영역은 서열 번호 45에 상응한다. 8 표지된 영역은 서열 번호 46의 3' 말단에서 부착된 4개의 iSp18 스페이서(9 표지된 영역)를 갖는 서열 번호 46에 상응한다. iSp18 스페이서의 반대의 말단에서 3' 콜레스테롤 테터(10 표지)가 있다. 11 표지된 영역은 4개의 SpC3 스페이서에 상응한다.
도 14: CsgG 단백질의 Strep trap(GE Healthcare) 정제의 크로마토그래피 트레이스의 예를 보여준다(x-축 라벨 = 용리 용적(㎖), Y-축 라벨 = 흡광도(mAu)). 샘플을 25mM 트리스, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 0.01% DDM 중에 로딩하고, 10mM 데스티오바이오틴에 의해 용리시켰다. CsgG 단백질이 용리된 용리 피크는 E1로 표지된다.
도 15: 초기 strep 정제 후 CsgG 단백질의 통상적인 SDS-PAGE 가시화의 예를 보여준다. 4-20% TGX 겔(Bio Rad)을 1X TGS 완충제 중에 300V에서 22분 동안 실행하였다. 겔을 Sypro Ruby 염색에 의해 염색하였다. 레인 1 내지 3은 화살표로 표시된 바대로 CsgG 단백질을 함유하는 주요 용리 피크(도 14에서 E1 표지)를 보여주다. 레인 4 내지 6은 오염물질을 함유하는 주요 용리 피크(도 14에서 E1 표지)의 꼬리의 용리 분획에 상응한다. M은 비염색된 Novex Sharp(단위 = kD)인 사용된 분자량 마커를 보여준다.
도 16: CsgG 단백질의 크기 배제 크로마토그램(SEC)의 예를 보여준다(120㎖ S200 GE healthcare, x-축 라벨 = 용리 용적(㎖), y-축 라벨 = 흡광도(mAu)). SEC를 strep 정제 및 단백질 샘플의 가열 후 수행하였다. SEC에 대한 실행 완충제는 25mM 트리스, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 0.01% DDM, 0.1% SDS, pH 8.0이고, 가열을 1㎖/분 속도에서 실행하였다. X 표지된 트레이스는 220㎚에서의 흡광도를 보여주고, Y 표지된 트레이스는 280㎚에서의 흡광도를 보여준다. 별로 표지된 피크를 수집하였다.
도 17: SEC 후 CsgG 단백질의 통상적인 SDS-PAGE 가시화의 예를 보여준다. 4-20% TGX 겔(Bio Rad)을 1X TGS 완충제 중에 300V에서 22분 동안 실행하고, 겔을 Sypro Ruby 염색에 의해 염색하였다. 레인 1은 정제 및 가열 후 그러나 SEC 전 CsgG 단백질 샘플을 보여준다. 레인 2 내지 8은 도 16의 대략 48㎖ 내지 60㎖(중간 피크 = 55㎖)를 실행하는 피크에 걸쳐 수집되고, 도 16에서 별로 표시된 분획을 보여준다. M은 비염색된 Novex Sharp(단위 = kD)인 사용된 분자량 마커를 보여준다. CsgG-Eco 기공에 상응하는 막대는 화살표로 표시된다.
도 18 내지 24: 야생형(WT)과 비교된 증가한 범위를 보여주는 돌연변이체 기공.
도 25 내지 30: 야생형(WT)과 비교된 증가한 범위를 보여주는 돌연변이체 기공.
도 31은, 모의(실행 1 내지 3) 동안 0 및 20ns에서 취한, 기공(CsgG-Eco-(Y51T/F56Q)-StrepII(C))9(돌연변이 Y51T/F56Q를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단 기공 돌연변이체 20호에서 부착됨))의 상부에서 효소(T4 Dda-(E94C/C109A/C136A/A360C)(돌연변이 E94C/C109A/C136A/A360C 및 이후 (ΔM1)G1G2를 갖는 서열 번호 24))의 스냅샷을 보여준다.
도 32는, 모의(실행 1 내지 3) 동안 30 및 40ns에서 취한, 기공(CsgG-Eco-(Y51T/F56Q)-StrepII(C))9(돌연변이 Y51T/F56Q를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단 기공 돌연변이체 20호에서 부착됨))의 상부에서 효소(T4 Dda-(E94C/C109A/C136A/A360C)(돌연변이 E94C/C109A/C136A/A360C 및 이후 (ΔM1)G1G2를 갖는 서열 번호 24))의 스냅샷을 보여준다.
도 33은, 실시예 5에 기재된 모의 동안 취한, 기공(CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W)-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97W를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단 기공 돌연변이체 26호에서 부착됨))의 상부에서 효소(T4 Dda-(E94C/F98W/C109A/C136A/K194L/A360C)(돌연변이 E94C/F98W/C109A/C136A/K194L/A360C 및 이후 (ΔM1)G1G2를 갖는 서열 번호 24)의 스냅샷을 보여준다.
도 34는, 효소의 제어 없이, MspA 돌연변이체 x = MspA -((Del-L74/G75/D118/L119)D56F/E59R/L88N/D90N/D91N/Q126R/D134R/E139K)8(돌연변이 D56F/E59R/L88N/D90N/D91N/Q126R/D134R/E139K 및 아미노산 L74/G75/D118/L119의 결실을 갖는 서열 번호 50)을 통한 DNA(서열 번호 51)의 전좌를 보여주는 전류 트레이스의 2개의 10개의 제2 스크린 샷을 보여준다.
도 35는, 효소의 제어 없이, CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W/R192D-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97W/R192D를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)를 통한 DNA(서열 번호 51)의 전좌를 보여주는 전류 트레이스의 2개의 10개의 제2 스크린 샷을 보여준다.
도 36은, 효소의 제어 없이, CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W/E101S/R192D-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97W/E101S/R192D를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)를 통한 DNA(서열 번호 51)의 전좌를 보여주는 전류 트레이스의 2개의 10개의 제2 스크린 샷을 보여준다.
도 37은 CsgG 돌연변이체 기공 A) CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W)-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97W를 가지는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨) 및 B) CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W/R192D)-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97W/R192D를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)의 2개의 겔 여과 크로마토그램(120㎖ S200 칼럼)의 오버레이를 보여준다. CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W)-StrepII(C))9에 대한 A280에서의 흡광도는 A 표지되고, CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W/R192D)-StrepII(C))9에 대한 것은 B 표지된다. 작제물 둘 다를 500㎖ 배양물 중에 성장시켰다. 단백질 둘 다의 발현 및 정제를 정확하게 동일한 프로토콜을 이용하여 수행하고, 동일한 용적을 칼럼에 로딩하였다. 실행 완충제는 25mM 트리스, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 0.01% DDM, 0.1% SDS(pH 8)이었다. CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W)-StrepII(C))9 기공에 의한 부분 지연은 AKTA Purifier 10에서 사용된 상이한 연결 구성으로 인했다. 흡광도 값의 차이는 더 높은 흡광도 값으로 표시된 단백질의 양을 나타내고, 이는 발현된 단백질의 더 높은 양을 나타낸다.
도 38은 CsgG 나노기공의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. 레인 A 내지 C는 CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W)-StrepII(C))9를 함유하고, 레인 D 내지 F는 CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W/R192D)-StrepII(C))9를 함유하고, 레인 M은 분자량 마커를 함유하였다. 2개의 기공은 정확하게 동일한 프로토콜을 이용하여 발현되고 정제되었다. 기공을 22분 동안 300V에서 TGS 완충제 중의 4 내지 20% TGX 겔(Bio rad 카탈로그 5671093호)에서 전기천공으로 처리하였다. 겔을 Sypro Ruby 염색(Life Technologies 카탈로그 S1200호)에 의해 가시화하였다. 각각의 기공 샘플으로부터의 동일한 용적을 겔에 로딩하여 정제 후 얻은 단백질의 양을 비교하였다 - 레인 A 및 D는 5㎕를 함유하고, 레인 B 및 E는 10㎕를 함유하고, 레인 C 및 F는 15㎕를 함유하였다.
도 39는 돌연변이체 28(CsgG-(WT-Y51A/F56Q/R97W/R192D-StrepII)9)인 기준 기공의 베이스콜(basecall) 정확성과 비교하여 8개의 CsgG 돌연변이체 기공의 베이스콜 정확성을 보여준다. D195-L199의 결실(돌연변이체 A), F193-L199의 결실(돌연변이체 B) 또는 V105-I107(돌연변이체 D)의 결실, 또는 F191T의 치환(돌연변이체 C)은 돌연변이체 28에서의 R97W 및 R192D 치환으로부터 생긴 정확성의 개선 이외에 정확성의 추가의 개선을 발생시킨다. V105-I107의 결실의 베이스콜 정확성에 대한 효과를 또한 추가 K94Q 돌연변이를 함유하는 돌연변이체 기공(돌연변이체 E)에서 시험하고, 기준 돌연변이체 28과 비교된 정확성의 개선이 여전히 관찰되었다. R97W 돌연변이(기준 돌연변이체 28) 대신에 R93W 돌연변이(돌연변이체 F) 또는 R93Y 및 R97W 돌연변이(돌연변이체 H) 둘 다를 도입하는 것은 베이스콜 정확성을 증가시켰다. R93W(돌연변이체 G) 이외에 D195-L199의 결실은 베이스콜 정확성의 증대를 발생시켰다.
도 40은 기준 돌연변이체 28 CsgG-(WT-Y51A/F56Q/R97W/R192D-StrepII)9 및 V105-I107의 추가 결실을 포함하는 돌연변이체 D의 주형 속도 분포(a) 및 주형 정확성 분포(b)를 보여준다. 주형 DNA를 제조하고, 실시예에 기재된 바대로 돌연변이체 기공을 통해 통과시켰다. 주형 속도 및 정확성을 실시예에 기재된 바대로 결정하였다. 도 40a는 기준 돌연변이체와 비교하여 돌연변이체 D를 사용할 때 속도 분포가 더 치밀하다는 것을 보여준다. 도 40b는 돌연변이체 D가 기준 돌연변이체와 비교하여 주형 정확성의 더 치밀한 분포를 갖는다는 것을 보여준다.
도 41은 기준 돌연변이체 28 CsgG-(WT-Y51A/F56Q/R97W/R192D-StrepII)9에 의해 나타난 "노이지" 기공 오차 방식을 보여주는 예시적인 "스쿼글(squiggle)"을 나타낸다. 도 41의 상부 패널은 "양호한" 및 "노이지" 기공 상태 동안 기공을 통한 전류의 흐름의 차이를 보여준다. 도 41의 하부 패널은 "양호한" 상태로부터 "노이지" 상태로이 이행의 확대도를 보여준다.
도 42는, 적어도 5회 실행에 걸쳐 평균이 된, 기준 돌연변이체 28과 비교할 때, 추가 K94N 돌연변이(돌연변이체 I) 또는 추가 K94Q 돌연변이(돌연변이체 J)를 갖는, Y51A/F56Q/R97W/R192D 돌연변이를 함유하는 기준 돌연변이체 28과 동일한 서열을 갖는 돌연변이체 기공의 노이지 기공 상태의 감소를 보여준다.
도 43은 어댑터가 이의 각각의 말단에 결찰된 주형 스트랜드의 구조를 예시한다. 어댑터는 여기에 미리 결합된 T4 Dda 헬리카제 효소를 갖는다. 실시예에서 사용된 어댑터의 다양한 부분의 서열은 서열 번호 52 내지 55에 기재되어 있다.
도 44는 하기 치환 중 하나를 포함하는 돌연변이체 CsgG 나노기공에 대한 트롬빈 결합 압타머(TBA) 사건 사이의 중앙치 시간을 보여준다: Q42K(돌연변이체 K), E44N(돌연변이체 L), E44Q(돌연변이체 M), L90R(돌연변이체 N), N91R(돌연변이체 O), I95R(돌연변이체 P), A99R(돌연변이체 Q), E101H(돌연변이체 R), E101K(돌연변이체 S), E101N(돌연변이체 T), E101Q(돌연변이체 U), E101T(돌연변이체 V) 및 Q114K(돌연변이체 W). 중앙치 시간은 돌연변이 Y51A/F56Q/K94Q/R97W/R192D-del(V105-I107)(기준 돌연변이체 E)(이들 모두 시험된 13개의 돌연변이체의 각각에 또한 포함됨)을 포함하는 기준 기공과 비교하여 유의미하게 감소하였다. 도 44는 Q42K, E44N, E44Q, L90R, N91R, I95R, A99R, E101H, E101K, E101N, E101Q, E101T 및 Q114K 치환의 각각은 주형 DNA 포획률을 증가시킨다는 것을 보여준다.
도 45는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 27, 28, 29, 30, 32, 36, 3, 35, 31, 40, 33, 34, 37, 39, 38, 41 및 4에 상응하는 21 CsgG 동족체의 서열 정렬을 보여준다.
도 46은 예측된 알파 나선 2차 구조 영역이 추가로 음영이 있는 도 45와 동일한 상대 서열 정렬을 보여준다.
도 47은 예측된 베타 시트 2차 구조 영역이 추가로 음영이 있는 도 45와 동일한 상대 서열 정렬을 보여준다.
도 48은 poreAQ 및 기공97W에 대한 원 전기 데이터의 2개의 예를 보여준다.
서열 목록의 설명
서열 번호 1은 에스체리치아 콜라이 Str. K-12 substr. MC4100으로부터의 야생형 CsgG 단량체를 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다. 이 단량체는 신호 서열이 결여된다.
서열 번호 2는 에스체리치아 콜라이 Str. K-12 substr. MC4100으로부터의 야생형 CsgG 단량체의 성숙 형태의 아미노산 서열을 보여준다. 이 단량체는 신호 서열이 결여된다. 여기에 사용된 약어 CsgG = CsgG-Eco.
서열 번호 3은 서열 번호 2와 99% 동일한 가상적 단백질 CKO_02032[시트로박터 코세리(Citrobacter koseri) ATCC BAA-895]의 YP_001453594.1: 1-248의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 4는 서열 번호 2와 98% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 성분 CsgG, 부분[살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)]의 WP_001787128.1: 16-238의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 5는 서열 번호 2와 98% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 단백질 CsgG[시트로박터 아말로나티쿠스(Citrobacter amalonaticus)]의 KEY44978.1|: 16-277의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 6은 서열 번호 2와 97% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 성분[시트로박터 로덴튬(Citrobacter rodentium) ICC168]의 YP_003364699.1: 16-277의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 7은 서열 번호 2와 94% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 성분 CsgG[엔테로박터 아스부리아에(Enterobacter asburiae) LF7a]의 YP_004828099.1: 16-277의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 8은 Phi29 DNA 중합효소를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 9는 Phi29 DNA 중합효소의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 10은 이. 콜라이로부터의 sbcB 유전자로부터 유래된 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다. 이것은 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 I 효소(EcoExo I)를 코딩한다.
서열 번호 11은 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 I 효소(EcoExo I)의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 12는 이. 콜라이로부터의 xthA 유전자로부터 유래된 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다. 이것은 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 III 효소를 코딩한다.
서열 번호 13은 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 III 효소의 아미노산 서열을 보여준다. 이 효소는 3'-5' 방향에서의 이중 가닥 DNA(dsDNA)의 하나의 스트랜드로부터의 5' 모노포스페이트 뉴클레오사이드의 분포성 분해를 수행한다. 스트랜드에서의 효소 개시는 대략 4개의 뉴클레오타이드의 5' 오버행을 요한다.
서열 번호 14는 티. 써모피루스(T. thermophilus)로부터의 recJ 유전자로부터 유래된 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다. 이것은 티. 써모피루스로부터의 RecJ 효소(TthRecJ-cd)를 코딩한다.
서열 번호 15는 티. 써모피루스로부터의 RecJ 효소(TthRecJ-cd)의 아미노산 서열을 보여준다. 이 효소는 5'-3' 방향에서 ssDNA로부터의 5' 모노포스페이트 뉴클레오사이드의 전진적 분해를 수행한다. 스트랜드에서의 효소 개시는 적어도 4개의 뉴클레오타이드를 요한다.
서열 번호 16은 박테리오파지 람다 엑소(redX) 유전자로부터 유래된 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다. 이것은 박테리오파지 람다 엑소뉴클레아제를 코딩한다.
서열 번호 17은 박테리오파지 람다 엑소뉴클레아제의 아미노산 서열을 보여준다. 서열은 삼합체로 조립되는 3개의 동일한 아단위 중 하나이다. 효소는 5'-3'방향에서 dsDNA의 하나의 스트랜드로부터 뉴클레오타이드의 고도로 전진적인 분해를 수행한다(http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0262.asp). 스트랜드에서의 효소 개시는 우선적으로 5' 포스페이트를 갖는 대략 4개의 뉴클레오타이드의 5' 오버행을 요한다.
서열 번호 18은 Hel308 Mbu의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 19는 Hel308 Csy의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 20은 Hel308 Tga의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 21은 Hel308 Mhu의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 22는 TraI Eco의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 23은 XPD Mbu의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 24는 Dda 1993의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 25는 Trwc Cba의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 26은 서열 번호 2와 91% 동일한 운반체[요케넬라 레겐스부르게이(Yokenella regensburgei)]의 WP_006819418.1: 19-280의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 27은 서열 번호 2와 89% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 단백질 CsgG[크로노박터 풀베리스(Cronobacter pulveris)]의 WP_024556654.1: 16-277의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 28은 서열 번호 2와 84% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 단백질 CsgG[라넬라 아쿠아틸리스(Rahnella aquatilis) HX2]의 YP_005400916.1:16-277의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 29는 서열 번호 2와 82% 동일한 CsgG 패밀리 컬리 생성 어셈블리/운반 성분[클루이베라 아스코르바타(Kluyvera ascorbata) ATCC 33433]의 KFC99297.1: 20-278의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 30은 서열 번호 2와 81% 동일한 CsgG 패밀리 컬리 생성 어셈블리/운반 성분[하프니아 알베이(Hafnia alvei) ATCC 13337]의 KFC86716.1|:16-274의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 31은 서열 번호 2와 76% 동일한 컬리 중합체[엔테로박테리아세아에 박테륨(Enterobacteriaceae bacterium) 균주 FGI 57]의 형성에 관여한 비규명된 단백질의 YP_007340845.1|:16-270의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 32는 서열 번호 2와 70% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 단백질 CsgG[플레시오모나스 쉬겔로이데스(Plesiomonas shigelloides)]의 WP_010861740.1: 17-274의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 33은 서열 번호 2와 60% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 외부 막 지단백 성분 CsgG[비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) ES114]의 YP_205788.1: 23-270의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 34는 서열 번호 2와 59% 동일한 컬리 생성 어셈블리 단백질 CsgG[알리비브리오 로게이(Aliivibrio logei)]의 WP_017023479.1: 23-270의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 35는 서열 번호 2와 57% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 성분 CsgG[포토박테륨 종(Photobacterium sp.) AK15]의 WP_007470398.1: 22-275의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 36은 서열 번호 2와 56% 동일한 컬리 생성 어셈블리 단백질 CsgG[아에로모나스 베로니(Aeromonas veronii)]의 WP_021231638.1: 17-277의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 37은 서열 번호 2와 56% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 단백질 CsgG[슈와넬라 종(Shewanella sp.) ECSMB14101]의 WP_033538267.1: 27-265의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 38은 서열 번호 2와 54% 동일한 컬리 생성 어셈블리 단백질 CsgG[슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)]의 WP_003247972.1: 30-262의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 39는 서열 번호 2와 53% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 성분 CsgG[슈와넬라 비올라세아(Shewanella violacea) DSS12]의 YP_003557438.1: 1-234의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 40은 서열 번호 2와 53% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 단백질 CsgG[마리노박테륨 자나쉬이(Marinobacterium jannaschii)]의 WP_027859066.1: 36-280의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 41은 서열 번호 2와 50% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 성분 CsgG[크리세오박테륨 오라니멘스(Chryseobacterium oranimense) G311]의 CEJ70222.1: 29-262의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 42는 실시예 2에서 사용된 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 43은 실시예 2에 사용된 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 44는 실시예 2에 사용된 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 45는 실시예 2에 사용된 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 46은 실시예 2에 사용된 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다. 반대의 말단에서 2개의 타이민 및 3' 콜레스테롤 TEG에 부착된 6개의 iSp18 스페이서는 서열 번호 46의 3' 말단에 부착된다.
서열 번호 47은 of StrepII(C)의 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 48은 Pro의 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 49는 야생형 MspA 단량체를 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다. 이 돌연변이체는 신호 서열이 결여된다.
서열 번호 50은 야생형 MspA 단량체의 성숙 형태의 아미노산 서열을 보여준다. 이 돌연변이체는 신호 서열이 결여된다.
서열 번호 51은 실시예 7 및 11에 사용된 트롬빈 결합 압타머의 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 52는 Y-어댑터 상부 스트랜드의 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 53은 Y-어댑터 블로커 스트랜드의 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 54는 Y-어댑터 콜레스테롤 테터 스트랜드의 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 55는 Y-어댑터 하부 스트랜드의 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 56은 실시예에 사용된 3.6kb 이중 가닥 DNA 표적 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
도 2: CsgG의 치수를 예시한다.
도 3: 10Å/ns에서의 단일 G 전좌를 예시한다. CsgG-Eco에서의 F56 고리로의 구아닌의 진입을 위한 큰 장벽이 있다. * = G는 F56 고리에 들어간다. A = G는 56 고리와의 상호작용을 중단시킨다. B = G는 55 고리와의 상호작용을 중단시킨다. C = G는 51 고리와의 상호작용을 중단시킨다.
도 4: 100Å/ns에서의 ssDNA 전좌를 예시한다. CsgG-Eco에 대한 수축을 통해 DNA를 당기기 위해 더 큰 힘이 필요하다.
도 5: 10Å/ns에서의 ss DNA 전좌를 예시한다. CsgG-F56A-N55S 및 CsG-F56A-N55S-Y51A 돌연변이체 둘 다는 ssDNA 전좌에 대해 더 낮은 장벽을 갖는다.
도 6 내지 8: 야생형(WT)과 비교된 증가한 범위를 보여주는 돌연변이체 기공.
도 9 및 도 10: 야생형(WT)과 비교된 증가한 처리량을 보여주는 돌연변이체 기공.
도 11 및 도 12: 야생형(WT)과 비교된 증가한 삽입을 보여주는 돌연변이체 기공.
도 13: 실시예 2에서 사용된 DNA 작제물 X를 보여준다. 1 표지된 영역은 30개의 SpC3 스페이서에 상응한다. 2 표지된 영역은 서열 번호 42에 상응한다. 3 표지된 영역은 4개의 iSp18 스페이서에 상응한다. 4 표지된 영역은 서열 번호 43에 상응한다. 5 표지된 부문은 4개의 5-나이트로인돌에 상응한다. 6 표지된 영역은 서열 번호 44에 상응한다. 7 표지된 영역은 서열 번호 45에 상응한다. 8 표지된 영역은 서열 번호 46의 3' 말단에서 부착된 4개의 iSp18 스페이서(9 표지된 영역)를 갖는 서열 번호 46에 상응한다. iSp18 스페이서의 반대의 말단에서 3' 콜레스테롤 테터(10 표지)가 있다. 11 표지된 영역은 4개의 SpC3 스페이서에 상응한다.
도 14: CsgG 단백질의 Strep trap(GE Healthcare) 정제의 크로마토그래피 트레이스의 예를 보여준다(x-축 라벨 = 용리 용적(㎖), Y-축 라벨 = 흡광도(mAu)). 샘플을 25mM 트리스, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 0.01% DDM 중에 로딩하고, 10mM 데스티오바이오틴에 의해 용리시켰다. CsgG 단백질이 용리된 용리 피크는 E1로 표지된다.
도 15: 초기 strep 정제 후 CsgG 단백질의 통상적인 SDS-PAGE 가시화의 예를 보여준다. 4-20% TGX 겔(Bio Rad)을 1X TGS 완충제 중에 300V에서 22분 동안 실행하였다. 겔을 Sypro Ruby 염색에 의해 염색하였다. 레인 1 내지 3은 화살표로 표시된 바대로 CsgG 단백질을 함유하는 주요 용리 피크(도 14에서 E1 표지)를 보여주다. 레인 4 내지 6은 오염물질을 함유하는 주요 용리 피크(도 14에서 E1 표지)의 꼬리의 용리 분획에 상응한다. M은 비염색된 Novex Sharp(단위 = kD)인 사용된 분자량 마커를 보여준다.
도 16: CsgG 단백질의 크기 배제 크로마토그램(SEC)의 예를 보여준다(120㎖ S200 GE healthcare, x-축 라벨 = 용리 용적(㎖), y-축 라벨 = 흡광도(mAu)). SEC를 strep 정제 및 단백질 샘플의 가열 후 수행하였다. SEC에 대한 실행 완충제는 25mM 트리스, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 0.01% DDM, 0.1% SDS, pH 8.0이고, 가열을 1㎖/분 속도에서 실행하였다. X 표지된 트레이스는 220㎚에서의 흡광도를 보여주고, Y 표지된 트레이스는 280㎚에서의 흡광도를 보여준다. 별로 표지된 피크를 수집하였다.
도 17: SEC 후 CsgG 단백질의 통상적인 SDS-PAGE 가시화의 예를 보여준다. 4-20% TGX 겔(Bio Rad)을 1X TGS 완충제 중에 300V에서 22분 동안 실행하고, 겔을 Sypro Ruby 염색에 의해 염색하였다. 레인 1은 정제 및 가열 후 그러나 SEC 전 CsgG 단백질 샘플을 보여준다. 레인 2 내지 8은 도 16의 대략 48㎖ 내지 60㎖(중간 피크 = 55㎖)를 실행하는 피크에 걸쳐 수집되고, 도 16에서 별로 표시된 분획을 보여준다. M은 비염색된 Novex Sharp(단위 = kD)인 사용된 분자량 마커를 보여준다. CsgG-Eco 기공에 상응하는 막대는 화살표로 표시된다.
도 18 내지 24: 야생형(WT)과 비교된 증가한 범위를 보여주는 돌연변이체 기공.
도 25 내지 30: 야생형(WT)과 비교된 증가한 범위를 보여주는 돌연변이체 기공.
도 31은, 모의(실행 1 내지 3) 동안 0 및 20ns에서 취한, 기공(CsgG-Eco-(Y51T/F56Q)-StrepII(C))9(돌연변이 Y51T/F56Q를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단 기공 돌연변이체 20호에서 부착됨))의 상부에서 효소(T4 Dda-(E94C/C109A/C136A/A360C)(돌연변이 E94C/C109A/C136A/A360C 및 이후 (ΔM1)G1G2를 갖는 서열 번호 24))의 스냅샷을 보여준다.
도 32는, 모의(실행 1 내지 3) 동안 30 및 40ns에서 취한, 기공(CsgG-Eco-(Y51T/F56Q)-StrepII(C))9(돌연변이 Y51T/F56Q를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단 기공 돌연변이체 20호에서 부착됨))의 상부에서 효소(T4 Dda-(E94C/C109A/C136A/A360C)(돌연변이 E94C/C109A/C136A/A360C 및 이후 (ΔM1)G1G2를 갖는 서열 번호 24))의 스냅샷을 보여준다.
도 33은, 실시예 5에 기재된 모의 동안 취한, 기공(CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W)-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97W를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단 기공 돌연변이체 26호에서 부착됨))의 상부에서 효소(T4 Dda-(E94C/F98W/C109A/C136A/K194L/A360C)(돌연변이 E94C/F98W/C109A/C136A/K194L/A360C 및 이후 (ΔM1)G1G2를 갖는 서열 번호 24)의 스냅샷을 보여준다.
도 34는, 효소의 제어 없이, MspA 돌연변이체 x = MspA -((Del-L74/G75/D118/L119)D56F/E59R/L88N/D90N/D91N/Q126R/D134R/E139K)8(돌연변이 D56F/E59R/L88N/D90N/D91N/Q126R/D134R/E139K 및 아미노산 L74/G75/D118/L119의 결실을 갖는 서열 번호 50)을 통한 DNA(서열 번호 51)의 전좌를 보여주는 전류 트레이스의 2개의 10개의 제2 스크린 샷을 보여준다.
도 35는, 효소의 제어 없이, CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W/R192D-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97W/R192D를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)를 통한 DNA(서열 번호 51)의 전좌를 보여주는 전류 트레이스의 2개의 10개의 제2 스크린 샷을 보여준다.
도 36은, 효소의 제어 없이, CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W/E101S/R192D-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97W/E101S/R192D를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)를 통한 DNA(서열 번호 51)의 전좌를 보여주는 전류 트레이스의 2개의 10개의 제2 스크린 샷을 보여준다.
도 37은 CsgG 돌연변이체 기공 A) CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W)-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97W를 가지는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨) 및 B) CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W/R192D)-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97W/R192D를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)의 2개의 겔 여과 크로마토그램(120㎖ S200 칼럼)의 오버레이를 보여준다. CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W)-StrepII(C))9에 대한 A280에서의 흡광도는 A 표지되고, CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W/R192D)-StrepII(C))9에 대한 것은 B 표지된다. 작제물 둘 다를 500㎖ 배양물 중에 성장시켰다. 단백질 둘 다의 발현 및 정제를 정확하게 동일한 프로토콜을 이용하여 수행하고, 동일한 용적을 칼럼에 로딩하였다. 실행 완충제는 25mM 트리스, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 0.01% DDM, 0.1% SDS(pH 8)이었다. CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W)-StrepII(C))9 기공에 의한 부분 지연은 AKTA Purifier 10에서 사용된 상이한 연결 구성으로 인했다. 흡광도 값의 차이는 더 높은 흡광도 값으로 표시된 단백질의 양을 나타내고, 이는 발현된 단백질의 더 높은 양을 나타낸다.
도 38은 CsgG 나노기공의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. 레인 A 내지 C는 CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W)-StrepII(C))9를 함유하고, 레인 D 내지 F는 CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W/R192D)-StrepII(C))9를 함유하고, 레인 M은 분자량 마커를 함유하였다. 2개의 기공은 정확하게 동일한 프로토콜을 이용하여 발현되고 정제되었다. 기공을 22분 동안 300V에서 TGS 완충제 중의 4 내지 20% TGX 겔(Bio rad 카탈로그 5671093호)에서 전기천공으로 처리하였다. 겔을 Sypro Ruby 염색(Life Technologies 카탈로그 S1200호)에 의해 가시화하였다. 각각의 기공 샘플으로부터의 동일한 용적을 겔에 로딩하여 정제 후 얻은 단백질의 양을 비교하였다 - 레인 A 및 D는 5㎕를 함유하고, 레인 B 및 E는 10㎕를 함유하고, 레인 C 및 F는 15㎕를 함유하였다.
도 39는 돌연변이체 28(CsgG-(WT-Y51A/F56Q/R97W/R192D-StrepII)9)인 기준 기공의 베이스콜(basecall) 정확성과 비교하여 8개의 CsgG 돌연변이체 기공의 베이스콜 정확성을 보여준다. D195-L199의 결실(돌연변이체 A), F193-L199의 결실(돌연변이체 B) 또는 V105-I107(돌연변이체 D)의 결실, 또는 F191T의 치환(돌연변이체 C)은 돌연변이체 28에서의 R97W 및 R192D 치환으로부터 생긴 정확성의 개선 이외에 정확성의 추가의 개선을 발생시킨다. V105-I107의 결실의 베이스콜 정확성에 대한 효과를 또한 추가 K94Q 돌연변이를 함유하는 돌연변이체 기공(돌연변이체 E)에서 시험하고, 기준 돌연변이체 28과 비교된 정확성의 개선이 여전히 관찰되었다. R97W 돌연변이(기준 돌연변이체 28) 대신에 R93W 돌연변이(돌연변이체 F) 또는 R93Y 및 R97W 돌연변이(돌연변이체 H) 둘 다를 도입하는 것은 베이스콜 정확성을 증가시켰다. R93W(돌연변이체 G) 이외에 D195-L199의 결실은 베이스콜 정확성의 증대를 발생시켰다.
도 40은 기준 돌연변이체 28 CsgG-(WT-Y51A/F56Q/R97W/R192D-StrepII)9 및 V105-I107의 추가 결실을 포함하는 돌연변이체 D의 주형 속도 분포(a) 및 주형 정확성 분포(b)를 보여준다. 주형 DNA를 제조하고, 실시예에 기재된 바대로 돌연변이체 기공을 통해 통과시켰다. 주형 속도 및 정확성을 실시예에 기재된 바대로 결정하였다. 도 40a는 기준 돌연변이체와 비교하여 돌연변이체 D를 사용할 때 속도 분포가 더 치밀하다는 것을 보여준다. 도 40b는 돌연변이체 D가 기준 돌연변이체와 비교하여 주형 정확성의 더 치밀한 분포를 갖는다는 것을 보여준다.
도 41은 기준 돌연변이체 28 CsgG-(WT-Y51A/F56Q/R97W/R192D-StrepII)9에 의해 나타난 "노이지" 기공 오차 방식을 보여주는 예시적인 "스쿼글(squiggle)"을 나타낸다. 도 41의 상부 패널은 "양호한" 및 "노이지" 기공 상태 동안 기공을 통한 전류의 흐름의 차이를 보여준다. 도 41의 하부 패널은 "양호한" 상태로부터 "노이지" 상태로이 이행의 확대도를 보여준다.
도 42는, 적어도 5회 실행에 걸쳐 평균이 된, 기준 돌연변이체 28과 비교할 때, 추가 K94N 돌연변이(돌연변이체 I) 또는 추가 K94Q 돌연변이(돌연변이체 J)를 갖는, Y51A/F56Q/R97W/R192D 돌연변이를 함유하는 기준 돌연변이체 28과 동일한 서열을 갖는 돌연변이체 기공의 노이지 기공 상태의 감소를 보여준다.
도 43은 어댑터가 이의 각각의 말단에 결찰된 주형 스트랜드의 구조를 예시한다. 어댑터는 여기에 미리 결합된 T4 Dda 헬리카제 효소를 갖는다. 실시예에서 사용된 어댑터의 다양한 부분의 서열은 서열 번호 52 내지 55에 기재되어 있다.
도 44는 하기 치환 중 하나를 포함하는 돌연변이체 CsgG 나노기공에 대한 트롬빈 결합 압타머(TBA) 사건 사이의 중앙치 시간을 보여준다: Q42K(돌연변이체 K), E44N(돌연변이체 L), E44Q(돌연변이체 M), L90R(돌연변이체 N), N91R(돌연변이체 O), I95R(돌연변이체 P), A99R(돌연변이체 Q), E101H(돌연변이체 R), E101K(돌연변이체 S), E101N(돌연변이체 T), E101Q(돌연변이체 U), E101T(돌연변이체 V) 및 Q114K(돌연변이체 W). 중앙치 시간은 돌연변이 Y51A/F56Q/K94Q/R97W/R192D-del(V105-I107)(기준 돌연변이체 E)(이들 모두 시험된 13개의 돌연변이체의 각각에 또한 포함됨)을 포함하는 기준 기공과 비교하여 유의미하게 감소하였다. 도 44는 Q42K, E44N, E44Q, L90R, N91R, I95R, A99R, E101H, E101K, E101N, E101Q, E101T 및 Q114K 치환의 각각은 주형 DNA 포획률을 증가시킨다는 것을 보여준다.
도 45는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 27, 28, 29, 30, 32, 36, 3, 35, 31, 40, 33, 34, 37, 39, 38, 41 및 4에 상응하는 21 CsgG 동족체의 서열 정렬을 보여준다.
도 46은 예측된 알파 나선 2차 구조 영역이 추가로 음영이 있는 도 45와 동일한 상대 서열 정렬을 보여준다.
도 47은 예측된 베타 시트 2차 구조 영역이 추가로 음영이 있는 도 45와 동일한 상대 서열 정렬을 보여준다.
도 48은 poreAQ 및 기공97W에 대한 원 전기 데이터의 2개의 예를 보여준다.
서열 목록의 설명
서열 번호 1은 에스체리치아 콜라이 Str. K-12 substr. MC4100으로부터의 야생형 CsgG 단량체를 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다. 이 단량체는 신호 서열이 결여된다.
서열 번호 2는 에스체리치아 콜라이 Str. K-12 substr. MC4100으로부터의 야생형 CsgG 단량체의 성숙 형태의 아미노산 서열을 보여준다. 이 단량체는 신호 서열이 결여된다. 여기에 사용된 약어 CsgG = CsgG-Eco.
서열 번호 3은 서열 번호 2와 99% 동일한 가상적 단백질 CKO_02032[시트로박터 코세리(Citrobacter koseri) ATCC BAA-895]의 YP_001453594.1: 1-248의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 4는 서열 번호 2와 98% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 성분 CsgG, 부분[살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)]의 WP_001787128.1: 16-238의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 5는 서열 번호 2와 98% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 단백질 CsgG[시트로박터 아말로나티쿠스(Citrobacter amalonaticus)]의 KEY44978.1|: 16-277의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 6은 서열 번호 2와 97% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 성분[시트로박터 로덴튬(Citrobacter rodentium) ICC168]의 YP_003364699.1: 16-277의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 7은 서열 번호 2와 94% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 성분 CsgG[엔테로박터 아스부리아에(Enterobacter asburiae) LF7a]의 YP_004828099.1: 16-277의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 8은 Phi29 DNA 중합효소를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 9는 Phi29 DNA 중합효소의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 10은 이. 콜라이로부터의 sbcB 유전자로부터 유래된 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다. 이것은 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 I 효소(EcoExo I)를 코딩한다.
서열 번호 11은 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 I 효소(EcoExo I)의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 12는 이. 콜라이로부터의 xthA 유전자로부터 유래된 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다. 이것은 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 III 효소를 코딩한다.
서열 번호 13은 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 III 효소의 아미노산 서열을 보여준다. 이 효소는 3'-5' 방향에서의 이중 가닥 DNA(dsDNA)의 하나의 스트랜드로부터의 5' 모노포스페이트 뉴클레오사이드의 분포성 분해를 수행한다. 스트랜드에서의 효소 개시는 대략 4개의 뉴클레오타이드의 5' 오버행을 요한다.
서열 번호 14는 티. 써모피루스(T. thermophilus)로부터의 recJ 유전자로부터 유래된 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다. 이것은 티. 써모피루스로부터의 RecJ 효소(TthRecJ-cd)를 코딩한다.
서열 번호 15는 티. 써모피루스로부터의 RecJ 효소(TthRecJ-cd)의 아미노산 서열을 보여준다. 이 효소는 5'-3' 방향에서 ssDNA로부터의 5' 모노포스페이트 뉴클레오사이드의 전진적 분해를 수행한다. 스트랜드에서의 효소 개시는 적어도 4개의 뉴클레오타이드를 요한다.
서열 번호 16은 박테리오파지 람다 엑소(redX) 유전자로부터 유래된 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다. 이것은 박테리오파지 람다 엑소뉴클레아제를 코딩한다.
서열 번호 17은 박테리오파지 람다 엑소뉴클레아제의 아미노산 서열을 보여준다. 서열은 삼합체로 조립되는 3개의 동일한 아단위 중 하나이다. 효소는 5'-3'방향에서 dsDNA의 하나의 스트랜드로부터 뉴클레오타이드의 고도로 전진적인 분해를 수행한다(http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0262.asp). 스트랜드에서의 효소 개시는 우선적으로 5' 포스페이트를 갖는 대략 4개의 뉴클레오타이드의 5' 오버행을 요한다.
서열 번호 18은 Hel308 Mbu의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 19는 Hel308 Csy의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 20은 Hel308 Tga의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 21은 Hel308 Mhu의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 22는 TraI Eco의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 23은 XPD Mbu의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 24는 Dda 1993의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 25는 Trwc Cba의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 26은 서열 번호 2와 91% 동일한 운반체[요케넬라 레겐스부르게이(Yokenella regensburgei)]의 WP_006819418.1: 19-280의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 27은 서열 번호 2와 89% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 단백질 CsgG[크로노박터 풀베리스(Cronobacter pulveris)]의 WP_024556654.1: 16-277의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 28은 서열 번호 2와 84% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 단백질 CsgG[라넬라 아쿠아틸리스(Rahnella aquatilis) HX2]의 YP_005400916.1:16-277의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 29는 서열 번호 2와 82% 동일한 CsgG 패밀리 컬리 생성 어셈블리/운반 성분[클루이베라 아스코르바타(Kluyvera ascorbata) ATCC 33433]의 KFC99297.1: 20-278의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 30은 서열 번호 2와 81% 동일한 CsgG 패밀리 컬리 생성 어셈블리/운반 성분[하프니아 알베이(Hafnia alvei) ATCC 13337]의 KFC86716.1|:16-274의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 31은 서열 번호 2와 76% 동일한 컬리 중합체[엔테로박테리아세아에 박테륨(Enterobacteriaceae bacterium) 균주 FGI 57]의 형성에 관여한 비규명된 단백질의 YP_007340845.1|:16-270의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 32는 서열 번호 2와 70% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 단백질 CsgG[플레시오모나스 쉬겔로이데스(Plesiomonas shigelloides)]의 WP_010861740.1: 17-274의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 33은 서열 번호 2와 60% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 외부 막 지단백 성분 CsgG[비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) ES114]의 YP_205788.1: 23-270의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 34는 서열 번호 2와 59% 동일한 컬리 생성 어셈블리 단백질 CsgG[알리비브리오 로게이(Aliivibrio logei)]의 WP_017023479.1: 23-270의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 35는 서열 번호 2와 57% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 성분 CsgG[포토박테륨 종(Photobacterium sp.) AK15]의 WP_007470398.1: 22-275의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 36은 서열 번호 2와 56% 동일한 컬리 생성 어셈블리 단백질 CsgG[아에로모나스 베로니(Aeromonas veronii)]의 WP_021231638.1: 17-277의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 37은 서열 번호 2와 56% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 단백질 CsgG[슈와넬라 종(Shewanella sp.) ECSMB14101]의 WP_033538267.1: 27-265의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 38은 서열 번호 2와 54% 동일한 컬리 생성 어셈블리 단백질 CsgG[슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)]의 WP_003247972.1: 30-262의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 39는 서열 번호 2와 53% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 성분 CsgG[슈와넬라 비올라세아(Shewanella violacea) DSS12]의 YP_003557438.1: 1-234의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 40은 서열 번호 2와 53% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 단백질 CsgG[마리노박테륨 자나쉬이(Marinobacterium jannaschii)]의 WP_027859066.1: 36-280의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 41은 서열 번호 2와 50% 동일한 컬리 생성 어셈블리/운반 성분 CsgG[크리세오박테륨 오라니멘스(Chryseobacterium oranimense) G311]의 CEJ70222.1: 29-262의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 42는 실시예 2에서 사용된 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 43은 실시예 2에 사용된 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 44는 실시예 2에 사용된 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 45는 실시예 2에 사용된 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 46은 실시예 2에 사용된 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다. 반대의 말단에서 2개의 타이민 및 3' 콜레스테롤 TEG에 부착된 6개의 iSp18 스페이서는 서열 번호 46의 3' 말단에 부착된다.
서열 번호 47은 of StrepII(C)의 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 48은 Pro의 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 49는 야생형 MspA 단량체를 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다. 이 돌연변이체는 신호 서열이 결여된다.
서열 번호 50은 야생형 MspA 단량체의 성숙 형태의 아미노산 서열을 보여준다. 이 돌연변이체는 신호 서열이 결여된다.
서열 번호 51은 실시예 7 및 11에 사용된 트롬빈 결합 압타머의 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 52는 Y-어댑터 상부 스트랜드의 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 53은 Y-어댑터 블로커 스트랜드의 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 54는 Y-어댑터 콜레스테롤 테터 스트랜드의 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 55는 Y-어댑터 하부 스트랜드의 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 56은 실시예에 사용된 3.6kb 이중 가닥 DNA 표적 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
개시된 생성물 및 방법의 상이한 분야는 당해 분야에서 특정한 수요에 맞춤될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용된 전문용어가 오직 본 발명의 특정한 실시형태를 기재할 목적을 위한 것이고 제한인 것으로 의도되지 않는다고 또한 이해되어야 한다.
또한 본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바대로, 단수 형태 "일", "하나" 및 "이"는, 문맥이 달리 명확히 기술하지 않는 한, 복수 지시어를 포함한다. 따라서, 예를 들어 "폴리뉴클레오타이드"에 대한 언급은 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, "폴리뉴클레오타이드 결합 단백질"에 대한 언급은 2개 이상의 이러한 단백질을 포함하고, "헬리카제"에 대한 언급은 2개 이상의 헬리카제를 포함하고, "단량체"에 대한 언급은 2개 이상의 단량체를 포함하고, "기공"에 대한 언급은 2개 이상의 기공 및 기타를 포함한다.
상기든 또는 하기든, 본 명세서에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된다.
돌연변이체 CsgG 단량체
본 발명의 양태는 돌연변이체 CsgG 단량체를 제공한다. 돌연변이체 CsgG 단량체는 본 발명의 기공을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 돌연변이체 CsgG 단량체는 서열이 야생형 CsgG 단량체의 것과 다르고 기공을 형성하는 능력을 보유하는 단량체이다. 기공을 형성하는 돌연변이체 단량체의 능력을 확인하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 하기 더 자세히 기재되어 있다.
변형 R97W를 포함하는 본 발명의 몇몇 실시형태의 CsgG 단량체로부터 작제된 기공은 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명(또는 서열분석)할 때 97에서의 변형이 없는 그 외 동일한 기공과 비교하여 증가한 정확성을 나타낸다. 증가한 정확성은 또한 R97W 대신에 본 발명의 CsgG 단량체가 변형 R93W 또는 변형 R93Y 및 R97Y를 포함할 때 보인다. 따라서, 기공은 서열 번호 2의 R97 또는 R93에서의 변형을 포함하는 하나 이상의 돌연변이체 CsgG 단량체로부터 작제될 수 있어서, 변형은 아미노산의 소수화도를 증가시킨다. 예를 들어, 이러한 변형은 예를 들어 W 및 Y(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 소수성 측쇄를 함유하는 임의의 아미노산에 의한 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
R192D/Q/F/S/T를 포함하는 본 발명의 몇몇 실시형태의 CsgG 단량체는 양전하의 감소로 인할 수 있는 192번 위치에서의 치환을 갖지 않는 단량체보다 발현하기 더 쉽다. 따라서, 192번 위치는 양전하를 감소시키는 아미노산에 의해 치환될 수 있다. R192D/Q/F/S/T를 포함하는 본 발명의 단량체는 분석물질, 예컨대 폴리뉴클레오타이드와 상호작용하고 이를 규명하도록 단량체로부터 형성된 돌연변이체 기공의 능력을 개선하는 추가 변형을 또한 포함할 수 있다.
V105, A106 및 I107의 결실, F193, I194, D195, Y196, Q197, R198 및 L199의 결실 또는 D195, Y196, Q197, R198 및 L199의 결실, 및/또는 F191T를 포함하는 본 발명의 몇몇 실시형태의 CsgG 단량체를 포함하는 기공은 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명(또는 서열분석)할 때 증가한 정확성을 나타낸다. 105번 내지 107번 위치에서의 아미노산은 나노기공의 캡에서 시스 루프에 상응하고, 193번 내지 199번 위치에서의 아미노산은 기공의 다른 말단에서의 트랜스 루프에 상응에 상응한다. 이론에 의해 구속되고자 바라지 않으면서, 시스 루프의 결실이 기공과의 효소의 상호작용을 개선하고, 트랜스 루프의 제거가 기공의 트랜스 측에서 DNA 사이의 임의의 원치않는 상호작용을 감소시킨다고 생각된다.
K94Q 또는 K94N을 포함하는 본 발명의 몇몇 실시형태의 CsgG 단량체를 포함하는 기공은 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명(또는 서열분석)할 때, 94에서의 돌연변이가 없는 동일한 기공과 비교하여, 노이지 기공(즉, 증가한 신호:노이즈 비율을 생성시키는 기공)의 수의 감소를 보여준다. 94번 위치는 기공의 통로(vestibule) 내에 발견되고, 전류 신호의 노이즈와 관련하여 특히 민감한 위치인 것으로 발견되었다.
T104K 또는 T104R, N91R, E101K/N/Q/T/H, E44N/Q, Q114K, A99R, I95R, N91R, L90R, E44Q/N 및/또는 Q42K를 포함하는 본 발명의 몇몇 실시형태의 CsgG 단량체를 포함하는 기공은 모두 이 위치에서 치환이 없는 동일한 기공과 비교하여 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명(또는 서열)하도록 사용될 때 표적 폴리뉴클레오타이드를 포획하는 개선된 능력을 입증한다.
막관통 기공을 사용한 폴리뉴클레오타이드의 규명, 예컨대 서열분석은 예컨대 국제 출원 제PCT/GB2012/052343호(WO 2013/041878로 공개됨)에 개시된 바대로 수행될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오타이드가 기공과 관련하여 또는 이를 통해 이동하면서, 분석물질은, 통상적으로 기공을 통한 이온 전류 흐름을 측정함으로써, 생성된 구별되는 이온 전류 서명으로부터 규명될 수 있다. 임의의 특정한 시점에 측정된 전류의 수준은 통상적으로 k 중합체(예를 들어 뉴클레오타이드) 단위(여기서, k는 양의 정수임)의 그룹에 의존하고, 통상적인 전류 서명은 특정한 k합체를 나타내는 일련의 전류 수준으로서 표시될 수 있다. 기공과 관련한, 예컨대 이를 통한 폴리뉴클레오타이드의 이동은 하나의 k합체로부터 또 다른 것으로의 또는 k합체로부터 k합체로의 이동으로서 보일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드를 규명하기 위한 분석 기법은 예를 들어 HMM, 신경망 및 예를 들어 특정한 서열에 상응하는 측정의 시리즈의 가능성을 결정하기 위한 Forwards Backwards 알고리즘 또는 Viterbi 알고리즘의 사용을 수반할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드는 특성 벡터를 결정하고 특성 벡터를 또 다른 특성 벡터와 비교함으로써 규명될 수 있고, 이는 공지되고, 예컨대 국제 출원 제PCT/GB2013/050381호(WO 2013/121224로 공개)에 개시될 수 있다. 그러나, 폴리뉴클레오타이드를 규명하기 위해 사용된 분석 기법은 반드시 상기 예로 제한되지 않는다.
본 발명의 단량체가 막관통 기공을 형성하고, 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하기 위해 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질과 사용될 때, 변형된 위치 중 몇몇은 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질과 상호작용한다. 예를 들어, 단량체가 막관통 기공을 형성하고, 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하기 위해 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질과 사용될 때, R97W는 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질과 상호작용한다. 본 발명에 따른 CsgG 단량체를 변형시키는 것은 통상적으로 단량체를 포함하는 막관통 기공과 관련한, 예컨대 이를 통한 표적 폴리뉴클레오타이드의 더 일관된 이동을 제공한다. 표적 폴리뉴클레오타이드가 기공과 관련하여, 예컨대 이를 통해 이동하면서, 변형(들)은 통상적으로 하나의 k합체로부터 또 다른 것으로의 또는 k합체로부터 k합체로의 더 일관된 이동을 제공한다. 변형(들)은 통상적으로 표적 폴리뉴클레오타이드가 막관통 기공과 관련하여, 예컨대 이를 통해 더 부드럽게 이동하게 한다. 변형(들)은 통상적으로 막관통 기공과 관련한, 예컨대 이를 통한 표적 폴리뉴클레오타이드의 더 규칙적인 또는 불규칙적인 이동을 제공한다.
본 발명에 따른 CsgG 단량체를 변형시키는 것(예를 들어, R97W)은 통상적으로 단량체를 포함하는 기공과 관련한, 예컨대 이를 통한 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동과 연관된 정방향 슬리핑의 양을 감소시킨다. 실시예에 사용된 Dda 헬리카제를 포함하는 몇몇 헬리카제는 5'-3' 방향에서 폴리뉴클레오타이드를 따라 이동한다. 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단(헬리카제가 멀리 이동하는 말단)이 기공에 의해 포획될 때, 헬리카제는 인가된 전위로부터 생긴 장의 방향에 따라 일하고, 트레딩된 폴리뉴클레오타이드를 기공으로 및 트랜스 챔버로 이동시킨다. 정방향 슬리핑은 기공과 관련하여 DNA를 정방향으로(즉, 이의 3' 말단을 향해 그리고 이의 5' 말단으로부터 멀리) 적어도 4개의 연속 뉴클레오타이드 및 통상적으로 10개 초과의 연속 뉴클레오타이드로 이동시키는 것을 수반한다. 정방향 슬리핑은 100개 또는 이것 초과의 연속 뉴클레오타이드의 정방향 이동을 수반할 수 있고, 이것은 각각의 스트랜드에서 1회 초과 발생할 수 있다.
본 발명에 따른 CsgG 단량체를 변형시키는 것(예를 들어, R97W)은 통상적으로 단량체를 포함하는 막관통 기공과 관련한, 예컨대 이를 통한 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동과 연관된 노이즈를 감소시킨다. 신호가 분석되면서 임의의 치수의 표적 폴리뉴클레오타이드의 원치 않는 이동은 통상적으로 k합체에 대한 전류 서명 또는 수준에서 노이즈를 발생시킨다. 변형은 표적 폴리뉴클레오타이드에서 하나 이상의 k합체, 예컨대 각각의 k합체와 연관된 원치 않는 이동을 감소시킴으로써 이 노이즈를 감소시킬 수 있다. 변형은 표적 폴리뉴클레오타이드에서 하나 이상의 k합체, 예컨대 각각의 k합체에 대한 전류 수준 또는 서명과 연관된 노이즈를 감소시킬 수 있다.
폴리뉴클레오타이드를 이동시키기 위해 사용된 효소 모터는 폴리뉴클레오타이드를 정방향 일 염기 이동시키도록 완전 촉매 사이클(여기서, ATP는 가수분해됨)에서 다수의 하위단계를 갖는다(예를 들어, ATP.Mg를 결합시키는 것, ADP.P.Mg를 생성하도록 가수분해하는 것, 폴리뉴클레오타이드를 일 염기 정방향을 이동시키는 것 및 ADP/P/Mg 부산물을 방출시키는 것). 각각의 하위단계 공정은 공정의 동역학에 의해 결정된 특징적인 체류 시간 분포를 갖는다. 촉매 사이클의 임의의 이들 하위단계가 판독기에서 (예를 들어, 효소에 대해 폴리뉴클레오타이드를 이동시킴으로써, 또는 기공의 상부에서 효소의 위치를 변경함으로써) 폴리뉴클레오타이드의 위치를 이동시키는 경우, 기공을 통한 전류의 변경이 획득 전자에 의해 검출되기에 충분히 길게 지속하는 한, 이것은 이러한 변경으로서 관찰될 수 있다. 하위단계 공정이 폴리뉴클레오타이드에서의 입체구조 또는 이동의 변경을 발생시키지 않거나, 관찰되기에 너무 빨리 발생하는 경우, 이상적인 시스템에서 완전 촉매 사이클은 일 정수 염기를 정방향으로 이동시키는 폴리뉴클레오타이드에 대해 전류의 오직 하나의 단계 변경을 발생시킬 것이다.
R97W를 함유하지 않는 기공(예를 들어, Pro-CP1-Eco-(WT-Y51A/F56Q-StrepII(C))9)에 대해, 본 발명자들은 ATP.Mg 농도에 의존적인 대략적으로 기하급수적인 체류 분포에 의해 모델에 의해 예측되는 경우 긴 체류 시간 수준을 관찰하였다. poreAQ에 대해, 본 발명자들은 또한, 도 48에 표시된 바대로, 주요 수준 사이에 짧게 사는 하위단계 전류 수준은 관찰하였다. 하위단계 전류 수준이 짧게 사므로, 이들은 2개의 광범위하게 분리된 전류 수준 사이에 갭에서 가장 쉽게 관찰된다. 하위단계 수준은 폴리뉴클레오타이드의 중간 대략 0.5염기 이동에 상응하고, 이 조건 하에 대략 3밀리초의 ATP.Mg 독립적 체류 시간을 갖는다.
R97W를 함유하는 기공(예를 들어, Pro-CP1-Eco-(WT-Y51A/F56Q/R97W-StrepII(C))9)은 ATP.Mg 의존적 체류 시간을 갖는 유사한 더 길게 사는 주요 수준을 나타내지만, 이 조건 하에 또는 이 획득 주파수에서 구별되는 중간 하위단계 전류 수준의 징후를 나타내지 않는다(가능한 설명은 이들이 발생하지 않고, 관찰되기에 너무 빨리 발생한다는 것, 또는 하위단계가 발생하고, 원칙적으로 관찰되기에 충분히 느리지만, 실제로 이들이 예를 들어 효소가 기공과 상호작용하는 방식으로 인해 관찰되지 않는다는 것이다.
원 데이터 트레이스(도 48)는 기공 Pro-CP1-Eco-(WT-Y51A/F56Q/R97W-StrepII(C))9(기공 97W) 및 Pro-CP1-Eco-(WT-Y51A/F56Q-StrepII(C))9(기공 AQ)에 대한 나노기공을 통한 효소 제어된 DNA 스트랜드 전좌의 시간(x축, 초)에 대한 이온 전류(y-축, pA) 트레이스를 보여준다. 각각의 전류 수준은 이온의 흐름을 변경하는 나노기공 판독기에 보유된 서열의 결과이고, 전류의 단계별 변경은 폴리뉴클레오타이드가 나노기공에서 위치를 변경할 때, 예를 들어 효소가 전체 스트랜드를 일 염기 정방향 이동시킬 때 관찰된다. Dda 효소를 합성 DNA 폴리뉴클레오타이드로 로딩하고 MinION 기록 원 데이터 출력(Cis 완충제: 500mM KCl, 25mM HEPES, pH8, 0.6mM MgCl2, 0.6mM ATP, 140mV, 37℃, 5kHz 획득 주파수)에서 실행함으로써 데이터를 획득한다. 기공97W는 수준 사이의 유의미한 데이터 밀도 없이 오직 폴리뉴클레오타이드의 정수 단계별 이동으로부터의 주요 전류 수준을 보여준다. 비교하면, PoreAQ는, 도 48에서 화살표로 표시된 것처럼, 유의미한 중간 하위단계 수준을 갖는다.
돌연변이체 단량체는 바람직하게는 개선된 폴리뉴클레오타이드 판독 특성을 갖고, 즉 개선된 폴리뉴클레오타이드 포획 및 뉴클레오타이드 구별을 나타낸다. 특히, 돌연변이체 단량체로부터 작제된 기공은 바람직하게는 야생형보다 더 쉽게 뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드를 포획한다. 게다가, 돌연변이체 단량체로부터 작제된 기공은 바람직하게는 증가한 전류 범위(상이한 뉴클레오타이드 사이를 구별하는 것이 더 쉽게 함), 및 감소한 상태 변동(신호 대 노이즈 비율을 증가시킴)을 나타낸다.
게다가, 폴리뉴클레오타이드가 돌연변이체로부터 작제된 기공을 통해 이동하면서 전류에 기여하는 뉴클레오타이드의 수는 바람직하게는 감소한다. 이것은 폴리뉴클레오타이드가 기공 및 폴리뉴클레오타이드 서열을 통해 이동하면서 관찰된 전류 사이의 직접적인 관계를 확인하는 것이 더 쉽게 한다. 게다가, 돌연변이체 단량체로부터 작제된 기공은 증가한 처리량을 나타낼 수 있고, 즉 분석물질, 예컨대 폴리뉴클레오타이드와 더욱 상호작용할 것이다. 이것은 기공을 사용하여 분석물질을 규명하는 것이 더 쉽게 한다. 돌연변이체 단량체로부터 작제된 기공을 막으로 더 쉽게 삽입할 수 있다. 본 발명의 돌연변이체 단량체는 서열 번호 2에 기재된 서열의 변이체를 포함한다. 서열 번호 2는 에스체리치아 콜라이 Str. K-12 substr. MC4100으로부터의 야생형 CsgG 단량체이다. 서열 번호 2의 변이체는 서열 번호 2의 것과 다른 아미노산 서열을 갖고 기공을 형성하는 이의 능력을 보유하는 폴리펩타이드이다. 기공을 형성하는 변이체의 능력은 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 변이체는 다른 적절한 아단위와 함께 양친매성 층으로 삽입될 수 있고, 기공을 형성하기 위해 올리고머화하는 이의 능력은 결정될 수 있다. 아단위를 막, 예컨대 양친매성 층으로 삽입하기 위한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 아단위는 삼중블록 공중합체 막을 함유하는 용액 중에 정제된 형태로 현탁될 수 있어서, 이것은 막으로 확산하고, 막에 결합하고 기능적 상태로 조립함으로써 삽입된다.
본 명세서에서의 모든 논의에서, 아미노산에 대한 표준 1철자 코드가 사용된다. 이것은 하기와 같다: 알라닌(A), 아르기닌(R), 아스파라긴(N), 아스파르트산(D), 시스테인(C), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 글라이신(G), 히스티딘(H), 아이소류신(I), 류신(L), 라이신(K), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프롤린(P), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W), 타이로신(Y) 및 발린(V). 표준 치환 표시가 또한 사용되고, 즉 Q42R은 42번 위치에서의 Q가 R에 의해 대체된다는 것을 의미한다.
본 발명의 돌연변이체 단량체의 일 실시형태에서, 서열 번호 2의 변이체는 (a) I41, R93, A98, Q100, G103, T104, A106, I107, N108, L113, S115, T117, Y130, K135, E170, S208, D233, D238 및 E244 및/또는, (b) D43S, E44S, F48S/N/Q/Y/W/I/V/H/R/K, Q87N/R/K, N91K/R, K94R/F/Y/W/L/S/N, R97F/Y/W/V/I/K/S/Q/H, E101I/L/A/H, N102K/Q/L/I/V/S/H, R110F/G/N, Q114R/K, R142Q/S, T150Y/A/V/L/S/Q/N, R192D/Q/F/S/T 및 D248S/N/Q/K/R의 위치에서의 하나 이상의 돌연변이(즉, 이들 위치 중 하나 이상에서의 돌연변이)를 포함한다. 변이체는 (a); (b); 또는 (a) 및 (b)를 포함할 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 2의 변이체는 R97W를 포함한다.
본 발명의 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 2의 변이체는 R192D/Q/F/S/T, 바람직하게는 R192D/Q, 더 바람직하게는 R192D를 포함한다. (a)에서, 변이체는 위치의 임의의 수 및 조합, 예컨대 위치의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19에서의 변형을 포함할 수 있다. (a)에서, 변이체는 바람직하게는 I41N, R93F/Y/W/L/I/V/N/Q/S, A98K/R, Q100K/R, G103F/W/S/N/K/R, T104R/K, A106R/K, I107R/K/W/F/Y/L/V, N108R/K, L113K/R, S115R/K, T117R/K, Y130W/F/H/Q/N, K135L/V/N/Q/S, E170S/N/Q/K/R, S208V/I/F/W/Y/L/T, D233S/N/Q/K/R, D238S/N/Q/K/R 및 E244S/N/Q/K/R 중 하나 이상을 포함한다.
(a)에서, 변이체는 바람직하게는 단량체를 포함하는 막관통 기공과 관련한, 예컨대 이를 통한 표적 폴리뉴클레오타이드의 더 일관된 이동을 제공하는 하나 이상의 변형을 포함한다. 특히, (a)에서, 변이체는 바람직하게는 R93, G103 및 I107의 위치에서의 하나 이상의 돌연변이(즉, 이들 위치 중 하나 이상에서의 돌연변이)를 포함한다. 변이체는 R93; G103; I107; R93 및 G103; R93 및 I107; G103 및 I107; 또는 R93, G103 및 I107을 포함할 수 있다. 변이체는 바람직하게는 R93F/Y/W/L/I/V/N/Q/S, G103F/W/S/N/K/R 및 I107R/K/W/F/Y/L/V의 하나 이상을 포함한다. 이것은 R93, G103 및 I107 위치에 대해 기재된 임의의 조합으로 존재할 수 있다.
(a)에서, 변이체는 바람직하게는 돌연변이체 단량체로부터 작제된 기공이 바람직하게는 뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드를 더 쉽게 포획하게 하는 하나 이상의 변형을 포함한다. 특히, (a)에서, 변이체는 바람직하게는 I41, T104, A106, N108, L113, S115, T117, E170, D233, D238 및 E244의 위치에서의 하나 이상의 돌연변이(즉, 이들 위치 중 하나 이상에서의 돌연변이)를 포함한다. 변이체는 위치의 임의의 수 및 조합, 예컨대 위치의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11에서의 변형을 포함할 수 있다. 변이체는 바람직하게는 I41N, T104R/K, A106R/K, N108R/K, L113K/R, S115R/K, T117R/K, E170S/N/Q/K/R, D233S/N/Q/K/R, D238S/N/Q/K/R 및 E244S/N/Q/K/R의 하나 이상을 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 변이체는 (c) Q42K/R, E44N/Q, L90R/K, N91R/K, I95R/K, A99R/K, E101H/K/N/Q/T 및/또는 Q114K/R을 포함할 수 있다.
(a)에서, 변이체는 바람직하게는 더 일관된 이동을 제공하고 포획을 증가시키는 하나 이상의 변형을 포함한다. 특히, (a)에서, 변이체는 바람직하게는 (ⅰ) A98, (ⅱ) Q100, (ⅲ) G103 및 (ⅳ) I107의 위치에서의 하나 이상의 돌연변이(즉, 이들 위치 중 하나 이상에서의 돌연변이)를 포함한다. 변이체는 바람직하게는 (ⅰ) A98R/K, (ⅱ) Q100K/R, (ⅲ) G103K/R 및 (ⅳ) I107R/K의 하나 이상을 포함한다. 변이체는 {i}; {ii}; {iii}; {iv}; {i,ii}; {i,iii}; {i,iv}; {ii,iii}; {ii,iv}; {iii,iv}; {i,ii,iii}; {i,ii,iv}; {i,iii,iv}; {ii,iii,iv}; 또는 {i,ii,iii,iv}를 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드와 같은 분석물질의 포획의 증가를 제공하는 특히 바람직한 돌연변이체 단량체는 Q42, E44, E44, L90, N91, I95, A99, E101 및 Q114의 위치 중 하나 이상에서의 돌연변이를 포함하고, 돌연변이는 음전하를 제거하고/하거나, 돌연변이된 위치에서 양전하를 증가시킨다. 특히, 하기 돌연변이는 분석물질, 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드를 포획하는 개선된 능력을 갖는 CsgG 기공을 생성하도록 본 발명의 돌연변이체 단량체에 포함될 수 있다: Q42K, E44N, E44Q, L90R, N91R, I95R, A99R, E101H, E101K, E101N, E101Q, E101T 및 Q114K. 다른 유리한 돌연변이와 조합되어 이 돌연변이 중 하나를 포함하는 특정한 돌연변이체 단량체의 예는 실시예 11에 기재되어 있다.
(a)에서, 변이체는 바람직하게는 증가한 규명 정확성을 제공하는 하나 이상의 변형을 포함한다. 특히, (a)에서, 변이체는 바람직하게는 Y130, K135 및 S208, 예컨대 Y130; K135; S208; Y130 및 K135; Y130 및 S208; K135 및 S208; 또는 Y130, K135 및 S208의 위치에서의 하나 이상의 돌연변이(즉, 이들 위치 중 하나 이상에서의 돌연변이)를 포함한다. 변이체는 바람직하게는 Y130W/F/H/Q/N, K135L/V/N/Q/S 및 R142Q/S의 하나 이상을 포함한다. 이들 치환은 Y130, K135 및 S208에 대해 기재된 바와 같은 임의의 수 및 조합으로 존재할 수 있다.
(b)에서, 변이체는 치환의 임의의 수 및 조합, 예컨대 치환의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12를 포함할 수 있다. (b)에서, 변이체는 바람직하게는 단량체를 포함하는 막관통 기공과 관련한, 예컨대 이를 통한 표적 폴리뉴클레오타이드의 더 일관된 이동을 제공하는 하나 이상의 변형을 포함한다. 특히, (b)에서, 변이체는 바람직하게는 (ⅰ) Q87N/R/K, (ⅱ) K94R/F/Y/W/L/S/N, (ⅲ) R97F/Y/W/V/I/K/S/Q/H, (ⅳ) N102K/Q/L/I/V/S/H 및 (ⅴ) R110F/G/N의 하나 이상을 포함한다. 더 바람직하게는, 변이체는 K94D 또는 K94Q 및/또는 R97W 또는 R97Y를 포함한다. 변이체는 {i}; {ii}; {iii}; {iv}; {v}; {i,ii}; {i,iii}; {i,iv}; {i,v}; {ii,iii}; {ii,iv}; {ii,v}; {iii,iv}; {iii,v}; {iv,v}; {i,ii,iii}; {i,ii,iv}; {i,ii,v}; {i,iii,iv}; {i,iii,v}; {i,iv,v}; {ii,iii,iv}; {ii,iii,v}; {ii,iv,v}; {iii,iv,v}; {i,ii,iii,iv}; {i,ii,iii,v}; {i,ii,iv,v}; {i,iii,iv,v}; {ii,iii,iv,v}; 또는 {i,ii,iii,iv,v}를 포함할 수 있다. 단량체를 포함하는 막관통 기공과 관련한, 예컨대 이를 통한 표적 폴리뉴클레오타이드의 더 일관된 이동을 제공하도록 변형된 다른 바람직한 변이체는 (ⅵ) R93W 및 R93Y를 포함한다. 바람직한 변이체는 R93W 및 R97W, R93Y 및 R97W, R93W 및 R97W, 또는 더 바람직하게는 R93Y 및 R97Y를 포함할 수 있다. 변이체는 {vi}; {i,vi}; {ii,vi}; {iii,vi}; {iv,vi}; {v,vi}; {i,ii,vi}; {i,iii,vi}; {i,iv,vi}; {i,v,vi}; {ii,iii,vi}; {ii,iv,vi}; {ii,v,vi}; {iii,iv,vi}; {iii,v,vi}; {iv,v,vi}, {i,ii,iii,vi}; {i,ii,iv,vi}; {i, ii,v,vi}, {i,iii,iv,vi}; {i,iii,v,vi}; {i,iv,v,vi}; {ii,iii,iv,vi}; {ii,iii,v,vi}; {ii, iv,v,vi};{iii, iv,v,vi}, {i,ii,iii,iv,vi}, {i,ii,iii,v,vi}; {i,ii,iv,v,vi}; {i,iii,iv,v,vi}; {ii,iii,iv,v,vi}; 또는 {i,ii,iii,iv,v,vi}를 포함할 수 있다.
(b)에서, 변이체는 바람직하게는 돌연변이체 단량체로부터 작제된 기공이 바람직하게는 뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드를 더 쉽게 포획하게 하는 하나 이상의 변형을 포함한다. 특히, (b)에서, 변이체는 바람직하게는 (ⅰ) D43S, (ⅱ) E44S, (ⅲ) N91K/R, (ⅳ) Q114R/K 및 (ⅴ) D248S/N/Q/K/R의 하나 이상을 포함한다. 변이체는 {i}; {ii}; {iii}; {iv}; {v}; {i,ii}; {i,iii}; {i,iv}; {i,v}; {ii,iii}; {ii,iv}; {ii,v}; {iii,iv}; {iii,v}; {iv,v}; {i,ii,iii}; {i,ii,iv}; {i,ii,v}; {i,iii,iv}; {i,iii,v}; {i,iv,v}; {ii,iii,iv}; {ii,iii,v}; {ii,iv,v}; {iii,iv,v}; {i,ii,iii,iv}; {i,ii,iii,v}; {i,ii,iv,v}; {i,iii,iv,v}; {ii,iii,iv,v}; 또는 {i,ii,iii,iv,v}를 포함할 수 있다.
(b)에서, 변이체는 바람직하게는 더 일관된 이동을 제공하고 포획을 증가시키는 하나 이상의 변형을 포함한다. 특히, (b)에서, 변이체는 바람직하게는 Q87R/K, E101I/L/A/H 및 N102K, 예컨대 Q87R/K; E101I/L/A/H; N102K; Q87R/K 및 E101I/L/A/H; Q87R/K 및 N102K; E101I/L/A/H 및 N102K; 또는 Q87R/K, E101I/L/A/H 및 N102K의 하나 이상을 포함한다.
(b)에서, 변이체는 바람직하게는 증가한 규명 정확성을 제공하는 하나 이상의 변형을 포함한다. 특히, (a)에서, 변이체는 바람직하게는 F48S/N/Q/Y/W/I/V를 포함한다.
(b)에서, 변이체는 바람직하게는 증가한 규명 정확성 및 증가한 포획을 제공하는 하나 이상의 변형을 포함한다. 특히, (a)에서, 변이체는 바람직하게는 F48H/R/K를 포함한다.
변이체는 더 일관된 이동을 제공하는 (a) 및 (b) 둘 다에서의 변형을 포함할 수 있다. 변이체는 증가한 포획을 제공하는 (a) 및 (b) 둘 다에서의 변형을 포함할 수 있다.
본 발명은 변이체를 포함하는 기공을 사용하여 분석물질, 예컨대 폴리뉴클레오타이드를 규명하기 위한 검정의 증가한 처리량을 제공하는 서열 번호 2의 변이체를 제공한다. 이러한 변이체는 K94에서의 돌연변이, 바람직하게는 K94Q 또는 K94N, 더 바람직하게는 K94Q를 포함할 수 있다. 다른 유리한 돌연변이와 조합되어 K94Q 또는 K94N 돌연변이를 포함하는 특정한 돌연변이체 단량체의 실시예는 실시예 10 및 11에 기재되어 있다.
본 발명은 변이체를 포함하는 기공을 사용하여 분석물질, 예컨대 폴리뉴클레오타이드를 규명하기 위한 검정에서의 증가한 규명 정확성을 제공하는 서열 번호 2의 변이체를 제공한다. 이러한 변이체는 F191에서의 돌연변이, 바람직하게는 F191T; V105-I107의 결실; F193-L199 또는 D195-L199의 결실; 및/또는 R93 및/또는 R97에서의 돌연변이, 바람직하게는 R93Y, R97Y, 또는 더 바람직하게는, R97W, R93W 또는 R97Y 및 R97Y 둘 다를 포함하는 변이체를 포함한다. 다른 유리한 돌연변이와 조합되어 이들 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 특정한 돌연변이체 단량체의 실시예는 실시예 9에 기재되어 있다.
본 발명의 돌연변이체 단량체의 또 다른 실시형태에서, 서열 번호 2의 변이체는 (A) R192, F193, I194, D195, Y196, Q197, R198, L199, L200 및 E201의 하나 이상의 위치의 결실 및/또는 (B) V139/G140/D149/T150/V186/Q187/V204/G205(본 명세서에서 밴드 1이라 불림), G137/G138/Q151/Y152/Y184/E185/Y206/T207(본 명세서에서 밴드 2라 불림) 및 A141/R142/G147/A148/A188/G189/G202/E203(본 명세서에서 밴드 3이라 불림)의 하나 이상의 결실을 포함한다.
(A)에서, 변이체는 위치의 임의의 수 및 조합, 예컨대 위치의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 결실을 포함할 수 있다. (A)에서, 변이체는 바람직하게는 하기의 결실을 포함한다:
- D195, Y196, Q197, R198 및 L199;
- R192, F193, I194, D195, Y196, Q197, R198, L199 및 L200;
- Q197, R198, L199 및 L200;
- I194, D195, Y196, Q197, R198 및 L199;
- D195, Y196, Q197, R198, L199 및 L200;
- Y196, Q197, R198, L199, L200 및 E201;
- Q197, R198, L199, L200 및 E201;
- Q197, R198, L199; 또는
- F193, I194, D195, Y196, Q197, R198 및 L199.
더 바람직하게는, 변이체는 D195, Y196, Q197, R198 및 L199 또는 F193, I194, D195, Y196, Q197, R198 및 L199의 결실을 포함한다. (B)에서, 밴드 1 내지 3의 임의의 수 및 조합, 예컨대 밴드 1; 밴드 2; 밴드 3; 밴드 1 및 2; 밴드 1 및 3; 밴드 2 및 3; 또는 밴드 1, 2 및 3은 결실될 수 있다.
변이체는 (A); (B); 또는 (A) 및 (B)에 따른 결실을 포함할 수 있다.
상기 (A) 및/또는 (B)에 따른 하나 이상의 위치의 결실을 포함하는 변이체는 상기 및 하기 기재된 임의의 변형 또는 치환을 추가로 포함할 수 있다. 서열 번호 2에서의 결실 위치 뒤에 보이는 하나 이상의 위치에서 변형 또는 치환이 이루어지는 경우, 변형 또는 치환의 하나 이상의 위치의 넘버링은 이에 따라 조정되어야 한다. 예를 들어, L199가 결실되는 경우, E244는 E243이 된다. 유사하게, 밴드 1이 결실되는 경우, R192는 R186이 된다.
본 발명의 돌연변이체 단량체의 또 다른 실시형태에서, 서열 번호 2의 변이체는 (C) V105, A106 및 I107의 하나 이상의 위치의 결실을 포함한다. (A) 및/또는 (B)에 따른 결실 이외에 (C)에 따른 결실이 이루어질 수 있다.
상기 기재된 결실은 통상적으로 단량체를 포함하는 막관통 기공과 관련한, 예컨대 이를 통한 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동과 연관된 노이즈를 감소시킨다. 그 결과, 표적 폴리뉴클레오타이드는 더 정확하게 규명될 수 있다.
특정한 위치에서의 상이한 아미노산이 / 기호에 의해 분리되는 상기 문단에서, / 기호는 "또는"을 의미한다. 예를 들어, Q87R/K는 Q87R 또는 Q87K를 의미한다.
본 발명은 분석물질, 예컨대 폴리뉴클레오타이드의 증가한 포획을 제공하는 서열 번호 2의 변이체를 제공한다. 이러한 변이체는 T104에서의 돌연변이, 바람직하게는 T104R 또는 T104K, N91에서의 돌연변이, 바람직하게는 N91R, E101에서의 돌연변이, 바람직하게는 E101K/N/Q/T/H, E44 위치에서의 돌연변이, 바람직하게는 E44N 또는 E44Q 및/또는 Q42 위치에서의 돌연변이, 바람직하게는 Q42K를 포함할 수 있다.
서열 번호 2에서의 상이한 위치에서의 돌연변이는 임의의 가능한 방식으로 조합될 수 있다. 특히, 본 발명의 단량체는 정확성을 개선하는 하나 이상의 돌연변이, 노이즈를 감소시키는 하나 이상의 돌연변이 및/또는 분석물질의 포획을 증대시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다.
본 발명의 돌연변이체 단량체에서, 서열 번호 2의 변이체는 바람직하게는 (ⅰ) N40, D43, E44, S54, S57, Q62, R97, E101, E124, E131, R142, T150 및 R192의 위치에서의 하나 이상의 돌연변이(즉, 이들 위치 중 하나 이상에서의 돌연변이), 예컨대 N40, D43, E44, S54, S57, Q62, E101, E131 및 T150 또는 N40, D43, E44, E101 및 E131의 위치에서의 하나 이상의 돌연변이(즉, 이들 위치 중 하나 이상에서의 돌연변이); (ⅱ) Y51/N55, Y51/F56, N55/F56 또는 Y51/N55/F56에서의 돌연변이; (ⅲ) Q42R 또는 Q42K; (ⅳ) K49R; (ⅴ) N102R, N102F, N102Y 또는 N102W; (ⅵ) D149N, D149Q 또는 D149R; (ⅶ) E185N, E185Q 또는 E185R; (ⅷ) D195N, D195Q 또는 D195R; (ⅸ) E201N, E201Q 또는 E201R; (ⅹ) E203N, E203Q 또는 E203R; 및 (xi) F48, K49, P50, Y51, P52, A53, S54, N55, F56 및 S57의 위치의 하나 이상의 결실 중 하나 이상을 포함한다. 변이체는 (ⅰ) 내지 (xi)의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 특히, 변이체는 (공간에 의해 분리된 괄호 {} 내의 각각의 변이체가 변이체의 목록으로부터 임의의 변이체, 즉 {i} 또는 {ii} 또는 {iii} 또는 {iv} 또는 {v} 등을 나타내는 경우) {i} {ii} {iii} {iv} {v} {vi} {vii} {viii} {ix} {x} {xi} {i,ii} {i,iii} {i,iv} {i,v} {i,vi} {i,vii} {i,viii} {i,ix} {i,x} {i,xi} {ii,iii} {ii,iv} {ii,v} {ii,vi} {ii,vii} {ii,viii} {ii,ix} {ii,x} {ii,xi} {iii,iv} {iii,v} {iii,vi} {iii,vii} {iii,viii} {iii,ix} {iii,x} {iii,xi} {iv,v} {iv,vi} {iv,vii} {iv,viii} {iv,ix} {iv,x} {iv,xi} {v,vi} {v,vii} {v,viii} {v,ix} {v,x} {v,xi} {vi,vii} {vi,viii} {vi,ix} {vi,x} {vi,xi} {vii,viii} {vii,ix} {vii,x} {vii,xi} {viii,ix} {viii,x} {viii,xi} {ix,x} {ix,xi} {x,xi} {i,ii,iii} {i,ii,iv} {i,ii,v} {i,ii,vi} {i,ii,vii} {i,ii,viii} {i,ii,ix} {i,ii,x} {i,ii,xi} {i,iii,iv} {i,iii,v} {i,iii,vi} {i,iii,vii} {i,iii,viii} {i,iii,ix} {i,iii,x} {i,iii,xi} {i,iv,v} {i,iv,vi} {i,iv,vii} {i,iv,viii} {i,iv,ix} {i,iv,x} {i,iv,xi} {i,v,vi} {i,v,vii} {i,v,viii} {i,v,ix} {i,v,x} {i,v,xi} {i,vi,vii} {i,vi,viii} {i,vi,ix} {i,vi,x} {i,vi,xi} {i,vii,viii} {i,vii,ix} {i,vii,x} {i,vii,xi} {i,viii,ix} {i,viii,x} {i,viii,xi} {i,ix,x} {i,ix,xi} {i,x,xi} {ii,iii,iv} {ii,iii,v} {ii,iii,vi} {ii,iii,vii} {ii,iii,viii} {ii,iii,ix} {ii,iii,x} {ii,iii,xi} {ii,iv,v} {ii,iv,vi} {ii,iv,vii} {ii,iv,viii} {ii,iv,ix} {ii,iv,x} {ii,iv,xi} {ii,v,vi} {ii,v,vii} {ii,v,viii} {ii,v,ix} {ii,v,x} {ii,v,xi} {ii,vi,vii} {ii,vi,viii} {ii,vi,ix} {ii,vi,x} {ii,vi,xi} {ii,vii,viii} {ii,vii,ix} {ii,vii,x} {ii,vii,xi} {ii,viii,ix} {ii,viii,x} {ii,viii,xi} {ii,ix,x} {ii,ix,xi} {ii,x,xi} {iii,iv,v} {iii,iv,vi} {iii,iv,vii} {iii,iv,viii} {iii,iv,ix} {iii,iv,x} {iii,iv,xi} {iii,v,vi} {iii,v,vii} {iii,v,viii} {iii,v,ix} {iii,v,x} {iii,v,xi} {iii,vi,vii} {iii,vi,viii} {iii,vi,ix} {iii,vi,x} {iii,vi,xi} {iii,vii,viii} {iii,vii,ix} {iii,vii,x} {iii,vii,xi} {iii,viii,ix} {iii,viii,x} {i,ii,iii,iv} {i,ii,iii,v} {i,ii,iii,vi} {i,ii,iii,vii} {i,ii,iii,viii} {i,ii,iii,ix} {i,ii,iii,x} {i,ii,iii,xi} {i,ii,iv,v} {i,ii,iv,vi} {i,ii,iv,vii} {i,ii,iv,viii} {i,ii,iv,ix} {i,ii,iv,x} {i,ii,iv,xi} {i,ii,v,vi} {i,ii,v,vii} {i,ii,v,viii} {i,ii,v,ix} {i,ii,v,x} {i,ii,v,xi} {i,ii,vi,vii} {i,ii,vi,viii} {i,ii,vi,ix} {i,ii,vi,x} {i,ii,vi,xi} {i,ii,vii,viii} {i,ii,vii,ix} {i,ii,vii,x} {i,ii,vii,xi} {i,ii,viii,ix} {i,ii,viii,x} {i,ii,viii,xi} {i,ii,ix,x} {i,ii,ix,xi} {i,ii,x,xi} {i,iii,iv,v} {i,iii,iv,vi} {i,iii,iv,vii} {i,iii,iv,viii} {i,iii,iv,ix} {i,iii,iv,x} {i,iii,iv,xi} {i,iii,v,vi} {i,iii,v,vii} {i,iii,v,viii} {i,iii,v,ix} {i,iii,v,x} {i,iii,v,xi} {i,iii,vi,vii} {i,iii,vi,viii} {i,iii,vi,ix} {i,iii,vi,x} {i,iii,vi,xi} {i,iii,vii,viii} {i,iii,vii,ix} {i,iii,vii,x} {i,iii,vii,xi} {i,iii,viii,ix} {i,iii,viii,x} {i,iii,viii,xi} {i,iii,ix,x} {i,iii,ix,xi} {i,iii,x,xi} {i,iv,v,vi} {i,iv,v,vii} {i,iv,v,viii} {i,iv,v,ix} {i,iv,v,x} {i,iv,v,xi} {i,iv,vi,vii} {i,iv,vi,viii} {i,iv,vi,ix} {i,iv,vi,x} {i,iv,vi,xi} {i,iv,vii,viii} {i,iv,vii,ix} {i,iv,vii,x} {i,iv,vii,xi} {i,iv,viii,ix} {i,iv,viii,x} {i,iv,viii,xi} {i,iv,ix,x} {i,iv,ix,xi} {i,iv,x,xi} {i,v,vi,vii} {i,v,vi,viii} {i,v,vi,ix} {i,v,vi,x} {i,v,vi,xi} {i,v,vii,viii} {i,v,vii,ix} {i,v,vii,x} {i,v,vii,xi} {i,v,viii,ix} {i,v,viii,x} {i,v,viii,xi} {i,v,ix,x} {i,v,ix,xi} {i,v,x,xi} {i,vi,vii,viii} {i,vi,vii,ix} {i,vi,vii,x} {i,vi,vii,xi} {i,vi,viii,ix} {i,vi,viii,x} {i,vi,viii,xi} {i,vi,ix,x} {i,vi,ix,xi} {i,vi,x,xi} {i,vii,viii,ix} {i,vii,viii,x} {i,vii,viii,xi} 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{ii,v,ix,x} {ii,v,ix,xi} {ii,v,x,xi} {ii,vi,vii,viii} {ii,vi,vii,ix} {ii,vi,vii,x} {ii,vi,vii,xi} {ii,vi,viii,ix} {ii,vi,viii,x} {ii,vi,viii,xi} {ii,vi,ix,x} {ii,vi,ix,xi} {ii,vi,x,xi} {ii,vii,viii,ix} {ii,vii,viii,x} {ii,vii,viii,xi} {ii,vii,ix,x} {ii,vii,ix,xi} {ii,vii,x,xi} {ii,viii,ix,x} {ii,viii,ix,xi} {ii,viii,x,xi} {ii,ix,x,xi} {iii,iv,v,vi} {iii,iv,v,vii} {iii,iv,v,viii} {iii,iv,v,ix} {iii,iv,v,x} {iii,iv,v,xi} {iii,iv,vi,vii} {iii,iv,vi,viii} {iii,iv,vi,ix} {iii,iv,vi,x} {iii,iv,vi,xi} {iii,iv,vii,viii} {iii,iv,vii,ix} {iii,iv,vii,x} {iii,iv,vii,xi} {iii,iv,viii,ix} {iii,iv,viii,x} {iii,iv,viii,xi} {iii,iv,ix,x} {iii,iv,ix,xi} {iii,iv,x,xi} {iii,v,vi,vii} {iii,v,vi,viii} {iii,v,vi,ix} {iii,v,vi,x} {iii,v,vi,xi} {iii,v,vii,viii} {iii,v,vii,ix} {iii,v,vii,x} {iii,v,vii,xi} {iii,v,viii,ix} {iii,v,viii,x} {iii,v,viii,xi} {iii,v,ix,x} {iii,v,ix,xi} {iii,v,x,xi} {iii,vi,vii,viii} {iii,vi,vii,ix} {iii,vi,vii,x} {iii,vi,vii,xi} {iii,vi,viii,ix} {iii,vi,viii,x} {iii,vi,viii,xi} 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{i,ii,v,vii,viii,ix,x,xi} {i,ii,vi,vii,viii,ix,x,xi} {i,iii,iv,v,vi,vii,viii,ix} {i,iii,iv,v,vi,vii,viii,x} {i,iii,iv,v,vi,vii,viii,xi} {i,iii,iv,v,vi,vii,ix,x} {i,iii,iv,v,vi,vii,ix,xi} {i,iii,iv,v,vi,vii,x,xi} {i,iii,iv,v,vi,viii,ix,x} {i,iii,iv,v,vi,viii,ix,xi} {i,iii,iv,v,vi,viii,x,xi} {i,iii,iv,v,vi,ix,x,xi} {i,iii,iv,v,vii,viii,ix,x} {i,iii,iv,v,vii,viii,ix,xi} {i,iii,iv,v,vii,viii,x,xi} {i,iii,iv,v,vii,ix,x,xi} {i,iii,iv,v,viii,ix,x,xi} {i,iii,iv,vi,vii,viii,ix,x} {i,iii,iv,vi,vii,viii,ix,xi} {i,iii,iv,vi,vii,viii,x,xi} {i,iii,iv,vi,vii,ix,x,xi} {i,iii,iv,vi,viii,ix,x,xi} {i,iii,iv,vii,viii,ix,x,xi} {i,iii,v,vi,vii,viii,ix,x} {i,iii,v,vi,vii,viii,ix,xi} {i,iii,v,vi,vii,viii,x,xi} {i,iii,v,vi,vii,ix,x,xi} {i,iii,v,vi,viii,ix,x,xi} {i,iii,v,vii,viii,ix,x,xi} {i,iii,vi,vii,viii,ix,x,xi} {i,iv,v,vi,vii,viii,ix,x} {i,iv,v,vi,vii,viii,ix,xi} {i,iv,v,vi,vii,viii,x,xi} {i,iv,v,vi,vii,ix,x,xi} {i,iv,v,vi,viii,ix,x,xi} {i,iv,v,vii,viii,ix,x,xi} {i,iv,vi,vii,viii,ix,x,xi} {i,v,vi,vii,viii,ix,x,xi} {ii,iii,iv,v,vi,vii,viii,ix} {ii,iii,iv,v,vi,vii,viii,x} {ii,iii,iv,v,vi,vii,viii,xi} {ii,iii,iv,v,vi,vii,ix,x} {ii,iii,iv,v,vi,vii,ix,xi} {ii,iii,iv,v,vi,vii,x,xi} {ii,iii,iv,v,vi,viii,ix,x} {ii,iii,iv,v,vi,viii,ix,xi} {ii,iii,iv,v,vi,viii,x,xi} {ii,iii,iv,v,vi,ix,x,xi} {ii,iii,iv,v,vii,viii,ix,x} {ii,iii,iv,v,vii,viii,ix,xi} {ii,iii,iv,v,vii,viii,x,xi} {ii,iii,iv,v,vii,ix,x,xi} {ii,iii,iv,v,viii,ix,x,xi} {ii,iii,iv,vi,vii,viii,ix,x} {ii,iii,iv,vi,vii,viii,ix,xi} {ii,iii,iv,vi,vii,viii,x,xi} {ii,iii,iv,vi,vii,ix,x,xi} {ii,iii,iv,vi,viii,ix,x,xi} {ii,iii,iv,vii,viii,ix,x,xi} {ii,iii,v,vi,vii,viii,ix,x} {ii,iii,v,vi,vii,viii,ix,xi} {ii,iii,v,vi,vii,viii,x,xi} {ii,iii,v,vi,vii,ix,x,xi} {ii,iii,v,vi,viii,ix,x,xi} {ii,iii,v,vii,viii,ix,x,xi} {ii,iii,vi,vii,viii,ix,x,xi} {ii,iv,v,vi,vii,viii,ix,x} {ii,iv,v,vi,vii,viii,ix,xi} {ii,iv,v,vi,vii,viii,x,xi} {ii,iv,v,vi,vii,ix,x,xi} {ii,iv,v,vi,viii,ix,x,xi} {ii,iv,v,vii,viii,ix,x,xi} {ii,iv,vi,vii,viii,ix,x,xi} {ii,v,vi,vii,viii,ix,x,xi} {iii,iv,v,vi,vii,viii,ix,x} {iii,iv,v,vi,vii,viii,ix,xi} {iii,iv,v,vi,vii,viii,x,xi} {iii,iv,v,vi,vii,ix,x,xi} {iii,iv,v,vi,viii,ix,x,xi} {iii,iv,v,vii,viii,ix,x,xi} {iii,iv,vi,vii,viii,ix,x,xi} {iii,v,vi,vii,viii,ix,x,xi} {iv,v,vi,vii,viii,ix,x,xi} {i,ii,iii,iv,v,vi,vii,viii,ix} {i,ii,iii,iv,v,vi,vii,viii,x} {i,ii,iii,iv,v,vi,vii,viii,xi} {i,ii,iii,iv,v,vi,vii,ix,x} {i,ii,iii,iv,v,vi,vii,ix,xi} {i,ii,iii,iv,v,vi,vii,x,xi} {i,ii,iii,iv,v,vi,viii,ix,x} {i,ii,iii,iv,v,vi,viii,ix,xi} {i,ii,iii,iv,v,vi,viii,x,xi} {i,ii,iii,iv,v,vi,ix,x,xi} {i,ii,iii,iv,v,vii,viii,ix,x} {i,ii,iii,iv,v,vii,viii,ix,xi} {i,ii,iii,iv,v,vii,viii,x,xi} {i,ii,iii,iv,v,vii,ix,x,xi} {i,ii,iii,iv,v,viii,ix,x,xi} {i,ii,iii,iv,vi,vii,viii,ix,x} {i,ii,iii,iv,vi,vii,viii,ix,xi} {i,ii,iii,iv,vi,vii,viii,x,xi} {i,ii,iii,iv,vi,vii,ix,x,xi} {i,ii,iii,iv,vi,viii,ix,x,xi} {i,ii,iii,iv,vii,viii,ix,x,xi} {i,ii,iii,v,vi,vii,viii,ix,x} {i,ii,iii,v,vi,vii,viii,ix,xi} {i,ii,iii,v,vi,vii,viii,x,xi} {i,ii,iii,v,vi,vii,ix,x,xi} {i,ii,iii,v,vi,viii,ix,x,xi} {i,ii,iii,v,vii,viii,ix,x,xi} {i,ii,iii,vi,vii,viii,ix,x,xi} {i,ii,iv,v,vi,vii,viii,ix,x} {i,ii,iv,v,vi,vii,viii,ix,xi} {i,ii,iv,v,vi,vii,viii,x,xi} {i,ii,iv,v,vi,vii,ix,x,xi} {i,ii,iv,v,vi,viii,ix,x,xi} {i,ii,iv,v,vii,viii,ix,x,xi} {i,ii,iv,vi,vii,viii,ix,x,xi} {i,ii,v,vi,vii,viii,ix,x,xi} {i,iii,iv,v,vi,vii,viii,ix,x} {i,iii,iv,v,vi,vii,viii,ix,xi} {i,iii,iv,v,vi,vii,viii,x,xi} {i,iii,iv,v,vi,vii,ix,x,xi} {i,iii,iv,v,vi,viii,ix,x,xi} {i,iii,iv,v,vii,viii,ix,x,xi} {i,iii,iv,vi,vii,viii,ix,x,xi} {i,iii,v,vi,vii,viii,ix,x,xi} {i,iv,v,vi,vii,viii,ix,x,xi} {ii,iii,iv,v,vi,vii,viii,ix,x} {ii,iii,iv,v,vi,vii,viii,ix,xi} {ii,iii,iv,v,vi,vii,viii,x,xi} {ii,iii,iv,v,vi,vii,ix,x,xi} {ii,iii,iv,v,vi,viii,ix,x,xi} {ii,iii,iv,v,vii,viii,ix,x,xi} {ii,iii,iv,vi,vii,viii,ix,x,xi} {ii,iii,v,vi,vii,viii,ix,x,xi} {ii,iv,v,vi,vii,viii,ix,x,xi} {iii,iv,v,vi,vii,viii,ix,x,xi} {i,ii,iii,iv,v,vi,vii,viii,ix,x} {i,ii,iii,iv,v,vi,vii,viii,ix,xi} {i,ii,iii,iv,v,vi,vii,viii,x,xi} {i,ii,iii,iv,v,vi,vii,ix,x,xi} {i,ii,iii,iv,v,vi,viii,ix,x,xi} {i,ii,iii,iv,v,vii,viii,ix,x,xi} {i,ii,iii,iv,vi,vii,viii,ix,x,xi} {i,ii,iii,v,vi,vii,viii,ix,x,xi} {i,ii,iv,v,vi,vii,viii,ix,x,xi} {i,iii,iv,v,vi,vii,viii,ix,x,xi} {ii,iii,iv,v,vi,vii,viii,ix,x,xi} 또는 {i,ii,iii,iv,v,vi,vii,viii,ix,x,xi}를 포함할 수 있다.
변이체가 (ⅰ) 및 (ⅲ) 내지 (xi) 중 임의의 하나를 포함하는 경우, 이것은 Y51, N55 및 F56의 하나 이상, 예컨대 Y51, N55, F56, Y51/N55, Y51/F56, N55/F56 또는 Y51/N55/F56에서의 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다.
(ⅰ)에서, 변이체는 N40, D43, E44, S54, S57, Q62, R97, E101, E124, E131, R142, T150 및 R192의 임의의 수 및 조합에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. (ⅰ)에서, 변이체는 바람직하게는 N40, D43, E44, S54, S57, Q62, E101, E131 및 T150의 위치에서의 하나 이상의 돌연변이(즉, 이들 위치 중 하나 이상에서의 돌연변이)를 포함한다. (ⅰ)에서, 변이체는 바람직하게는 N40, D43, E44, E101 및 E131의 위치에서의 하나 이상의 돌연변이(즉, 하기 위치의 하나 이상에서의 돌연변이)를 포함한다. (ⅰ)에서, 변이체는 바람직하게는 S54 및/또는 S57에서의 돌연변이를 포함한다. (ⅰ)에서, 변이체는 더 바람직하게는 (a) S54 및/또는 S57 및 (b) Y51, N55 및 F56의 하나 이상, 예컨대 Y51, N55, F56, Y51/N55, Y51/F56, N55/F56 또는 Y51/N55/F56에서의 돌연변이를 포함한다. S54 및/또는 S57이 (xi)에서 결실되는 경우, 이것은 (ⅰ)에서 돌연변이될 수 없고 그 반대일 수 있다. (ⅰ)에서, 변이체는 바람직하게는 T150에서의 돌연변이, 예컨대 T150I를 포함한다. 대안적으로, 변이체는 바람직하게는 (a) T150 및 (b) Y51, N55 및 F56의 하나 이상, 예컨대 Y51, N55, F56, Y51/N55, Y51/F56, N55/F56 또는 Y51/N55/F56에서의 돌연변이를 포함한다. (ⅰ)에서, 변이체는 바람직하게는 Q62에서의 돌연변이, 예컨대 Q62R 또는 Q62K를 포함한다. 대안적으로, 변이체는 바람직하게는 (a) Q62 및 (b) Y51, N55 및 F56의 하나 이상, 예컨대 Y51, N55, F56, Y51/N55, Y51/F56, N55/F56 또는 Y51/N55/F56에서의 돌연변이를 포함한다. 변이체는 D43, E44, Q62 또는 임의의 이들의 조합, 예컨대 D43, E44, Q62, D43/E44, D43/Q62, E44/Q62 또는 D43/E44/Q62에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 대안적으로, 변이체는 바람직하게는 (a) D43, E44, Q62, D43/E44, D43/Q62, E44/Q62 또는 D43/E44/Q62 및 (b) Y51, N55 및 F56의 하나 이상, 예컨대 Y51, N55, F56, Y51/N55, Y51/F56, N55/F56 또는 Y51/N55/F56에서의 돌연변이를 포함한다.
(ⅱ)에서 및 상이한 위치가 / 기호에 의해 분리되는 본 출원에서의 그 외에서, / 기호는 "및"을 의미하여서, Y51/N55는 Y51 및 N55이다. (ⅱ)에서, 변이체는 바람직하게는 Y51/N55에서의 돌연변이를 포함한다. CsgG에서의 속박이 Y51, N55 및 F56 잔기의 측쇄에 의해 형성된 3개의 적층된 동심 고리로 이루어진다고 제안된다(Goyal et al, 2014, Nature, 516, 250-253). 폴리뉴클레오타이드가 기공을 통해 이동하고, 이에 의해 (폴리뉴클레오타이드가 기공을 통해 이동하면서) 관찰된 전류와 폴리뉴클레오타이드 사이의 직접적인 관계를 확인하는 것이 더 쉽게 만들면서, (ⅱ)에서의 이들 잔기의 돌연변이는 따라서 전류에 기여하는 뉴클레오타이드의 수를 감소시킬 수 있다. F56은 본 발명의 방법에서 유용한 변이체 및 기공을 참조하여 하기 기재된 임의의 방식으로 돌연변이될 수 있다.
(ⅴ)에서, 변이체는 N102R, N102F, N102Y 또는 N102W를 포함할 수 있다. 변이체는 바람직하게는 (a) N102R, N102F, N102Y 또는 N102W 및 (b) Y51, N55 및 F56의 하나 이상, 예컨대 Y51, N55, F56, Y51/N55, Y51/F56, N55/F56 또는 Y51/N55/F56에서의 돌연변이를 포함한다.
(xi)에서, K49, P50, Y51, P52, A53, S54, N55, F56 및 S57의 임의의 수 및 조합은 결실될 수 있다. 바람직하게는, K49, P50, Y51, P52, A53, S54, N55 및 S57의 하나 이상은 결실될 수 있다. Y51, N55 및 F56의 어떤 것이 (xi)에서 결실되는 경우, 이것은 (ⅱ)에서 돌연변이될 수 없고, 그 반대일 수 있다.
(ⅰ)에서, 변이체는 바람직하게는 N40R, N40K, D43N, D43Q, D43R, D43K, E44N, E44Q, E44R, E44K, S54P, S57P, Q62R, Q62K, R97N, R97G, R97L, E101N, E101Q, E101R, E101K, E101F, E101Y, E101W, E124N, E124Q, E124R, E124K, E124F, E124Y, E124W, E131D, R142E, R142N, T150I, R192E 및 R192N의 치환의 하나 이상, 예컨대 N40R, N40K, D43N, D43Q, D43R, D43K, E44N, E44Q, E44R, E44K, S54P, S57P, Q62R, Q62K, E101N, E101Q, E101R, E101K, E101F, E101Y, E101W, E131D 및 T150I의 하나 이상, 또는 N40R, N40K, D43N, D43Q, D43R, D43K, E44N, E44Q, E44R, E44K, E101N, E101Q, E101R, E101K, E101F, E101Y, E101W 및 E131D의 하나 이상을 포함한다. 변이체는 이들 치환의 임의의 수 및 조합을 포함할 수 있다. (ⅰ)에서, 변이체는 바람직하게는 S54P 및/또는 S57P를 포함한다. (ⅰ)에서, 변이체는 바람직하게는 (a) S54P 및/또는 S57P 및 (b) Y51, N55 및 F56의 하나 이상, 예컨대 Y51, N55, F56, Y51/N55, Y51/F56, N55/F56 또는 Y51/N55/F56에서의 돌연변이를 포함한다. Y51, N55 및 F56의 하나 이상에서의 돌연변이는 임의의 하기 기재된 것일 수 있다. (ⅰ)에서, 변이체는 바람직하게는 F56A/S57P 또는 S54P/F56A를 포함한다. 변이체는 바람직하게는 T150I를 포함한다. 대안적으로, 변이체는 바람직하게는 (a) T150I 및 (b) Y51, N55 및 F56의 하나 이상, 예컨대 Y51, N55, F56, Y51/N55, Y51/F56, N55/F56 또는 Y51/N55/F56에서의 돌연변이를 포함한다.
(ⅰ)에서, 변이체는 바람직하게는 Q62R 또는 Q62K를 포함한다. 대안적으로, 변이체는 바람직하게는 (a) Q62R 또는 Q62K 및 (b) Y51, N55 및 F56의 하나 이상, 예컨대 Y51, N55, F56, Y51/N55, Y51/F56, N55/F56 또는 Y51/N55/F56에서의 돌연변이를 포함한다. 변이체는 D43N, E44N, Q62R 또는 Q62K 또는 임의의 이들의 조합, 예컨대 D43N, E44N, Q62R, Q62K, D43N/E44N, D43N/Q62R, D43N/Q62K, E44N/Q62R, E44N/Q62K, D43N/E44N/Q62R 또는 D43N/E44N/Q62K를 포함할 수 있다. 대안적으로, 변이체는 바람직하게는 (a) D43N, E44N, Q62R, Q62K, D43N/E44N, D43N/Q62R, D43N/Q62K, E44N/Q62R, E44N/Q62K, D43N/E44N/Q62R 또는 D43N/E44N/Q62K 및 (b) Y51, N55 및 F56의 하나 이상, 예컨대 Y51, N55, F56, Y51/N55, Y51/F56, N55/F56 또는 Y51/N55/F56에서의 돌연변이를 포함한다.
(ⅰ)에서, 변이체는 바람직하게는 D43N을 포함한다.
(ⅰ)에서, 변이체는 바람직하게는 E101R, E101S, E101F 또는 E101N을 포함한다.
(ⅰ)에서, 변이체는 바람직하게는 E124N, E124Q, E124R, E124K, E124F, E124Y, E124W 또는 E124D, 예컨대 E124N을 포함한다.
(ⅰ)에서, 변이체는 바람직하게는 R142E 및 R142N을 포함한다.
(ⅰ)에서, 변이체는 바람직하게는 R97N, R97G 또는 R97L을 포함한다.
(ⅰ)에서, 변이체는 바람직하게는 R192E 및 R192N을 포함한다.
(ⅱ)에서, 변이체는 바람직하게는 F56N/N55Q, F56N/N55R, F56N/N55K, F56N/N55S, F56N/N55G, F56N/N55A, F56N/N55T, F56Q/N55Q, F56Q/N55R, F56Q /N55K, F56Q/N55S, F56Q/N55G, F56Q/N55A, F56Q/N55T, F56R/N55Q, F56R/N55R, F56R/N55K, F56R/N55S, F56R/N55G, F56R/N55A, F56R/N55T, F56S/N55Q, F56S/N55R, F56S/N55K, F56S/N55S, F56S/N55G, F56S/N55A, F56S/N55T, F56G/N55Q, F56G/N55R, F56G/N55K, F56G/N55S, F56G/N55G, F56G/N55A, F56G/N55T, F56A/N55Q, F56A/N55R, F56A/N55K, F56A/N55S, F56A/N55G, F56A/N55A, F56A/N55T, F56K/N55Q, F56K/N55R,F56K/N55K, F56K/N55S, F56K/N55G, F56K/N55A, F56K/N55T, F56N/Y51L, F56N/Y51V, F56N/Y51A, F56N/Y51N, F56N/Y51Q, F56N/Y51S, F56N/Y51G, F56Q/Y51L, F56Q/Y51V, F56Q/Y51A, F56Q/Y51N, F56Q/Y51Q, F56Q/Y51S, F56Q/Y51G, F56R/Y51L, F56R/Y51V, F56R/Y51A, F56R/Y51N, F56R/Y51Q, F56R/Y51S, F56R/Y51G, F56S/Y51L, F56S/Y51V, F56S/Y51A, F56S/Y51N, F56S/Y51Q, F56S/Y51S, F56S/Y51G, F56G/Y51L, F56G/Y51V, F56G/Y51A, F56G/Y51N, F56G/Y51Q, F56G/Y51S, F56G/Y51G, F56A/Y51L, F56A/Y51V, F56A/Y51A, F56A/Y51N, F56A/Y51Q, F56A/Y51S, F56A/Y51G, F56K/Y51L, F56K/Y51V, F56K/Y51A, F56K/Y51N, F56K/Y51Q, F56K/Y51S, F56K/Y51G, N55Q/Y51L, N55Q/Y51V, N55Q/Y51A, N55Q/Y51N, N55Q/Y51Q, N55Q/Y51S, N55Q/Y51G, N55R/Y51L, N55R/Y51V, N55R/Y51A, N55R/Y51N, N55R/Y51Q, N55R/Y51S, N55R/Y51G, N55K/Y51L, N55K/Y51V, N55K/Y51A, N55K/Y51N, N55K/Y51Q, N55K/Y51S, N55K/Y51G, N55S/Y51L, N55S/Y51V, N55S/Y51A, N55S/Y51N, N55S/Y51Q, N55S/Y51S, N55S/Y51G, N55G/Y51L, N55G/Y51V, N55G/Y51A, N55G/Y51N, N55G/Y51Q, N55G/Y51S, N55G/Y51G, N55A/Y51L, N55A/Y51V, N55A/Y51A, N55A/Y51N, N55A/Y51Q, N55A/Y51S, N55A/Y51G, N55T/Y51L, N55T/Y51V, N55T/Y51A, N55T/Y51N, N55T/Y51Q, N55T/Y51S, N55T/Y51G, F56N/N55Q/Y51L, F56N/N55Q/Y51V, F56N/N55Q/Y51A, F56N/N55Q/Y51N, F56N/N55Q/Y51Q, F56N/N55Q/Y51S, F56N/N55Q/Y51G, F56N/N55R/Y51L, F56N/N55R/Y51V, F56N/N55R/Y51A, F56N/N55R/Y51N, F56N/N55R/Y51Q, F56N/N55R/Y51S, F56N/N55R/Y51G, F56N/N55K/Y51L, F56N/N55K/Y51V, F56N/N55K/Y51A, F56N/N55K/Y51N, F56N/N55K/Y51Q, F56N/N55K/Y51S, F56N/N55K/Y51G, F56N/N55S/Y51L, F56N/N55S/Y51V, F56N/N55S/Y51A, F56N/N55S/Y51N, F56N/N55S/Y51Q, F56N/N55S/Y51S, F56N/N55S/Y51G, F56N/N55G/Y51L, F56N/N55G/Y51V, F56N/N55G/Y51A, F56N/N55G/Y51N, F56N/N55G/Y51Q, F56N/N55G/Y51S, F56N/N55G/Y51G, F56N/N55A/Y51L, F56N/N55A/Y51V, F56N/N55A/Y51A, F56N/N55A/Y51N, F56N/N55A/Y51Q, F56N/N55A/Y51S, F56N/N55A/Y51G, F56N/N55T/Y51L, F56N/N55T/Y51V, F56N/N55T/Y51A, F56N/N55T/Y51N, F56N/N55T/Y51Q, F56N/N55T/Y51S, F56N/N55T/Y51G, F56Q/N55Q/Y51L, F56Q/N55Q/Y51V, F56Q/N55Q/Y51A, F56Q/N55Q/Y51N, F56Q/N55Q/Y51Q, F56Q/N55Q/Y51S, F56Q/N55Q/Y51G, F56Q/N55R/Y51L, F56Q/N55R/Y51V, F56Q/N55R/Y51A, F56Q/N55R/Y51N, F56Q/N55R/Y51Q, F56Q/N55R/Y51S, F56Q/N55R/Y51G, F56Q/N55K/Y51L, F56Q /N55K/Y51V, F56Q/N55K/Y51A, F56Q /N55K/Y51N, F56Q/N55K/Y51Q, F56Q /N55K/Y51S, F56Q /N55K/Y51G, F56Q/N55S/Y51L, F56Q/N55S/Y51V, F56Q/N55S/Y51A, F56Q/N55S/Y51N, F56Q/N55S/Y51Q, F56Q/N55S/Y51S, F56Q/N55S/Y51G, F56Q/N55G/Y51L, F56Q/N55G/Y51V, F56Q/N55G/Y51A, F56Q/N55G/Y51N, F56Q/N55G/Y51Q, F56Q/N55G/Y51S, F56Q/N55G/Y51G, F56Q/N55A/Y51L, F56Q/N55A/Y51V, F56Q/N55A/Y51A, F56Q/N55A/Y51N, F56Q/N55A/Y51Q, F56Q/N55A/Y51S, F56Q/N55A/Y51G, F56Q/N55T/Y51L, F56Q/N55T/Y51V, F56Q/N55T/Y51A, F56Q/N55T/Y51N, F56Q/N55T/Y51Q, F56Q/N55T/Y51S, F56Q/N55T/Y51G, F56R/N55Q/Y51L, F56R/N55Q/Y51V, F56R/N55Q/Y51A, F56R/N55Q/Y51N, F56R/N55Q/Y51Q, F56R/N55Q/Y51S, F56R/N55Q/Y51G, F56R/N55R/Y51L, F56R/N55R/Y51V, F56R/N55R/Y51A, F56R/N55R/Y51N, F56R/N55R/Y51Q, F56R/N55R/Y51S, F56R/N55R/Y51G, F56R/N55K/Y51L, F56R/N55K/Y51V, F56R/N55K/Y51A, F56R/N55K/Y51N, F56R/N55K/Y51Q, F56R/N55K/Y51S, F56R/N55K/Y51G, F56R/N55S/Y51L, F56R/N55S/Y51V, F56R/N55S/Y51A, F56R/N55S/Y51N, F56R/N55S/Y51Q, F56R/N55S/Y51S, F56R/N55S/Y51G, F56R/N55G/Y51L, F56R/N55G/Y51V, F56R/N55G/Y51A, F56R/N55G/Y51N, F56R/N55G/Y51Q, F56R/N55G/Y51S, F56R/N55G/Y51G, F56R/N55A/Y51L, F56R/N55A/Y51V, F56R/N55A/Y51A, F56R/N55A/Y51N, F56R/N55A/Y51Q, F56R/N55A/Y51S, F56R/N55A/Y51G, F56R/N55T/Y51L, F56R/N55T/Y51V, F56R/N55T/Y51A, F56R/N55T/Y51N, F56R/N55T/Y51Q, F56R/N55T/Y51S, F56R/N55T/Y51G, F56S/N55Q/Y51L, F56S/N55Q/Y51V, F56S/N55Q/Y51A, F56S/N55Q/Y51N, F56S/N55Q/Y51Q, F56S/N55Q/Y51S, F56S/N55Q/Y51G, F56S/N55R/Y51L, F56S/N55R/Y51V, F56S/N55R/Y51A, F56S/N55R/Y51N, F56S/N55R/Y51Q, F56S/N55R/Y51S, F56S/N55R/Y51G, F56S/N55K/Y51L, F56S/N55K/Y51V, F56S/N55K/Y51A, F56S/N55K/Y51N, F56S/N55K/Y51Q, F56S/N55K/Y51S, F56S/N55K/Y51G, F56S/N55S/Y51L, F56S/N55S/Y51V, F56S/N55S/Y51A, F56S/N55S/Y51N, F56S/N55S/Y51Q, F56S/N55S/Y51S, F56S/N55S/Y51G, F56S/N55G/Y51L, F56S/N55G/Y51V, F56S/N55G/Y51A, F56S/N55G/Y51N, F56S/N55G/Y51Q, F56S/N55G/Y51S, F56S/N55G/Y51G, F56S/N55A/Y51L, F56S/N55A/Y51V, F56S/N55A/Y51A, F56S/N55A/Y51N, F56S/N55A/Y51Q, F56S/N55A/Y51S, F56S/N55A/Y51G, F56S/N55T/Y51L, F56S/N55T/Y51V, F56S/N55T/Y51A, F56S/N55T/Y51N, F56S/N55T/Y51Q, F56S/N55T/Y51S, F56S/N55T/Y51G, F56G/N55Q/Y51L, F56G/N55Q/Y51V, F56G/N55Q/Y51A, F56G/N55Q/Y51N, F56G/N55Q/Y51Q, F56G/N55Q/Y51S, F56G/N55Q/Y51G, F56G/N55R/Y51L, F56G/N55R/Y51V, F56G/N55R/Y51A, F56G/N55R/Y51N, F56G/N55R/Y51Q, F56G/N55R/Y51S, F56G/N55R/Y51G, F56G/N55K/Y51L, F56G/N55K/Y51V, F56G/N55K/Y51A, F56G/N55K/Y51N, F56G/N55K/Y51Q, F56G/N55K/Y51S, F56G/N55K/Y51G, F56G/N55S/Y51L, F56G/N55S/Y51V, F56G/N55S/Y51A, F56G/N55S/Y51N, F56G/N55S/Y51Q, F56G/N55S/Y51S, F56G/N55S/Y51G, F56G/N55G/Y51L, F56G/N55G/Y51V, F56G/N55G/Y51A, F56G/N55G/Y51N, F56G/N55G/Y51Q, F56G/N55G/Y51S, F56G/N55G/Y51G, F56G/N55A/Y51L, F56G/N55A/Y51V, F56G/N55A/Y51A, F56G/N55A/Y51N, F56G/N55A/Y51Q, F56G/N55A/Y51S, F56G/N55A/Y51G, F56G/N55T/Y51L, F56G/N55T/Y51V, F56G/N55T/Y51A, F56G/N55T/Y51N, F56G/N55T/Y51Q, F56G/N55T/Y51S, F56G/N55T/Y51G, F56A/N55Q/Y51L, F56A/N55Q/Y51V, F56A/N55Q/Y51A, F56A/N55Q/Y51N, F56A/N55Q/Y51Q, F56A/N55Q/Y51S, F56A/N55Q/Y51G, F56A/N55R/Y51L, F56A/N55R/Y51V, F56A/N55R/Y51A, F56A/N55R/Y51N, F56A/N55R/Y51Q, F56A/N55R/Y51S, F56A/N55R/Y51G, F56A/N55K/Y51L, F56A/N55K/Y51V, F56A/N55K/Y51A, F56A/N55K/Y51N, F56A/N55K/Y51Q, F56A/N55K/Y51S, F56A/N55K/Y51G, F56A/N55S/Y51L, F56A/N55S/Y51V, F56A/N55S/Y51A, F56A/N55S/Y51N, F56A/N55S/Y51Q, F56A/N55S/Y51S, F56A/N55S/Y51G, F56A/N55G/Y51L, F56A/N55G/Y51V, F56A/N55G/Y51A, F56A/N55G/Y51N, F56A/N55G/Y51Q, F56A/N55G/Y51S, F56A/N55G/Y51G, F56A/N55A/Y51L, F56A/N55A/Y51V, F56A/N55A/Y51A, F56A/N55A/Y51N, F56A/N55A/Y51Q, F56A/N55A/Y51S, F56A/N55A/Y51G, F56A/N55T/Y51L, F56A/N55T/Y51V, F56A/N55T/Y51A, F56A/N55T/Y51N, F56A/N55T/Y51Q, F56A/N55T/Y51S, F56A/N55T/Y51G, F56K/N55Q/Y51L, F56K/N55Q/Y51V, F56K/N55Q/Y51A, F56K/N55Q/Y51N, F56K/N55Q/Y51Q, F56K/N55Q/Y51S, F56K/N55Q/Y51G, F56K/N55R/Y51L, F56K/N55R/Y51V, F56K/N55R/Y51A, F56K/N55R/Y51N, F56K/N55R/Y51Q, F56K/N55R/Y51S, F56K/N55R/Y51G, F56K/N55K/Y51L, F56K/N55K/Y51V, F56K/N55K/Y51A, F56K/N55K/Y51N, F56K/N55K/Y51Q, F56K/N55K/Y51S, F56K/N55K/Y51G, F56K/N55S/Y51L, F56K/N55S/Y51V, F56K/N55S/Y51A, F56K/N55S/Y51N, F56K/N55S/Y51Q, F56K/N55S/Y51S, F56K/N55S/Y51G, F56K/N55G/Y51L, F56K/N55G/Y51V, F56K/N55G/Y51A, F56K/N55G/Y51N, F56K/N55G/Y51Q, F56K/N55G/Y51S, F56K/N55G/Y51G, F56K/N55A/Y51L, F56K/N55A/Y51V, F56K/N55A/Y51A, F56K/N55A/Y51N, F56K/N55A/Y51Q, F56K/N55A/Y51S, F56K/N55A/Y51G, F56K/N55T/Y51L, F56K/N55T/Y51V, F56K/N55T/Y51A, F56K/N55T/Y51N, F56K/N55T/Y51Q,F56K/N55T/Y51S, F56K/N55T/Y51G, F56E/N55R, F56E/N55K, F56D/N55R, F56D/N55K, F56R/N55E, F56R/N55D, F56K/N55E 또는 F56K/N55D를 포함한다.
(ⅱ)에서, 변이체는 바람직하게는 Y51R/F56Q, Y51N/F56N, Y51M/F56Q, Y51L/F56Q, Y51I/F56Q, Y51V/F56Q, Y51A/F56Q, Y51P/F56Q, Y51G/F56Q, Y51C/F56Q, Y51Q/F56Q, Y51N/F56Q, Y51S/F56Q, Y51E/F56Q, Y51D/F56Q, Y51K/F56Q 또는 Y51H/F56Q를 포함한다.
(ⅱ)에서, 변이체는 바람직하게는 Y51T/F56Q, Y51Q/F56Q 또는 Y51A/F56Q를 포함한다.
(ⅱ)에서, 변이체는 바람직하게는 Y51T/F56F, Y51T/F56M, Y51T/F56L, Y51T/F56I, Y51T/F56V, Y51T/F56A, Y51T/F56P, Y51T/F56G, Y51T/F56C, Y51T/F56Q, Y51T/F56N, Y51T/F56T, Y51T/F56S, Y51T/F56E, Y51T/F56D, Y51T/F56K, Y51T/F56H 또는 Y51T/F56R을 포함한다.
(ⅱ)에서, 변이체는 바람직하게는 Y51T/N55Q, Y51T/N55S 또는 Y51T/N55A를 포함한다.
(ⅱ)에서, 변이체는 바람직하게는 Y51A/F56F, Y51A/F56L, Y51A/F56I, Y51A/F56V, Y51A/F56A, Y51A/F56P, Y51A/F56G, Y51A/F56C, Y51A/F56Q, Y51A/F56N, Y51A/F56T, Y51A/F56S, Y51A/F56E, Y51A/F56D, Y51A/F56K, Y51A/F56H 또는 Y51A/F56R을 포함한다.
(ⅱ)에서, 변이체는 바람직하게는 Y51C/F56A, Y51E/F56A, Y51D/F56A, Y51K/F56A, Y51H/F56A, Y51Q/F56A, Y51N/F56A, Y51S/F56A, Y51P/F56A 또는 Y51V/F56A를 포함한다.
(xi)에서, 변이체는 바람직하게는 Y51/P52, Y51/P52/A53, P50 내지 P52, P50 내지 A53, K49 내지 Y51, K49 내지 A53의 결실 및 단일 프롤린(P), K49 내지 S54에 의한 대체 및 단일 P, Y51 내지 A53, Y51 내지 S54, N55/F56, N55 내지 S57, N55/F56에 의한 대체 및 단일 P, N55/F56에 의한 대체 및 단일 글라이신(G), N55/F56에 의한 대체 및 단일 알라닌(A), N55/F56에 의한 대체 및 단일 P 및 Y51N, N55/F56에 의한 대체 및 단일 P 및 Y51Q, N55/F56에 의한 대체 및 단일 P 및 Y51S, N55/F56에 의한 대체 및 단일 G 및 Y51N, N55/F56에 의한 대체 및 단일 G 및 Y51Q, N55/F56에 의한 대체 및 단일 G 및 Y51S, N55/F56에 의한 대체 및 단일 A 및 Y51N, N55/F56에 의한 대체 및 단일 A/Y51Q 또는 N55/F56에 의한 대체 및 단일 A 및 Y51S에 의한 대체를 포함한다.
변이체는 더 바람직하게는 D195N/E203N, D195Q/E203N, D195N/E203Q, D195Q/E203Q, E201N/E203N, E201Q/E203N, E201N/E203Q, E201Q/E203Q, E185N/E203Q, E185Q/E203Q, E185N/E203N, E185Q/E203N, D195N/E201N/E203N, D195Q/E201N/E203N, D195N/E201Q/E203N, D195N/E201N/E203Q, D195Q/E201Q/E203N, D195Q/E201N/E203Q, D195N/E201Q/E203Q, D195Q/E201Q/E203Q, D149N/E201N, D149Q/E201N, D149N/E201Q, D149Q/E201Q, D149N/E201N/D195N, D149Q/E201N/D195N, D149N/E201Q/D195N, D149N/E201N/D195Q, D149Q/E201Q/D195N, D149Q/E201N/D195Q, D149N/E201Q/D195Q, D149Q/E201Q/D195Q, D149N/E203N, D149Q/E203N, D149N/E203Q, D149Q/E203Q, D149N/E185N/E201N, D149Q/E185N/E201N, D149N/E185Q/E201N, D149N/E185N/E201Q, D149Q/E185Q/E201N, D149Q/E185N/E201Q, D149N/E185Q/E201Q, D149Q/E185Q/E201Q, D149N/E185N/E203N, D149Q/E185N/E203N, D149N/E185Q/E203N, D149N/E185N/E203Q, D149Q/E185Q/E203N, D149Q/E185N/E203Q, D149N/E185Q/E203Q, D149Q/E185Q/E203Q, D149N/E185N/E201N/E203N, D149Q/E185N/E201N/E203N, D149N/E185Q/E201N/E203N, D149N/E185N/E201Q/E203N, D149N/E185N/E201N/E203Q, D149Q/E185Q/E201N/E203N, D149Q/E185N/E201Q/E203N, D149Q/E185N/E201N/E203Q, D149N/E185Q/E201Q/E203N, D149N/E185Q/E201N/E203Q, D149N/E185N/E201Q/E203Q, D149Q/E185Q/E201Q/E203Q, D149Q/E185Q/E201N/E203Q, D149Q/E185N/E201Q/E203Q, D149N/E185Q/E201Q/E203Q, D149Q/E185Q/E201Q/E203N, D149N/E185N/D195N/E201N/E203N, D149Q/E185N/D195N/E201N/E203N, D149N/E185Q/D195N/E201N/E203N, D149N/E185N/D195Q/E201N/E203N, D149N/E185N/D195N/E201Q/E203N, D149N/E185N/D195N/E201N/E203Q, D149Q/E185Q/D195N/E201N/E203N, D149Q/E185N/D195Q/E201N/E203N, D149Q/E185N/D195N/E201Q/E203N, D149Q/E185N/D195N/E201N/E203Q, D149N/E185Q/D195Q/E201N/E203N, D149N/E185Q/D195N/E201Q/E203N, D149N/E185Q/D195N/E201N/E203Q, D149N/E185N/D195Q/E201Q/E203N, D149N/E185N/D195Q/E201N/E203Q, D149N/E185N/D195N/E201Q/E203Q, D149Q/E185Q/D195Q/E201N/E203N, D149Q/E185Q/D195N/E201Q/E203N, D149Q/E185Q/D195N/E201N/E203Q, D149Q/E185N/D195Q/E201Q/E203N, D149Q/E185N/D195Q/E201N/E203Q, D149Q/E185N/D195N/E201Q/E203Q, D149N/E185Q/D195Q/E201Q/E203N, D149N/E185Q/D195Q/E201N/E203Q, D149N/E185Q/D195N/E201Q/E203Q, D149N/E185N/D195Q/E201Q/E203Q, D149Q/E185Q/D195Q/E201Q/E203N, D149Q/E185Q/D195Q/E201N/E203Q, D149Q/E185Q/D195N/E201Q/E203Q, D149Q/E185N/D195Q/E201Q/E203Q, D149N/E185Q/D195Q/E201Q/E203Q, D149Q/E185Q/D195Q/E201Q/E203Q, D149N/E185R/E201N/E203N, D149Q/E185R/E201N/E203N, D149N/E185R/E201Q/E203N, D149N/E185R/E201N/E203Q, D149Q/E185R/E201Q/E203N, D149Q/E185R/E201N/E203Q, D149N/E185R/E201Q/E203Q, D149Q/E185R/E201Q/E203Q, D149R/E185N/E201N/E203N, D149R/E185Q/E201N/E203N, D149R/E185N/E201Q/E203N, D149R/E185N/E201N/E203Q, D149R/E185Q/E201Q/E203N, D149R/E185Q/E201N/E203Q, D149R/E185N/E201Q/E203Q, D149R/E185Q/E201Q/E203Q, D149R/E185N/D195N/E201N/E203N, D149R/E185Q/D195N/E201N/E203N, D149R/E185N/D195Q/E201N/E203N, D149R/E185N/D195N/E201Q/E203N, D149R/E185Q/D195N/E201N/E203Q, D149R/E185Q/D195Q/E201N/E203N, D149R/E185Q/D195N/E201Q/E203N, D149R/E185Q/D195N/E201N/E203Q, D149R/E185N/D195Q/E201Q/E203N, D149R/E185N/D195Q/E201N/E203Q, D149R/E185N/D195N/E201Q/E203Q, D149R/E185Q/D195Q/E201Q/E203N, D149R/E185Q/D195Q/E201N/E203Q, D149R/E185Q/D195N/E201Q/E203Q, D149R/E185N/D195Q/E201Q/E203Q, D149R/E185Q/D195Q/E201Q/E203Q, D149N/E185R/D195N/E201N/E203N, D149Q/E185R/D195N/E201N/E203N, D149N/E185R/D195Q/E201N/E203N, D149N/E185R/D195N/E201Q/E203N, D149N/E185R/D195N/E201N/E203Q, D149Q/E185R/D195Q/E201N/E203N, D149Q/E185R/D195N/E201Q/E203N, D149Q/E185R/D195N/E201N/E203Q, D149N/E185R/D195Q/E201Q/E203N, D149N/E185R/D195Q/E201N/E203Q, D149N/E185R/D195N/E201Q/E203Q, D149Q/E185R/D195Q/E201Q/E203N, D149Q/E185R/D195Q/E201N/E203Q, D149Q/E185R/D195N/E201Q/E203Q, D149N/E185R/D195Q/E201Q/E203Q, D149Q/E185R/D195Q/E201Q/E203Q, D149N/E185R/D195N/E201R/E203N, D149Q/E185R/D195N/E201R/E203N, D149N/E185R/D195Q/E201R/E203N, D149N/E185R/D195N/E201R/E203Q, D149Q/E185R/D195Q/E201R/E203N, D149Q/E185R/D195N/E201R/E203Q, D149N/E185R/D195Q/E201R/E203Q, D149Q/E185R/D195Q/E201R/E203Q, E131D/K49R, E101N/N102F, E101N/N102Y, E101N/N102W, E101F/N102F, E101F/N102Y, E101F/N102W, E101Y/N102F, E101Y/N102Y, E101Y/N102W, E101W/N102F, E101W/N102Y, E101W/N102W, E101N/N102R, E101F/N102R, E101Y/N102R 또는 E101W/N102F를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드가 기공을 통해 이동하면서 더 적은 뉴클레오타이드가 전류에 기여하는 기공을 형성하는 본 발명의 바람직한 변이체는 Y51A/F56A, Y51A/F56N, Y51I/F56A, Y51L/F56A, Y51T/F56A, Y51I/F56N, Y51L/F56N 또는 Y51T/F56N 또는 더 바람직하게는 Y51I/F56A, Y51L/F56A 또는 Y51T/F56A를 포함한다. 상기 기재된 바대로, 이것은 (폴리뉴클레오타이드가 기공을 통해 이동하면서) 관찰된 전류와 폴리뉴클레오타이드 사이의 직접적인 관계를 확인하는 것이 더 쉽게 한다.
증가한 범위를 나타내는 기공을 형성하는 바람직한 변이체는 하기 위치에서의 돌연변이를 포함한다:
Y51, F56, D149, E185, E201 및 E203;
N55 및 F56;
Y51 및 F56;
Y51, N55 및 F56; 또는
F56 및 N102.
증가한 범위를 나타내는 기공을 형성하는 바람직한 변이체는 하기를 포함한다:
Y51N, F56A, D149N, E185R, E201N 및 E203N;
N55S 및 F56Q;
Y51A 및 F56A;
Y51A 및 F56N;
Y51I 및 F56A;
Y51L 및 F56A;
Y51T 및 F56A;
Y51I 및 F56N;
Y51L 및 F56N;
Y51T 및 F56N;
Y51T 및 F56Q;
Y51A, N55S 및 F56A;
Y51A, N55S 및 F56N;
Y51T, N55S 및 F56Q; 또는
F56Q 및 N102R.
폴리뉴클레오타이드가 기공을 통해 이동하면서 더 적은 뉴클레오타이드가 전류에 기여하는 기공을 형성하는 바람직한 변이체는 하기를 포함한다:
N55 및 F56의 위치에서의 돌연변이, 예컨대 N55X 및 F56Q(식 중, X는 임의의 아미노산임); 또는
Y51 및 F56의 위치에서의 돌연변이, 예컨대 Y51X 및 F56Q(식 중, X는 임의의 아미노산임).
특히 바람직한 변이체는 Y51A 및 F56Q를 포함한다.
증가한 처리량을 나타내는 기공을 형성하는 바람직한 변이체는 하기 위치에서의 돌연변이를 포함한다:
D149, E185 및 E203;
D149, E185, E201 및 E203; 또는
D149, E185, D195, E201 및 E203.
증가한 처리량을 나타내는 기공을 형성하는 바람직한 변이체는 하기를 포함한다:
D149N, E185N 및 E203N;
D149N, E185N, E201N 및 E203N;
D149N, E185R, D195N, E201N 및 E203N; 또는
D149N, E185R, D195N, E201R 및 E203N.
폴리뉴클레오타이드의 포획이 증가한 기공을 형성하는 바람직한 변이체는 하기에서의 돌연변이를 포함한다:
D43N/Y51T/F56Q;
E44N/Y51T/F56Q;
D43N/E44N/Y51T/F56Q;
Y51T/F56Q/Q62R;
D43N/Y51T/F56Q/Q62R;
E44N/Y51T/F56Q/Q62R; 또는
D43N/E44N/Y51T/F56Q/Q62R.
바람직한 변이체는 하기 돌연변이를 포함한다:
D149R/E185R/E201R/E203R 또는 Y51T/F56Q/D149R/E185R/E201R/E203R;
D149N/E185N/E201N/E203N 또는 Y51T/F56Q/D149N/E185N/E201N/E203N;
E201R/E203R 또는 Y51T/F56Q/E201R/E203R
E201N/E203R 또는 Y51T/F56Q/E201N/E203R;
E203R 또는 Y51T/F56Q/E203R;
E203N 또는 Y51T/F56Q/E203N;
E201R 또는 Y51T/F56Q/E201R;
E201N 또는 Y51T/F56Q/E201N;
E185R 또는 Y51T/F56Q/E185R;
E185N 또는 Y51T/F56Q/E185N;
D149R 또는 Y51T/F56Q/D149R;
D149N 또는 Y51T/F56Q/D149N;
R142E 또는 Y51T/F56Q/R142E;
R142N 또는 Y51T/F56Q/R142N;
R192E 또는 Y51T/F56Q/R192E; 또는
R192N 또는 Y51T/F56Q/R192N.
바람직한 변이체는 하기 돌연변이를 포함한다:
Y51A/F56Q/E101N/N102R;
Y51A/F56Q/R97N/N102G;
Y51A/F56Q/R97N/N102R;
Y51A/F56Q/R97N;
Y51A/F56Q/R97G;
Y51A/F56Q/R97L;
Y51A/F56Q/N102R;
Y51A/F56Q/N102F;
Y51A/F56Q/N102G;
Y51A/F56Q/E101R;
Y51A/F56Q/E101F;
Y51A/F56Q/E101N; 또는
Y51A/F56Q/E101G.
변이체는 바람직하게는 T150에서의 돌연변이를 추가로 포함한다. 증가한 삽입을 나타내는 기공을 형성하는 바람직한 변이체는 T150I를 포함한다. T150에서의 돌연변이, 예컨대 T150I는 임의의 돌연변이 또는 상기 기재된 돌연변이의 조합과 조합될 수 있다.
서열 번호 2의 바람직한 변이체는 (a) R97W 및 (b) Y51 및/또는 F56에서의 돌연변이를 포함한다. 서열 번호 2의 바람직한 변이체는 (a) R97W 및 (b) Y51R/H/K/D/E/S/T/N/Q/C/G/P/A/V/I/L/M 및/또는 F56R/H/K/D/E/S/T/N/Q/C/G/P/A/V/I/L/M을 포함한다. 서열 번호 2의 바람직한 변이체는 (a) R97W 및 (b) Y51L/V/A/N/Q/S/G 및/또는 F56A/Q/N을 포함한다. 서열 번호 2의 바람직한 변이체는 (a) R97W 및 (b) Y51A 및/또는 F56Q를 포함한다. 서열 번호 2의 바람직한 변이체는 R97W, Y51A 및 F56Q를 포함한다.
본 발명의 돌연변이체 단량체에서, 서열 번호 2의 변이체는 바람직하게는 R192에서의 돌연변이를 포함한다. 변이체는 바람직하게는 R192D/Q/F/S/T/N/E, R192D/Q/F/S/T 또는 R192D/Q를 포함한다. 서열 번호 2의 바람직한 변이체는 (a) R97W, (b) Y51 및/또는 F56에서의 돌연변이 및 (c) R192에서의 돌연변이, 예컨대 R192D/Q/F/S/T/N/E, R192D/Q/F/S/T 또는 R192D/Q를 포함한다. 서열 번호 2의 바람직한 변이체는 (a) R97W, (b) Y51R/H/K/D/E/S/T/N/Q/C/G/P/A/V/I/L/M 및/또는 F56R/H/K/D/E/S/T/N/Q/C/G/P/A/V/I/L/M 및 (c) R192에서의 돌연변이, 예컨대 R192D/Q/F/S/T/N/E, R192D/Q/F/S/T 또는 R192D/Q를 포함한다. 서열 번호 2의 바람직한 변이체는 (a) R97W, (b) Y51L/V/A/N/Q/S/G 및/또는 F56A/Q/N 및 (c) R192에서의 돌연변이, 예컨대 R192D/Q/F/S/T/N/E, R192D/Q/F/S/T 또는 R192D/Q를 포함한다. 서열 번호 2의 바람직한 변이체는 (a) R97W, (b) Y51A 및/또는 F56Q 및 (c) R192에서의 돌연변이, 예컨대 R192D/Q/F/S/T/N/E, R192D/Q/F/S/T 또는 R192D/Q를 포함한다. 서열 번호 2의 바람직한 변이체는 R97W, Y51A, F56Q 및 R192D/Q/F/S/T 또는 R192D/Q를 포함한다. 서열 번호 2의 바람직한 변이체는 R97W, Y51A, F56Q 및 R192D를 포함한다. 서열 번호 2의 바람직한 변이체는 R97W, Y51A, F56Q 및 R192Q를 포함한다. 특정한 위치에서의 상이한 아미노산이 / 기호에 의해 분리된 상기 문단에서, / 기호는 "또는"을 의미한다. 예를 들어, R192D/Q는 R192D 또는 R192Q를 의미한다.
상기 기재된 서열 번호 2의 임의의 상기 바람직한 변이체는 추가로 포함할 수 있다 본 발명의 돌연변이체 단량체에서, 서열 번호 2의 변이체는 바람직하게는 R93에서의 돌연변이를 포함한다. 서열 번호 2의 바람직한 변이체는 (a) R93W 및 (b) Y51 및/또는 F56에서의 돌연변이, 바람직하게는 Y51A 및 F56Q를 포함한다. D 또는 R192N. V105, A106 및 I107의 결실.
서열 번호 2의 임의의 상기 바람직한 변이체는 K94N/Q 돌연변이를 포함할 수 있다. 서열 번호 2의 임의의 상기 바람직한 변이체는 F191T 돌연변이를 포함할 수 있다. 본 발명은 실시예에 개시된 변이체에 존재하는 돌연변이의 조합을 포함하는 서열 번호 2에 기재된 서열의 변이체를 포함하는 돌연변이체 CsgG 단량체를 또한 제공한다.
천연 아미노산을 도입하거나 치환하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 메티오닌(M)은 돌연변이체 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에서 관련 위치에서 아르기닌에 대한 코돈(CGT)에 의해 메티오닌에 대한 코돈(ATG)을 대체함으로써 아르기닌(R)에 의해 치환될 수 있다. 이후, 폴리뉴클레오타이드는 하기 기재된 바대로 발현될 수 있다.
비천연 아미노산을 도입하거나 치환하는 방법은 당해 분야에 또한 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 비천연 아미노산은 돌연변이체 단량체를 발현하기 위해 사용된 IVTT 시스템에서 합성 아미노아실-tRNA를 포함시킴으로써 도입될 수 있다. 대안적으로, 이들은 이들 특정한 아미노산의 합성(즉, 비천연) 유사체의 존재 하에 특정한 아미노산에 대해 영양요구성인 이. 콜라이에서의 돌연변이체 단량체를 발현시킴으로써 도입될 수 있다. 이들은 돌연변이체 단량체가 부분 펩타이드 합성을 사용하여 제조되는 경우 네이키드 결찰에 의해 또한 제조될 수 있다.
변이체
상기 기재된 특정한 돌연변이 이외에, 변이체는 다른 돌연변이를 포함할 수 있다. 서열 번호 2의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐, 변이체는 바람직하게는 아미노산 동일성에 기초하여 그 서열과 적어도 50% 상동성일 것이다. 더 바람직하게는, 변이체는 전체 서열에 걸쳐 서열 번호 2의 아미노산 서열과의 아미노산 동일성에 기초하여 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 97% 또는 99% 상동성일 수 있다. 100개 또는 이것 초과, 예를 들어 125개, 150개, 175개 또는 200개 또는 이것 초과의 인접한 아미노산의 스트레치에 걸쳐 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 90% 또는 95%의 아미노산 동일성("하드 상동성")이 존재할 수 있다.
당해 분야에서 표준 방법은 상동성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, UWGCG Package는 예를 들어 이의 디폴트 설정에서 사용된 상동성을 계산하기 위해 이용될 수 있는 BESTFIT 프로그램을 제공한다(Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395). PILEUP 및 BLAST 알고리즘은 예를 들어 문헌[Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S.F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10]에 기재된 바대로 상동성을 계산하거나 서열을 한 줄로 세우기 위해(예컨대, (통상적으로 이의 디폴트 설정에서) 동등한 잔기 또는 상응하는 서열을 확인하는 것) 이용될 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 생물 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공중에게 이용 가능하다.
서열 번호 2는 에스체리치아 콜라이 Str. K-12 substr. MC4100으로부터의 야생형 CsgG 단량체이다. 서열 번호 2의 변이체는 또 다른 CsgG 동족체에 존재하는 임의의 치환을 포함할 수 있다. 바람직한 CsgG 동족체는 서열 번호 3 내지 7 및 26 내지 41에 기재되어 있다. 변이체는 서열 번호 2와 비교하여 서열 번호 3 내지 7 및 26 내지 41에 존재하는 하나 이상의 치환의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 서열 번호 2와 서열 번호 3 내지 7 및 서열 번호 26 내지 41 중 임의의 하나 사이에 상이한 서열 번호 2에서의 임의의 하나 이상의 위치에서 이루어질 수 있다. 이러한 돌연변이는 서열 번호 3 내지 7 및 서열 번호 26 내지 41 중 임의의 하나에서의 상응하는 위치로부터의 아미노산에 의한 서열 번호 2에서의 아미노산의 치환일 수 있다. 대안적으로, 이들 위치 중 임의의 하나에서의 돌연변이는 임의의 아미노산에 의한 치환일 수 있거나, 결실 또는 삽입 돌연변이, 예컨대 1개 내지 10개의 아미노산, 예컨대 2개 내지 8개 또는 3개 내지 6개의 아미노산의 결실 또는 삽입일 수 있다. 본 명세서에 개시된 돌연변이 이외에, 서열 번호 2와 서열 번호 3 내지 7 및 서열 번호 26 내지 41의 모두 사이에 보존된 아미노산은 바람직하게는 본 발명의 변이체에 존재한다. 그러나, 보존적 돌연변이는 서열 번호 2와 서열 번호 3 내지 7 및 서열 번호 26 내지 41의 모두 사이에 보존된 이들 위치 중 임의의 하나 이상에서 이루어질 수 있다.
본 발명은, 서열 번호 2에서의 특정한 위치에 상응하는 CsgG 단량체의 구조의 위치에서의 서열 번호 2의 특정한 위치로 치환된, 본 명세서에 기재된 임의의 하나 이상의 아미노산을 포함하는 기공 형성 CsgG 돌연변이체 단량체를 제공한다. 상응하는 위치는 당해 분야에서의 표준 기법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 언급된 PILEUP 및 BLAST 알고리즘은 서열 번호 2에 의해 CsgG 단량체의 서열을 정렬하고 이에 의해 상응하는 잔기를 확인하기 위해 이용될 수 있다.
특히, 본 발명은 하기 중 임의의 하나 이상을 포함하는 기공 형성 CsgG 돌연변이체 단량체를 제공한다:
- 서열 번호 2에서의 R97에 상응하는 위치에서의 W;
- 서열 번호 2에서의 R93에 상응하는 위치에서의 W;
- 서열 번호 2에서의 R97에 상응하는 위치에서의 Y;
- 서열 번호 2에서의 R93에 상응하는 위치에서의 Y;
- 서열 번호 2에서의 R93 및 R97에 상응하는 위치의 각각에서의 Y;
- 서열 번호 2에서의 R192에 상응하는 위치에서의 D;
- 서열 번호 2에서의 V105-I107에 상응하는 위치에서의 잔기의 결실;
- 서열 번호 2에서의 F193 내지 L199에 상응하는 위치 중 하나 이상에서의 잔기의 결실;
- 서열 번호 2에서의 F195 내지 L199에 상응하는 위치에서의 잔기의 결실;
- 서열 번호 2에서의 F193 내지 L199에 상응하는 위치에서의 잔기의 결실;
- 서열 번호 2에서의 F191에 상응하는 위치에서의 T;
- 서열 번호 2에서의 K49에 상응하는 위치에서의 Q;
- 서열 번호 2에서의 K49에 상응하는 위치에서의 N;
- 서열 번호 2에서의 K42에 상응하는 위치에서의 Q;
- 서열 번호 2에서의 E44에 상응하는 위치에서의 Q;
- 서열 번호 2에서의 E44에 상응하는 위치에서의 N;
- 서열 번호 2에서의 L90에 상응하는 위치에서의 R;
- 서열 번호 2에서의 L91에 상응하는 위치에서의 R;
- 서열 번호 2에서의 I95에 상응하는 위치에서의 R;
- 서열 번호 2에서의 A99에 상응하는 위치에서의 R;
- 서열 번호 2에서의 E101에 상응하는 위치에서의 H;
- 서열 번호 2에서의 E101에 상응하는 위치에서의 K;
- 서열 번호 2에서의 E101에 상응하는 위치에서의 N;
- 서열 번호 2에서의 E101에 상응하는 위치에서의 Q;
- 서열 번호 2에서의 E101에 상응하는 위치에서의 T;
- 서열 번호 2에서의 Q114에 상응하는 위치에서의 K.
본 발명의 CsgG 기공 형성 단량체는 바람직하게는 서열 번호 2에서의 Y51에 상응하는 위치에서 A 및/또는 서열 번호 2에서의 F56에 상응하는 위치에서 Q를 추가로 포함한다.
기공 형성 돌연변이체 단량체는 통상적으로 야생형 CsgG 단량체와 동일한 3D 구조, 예컨대 서열 번호 2의 서열을 갖는 CsgG 단량체와 동일한 3D 구조를 형성하는 능력을 보유한다. CsgG의 3D 구조는 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Cao et al (2014) PNAS E5439-E5444]에 개시되어 있다. 임의의 수의 돌연변이는 본 명세서에 기재된 돌연변이 이외에 야생형 CsgG 서열에서 이루어질 수 있되, 단 CsgG 돌연변이체 단량체는 본 발명의 돌연변이에 의해 이것에 부여된 개선된 특성을 보유한다.
통상적으로, CsgG 단량체는 3개의 알파 나선 및 5개의 베타 시트를 포함하는 구조를 형성하는 능력을 보유할 것이다. 본 발명자들은 특히 돌연변이가, 폴리펩타이드를 전좌시킬 수 있는 막관통 기공을 형성하는 CsgG 단량체의 능력에 영향을 미치지 않으면서, 적어도 (서열 번호 2에서 S63에서 시작하는) 제1 알파 나선에 대한 N 말단인 CsgG의 영역에서, 제2 알파 나선(서열 번호 2의 G85 내지 A99)에서, 제2 알파 나선과 제1 베타 시트 사이의 루프(서열 번호 2의 Q100 내지 N120)에서, 제4 베타 시트 및 제5 베타 시트(각각 서열 번호 2의 S173 내지 R192 및 R198 내지 T107)에서 및 제4 베타 시트와 제5 베타 시트 사이의 루프(서열 번호 2의 F193 내지 Q197)에서 이루어질 수 있다는 것을 보여주었다. 따라서, 추가의 돌연변이가 폴리뉴클레오타이드를 전좌시킬 수 있는 기공을 형성하는 단량체의 능력에 영향을 미치지 않으면서 임의의 CsgG 단량체에서 임의의 이들 영역에서 이루어질 수 있는 것으로 고안된다. 돌연변이가 폴리뉴클레오타이드를 전좌시킬 수 있는 기공을 형성하는 단량체의 능력에 영향을 미치지 않으면서 다른 영역에서, 예컨대 임의의 알파 나선(서열 번호 2의 S63 내지 R76, G85 내지 A99 또는 V211 내지 L236)에서 또는 임의의 베타 시트(서열 번호 2의 I121 내지 N133, K135 내지 R142, I146 내지 R162, S173 내지 R192 또는 R198 내지 T107)에서 이루어질 수 있는 것으로 또한 예상된다. 하나 이상의 아미노산의 결실이 폴리뉴클레오타이드를 전좌시킬 수 있는 기공을 형성하는 단량체의 능력에 영향을 미치지 않으면서 알파 나선 및 베타 시트를 연결하는 임의의 루프 영역에서 및/또는 CsgG 단량체의 N 말단 및/또는 C 말단 영역에서 이루어질 수 있는 것으로 또한 예상된다.
아미노산 치환, 예를 들어 1개 이하, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 30개의 치환은 상기 기재된 것 이외에 서열 번호 2의 아미노산 서열에 이루어질 수 있다. 보존적 치환은 유사한 화학 구조, 유사한 화학 특성 또는 유사한 측쇄 용적의 다른 아미노산에 의해 아미노산을 대체한다. 도입된 아미노산은 이들이 대체하는 아미노산과 유사한 극성, 친수화도, 소수화도, 염기도, 산도, 중성도 또는 전하를 가질 수 있다. 대안적으로, 보존적 치환은 이미 존재하는 방향족 또는 지방족 아미노산 대신에 방향족 또는 지방족인 또 다른 아미노산을 도입할 수 있다. 보존적 아미노산 변경은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 하기 표 2에 정의된 바와 같은 20개의 주요 아미노산의 특성에 따라 선택될 수 있다. 아미노산이 유사한 극성을 갖는 경우, 이것은 표 3에서 아미노산 측쇄에 대한 수치요법 스케일(hydropathy scale)에 참조하여 또한 결정될 수 있다.
서열 번호 2의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기는 상기 기재된 폴리펩타이드로부터 추가로 결실될 수 있다. 1개 이하, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 30개 또는 이것 초과의 잔기가 결실될 수 있다.
변이체는 서열 번호 2의 단편을 포함할 수 있다. 이러한 단편은 기공 형성 활성을 보유한다. 단편은 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개 또는 적어도 250개의 아미노산 길이일 수 있다. 이러한 단편은 기공을 제조하도록 사용될 수 있다. 단편은 바람직하게는 서열 번호 2의 막 스패닝 도메인, 즉 K135-Q153 및 S183-S208을 포함한다.
하나 이상의 아미노산은 상기 기재된 폴리펩타이드에 대안적으로 또는 추가로 부가될 수 있다. 연장은 서열 번호 2의 아미노산 서열의 아미노 말단 또는 카복시 말단 또는 폴리펩타이드 변이체 또는 이의 단편에서 제공될 수 있다. 연장은 꽤 짧은, 예를 들어 1개 내지 10개의 아미노산 길이일 수 있다. 대안적으로, 연장은 더 긴, 예를 들어 50개 이하 또는 100개의 아미노산일 수 있다. 운반 단백질은 본 발명에 따른 아미노산 서열에 융합될 수 있다. 다른 융합 단백질은 하기 더 자세히 기재되어 있다.
상기 기재된 바대로, 변이체는 서열 번호 2의 것과 다른 아미노산 서열을 갖고 기공을 형성하는 이의 능력을 보유하는 폴리펩타이드이다. 변이체는 통상적으로 기공 형성을 담당하는 서열 번호 2의 영역을 함유한다. β 배럴을 함유하는 CsgG의 기공 형성 능력은 각각의 아단위에서의 β 시트에 의해 제공된다. 서열 번호 2의 변이체는 통상적으로 β 시트를 형성하는 서열 번호 2에서의 영역, 즉 K135-Q153 및 S183-S208을 포함한다. 하나 이상의 변형은 생성된 변이체가 기공을 형성하는 이의 능력을 보유하는 한 β 시트를 형성하는 서열 번호 2의 영역에 이루어질 수 있다. 서열 번호 2의 변이체는 바람직하게는 이의 α-나선 및/또는 루프 영역 내에 하나 이상의 변형, 예컨대 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.
CsgG로부터 유래된 단량체는 단량체가 천연에서 이러한 서열을 함유하지 않는 세포로부터의 이의 분비를 수월하게 하도록, 예를 들어 스트렙타비딘 태그의 첨가에 의해 또는 신호 서열의 첨가에 의해, 이의 확인 또는 정제를 돕도록 변형될 수 있다. 다른 적합한 태그는 하기 더 자세히 기재되어 있다. 단량체는 공개성 라벨에 의해 표지될 수 있다. 공개성 라벨은 단량체가 검출되게 하는 임의의 적합한 라벨일 수 있다. 적합한 라벨은 하기 기재되어 있다.
CsgG로부터 유래된 단량체는 또한 D-아미노산을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, CsgG로부터 유래된 단량체는 L-아미노산 및 D-아미노산의 혼합물을 포함할 수 있다. 이것은 이러한 단백질 또는 펩타이드를 제조하기 위해 당해 분야에서 관습적이다.
CsgG로부터 유래된 단량체는 뉴클레오타이드 구별을 수월하게 하도록 하나 이상의 특정한 변형을 함유한다. CsgG로부터 유래된 단량체는 또한 이것이 기공 형성을 방해하지 않는 한 다른 비특정한 변형을 함유할 수 있다. 다수의 비특정한 측쇄 변형은 당해 분야에 공지되어 있고, CsgG로부터 유래된 단량체의 측쇄에 이루어질 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 알데하이드와의 반응에 의한 아미노산의 환원성 알킬화, 이어서 NaBH4에 의한 환원, 메틸아세트이미데이트에 의한 아미딘화 또는 아세트산 무수물에 의한 아실화를 포함한다.
CsgG로부터 유래된 단량체는 당해 분야에 공지된 표준 방법을 이용하여 제조될 수 있다. CsgG로부터 유래된 단량체는 합성으로 또는 재조합 수단에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 단량체는 시험관내 번역 및 전사(in vitro translation and transcription: IVTT)에 의해 합성될 수 있다. 기공 및 단량체를 제조하기 위한 적합한 방법은 국제 출원 제PCT/GB09/001690호(WO 제2010/004273호로 공개됨), 제PCT/GB09/001679호(WO 제2010/004265호로 공개됨) 또는 제PCT/GB10/000133호(WO 제2010/086603호로 공개됨)에 기재되어 있다. 막으로 기공을 삽입하는 방법이 기재되어 있다.
몇몇 실시형태에서, 돌연변이체 단량체는 화학적으로 변형된다. 돌연변이체 단량체는 임의의 방식으로 및 임의의 부위에서 화학적으로 변형될 수 있다. 돌연변이체 단량체는 바람직하게는 하나 이상의 시스테인에 대한 분자의 부착(시스테인 연결), 하나 이상의 라이신에 대한 분자의 부착, 하나 이상의 비천연 아미노산에 대한 분자의 부착, 에피토프의 효소 변형 또는 말단의 변형에 의해 화학적으로 변형된다. 이러한 변형을 수행하기 위한 적합한 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 돌연변이체 단량체는 임의의 분자의 부착에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 단량체는 염료 또는 형광단의 부착에 의해 화학적으로 변형될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 돌연변이체 단량체는 단량체를 포함하는 기공과 표적 뉴클레오타이드 또는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 상호작용을 수월하게 하는 분자 어댑터에 의해 화학적으로 변형된다. 어댑터의 존재는 기공과 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 호스트-게스트 화학을 개선하고, 이로써 돌연변이체 단량체로부터 형성된 기공의 서열분석 능력을 개선한다. 호스트-게스트 화학의 원칙은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 어댑터는 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열과의 이의 상호작용을 개선하는 기공의 물리적 또는 화학적 특성에 효과를 갖는다. 어댑터는 기공의 배럴 또는 채널의 전하를 변경하거나 구체적으로 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열과 상호작용하고 이에 결합하여서 기공과의 이의 상호작용을 수월하게 할 수 있다.
분자 어댑터는 바람직하게는 환형 분자, 사이클로덱스트린, 혼성화할 수 있는 종, DNA 결합제 또는 인터킬레이터, 펩타이드 또는 펩타이드 유사체, 합성 중합체, 방향족 평면 분자, 작은 양으로 하전된 분자 또는 수소 결합할 수 있는 소분자이다.
어댑터는 환형일 수 있다. 환형 어댑터는 바람직하게는 기공과 동일한 대칭을 갖는다. CsgG가 통상적으로 중앙 축 주위에 8개 또는 0개의 아단위를 가지므로, 어댑터는 바람직하게는 8배 또는 9배 대칭을 갖는다. 이것은 하기 더 자세히 기재되어 있다.
어댑터는 통상적으로 호스트-게스트 화학을 통해 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열과 상호작용한다. 어댑터는 통상적으로 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열과 상호작용할 수 있다. 어댑터는 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열과 상호작용할 수 있는 하나 이상의 화학 기를 포함한다. 하나 이상의 화학 기는 바람직하게는 비공유 상호작용, 예컨대 소수성 상호작용, 수소 결합, 반 데르 발스 힘, π-양이온 상호작용 및/또는 정전기 힘에 의해 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열과 상호작용한다. 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열과 상호작용할 수 있는 하나 이상의 화학 기는 바람직하게는 양으로 하전된다. 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열과 상호작용할 수 있는 하나 이상의 화학 기는 더 바람직하게는 아미노기를 포함한다. 아미노기는 1차, 2차 또는 3차 탄소 원자에 부착될 수 있다. 어댑터는 훨씬 더 바람직하게는 아미노기의 고리, 예컨대 6개, 7개 또는 8개의 아미노기의 고리를 포함한다. 어댑터는 가장 바람직하게는 8개의 아미노기의 고리를 포함한다. 양성자화된 아미노기의 고리는 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 내의 음으로 하전된 포스페이트기와 상호작용할 수 있다.
기공 내의 어댑터의 정확한 배치는 돌연변이체 단량체를 포함하는 기공과 어댑터 사이의 호스트-게스트 화학에 의해 수월해질 수 있다. 어댑터는 바람직하게는 기공에서 하나 이상의 아미노산과 상호작용할 수 있는 하나 이상의 화학 기를 포함한다. 어댑터는 더 바람직하게는 비공유 상호작용, 예컨대 소수성 상호작용, 수소 결합, 반 데르 발스 힘, π-양이온 상호작용 및/또는 정전기 힘을 통해 기공에서 하나 이상의 아미노산과 상호작용할 수 있는 하나 이상의 화학 기를 포함한다. 기공에서 하나 이상의 아미노산과 상호작용할 수 있는 화학 기는 통상적으로 하이드록실 또는 아민이다. 하이드록실기는 1차, 2차 또는 3차 탄소 원자에 부착될 수 있다. 하이드록실기는 기공에서 비하전된 아미노산과 수소 결합을 형성할 수 있다. 기공과 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 상호작용을 수월하게 하는 임의의 어댑터를 사용할 수 있다.
적합한 어댑터는 사이클로덱스트린, 사이클릭 펩타이드 및 쿠커비투릴을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 어댑터는 바람직하게는 사이클로덱스트린 또는 이의 유도체이다. 사이클로덱스트린 또는 이의 유도체는 문헌[Eliseev, A. V., and Schneider, H-J. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116, 6081-6088]에 개시된 임의의 것일 수 있다. 어댑터는 더 바람직하게는 헵타키스-6-아미노-β-사이클로덱스트린(am7-βCD), 6-모노데옥시-6-모노아미노-β-사이클로덱스트린(am1-βCD) 또는 헵타키스-(6-데옥시-6-구아니디노)-사이클로덱스트린(gu7-βCD)이다. gu7-βCD에서의 구아니디노기는 am7-βCD에서의 1차 아민보다 훨씬 더 높은 pKa를 갖고, 그래서 이것은 더 양으로 하전된다. 이 gu7-βCD 어댑터는 기공에서의 뉴클레오타이드의 체류 시간을 증가시키기 위해, 측정된 잔류 전류의 정확성을 증가시키기 위해, 그리고 고온에서의 염기 검출률 또는 낮은 데이터 획득률을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
숙신이미딜 3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트(SPDP) 가교결합제가 하기 더 자세히 기재된 바대로 사용되는 경우, 어댑터는 바람직하게는 헵타키스(6-데옥시-6-아미노)-6-N-모노(2-피리딜)다이티오프로판오일-β-사이클로덱스트린(am6amPDP1-βCD)이다.
더 적합한 어댑터는 9개의 당 단위를 포함하는(그리고 이에 따라 9배 대칭을 갖는) γ-사이클로덱스트린을 포함한다. γ-사이클로덱스트린은 링커 분자를 함유할 수 있거나, 상기 기재된 β-사이클로덱스트린 예에서 사용된 하나 이상의 변형된 당 단위를 포함하도록 변형될 수 있다.
분자 어댑터는 바람직하게는 돌연변이체 단량체에 공유 결합으로 부착된다. 어댑터는 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 기공에 공유 결합으로 부착될 수 있다. 어댑터는 통상적으로 화학 연결을 통해 부착된다. 분자 어댑터가 시스테인 연결을 통해 부착된 경우, 하나 이상의 시스테인은 바람직하게는 치환에 의해 예를 들어 배럴에서 돌연변이체로 도입된다. 돌연변이체 단량체는 돌연변이체 단량체에서의 하나 이상의 시스테인에 대한 분자 어댑터의 부착에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 하나 이상의 시스테인은 천연 발생일 수, 즉 서열 번호 2에서의 1번 및/또는 215번 위치에서 있을 수 있다. 대안적으로, 돌연변이체 단량체는 다른 위치에서 도입된 하나 이상의 시스테인에 대한 분자의 부착에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 215번 위치에서의 시스테인은 예를 들어 치환에 의해 제거될 수 있어서, 분자 어댑터는 1번 위치에서의 시스테인 또는 또 다른 위치에서 도입된 시스테인보다는 그 위치에 부착하지 않도록 보장한다.
시스테인 잔기의 반응성은 인접한 잔기의 변형에 의해 증대될 수 있다. 예를 들어, 플랭킹 아르기닌, 히스티딘 또는 라이신 잔기의 염기성 기는 더 반응성인 S- 기의 것으로 시스테인 티올기의 pKa를 변경할 것이다. 시스테인 잔기의 반응성은 티올 보호기, 예컨대 dTNB에 의해 보호될 수 있다. 이것은 링커가 부착되기 전에 돌연변이체 단량체의 하나 이상의 시스테인 잔기와 반응할 수 있다. 분자는 돌연변이체 단량체에 직접적으로 부착될 수 있다. 분자는 바람직하게는 링커, 예컨대 화학 가교결합제 또는 펩타이드 링커를 사용하여 돌연변이체 단량체에 부착된다.
적합한 화학 가교결합제는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 바람직한 가교결합제는 2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 3-(피리딘-2-일다이설파닐)프로파노에이트, 2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 4-(피리딘-2-일다이설파닐)뷰타노에이트 및 2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 8-(피리딘-2-일다이설파닐)옥타나노에이트를 포함한다. 가장 바람직한 가교결합제는 숙신이미딜 3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트(SPDP)이다. 통상적으로, 분자/가교결합제 복합체가 돌연변이체 단량체에 공유 결합으로 부착되기 전에 분자는 이작용성 가교결합제에 공유 결합으로 부착되지만, 이작용성 가교결합제/단량체 복합체가 분자에 부착되기 전에 이작용성 가교결합제를 단량체에 공유 결합으로 또한 부착시킬 수 있다.
링커는 바람직하게는 다이티오트레이톨(DTT)에 저항적이다. 적합한 링커는 요오도아세트아마이드계 및 말레이미드계 링커를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
다른 실시형태에서, 단량체는 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질에 부착될 수 있다. 이것은 본 발명의 서열분석의 방법에서 사용될 수 있는 모듈식 서열분석 시스템을 형성한다. 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질은 하기 기재되어 있다.
폴리뉴클레오타이드 결합 단백질은 바람직하게는 돌연변이체 단량체에 공유 결합으로 부착된다. 단백질은 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 단량체에 공유 결합으로 부착될 수 있다. 단량체 및 단백질은 화학적으로 융합되거나 유전자 융합될 수 있다. 단량체 및 단백질은 전체 작제물이 단일 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 발현되는 경우 유전자 융합된다. 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질에 대한 단량체의 유전자 융합은 국제 출원 제PCT/GB09/001679호(WO 제2010/004265호로 공개됨)에 기재되어 있다.
폴리뉴클레오타이드 결합 단백질이 시스테인 연결을 통해 부착된 경우, 하나 이상의 시스테인은 바람직하게는 치환에 의해 돌연변이체로 도입된다. 하나 이상의 시스테인은 바람직하게는 동족체 중에 낮은 보존을 갖는 루프 영역으로 도입되어서, 돌연변이 또는 삽입이 관용성일 수 있다는 것을 나타낸다. 이것은 따라서 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질을 부착하기에 적합하다. 이러한 실시형태에서, 251번 위치에서의 천연 발생 시스테인은 제거될 수 있다. 시스테인 잔기의 반응성은 상기 기재된 바대로 변형에 의해 증대될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 결합 단백질은 돌연변이체 단량체에 직접적으로 또는 하나 이상의 링커를 통해 부착될 수 있다. 분자는 국제 출원 제PCT/GB10/000132호(WO 2010/086602로 공개됨)에 기재된 혼성화 링커를 이용하여 돌연변이체 단량체에 부착될 수 있다. 대안적으로, 펩타이드 링커를 사용할 수 있다. 펩타이드 링커는 아미노산 서열이다. 펩타이드 링커의 길이, 가요성 및 친수화도는 통상적으로 이것이 단량체 및 분자의 기능을 방해하지 않도록 설계된다. 바람직한 가요성 펩타이드 링커는 2개 내지 20개, 예컨대 4개, 6개, 8개, 10개 또는 16개의 세린 및/또는 글라이신 아미노산의 스트레치이다. 더 바람직한 가요성 링커는 (SG)1, (SG)2, (SG)3, (SG)4, (SG)5 및 (SG)8(여기서, S는 세린이고, G는 글라이신임)을 포함한다. 바람직한 경질 링커는 2개 내지 30개, 예컨대 4개, 6개, 8개, 16개 또는 24개의 프롤린 아미노산의 스트레치이다. 더 바람직한 경질 링커는 (P)12(여기서, P는 프롤린임)를 포함한다.
돌연변이체 단량체는 분자 어댑터 및 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질에 의해 화학적으로 변형될 수 있다.
분자(이것에 의해 단량체가 화학적으로 변형됨)는 국제 출원 제PCT/GB09/001690호(WO 제2010/004273호로 공개됨), 제PCT/GB09/001679호(WO 제2010/004265호로 공개됨) 또는 제PCT/GB10/000133호(WO 제2010/086603호로 공개됨)에 개시된 바대로 단량체에 직접적으로 부착되거나 링커를 통해 부착될 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 단백질, 예컨대 본 발명의 돌연변이체 단량체 및 기공은 예를 들어 히스티딘 잔기(his 태그), 아스파르트산 잔기(asp 태그), 스트렙타비딘 태그, flag 태그, SUMO 태그, GST 태그 또는 MBP 태그의 첨가에 의해, 또는 폴리펩타이드가 이러한 서열을 천연으로 함유하지 않는 세포로부터의 이의 분비를 수월하게 하도록 신호 서열의 첨가에 의해 이의 확인 또는 정제를 돕도록 변형될 수 있다. 유전자 태그를 도입하는 것의 대안은 단백질에서 네이티브 또는 조작된 위치로 태그를 화학적으로 반응시키는 것이다. 이의 예는 단백질의 밖에서 조작된 시스테인으로 겔-이동 시약을 반응시키는 것일 것이다. 이것은 헤몰리신 이종올리고머를 분리시키기 위한 방법으로서 입증된다(Chem Biol. 1997 Jul;4(7):497-505).
본 명세서에 기재된 임의의 단백질, 예컨대 본 발명의 돌연변이체 단량체 및 기공은 공개성 라벨에 의해 표지될 수 있다. 공개성 라벨은 단백질이 검출되게 하는 임의의 적합한 라벨일 수 있다. 적합한 라벨은 형광성 분자, 방사성 동위원소, 예를 들어 125I, 35S, 효소, 항체, 항원, 폴리뉴클레오타이드 및 리간드, 예컨대 바이오틴을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 명세서에 기재된 임의의 단백질, 예컨대 본 발명의 단량체 또는 기공은 합성으로 또는 재조합 수단에 의해 만들어질 수 있다. 예를 들어, 단백질은 시험관내 번역 및 전사(IVTT)에 의해 합성될 수 있다. 단백질의 아미노산 서열은 비천연 아미노산을 포함하거나 단백질의 안정성을 증가시키도록 변형될 수 있다. 단백질이 합성 수단에 의해 제조될 때, 이러한 아미노산은 제조 동안 도입될 수 있다. 단백질은 합성 또는 재조합 제조 후 또한 변경될 수 있다.
단백질은 D-아미노산을 사용하여 또한 제조될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 L-아미노산 및 D-아미노산의 혼합물을 포함할 수 있다. 이것은 이러한 단백질 또는 펩타이드를 제조하기 위해 당해 분야에서 관습적이다.
다른 비특이적 변형이 단백질의 기능을 방해하지 않는 한 단백질은 이 변형을 또한 함유할 수 있다. 다수의 비특이적 측쇄 변형은 당해 분야에 공지되어 있고, 단백질(들)의 측쇄에 만들어질 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 알데하이드와의 반응에 의한 아미노산의 환원성 알킬화, 이어서 NaBH4에 의한 환원, 메틸아세트이미데이트에 의한 아미딘화 또는 아세트산 무수물에 의한 아실화를 포함한다.
본 발명의 단량체 및 기공을 포함하는, 본 명세서에 기재된 임의의 단백질은 당해 분야에 공지된 표준 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 당해 분야에서의 표준 방법을 이용하여 유래되고 복제될 수 있다. 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 당해 분야에서의 표준 기법을 이용하여 박테리아 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 단백질은 재조합 발현 벡터로부터의 폴리펩타이드의 인시츄 발현에 의해 세포에서 제조될 수 있다. 발현 벡터는 임의로 폴리펩타이드의 발현을 제어하기 위해 유도성 촉진자를 보유한다. 이 방법은 문헌[Sambrook, J. and Russell, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]에 기재되어 있다.
단백질은 단백질 생성 유기체로부터 임의의 단백질 액체 크로마토그래피 시스템에 의한 정제 후 또는 재조합 발현 후 대규모로 제조될 수 있다. 통상적인 단백질 액체 크로마토그래피 시스템은 FPLC, AKTA 시스템, Bio-Cad 시스템, Bio-Rad BioLogic 시스템 및 Gilson HPLC 시스템을 포함한다.
작제물
본 발명은 또한 2개 이상의 공유 결합으로 부착된 CsgG 단량체를 포함하는 작제물을 제공하고, 단량체 중 적어도 하나는 본 발명의 돌연변이체 단량체이다. 본 발명의 작제물은 기공을 형성하는 이의 능력을 보유한다. 이것은 상기 기재된 바대로 결정될 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 작제물은 폴리뉴클레오타이드를 규명, 예컨대 서열분석하기 위해 기공을 형성하도록 사용될 수 있다. 작제물은 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 단량체를 포함할 수 있다. 작제물은 바람직하게는 2개의 단량체를 포함한다. 2개 이상의 단량체는 동일하거나 상이할 수 있다.
작제물에서의 적어도 하나의 단량체는 본 발명의 돌연변이체 단량체이다. 작제물에서의 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 단량체는 본 발명의 돌연변이체 단량체일 수 있다. 작제물에서의 모든 단량체는 바람직하게는 본 발명의 돌연변이체 단량체이다. 돌연변이체 단량체는 동일하거나 상이할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 작제물은 2개의 본 발명의 돌연변이체 단량체를 포함한다.
작제물에서의 본 발명의 돌연변이체 단량체는 바람직하게는 대략 동일한 길이 또는 동일한 길이이다. 작제물에서의 본 발명의 돌연변이체 단량체의 배럴은 바람직하게는 대략 동일한 길이 또는 동일한 길이이다. 길이는 아미노산의 수 및/또는 길이의 단위로 측정될 수 있다.
작제물은 본 발명의 돌연변이체 단량체가 아닌 하나 이상의 단량체를 포함할 수 있다. 본 발명의 돌연변이체 단량체가 아닌 CsgG 돌연변이체 단량체는 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 41을 포함하는 단량체 또는 상기 기재된 아미노산/위치가 돌연변이되지 않는 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 41의 비교용 변이체를 포함한다. 작제물에서의 적어도 하나의 단량체는 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 41 또는 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 41에 기재된 서열의 비교용 변이체를 포함할 수 있다. 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 41의 비교용 변이체는 아미노산 동일성에 기초하여 이의 전체 서열에 걸쳐 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 41과 적어도 50% 상동성이다. 더 바람직하게는, 비교용 변이체는 전체 서열에 걸쳐 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 41의 아미노산 서열에 대한 아미노산 동일성에 기초하여 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 97% 또는 99% 상동성일 수 있다.
작제물에서의 단량체는 바람직하게는 유전자 융합된다. 단량체는 전체 작제물이 단일 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 발현되는 경우 유전자 융합된다. 단량체의 코딩 서열은 작제물을 코딩하는 단일 폴리뉴클레오타이드 서열을 형성하기 위한 임의의 방식으로 조합될 수 있다.
단량체는 임의의 구성으로 유전자 융합될 수 있다. 단량체는 이의 말단 아미노산을 통해 융합될 수 있다. 예를 들어, 하나의 단량체의 아미노 말단은 또 다른 단량체의 카복시 말단에 융합될 수 있다. (아미노 방향에서 카복시 방향으로) 작제물에서의 제2 및 후속하는 단량체는 이의 아미노 말단 말단에서 메티오닌을 포함할 수 있다(이들 각각은 이전의 단량체의 카복시 말단에 융합됨). 예를 들어, M이 단량체이고(아미노 말단 메티오닌 없음), mM이 아미노 말단 메티오닌을 갖는 단량체인 경우, 작제물은 서열 M-mM, M-mM-mM 또는 M-mM-mM-mM을 포함할 수 있다. 이 메티오닌의 존재는 통상적으로 전체 작제물을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 내에 제2 또는 후속하는 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단에서 시작 코돈(즉, ATG)의 발현으로부터 생긴다. (아미노 방향에서 카복시 방향으로) 작제물에서의 제1 단량체는 메티오닌(예를 들어, mM-mM, mM-mM-mM 또는 mM-mM-mM-mM)을 또한 포함할 수 있다.
2개 이상의 단량체는 직접적으로 함께 유전자 융합될 수 있다. 단량체는 바람직하게는 링커를 사용하여 유전자 융합된다. 링커는 단량체의 이동성을 구속하도록 설계될 수 있다. 바람직한 링커는 아미노산 서열(즉, 펩타이드 링커)이다. 상기 기재된 임의의 펩타이드 링커를 사용할 수 있다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 단량체는 화학적으로 융합된다. 2개의 단량체는 2개의 부분이 예를 들어 화학 가교결합제를 통해 화학적으로 부착된 경우 화학적으로 융합된다. 상기 기재된 임의의 화학 가교결합제를 사용할 수 있다. 링커는 본 발명의 돌연변이체 단량체로 도입된 하나 이상의 시스테인 잔기에 부착될 수 있다. 대안적으로, 링커는 작제물에서의 단량체의 하나의 말단에 부착될 수 있다.
작제물이 상이한 단량체를 함유하는 경우, 그 자체에 대한 단량체의 가교결합은 아주 과량의 단량체 중에 링커의 농도를 유지시킴으로써 방지될 수 있다. 대안적으로, 2개의 링커가 사용되는 "락 앤 키" 배열을 이용할 수 있다. 각각의 링커의 적어도 하나의 말단은 함께 반응하여 더 긴 링커를 형성할 수 있고, 링커의 다른 말단은 각각 상이한 단량체와 반응한다. 이러한 링커는 국제 출원 제PCT/GB10/000132호(WO 제2010/086602호로 공개)에 기재되어 있다.
폴리뉴클레오타이드
본 발명은 또한 본 발명의 돌연변이체 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 돌연변이체 단량체는 임의의 상기 기재된 것일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 전체 서열에 걸쳐 서열 번호 1의 서열과 뉴클레오타이드 동일성에 기초하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 상동성인 서열을 포함한다. 300개 또는 이것 초과, 예를 들어 375개, 450개, 525개 또는 600개, 또는 이것 초과의 인접한 뉴클레오타이드의 스트레치에 걸쳐 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 90% 또는 95%의 뉴클레오타이드 동일성("하드 상동성")이 존재할 수 있다. 상동성은 상기 기재된 바대로 계산될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 서열은 유전자 코드의 축퇴성에 기초하여 서열 번호 1과 다른 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 유전자 융합된 작제물을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 서열 번호 1에 기재된 서열의 2개 이상의 변이체를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 전체 서열에 걸쳐 뉴클레오타이드 동일성에 기초하여 서열 번호 1과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 상동성을 갖는 2개 이상의 서열을 포함한다. 600개 또는 이것 초과, 예를 들어 750개, 900개, 1050개 또는 1200개 또는 이것 초과의 인접한 뉴클레오타이드의 스트레치에 걸쳐 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 90% 또는 95%의 뉴클레오타이드 동일성("하드 상동성")이 존재할 수 있다. 상동성은 상기 기재된 바대로 계산될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 서열은 당해 분야에서의 표준 방법을 이용하여 유래되고 복제될 수 있다. 야생형 CsgG를 코딩하는 염색체 DNA는 기공 생성 유기체, 예컨대 에스체리치아 콜라이로부터 추출될 수 있다. 기공 아단위를 코딩하는 유전자는 특정한 프라이머를 수반하는 PCR을 이용하여 증폭될 수 있다. 이후, 증폭된 서열은 부위 지정 돌연변이유발을 겪을 수 있다. 부위 지정 돌연변이유발의 적합한 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 조합 연쇄 반응을 포함한다. 본 발명의 작제물을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 널리 공지된 기법, 예컨대 문헌[Sambrook, J. and Russell, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]에 기재된 것을 이용하여 만들어질 수 있다.
이후, 생성된 폴리뉴클레오타이드 서열은 재조합 복제 가능한 벡터, 예컨대 클로닝 벡터로 도입될 수 있다. 벡터는 상용성 숙주 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 복제하도록 사용될 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 폴리뉴클레오타이드를 복제 가능한 벡터로 도입하고, 벡터를 상용성 숙주 세포로 도입하고, 숙주 세포를 벡터의 복제를 발생시키는 조건 하에 성장시킴으로써 만들어질 수 있다. 벡터는 숙주 세포로부터 회수될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드를 클로닝하기 위한 적합한 숙주 세포는 당해 분야에 공지되어 있고, 하기 더 자세히 기재되어 있다.
폴리뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 벡터로 클로닝될 수 있다. 발현 벡터에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포에 의해 코딩 서열의 발현을 제공할 수 있는 제어 서열에 통상적으로 작동적으로 연결된다. 이러한 발현 벡터는 기공 아단위를 발현하도록 사용될 수 있다.
용어 "작동적으로 연결된"은 기재된 성분이 이의 의도된 방식으로 작용하게 허용하는 관계에 있는 병치를 의미한다. 코딩 서열에 "작동적으로 연결된" 제어 서열은 코딩 서열의 발현이 제어 서열과 상용성인 조건 하에 달성되는 방식으로 결찰된다. 동일하거나 상이한 폴리뉴클레오타이드 서열의 다수의 카피는 벡터로 도입될 수 있다.
이후, 발현 벡터는 적합한 숙주 세포로 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명의 돌연변이체 단량체 또는 작제물은 폴리뉴클레오타이드 서열을 벡터로 삽입하고, 벡터를 박테리아 숙주 세포로 도입하고, 숙주 세포를 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 발생시키는 조건 하에 성장시킴으로써 제조될 수 있다. 재조합으로 발현된 단량체 또는 작제물은 숙주 세포막에서 기공으로 자가조립할 수 있다. 대안적으로, 이러한 방식으로 제조된 재조합 기공은 숙주 세포로부터 제거되고, 또 다른 막으로 삽입될 수 있다. 적어도 2개의 상이한 단량체 또는 작제물을 포함하는 기공을 제조할 때, 상이한 단량체 또는 작제물은 상기 기재된 바대로 상이한 숙주 세포에서 별도로 발현되고, 숙주 세포로부터 제거되고, 별개의 막, 예컨대 토끼 세포막 또는 합성 막에서 기공으로 조립될 수 있다.
벡터는 예를 들어 복제 기원에 의해 제공된 플라스미드, 바이러스 또는 파지 벡터, 임의로 상기 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 위한 촉진자 및 임의로 촉진자의 조절자일 수 있다. 벡터는 하나 이상의 선택 가능한 마커 유전자, 예를 들어 테트라사이클린 내성 유전자를 함유할 수 있다. 촉진자 및 다른 발현 조절 신호는 발현 벡터가 설계된 숙주 세포와 상용성이도록 선택될 수 있다. T7, trc, lac, ara 또는 λL 촉진자를 통상적으로 사용한다. 숙주 세포는 통상적으로 높은 수준에서 단량체 또는 작제물을 발현한다. 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 형질전환된 숙주 세포는 세포를 형질전환시키기 위해 사용된 발현 벡터와 상용성이도록 선택될 것이다. 숙주 세포는 통상적으로 박테리아, 바람직하게는 에스체리치아 콜라이이다. λ DE3 라이소겐, 예를 들어 C41(DE3), BL21(DE3), JM109(DE3), B834(DE3), TUNER, Origami 및 Origami B를 갖는 임의의 세포는 T7 촉진자를 포함하는 벡터를 발현할 수 있다. 상기 기재된 조건 이외에, 문헌[Cao et al, 2014, PNAS, Structure of the nonameric bacterial amyloid secretion channel, doi - 1411942111 및 Goyal et al, 2014, Nature, 516, 250-253 structural and mechanistic insights into the bacterial amyloid secretion channel CsgG may be used to express the CsgG proteins]에 인용된 임의의 방법은 CsgG 단백질을 발현하도록 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 돌연변이체 단량체 또는 본 발명의 작제물을 제조하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 적합한 숙주 세포에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 것을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 벡터의 일부이고, 바람직하게는 촉진자에 작동적으로 연결된다.
기공
본 발명은 또한 다양한 기공을 제공한다. 본 발명의 기공은 높은 정도의 민감도로 상이한 뉴클레오타이드 사이를 구별할 수 있으므로 폴리뉴클레오타이드 서열을 규명, 예컨대 서열분석하기에 이상적이다. 기공은 놀랍게도 DNA 및 RNA에서의 4개의 뉴클레오타이드 사이를 구별할 수 있다. 본 발명의 기공은 심지어 메틸화 뉴클레오타이드와 비메틸화 뉴클레오타이드 사이를 구별할 수 있다. 본 발명의 기공의 기본 해상도는 놀랍게도 높다. 기공은 모든 4개의 DNA 뉴클레오타이드의 거의 완전한 분리를 보여준다. 기공은 기공에서의 체류 시간 및 기공을 통해 흐르는 전류에 기초하여 데옥시사이티딘 모노포스페이트(dCMP)와 메틸-dCMP 사이를 추가로 구별한다.
본 발명의 기공은 또한 조건의 범위 하에 상이한 뉴클레오타이드 사이를 구별할 수 있다. 특히, 기공은 핵산을 규명, 예컨대 서열분석하기에 양호한 조건 하에 뉴클레오타이드 사이를 구별할 것이다. 본 발명의 기공이 상이한 뉴클레오타이드 사이를 구별할 수 있는 정도는 인가된 전위, 염 농도, 완충제, 온도 및 첨가제, 예컨대 우레아, 베타인 및 DTT의 존재를 변경함으로써 제어될 수 있다. 이것은 특히 서열분석할 때 기공의 기능이 미세 조정되게 한다. 이것은 하기 더 자세히 기재되어 있다. 본 발명의 기공은 뉴클레오타이드 기준에 의해 뉴클레오타이드에서보다 하나 이상의 단량체와의 상호작용으로부터 폴리뉴클레오타이드 중합체를 확인하기 위해 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 기공은 단리되거나, 실질적으로 단리되거나, 정제되거나 실질적으로 정제될 수 있다. 본 발명의 기공은 임의의 다른 성분, 예컨대 지질 또는 다른 기공이 완전히 없는 경우 단리되거나 정제된다. 기공은 이의 의도된 사용을 방해하지 않는 캐리어 또는 희석제와 혼합되는 경우 실질적으로 단리된다. 예를 들어, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만의 다른 성분, 예컨대 삼중블록 공중합체, 지질 또는 다른 기공을 포함하는 형태로 존재하는 경우 기공은 실질적으로 단리되거나 실질적으로 정제된다. 대안적으로, 본 발명의 기공은 막에 존재할 수 있다. 적합한 막은 하기 기재되어 있다.
본 발명의 기공은 개별 또는 단일 기공으로서 존재할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 기공은 2개 이상의 기공의 상동성 또는 비상동성 집단에 존재할 수 있다.
동종올리고머 기공
본 발명은 또한 본 발명의 동일한 돌연변이체 단량체를 포함하는 CsgG로부터 유래된 동종올리고머 기공을 제공한다. 동종올리고머 기공은 본 발명의 임의의 돌연변이체를 포함할 수 있다. 본 발명의 동종올리고머 기공은 폴리뉴클레오타이드를 규명, 예컨대 서열분석하기에 이상적이다. 본 발명의 동종올리고머 기공은 상기 기재된 임의의 이점을 가질 수 있다.
동종올리고머 기공은 임의의 수의 돌연변이체 단량체를 함유할 수 있다. 기공은 통상적으로 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 동일한 돌연변이체 단량체, 예컨대 7개, 8개, 9개 또는 10개의 돌연변이체 단량체를 포함한다. 기공은 바람직하게는 8개 또는 9개의 동일한 돌연변이체 단량체를 포함한다. 1개 이상, 예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 돌연변이체 단량체는 바람직하게는 상기 기재된 바대로 화학적으로 변형된다.
기공을 제조하는 방법은 하기 더 자세히 기재되어 있다.
이종올리고머 기공
본 발명은 또한 적어도 하나의 본 발명의 돌연변이체 단량체를 포함하는 CsgG로부터 유래된 이종올리고머 기공을 제공한다. 본 발명의 이종올리고머 기공은 폴리뉴클레오타이드를 규명, 예컨대 서열분석하기에 이상적이다. 이종올리고머 기공은 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 만들어질 수 있다(예를 들어, 문헌[Protein Sci. 2002 Jul; 11(7):1813-24]).
이종올리고머 기공은 충분한 단량체를 함유하여 기공을 형성하다. 단량체는 임의의 유형일 수 있다. 기공은 통상적으로 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 단량체, 예컨대 7개, 8개, 9개 또는 10개의 단량체를 포함한다. 기공은 바람직하게는 8개 또는 9개의 단량체를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 모든 단량체(예컨대, 10개, 9개, 8개 또는 7개의 단량체)는 본 발명의 돌연변이체 단량체이고, 이들 중 적어도 1개는 서로 다르다. 더 바람직한 실시형태에서, 기공은 8개 또는 9개의 본 발명의 돌연변이체 단량체를 포함하고, 이들 중 적어도 1개는 서로 다르다. 이들은 모두 서로 다를 수 있다.
기공에서의 본 발명의 돌연변이체 단량체는 바람직하게는 대략 동일한 길이 또는 동일한 길이이다. 기공에서의 본 발명의 돌연변이체 단량체의 배럴은 바람직하게는 대략 동일한 길이 또는 동일한 길이이다. 길이는 아미노산의 수 및/또는 길이의 단위에서 측정될 수 있다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 돌연변이체 단량체의 적어도 하나는 본 발명의 돌연변이체 단량체가 아니다. 이 실시형태에서, 남은 단량체는 바람직하게는 본 발명의 돌연변이체 단량체이다. 그러므로, 기공은 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 본 발명의 돌연변이체 단량체를 포함할 수 있다. 기공 내의 단량체의 임의의 수는 본 발명의 돌연변이체 단량체가 아닐 수 있다. 기공은 바람직하게는 7개 또는 8개의 본 발명의 돌연변이체 단량체 및 본 발명의 단량체가 아닌 단량체를 포함한다. 본 발명의 돌연변이체 단량체는 동일하거나 상이할 수 있다.
작제물에서의 본 발명의 돌연변이체 단량체는 바람직하게는 대략 동일한 길이 또는 동일한 길이이다. 작제물에서의 본 발명의 돌연변이체 단량체의 배럴은 바람직하게는 대략 동일한 길이 또는 동일한 길이이다. 길이는 아미노산의 수 및/또는 길이의 단위에서 측정될 수 있다.
기공은 본 발명의 돌연변이체 단량체가 아닌 하나 이상의 단량체를 포함할 수 있다. 본 발명의 돌연변이체 단량체가 아닌 CsgG 단량체는 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 41을 포함하는 단량체 또는 본 발명과 관련하여 상기 기재된 아미노산/위치가 돌연변이/치환되지 않는 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 41의 비교용 변이체를 포함한다. 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 41의 비교용 변이체는 통상적으로 아미노산 동일성에 기초하여 이의 전체 서열에 걸쳐 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 41과 적어도 50% 상동성이다. 더 바람직하게는, 비교용 변이체는 전체 서열에 걸쳐 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 41의 아미노산 서열에 대한 아미노산 동일성에 기초하여 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 97% 또는 99% 상동성일 수 있다.
상기 기재된 모든 실시형태에서, 1개 이상, 예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 돌연변이체 단량체는 바람직하게는 상기 기재된 바대로 화학적으로 변형된다.
기공을 제조하는 방법은 하기 더 자세히 기재되어 있다.
작제물 함유 기공
본 발명은 또한 적어도 하나의 본 발명의 작제물을 포함하는 기공을 제공한다. 본 발명의 작제물은 단량체 중 적어도 하나가 본 발명의 돌연변이체 단량체인 CsgG로부터 유래된 2개 이상의 공유 결합으로 부착된 단량체를 포함한다. 즉, 작제물은 하나 초과의 단량체를 함유해야 한다. 기공은 충분한 작제물 및, 필요한 경우, 단량체를 함유하여 기공을 형성한다. 예를 들어, 옥타머 기공은 (a) 2개의 작제물을 각각 포함하는 4개의 작제물, (b) 4개의 단량체를 각각 포함하는 2개의 작제물 또는 (b) 작제물의 일부를 형성하지 않는 6개의 단량체 및 2개의 단량체를 포함하는 1개의 작제물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 노나머 기공은 (a) 2개의 작제물 및 작제물의 일부를 형성하지 않는 1개의 단량체를 각각 포함하는 4개의 작제물, (b) 작제물의 일부를 형성하지 않는 단량체 및 4개의 단량체를 각각 포함하는 2개의 작제물 또는 (b) 작제물의 일부를 형성하지 않는 7개의 단량체 및 2개의 단량체를 각각 포함하는 1개의 작제물을 포함할 수 있다. 작제물 및 단량체의 다른 조합은 숙련자에 의해 고안될 수 있다.
기공에서의 단량체 중 적어도 2개는 본 발명의 작제물의 형태이다. 작제물, 및 이에 따라 기공은 적어도 하나의 본 발명의 돌연변이체 단량체를 포함한다. 기공은 통상적으로 전체로 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 단량체, 예컨대 7개, 8개, 9개 또는 10개의 단량체를 포함한다(이들 중 적어도 2개는 작제물이어야 함). 기공은 바람직하게는 8개 또는 9개의 단량체를 포함한다(이들 중 적어도 2개는 작제물이어야 함).
기공을 함유하는 작제물은 동종올리고머(즉, 동일한 작제물을 포함) 또는 이종올리고머(즉, 여기서 적어도 하나의 작제물은 서로 다름)일 수 있다.
기공은 통상적으로 (a) 2개의 단량체를 포함하는 1개의 작제물 및 (b) 5개, 6개, 7개 또는 8개의 단량체를 함유한다. 작제물은 임의의 상기 기재된 것일 수 있다. 단량체는 임의의 상기 기재된 것, 예를 들어 본 발명의 돌연변이체 단량체, 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 41을 포함하는 단량체 및 상기 기재된 바와 같은 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 41의 비교용 변이체를 포함하는 돌연변이체 단량체일 수 있다.
또 다른 통상적인 기공은 본 발명의 하나 초과의 작제물, 예컨대 본 발명의 2개, 3개 또는 4개의 작제물을 포함한다. 필요한 경우, 이러한 기공은 기공을 형성하기 위해 충분한 추가 단량체 또는 작제물을 추가로 포함한다. 추가 단량체(들)는 임의의 상기 기재된 것, 예를 들어 본 발명의 돌연변이체 단량체, 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 41을 포함하는 단량체 및 상기 기재된 바와 같은 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 41의 비교용 변이체를 포함하는 돌연변이체 단량체일 수 있다. 추가 작제물(들)은 임의의 상기 기재된 것일 수 있거나, 2개 이상의 공유 결합으로 부착된 CsgG 단량체를 포함하는 작제물일 수 있고, 이들은 각각 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 41을 포함하는 단량체 또는 상기 기재된 바와 같은 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 41의 비교용 변이체를 포함한다.
본 발명의 추가의 기공은 오직 2개의 단량체를 포함하는 작제물을 포함하고, 예를 들어 기공은 2개의 단량체를 포함하는 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 작제물을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 작제물은 본 발명의 작제물이고, 즉 적어도 하나의 작제물에서의 적어도 하나의 단량체, 바람직하게는 적어도 하나의 작제물에서의 각각의 단량체는 본 발명의 돌연변이체 단량체이다. 2개의 단량체를 포함하는 모든 작제물은 본 발명의 작제물일 수 있다.
본 발명에 따른 특정한 기공은 2개의 단량체를 각각 포함하는 본 발명의 4개의 작제물을 포함하고, 각각의 작제물에서의 적어도 하나의 단량체, 바람직하게는 각각의 작제물에서의 각각의 단량체는 본 발명의 돌연변이체 단량체이다. 작제물은 각각의 작제물의 적어도 하나의 단량체가 기공의 채널에 기여하게 하는 구조를 갖는 기공으로 올리고머화할 수 있다. 통상적으로, 작제물의 다른 단량체는 기공의 채널 밖에 있을 것이다. 예를 들어, 본 발명의 기공은 2개의 단량체를 포함하는 7개, 8개, 9개 또는 10개의 작제물을 포함할 수 있고, 채널은 7개, 8개, 9개 또는 10개의 단량체를 포함한다.
돌연변이는 상기 기재된 바대로 작제물로 도입될 수 있다. 돌연변이는 교대일 수 있어서, 즉 돌연변이는 2개의 단량체 작제물 내에 각각의 단량체에 대해 상이하고, 작제물은 교대하는 변형을 생성시키는 동종올리고머로서 조립된다. 즉 MutA 및 MutB를 포함하는 단량체는 융합되고 조립되어 A-B:A-B:A-B:A-B 기공을 형성한다. 대안적으로, 돌연변이는 이웃할 수 있고, 즉 동일한 돌연변이는 작제물에서 2개의 단량체로 도입되고, 이것은 이후 상이한 돌연변이체 단량체 또는 작제물에 의해 올리고머화된다. 즉, MutA를 포함하는 단량체는 융합된 후, MutB 함유 단량체에 의해 올리고머화하여 A-A:B:B:B:B:B:B를 형성한다.
작제물 함유 기공에서의 본 발명의 단량체 중 하나 이상은 상기 기재된 바대로 화학적으로 변형될 수 있다.
분석물질 규명
본 발명은 표적 분석물질의 존재, 부재 또는 하나 이상의 특징을 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 표적 분석물질을 본 발명의 기공과 접촉시키는 단계(이로써 표적 분석물질은 기공과 관련하여, 예컨대 이를 통해 이동함) 및 분석물질이 기공과 관련하여 이동하면서 하나 이상의 측정을 하고, 이로써 분석물질의 존재, 부재 또는 하나 이상의 특징을 결정하는 단계를 수반한다. 표적 분석물질은 주형 분석물질 또는 관심 대상의 분석물질이라 또한 불릴 수 있다.
단계 (a) 및 (b)는 바람직하게는 기공에 걸쳐 인가된 전위에 의해 수행된다. 하기 더 자세히 기재된 것처럼, 인가된 전위는 통상적으로 기공과 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질 사이에 복합체의 형성을 발생시킨다. 인가된 전위는 전압 전위일 수 있다. 대안적으로, 인가된 전위는 화학 전위일 수 있다. 이의 예는 양친매성 층에 걸친 염 구배를 이용하는 것이다. 염 구배는 문헌[Holden et al., J Am Chem Soc. 2007 Jul 11;129(27):8650-5]에 개시되어 있다.
상기 방법은 표적 분석물질의 존재, 부재 또는 하나 이상의 특징을 결정하기 위한 것이다. 상기 방법은 적어도 하나의 분석물질의 존재, 부재 또는 하나 이상의 특징을 결정하기 위한 것일 수 있다. 상기 방법은 2개 이상의 분석물질의 존재, 부재 또는 하나 이상의 특징을 결정하는 것에 관한 것일 수 있다. 상기 방법은 임의의 수의 분석물질, 예컨대 2개, 5개, 10개, 15개, 20개, 30개, 40개, 50개, 100개 또는 이것 초과의 분석물질의 존재, 부재 또는 하나 이상의 특징을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 하나 이상의 분석물질의 임의의 수의 특징, 예컨대 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개 또는 이것 초과의 특징은 결정될 수 있다.
표적 분석물질은 바람직하게는 금속 이온, 무기 염, 중합체, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 염료, 표백제, 의약품, 진단제, 레크리에이션 약물(recreational drug), 폭발성 또는 환경적 오염물질이다. 상기 방법은 동일한 유형의 2개 이상의 분석물질, 예컨대 2개 이상의 단백질, 2개 이상의 뉴클레오타이드 또는 2개 이상의 의약품의 존재, 부재 또는 하나 이상의 특징을 결정하는 것에 관할 수 있다. 대안적으로, 상기 방법은 상이한 유형의 2개 이상의 분석물질, 예컨대 1개 이상의 단백질, 1개 이상의 뉴클레오타이드 및 1개 이상의 의약품의 존재, 부재 또는 하나 이상의 특징을 결정하는 것에 관할 수 있다.
표적 분석물질은 세포로부터 분비될 수 있다. 대안적으로, 표적 분석물질은 세포 내부에 존재하는 분석물질일 수 있어서, 분석물질은 본 발명이 수행될 수 있기 전에 세포로부터 추출되어야 한다.
분석물질은 바람직하게는 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드 및/또는 단백질이다. 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 천연 발생 또는 천연 비발생일 수 있다. 폴리펩타이드 또는 단백질은 이들 내에 합성 또는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 아미노산에 대한 변형의 다수의 상이한 유형은 당해 분야에 공지되어 있다. 적합한 아미노산 및 이의 변형은 상기에 있다. 본 발명의 목적을 위해, 표적 분석물질이 당해 분야에서 이용 가능한 임의의 방법에 의해 변형될 수 있다고 이해되어야 한다.
단백질은 효소, 항체, 호르몬, 성장 인자 또는 성장 조절 단백질, 예컨대 사이토카인일 수 있다. 사이토카인은 인터류킨, 바람직하게는 IFN-1, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12 및 IL-13, 인터페론, 바람직하게는 IL-γ, 및 다른 사이토카인, 예컨대 TNF-α로부터 선택될 수 있다. 단백질은 박테리아 단백질, 진균 단백질, 바이러스 단백질 또는 기생충 유래 단백질일 수 있다.
표적 분석물질은 바람직하게는 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드이다. 뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 하기 기재되어 있다. 올리고뉴클레오타이드는 50개 이하의 뉴클레오타이드, 예컨대 40개 이하, 30개 이하, 20개 이하, 10개 이하 또는 5개 이하의 뉴클레오타이드를 통상적으로 갖는 짧은 뉴클레오타이드 중합체이다. 올리고뉴클레오타이드는 비염기성 및 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 하기 기재된 임의의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
표적 분석물질, 예컨대 표적 폴리뉴클레오타이드는 하기 기재된 임의의 적합한 샘플에 존재할 수 있다.
기공은 통상적으로 하기 기재된 바와 같이 막에 존재한다. 표적 분석물질은 하기 기재된 방법을 이용하여 막에 커플링되거나 전달될 수 있다.
하기 기재된 임의의 측정은 표적 분석물질의 존재, 부재 또는 하나 이상의 특징을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 바람직하게는 분석물질이 기공과 관련하여 이동하도록, 예컨대 이를 통해 이동하도록 표적 분석물질을 기공과 접촉시키는 단계 및 분석물질이 기공과 관련하여 이동하면서 기공을 통해 흐르는 전류를 측정하여 분석물질의 존재, 부재 또는 하나 이상의 특징을 결정하는 단계를 포함한다.
표적 분석물질은 전류가 분석물질에 특정한 방식으로 기공을 통해 흐르는 경우(즉, 기공을 통해 흐르는 분석물질과 연관된 명확한 전류가 관찰되는 경우) 존재한다. 분석물질은 전류가 뉴클레오타이드에 특정한 방식으로 기공을 통해 흐르지 않는 경우 부재한다. 대조군 실험은 이것이 기공을 통해 흐르는 전류에 영향을 미치는 방식을 결정하기 위해 분석물질의 존재 하에 수행될 수 있다.
본 발명은 이들이 기공을 통해 흐르는 전류에 갖는 상이한 효과에 기초하여 유사한 구조의 분석물질을 구별하도록 사용될 수 있다. 개별 분석물질은 이들이 기공과 상호작용할 때 이의 전류 진폭으로부터 단일 분자 수준에서 확인될 수 있다. 본 발명은 특정한 분석물질이 샘플에 존재하는지 또는 아닌지를 결정하기 위해 또한 사용될 수 있다. 본 발명은 샘플에서 특정한 분석물질의 농도를 측정하기 위해 또한 사용될 수 있다. CsgG 이외의 기공을 이용한 분석물질 규명은 당해 분야에 공지되어 있다.
폴리뉴클레오타이드 규명
본 발명은 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하고, 예컨대 폴리뉴클레오타이드를 서열분석하는 방법을 제공한다. 나노기공을 이용하여 폴리뉴클레오타이드를 규명하거나 서열분석하기 위한 2개의 주요 전략, 즉 스트랜드 규명/서열분석 및 엑소뉴클레아제 규명/서열분석이 존재한다. 본 발명의 방법은 상기 방법 중 어느 하나에 관한 것일 수 있다.
스트랜드 서열분석에서, DNA는 인가된 전위에 의해 또는 이에 대해 나노기공을 통해 전좌된다. 이중 가닥 DNA에서 계속해서 또는 과정적으로 작용하는 엑소뉴클레아제는 인가된 전위 하에 남은 단일 스트랜드를 공급하도록 기공의 시스 측에서 또는 리버스 전위 하에 트랜스 측에서 사용될 수 있다. 마찬가지로, 이중 가닥 DNA를 해권하는 헬리카제를 유사한 방식으로 또한 사용할 수 있다. 중합효소를 또한 사용할 수 있다. 인가된 전위에 대해 스트랜드 전좌를 요하는 서열분석 분야에 대한 가능성이 또한 존재하지만, DNA는 리버스 전위 또는 비전위 하에 효소에 의해 처음에 "잡혀야" 한다. 결합 후 이후 뒤로 스위칭되는 전위에 의해, 스트랜드는 기공을 통해 시스 대 트랜스 통과시키고, 전류 흐름에 의해 연장된 형태로 보유될 것이다. 단일 스트랜드 DNA 엑소뉴클레아제 또는 단일 스트랜드 DNA 의존적 중합효소는 인가된 전위에 대해 제어된 단계별 방식으로 시스 대 트랜스로 기공을 통해 다시 최근에 전좌된 단일 스트랜드를 당기도록 분자 모터로서 작용할 수 있다.
일 실시형태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하는 방법은 표적 서열을 본 발명의 기공 및 헬리카제 효소와 접촉시키는 단계를 수반한다. 임의의 헬리카제를 상기 방법에서 사용할 수 있다. 적합한 헬리카제는 하기 기재되어 있다. 헬리카제는 기공과 관련하여 2개의 방식으로 일할 수 있다. 첫째로, 상기 방법은 바람직하게는 헬리카제를 사용하여 수행되어서 이것은 인가된 전압으로부터 생긴 장에 의해 기공을 통해 표적 서열의 이동을 제어한다. 이 방식에서, DNA의 5' 말단은 처음에 기공에서 포획되고, 효소는 기공으로의 DNA의 이동을 제어하여서 표적 서열은 이것이 이중층의 트랜스 측을 통해 마침내 전좌할 때까지 장에 의해 기공을 통해 통과한다. 대안적으로, 상기 방법은 바람직하게는 헬리카제 효소가 인가된 전압으로부터 생긴 장에 대해 기공을 통해 표적 서열의 이동을 제어하도록 수행된다. 이 방식에서, DNA의 3' 말단은 처음에 기공에 포획되고, 효소는 기공을 통한 DNA의 이동을 제어하여서 표적 서열은 이중층의 시스 측으로 다시 마침내 나올 때까지 인가된 장에 대해 기공 밖으로 빠져나온다.
엑소뉴클레아제 서열분석에서, 엑소뉴클레아제는 표적 폴리뉴클레오타이드의 일 말단으로부터 개별 뉴클레오타이드를 방출하고, 이 개별 뉴클레오타이드는 하기 기재된 바대로 확인된다. 또 다른 실시형태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하는 방법은 표적 서열을 기공 및 엑소뉴클레아제 효소와 접촉시키는 단계를 수반한다. 하기 기재된 임의의 엑소뉴클레아제 효소를 상기 방법에서 사용할 수 있다. 효소는 하기 기재된 바대로 기공에 공유 결합으로 부착될 수 있다.
엑소뉴클레아제는 통상적으로 폴리뉴클레오타이드의 일 말단에 달라붙고 그 말단으로부터 한 번에 서열 일 뉴클레오타이드를 분해하는 효소이다. 엑소뉴클레아제는 5'에서 3' 방향 또는 3'에서 5' 방향으로 폴리뉴클레오타이드를 분해할 수 있다. 엑소뉴클레아제가 결합하는 폴리뉴클레오타이드의 밀단은 통상적으로 사용된 효소의 선택을 통해 및/또는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 결정된다. 폴리뉴클레오타이드의 어느 한 말단에서의 하이드록실기 또는 캡 구조는 통상적으로 폴리뉴클레오타이드의 특정한 말단에 대한 엑소뉴클레아제의 결합을 막거나 수월하게 하도록 사용될 수 있다.
상기 방법은 뉴클레오타이드가 상기 기재된 바와 같은 뉴클레오타이드의 규명 또는 이의 비율의 확인을 허용하는 속도로 폴리뉴클레오타이드의 말단으로부터 분해되도록 폴리뉴클레오타이드를 엑소뉴클레아제와 접촉시키는 단계를 수반한다. 이렇게 하기 위한 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, Edman 분해는 폴리펩타이드의 말단으로부터 단일 아미노산을 성공적으로 분해하도록 사용되어서, 이들은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 확인될 수 있다. 상동성 방법은 본 발명에서 사용될 수 있다.
엑소뉴클레아제가 작용하는 속도는 통상적으로 야생형 엑소뉴클레아제의 최적 속도보다 느리다. 본 발명의 방법에서의 엑소뉴클레아제의 활성의 적합한 속도는 초당 0.5개 내지 1000개의 뉴클레오타이드, 초당 0.6개 내지 500개의 뉴클레오타이드, 초당 0.7개 내지 200개의 뉴클레오타이드, 초당 0.8개 내지 100개의 뉴클레오타이드, 초당 0.9개 내지 50개의 뉴클레오타이드 또는 초당 1개 내지 20개 또는 10개의 뉴클레오타이드의 분해를 수반한다. 속도는 바람직하게는 초당 1개, 10개, 100개, 500개 또는 1000개의 뉴클레오타이드이다. 엑소뉴클레아제 활성의 적합한 속도는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 활성의 최적 속도가 감소한 변이체 엑소뉴클레아제를 본 발명에 따라 사용할 수 있다.
스트랜드 규명 실시형태에서, 상기 방법은 폴리뉴클레오타이드를 본 발명의 기공과 접촉시키는 단계(이로써 폴리뉴클레오타이드는 기공과 관련하여, 예컨대 이를 통해 이동함) 및 폴리뉴클레오타이드가 기공과 관련하여 이동하면서 하나 이상의 측정을 하고(여기서, 측정은 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 특징을 나타냄), 이로써 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하는 단계를 포함한다.
엑소뉴클레오타이드 규명 실시형태에서, 상기 방법은 엑소뉴클레아제가 표적 폴리뉴클레오타이드의 일 말단으로부터 개별 뉴클레오타이드를 분해하고, 개별 뉴클레오타이드가 기공과 관련하여, 예컨대 이를 통해 이동하도록 폴리뉴클레오타이드를 본 발명의 기공 및 엑소뉴클레오아제와 접촉시키는 단계 및 개별 뉴클레오타이드가 기공과 관련하여 이동하면서 하나 이상의 측정을 하고(여기서, 측정은 개별 뉴클레오타이드의 하나 이상의 특징을 나타냄), 이로써 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하는 단계를 포함한다.
개별 뉴클레오타이드는 단일 뉴클레오타이드이다. 개별 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 결합에 의해 또 다른 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 결합하지 않는 것이다. 뉴클레오타이드 결합은 또 다른 뉴클레오타이드의 당 기에 결합된 뉴클레오타이드의 포스페이트 기의 하나를 수반한다. 개별 뉴클레오타이드는 통상적으로 뉴클레오타이드 결합에 의해 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 200개, 적어도 500개, 적어도 1000개 또는 적어도 5000개의 뉴클레오타이드의 또 다른 폴리뉴클레오타이드에 결합되지 않는 것이다. 예를 들어, 개별 뉴클레오타이드는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열, 예컨대 DNA 또는 RNA 스트랜드로부터 분해된다. 뉴클레오타이드는 임의의 하기 기재된 것일 수 있다.
개별 뉴클레오타이드는 임의의 방식으로 및 임의의 부위에서 기공과 상호작용할 수 있다. 뉴클레오타이드는 바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 어댑터를 통해 또는 이것과 조합되어 기공에 가역적으로 결합한다. 뉴클레오타이드는 가장 바람직하게는, 이것이 막에 걸쳐 기공을 통해 통과하면서, 어댑터를 통해 또는 이것과 조합되어 기공에 가역적으로 결합한다. 뉴클레오타이드는 또한, 이것이 막에 걸쳐 기공을 통해 통과하면서, 어댑터를 통해 또는 이것과 조합되어 기공의 배럴 또는 채널에 가역적으로 결합할 수 있다.
개별 뉴클레오타이드와 기공 사이의 상호작용 동안, 뉴클레오타이드는 통상적으로 그 뉴클레오타이드에 대해 특정한 방식으로 기공을 통해 흐르는 전류에 영향을 미친다. 예를 들어, 특정한 뉴클레오타이드는 특정한 평균 시간 기간 동안 특정한 정도로 기공을 통해 흐르는 전류를 감소시킬 것이다. 즉, 기공을 통해 흐르는 전류는 특정한 뉴클레오타이드에 대해 구별된다. 대조군 실험은 특정한 뉴클레오타이드가 기공을 통해 흐르는 전류에 갖는 효과를 결정하기 위해 수행될 수 있다. 시험 샘플에서 본 발명의 방법을 수행하는 것으로부터의 결과는 이후 샘플 내의 특정한 뉴클레오타이드를 확인하거나 특정한 뉴클레오타이드가 샘플에 존재하는지를 결정하기 위해 이러한 대조군 실험으로부터 유래된 것과 비교될 수 있다. 기공을 통해 흐르는 전류가 특정한 뉴클레오타이드를 나타내는 방식으로 영향을 받는 주파수는 샘플 내의 그 뉴클레오타이드의 농도를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 샘플 내의 상이한 뉴클레오타이드의 비율을 또한 계산할 수 있다. 예를 들어, dCMP 대 메틸-dCMP의 비율은 계산할 수 있다.
상기 방법은 표적 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 특징을 측정하는 단계를 수반한다. 표적 폴리뉴클레오타이드는 또한 주형 폴리뉴클레오타이드 또는 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드라 불릴 수 있다.
이 실시형태는 또한 본 발명의 기공을 사용한다. 표적 분석물질을 참조하여 상기 기재된 임의의 기공 및 실시형태를 사용할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드
폴리뉴클레오타이드, 예컨대 핵산은 2개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 거대분자이다. 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 임의의 뉴클레오타이드의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드는 천연 발생 또는 인공일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드에서의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 산화되거나 메틸화될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드에서의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 손상될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 피리미딘 이합체를 포함할 수 있다. 이러한 이합체는 통상적으로 자외선 광에 의한 손상과 연관되고, 피부 흑색종의 주요 원인이다. 폴리뉴클레오타이드에서의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 예를 들어 라벨 또는 태그에 의해 변형될 수 있다. 적합한 라벨은 하기 기재되어 있다. 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 스페이서를 포함할 수 있다.
뉴클레오타이드는 통상적으로 핵염기, 당 및 적어도 하나의 포스페이트 기를 함유한다. 핵염기 및 당은 뉴클레오사이드를 형성한다.
핵염기는 통상적으로 헤테로사이클릭이다. 핵염기는 퓨린 및 피리미딘, 더 구체적으로 아데닌(A), 구아닌(G), 타이민(T), 유라실(U) 및 사이토신(C)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
당은 통상적으로 펜토스 당이다. 뉴클레오타이드 당은 리보스 및 데옥시리보스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 당은 바람직하게는 데옥시리보스이다.
폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 데옥시아데노신(dA), 데옥시유리딘(dU) 및/또는 타이미딘(dT), 데옥시구아노신(dG) 및 데옥시사이티딘(dC)의 뉴클레오사이드를 포함한다.
뉴클레오타이드는 통상적으로 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드이다. 뉴클레오타이드는 통상적으로 모노포스페이트, 다이포스페이트 또는 트라이포스페이트를 함유한다. 뉴클레오타이드는 3개 초과의 포스페이트, 예컨대 4개 또는 5개의 포스페이트를 포함할 수 있다. 포스페이트는 뉴클레오타이드의 5' 또는 3' 측에서 부착될 수 있다. 뉴클레오타이드는 아데노신 모노포스페이트(AMP), 구아노신 모노포스페이트(GMP), 타이미딘 모노포스페이트(TMP), 유리딘 모노포스페이트(UMP), 5-메틸사이티딘 모노포스페이트, 5-하이드록시메틸사이티딘 모노포스페이트, 사이티딘 모노포스페이트(CMP), 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(cAMP), 사이클릭 구아노신 모노포스페이트(cGMP), 데옥시아데노신 모노포스페이트(dAMP), 데옥시구아노신 모노포스페이트(dGMP), 데옥시타이미딘 모노포스페이트(dTMP), 데옥시유리딘 모노포스페이트(dUMP), 데옥시사이티딘 모노포스페이트(dCMP) 및 데옥시메틸사이티딘 모노포스페이트를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 뉴클레오타이드는 바람직하게는 AMP, TMP, GMP, CMP, UMP, dAMP, dTMP, dGMP, dCMP 및 dUMP로부터 선택된다.
뉴클레오타이드는 비염기성(즉, 핵염기 결여)일 수 있다. 뉴클레오타이드는 또한 핵염기 및 당(즉, C3 스페이서임)이 결여될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드에서의 뉴클레오타이드는 임의의 방식으로 서로에 부착될 수 있다. 뉴클레오타이드는 통상적으로 핵산에서처럼 이의 당 및 포스페이트기에 의해 부착된다. 뉴클레오타이드는 피리미딘 이합체에서처럼 이의 핵염기를 통해 연결될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 단일 가닥이다. 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 규명은 실시예에서 1D라 칭해진다. 폴리뉴클레오타이드의 적어도 일부는 이중 가닥일 수 있다.
폴리뉴클레오타이드는 핵산, 예컨대 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 DNA의 하나의 스트랜드에 혼성화된 RNA의 하나의 스트랜드를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 당해 분야에 공지된 임의의 합성 핵산, 예컨대 펩타이드 핵산(PNA), 글라이세롤 핵산(GNA), 트레오스 핵산(TNA), 잠긴 핵산(LNA) 또는 뉴클레오타이드 측쇄를 갖는 다른 합성 중합체일 수 있다. PNA 골격은 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복 N-(2-아미노에틸)-글라이신 단위로 이루어진다. GNA 골격은 포스포다이에스터 결합에 의해 연결된 반복 글라이콜 단위로 이루어진다. TNA 골격은 포스포다이에스터 결합에 의해 함께 연결된 반복 트레오스 당으로 이루어진다. LNA는 리보스 모이어티에서의 2' 산소 및 4' 탄소를 연결하는 추가의 브릿지를 갖는 상기 기재된 바와 같은 리보뉴클레오타이드로부터 형성된다. 브릿징된 핵산(BNA)은 변형된 RNA 뉴클레오타이드이다. 이것은 또한 구속된 또는 접근 불가능한 RNA라 칭해질 수 있다. BNA 단량체는 "고정된" C3'-엔도 당 퍼커링(puckering)을 갖는 5원, 6원 또는 심지어 7원 브릿징된 구조를 함유할 수 있다. 브릿지는 2', 4'-BNA 단량체를 제조하기 위해 리보스의 2', 4'-위치에서 합성으로 도입된다.
폴리뉴클레오타이드는 가장 바람직하게는 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA)이다.
폴리뉴클레오타이드는 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 적어도 10개, 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 400개 또는 적어도 500개의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍의 길이일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 1000개 이상의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍, 5000개 이상의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍의 길이 또는 100000개 이상의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍의 길이일 수 있다.
폴리뉴클레오타이드의 임의의 수를 조사할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 50개, 100개 또는 이것 초과의 폴리뉴클레오타이드를 규명하는 것에 관한 것일 수 있다. 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드가 규명되는 경우, 이것은 상이한 폴리뉴클레오타이드 또는 동일한 폴리뉴클레오타이드의 2개의 경우일 수 있다.
폴리뉴클레오타이드는 천연 발생 또는 인공일 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 제조된 올리고뉴클레오타이드의 서열을 검증하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 통상적으로 시험관내 수행된다.
샘플
폴리뉴클레오타이드는 통상적으로 임의의 적합한 샘플에 존재한다. 본 발명은 통상적으로 폴리뉴클레오타이드를 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 것으로 공지된 샘플에서 수행된다. 대안적으로, 본 발명은 샘플에서의 존재가 공지되거나 예상되는 폴리뉴클레오타이드의 동일성을 확인하기 위해 샘플에서 수행될 수 있다.
샘플은 생물학적 샘플일 수 있다. 본 발명은 임의의 유기체 또는 미생물로부터 얻어지거나 추출된 샘플을 사용하여 시험관내 수행될 수 있다. 유기체 또는 미생물은 통상적으로 고세균, 원핵생물 또는 진핵생물이고, 통상적으로 식물계, 동물계, 균류, 모네라계 및 원생생물의 5개의 계 중 하나에 속한다. 본 발명은 임의의 바이러스로부터 얻어지거나 추출된 샘플에서 시험관내 수행될 수 있다. 샘플은 바람직하게는 유체 샘플이다. 샘플은 통상적으로 환자의 체액을 포함한다. 샘플은 뇨, 림프, 타액, 점액 또는 양수일 수 있지만, 바람직하게는 혈액, 혈장 또는 혈청이다.
통상적으로, 샘플은 인간 기원이지만, 대안적으로 이것은 또 다른 포유류 동물, 예컨대 상업적으로 사육된 동물, 예컨대 말, 소, 양, 어류, 닭 또는 돼지 기원일 수 있거나, 대안적으로 애완동물, 예컨대 고양이 또는 개일 수 있다. 대안적으로, 샘플은 식물 기원, 예컨대 상업용 작물, 예컨대 곡물, 협과, 과일 또는 야채, 예를 들어 밀, 보리, 귀리, 카누라, 옥수수, 콩, 쌀, 대황, 바나나, 사과, 토마토, 감자, 포도, 담배, 콩, 녹두, 사탕수수, 코코아, 면으로부터 얻은 샘플일 수 있다.
샘플은 비생물학적 샘플일 수 있다. 비생물학적 샘플은 바람직하게는 유체 샘플이다. 비생물학적 샘플의 예는 수술 유체, 물, 예컨대 식용수, 해수 또는 강수, 및 실험실 시험용 시약을 포함한다.
샘플은 통상적으로 예를 들어 원심분리에 의해 또는 원치 않는 분자 또는 세포, 예컨대 적혈구를 여과제거하는 막을 통한 통과에 의해 본 발명에서 사용되기 전에 공정처리된다. 채취 직전에 측정될 수 있다. 샘플은 또한 통상적으로 검정 전에, 바람직하게는 -70℃ 미만에서 저장될 수 있다.
규명
상기 방법은 폴리뉴클레오타이드의 2개, 3개, 4개 또는 5개, 또는 이것 초과의 특징을 측정하는 단계를 수반할 수 있다. 하나 이상의 특징은 바람직하게는 (ⅰ) 폴리뉴클레오타이드의 길이, (ⅱ) 폴리뉴클레오타이드의 동일성, (ⅲ) 폴리뉴클레오타이드의 서열, (ⅳ) 폴리뉴클레오타이드의 2차 구조 및 (ⅴ) 폴리뉴클레오타이드가 변형되는지 또는 아닌지로부터 선택된다. (ⅰ) 내지 (ⅴ)의 임의의 조합, 예컨대 {i}, {ii}, {iii}, {iv}, {v}, {i,ii}, {i,iii}, {i,iv}, {i,v}, {ii,iii}, {ii,iv}, {ii,v}, {iii,iv}, {iii,v}, {iv,v}, {i,ii,iii}, {i,ii,iv}, {i,ii,v}, {i,iii,iv}, {i,iii,v}, {i,iv,v}, {ii,iii,iv}, {ii,iii,v}, {ii,iv,v}, {iii,iv,v}, {i,ii,iii,iv}, {i,ii,iii,v}, {i,ii,iv,v}, {i,iii,iv,v}, {ii,iii,iv,v} 또는 {i,ii,iii,iv,v}는 본 발명에 따라 측정될 수 있다. (ⅰ) 내지 (ⅴ)의 상이한 조합, 예를 들어 상기 기재된 임의의 조합은 제2 폴리뉴클레오타이드와 비교하여 제1 폴리뉴클레오타이드에 대해 측정될 수 있다.
(ⅰ)에 대해, 폴리뉴클레오타이드의 길이는 예를 들어 폴리뉴클레오타이드와 기공 사이의 상호작용의 수 또는 폴리뉴클레오타이드와 기공 사이의 상호작용의 기간을 결정함으로써 측정될 수 있다.
(ⅱ)에 대해, 폴리뉴클레오타이드의 동일성은 여러 방식으로 측정될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 동일성은 폴리뉴클레오타이드의 서열의 측정과 조합되어 또는 폴리뉴클레오타이드의 서열의 측정 없이 측정될 수 있다. 전자는 간단하고, 폴리뉴클레오타이드는 서열분석되고 이로써 확인된다. 후자는 몇몇 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드에서의 특정한 모티프의 존재는 (폴리뉴클레오타이드의 남은 서열을 측정함이 없이) 측정될 수 있다. 대안적으로, 상기 방법에서의 특정한 전기 및/또는 광학 신호의 측정은 특정한 공급원으로부터 오는 것으로 폴리뉴클레오타이드를 확인할 수 있다.
(ⅲ)에 대해, 폴리뉴클레오타이드의 서열은 이전에 기재된 바대로 결정될 수 있다. 적합한 서열분석 방법, 특히 전기 측정을 이용한 것은 문헌[Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7, Lieberman KR et al, J Am Chem Soc. 2010;132(50):17961-72], 및 국제 출원 WO 제2000/28312호에 기재되어 있다.
(ⅳ)에 대해, 2차 구조는 다양한 방식으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법이 전기 측정을 수반하는 경우, 2차 구조는 체류 시간의 변경 또는 기공을 통해 흐르는 전류의 변경을 이용하여 측정될 수 있다. 이것은 단일 가닥 및 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드의 영역이 구별되게 한다.
(ⅴ)에 대해, 임의의 변형의 존재 또는 부재는 측정될 수 있다. 상기 방법은 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드가 메틸화에 의해, 산화에 의해, 손상에 의해, 하나 이상의 단백질에 의해 또는 하나 이상의 라벨, 태그 또는 스페이서에 의해 변형되는지 또는 아닌지를 결정하는 것을 포함한다. 특정한 변형은 상기 기재된 방법을 이용하여 측정될 수 있는 기공과의 특정한 상호작용을 발생시킬 것이다. 예를 들어, 메틸사이토신은 각각의 뉴클레오타이드와의 이의 상호작용 동안 기공을 통해 흐르는 전류에 기초하여 사이토신으로부터 구별될 수 있다.
표적 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 기공과 접촉한다. 기공은 통상적으로 막에 존재한다. 적합한 막은 하기 기재되어 있다. 상기 방법은 기공이 막에 존재하는 막/기공 시스템을 조사하기에 적합한 임의의 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 방법은 막관통 기공 센싱에 적합한 임의의 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 장치는 수용액을 포함하는 챔버 및 챔버를 2개의 섹션으로 분리하는 장벽을 포함한다. 장벽은 통상적으로 기공을 함유하는 막이 형성되는 어퍼쳐를 갖는다. 대안적으로, 장벽은 기공이 존재하는 막을 형성한다.
상기 방법은 국제 출원 제PCT/GB08/000562호(WO 제2008/102120호)에 기재된 장치를 사용하여 수행될 수 있다.
다양한 상이한 유형의 측정이 이루어질 수 있다. 이것은 제한 없이 전기 측정 및 광학 측정을 포함한다. 가능한 전기 측정은 전류 측정, 임피던스 측정, 터널링 측정(Ivanov AP et al., Nano Lett. 2011 Jan 12;11(1):279-85) 및 FET 측정(국제 출원 WO 제2005/124888호)을 포함한다. 광학 측정은 전기 측정과 조합될 수 있다(Soni GV et al., Rev Sci Instrum. 2010 Jan;81(1):014301). 측정은 막관통 전류 측정, 예컨대 기공을 통해 흐르는 이온성 전류의 측정일 수 있다.
전기 측정은 문헌[Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7, Lieberman KR et al, J Am Chem Soc. 2010;132(50):17961-72] 및 국제 출원 WO 제2000/28312호에 기재된 바대로 표준 단일 채널 기록 설비를 이용하여 이루어질 수 있다. 대안적으로, 전기 측정은 예를 들어 국제 출원 WO 제2009/077734호 및 국제 출원 WO 제2011/067559호에 기재된 바대로 다채널 시스템을 이용하여 이루어질 수 있다.
상기 방법은 바람직하게는 막에 걸쳐 인가된 전위에 의해 수행된다. 인가된 전위는 전압 전위일 수 있다. 대안적으로, 인가된 전위는 화학 전위일 수 있다. 이의 예는 막, 예컨대 양친매성 층에 걸친 염 구배를 이용하는 것이다. 염 구배는 문헌[Holden et al., J Am Chem Soc. 2007 Jul 11; 129(27):8650-5]에 개시되어 있다. 몇몇 경우에, 폴리뉴클레오타이드가 기공과 관련하여 이동하면서 기공을 통해 흐르는 전류는 폴리뉴클레오타이드의 서열을 예상하거나 결정하도록 사용된다. 이것은 스트랜드 서열분석이다.
상기 방법은 폴리뉴클레오타이드가 기공과 관련하여 이동하면서 기공을 통해 흐르는 전류를 측정하는 단계를 수반할 수 있다. 따라서, 상기 방법에서 사용된 장치는 전위를 인가하고 막 및 기공에 걸쳐 전기 신호를 측정할 수 있는 전기 회로를 또한 포함할 수 있다. 상기 방법은 패치 클램프 또는 전압 클램프를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 방법은 바람직하게는 전압 클램프의 사용을 수반한다.
본 발명의 방법은 폴리뉴클레오타이드가 기공과 관련하여 이동하면서 기공을 통해 흐르는 전류를 측정하는 단계를 수반할 수 있다. 막관통 단백질 기공을 통한 이온성 전류를 측정하기에 적합한 조건은 당해 분야에 공지되어 있고 실시예에 개시되어 있다. 상기 방법은 통상적으로 막 및 기공에 걸쳐 인가된 전압에 의해 수행된다. 사용된 전압은 통상적으로 +5V 내지 -5V, 예컨대 +4V 내지 -4V, +3V 내지 -3V 또는 +2V 내지 -2V이다. 사용된 전압은 통상적으로 -600mV 내지 +600mV 또는 -400mV 내지 +400mV이다. 사용된 전압은 바람직하게는 -400mV, -300mV, -200mV, -150mV, -100mV, -50mV, -20mV 및 0mV로부터 선택된 하한 및 +10mV, + 20mV, +50mV, +100mV, +150mV, +200mV, +300mV 및 +400mV로부터 독립적으로 선택된 상한을 갖는 범위이다. 사용된 전압은 더 바람직하게는 100mV 내지 240mV의 범위, 가장 바람직하게는 120mV 내지 220mV의 범위이다. 증가된 인가된 전위를 사용함으로써 기공에 의해 상이한 뉴클레오타이드 사이의 구별을 증가시킬 수 있다.
상기 방법은 통상적으로 임의의 전하 캐리어, 예컨대 금속염, 예를 들어 알칼리 금속염, 할라이드 염, 예를 들어 클로라이드 염, 예컨대 알칼리 금속 클로라이드 염의 존재 하에 수행된다. 전하 캐리어는 이온성 액체 또는 유기 염, 예를 들어 테트라메틸 암모늄 클로라이드, 트라이메틸페닐 암모늄 클로라이드, 페닐트라이메틸 암모늄 클로라이드, 또는 1-에틸-3-메틸 이미다졸륨 클로라이드를 포함할 수 있다. 상기 기재된 예시적인 장치에서, 염은 챔버 내에 수용액으로 존재한다. 염화칼륨(KCl), 염화나트륨(NaCl), 염화세슘(CsCl) 또는 칼륨 페로시아나이드 및 칼륨 페리시아나이드의 혼합물이 통상적으로 사용된다. KCl, NaCl 및 칼륨 페로시아나이드 및 칼륨 페리시아나이드의 혼합물이 바람직하다. 전하 캐리어는 막에 걸쳐 비대칭일 수 있다. 예를 들어, 전하 캐리어의 유형 및/또는 농도는 막의 각각의 측에서 상이할 수 있다.
염 농도는 포화에 있을 수 있다. 염 농도는 3M 이하일 수 있고, 통상적으로 0.1 내지 2.5M, 0.3 내지 1.9M, 0.5 내지 1.8M, 0.7 내지 1.7M, 0.9 내지 1.6M 또는 1M 내지 1.4M이다. 염 농도는 바람직하게는 150mM 내지 1M이다. 상기 방법은 바람직하게는 적어도 0.3M, 예컨대 적어도 0.4M, 적어도 0.5M, 적어도 0.6M, 적어도 0.8M, 적어도 1.0M, 적어도 1.5M, 적어도 2.0M, 적어도 2.5M 또는 적어도 3.0M의 염 농도를 사용하여 수행된다. 높은 염 농도는 높은 신호 대 노이즈 비를 제공하고, 정상 전류 변동의 배경에 대해 확인되는 뉴클레오타이드의 존재를 표시하는 전류를 허용한다.
상기 방법은 통상적으로 완충제의 존재 하에 수행된다. 상기 기재된 예시적인 장치에서, 완충제는 챔버 내에 수용액으로 존재한다. 임의의 완충제를 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다. 통상적으로, 완충제는 인산염 완충제이다. 다른 적합한 완충제는 HEPES 및 트리스-HCl 완충제이다. 상기 방법은 통상적으로 4.0 내지 12.0, 4.5 내지 10.0, 5.0 내지 9.0, 5.5 내지 8.8, 6.0 내지 8.7 또는 7.0 내지 8.8 또는 7.5 내지 8.5의 pH에서 수행되다. 사용된 pH는 바람직하게는 약 7.5이다.
상기 방법은 0℃ 내지 100℃, 15℃ 내지 95℃, 16℃ 내지 90℃, 17℃ 내지 85℃, 18℃ 내지 80℃, 19℃ 내지 70℃, 또는 20℃ 내지 60℃에서 수행될 수 있다. 상기 방법은 통상적으로 실온에서 수행된다. 상기 방법은 임의로 효소 기능을 지지하는 온도, 예컨대 약 37℃에서 수행된다.
폴리뉴클레오타이드 결합 단백질
스트랜드 규명 방법은 바람직하게는 단백질이 기공과 관련하여, 예컨대 이를 통해 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어하도록 폴리뉴클레오타이드를 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함한다.
더 바람직하게는, 상기 방법은 (a) 단백질이 기공과 관련하여, 예컨대 이를 통해 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어하도록 폴리뉴클레오타이드를 본 발명의 기공 및 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질과 접촉시키는 단계 및 (b) 폴리뉴클레오타이드가 기공과 관련하여 이동하면서 하나 이상의 측정을 하고(여기서, 측정은 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 특징을 나타냄), 이로써 폴리뉴클레오타이드를 규명하는 단계를 포함한다.
더 바람직하게는, 상기 방법은 (a) 단백질이 기공과 관련하여, 예컨대 이를 통해 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어하도록 폴리뉴클레오타이드를 본 발명의 기공 및 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질과 접촉시키는 단계 및 (b) 폴리뉴클레오타이드가 기공과 관련하여 이동하면서 기공을 통해 전류를 측정하고(여기서, 전류는 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 특징을 나타냄), 이로써 폴리뉴클레오타이드를 규명하는 단계를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드 결합 단백질은 폴리뉴클레오타이드에 결합하고 기공을 통한 이의 이동을 제어할 수 있는 임의의 단백질일 수 있다. 단백질이 폴리뉴클레오타이드에 결합하는지 또는 아닌지를 결정하는 것은 당해 분야에서 간단하다. 단백질은 통상적으로 폴리뉴클레오타이드와 상호작용하고 이의 적어도 하나의 특성을 개질시킨다. 단백질은 폴리뉴클레오타이드를 절단하여서 개별 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드, 예컨대 다이뉴클레오타이드 또는 트라이뉴클레오타이드의 더 짧은 사슬을 형성함으로써 폴리뉴클레오타이드를 변형시킬 수 있다. 단백질은 폴리뉴클레오타이드를 배향시키거나 이것을 특정한 위치로 이동시킴으로써, 즉 이의 이동을 제어함으로써 폴리뉴클레오타이드를 변형시킬 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 결합 단백질은 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드 취급 효소로부터 유래된다. 폴리뉴클레오타이드 취급 효소는 폴리뉴클레오타이드와 상호작용하고 이의 적어도 하나의 특성을 개질시킬 수 있는 폴리펩타이드이다. 효소는 폴리뉴클레오타이드를 절단하여서 개별 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드, 예컨대 다이뉴클레오타이드 또는 트라이뉴클레오타이드의 더 짧은 사슬을 형성함으로써 폴리뉴클레오타이드를 변형시킬 수 있다. 효소는 폴리뉴클레오타이드를 배향시키거나 이것을 특정한 위치로 이동시킴으로써 폴리뉴클레오타이드를 변형시킬 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 취급 효소는 폴리뉴클레오타이드를 결합시키고 기공을 통한 이의 이동을 제어할 수 있는 한 효소 활성을 나타낼 필요가 없다. 예를 들어, 효소는 이의 효소 활성을 제거하도록 변형될 수 있거나, 이것이 효소로서 작용하는 것을 막는 조건 하에 사용될 수 있다. 이러한 조건은 하기 더 자세히 기재되어 있다.
폴리뉴클레오타이드 취급 효소는 바람직하게는 핵산분해 효소로부터 유래된다. 효소의 작제물에서 사용되는 폴리뉴클레오타이드 취급 효소는 더 바람직하게는 임의의 효소 분류(Enzyme Classification: EC) 그룹 3.1.11, 3.1.13, 3.1.14, 3.1.15, 3.1.16, 3.1.21, 3.1.22, 3.1.25, 3.1.26, 3.1.27, 3.1.30 및 3.1.31의 구성원으로부터 유래된다. 효소는 국제 출원 제PCT/GB10/000133호(WO 제2010/086603호로 공개됨)에 개시된 임의의 것일 수 있다.
바람직한 효소는 중합효소, 엑소뉴클레아제, 헬리카제 및 토포아이소머라제, 예컨대 자이레이스이다. 적합한 효소는 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 I(서열 번호 11), 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 III 효소(서열 번호 13), 티. 써모피루스(T. thermophilus)로부터의 RecJ(서열 번호 15) 및 박테리오파지 람다 엑소뉴클레아제(서열 번호 17), TatD 엑소뉴클레아제 및 이들의 변이체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 서열 번호 15에 기재된 서열을 포함하는 3개의 아단위 또는 이들의 변이체는 상호작용하여 삼합체 엑소뉴클레아제를 형성한다. 이 엑소뉴클레아제는 본 발명의 엑소뉴클레아제 방법에서 또한 사용될 수 있다. 중합효소는 PyroPhage(등록상표) 3173 DNA Polymerase(Lucigen(등록상표) Corporation으로부터 상업적으로 구입 가능), SD Polymerase(Bioron(등록상표)으로부터 상업적으로 구입 가능) 또는 이들의 변이체일 수 있다. 효소는 바람직하게는 Phi29 DNA 중합효소(서열 번호 9) 또는 이의 변이체이다. 토포아이소머라제는 바람직하게는 임의의 모이어티 분류(EC) 그룹 5.99.1.2 및 5.99.1.3의 구성원이다.
효소는 가장 바람직하게는 헬리카제, 예컨대 Hel308 Mbu(서열 번호 18), Hel308 Csy(서열 번호 19), Hel308 Tga(서열 번호 20), Hel308 Mhu(서열 번호 21), TraI Eco(서열 번호 22), XPD Mbu(서열 번호 23) 또는 이들의 변이체로부터 유래된다. 임의의 헬리카제를 본 발명에서 사용할 수 있다. 헬리카제는 Hel308 헬리카제, RecD 헬리카제, 예컨대 TraI 헬리카제 또는 TrwC 헬리카제, XPD 헬리카제 또는 Dda 헬리카제이거나 이들로부터 유래될 수 있다. 헬리카제는 국제 출원 제PCT/GB2012/052579호(WO 제2013/057495호로 공개됨); 제PCT/GB2012/053274호(WO 제2013/098562호로 공개됨); 제PCT/GB2012/053273호(WO 제2013098561호로 공개됨); 제PCT/GB2013/051925호(WO 제2014/013260호로 공개됨); 제PCT/GB2013/051924호(WO 제2014/013259호로 공개됨); 제PCT/GB2013/051928호(WO 제2014/013262호로 공개됨) 및 제PCT/GB2014/052736호에 개시된 임의의 헬리카제, 변형된 헬리카제 또는 헬리카제 작제물일 수 있다.
헬리카제는 바람직하게는 서열 번호 25에 기재된 서열(Trwc Cba) 또는 이의 변이체, 서열 번호 18에 기재된 서열(Hel308 Mbu) 또는 이의 변이체 또는 서열 번호 24에 기재된 서열4(Dda) 또는 이의 변이체를 포함한다. 변이체는 막관통 기공에 대해 하기 기재된 임의의 방식으로 네이티브 서열과 다를 수 있다. 서열 번호 24의 바람직한 변이체는 (a) E94C 및 A360C 또는 (b) E94C, A360C, C109A 및 C136A 및 이후 임의로 (ΔM1)G1G2(즉, M1의 결실 및 이후 부가 G1 및 G2)를 포함한다.
헬리카제의 임의의 수를 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 이것 초과의 헬리카제를 사용할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 헬리카제의 상이한 수를 사용할 수 있다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드를 2개 이상의 헬리카제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 2개 이상의 헬리카제는 통상적으로 동일한 헬리카제이다. 2개 이상의 헬리카제는 상이한 헬리카제일 수 있다.
2개 이상의 헬리카제는 상기 언급된 헬리카제의 임의의 조합일 수 있다. 2개 이상의 헬리카제는 2개 이상의 Dda 헬리카제일 수 있다. 2개 이상의 헬리카제는 하나 이상의 Dda 헬리카제 및 하나 이상의 TrwC 헬리카제일 수 있다. 2개 이상의 헬리카제는 동일한 헬리카제의 상이한 변이체일 수 있다.
2개 이상의 헬리카제는 바람직하게는 서로에 부착된다. 2개 이상의 헬리카제는 더 바람직하게는 서로에 공유 결합으로 부착된다. 헬리카제는 임의의 순서로 및 임의의 방법을 이용하여 부착될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 바람직한 헬리카제 작제물은 국제 출원 제PCT/GB2013/051925호(WO 제2014/013260호로 공개됨); 제PCT/GB2013/051924호(WO 제2014/013259호로 공개됨); 제PCT/GB2013/051928호(WO 제2014/013262호로 공개됨) 및 제PCT/GB2014/052736호에 기재되어 있다.
서열 번호 9, 11, 13, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25의 변이체는 서열 번호 9, 11, 13, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25의 것과 다른 아미노산 서열을 갖고 폴리뉴클레오타이드 결합 능력을 보유하는 효소이다. 이것은 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 변이체는 폴리뉴클레오타이드와 접촉할 수 있고, 폴리뉴클레오타이드에 결합하고 이를 따라 이동하는 이의 능력은 측정될 수 있다. 변이체는 폴리뉴클레오타이드의 결합을 촉진하고/하거나, 높은 염 농도 및/또는 실온에서 이의 활성을 촉진하는 변형을 포함할 수 있다. 변이체가 폴리뉴클레오타이드를 결합시키지만(즉, 폴리뉴클레오타이드 결합 능력을 보유), 헬리카제로서 작용하지 않도록(즉, 이동을 수월하게 하도록 모든 필요한 성분, 예를 들어 ATP 및 Mg2+가 제공될 때 폴리뉴클레오타이드를 따라 이동하지 않음), 변이체는 변형될 수 있다. 이러한 변형은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 헬리카제에서의 Mg2+ 결합 도메인의 변형은 통상적으로 헬리카제로서 작용하지 않는 변이체를 발생시킨다. 변이체의 이 유형은 분자 브레이크로서 작용할 수 있다(하기 참조).
서열 번호 9, 11, 13, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐, 변이체는 바람직하게는 아미노산 동일성에 기초하여 그 서열에 적어도 50% 상동성일 것이다. 더 바람직하게는, 변이체 폴리펩타이드는 전체 서열에 걸쳐 서열 번호 9, 11, 13, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25의 아미노산 서열에 대한 아미노산 동일성에 기초하여 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 97% 또는 99% 상동성일 수 있다. 200개 또는 이것 초과, 예를 들어 230개, 250개, 270개, 280개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개 또는 1000개 또는 이것 초과의 인접한 아미노산의 스트레치에 걸쳐 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 90% 또는 95%의 아미노산 동일성("하드 상동성")이 존재할 수 있다. 상동성은 상기 기재된 바대로 결정된다. 변이체는 상기 서열 번호 2와 관련하여 상기 기재된 임의의 방식으로 야생형 서열과 다를 수 있다. 효소는 기공에 공유 결합으로 부착될 수 있다. 임의의 방법은 효소를 기공에 공유 결합으로 부착시키기 위해 이용될 수 있다.
바람직한 분자 브레이크는 TrwC Cba-Q594A(돌연변이 Q594A를 갖는 서열 번호 25)이다. 이 변이체는 헬리카제로서 작용하지 않는다(즉, 폴리뉴클레오타이드를 결합시키지만, 이동을 수월하게 하는 모든 필요한 성분, 예를 들어 ATP 및 Mg2+가 제공될 때 이들을 따라 이동하지 않음).
스트랜드 서열분석에서, 폴리뉴클레오타이드는 인가된 전위에 의해 또는 이에 대해 기공을 통해 전좌된다. 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드에서 계속해서 또는 과정적으로 작용하는 엑소뉴클레아제는 인가된 전위 하에 남은 단일 스트랜드를 공급하도록 기공의 시스 측에서 또는 리버스 전위 하에 트랜스 측에서 사용될 수 있다. 마찬가지로, 이중 가닥 DNA를 해권하는 헬리카제를 유사한 방식으로 또한 사용할 수 있다. 중합효소를 또한 사용할 수 있다. 인가된 전위에 대해 스트랜드 전좌를 요하는 서열분석 분야에 대한 가능성이 또한 존재하지만, DNA는 리버스 전위 또는 비전위 하에 효소에 의해 처음에 "잡혀야" 한다. 결합 후 이후 뒤로 스위칭되는 전위에 의해, 스트랜드는 기공을 통해 시스 대 트랜스 통과시키고, 전류 흐름에 의해 연장된 형태로 보유될 것이다. 단일 스트랜드 DNA 엑소뉴클레아제 또는 단일 스트랜드 DNA 의존적 중합효소는 인가된 전위에 대해 제어된 단계별 방식으로 시스 대 트랜스로 기공을 통해 다시 최근에 전좌된 단일 스트랜드를 당기도록 분자 모터로서 작용할 수 있다.
임의의 헬리카제를 상기 방법에서 사용할 수 있다. 헬리카제는 기공과 관련하여 2개의 방식으로 일할 수 있다. 처음에, 상기 방법은 바람직하게는 헬리카제가 인가된 전압으로부터 생긴 장에 의해 기공을 통해 폴리뉴클레오타이드를 이동시키도록 헬리카제를 사용함으로써 수행된다. 이 방식에서, 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단은 처음에 기공에 포획되고, 헬리카제는 폴리뉴클레오타이드를 기공으로 이동시켜서, 이것이 막의 트랜스 측을 통해 마침내 전좌할 때까지 이것은 장에 의해 기공을 통해 통과한다. 대안적으로, 상기 방법은 바람직하게는 헬리카제가 인가된 전압으로부터 생긴 장에 대해 기공을 통해 폴리뉴클레오타이드를 이동시키도록 수행된다. 이 방식에서, 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단은 처음에 기공에 포획되고, 헬리카제는 기공을 통해 폴리뉴클레오타이드를 이동시켜서, 이것이 막의 시스 측으로 다시 마침내 나올 때까지 기공 밖으로 빠져나온다.
상기 방법은 또한 반대의 방향에서 수행될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단은 처음에 기공에 포획될 수 있고, 헬리카제는 폴리뉴클레오타이드를 기공으로 이동시킬 수 있어서, 이것이 막의 트랜스 측을 통해 마침내 전좌할 때까지 이것은 장에 의해 기공을 통해 통과한다.
헬리카제가 이동을 수월하게 하도록 필요한 성분이 제공되지 않거나 이의 이동을 방해하거나 막도록 변형되는 경우, 이것은 폴리뉴클레오타이드에 결합하고 인가된 장에 의해 기공으로 당겨질 때 폴리뉴클레오타이드의 이동을 감소시키는 브레이크로서 작용할 수 있다. 비활성 모드에서, 이것은 폴리뉴클레오타이드가 3' 또는 5' 아래 중 어느 하나로 포획되는지는 문제가 되지 않고, 이것은 브레이크로서 작용하는 효소에 의해 트랜스 측을 향해 폴리뉴클레오타이드를 기공으로 당기는 인가된 장이다. 비활성 모드일 때, 헬리카제에 의한 폴리뉴클레오타이드의 이동 제어는 라체팅(ratcheting), 슬라이딩 및 브레이킹을 포함하는 다수의 방식으로 기재될 수 있다. 헬리카제 활성이 결여된 헬리카제 변이체를 또한 이러한 방식으로 사용할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드는 임의의 순서로 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질 및 기공과 접촉할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드가 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질, 예컨대 헬리카제, 및 기공과 접촉할 때, 폴리뉴클레오타이드가 처음에 단백질과 복합체를 형성하는 것이 바람직하다. 전압이 기공에 걸쳐 인가될 때, 폴리뉴클레오타이드/단백질 복합체는 이후 기공과 복합체를 형성하고, 기공을 통한 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어한다.
폴리뉴클레오타이드 결합 단백질을 사용하는 방법에서 임의의 단계는 통상적으로 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질의 작용을 수월하게 하는 유리 뉴클레오타이드 또는 유리 뉴클레오타이드 유사체 및 효소 보인자의 존재 하에 수행된다. 유리 뉴클레오타이드는 상기 기재된 임의의 개별 뉴클레오타이드 중 하나 이상일 수 있다. 유리 뉴클레오타이드는 아데노신 모노포스페이트(AMP), 아데노신 다이포스페이트(ADP), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 구아노신 모노포스페이트(GMP), 구아노신 다이포스페이트(GDP), 구아노신 트라이포스페이트(GTP), 타이미딘 모노포스페이트(TMP), 타이미딘 다이포스페이트(TDP), 타이미딘 트라이포스페이트(TTP), 유리딘 모노포스페이트(UMP), 유리딘 다이포스페이트(UDP), 유리딘 트라이포스페이트(UTP), 사이티딘 모노포스페이트(CMP), 사이티딘 다이포스페이트(CDP), 사이티딘 트라이포스페이트(CTP), 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(cAMP), 사이클릭 구아노신 모노포스페이트(cGMP), 데옥시아데노신 모노포스페이트(dAMP), 데옥시아데노신 다이포스페이트(dADP), 데옥시아데노신 트라이포스페이트(dATP), 데옥시구아노신 모노포스페이트(dGMP), 데옥시구아노신 다이포스페이트(dGDP), 데옥시구아노신 트라이포스페이트(dGTP), 데옥시타이미딘 모노포스페이트(dTMP), 데옥시타이미딘 다이포스페이트(dTDP), 데옥시타이미딘 트라이포스페이트(dTTP), 데옥시유리딘 모노포스페이트(dUMP), 데옥시유리딘 다이포스페이트(dUDP), 데옥시유리딘 트라이포스페이트(dUTP), 데옥시사이티딘 모노포스페이트(dCMP), 데옥시사이티딘 다이포스페이트(dCDP) 및 데옥시사이티딘 트라이포스페이트(dCTP)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 유리 뉴클레오타이드는 바람직하게는 AMP, TMP, GMP, CMP, UMP, dAMP, dTMP, dGMP 또는 dCMP로부터 선택된다. 유리 뉴클레오타이드는 바람직하게는 아데노신 트라이포스페이트(ATP)이다. 효소 보인자는 작제물이 작용하게 하는 인자이다. 효소 보인자는 바람직하게는 2가 금속 양이온이다. 2가 금속 양이온은 바람직하게는 Mg2+, Mn2+, Ca2+ 또는 Co2+이다. 효소 보인자는 가장 바람직하게는 Mg2+이다.
헬리카제(들) 및 분자 브레이크(들)
바람직한 실시형태에서, 상기 방법은
(a) 폴리뉴클레오타이드에 부착된 하나 이상의 헬리카제 및 하나 이상의 분자 브레이크를 갖는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 단계;
(b) 하나 이상의 헬리카제 및 하나 이상의 분자 브레이크가 함께 놓이고, 둘 다 기공과 관련한, 예컨대 이를 통한 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어하도록 폴리뉴클레오타이드를 본 발명의 기공과 접촉시키고 기공에 걸쳐 전위를 인가하는 단계;
(c) 폴리뉴클레오타이드가 기공과 관련하여 이동하면서 하나 이상의 측정을 하고, 이로써 폴리뉴클레오타이드를 규명하는 단계(여기서, 측정은 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 특징을 나타냄)를 포함한다.
이 유형의 방법은 국제 출원 제PCT/GB2014/052737호에 자세히 기재되어 있다.
하나 이상의 헬리카제는 상기 기재된 임의의 것일 수 있다. 하나 이상의 분자 브레이크는 폴리뉴클레오타이드에 결합하고 기공을 통한 폴리뉴클레오타이드의 이동을 느리게 하는 임의의 화합물 또는 분자일 수 있다. 하나 이상의 분자 브레이크는 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드에 결합하는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 하나 이상의 화합물은 바람직하게는 하나 이상의 마크로사이클이다. 적합한 마크로사이클은 사이클로덱스트린, 칼릭사렌, 사이클릭 펩타이드, 크라운 에터, 쿠커비투릴, 필라라렌, 이들의 유도체 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 사이클로덱스트린 또는 이의 유도체는 문헌[Eliseev, A. V., and Schneider, H-J. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116, 6081-6088]에 개시된 임의의 것일 수 있다. 상기 물질은 더 바람직하게는 헵타키스-6-아미노-β-사이클로덱스트린(am7-βCD), 6-모노데옥시-6-모노아미노-β-사이클로덱스트린(am1-βCD) 또는 헵타키스-(6-데옥시-6-구아니디노)-사이클로덱스트린(gu7-βCD)이다.
하나 이상의 분자 브레이크는 바람직하게는 하나 이상의 단일 가닥 결합 단백질(single stranded binding protein: SSB)이다. 하나 이상의 분자 브레이크는 더 바람직하게는 순 음전하를 갖지 않는 카복시 말단(C 말단) 영역을 포함하는 단일 가닥 결합 단백질(SSB) 또는 (ⅱ) C 말단 영역의 순 음전하를 감소시키는 이의 C 말단 영역에서 하나 이상의 변형을 포함하는 변형된 SSB이다. 하나 이상의 분자 브레이크는 가장 바람직하게는 국제 출원 제PCT/GB2013/051924호(WO 제2014/013259로 공개됨)에 개시된 SSB의 것이다.
하나 이상의 분자 브레이크는 바람직하게는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질이다. 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질은 폴리뉴클레오타이드에 결합하고 기공을 통한 이의 이동을 제어할 수 있는 임의의 단백질일 수 있다. 단백질이 폴리뉴클레오타이드에 결합하는지 또는 아닌지를 결정하는 것은 당해 분야에서 간단하다. 단백질은 통상적으로 폴리뉴클레오타이드의 적어도 하나의 특성과 상호작용하고 이를 개질시킨다. 단백질은 폴리뉴클레오타이드를 절단하여서 개별 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드, 예컨대 다이뉴클레오타이드 또는 트라이뉴클레오타이드의 더 짧은 사슬을 형성함으로써 폴리뉴클레오타이드를 변형시킬 수 있다. 모이어티는 폴리뉴클레오타이드를 배향시키거나 이것을 특정한 위치로 이동시킴으로써, 즉 이의 이동을 제어함으로써 폴리뉴클레오타이드를 변형시킬 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 결합 단백질은 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드 취급 효소로부터 유래된다. 하나 이상의 분자 브레이크는 상기 기재된 임의의 폴리뉴클레오타이드 취급 효소로부터 유래될 수 있다. 분자 브레이크로서 작용하는 Phi29 중합효소(서열 번호 8)의 변형된 버전은 US 특허 제5,576,204호에 개시되어 있다. 하나 이상의 분자 브레이크는 바람직하게는 헬리카제로부터 유래된다.
헬리카제로부터 유래된 임의의 수의 분자 브레이크를 사용할 수 있다. 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 이것 초과의 헬리카제는 분자 브레이크로서 사용될 수 있다. 2개 이상의 헬리카제가 분자 브레이크로서 사용되는 경우, 2개 이상의 헬리카제는 통상적으로 동일한 헬리카제이다. 2개 이상의 헬리카제는 상이한 헬리카제일 수 있다.
2개 이상의 헬리카제는 상기 언급된 헬리카제의 임의의 조합일 수 있다. 2개 이상의 헬리카제는 2개 이상의 Dda 헬리카제일 수 있다. 2개 이상의 헬리카제는 하나 이상의 Dda 헬리카제 및 하나 이상의 TrwC 헬리카제일 수 있다. 2개 이상의 헬리카제는 동일한 헬리카제의 상이한 변이체일 수 있다.
2개 이상의 헬리카제는 바람직하게는 서로에 부착된다. 2개 이상의 헬리카제는 더 바람직하게는 서로에 공유 결합으로 부착된다. 헬리카제는 임의의 순서로 및 임의의 방법을 이용하여 부착될 수 있다. 헬리카제로부터 유래된 하나 이상의 분자 브레이크는 바람직하게는 적어도 하나의 입체형태 상태에서 폴리뉴클레오타이드가 헬리카제로부터 비결합할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 결합 도메인에서의 개구의 크기를 감소시키도록 변형된다. 이것은 WO 제2014/013260호에 개시되어 있다.
본 발명에서 사용하기에 바람직한 헬리카제 작제물은 국제 출원 제PCT/GB2013/051925호(WO 제2014/013260호로 공개됨); 제PCT/GB2013/051924호(WO 제2014/013259호로 공개됨); 제PCT/GB2013/051928호(WO 제2014/013262호로 공개됨) 및 제PCT/GB2014/052736호에 기재되어 있다.
하나 이상의 헬리카제가 활성 모드로 사용되는 경우(즉, 하나 이상의 헬리카제가 이동을 수월하게 하는 데 모든 필요한 성분, 예를 들어 ATP 및 Mg2+가 제공될 때), 하나 이상의 분자 브레이크는 바람직하게는 (a) 불활성 모드로 사용되거나(즉, 이동을 수월하게 하거나 활성 이동을 할 수 없는 필요한 성분의 부재 하에 사용되거나), (b) 하나 이상의 분자 브레이크가 하나 이상의 헬리카제에 반대의 방향으로 이동하는 활성 모드로 사용되거나, (c) 하나 이상의 분자 브레이크가 하나 이상의 헬리카제와 동일한 방향으로 이동하고 하나 이상의 헬리카제보다 더 느리게 이동하는 활성 모드로 사용된다.
하나 이상의 헬리카제가 비활성 모드로 사용될 때(즉, 하나 이상의 헬리카제가 이동을 수월하게 하는 데 모든 필요한 성분, 예를 들어 ATP 및 Mg2+가 제공되지 않거나 활성 이동을 할 수 없을 때), 하나 이상의 분자 브레이크는 바람직하게는 (a) 불활성 모드로 사용되거나(즉, 이동을 수월하게 하거나 활성 이동을 할 수 없는 필요한 성분의 부재 하에 사용되거나), (b) 하나 이상의 분자 브레이크가 기공을 통해 폴리뉴클레오타이드와 동일한 방향으로 폴리뉴클레오타이드를 따라 이동하는 활성 모드로 사용된다.
하나 이상의 헬리카제 및 하나 이상의 분자 브레이크가 함께 놓이고 둘 다 기공을 통한 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어하도록 임의의 위치에서 폴리뉴클레오타이드에 부착될 수 있다. 하나 이상의 헬리카제 및 하나 이상의 분자 브레이크는 적어도 1개의 뉴클레오타이드, 예컨대 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 500개, 적어도 1000개, 적어도 5000개, 적어도 10,000개, 적어도 50,000개 또는 이것 초과의 뉴클레오타이드로 떨어져 있다. 상기 방법이 일 말단에서의 Y 어댑터 및 다른 말단에서의 헤어핀 루프 어댑터가 제공된 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 규명하는 것에 관한 것일 때, 하나 이상의 헬리카제는 바람직하게는 Y 어댑터에 부착되고, 하나 이상의 분자 브레이크는 바람직하게는 헤어핀 루프 어댑터에 부착된다. 이 실시형태에서, 하나 이상의 분자 브레이크는 바람직하게는 이들이 폴리뉴클레오타이드를 결합시키지만 헬리카제로서 작용하지 않도록 변형된 하나 이상의 헬리카제이다. Y 어댑터에 부착된 하나 이상의 헬리카제는 바람직하게는 하기 더 자세히 기재된 바대로 스페이서에서 기능정지된다. 헤어핀 루프 어댑터에 부착된 하나 이상의 분자 브레이크는 바람직하게는 스페이서에서 기능정지되지 않는다. 하나 이상의 헬리카제 및 하나 이상의 분자 브레이크는 하나 이상의 헬리카제가 헤어핀 루프에 도달할 때 바람직하게는 함께 놓인다. 하나 이상의 헬리카제는 Y 어댑터가 폴리뉴클레오타이드에 부착하기 전에 또는 Y 어댑터가 폴리뉴클레오타이드에 부착한 후 Y 어댑터에 부착될 수 있다. 하나 이상의 분자 브레이크는 헤어핀 루프 어댑터가 폴리뉴클레오타이드에 부착하기 전에 또는 헤어핀 루프 어댑터가 폴리뉴클레오타이드에 부착한 후 헤어핀 루프 어댑터에 부착될 수 있다.
하나 이상의 헬리카제 및 하나 이상의 분자 브레이크는 바람직하게는 서로에 부착된다. 하나 이상의 헬리카제 및 하나 이상의 분자 브레이크는 더 바람직하게는 서로에 공유 결합으로 부착되지 않는다. 하나 이상의 헬리카제 및 하나 이상의 분자 브레이크는 바람직하게는 국제 출원 제PCT/GB2013/051925호(WO 제2014/013260호로 공개됨); 제PCT/GB2013/051924호(WO 제2014/013259호로 공개됨); 제PCT/GB2013/051928호(WO 제2014/013262호로 공개됨) 및 제PCT/GB2014/052736호에 기재된 바대로 부착되지 않는다.
스페이서
하나 이상의 헬리카제는 국제 출원 제PCT/GB2014/050175호에 기재된 바대로 하나 이상의 스페이서에서 기능정지될 수 있다. 국제 출원에 개시된 하나 이상의 헬리카제 및 하나 이상의 스페이서의 임의의 구성은 본 발명에서 사용될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드의 일부가 기공에 진입하고 인가된 전위로부터 생긴 장을 따라 기공을 통해 이동할 때, 하나 이상의 헬리카제는 폴리뉴클레오타이드가 기공을 통해 이동하면서 기공에 의해 스페이서를 지나 이동한다. 이것은 (하나 이상의 스페이서를 포함하는) 폴리뉴클레오타이드가 기공을 통해 이동하고 하나 이상의 헬리카제가 기공의 상부에 있기 때문이다.
하나 이상의 스페이서는 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드의 일부이고, 예를 들어 이것은 폴리뉴클레오타이드 서열을 방해한다. 하나 이상의 스페이서는 바람직하게는 하나 이상의 차단 분자, 예컨대 폴리뉴클레오타이드에 혼성화된 스피드 범프의 일부가 아니다.
이들은 폴리뉴클레오타이드 내의 임의의 수의 스페이서, 예컨대 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 이것 초과의 스페이서일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 내에 바람직하게는 2개, 4개 또는 6개의 스페이서가 있다. 폴리뉴클레오타이드의 상이한 영역에 하나 이상의 스페이서, 예컨대 Y 어댑터 및/또는 헤어핀 루프 어댑터 내의 하나 이상의 스페이서가 존재할 수 있다.
하나 이상의 스페이서는 각각 하나 이상의 헬리카제가 활성 모드에서도 극복할 수 없는 에너지 장벽을 제공한다. 하나 이상의 스페이서는 헬리카제의 끌어당김을 감소시킴으로써(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드에서의 뉴클레오타이드로부터 염기를 제거함으로써) 또는 (예를 들어, 벌키한 화학 기를 사용하여) 하나 이상의 헬리카제의 이동을 물리적으로 차단함으로써 하나 이상의 헬리카제를 기능정지시킬 수 있다.
하나 이상의 스페이서는 하나 이상의 헬리카제를 기능정지시키는 임의의 분자 또는 분자의 조합을 포함할 수 있다. 하나 이상의 스페이서는 하나 이상의 헬리카제가 폴리뉴클레오타이드를 따라 이동하는 것을 막는 임의의 분자 또는 분자의 조합을 포함할 수 있다. 하나 이상의 헬리카제가 막관통 기공 및 인가된 전위의 부재 하에 하나 이상의 스페이서에서 기능정지되는지 또는 되지 않는지를 결정하는 것이 간단하다. 예를 들어, 스페이서를 지나 이동하고 DNA의 상보성 스트랜드를 대체하는 헬리카제의 능력은 PAGE에 의해 측정될 수 있다.
하나 이상의 스페이서는 통상적으로 선형 분자, 예컨대 중합체를 포함한다. 하나 이상의 스페이서는 통상적으로 폴리뉴클레오타이드와 상이한 구조를 갖는다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드가 DNA인 경우, 하나 이상의 스페이서는 통상적으로 DNA가 아니다. 특히, 폴리뉴클레오타이드가 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)인 경우, 하나 이상의 스페이서는 바람직하게는 펩타이드 핵산(PNA), 글라이세롤 핵산(GNA), 트레오스 핵산(TNA), 잠긴 핵산(LNA) 또는 뉴클레오타이드 측쇄를 갖는 합성 중합체를 포함한다. 하나 이상의 스페이서는 폴리뉴클레오타이드로부터의 반대의 방향에서 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 스페이서는 폴리뉴클레오타이드가 5'에서 3' 방향일 때 3'에서 5' 방향에서 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드는 상기 기재된 임의의 것일 수 있다.
하나 이상의 스페이서는 바람직하게는 하나 이상의 나이트로인돌, 예컨대 하나 이상의 5-나이트로인돌, 하나 이상의 이노신, 하나 이상의 아크리딘, 하나 이상의 2-아미노퓨린, 하나 이상의 2-6-다이아미노퓨린, 하나 이상의 5-브로모-데옥시유리딘, 하나 이상의 인버티드 타이미딘(인버티드 dT), 하나 이상의 인버티드 다이데옥시-타이미딘(ddT), 하나 이상의 다이데옥시-사이티딘(ddC), 하나 이상의 5-메틸사이티딘, 하나 이상의 5-하이드록시메틸사이티딘, 하나 이상의 2'-O-메틸 RNA 염기, 하나 이상의 아이소-데옥시사이티딘(아이소-dC), 하나 이상의 아이소-데옥시구아노신(아이소-dG), 하나 이상의 iSpC3 기(즉, 당 및 염기가 결여된 뉴클레오타이드), 하나 이상의 광 절단 가능한(PC) 기, 하나 이상의 헥산다이올기, 하나 이상의 스페이서 9(iSp9) 기, 하나 이상의 스페이서 18(iSp18) 기, 중합체 또는 하나 이상의 티올 연결을 포함한다. 하나 이상의 스페이서는 이들 기의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 많은 이들 기는 IDT(등록상표)(Integrated DNA Technologies(등록상표))로부터 상업적으로 구입 가능하다.
하나 이상의 스페이서는 임의의 수의 이들 기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 2-아미노퓨린, 2-6-다이아미노퓨린, 5-브로모-데옥시유리딘, 인버티드 dT, ddT, ddC, 5-메틸사이티딘, 5-하이드록시메틸사이티딘, 2'-O-메틸 RNA 염기, 아이소-dC, 아이소-dG, iSpC3 기, PC 기, 헥산다이올기 및 티올 연결에 대해, 하나 이상의 스페이서는 바람직하게는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 또는 이것 초과를 포함한다. 하나 이상의 스페이서는 바람직하게는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 이것 초과의 iSp9 기를 포함한다. 하나 이상의 스페이서는 바람직하게는 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 또는 이것 초과의 iSp18 기를 포함한다. 가장 바람직한 스페이서는 4개의 iSp18 기이다.
중합체는 바람직하게는 폴리펩타이드 또는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)이다. 폴리펩타이드는 바람직하게는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 또는 이것 초과의 아미노산을 포함한다. PEG는 바람직하게는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 또는 이것 초과의 단량체 단위를 포함한다.
하나 이상의 스페이서는 바람직하게는 하나 이상의 비염기성 뉴클레오타이드(즉, 핵염기가 결여된 뉴클레오타이드), 예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 또는 이것 초과의 비염기성 뉴클레오타이드를 포함한다. 핵염기는 비염기성 뉴클레오타이드에서 -H(idSp) 또는 -OH에 의해 대체될 수 있다. 비염기성 스페이서는 하나 이상의 인접한 뉴클레오타이드로부터 핵염기를 제거함으로써 폴리뉴클레오타이드로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 3-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 1,N6-에테노아데닌 이노신 또는 하이폭산틴을 포함하도록 변형될 수 있고, 핵염기는 인간 알킬아데닌 DNA 글라이코실라제(hAAG)를 사용하여 이 뉴클레오타이드로부터 제거될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드는 유라실-DNA 글라이코실라제(UDG)에 의해 제거된 핵염기 및 유라실을 포함하도록 변형될 수 있다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 스페이서는 임의의 비염기성 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
하나 이상의 헬리카제는 각각의 선형 분자 스페이서에 의해(즉, 이것 전에) 또는 이것에서 기능정지될 수 있다. 선형 분자 스페이서가 사용되는 경우, 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 하나 이상의 헬리카제가 지나서 이동되어야 하는 각각의 스페이서의 말단에 인접한 폴리뉴클레오타이드의 이중 가닥 영역이 제공된다. 이중 가닥 영역은 통상적으로 인접한 스페이서에서 하나 이상의 헬리카제를 기능정지시키는 것을 돕는다. 이중 가닥 영역(들)의 존재는 상기 방법이 약 100mM 이하의 염 농도에서 수행되므로 특히 바람직하다. 각각의 이중 가닥 영역은 통상적으로 적어도 10개, 예컨대 적어도 12개의 뉴클레오타이드 길이이다. 본 발명에서 사용된 폴리뉴클레오타이드가 단일 가닥인 경우, 이중 가닥 영역은 스페이서에 인접한 영역에 더 짧은 폴리뉴클레오타이드를 혼성화시킴으로써 형성될 수 있다. 더 짧은 폴리뉴클레오타이드는 통상적으로 폴리뉴클레오타이드와 동일한 뉴클레오타이드로부터 형성되지만, 상이한 뉴클레오타이드로부터 형성될 수 있다. 예를 들어, 더 짧은 폴리뉴클레오타이드는 LNA로부터 형성될 수 있다.
선형 분자 스페이서가 사용되는 경우, 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 하나 이상의 헬리카제가 지나서 이동되어야 하는 말단에 반대인 각각의 스페이서의 말단에서 차단 분자가 제공된다. 이것은 하나 이상의 헬리카제가 각각의 스페이서에 기능정지된 채 머물도록 보장하는 것을 도울 수 있다. 이것이 용액 중에 확산되는 경우에 이것은 폴리뉴클레오타이드에서 하나 이상의 헬리카제를 보유하는 것을 또한 도울 수 있다. 차단 분자는 물리적으로 하나 이상의 헬리카제가 기능정지되게 하는 하기 기재된 임의의 화학 기일 수 있다. 차단 분자는 폴리뉴클레오타이드의 이중 가닥 영역일 수 있다.
하나 이상의 스페이서는 바람직하게는 물리적으로 하나 이상의 헬리카제가 기능정지되게 하는 하나 이상의 화학 기를 포함한다. 하나 이상의 화학 기는 바람직하게는 하나 이상의 펜던트 화학 기이다. 하나 이상의 화학 기는 폴리뉴클레오타이드에서 하나 이상의 핵염기에 부착될 수 있다. 하나 이상의 화학 기는 폴리뉴클레오타이드 골격에 부착될 수 있다. 이들 화학 기의 임의의 수, 예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 또는 이것 초과가 존재할 수 있다. 적합한 기는 형광단, 스트렙타비딘 및/또는 바이오틴, 콜레스테롤, 메틸렌 블루, 다이나이트로페놀(DNPs), 다이곡시게닌 및/또는 항-다이곡시게닌 및 다이벤질사이클로옥틴 기를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
폴리뉴클레오타이드에서의 상이한 스페이서는 상이한 기능정지 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나의 스페이서는 상기 기재된 선형 분자 중 하나를 포함할 수 있고, 또 다른 스페이서는 물리적으로 하나 이상의 헬리카제가 기능정지되게 하는 하나 이상의 화학 기를 포함할 수 있다. 스페이서는 상기 기재된 임의의 선형 분자 및 물리적으로 하나 이상의 헬리카제가 기능정지되게 하는 하나 이상의 화학 기, 예컨대 하나 이상의 비염기성 및 형광단을 포함할 수 있다.
적합한 스페이서는 폴리뉴클레오타이드의 유형 및 본 발명의 방법이 수행되는 조건에 따라 설계될 수 있다. 대부분의 헬리카제는 DNA를 결합시키고 이를 따라 이동하고, 그래서 DNA가 아닌 어떤 것을 사용하여 기능정지될 수 있다. 적합한 분자는 상기 기재되어 있다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 유리 뉴클레오타이드의 존재 및/또는 헬리카제 보인자의 존재 하에 수행된다. 이것은 하기 더 자세히 기재되어 있다. 막관통 기공 및 인가된 전위의 부재 하에, 하나 이상의 스페이서는 바람직하게는 유리 뉴클레오타이드의 존재 및/또는 헬리카제 보인자의 존재 하에 하나 이상의 헬리카제를 기능정지시킬 수 있다.
본 발명의 방법이 하기 기재된 바대로 하나 이상의 헬리카제는 활성 모드이도록 유리 뉴클레오타이드 및 헬리카제 보인자의 존재 하에 수행되는 경우, 하나 이상의 더 긴 스페이서는 통상적으로 이들이 막관통 기공과 접촉하고 전위가 인가되기 전에 하나 이상의 헬리카제가 폴리뉴클레오타이드에서 기능정지되는 것을 보장하도록 사용된다. 하나 이상의 더 짧은 스페이서는 하나 이상의 헬리카제가 비활성 모드이도록 유리 뉴클레오타이드 및 헬리카제 보인자의 부재 하에 사용될 수 있다.
염 농도는 또한 하나 이상의 헬리카제를 기능정지시키는 하나 이상의 스페이서의 능력에 영향을 미친다. 막관통 기공 및 인가된 전위의 부재 하에, 하나 이상의 스페이서는 바람직하게는 약 100mM 이하의 염 농도에서 하나 이상의 헬리카제를 기능정지시킬 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용된 염 농도가 더 높을수록, 통상적으로 사용되는 하나 이상의 스페이서가 더 짧고, 그 반대도 그렇다.
특징의 바람직한 조합은 하기 표 4에 기재되어 있다.
상기 방법은 스페이서를 지나 2개 이상의 헬리카제를 이동시키는 것에 관한 수 있다. 이러한 경우에, 스페이서의 길이는 통상적으로 기공 및 인가된 전위의 부재 하에 트레일링 헬리카제가 스페이서를 지나 리딩 헬리카제를 미는 것을 막도록 증가한다. 상기 방법이 하나 이상의 스페이서를 지나 2개 이상의 헬리카제를 이동시키는 것에 관한 것일 때, 상기 기재된 스페이서 길이는 적어도 1.5배, 2배, 2.5배 또는 3배 증가할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법이 하나 이상의 스페이서를 지나 2개 이상의 헬리카제를 이동시키는 것에 관한 것일 때, 상기 표 4의 제3 열에서의 스페이서 길이는 1.5배, 2배, 2.5배 또는 3배 증가할 수 있다.
막
본 발명의 기공은 막에 존재할 수 있다. 본 발명의 방법에서, 폴리뉴클레오타이드는 통상적으로 막에서 본 발명의 기공과 접촉한다. 임의의 막은 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 적합한 막은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 막은 바람직하게는 양친매성 층이다. 양친매성 층은 양친매성 분자, 예컨대 친수성 특성 및 친유성 특성 둘 다를 갖는 인지질로부터 형성된 층이다. 양친매성 분자는 합성 또는 천연 발생일 수 있다. 비천연 발생 양친매성물질 및 단층을 형성하는 양친매성물질은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 블록 공중합체를 포함한다(Gonzalez-Perez et al., Langmuir, 2009, 25, 10447-10450). 블록 공중합체는 단일 중합체 사슬을 생성하기 위해 2개 이상의 단량체 아단위가 함께 중합된 중합체 재료이다. 블록 공중합체는 통상적으로 각각의 단량체 아단위가 기여하는 특성을 갖는다. 그러나, 블록 공중합체는 개별 아단위로부터 형성된 중합체가 보유하지 않는 독특한 특성을 가질 수 있다. 블록 공중합체는 단량체 아단위 중 하나가 소수성(즉, 친유성)인 한편, 다른 아단위(들)가 수성 매질 중에 친수성이도록 조작될 수 있다. 이러한 경우에, 블록 공중합체는 양친매성 특성을 보유할 수 있고, 생물학적 막을 닮은 구조를 형성할 수 있다. 블록 공중합체는 (2개의 단량체 아단위로 이루어진) 이중블록일 수 있지만, 양친매성물질로서 거동하는 더 복잡한 배열을 형성하기 위해 2개 초과의 단량체 아단위로부터 또한 작제될 수 있다. 공중합체는 삼중블록, 사중블록 또는 오중블록 공중합체일 수 있다. 막은 바람직하게는 삼중블록 공중합체 막이다.
고세균 양극성 테트라에터 지질은 지질이 단층 막을 형성하도록 작제된 천연 발생 지질이다. 이 지질은 일반적으로 가혹한 생물학적 환경에서 성장하는 극한성 생물(extremophile), 호열균, 호염균 및 호산균에서 발견된다. 이의 안정성은 최종 이중층의 융합된 성질로부터 유래되는 것으로 생각된다. 일반적인 모티프 친수성-소수성-친수성을 갖는 삼중블록 중합체를 생성함으로써 이 생물학적 집합체를 모방하는 블록 공중합체 재료를 작제하는 것이 간단하다. 이 재료는 지질 이중층과 유사하게 거동하는 단량체 막을 형성할 수 있고, 베시클로부터 판상 층을 통해 일련의 위상 거동(phase behaviour)을 포함한다. 이 삼중블록 공중합체로부터 형성된 막은 생물학적 지질 막에 비해 몇몇 이점을 보유한다. 삼중블록 공중합체가 합성되므로, 정확한 작제는 막을 형성하고 기공 및 다른 단백질과 상호작용하는 데 필요한 특성 및 정확한 사슬 길이를 제공하도록 조심스럽게 제어될 수 있다.
블록 공중합체는 또한 지질 하위재료로 분류되지 않은 아단위로부터 작제될 수 있고, 예를 들어 소수성 중합체는 실록산 또는 다른 비탄화수소계 단량체로부터 제조될 수 있다. 블록 공중합체의 친수성 하위섹션은 낮은 단백질 결합 특성을 또한 보유할 수 있고, 이는 미처리 생물학적 샘플에 노출될 때 고도로 저항적인 막의 생성을 허용하다. 이 헤드 기 단위는 또한 비전통적인 지질 헤드 기로부터 유래될 수 있다.
삼중블록 공중합체 막은 또한 생물학적 지질 막, 예를 들어 훨씬 더 높은 조작 온도 또는 pH 범위와 비교하여 증가한 기계적 및 환경 안정성을 갖는다. 블록 공중합체의 합성 성질은 광범위한 분야에 대해 중합체 기반 막을 맞춤화하기 위한 플랫폼을 제공한다.
막은 가장 바람직하게는 국제 출원 제PCT/GB2013/052766호 또는 제PCT/GB2013/052767호에 개시된 막 중 하나이다.
양친매성 분자는 폴리뉴클레오타이드의 커플링을 수월하게 하도록 화학적으로 변형되거나 작용기화될 수 있다.
양친매성 층은 단층 또는 이중층일 수 있다. 양친매성 층은 통상적으로 평면이다. 양친매성 층은 곡선일 수 있다. 양친매성 층은 지지될 수 있다.
양친매성 막은 통상적으로 자연히 이동성이어서, 본질적으로 대략 10-8cm s-1의 지질 확산 속도를 갖는 2차원 유체로서 작용한다. 이것은 기공 및 커플링된 폴리뉴클레오타이드가 통상적으로 양친매성 막 내에 이동할 수 있다는 것을 의미한다.
막은 지질 이중층일 수 있다. 지질 이중층은 세포막의 모델이고, 일련의 실험 연구에 대한 훌륭한 플랫폼으로서 작용한다. 예를 들어, 지질 이중층은 단일-채널 기록에 의해 막 단백질의 시험관내 조사에 사용될 수 있다. 대안적으로, 지질 이중층은 일련의 물질의 존재를 검출하도록 바이오센서로서 사용될 수 있다. 지질 이중층은 임의의 지질 이중층일 수 있다. 적합한 지질 이중층은 평면 지질 이중층, 지지된 이중층 또는 리포솜을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 지질 이중층은 바람직하게는 평면 지질 이중층이다. 적합한 지질 이중층은 국제 출원 제PCT/GB08/000563호(WO 2008/102121로 공개됨), 국제 출원 제PCT/GB08/004127호(WO 2009/077734로 공개됨) 및 국제 출원 제PCT/GB2006/001057호(WO 2006/100484로 공개됨)에 개시되어 있다.
지질 이중층을 형성하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 지질 이중층은 Montal 및 Mueller의 방법에 의해 흔히 형성되고(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1972; 69: 3561-3566), 여기서 지질 단층은 계면에 직각인 어퍼쳐의 어느 한 측을 지나 수용액/공기 계면에 보유된다. 지질은 보통 처음에 이것을 유기 용매 중에 용해시키고 이후 용매의 방울이 어퍼쳐의 어느 한 측에서 수용액의 표면에서 증발하게 함으로써 수성 전해질 용액의 표면에 첨가된다. 유기 용매가 증발되면, 어퍼쳐의 어느 한 측에서의 용액/공기 계면은 이중층이 형성될 때까지 어퍼쳐를 지나 위 및 아래로 물리적으로 이동된다. 평면 지질 이중층은 막에서 어퍼쳐에 걸쳐 또는 리세스로 개구에 걸쳐 형성될 수 있다.
Montal & Mueller의 방법은 단백질 기공 삽입에 적합한 우수 품질의 지질 이중층을 형성하는 비용 효과적이고 비교적 간단한 방법이므로 인기있다. 이중층 형성의 다른 흔한 방법은 팁-딥핑, 이중층 인쇄 및 리포솜 이중층의 패치-클램핑을 포함한다.
팁-딥핑 이중층 형성은 지질의 단층을 보유하는 시험 용액의 표면에 어퍼쳐 표면(예를 들어, 피펫 팁)을 터치하는 것을 수반한다. 다시, 지질 단층은 유기 용매 중에 용해된 지질의 방울이 용액 표면에서 증발하게 함으로써 처음에 용액/공기 계면에서 생성된다. 이후, 이중층은 Langmuir-Schaefer 공정에 의해 형성되고, 용액 표면에 대해 어퍼쳐를 이동시키는 기계적 자동화를 요한다.
인쇄된 이중층에 대해, 유기 용매 중에 용해된 지질의 방울을 어퍼쳐에 직접적으로 도포하고, 이것은 수성 시험 용액 중에 액침된다. 지질 용액은 페인트브러쉬 또는 균등물을 사용하여 어퍼쳐 위로 얇게 분산된다. 용매의 희박화는 지질 이중층을 형성시킨다. 그러나, 이중층으로부터의 용매의 완전한 제거는 어렵고, 결과적으로 이 방법에 의해 형성된 이중층은 덜 안정적이고 전기화학 측정 동안 노이즈어 더 노출된다.
패치-클램핑은 생물학적 세포막의 연구에서 흔히 사용된다. 세포막은 흡인에 의해 피펫의 말단에 클램핑되고, 막의 패치는 어퍼쳐 위로 부착된다. 상기 방법은 리포솜을 클램핑함으로써(이후 파열하여 피펫의 어퍼쳐 위로 지질 이중층 밀봉을 남김) 지질 이중층을 제조하기 위해 적응된다. 상기 방법은 안정하고 거대한 단일층 리포솜 및 유리 표면을 갖는 재료에서의 작은 어퍼쳐의 작제를 요한다.
리포솜은 음파처리, 압출 또는 Mozafari 방법에 의해 형성될 수 있다(Colas et al. (2007) Micron 38:841-847).
바람직한 실시형태에서, 지질 이중층은 국제 출원 제PCT/GB08/004127호(WO 제2009/077734호로 공개됨)에 기재된 바대로 형성된다. 유리하게는 이 방법에서, 지질 이중층은 건조된 지질로부터 형성된다. 가장 바람직한 실시형태에서, 지질 이중층은 WO 제2009/077734호(제PCT/GB08/004127호)에 기재된 바대로 개구에 걸쳐 형성된다.
지질 이중층은 지질의 2개의 반대의 층으로부터 형성된다. 지질의 2개의 층은 이의 소수성 꼬리 기가 소수성 내부를 형성하기 위해 서로를 향해 향하도록 배열된다. 지질의 친수성 헤드 기는 이중층의 각각의 측에서 수성 환경을 향해 밖으로 향한다. 이중층은 액체 무질서 상(유체 라멜라), 액체 배향 상, 고체 배향 상(판상형 겔상, 서로 얽힌 겔상) 및 평면 이중층 결정(판상형 준겔상, 판상형 결정상)(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 다수의 지질 상에 존재할 수 있다.
지질 이중층을 형성하는 임의의 지질 조성물을 사용할 수 있다. 지질 조성물은 필요한 특성, 예컨대 표면 전하, 막 단백질을 지지하는 능력, 패킹 밀도 또는 기계적 특성을 갖는 지질 이중층이 형성되도록 선택된다. 지질 조성물은 하나 이상의 상이한 지질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 지질 조성물은 100개 이하의 지질을 함유할 수 있다. 지질 조성물은 바람직하게는 1개 내지 10개의 지질을 함유한다. 지질 조성물은 천연 발생 지질 및/또는 인공 지질을 포함할 수 있다.
지질은 통상적으로 헤드 기, 계면 모이어티 및 동일하거나 상이할 수 있는 2개의 소수성 꼬리 기를 포함한다. 적합한 헤드 기는 중성 헤드 기, 예컨대 다이아실글라이세라이드(DG) 및 세라마이드(CM); 쌍성이온 헤드 기, 예컨대 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE) 및 스핑고미엘린(SM); 음으로 하전된 헤드 기, 예컨대 포스파티딜글라이세롤(PG); 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜이노시톨(PI), 인산염산(PA) 및 카르디올리핀(CA); 및 양으로 하전된 헤드 기, 예컨대 트라이메틸암모늄-프로판(TAP)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 적합한 계면 모이어티는 천연 발생 계면 모이어티, 예컨대 글라이세롤계 또는 세라마이드계 모이어티를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 적합한 소수성 꼬리 기는 포화 탄화수소 사슬, 예컨대 라우르산(n-도데칸올산), 미리스트산(n-테트라데콘논산), 팔미트산(n-헥사데칸산), 스테아르산(n-옥타데칸산) 및 아라키드산(n-에이코산산); 불포화 탄화수소 사슬, 예컨대 올레산(시스-9-옥타데칸산); 및 분지된 탄화수소 사슬, 예컨대 피타노일을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 불포화 탄화수소 사슬에서의 사슬의 길이 및 이중 결합의 위치 및 수는 변할 수 있다. 분지된 탄화수소 사슬에서의 사슬의 길이 및 메틸기와 같은 가지의 위치 및 수는 변할 수 있다. 소수성 꼬리 기는 에터 또는 에스터로서 계면 모이어티에 연결될 수 있다. 지질은 마이콜산일 수 있다.
지질은 또한 화학적으로 변형될 수 있다. 지질의 헤드 기 또는 꼬리 기는 화학적으로 변형될 수 있다. 헤드 기가 화학적으로 변형된 적합한 지질은 PEG-변형된 지질, 예컨대 1,2-다이아실-sn-글라이세로 3-포스포에탄올아민-N -[메톡시(폴리에틸렌 글라이콜)-2000]; 작용기화된 PEG 지질, 예컨대 1,2-다이스테아로일-sn-글라이세로 3 포스포에탄올아민-N-[바이오티닐(폴리에틸렌 글라이콜)2000]; 및 공액을 위해 변형된 지질, 예컨대 1,2-다이올레오일-sn-글라이세로 3-포스포에탄올아민-N-(숙신일) 및 1,2-다이팔미토일-sn-글라이세로 3-포스포에탄올아민-N-(바이오티닐)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 꼬리 기가 화학적으로 변형된 적합한 지질은 중합 가능한 지질, 예컨대 1,2-비스(10,12-트라이코사다이이노일)-sn-글라이세로 3-포스포콜린; 불화된 지질, 예컨대 1-팔미토일-2-(16-플루오로팔미토일)-sn-글라이세로 3-포스포콜린; 중수소화된 지질, 예컨대 1,2-다이팔미토일-D62-sn-글라이세로 3-포스포콜린; 및 에터 연결된 지질, 예컨대 1,2-다이-O-피탄일-sn-글라이세로 3-포스포콜린을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 지질은 폴리뉴클레오타이드의 커플링을 수월하게 하도록 화학적으로 변형되거나 작용기화될 수 있다.
양친매성 층, 예를 들어 지질 조성물은 통상적으로 층의 특성에 영향을 미치는 하나 이상의 첨가제를 포함한다. 적합한 첨가제는 지방산, 예컨대 팔미트산, 미리스트산 및 올레산; 지방 알코올, 예컨대 팔미트산 알코올, 미리스트산 알코올 및 올레산 알코올; 스테롤, 예컨대 콜레스테롤, 에르고스테롤, 라노스테롤, 시토스테롤 및 스티그마스테롤; 라이소인지질, 예컨대 1-아실-2-하이드록시-sn-글라이세로 3-포스포콜린; 및 세라마이드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 막은 고체 상태 층을 포함한다. 고체 상태 층은 마이크로전자 재료, 절연 재료, 예컨대 Si3N4, A12O3, 및 SiO, 유기 및 무기 중합체, 예컨대 폴리아마이드, 플라스틱, 예컨대 Teflon(등록상표) 또는 엘라스토머, 예컨대 2성분 첨가-경화 실리콘 고무, 및 유리(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 유기 재료 및 무기 재료 둘 다로부터 형성될 수 있다. 고체 상태 층은 흑연으로부터 형성된다. 적합한 흑연 층은 국제 출원 제PCT/US2008/010637호(WO 제2009/035647호로 공개됨)에 개시되어 있다. 막이 고체 상태 층을 포함하는 경우, 기공은 통상적으로 고체 상태 층 내에 함유된 양친매성 막 또는 층에, 예를 들어 고체 상태 층 내에 홀, 웰, 갭, 채널, 트렌치 또는 슬릿 내에 존재한다. 숙련자는 적합한 고체 상태/양친매성 하이브리드 시스템을 제조할 수 있다. 적합한 시스템은 WO 제2009/020682호 및 WO 제2012/005857호에 개시되어 있다. 상기 기재된 임의의 양친매성 막 또는 층을 사용할 수 있다.
상기 방법은 통상적으로 (ⅰ) 기공을 포함하는 인공 양친매성 층, (ⅱ) 기공을 포함하는 단리된 천연 발생 지질 이중층, 또는 (ⅲ) 기공이 내부에 삽입된 세포를 사용하여 수행된다. 상기 방법은 통상적으로 인공 양친매성 층, 예컨대 인공 삼중블록 공중합체 층을 사용하여 수행된다. 층은 기공 이외에 다른 막관통 및/또는 막내 단백질 및 다른 분자를 포함할 수 있다. 적합한 장치 및 조건은 하기 기재되어 있다. 본 발명의 방법은 통상적으로 시험관내 수행된다.
커플링
폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 기공을 포함하는 막에 커플링된다. 상기 방법은 기공을 포함하는 막에 폴리뉴클레오타이드를 커플링시키는 단계를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 하나 이상의 앵커를 사용하여 막에 커플링된다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 공지된 방법을 이용하여 막에 커플링될 수 있다.
각각의 앵커는 폴리뉴클레오타이드에 커플링(또는 결합)하는 기 및 막에 커플링(또는 결합)하는 기를 포함한다. 각각의 앵커는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 막에 공유 결합으로 커플링(또는 결합)할 수 있다. Y 어댑터 및/또는 헤어핀 루프 어댑터가 사용되는 경우, 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 어댑터(들)를 사용하여 막에 커플링된다.
폴리뉴클레오타이드는 임의의 수의 앵커, 예컨대 2개, 3개, 4개 또는 이것 초과의 앵커를 사용하여 막에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 각각 폴리뉴클레오타이드 및 막 둘 다에 별개로 커플링(또는 결합)하는 2개의 앵커를 사용하여 막에 커플링될 수 있다.
하나 이상의 앵커는 하나 이상의 헬리카제 및/또는 하나 이상의 분자 브레이크를 포함할 수 있다.
막이 양친매성 층, 예컨대 공중합체 막 또는 지질 이중층인 경우, 하나 이상의 앵커는 바람직하게는 막에 존재하는 폴리펩타이드 앵커 및/또는 막에 존재하는 소수성 앵커를 포함한다. 소수성 앵커는 바람직하게는 지질, 지방산, 스테롤, 탄소 나노관, 폴리펩타이드, 단백질 또는 아미노산, 예를 들어 콜레스테롤, 팔미테이트 또는 토코페롤이다. 바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 앵커는 기공이 아니다.
막의 성분, 예컨대 양친매성 분자, 공중합체 또는 지질은 하나 이상의 앵커를 형성하도록 화학적으로 변형되거나 작용기화될 수 있다. 적합한 화학 변형 및 막의 성분을 작용기화하는 적합한 방식의 예는 하기 더 자세히 기재되어 있다. 막 성분의 임의의 일부, 예를 들어 적어도 0.01%, 적어도 0.1%, 적어도 1%, 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50% 또는 100%는 작용기화될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드는 막에 직접적으로 커플링될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드를 막에 커플링하기 위해 사용되는 하나 이상의 앵커는 바람직하게는 링커를 포함한다. 하나 이상의 앵커는 1개 이상, 예컨대 2개, 3개, 4개 또는 이것 초과의 링커를 포함할 수 있다. 1개의 링커는 막에 1개 초과, 예컨대 2개, 3개, 4개 또는 이것 초과의 폴리뉴클레오타이드를 커플링하도록 사용될 수 있다.
바람직한 링커는 중합체, 예컨대 폴리뉴클레오타이드, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 폴리사카라이드 및 폴리펩타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이들 링커는 선형, 분지형 또는 환형일 수 있다. 예를 들어, 링커는 환형 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 환형 폴리뉴클레오타이드 링커에서 상보성 서열에 혼성화할 수 있다.
하나 이상의 앵커 또는 하나 이상의 링커는 절단되어 분해될 수 있는 성분, 예컨대 제한 부위 또는 광 불안정(photolabile) 기를 포함할 수 있다.
작용기화된 링커 및 이것이 분자를 커플링할 수 있는 방식은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 말레이미드기에 의해 작용기화된 링커는 단백질에서 시스테인 잔기와 반응하고 이에 부착할 것이다. 본 발명의 맥락에서, 단백질은 막에 존재할 수 있거나, 폴리뉴클레오타이드에 커플링(또는 결합)하도록 사용될 수 있다. 이것은 하기 더 자세히 기재되어 있다.
폴리뉴클레오타이드의 가교결합은 "잠금 및 키" 배열을 이용하여 피해질 수 있다. 각각의 링커의 적어도 하나의 말단은 함께 반응하여 더 긴 링커를 형성할 수 있고, 각각의 링커의 다른 말단은 각각 폴리뉴클레오타이드 또는 막과 반응한다. 이러한 링커는 국제 출원 제PCT/GB10/000132호(WO 제2010/086602호로 공개됨)에 기재되어 있다.
하기 기재된 서열분석 실시형태에서 링커의 사용은 바람직하다. 폴리뉴클레오타이드가 기공과 상호작용할 때 비커플링되지 않는다(즉, 단계 (b) 또는 (e)에서 비커플링되지 않는다)는 점에서 영구적으로 막에 직접적으로 커플링되는 경우, 서열분석 실행이 막과 기공 사이의 거리로 인해 폴리뉴클레오타이드의 말단으로 계속될 수 없으면서 몇몇 서열 데이터를 잃어버릴 것이다. 링커가 사용되는 경우, 폴리뉴클레오타이드는 완료로 프로세싱될 수 있다.
커플링은 영구적이거나 안정할 수 있다. 즉, 커플링은 폴리뉴클레오타이드가 기공과 상호작용할 때 막에 커플링된 채 있도록 있을 수 있다.
커플링은 일시적일 수 있다. 즉, 커플링은 폴리뉴클레오타이드가 기공과 상호작용할 때 막으로부터 디커플링될 수 있도록 있을 수 있다.
소정의 분야, 예컨대 압타머 검출에 대해, 커플링의 일시적인 성질이 바람직하다. 영구적인 또는 안정한 링커가 폴리뉴클레오타이드의 5' 또는 3' 말단에 직접적으로 부착되고, 링커가 막과 막관통 기공의 채널 사이의 거리보다 짧은 경우, 서열분석 실행이 폴리뉴클레오타이드의 말단으로 계속될 수 없으면서 몇몇 서열 데이터를 잃어버릴 것이다. 커플링이 일시적인 경우, 커플링된 말단이 무작위로 막이 없게 될 때, 폴리뉴클레오타이드는 완료로 프로세싱될 수 있다. 영구적인/안정한 또는 일시적인 링크를 형성하는 화학 기는 하기 더 자세히 기재되어 있다. 폴리뉴클레오타이드는 콜레스테롤 또는 지방 아실 사슬을 사용하여 양친매성 층 또는 삼중블록 공중합체 막에 일시적으로 커플링될 수 있다. 6개 내지 30개의 탄소 원자의 길이를 갖는 임의의 지방 아실 사슬, 예컨대 헥사데칸산을 사용할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 핵산은 양친매성 층, 예컨대 삼중블록 공중합체 막 또는 지질 이중층에 커플링된다. 합성 지질 이중층에 대한 핵산의 커플링은 다양한 상이한 테더링 전략에 의해 이전에 수행되었다. 이것은 하기 표 5에 요약되어 있다.
합성 폴리뉴클레오타이드 및/또는 링커는 합성 반응에서 변형된 포스포르아미다이트를 사용하여 작용기화될 수 있고, 이는 적합한 앵커링 기, 예컨대 콜레스테롤, 토코페롤, 팔미테이트, 티올, 지질 및 바이오틴기의 직접 첨가에 쉽게 적합하다. 이 상이한 부착 화학은 폴리뉴클레오타이드에 대한 부착에 대한 옵션의 모음을 제공한다. 각각의 상이한 변형 기는 폴리뉴클레오타이드를 약간 상이한 방식으로 커플링시키고, 커플링은 항상 영구적인 것은 아니어서 폴리뉴클레오타이드가 막에 커플링하는 상이한 체류 시간을 제공한다. 일시적인 커플링의 이점은 상기 기재되어 있다.
링커 또는 작용기화된 막에 대한 폴리뉴클레오타이드의 커플링은 또한 다수의 다른 수단에 의해 달성될 수 있지만, 단 상보성 반응성 기 또는 앵커링 기는 폴리뉴클레오타이드에 첨가될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 어느 하나의 막에 대한 반응성 기의 첨가는 이전에 보고되었다. 티올기는 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제 및 ATPγS를 사용하여 ssDNA 또는 dsDNA의 5'에 첨가될 수 있다(Grant, G. P. and P. Z. Qin (2007). "A facile method for attaching nitroxide spin labels at the 5' terminus of nucleic acids." Nucleic Acids Res 35(10): e77). 아지드기는 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제 및 γ-[2-아지도에틸]-ATP 또는 γ-[6-아지도헥실]-ATP를 사용하여 ssDNA 또는 dsDNA의 5'-포스페이트에 첨가될 수 있다. 티올 또는 클릭 화학을 이용하여, 티올, 요오도아세트아마이드 OPSS 또는 말레이미드기(티올에 반응성임) 또는 DIBO(다이벤조사이클로옥스틴) 또는 알킨기(아지드에 반응성임)를 함유하는 테터는 폴리뉴클레오타이드에 공유 결합으로 부착될 수 있다. 바이오틴, 티올 및 형광단과 같은 화학 기의 더 다양한 선택은 ssDNA의 3'에 변형된 올리고뉴클레오타이드를 도입하도록 말단 전환효소를 사용하여 첨가될 수 있다(Kumar, A., P. Tchen, et al. (1988). "Nonradioactive labeling of synthetic oligonucleotide probes with terminal deoxynucleotidyl transferase." Anal Biochem 169(2): 376-82). 스트렙타비딘/바이오틴 및/또는 스트렙타비딘/데스티오바이오틴 커플링은 임의의 다른 폴리뉴클레오타이드에 사용될 수 있다. 하기 실시예는 스트렙타비딘/바이오틴 및 스트렙타비딘/데스티오바이오틴을 사용하여 폴리뉴클레오타이드가 어떻게 막에 커플링될 수 있는지를 기재한다. 적합하게는 변형된 뉴클레오타이드(예를 들어, 콜레스테롤 또는 팔미테이트)에 의해 말단 전환효소를 사용하여 앵커가 폴리뉴클레오타이드에 직접적으로 첨가될 수 있다는 것이 또한 가능할 수 있다.
하나 이상의 앵커는 바람직하게는 혼성화를 통해 폴리뉴클레오타이드를 막에 커플링시킨다. 하나 이상의 앵커에서의 혼성화는 상기 기재된 바대로 일시적인 방식으로 커플링을 허용한다. 혼성화는 하나 이상의 앵커의 임의의 부분에, 예컨대 하나 이상의 앵커와 폴리뉴클레오타이드 사이에, 하나 이상의 앵커 내에 또는 하나 이상의 앵커와 막 사이에 존재할 수 있다. 예를 들어, 링커는 함께 혼성화된 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 3개, 4개 또는 5개의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 하나 이상의 앵커는 폴리뉴클레오타이드에 혼성화할 수 있다. 하나 이상의 앵커는 폴리뉴클레오타이드에 직접적으로 또는 폴리뉴클레오타이드에 부착된 Y 어댑터 및/또는 리더 서열에 직접적으로 또는 (하기 기재된 바대로) 폴리뉴클레오타이드에 부착된 헤어핀 루프 어댑터에 직접적으로 혼성화할 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 앵커는 폴리뉴클레오타이드에, 폴리뉴클레오타이드에 부착된 Y 어댑터 및/또는 리더 서열에 또는 (하기 기재된 바대로) 폴리뉴클레오타이드에 부착된 헤어핀 루프 어댑터에 혼성화된 1개 이상, 예컨대 2개 또는 3개의 중간 폴리뉴클레오타이드(또는 "스필린트")에 혼성화될 수 있다.
하나 이상의 앵커는 단일 가닥 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 앵커의 일 부분은 단일 가닥 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드에 결찰될 수 있다. T4 RNA 리가제 I을 사용한 ssDNA의 짧은 조각의 결찰은 보고되어 있다(Troutt, A. B., M. G. McHeyzer-Williams, et al. (1992). "Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity." Proc Natl Acad Sci U S A 89(20): 9823-5). 대안적으로, 단일 가닥 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 및 이후 열 또는 화학 변성에 의해 분리된 2개의 스트랜드에 결찰될 수 있다. 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드에, 듀플렉스의 말단 중 하나 또는 둘 다에 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 어느 한 조각, 또는 일 말단 또는 양 말단에 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 첨가할 수 있다. 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드에 대한 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 첨가에 대해, 이것은 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 다른 영역에 대한 결찰에 대한 것처럼 T4 RNA 리가제 I를 사용하여 달성될 수 있다. 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드에 대한 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드의 첨가에 대해 이후 결찰은 각각 폴리뉴클레오타이드에서의 상보성 3' dA/dT 꼬리 및 첨가된 폴리뉴클레오타이드(콘카티머 또는 이합체 형성을 막도록 많은 샘플 제조 분야에 대해 일상적으로 수행된 것처럼)에 의해 또는 폴리뉴클레오타이드의 제한 분해 및 상용성 어댑터의 결찰에 의해 생성된 "점착성 말단"을 사용하여 "무딘 말단"일 수 있다. 이후, 듀플렉스가 용융될 때, 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드가 결찰에 사용되는 경우 각각의 단일 스트랜드는 5' 또는 3' 변형 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드가 결찰에 사용되는 경우 5' 말단, 3' 말단 또는 둘 다에서의 변형을 가질 것이다.
폴리뉴클레오타이드가 합성 스트랜드인 경우, 폴리뉴클레오타이드의 화학 합성 동안 하나 이상의 앵커는 도입될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 반응성 기가 이것에 부착된 프라이머를 사용하여 합성될 수 있다.
아데닐화 폴리뉴클레오타이드는 결찰 반응에서 중간체이고, 여기서 아데노신-모노포스페이트는 폴리뉴클레오타이드의 5'-포스페이트에 부착된다. 다양한 키트, 예컨대 NEB로부터의 5' DNA 아데닐화 키트는 이 중간체의 생성에 이용 가능하다. 변형된 뉴클레오타이드 트라이포스페이트에 대한 반응에서 ATP를 치환함으로써, 이후 폴리뉴클레오타이드의 5'에 대한 반응성 기(예컨대, 티올, 아민, 바이오틴, 아지드 등)의 첨가가 가능하다. 앵커가 적합하게는 변형된 뉴클레오타이드(예를 들어, 콜레스테롤 또는 팔미테이트)에 의해 5' DNA 아데닐화 키트를 사용하여 폴리뉴클레오타이드에 직접적으로 첨가될 수 있는 것이 또한 가능할 수 있다.
게놈 DNA의 섹션의 증폭에 흔한 기법은 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하는 것이다. 여기서, 2개의 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여, DNA의 동일한 섹션의 다수의 카피가 생성될 수 있고, 여기서 각각의 카피에 대해 듀플렉스에서의 각각의 스트랜드의 5'는 합성 폴리뉴클레오타이드일 것이다. 단일 또는 다수의 뉴클레오타이드는 중합효소를 사용함으로써 단일 또는 이중 가닥 DNA의 3' 말단에 첨가될 수 있다. 사용될 수 있는 중합효소의 예는 말단 전환효소, Klenow 및 이. 콜라이 Poly(A) 중합효소를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 변형된 뉴클레오타이드 트라이포스페이트에 대한 반응에서 ATP를 치환함으로써, 이후 앵커, 예컨대 콜레스테롤, 티올, 아민, 아지드, 바이오틴 또는 지질은 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드로 도입될 수 있다. 따라서, 증폭된 폴리뉴클레오타이드의 각각의 카피는 앵커를 함유할 것이다.
이상적으로는, 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드를 작용기화시키지 않으면서 막에 커플링된다. 이것은 하나 이상의 앵커, 예컨대 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질 또는 화학 기를 막에 커플링시키고 하나 이상의 앵커가 폴리뉴클레오타이드와 상호작용하게 함으로써 또는 막을 작용기화함으로써 달성될 수 있다. 하나 이상의 앵커는 본 명세서에 기재된 임의의 방법 임의의 방법에 의해 막에 커플링될 수 있다. 특히, 하나 이상의 앵커는 하나 이상의 링커, 예컨대 말레이미드 작용기화된 링커를 포함할 수 있다.
이 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 통상적으로 RNA, DNA, PNA, TNA 또는 LNA이고, 이중 또는 단일 가닥일 수 있다. 이 실시형태는 특히 게놈 DNA 폴리뉴클레오타이드에 알맞다.
하나 이상의 앵커는 단일 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 내의 특정한 뉴클레오타이드 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 내의 변형된 뉴클레오타이드의 패턴, 또는 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 임의의 다른 리간드에 커플링하거나, 이에 결합하거나, 이것과 상호작용하는 임의의 기를 포함할 수 있다.
앵커에서 사용하기에 적합한 결합 단백질은 이. 콜라이 단일 가닥 결합 단백질, P5 단일 가닥 결합 단백질, T4 gp32 단일 가닥 결합 단백질, TOPO V dsDNA 결합 영역, 인간 히스톤 단백질, 이. 콜라이 HU DNA 결합 단백질 및 다른 고세균, 원핵생물 또는 진핵생물 단일 가닥 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드(또는 핵산) 결합 단백질, 예컨대 하기 기재된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
특정한 뉴클레오타이드 서열은 전사 인자에 의해 인식된 서열, 리보솜, 엔도뉴클레아제, 토포아이소머라제 또는 복제 개시 인자일 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드의 패턴은 메틸화 또는 손상의 패턴일 수 있다.
하나 이상의 앵커는 폴리뉴클레오타이드에 커플링하거나, 이에 결합하거나, 이것과 인터칼레이팅하거나, 이것과 상호작용하는 임의의 기를 포함할 수 있다. 기는 정전기, 수소 결합 또는 반 데르 발스 상호작용을 통해 폴리뉴클레오타이드와 인터칼레이팅하거나 상호작용할 수 있다. 이러한 기는 라이신 단량체, (ssDNA 또는 dsDNA와 상호작용하는) 폴리-라이신, (dsDNA와 상호작용하는) 에티듐 브로마이드, (임의의 폴리뉴클레오타이드와 혼성화할 수 있는) 보편적 염기 또는 보편적 뉴클레오타이드 및 (메틸화 염기와 반응할 수 있는) 오스뮴 복합체를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 따라서 막에 부착된 하나 이상의 보편적 뉴클레오타이드를 사용하여 막에 커플링될 수 있다. 각각의 보편적 뉴클레오타이드는 하나 이상의 링커를 사용하여 막에 커플링될 수 있다. 보편적 뉴클레오타이드는 바람직하게는 하기 핵염기 중 하나를 포함한다: 하이폭산틴, 4-나이트로인돌, 5-나이트로인돌, 6-나이트로인돌, 폼일인돌, 3-나이트로피롤, 나이트로이미다졸, 4-나이트로피라졸, 4-나이트로벤즈이미다졸, 5-나이트로인다졸, 4-아미노벤즈이미다졸 또는 페닐(C6-방향족 고리). 보편적 뉴클레오타이드는 더 바람직하게는 하기 뉴클레오사이드 중 하나를 포함한다: 2'-데옥시이노신, 이노신, 7-데아자-2'-데옥시이노신, 7-데아자-이노신, 2-아자-데옥시이노신, 2-아자-이노신, 2-O'-메틸이노신, 4-나이트로인돌 2'-데옥시리보뉴클레오사이드, 4-나이트로인돌 리보뉴클레오사이드, 5-나이트로인돌 2'-데옥시리보뉴클레오사이드, 5-나이트로인돌 리보뉴클레오사이드, 6-나이트로인돌 2'-데옥시리보뉴클레오사이드, 6-나이트로인돌 리보뉴클레오사이드, 3-나이트로피롤 2'-데옥시리보뉴클레오사이드, 3-나이트로피롤 리보뉴클레오사이드, 하이폭산틴의 비사이클릭 당 유사체, 나이트로이미다졸 2'-데옥시리보뉴클레오사이드, 나이트로이미다졸 리보뉴클레오사이드, 4-나이트로피라졸 2'-데옥시리보뉴클레오사이드, 4-나이트로피라졸 리보뉴클레오사이드, 4-나이트로벤즈이미다졸 2'-데옥시리보뉴클레오사이드, 4-나이트로벤즈이미다졸 리보뉴클레오사이드, 5-나이트로인다졸 2'-데옥시리보뉴클레오사이드, 5-나이트로인다졸 리보뉴클레오사이드, 4-아미노벤즈이미다졸 2'-데옥시리보뉴클레오사이드, 4-아미노벤즈이미다졸 리보뉴클레오사이드, 페닐 C-리보뉴클레오사이드, 페닐 C-2'-데옥시리보실 뉴클레오사이드, 2'-데옥시네불라린, 2'-데옥시아이소구아노신, K-2'-데옥시리보스, P-2'-데옥시리보스 및 피롤리딘. 보편적 뉴클레오타이드는 더 바람직하게는 2'-데옥시이노신을 포함한다. 보편적 뉴클레오타이드는 더 바람직하게는 IMP 또는 dIMP이다. 보편적 뉴클레오타이드는 가장 바람직하게는 dPMP(2'-데옥시-P-뉴클레오사이드 모노포스페이트) 또는 dKMP(N6-메톡시-2, 6-다이아미노퓨린 모노포스페이트)이다.
하나 이상의 앵커는 후그스틴(Hoogsteen) 수소 결합(여기서, 2개의 핵염기는 수소 결합에 의해 함께 보유됨) 또는 리버스드 후그스틴 수소 결합(여기서, 1개의 핵염기는 다른 핵염기에 대해 180°를 통해 회전함)을 통해 폴리뉴클레오타이드에 커플링(또는 결합)할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 앵커는 폴리뉴클레오타이드와 후그스틴 수소 결합 또는 리버스드 후그스틴 수소 결합을 형성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드, 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 또는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이 유형의 수소 결합은 제3 폴리뉴클레오타이드 스트랜드가 이중 가닥 나선 주위를 권취하고 트라이플렉스를 형성하게 한다. 하나 이상의 앵커는 이중 가닥 듀플렉스와 트라이플렉스를 형성함으로써 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드에 커플링(또는 결합)할 수 있다.
이 실시형태에서, 막 성분의 적어도 1%, 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50% 또는 100%는 작용기화될 수 있다.
하나 이상의 앵커가 단백질을 포함하는 경우, 예를 들어 이것이 이미 막과 상용성인 외부 소수성 영역을 갖은 경우 이것은 추가의 작용기화 없이 막에 직접적으로 앵커링할 수 있다. 이러한 단백질의 예는 막관통 단백질, 막내 단백질 및 막 단백질을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 대안적으로, 단백질은 막과 상용성인 유전자 융합된 소수성 영역에 의해 발현될 수 있다. 이러한 소수성 단백질 영역은 당해 분야에 공지되어 있다.
하나 이상의 앵커는 바람직하게는 막과 접촉하기 전에 폴리뉴클레오타이드와 혼합되지만, 하나 이상의 앵커는 막과 접촉하고 후속하여 폴리뉴클레오타이드와 접촉할 수 있다.
또 다른 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 상기 기재된 방법을 이용하여 작용기화될 수 있어서, 이것은 특정한 결합 기에 의해 인식될 수 있다. 구체적으로, 폴리뉴클레오타이드는 리간드, 예컨대 (스트렙타비딘에 결합하기 위한) 바이오틴, (말토즈 결합 단백질 또는 융합 단백질에 결합하기 위한) 아밀로즈, (폴리-히스티딘 또는 폴리-히스티딘 태그화된 단백질에 결합하기 위한) Ni-NTA 또는 펩타이드(예컨대, 항원)에 의해 작용기화될 수 있다.
바람직한 실시형태에 따라, 폴리뉴클레오타이드가 기공으로 우선적으로 트레딩하는 리더 서열에 부착될 때 폴리뉴클레오타이드를 막에 커플링시키기 위해 하나 이상의 앵커를 사용할 수 있다. 리더 서열은 하기 더 자세히 기재되어 있다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 기공으로 우선적으로 트레딩하는 리더 서열에 부착(예컨대, 결찰)된다. 이러한 리더 서열은 단독중합체 폴리뉴클레오타이드 또는 비염기성 영역을 포함할 수 있다. 리더 서열은 통상적으로 직접적으로 또는 하나 이상의 중간 폴리뉴클레오타이드(또는 스필린트)를 통해 하나 이상의 앵커에 혼성화하도록 설계된다. 이러한 경우에, 하나 이상의 앵커는 통상적으로 리더 서열에서의 서열 또는 하나 이상의 중간 폴리뉴클레오타이드(또는 스필린트)에서의 서열에 상보성인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이러한 경우에, 하나 이상의 스필린트는 통상적으로 리더 서열에서의 서열에 상보성인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
화학 부착에 사용된 분자의 예는 EDC(1-에틸-3-[3-다이메틸아미노프로필]카보다이이미드 하이드로클로라이드)이다. 반응성 기는 상업적으로 구입 가능 키트(Thermo Pierce, 파트 22980호)를 사용하여 폴리뉴클레오타이드의 5'에 또한 첨가될 수 있다. 적합한 방법은 히스티딘 잔기 및 Ni-NTA를 사용한 일시적 친화도 부착, 및 반응성 시스테인, 라이신 또는 비천연 아미노산에 의한 가장 견고한 공유 부착을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
이중 가닥 폴리뉴클레오타이드
폴리뉴클레오타이드는 이중 가닥일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드가 이중 가닥인 경우, 상기 방법은 바람직하게는 접촉 단계 전에 폴리뉴클레오타이드의 일 말단에 브릿징 모이어티, 예컨대 헤어핀 루프를 결찰시키는 단계를 추가로 포함한다. 이후, 폴리뉴클레오타이드의 2개의 스트랜드는 폴리뉴클레오타이드가 본 발명에 따른 기공과 접촉하면서 또는 접촉하기 전에 분리될 수 있다. 기공을 통한 폴리뉴클레오타이드 이동이 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질, 예컨대 헬리카제, 또는 분자 브레이크에 의해 제어되면서 2개의 스트랜드는 분리될 수 있다.
이러한 방식으로 이중 가닥 작제물에서 스트랜드 둘 다를 연결 및 호출하는 것은 규명의 효율 및 정확성을 증가시킨다.
브릿징 모이어티는 표적 폴리뉴클레오타이드의 2개의 스트랜드를 연결시킬 수 있다. 브릿징 모이어티는 통상적으로 표적 폴리뉴클레오타이드의 2개의 스트랜드를 공유 연결시킨다. 브릿징 모이어티는 표적 폴리뉴클레오타이드의 2개의 스트랜드를 연결시킬 수 있는 어떤 것일 수 있고, 단 브릿징 모이어티는 막관통 기공을 통한 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 이동을 방해하지 않는다.
브릿징 모이어티는 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 표적 폴리뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 브릿징 모이어티는 별도로 합성되고 표적 폴리뉴클레오타이드에 화학적으로 부착되거나 효소로 결찰될 수 있다. 대안적으로, 브릿징 모이어티는 표적 폴리뉴클레오타이드의 가공처리에서 생성될 수 있다.
브릿징 모이어티는 표적 폴리뉴클레오타이드의 일 말단에서 또는 그 근처에서 표적 폴리뉴클레오타이드에 연결된다. 브릿징 모이어티는 바람직하게는 표적 폴리뉴클레오타이드의 말단의 10개의 뉴클레오타이드 내에 표적 폴리뉴클레오타이드에 연결된다.
적합한 브릿징 모이어티는 중합체 링커, 화학 링커, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 브릿징 모이어티는 DNA, RNA, 변형된 DNA(예컨대, 비염기성 DNA), RNA, PNA, LNA 또는 PEG를 포함한다. 브릿징 모이어티는 더 바람직하게는 DNA 또는 RNA이다.
브릿징 모이어티는 가장 바람직하게는 헤어핀 루프 또는 헤어핀 루프 어댑터이다. 적합한 헤어핀 어댑터는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 설계될 수 있다. 헤어핀 루프는 임의의 길이일 수 있다. 헤어핀 루프는 통상적으로 110개 이하의 뉴클레오타이드, 예컨대 100개 이하의 뉴클레오타이드, 90개 이하의 뉴클레오타이드, 80개 이하의 뉴클레오타이드, 70개 이하의 뉴클레오타이드, 60개 이하의 뉴클레오타이드, 50개 이하의 뉴클레오타이드, 40개 이하의 뉴클레오타이드, 30개 이하의 뉴클레오타이드, 20개 이하의 뉴클레오타이드 또는 10개 이하의 뉴클레오타이드의 길이이다. 헤어핀 루프는 바람직하게는 약 1개 내지 110개, 2개 내지 100개, 5개 내지 80개, 또는 6개 내지 50개의 뉴클레오타이드 길이이다. 루프가 어댑터의 차등적 선택성에 관여하는 경우 50개 내지 110개의 뉴클레오타이드와 같은 더 긴 길이의 헤어핀 루프가 바람직하다. 유사하게, 루프가 하기 기재된 바와 같은 선택 가능한 결합에 관여하지 않는 경우 1개 내지 5개의 뉴클레오타이드와 같은 더 짧은 길이의 헤어핀 루프가 바람직하다.
헤어핀 어댑터는 제1 및/또는 제2 폴리뉴클레오타이드의 어느 한 말단, 즉 5' 또는 3' 말단에 결찰될 수 있다. 헤어핀 어댑터는 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 제1 및/또는 제2 폴리뉴클레오타이드에 결찰될 수 있다. 헤어핀 어댑터는 리가제, 예컨대 T4 DNA 리가제, 이. 콜라이 DNA 리가제, Taq DNA 리가제, Tma DNA 리가제 및 9oN DNA 리가제를 사용하여 결찰될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드의 2개의 스트랜드는 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 분리될 수 있다. 예를 들어, 이것은 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질에 의해 또는 탈혼성화를 선호하는 조건을 이용하여 분리될 수 있다(탈혼성화를 선호하는 조건의 예는 고온, 높은 pH 및 수소 결합 또는 염기 쌍 짓기를 방해할 수 있는 물질, 예컨대 폼아마이드 및 우레아의 첨가를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않음).
헤어핀 어댑터는 바람직하게는 선택 가능한 결합 모이어티를 포함한다. 이것은 제1 및/또는 제2 폴리뉴클레오타이드가 정제되거나 단리되게 한다. 선택 가능한 결합 모이어티는 이의 결합 특성에 기초하여 선택될 수 있는 모이어티이다. 그러므로, 선택 가능한 결합 모이어티는 바람직하게는 표면에 특이적으로 결합하는 모이어티이다. 선택 가능한 결합 모이어티가 본 발명에서 사용된 임의의 다른 모이어티보다 훨씬 더 큰 정도로 표면에 결합하는 경우 이것은 표면에 특이적으로 결합한다. 바람직한 실시형태에서, 모이어티는 본 발명에서 사용된 다른 모이어티가 결합하지 않는 표면에 결합한다.
적합한 선택적 결합 모이어티는 당해 분야에 공지되어 있다. 바람직한 선택적 결합 모이어티는 바이오틴, 폴리뉴클레오타이드 서열, 항체, 항체 단편, 예컨대 Fab 및 ScSv, 항원, 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질, 폴리 히스티딘 꼬리 및 GST 태그를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 가장 바람직한 선택적 결합 모이어티는 바이오틴 및 선택 가능한 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 바이오틴은 아비딘에 의해 코팅된 표면에 특이적으로 결합한다. 선택 가능한 폴리뉴클레오타이드 서열은 상동성 서열에 의해 코팅된 표면에 특이적으로 결합(즉, 혼성화)한다. 대안적으로, 선택 가능한 폴리뉴클레오타이드 서열은 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질에 의해 코팅된 표면에 특이적으로 결합한다.
헤어핀 어댑터 및/또는 선택 가능한 결합 모이어티는 절단, 닉킹, 개열 또는 가수분해될 수 있는 영역을 포함할 수 있다. 이러한 영역은 제1 및/또는 제2 폴리뉴클레오타이드가 정제 또는 단리 후 이것이 결합한 표면으로부터 제거되게 하도록 설계될 수 있다. 적합한 영역은 당해 분야에 공지되어 있다. 적합한 영역은 RNA 영역, 데스티오바이오틴 및 스트렙타비딘을 포함하는 영역, 다이설파이드 결합 및 광분해성 영역을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
이중 가닥 표적 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 브릿징 모이어티의 반대의 말단에서의 리더 서열, 예컨대 헤어핀 루프 또는 헤어핀 루프 어댑터를 포함한다. 리더 서열은 하기 더 자세히 기재되어 있다.
라운드 더 코너 서열분석
바람직한 실시형태에서, 표적 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드는 일 말단에서 브릿징 모이어티, 예컨대 헤어핀 루프 또는 헤어핀 루프 어댑터가 제공되고, 상기 방법은 폴리뉴클레오타이드의 스트랜드 둘 다가 기공을 따라 이동하도록 폴리뉴클레오타이드를 기공과 접촉시키는 단계 및 폴리뉴클레오타이드의 스트랜드 둘 다가 기공과 관련하여 이동하면서 하나 이상의 측정을 하고(여기서, 측정은 폴리뉴클레오타이드의 스트랜드의 하나 이상의 특징을 나타냄), 이로써 표적 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 규명하는 단계를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 표적 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드는 일 말단에서 브릿징 모이어티, 예컨대 헤어핀 루프 또는 헤어핀 루프 어댑터가 제공되고, 상기 방법은 폴리뉴클레오타이드의 스트랜드 둘 다가 분해되어 개별 뉴클레오타이드를 형성하도록 폴리뉴클레오타이드를 기공 및 엑소뉴클레아제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 기재된 임의의 실시형태는 이 실시형태에 동등하게 적용된다.
리더 서열
스트랜드 규명/서열분석 방법에서 접촉 단계 전에, 상기 방법은 바람직하게는 기공으로 우선적으로 트레딩하는 리더 서열을 폴리뉴클레오타이드에 부착시키는 단계를 포함한다. 리더 서열은 본 발명의 방법을 수월하게 한다. 리더 서열은 기공으로 우선적으로 트레딩하고 이에 의해 기공을 통한 폴리뉴클레오타이드의 이동을 수월하게 하도록 설계된다. 리더 서열은 상기 기재된 바대로 하나 이상의 앵커에 폴리뉴클레오타이드를 연결하도록 또한 사용될 수 있다.
리더 서열은 통상적으로 중합체를 포함한다. 중합체는 바람직하게는 음으로 하전된다. 중합체는 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 DNA 또는 RNA, 변형된 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 비염기성 DNA), PNA, LNA, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 또는 폴리펩타이드이다. 리더는 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 더 바람직하게는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 리더 서열은 상기 기재된 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 단일 가닥 리더 서열은 가장 바람직하게는 DNA의 단일 스트랜드, 예컨대 폴리 dT 섹션을 포함한다. 리더 서열은 바람직하게는 하나 이상의 스페이서를 포함한다.
리더 서열은 임의의 길이일 수 있지만, 통상적으로 10개 내지 150개의 뉴클레오타이드 길이, 예컨대 20개 내지 150개의 뉴클레오타이드 길이이다. 리더의 길이는 통상적으로 상기 방법에서 사용된 막관통 기공에 따라 달라진다.
리더 서열은 바람직하게는 하기 정의된 바와 같은 Y 어댑터의 부분이다.
이중 커플링
본 발명의 방법은 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드의 이중 커플링을 수반할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법은
(a) 일 말단에서 Y 어댑터 및 다른 말단에서 브릿징 모이어티 어댑터, 예컨대 헤어핀 루프 어댑터를 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 단계(여기서, Y 어댑터는 폴리뉴클레오타이드를 막에 커플링하기 위한 하나 이상의 제1 앵커를 포함하고, 브릿징 모이어티 어댑터는 폴리뉴클레오타이드를 막에 커플링하기 위한 하나 이상의 제2 앵커를 포함하고, 브릿징 모이어티 어댑터를 막에 커플링하는 강도는 Y 어댑터를 막에 커플링하는 강도보다 큼);
(b) 폴리뉴클레오타이드가 기공과 관련하여, 예컨대 이를 통해 이동하도록 단계 (a)에서 제공된 폴리뉴클레오타이드를 본 발명의 기공과 접촉시키는 단계; 및
(c) 폴리뉴클레오타이드가 기공과 관련하여 이동하면서 하나 이상의 측정을 하고(여기서, 측정은 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 특징을 나타냄), 이로써 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하는 단계를 포함한다.
이 유형의 방법은 UK 출원 제1406147.7호에 자세히 기재되어 있다.
이중 가닥 폴리뉴클레오타이드는 일 말단에서 Y 어댑터 및 다른 말단에서 브릿징 모이어티 어댑터가 제공된다. Y 어댑터 및/또는 브릿징 모이어티 어댑터는 통상적으로 폴리뉴클레오타이드 어댑터이다. 이들은 상기 기재된 임의의 폴리뉴클레오타이드로부터 형성된다.
Y 어댑터는 통상적으로 (a) 이중 가닥 영역 및 (b) 단일 가닥 영역 또는 다른 말단에서 상보성이 아닌 영역을 포함한다. Y 어댑터는 단일 가닥 영역을 포함하는 경우 오버행을 갖는 것으로 기재될 수 있다. 2개의 스트랜드가 통상적으로 이중 가닥 부분과 달리 서로에 혼성화하지 않으므로, Y 어댑터에서의 비상보성 영역의 존재는 어댑터에 이의 Y 형상을 준다. Y 어댑터는 하나 이상의 제1 앵커를 포함한다. 앵커는 상기 더 자세히 기재되어 있다.
Y 어댑터는 바람직하게는 기공으로 우선적으로 트레딩하는 리더 서열을 포함한다. 이것은 상기 기재되어 있다.
브릿징 모이어티 어댑터는 바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 선택 가능한 결합 모이어티를 포함한다. 브릿징 모이어티 어댑터 및/또는 선택 가능한 결합 모이어티는 상기 기재된 바대로 절단, 닉킹, 개열 또는 가수분해될 수 있는 영역을 포함할 수 있다.
하나 이상의 헬리카제 및 하나 이상의 분자 브레이크가 상기 기재된 바대로 사용되는 경우, Y 어댑터는 바람직하게는 하나 이상의 헬리카제를 포함하고, 브릿징 모이어티 어댑터는 바람직하게는 하나 이상의 분자 브레이크를 포함한다.
Y 어댑터 및/또는 브릿징 모이어티 어댑터는 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 폴리뉴클레오타이드에 결찰될 수 있다. 어댑터 중 하나 또는 둘 다는 리가제, 예컨대 T4 DNA 리가제, 이. 콜라이 DNA 리가제, Taq DNA 리가제, Tma DNA 리가제 및 9oN DNA 리가제를 사용하여 결찰될 수 있다. 대안적으로, 어댑터는 하기 기재된 본 발명의 방법을 이용하여 폴리뉴클레오타이드에 첨가될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 상기 방법의 단계 a)는 일 말단에서 Y 어댑터 및 다른 말단에서 브릿징 모이어티 어댑터를 포함하도록 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 변형시키는 것을 포함한다. 변형의 임의의 방식을 이용할 수 있다. 상기 방법은 바람직하게는 본 발명에 따른 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 변형시키는 것을 포함한다. 이것은 하기 더 자세히 기재되어 있다. 변형 및 규명의 방법은 임의의 방식으로 조합될 수 있다.
막에 대한 브릿징 모이어티 어댑터의 커플링(또는 결합)의 강도는 막에 대한 Y 어댑터의 커플링(또는 결합)의 강도보다 높다. 이것은 임의의 방식으로 측정될 수 있다. 커플링(또는 결합)의 강도를 측정하기 위한 적합한 방법은 UK 출원 제1406147.7호의 실시예에 개시되어 있다.
브릿징 모이어티 어댑터의 커플링(또는 결합)의 강도는 바람직하게는 Y 어댑터의 커플링(또는 결합)의 강도의 적어도 1.5배, 예컨대 앵커 어댑터의 커플링(또는 결합)의 강도의 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배 또는 적어도 10배이다. 막에 대한 브릿징 모이어티 어댑터의 친화도 상수(Kd)는 바람직하게는 Y 어댑터의 친화도 상수의 적어도 1.5배, 예컨대 Y 어댑터의 커플링의 강도의 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5베 또는 적어도 10배이다.
브릿징 모이어티 어댑터가 Y 어댑터보다 막에 더 강하게 커플링(또는 결합)하는 몇몇 방식이 존재한다. 예를 들어, 브릿징 모이어티 어댑터는 Y 어댑터보다 많은 앵커를 포함할 수 있다. 예를 들어, 브릿징 모이어티 어댑터는 2개, 3개 또는 이것 초과의 제2 앵커를 포함할 수 있는 한편, Y 어댑터는 1개의 제1 앵커를 포함할 수 있다.
막에 대한 하나 이상의 제2 앵커의 커플링(또는 결합)의 강도는 막에 대한 하나 이상의 제1 앵커의 커플링(또는 결합)보다 높을 수 있다. 브릿징 모이어티 어댑터에 대한 하나 이상의 제2 앵커의 커플링(또는 결합)의 강도는 Y 어댑터에 대한 하나 이상의 제1 앵커의 커플링(또는 결합)의 강도보다 높을 수 있다. 하나 이상의 제1 앵커 및 하나 이상의 제2 앵커는 혼성화를 통해 이의 각각의 어댑터에 부착될 수 있고, 혼성화의 강도는 하나 이상의 제1 앵커에서보다 하나 이상의 제2 앵커에서 더 높다. 이들 실시형태의 임의의 조합은 본 발명에서 또한 사용될 수 있다. 커플링(또는 결합)의 강도는 당해 분야에 공지된 기법을 이용하여 측정될 수 있다.
하나 이상의 제2 앵커는 바람직하게는 막에 커플링(또는 결합)하는 하나 이상의 제1 앵커에서의 하나 이상의 기보다 더 큰 강도로 막에 커플링(또는 결합)하는 하나 이상의 기를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 브릿징 모이어티 어댑터/하나 이상의 제2 앵커는 콜레스테롤을 사용하여 막에 커플링(또는 결합)하고, Y 어댑터/하나 이상의 제1 앵커는 팔미테이트를 사용하여 막에 커플링(또는 결합)한다. 콜레스테롤은 팔미테이트보다 더 강하게 삼중블록 공중합체 막 및 지질 막에 결합한다. 대안적인 실시형태에서, 브릿징 모이어티 어댑터/하나 이상의 제2 앵커는 모노-아실 종, 예컨대 팔미테이트를 사용하여 막에 커플링(또는 결합)하고, Y 어댑터/하나 이상의 제1 앵커는 다이아실 종, 예컨대 다이팔미토일포스파티딜콜린을 사용하여 막에 커플링(또는 결합)한다.
헤어핀 루프 및 리더 서열의 첨가
제공 전에, 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드는 MuA 유전자전위효소 및 이중 가닥 MuA 기질의 집단과 접촉할 수 있고, 집단에서의 기질의 일부는 리더 서열을 포함하는 Y 어댑터이고, 집단에서의 기질의 일부는 헤어핀 루프 어댑터이다. 유전자전위효소는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 분석물질을 단편화하고, MuA 기질을 단편의 일 말단 또는 양 말단에 결찰시킨다. 이것은 일 말단에서 리더 서열 및 다른 말단에서 헤어핀 루프를 포함하는 복수의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 생성한다. 이후, 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 방법을 이용하여 조사될 수 있다.
집단에서의 각각의 기질은 바람직하게는 보편적 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 오버행을 포함하여서, 유전자전위효소는 주형 폴리뉴클레오타이드를 단편화하고, 기질을 이중 가닥 단편의 일 말단 또는 양 말단에 결찰시키고, 이로써 복수의 단편/기질 작제물을 생성시키고, 상기 방법은 작제물에서 오버행을 단편에 결찰시키고 이로써 복수의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 생성시키는 단계를 추가로 포함한다. 적합한 보편적 뉴클레오타이드는 상기 기재된 바와 같다. 오버행은 바람직하게는 5개의 뉴클레오타이드 길이이다.
대안적으로, 집단에서의 각각의 기질은 바람직하게는 주형 폴리뉴클레오타이드에 존재하지 않는 뉴클레오사이드를 포함하는 적어도 하나의 오버행과 동일한 스트랜드에서 (ⅰ) 적어도 하나의 오버행 및 (ⅱ) 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 포함하여서, 유전자전위효소는 주형 폴리뉴클레오타이드를 단편화하고, 기질을 이중 가닥 단편의 일 말단 또는 양 말단에 결찰시키고, 이로써 복수의 단편/기질 작제물을 생성시키고, 상기 방법은 (a) 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 선택적으로 제거하고, 이로써 단일 가닥 갭을 포함하는 복수의 이중 가닥 작제물을 생성함으로써 작제물로부터 오버행을 제거하는 단계 및 (b) 작제물에서 단일 가닥 갭을 보수하고, 이로써 복수의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 생성시키는 단계를 추가로 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 통상적으로 뉴클레오사이드 데옥시아데노신(dA), 데옥시유리딘(dU) 및/또는 타이미딘(dT), 데옥시구아노신(dG) 및 데옥시사이티딘(dC)을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드에 존재하지 않는 뉴클레오사이드는 바람직하게는 비염기성, 아데노신(A), 유리딘(U), 5-메틸유리딘(m5U), 사이티딘(C) 또는 구아노신(G)이거나, 우레아, 5, 6 다이하이드록시타이민, 타이민 글라이콜, 5-하이드록시-5 메틸히단토인, 유라실 글라이콜, 6-하이드록시-5, 6-다이하이드로티민, 메틸타르트로닐우레아, 7, 8-다이하이드로 8-옥소구아닌(8-옥소구아닌), 8-옥소아데닌, fapy-구아닌, 메틸-fapy-구아닌, fapy-아데닌, 아플라톡신 B1-fapy-구아닌, 5-하이드록시-사이토신, 5-하이드록시-유라실, 3-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 1,N6-에테노아데닌, 하이폭산틴, 5-하이드록시유라실, 5-하이드록시메틸유라실, 5-폼일유라실 또는 시스-syn-사이클로뷰탄 피리미딘 이합체를 포함한다. 적어도 하나의 뉴클레오타이드는 바람직하게는 오버행으로부터의 10개 이하의 뉴클레오타이드이다. 적어도 하나의 뉴클레오타이드는 오버행에서의 제1 뉴클레오타이드이다. 오버행에서의 모든 뉴클레오타이드는 바람직하게는 주형 폴리뉴클레오타이드에 존재하지 않는 뉴클레오사이드를 포함한다.
이 MuA 기반 방법은 국제 출원 제PCT/GB2014/052505호에 개시되어 있다. 이것은 UK 출원 제1406147.7호에 또한 자세히 기재되어 있다.
하나 이상의 헬리카제는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 및 MuA 유전자전위효소와 접촉하기 전에 MuA 기질 Y 어댑터에 부착될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 헬리카제는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 및 MuA 유전자전위효소와 접촉하기 전에 MuA 기질 Y 어댑터에 부착될 수 있다.
하나 이상의 분자 브레이크는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 및 MuA 유전자전위효소와 접촉하기 전에 MuA 기질 헤어핀 루프 어댑터에 부착될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 분자 브레이크는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 및 MuA 유전자전위효소와 접촉하기 전에 MuA 기질 헤어핀 루프 어댑터에 부착될 수 있다.
비커플링
본 발명의 방법은 다수의 표적 폴리뉴클레오타이드의 규명 및 적어도 제1 표적 폴리뉴클레오타이드의 비커플링을 수반할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은 2개 이상의 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하는 것을 수반한다. 상기 방법은
(a) 제1 샘플에서 제1 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 단계;
(b) 제2 샘플에서 제2 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 단계;
(c) 하나 이상의 앵커를 사용하여 제1 샘플에서의 제1 폴리뉴클레오타이드를 막에 커플링하는 단계;
(d) 폴리뉴클레오타이드가 기공과 관련하여, 예컨대 이를 통해 이동하도록 제1 폴리뉴클레오타이드를 본 발명의 기공과 접촉시키는 단계;
(e) 제1 폴리뉴클레오타이드가 기공과 관련하여 이동하면서 하나 이상의 측정을 하고(여기서, 측정은 제1 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 특징을 나타냄), 이로써 제1 폴리뉴클레오타이드를 규명하는 단계;
(f) 막으로부터 제1 폴리뉴클레오타이드를 비커플링시키는 단계;
(g) 하나 이상의 앵커를 사용하여 제2 샘플에서의 제2 폴리뉴클레오타이드를 막에 커플링하는 단계;
(h) 제2 폴리뉴클레오타이드가 기공과 관련하여, 예컨대 이를 통해 이동하도록 제2 폴리뉴클레오타이드를 본 발명의 기공과 접촉시키는 단계; 및
(i) 제2 폴리뉴클레오타이드가 기공과 관련하여 이동하면서 하나 이상의 측정을 하고(여기서, 측정은 제2 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 특징을 나타냄), 이로써 제2 폴리뉴클레오타이드를 규명하는 단계를 포함한다.
이 유형의 방법은 UK 출원 제1406155.0호에 자세히 기재되어 있다.
단계 (f)(즉, 제1 폴리뉴클레오타이드의 비커플링)는 단계 (g) 전에(즉, 제2 폴리뉴클레오타이드를 막에 커플링하기 전에) 수행될 수 있다. 단계 (g)는 단계 (f) 전에 수행될 수 있다. 제1 폴리뉴클레오타이드가 비커플링되기 전에 제2 폴리뉴클레오타이드가 막에 커플링하는 경우, 단계 (f)는 바람직하게는 막으로부터 제1 폴리뉴클레오타이드를 선택적으로 비커플링시키는 것(즉, 막으로부터 제2 폴리뉴클레오타이드가 아니라 제1 폴리뉴클레오타이드를 비커플링시키는 것)을 포함한다. 숙련자는 선택적인 비커플링이 달성되는 시스템을 설계할 수 있다. 단계 (f) 및 (g)는 동시에 수행될 수 있다. 이것은 하기 더 자세히 기재되어 있다.
단계 (f)에서, 제1 폴리뉴클레오타이드의 적어도 10%는 바람직하게는 막으로부터 비커플링된다. 예를 들어, 제1 폴리뉴클레오타이드의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 막으로부터 비커플링될 수 있다. 바람직하게는, 모든 제1 폴리뉴클레오타이드는 막으로부터 비커플링된다. 막으로부터 비커플링된 제1 폴리뉴클레오타이드의 양은 기공을 사용하여 결정될 수 있다. 이것은 실시예에 개시되어 있다.
제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 서로 상이할 수 있다. 대안적으로, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 상이한 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 이러한 경우에, 제2 폴리뉴클레오타이드를 첨가하기 전에 제1 샘플의 적어도 일부를 제거할 필요가 없을 수 있다. 이것은 하기 더 자세히 기재되어 있다. 상기 방법이 3개 이상의 폴리뉴클레오타이드를 조사하는 것에 관한 경우, 이들은 모두 서로 상이할 수 있고, 이들 중 몇몇은 서로 상이할 수 있다.
제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 동일한 폴리뉴클레오타이드의 2개의 경우일 수 있다. 제1 폴리뉴클레오타이드는 제2 폴리뉴클레오타이드와 동일할 수 있다. 이것은 프루프 리딩을 허용한다. 상기 방법이 3개 이상의 폴리뉴클레오타이드를 조사하는 것에 관한 경우, 이들은 모두 동일한 폴리뉴클레오타이드의 3개 이상의 경우일 수 있거나, 이들 중 몇몇은 동일한 폴리뉴클레오타이드의 별개의 경우일 수 있다.
제1 샘플 및 제2 샘플은 서로 상이할 수 있다. 예를 들어, 제1 샘플은 인간으로부터 유래할 수 있고, 제2 샘플은 바이러스로부터 유래될 수 있다. 제1 및 제2 샘플이 서로 상이한 경우, 이들은 동일한 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 함유하거나 이를 함유하는 것으로 의심될 수 있다. 상기 방법이 3개 이상의 샘플을 조사하는 것에 관한 경우, 이들은 모두 서로 상이할 수 있거나, 이들 중 몇몇은 서로 상이할 수 있다.
제1 샘플 및 제2 샘플은 바람직하게는 동일한 샘플의 2개의 경우이다. 제1 샘플은 바람직하게는 제2 샘플과 동일하다. 이것은 프루프 리딩을 허용한다. 상기 방법이 3개 이상의 샘플을 조사하는 것에 관한 경우, 이들은 모두 동일한 샘플의 3개 이상의 경우일 수 있거나, 이들 중 몇몇은 동일한 샘플의 별개의 경우일 수 있다.
폴리뉴클레오타이드의 임의의 수를 조사할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 50개, 100개 또는 이것 초과의 폴리뉴클레오타이드를 규명하는 것에 관한 것일 수 있다. 3개 이상의 폴리뉴클레오타이드가 본 발명의 방법을 이용하여 조사되는 경우, 제2 폴리뉴클레오타이드는 또한 막으로부터 비커플링되고, 단계의 필수 단계는 제3 폴리뉴클레오타이드에 대해 첨가된다. 4개 이상의 폴리뉴클레오타이드에 대해서도 그러하다.
본 발명의 방법은 막으로부터 제1 폴리뉴클레오타이드를 비커플링시키는 단계를 수반한다. 본 발명의 방법은 3개 이상의 폴리뉴클레오타이드가 조사되는 경우 막으로부터 제2 폴리뉴클레오타이드를 비커플링시키는 단계를 수반할 수 있다.
제1 폴리뉴클레오타이드는 임의의 공지된 방법을 이용하여 막으로부터 비커플링될 수 있다. 제1 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 단계 (f)에서 막관통 기공을 사용하여 막으로부터 비커플링되지 않는다. 제1 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 전압 또는 인가된 전위를 사용하여 막으로부터 비커플링되지 않는다.
단계 (f)는 바람직하게는 막으로부터 하나 이상의 앵커를 제거함으로써 막으로부터 제1 폴리뉴클레오타이드를 비커플링시키는 것을 수반한다. 앵커가 제거되는 경우, 제2 폴리뉴클레오타이드는 다른(또는 별개의) 앵커를 사용하여 막에 커플링된다. 제2 폴리뉴클레오타이드를 커플링시키도록 사용된 앵커는 제1 폴리뉴클레오타이드를 커플링시키도록 사용된 앵커의 동일한 유형 또는 앵커의 상이한 유형일 수 있다.
단계 (f)는 더 바람직하게는 하나 이상의 앵커를 막에 대해 앵커보다 하나 이상의 앵커에 대해 더 높은 친화도를 갖는 물질과 접촉시키는 것을 포함한다. 분자의 특정한 결합 역량을 결정하기 위한 경쟁적 결합 또는 면역방사측정 검정에 대한 다양한 프로토콜은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어 문헌[Maddox et al, J. Exp. Med. 158, 1211-1226, 1993] 참조). 상기 물질은 막으로부터 앵커(들)를 제거하고, 이에 의해 제1 폴리뉴클레오타이드를 비커플링시킨다. 상기 물질은 바람직하게는 당이다. 막에 대해 하나 이상의 앵커보다 더 높은 친화도를 갖는 하나 이상의 앵커에 결합하는 임의의 당을 사용할 수 있다. 당은 사이클로덱스트린 또는 하기 기재된 바와 같은 유도체일 수 있다.
하나 이상의 앵커가 소수성 앵커, 예컨대 콜레스테롤을 포함하는 경우, 상기 물질은 바람직하게는 사이클로덱스트린 또는 이의 유도체 또는 지질이다. 사이클로덱스트린 또는 이의 유도체는 문헌[Eliseev, A. V., and Schneider, H-J. (1994) J. Am. Chem . Soc. 116, 6081-6088]에 개시된 임의의 것일 수 있다. 상기 물질은 더 바람직하게는 헵타키스-6-아미노-β-사이클로덱스트린(am7-βCD), 6-모노데옥시-6-모노아미노-β-사이클로덱스트린(am1-βCD) 또는 헵타키스-(6-데옥시-6-구아니디노)-사이클로덱스트린(gu7-βCD)이다. 본 명세서에 개시된 임의의 지질을 사용할 수 있다.
앵커가 스트렙타비딘, 바이오틴 또는 데스티오바이오틴을 포함하는 경우, 상기 물질은 바람직하게는 바이오틴, 데스티오바이오틴 또는 스트렙타비딘이다. 바이오틴 및 데스티오바이오틴 둘 다는 스트렙타비딘이 막에 결합하는 것보다 더 높은 친화도로 스트렙타비딘에 결합하고, 그 반대도 그렇다. 바이오틴은 데스티오바이오틴보다 스트렙타비딘에 대해 더 강한 친화도를 갖는다. 스트렙타비딘을 포함하는 는앵커 이에 따라 바이오틴 또는 스트렙타비딘을 사용하여 막으로부터 제거될 수 있고, 그 반대도 그렇다.
앵커가 단백질을 포함하는 경우, 상기 물질은 바람직하게는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편이다. 항체는 우선적 또는 높은 친화도로 단백질에 결합하는 경우 단백질에 특이적으로 결합하지만, 다른 또는 상이한 단백질에 결합하지 않거나 오직 낮은 친화도로 결합한다. 항체는 1x10-6M 이하, 더 바람직하게는 1x10-7M 이하, 5x10-8M 이하, 더 바람직하게는 1x10-8M 이하, 또는 더 바람직하게는 5x10-9M 이하의 Kd로 결합하는 경우 우선적 또는 높은 친화도로 결합한다. 항체는 1x10-6M 이하, 더 바람직하게는 1x10-5M 이하, 더 바람직하게는 1x10-4M 이하, 더 바람직하게는 1x10-3M 이하, 훨씬 더 바람직하게는 1x10-2 M 이하의 Kd로 결합하는 경우 낮은 친화도로 결합한다. 결합 또는 특이적 결합을 검출하기 위해 임의의 방법을 이용할 수 있다. 단백질에 대한 항체의 결합을 정량적으로 측정하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 항체는 단일클론 항체 또는 다중클론 항체일 수 있다. 항체의 적합한 단편은 Fv, F(ab') 및 F(ab')2 단편, 및 단일 사슬 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 더구나, 항체 또는 이의 단편은 키메라 항체 또는 이의 단편, CDR 그래프팅된 항체 또는 이의 단편 또는 인간화된 항체 또는 이의 단편일 수 있다.
단계 (f)는 바람직하게는 하나 이상의 앵커를 막에 커플링하는 하나 이상의 앵커의 능력을 감소시키는 물질과 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 물질은 하나 이상의 앵커의 구조 및/또는 소수화도를 방해하고, 이로써 막에 커플링하는 이의 능력을 감소시킬 수 있다. 앵커가 콜레스테롤을 포함하는 경우, 상기 물질은 바람직하게는 콜레스테롤 탈수소효소이다. 앵커가 지질을 포함하는 경우, 상기 물질은 바람직하게는 포스포리파제이다. 앵커가 단백질을 포함하는 경우, 상기 물질은 바람직하게는 단백분해효소 또는 우레아이다. 적합한 앵커 및 상기 물질의 다른 조합은 당해 분야의 숙련자에게 명확할 것이다.
단계 (f)는 바람직하게는 하나 이상의 앵커로부터 제1 폴리뉴클레오타이드를 분리함으로써 막으로부터 제1 폴리뉴클레오타이드를 비커플링시키는 것을 포함한다. 이것은 임의의 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 링커는 링커를 포함하는 앵커에서 절단될 수 있다. 이 실시형태는 혼성화를 통해 연결을 수반하는 앵커에 특히 적용 가능하다. 이러한 앵커는 상기 기재되어 있다.
단계 (f)는 더 바람직하게는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 하나 이상의 앵커를 하나 이상의 앵커에 결합하는 것에 대해 제1 폴리뉴클레오타이드와 경쟁하는 물질과 접촉시킴으로써 막으로부터 제1 폴리뉴클레오타이드를 비커플링시키는 것을 포함한다. 경쟁적 결합을 결정하고 측정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 물질은 바람직하게는 하나 이상의 앵커에 대한 혼성화에 대해 제1 폴리뉴클레오타이드와 경쟁하는 폴리뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 혼성화를 수반하는 하나 이상의 앵커를 사용하여 제1 폴리뉴클레오타이드가 막에 커플링되는 경우, 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 앵커를 혼성화의 부위에 또한 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드와 접촉시킴으로써 비커플링될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 물질은 통상적으로 제1 폴리뉴클레오타이드 및 하나 이상의 앵커의 농도보다 높은 농도에서 첨가된다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드 물질은 제1 폴리뉴클레오타이드보다 하나 이상의 앵커에 더 강하게 혼성화할 수 있다.
단계 (f)는 더 바람직하게는 (ⅰ) 제1 폴리뉴클레오타이드 및 하나 이상의 앵커를 우레아, 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP), 다이티오트레이톨(DTT), 스트렙타비딘 또는 바이오틴, UV 광, 효소 또는 결합제와 접촉시키는 것; (ⅱ) 제1 폴리뉴클레오타이드 및 하나 이상의 앵커를 가열하는 것; 또는 (ⅲ) pH를 변경하는 것을 포함한다. 우레아, 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP) 또는 다이티오트레이톨(DTT)은 앵커를 파괴하고 막으로부터 제1 폴리뉴클레오타이드를 분리시킬 수 있다. 앵커가 스트렙타비딘-바이오틴 링크를 포함하는 경우, 스트렙타비딘 물질은 바이오틴에 대한 결합에 대해 경쟁할 것이다. 앵커가 스트렙타비딘-데스티오바이오틴 링크를 포함하는 경우, 바이오틴 물질은 스트렙타비딘에 대한 결합에 대해 경쟁할 것이다. UV 광은 광 불안정 기를 분괴하기 위해 이용될 수 있다. 효소 및 결합제는 앵커를 절단하거나 파괴하거나 해소하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 효소는 엑소뉴클레아제, 엔도뉴클레아제 또는 헬리카제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직한 결합제는 효소, 항체 또는 이의 단편 또는 단일 가닥 결합 단백질(SSB)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 하기 기재된 임의의 효소 또는 상기 기재된 항체를 사용할 수 있다. 열 및 pH는 혼성화 및 다른 연결을 방해하기 위해 이용될 수 있다.
제1 폴리뉴클레오타이드가 하나 이상의 앵커로부터 제1 폴리뉴클레오타이드를 분리시킴으로써 막으로부터 비커플링될 때, 하나 이상의 앵커는 막에 남을 것이다. 단계 (g)는 바람직하게는 제1 폴리뉴클레오타이드로부터 분리된 하나 이상의 앵커를 사용하여 제2 폴리뉴클레오타이드를 막에 커플링하는 것을 포함한다. 예를 들어, 제2 폴리뉴클레오타이드는 막에 남은 하나 이상의 앵커에 혼성화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 의해 또한 제공될 수 있다. 대안적으로, 단계 (g)는 바람직하게는 제1 폴리뉴클레오타이드로부터 분리된 하나 이상의 별개의 앵커(즉, 하나 이상의 다른 앵커)를 사용하여 제2 폴리뉴클레오타이드를 막에 커플링하는 것을 포함한다. 하나 이상의 별개의 앵커는 제1 폴리뉴클레오타이드를 막에 커플링하기 위해 사용된 동일한 유형의 앵커일 수 있거나, 상이한 유형의 앵커일 수 있다. 단계 (g)는 바람직하게는 제1 폴리뉴클레오타이드로부터 분리된 하나 이상의 앵커로부터 하나 이상의 상이한 앵커를 사용하여 제2 폴리뉴클레오타이드를 막에 커플링하는 것을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 단계 (f) 및 (g)는 제2 폴리뉴클레오타이드가 하나 이상의 앵커에 대한 결합에 대해 제1 폴리뉴클레오타이드와 경쟁하고 제1 폴리뉴클레오타이드를 대체하도록 막을 제2 폴리뉴클레오타이드와 접촉시킴으로써 막으로부터 제1 폴리뉴클레오타이드를 비커플링시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 제1 폴리뉴클레오타이드가 혼성화를 수반하는 하나 이상의 앵커를 사용하여 막에 커플링되는 경우, 제1 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 앵커에서 혼성화의 부위에 또한 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드에 부착된 제2 폴리뉴클레오타이드와 앵커를 접촉시킴으로써 비커플링될 수 있다. 제2 폴리뉴클레오타이드는 통상적으로 제1 폴리뉴클레오타이드 및 하나 이상의 앵커의 농도보다 높은 농도에서 첨가된다. 대안적으로, 제2 폴리뉴클레오타이드는 제1 폴리뉴클레오타이드보다 하나 이상의 앵커에 더 강하게 혼성화할 수 있다.
제거 또는 세척
제1 폴리뉴클레오타이드가 단계 (f)에서 막으로부터 비커플링되더라도, 이것은 반드시 제거되거나 세척되지는 않는다. 제2 폴리뉴클레오타이드가 제1 폴리뉴클레오타이드로부터 쉽게 구별될 수 있는 경우, 제1 폴리뉴클레오타이드를 제거할 필요가 없다.
단계 (f)와 (g) 사이에, 상기 방법은 바람직하게는 막으로부터 제1 샘플의 적어도 몇몇을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 제1 샘플의 적어도 10%는 제거될 수 있고, 예컨대 제1 샘플의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%는 제거될 수 있다.
상기 방법은 더 바람직하게는 막으로부터 모든 제1 샘플을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 이것은 임의의 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 제1 폴리뉴클레오타이드가 비커플링된 후 막은 완충제에 의해 세척될 수 있다. 적합한 완충제는 하기 기재되어 있다.
변형된 폴리뉴클레오타이드
규명 전에, 주형으로서 표적 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 중합효소가 변형된 폴리뉴클레오타이드를 형성하는 조건 하에 폴리뉴클레오타이드와 중합효소 및 유리 뉴클레오타이드의 집단을 접촉시킴으로써 표적 폴리뉴클레오타이드는 변형될 수 있고, 여기서 변형된 폴리뉴클레오타이드를 형성할 때 중합효소는 표적 폴리뉴클레오타이드에서의 뉴클레오타이드 중 하나 이상을 상이한 뉴클레오타이드 종에 의해 대체한다. 이후, 변형된 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드에 부착된 하나 이상의 헬리카제 및 폴리뉴클레오타이드에 부착된 하나 이상의 분자 브레이크가 제공될 수 있다. 이 유형의 변형은 UK 출원 제1403096.9호에 기재되어 있다. 상기 기재된 임의의 중합효소를 사용할 수 있다. 중합효소는 바람직하게는 Klenow 또는 9o North이다.
주형으로서 주형 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 중합효소가 변형된 폴리뉴클레오타이드를 형성하는 조건 하에 주형 폴리뉴클레오타이드는 중합효소와 접촉한다. 이러한 조건은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 통상적으로 상업적으로 구입 가능 중합효소 완충제, 예컨대 New England Biolabs(등록상표)로부터의 완충제에서 중합효소와 접촉한다. 온도는 바람직하게는 Klenow에 대해 20 내지 37℃ 또는 9o North에 대해 60 내지 75℃이다. 프라이머 또는 3' 헤어핀은 통상적으로 중합효소 연장을 위한 조핵 점으로서 사용된다.
막관통 기공을 사용한 폴리뉴클레오타이드의 규명, 예컨대 서열분석은 통상적으로 k개 이하의 뉴클레오타이드(여기서, k는 양의 정수임(즉, 'k합체'))로 이루어진 중합체 단위를 분석하는 것을 수반한다. 이것은 국제 출원 제PCT/GB2012/052343호(WO 제2013/041878호로 공개됨)에 기재되어 있다. 상이한 k합체에 대해 전류 측정 사이에 명확한 분리를 갖는 것이 바람직하지만, 이들 측정 중 일부가 중첩하는 것이 흔하다. 특히 k합체에서의 중합체 단위의 높은 수, 즉 k의 높은 값에 의해, 폴리뉴클레오타이드에 관한 정보, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드의 기초 서열의 예상치를 유도하는 것의 손상에, 상이한 k합체에 의해 생성된 측정을 해소하는 것이 어려워질 수 있다.
변형된 폴리뉴클레오타이드에서의 상이한 뉴클레오타이드 종에 의해 표적 폴리뉴클레오타이드에서의 하나 이상의 뉴클레오타이드를 대체함으로써, 변형된 폴리뉴클레오타이드는 표적 폴리뉴클레오타이드에서의 것과 상이한 k합체를 함유한다. 변형된 폴리뉴클레오타이드에서의 상이한 k합체는 표적 폴리뉴클레오타이드에서의 k합체로부터 상이한 전류 측정을 생성할 수 있고, 그래서 변형된 폴리뉴클레오타이드는 표적 폴리뉴클레오타이드로부터의 상이한 정보를 제공한다. 변형된 폴리뉴클레오타이드로부터의 추가 정보는 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하는 것이 더 쉽게 만들 수 있다. 몇몇 경우에, 변형된 폴리뉴클레오타이드 자체는 규명하는 것이 더 쉬워질 수 있다. 예를 들어, 변형된 폴리뉴클레오타이드는 이의 전류 측정 사이의 증가한 분리 또는 명확한 분리를 갖는 k합체 또는 감소한 노이즈를 갖는 k합체를 포함하도록 설계될 수 있다.
중합효소는 바람직하게는 변형된 폴리뉴클레오타이드를 형성할 때 상이한 뉴클레오타이드 종에 의해 표적 폴리뉴클레오타이드에서의 뉴클레오타이드 종의 2개 이상을 대체한다. 중합효소는 구별되는 뉴클레오타이드 종에 의해 표적 폴리뉴클레오타이드에서의 2개 이상의 뉴클레오타이드 종의 각각을 대체할 수 있다. 중합효소는 동일한 뉴클레오타이드 종에 의해 표적 폴리뉴클레오타이드에서의 2개 이상의 뉴클레오타이드 종의 각각을 대체할 수 있다.
표적 폴리뉴클레오타이드가 DNA인 경우, 변형된 폴리뉴클레오타이드에서의 상이한 뉴클레오타이드 종은 통상적으로 아데닌, 구아닌, 타이민, 사이토신 또는 메틸사이토신과 상이한 핵염기를 포함하고/하거나, 데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 타이미딘, 데옥시사이티딘 또는 데옥시메틸사이티딘과 상이한 뉴클레오사이드를 포함한다. 표적 폴리뉴클레오타이드가 RNA인 경우, 변형된 폴리뉴클레오타이드에서의 상이한 뉴클레오타이드 종은 통상적으로 아데닌, 구아닌, 유라실, 사이토신 또는 메틸사이토신과 상이한 핵염기를 포함하고/하거나, 아데노신, 구아노신, 유리딘, 사이티딘 또는 메틸사이티딘과 상이한 뉴클레오사이드를 포함한다. 상이한 뉴클레오타이드 종은 상기 기재된 임의의 보편적 뉴클레오타이드일 수 있다.
중합효소는 하나 이상의 뉴클레오타이드 종으로부터 부재한 화학 기 또는 원자를 포함하는 상이한 뉴클레오타이드 종에 의해 하나 이상의 뉴클레오타이드를 대체할 수 있다. 화학 기는 프로피닐기, 티오기, 옥소기, 메틸기, 하이드록시메틸기, 폼일기, 카복시기, 카보닐기, 벤질기, 프로파길기 또는 프로파길아민기일 수 있다.
중합효소는 하나 이상의 뉴클레오타이드 종에 존재하는 화학 기 또는 원자가 결여된 상이한 뉴클레오타이드 종에 의해 하나 이상의 뉴클레오타이드 종을 대체할 수 있다. 중합효소는 변경된 전기음성도를 갖는 상이한 뉴클레오타이드 종을 뉴클레오타이드 종의 하나 이상을 대체할 수 있다. 변경된 전기음성도를 갖는 상이한 뉴클레오타이드 종은 바람직하게는 할로겐 원자를 포함한다.
상기 방법은 바람직하게는 변형된 폴리뉴클레오타이드에서의 하나 이상의 상이한 뉴클레오타이드 종으로부터 핵염기를 선택적으로 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
분석물질 전달
표적 분석물질은 바람직하게는 막을 향해 분석물질을 전달하는 마이크로입자에 부착된다. 이 유형의 전달은 UK 출원 제1418469.1호에 개시되어 있다. 임의의 유형의 마이크로입자 및 부착 방법을 이용할 수 있다.
다른 규명 방법
또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 중합효소에 의해 표적 폴리뉴클레오타이드에 첨가되고 이후 방출된 표지된 종을 검출함으로써 규명된다. 중합효소는 주형으로서 폴리뉴클레오타이드를 사용한다. 각각의 표지된 종은 각각의 뉴클레오타이드에 대해 특이적이다. 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 기공, 예컨대 본 발명의 기공, 중합효소 및 표지된 뉴클레오타이드와 접촉하여서, 포스페이트 표지된 종은 중합효소에 의해 폴리뉴클레오타이드에 순차적으로 첨가되고, 포스페이트 종은 각각의 뉴클레오타이드에 특이적인 라벨을 함유한다. 표지된 종은 뉴클레오타이드로부터 방출되기 전에(즉, 이들이 표적 폴리뉴클레오타이드에 첨가되면서) 또는 뉴클레오타이드로부터 방출된 후에 기공을 사용하여 검출될 수 있다.
중합효소는 상기 기재된 임의의 것일 수 있다. 포스페이트 표지된 종은 기공을 사용하고, 이로써 폴리뉴클레오타이드를 규명함으로써 검출된다. 이 유형의 방법은 유럽 출원 제13187149.3호(EP 제2682460호로 공개됨)에 개시되어 있다. 상기 기재된 임의의 실시형태는 이 방법에 동등하게 적용된다.
표지된 종의 예는 중합체, 폴리에틸렌 글라이콜, 당, 사이클로덱스트린, 형광단, 약물, 대사물질, 펩타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 태그의 비제한적인 예는 문헌[Kumar et al. Sci Rep. 2012;2:684. Epub 2012 Sep 21]의 업적에서 발견될 수 있다.
센서를 형성하는 방법
본 발명은 또한 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하기 위한 센서를 형성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 기공과 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질, 예컨대 헬리카제 또는 엑소뉴클레아제 사이에 복합체를 형성하는 단계를 포함한다. 복합체는 표적 폴리뉴클레오타이드의 존재 하에 기공 및 단백질을 접촉시키고 이후 기공에 걸쳐 전위를 인가함으로써 형성될 수 있다. 인가된 전위는 상기 기재된 바와 같은 화학 전위 또는 전압 전위일 수 있다. 대안적으로, 복합체는 기공을 단백질에 공유 부착함으로써 형성될 수 있다. 공유 부착을 위한 방법은 당해 분야, 예를 들어 국제 출원 제PCT/GB09/001679호(WO 제2010/004265호로 공개) 및 PCT/GB10/000133(WO 제2010/086603호)에 공지되고 개시되어 있다. 복합체는 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하기 위한 센서이다. 상기 방법은 바람직하게는 본 발명의 기공과 헬리카제 사이에 복합체를 형성하는 단계를 포함한다. 상기 기재된 임의의 실시형태는 이 방법에 동등하게 적용된다.
본 발명은 또한 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하기 위한 센서를 제공한다. 센서는 본 발명의 기공과 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질 사이의 복합체를 포함한다. 상기 기재된 임의의 실시형태는 본 발명의 센서에 동등하게 적용된다.
키트
본 발명은 또한 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 본 발명의 기공 및 막의 성분을 포함한다. 막은 바람직하게는 성분으로부터 형성된다. 기공은 바람직하게는 막에 존재한다. 키트는 상기 개시된 임의의 막의 성분, 예컨대 양친매성 층 또는 삼중블록 공중합체 막을 포함할 수 있다.
키트는 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 기재된 임의의 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질을 사용할 수 있다.
키트는 폴리뉴클레오타이드를 막에 커플링하기 위한 하나 이상의 앵커를 추가로 포함할 수 있다.
키트는 바람직하게는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 규명하기 위한 것이고, 바람직하게는 Y 어댑터 및 헤어핀 루프 어댑터를 포함한다. Y 어댑터는 바람직하게는 부착된 하나 이상의 헬리카제를 갖고, 헤어핀 루프 어댑터는 바람직하게는 부착된 하나 이상의 분자 브레이크를 갖는다. Y 어댑터는 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드를 막에 커플링하기 위한 하나 이상의 제1 앵커를 포함하고, 헤어핀 루프 어댑터는 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드를 막에 커플링하기 위한 하나 이상의 제2 앵커를 포함하고, 헤어핀 루프 어댑터를 막에 커플링하는 것의 강도는 바람직하게는 Y 어댑터를 막에 커플링하는 것의 강도보다 높다.
본 발명의 키트는 상기 언급된 임의의 실시형태가 수행되게 하는 하나 이상의 다른 시약 또는 장치를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 시약 또는 장치는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 적합한 완충제(들)(수용액), 대상체로부터 샘플을 얻기 위한 수단(예컨대, 침을 포함하는 용기 또는 장치), 폴리뉴클레오타이드를 증폭시키고/시키거나 발현시키는 수단 또는 전압 또는 패치 클램프 장치. 시약은 유체 샘플이 시약을 재현탁시키도록 건조 상태로 키트에 존재할 수 있다. 키트는 또한, 임의로, 키트가 본 발명의 방법에서 사용되게 하는 설명서 또는 방법이 이용될 수 있는 유기체에 관한 세부사항을 포함할 수 있다.
장치
본 발명은 또한 표적 분석물질, 예컨대 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하기 위한 장치를 제공한다. 상기 장치는 복수의 본 발명의 기공 및 복수의 막을 포함한다. 복수의 기공은 바람직하게는 복수의 막에 존재한다. 기공 및 막의 수는 바람직하게는 동일하다. 바람직하게는, 단일 기공은 각각의 막에 존재한다.
상기 장치는 바람직하게는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 상기 장치는 분석물질 분석을 위한 임의의 종래의 장치, 예컨대 어레이 또는 칩일 수 있다. 본 발명의 방법을 참조하여 상기 기재된 임의의 실시형태는 본 발명의 장치에 동등하게 적용 가능하다. 상기 장치는 본 발명의 키트에 존재하는 임의의 특징을 추가로 포함할 수 있다.
상기 장치는 바람직하게는 본 발명의 방법을 수행하기 위해 설정된다.
상기 장치는 바람직하게는
기공 및 막을 사용하여 분석물질 규명을 수행하도록 조작 가능하고, 복수의 기공 및 막을 지지할 수 있는 센서 장치; 및
규명을 수행하기 위한 재료의 전달을 위한 적어도 하나의 포트를 포함한다.
대안적으로, 상기 장치는 바람직하게는
기공 및 막을 사용하여 분석물질 규명을 수행하도록 조작 가능하고, 복수의 기공 및 막을 지지할 수 있는 센서 장치; 및
규명을 수행하기 위한 재료를 보유하기 위한 적어도 하나의 저장소를 포함한다.
상기 장치는 더 바람직하게는
기공 및 막을 사용하여 분석물질 규명을 수행하도록 조작 가능하고, 막 및 복수의 기공 및 막을 지지할 수 있는 센서 장치;
규명을 수행하기 위한 재료를 보유하기 위한 적어도 하나의 저장소;
적어도 하나의 저장소로부터 센서 장치로 재료를 제어 가능하게 공급하도록 구성된 유체 시스템; 및
각각의 샘플을 수용하기 위한 하나 이상의 용기를 포함하고, 유체 시스템은 하나 이상의 용기로부터 센서 장치로 샘플을 선택적으로 공급하도록 구성된다.
상기 장치는 국제 출원 제PCT/GB08/004127호(WO 제2009/077734호로 공개됨), 제PCT/GB10/000789호(WO 제2010/122293호로 공개됨), 국제 출원 제PCT/GB10/002206(WO 제2011/067559호로 공개됨) 또는 국제 출원 제PCT/US99/25679(WO 제00/28312호로 공개됨)에 기재된 임의의 것일 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 예시한다.
실시예
1
이 실시예는 CsgG 내의 DNA 거동을 조사하기 위해 실행된 모의를 기재한다.
재료 및 방법
DNA 전좌에 대한 CsgG-Eco 및 다양한 돌연변이체의 에너지 장벽의 규모를 조사하기 위해 스티어드 분자 동적 모의를 수행하였다. GROMOS 53a6 포스필드 및 SPC water 모델에 의해 GROMACS package 버전 4.0.5를 사용하여 모의를 수행하였다. CsgG-Eco(서열 번호 2)의 구조를 단백질 데이터 은행, 수탁 코드 4UV3으로부터 취했다. CsgG-Eco 돌연변이체의 모델을 만들기 위해, PyMOL을 사용하여 야생형 단백질 구조를 돌연변이시켰다. 연구된 돌연변이체는 CsgG-Eco-(F56A)(돌연변이 F56A를 갖는 서열 번호 2), CsgG-Eco-(F56A-N55S)(돌연변이 F56A/N55S를 갖는 서열 번호 2) 및 CsgG-Eco-(F56A-N55S-Y51A)(돌연변이 F56A/N55S/Y51A를 갖는 서열 번호 2)이었다.
이후, DNA를 기공에 위치시켰다. 2개의 상이한 시스템을 설정하였다:
ⅰ. 수축 영역 바로 위에(잔기 56 고리 위의 대략 5 내지 10Å) 기공으로 단일 구아닌 뉴클레오타이드를 배치하였다.
ⅱ. DNA의 단일 스트랜드(ssDNA)를 기공의 베타-배럴 측을 항해 5' 말단에 의해 기공 축을 따라 배치하였다. 이 설정에서, ssDNA를 기공의 전체 길이를 통해 예비 트레딩하였다.
모의 박스를 이후 용매화하고 가장 가파른 디센트 알고리즘을 이용하여 이후 에너지 최소화하였다.
300K로 Berendsen 서모스탯(thermostat) 및 Berendsen 바로스탯(barostat)을 사용하여 각각의 시스템을 NPT 앙상블에서 모의하였다. 모의에 걸쳐, 기공의 골격에 구속을 인가하였다.
기공을 통해 DNA를 끌어당기기 위해, 단일 구아닌 모의에서 인 원자에 견인력을 인가하였다. ssDNA 모의에서 스트랜드의 5' 말단에서 인 원자에 견인력을 인가하였다. 기공 축과 평행하게 일정한 속도로 이동하는 허점과 상기 언급된 DNA 인 원자 사이의 스프링을 연결함으로써 일정한 속도에서 견인력을 인가하였다. 스프링이 어떤 형상도 갖지 않고, 어떤 수력학적 항력도 겪지 않는다는 것에 주의한다. 스프링 상수는 5kJmol-1Å-2이었다.
결과
단일 G 전좌
도 3에 도시된 바대로, 시간에 대한 견인력의 선도는 야생형 CsgG-Eco 기공에서 페닐알라닌 잔기 F56의 고리로의 뉴클레오타이드 진입을 위한 큰 장벽이 있다는 것을 보여준다. 연구된 CsgG-Eco 돌연변이체에 관찰된 구아닌 전좌에 대한 유의미한 장벽이 없다.
ssDNA
전좌
ssDNA 전좌를 위해, 상이한 인가된 견인 속도(100Å/ns 및 10Å/ns)를 갖는 각각의 실행에 의해 기공마다 2개의 모의를 실행하였다. 더 빠른 견인 속도 모의를 예시하는 도 4에 도시된 바대로, CsgG 야생형 기공은 ssDNA 전좌가 가능하게 하는 가장 큰 견인력을 요했다. 더 느린 견인 속도 모의를 예시하는 도 5에 도시된 바대로, CsgG-Eco(야생형, 서열 번호 2) 및 CsgG-Eco-(F56A) 기공 둘 다는 ssDNA 전좌가 가능하게 하는 가장 큰 인가된 힘을 요했다. MspA 기준 기공 및 CsgG를 통한 ssDNA 전좌에 필요한 견인력 사이의 비교는 CsgG 기공의 돌연변이가 ssDNA 전좌의 유사한 수준을 허용하도록 필요하다는 것을 제안한다.
실시예
2
이 실시예는 몇몇 CsgG 돌연변이체의 규명을 기재한다.
재료 및 방법
실험을 설정하기 전에, DNA 작제물 X(최종 농도 0.1nM, 작제물 X의 카툰 표시 및 설명을 위해 도 13 참조)를 T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C(돌연변이 E94C/C109A/C136A/A360C를 갖는 서열 번호 24, 나노기공 시스템 10nM에 첨가된 최종 농도, 완충제(151.5mM KCl, 25mM 인산칼륨, 5% 글라이세롤, pH 7.0, 1mM EDTA) 중에 제공됨))와 5분 동안 실온에서 예비항온처리하였다. 5분 후, TMAD(100μM)를 프리믹스에 첨가하고, 혼합물을 추가로 5분 동안 항온처리하였다. 마지막으로, MgCl2(나노기공 시스템체 첨가된 1.5mM 최종 농도), ATP(나노기공 시스템에 첨가된 1.5mM 최종 농도), KCl(나노기공 시스템에 첨가된 500mM 최종 농도) 및 인산칼륨 완충제(나노기공 시스템에 첨가된 25mM 최종 농도)를 프리믹스에 첨가하였다.
완충제(25mM K 인산염 완충제, 150mM 칼륨 페로시아나이드(II), 150mM 칼륨 페리시아나이드(III), pH 8.0) 중에 블록 공중합체에서 삽입된 다양한 단일 CsgG 나노기공으로부터 전기 측정을 획득하였다. 블록 공중합체에서 삽입된 단일 기공을 획득한 후, 완충제(2㎖, 25mM K 인산염 완충제, 150mM 칼륨 페로시아나이드(II), 150mM 칼륨 페리시아나이드(III), pH 8.0)를 시스템을 통해 유동시켜 임의의 과량의 CsgG 나노기공을 제거하였다. 이후, 150㎕의 500mM KCl, 25mM K 인산염, 1.5mM MgCl2, 1.5mM ATP(pH 8.0)를 시스템을 통해 유동시켰다. 10분 후, 150㎕의 500mM KCl, 25mM 인산칼륨, 1.5mM MgCl2, 1.5mM ATP(pH 8.0)를 시스템을 통해 유동시키고, 이후 효소(T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C, 10nM 최종 농도), DNA 작제물 X(0.1nM 최종 농도), 연료(MgCl2 1.5mM 최종 농도, ATP 1.5mM 최종 농도) 프리믹스(전체 150㎕)를 이후 단일 나노기공 실험 시스템으로 유동시켰다. 실험을 -120mV에서 실행하고, 헬리카제 제어된 DNA 이동을 모니터링하였다.
결과
증가한 범위를 보여주는 기공(도 6 내지 8, 및 18 내지 30)
CsgG-Eco-(StrepII(C))(서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)는 약 10pA의 범위를 갖는 한편(도 6(a) 참조), 하기 CsgG-Eco 기공 돌연변이체는 증가한 전류 범위를 나타냈다 -
1 - CsgG-Eco-(Y51N-F56A-D149N-E185R-E201N-E203N-StrepII(C))9(돌연변이 Y51N/F56A/D149N/E185R/E201N/E203N을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)는 약 30pA의 범위를 나타냈다(도 6(b) 참조).
2 - CsgG-Eco-(N55A-StrepII(C))9(돌연변이 N55A를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47을 갖고, C 말단에서 부착됨)는 약 35pA의 범위를 나타냈다(도 6(c) 참조).
3 - CsgG-Eco-(N55S-StrepII(C))9(돌연변이 N55S를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)는 약 40pA의 범위를 나타냈다(도 7(a) 참조).
4 - CsgG-Eco-(Y51N-StrepII(C))9(돌연변이 Y51N을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)는 약 40pA의 범위를 나타냈다(도 7(b) 참조).
5 - CsgG-Eco-(Y51A-F56A-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56A를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)는 약 30pA의 범위를 나타냈다(도 7(c) 참조).
6 - CsgG-Eco-(Y51A-F56N-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56N를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)는 약 20pA의 범위를 나타냈다(도 8(a) 참조).
7 - CsgG-Eco-(Y51A-N55S-F56A-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/N55S/F56A를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)는 약 30pA의 범위를 나타냈다(도 8(b) 참조).
8 - CsgG-Eco-(Y51A-N55S-F56N-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/N55S/F56N을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)는 약 30pA의 범위를 나타냈다(도 8(c) 참조).
13 - CsgG-Eco-(F56H-StrepII(C))9(돌연변이 F56H를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)는 약 35pA의 범위를 나타냈다(도 18 참조).
14 - CsgG-Eco-(F56Q-StrepII(C))9(돌연변이 F56Q를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)는 약 40pA의 범위를 나타냈다(도 19 참조).
15 - CsgG-Eco-(F56T-StrepII(C))9(돌연변이 F56T를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)는 약 35pA의 범위를 나타냈다(도 20 참조).
16 - CsgG-Eco-(S54P/F56A-StrepII(C))9(돌연변이 S54P/F56A를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)는 약 35pA의 범위를 나타냈다(도 21 참조).
17 - CsgG-Eco-(Y51T/F56A-StrepII(C))9(돌연변이 Y51T/F56A를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)는 약 30pA의 범위를 나타냈다(도 22 참조).
18 - CsgG-Eco-(F56P-StrepII(C))9(돌연변이 F56P를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)는 약 30pA의 범위를 나타냈다(도 23 참조).
19 - CsgG-Eco-(F56A-StrepII(C))9(돌연변이 F56A를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)는 약 40pA의 범위를 나타냈다(도 24 참조).
20 - CsgG-Eco-(Y51T/F56Q-StrepII(C))9(돌연변이 Y51T/F56Q를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)는 약 30pA의 범위를 나타냈다(도 25 참조).
21 - CsgG-Eco-(N55S/F56Q-StrepII(C))9(돌연변이 N55S/F56Q를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)는 약 35pA의 범위를 나타냈다(도 26 참조).
22 - CsgG-Eco-(Y51T/N55S/F56Q-StrepII(C))9(돌연변이 Y51T/N55S/F56Q를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)는 약 35pA의 범위를 나타냈다(도 27 참조).
23 - CsgG-Eco-(F56Q/N102R-StrepII(C))9(돌연변이 F56Q/N102R을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)는 약 30pA의 범위를 나타냈다(도 28 참조).
24 - CsgG-Eco-(Y51Q/F56Q-StrepII(C))9(돌연변이 Y51Q/F56Q를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)는 약 40pA의 범위를 나타냈다(도 29 참조).
25 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)는 약 35pA의 범위를 나타냈다(도 30 참조).
증가한 처리량을 보여주는 기공(도 9 및 도 10)
도 9 및 도 10으로부터 볼 수 있는 것처럼, 하기 돌연변이체 기공(하기 9 내지 12)은 4시간에 채널마다 다수의 헬리카제 제어된 DNA 이동(도 9 및 도 10에서 X로 표지)을 나타내는 한편, 도 9(a)에 도시된 CsgG-Eco-(StrepII(C))(서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)는 4시간에 채널마다 오직 1개 또는 2개의 헬리카제 제어된 DNA 이동(도 9(a)에서 X로 표지)을 자주 나타냈고, 대신에 연장된 블록 영역(도 9(a)에서 Y로 표지)을 나타냈다.
9 - CsgG-Eco-(D149N-E185N-E203N-StrepII(C))9(돌연변이 D149N/E185N/E203N을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)(도 9(b))
10 - CsgG-Eco-(D149N-E185N-E201N-E203N-StrepII(C))9(돌연변이 D149N/E185N/E201N/E203N을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)(도 9(c))
11 - CsgG-Eco-(D149N-E185R-D195N-E201N-E203N)-StrepII(C))9(돌연변이 D149N/E185R/D195N/E201N/E203N을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)(도 10(a))
12 - CsgG-Eco-(D149N-E185R-D195N-E201R-E203N)-StrepII(C))9(돌연변이 D149N/E185R/D195N/E201R/E203N을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)(도 10(b))
증가한 삽입을 보여주는 기공(도 11 및 도 12)
도 11 및 도 12를 비교함으로써 볼 수 있는 것처럼, 도 12에 도시된 돌연변이체 기공 CsgG-Eco-(T150I-StrepII(C))9(돌연변이 T150I을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)는 CsgG-Eco-(StrepII(C))(서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨) 기공(도 11에 도시됨)과 비교하여 증가한 기공 수(약 4배 내지 5배)로 막에 존재한다. 도 11 및 도 12에서의 화살표는 4시간 실험에서 블록 공중합체로 삽입된 CsgG-Eco 나노기공의 수를 예시하였다(도 11에서의 130-140 및 도 12에서의 1-11은 각각 별개의 나노기공 실험에 상응함). CsgG-Eco-(StrepII(C))(서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)에 대해 3개의 실험은 1개의 나노기공의 삽입을 보여주는 한편, 돌연변이체 기공(CsgG-Eco-(T150I-StrepII(C))9)에 대해 각각의 실험은 적어도 하나의 나노기공의 삽입을 보여주고, 몇몇 실험은 다수의 기공 삽입을 보여주었다.
실시예
3
이 실시예는 CsgG 기공을 정제하기 위해 개발된 이. 콜라이 정제 방법을 기재한다.
재료 및 방법
폴리펩타이드 Pro-CsgG-Eco-(StrepII(C))(서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착되고, Pro는 서열 번호 48이고, N 말단에서 부착됨)를 코딩하는 DNA를 GenScript USA Inc.에서 합성하고, 암피실린 내성 유전자를 함유하는 pT7 벡터로 클로닝하였다. 아이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)에 의해 pT7 벡터의 단백질 발현을 유도하였다. DNA 용액의 농도를 400ng/㎕로 조정하였다. DNA(1㎕)를 사용하여 Lemo21(DE3) 유능 이. 콜라이 세포(50㎕, NEB, 카탈로그 C2528H호)를 형질전환시켰다. 형질전환 전에, CsgG 유전자를 Lemo21(DE3) 세포(Gene Bridges GmbH(독일))로부터 넉다운시켰다. 이후, 세포를 암피실린(0.1㎎/㎖)을 함유하는 LB 한천에 플레이팅하고, 37℃에서 대략 16시간 동안 항온처리하였다.
암피실린을 함유하는 LB 플레이트에서 성장한 박테리아 콜로니를 CsgG 플라스미드로 도입하였다. 하나의 이러한 콜로니를 사용하여 카르베니실린(0.1㎎/㎖)을 함유하는 LB 배지(100㎖)의 스타터 배양물을 접종하였다. OD600이 1.0 내지 1.2에 도달할 때까지, 스타터 배양물을 아지테이션에 의해 37℃에서 성장시켰다. 스타터 배양물을 사용하여 0.1의 O.D. 600으로 카르베니실린(0.1㎎/㎖) 및 람노스(500μM)를 함유하는 새로운 500㎖의 LB 배지를 접종하였다. OD600이 0.6에 도달할 때까지, 배양물을 아지테이션에 의해 37℃에서 성장시켰다. 이후, 배양물의 온도를 18℃로 조정하고, IPTG(0.2mM 최종 농도)의 첨가에 의해 유도를 개시하였다. 18℃에서 아지테이션에 의해 대략 18시간 동안 유도를 수행하였다.
유도 후, 배양물을 30분 동안 6,000g에서 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 펠렛을 50mM 트리스, 300mM NaCl, 함유 프로테아제 저해제(Merck Millipore 539138), 벤조나제 뉴클레아제(Sigma E1014) 및 1X bugbuster(Merck Millipore 70921)(pH 8.0)(펠렛 1그램당 대략 10㎖의 완충제) 중에 재현탁시켰다. 현탁액을 완전히 균질해질 때까지 혼합하고, 이후 샘플을 대략 5시간 동안 4℃에서 롤러 혼합기로 옮겼다. 용리물을 20,000g에서 원심분리에 의해 45분 동안 펠렛화하고, 상청액을 0.22μM PES 주사기 필터를 통해 여과시켰다. CsgG(샘플 1로 공지됨)를 함유하는 상청액을 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제에 대해 앞으로 취했다.
샘플 1을 5㎖ Strep Trap 칼럼(GE Healthcare)에 적용하였다. 10 칼럼 용적의 안정 기준치가 유지될 때까지 25mM 트리스, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 0.01% DDM(pH 8)에 의해 칼럼을 세척하였다. 이후, 칼럼을 150mM 완충제로 반환하기 전에 25mM 트리스, 2M NaCl, 2mM EDTA, 0.01% DDM(pH 8)에 의해 세척하였다. 10mM 데스티오바이오틴에 의해 용리를 수행하였다. CsgG 단백질의 Strep trap(GE Healthcare) 정제의 크로마토그래피 트레이스의 예가 도 14에 도시되어 있다. 용리 피크는 E1로 표지된다. 도 15는 초기 Strep 정제 후 CsgG-Eco 단백질의 통상적인 SDS-PAGE 가시화의 예를 보여준다. 레인 1 내지 3은 화살표로 표시된 바와 같은 CsgG 단백질을 함유하는 (도 14에서 E1로 표지된) 주요 용리 피크를 보여준다. 레인 4 내지 6은 오염물질을 함유하는 (도 14에서 E1로 표지된) 주요 용리 피크의 꼬리의 용리 분획에 상응하였다.
용리 피크를 풀링하고, 15분 동안 65℃로 가열하여 비안정한 오염된 단백질을 제거하였다. 가열된 용액을 20,000g에서 10분 동안 원심분리로 처리하고, 펠렛을 버렸다. 상청액을 25mM 트리스, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 0.01% DDM, 0.1% SDS(pH 8) 중에 120㎖의 Sephadex S200 칼럼(GE Healthcare)에서 겔 여과로 처리하였다. 단백질의 낮은 트립토판 성분으로 인해 220nM에서 모니터링을 수행하였다. 샘플을 대략 55㎖ 용적에서 용리시켰다(도 16은 별로 표지된 55㎖ 샘플 피크에 의한 크기 배제 칼럼 트레이스를 보여준다). 관심 대상의 CsgG-Eco-(StrepII(C))(서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)의 기공의 존재를 확인하도록 4-20% TGX(도 17 참조, Bio Rad)에서 용리 피크를 실행하였다. 확인된 분획을 풀링하고 50kD Amicon 스핀 칼럼에 의해 농축시켰다.
실시예
4
이 실시예는 CsgG-Eco-(Y51T/F56Q)-StrepII(C))9(돌연변이 Y51T/F56Q를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단 기공 돌연변이체 20호에서 부착됨)와 T4 Dda-(E94C/C109A/C136A/A360C)(돌연변이 E94C/C109A/C136A/A360C 및 이후 (ΔM1)G1G2를 갖는 서열 번호 24) 사이의 상호작용을 조사하기 위해 실행된 모의를 기재한다.
모의 방법
GROMOS 53a6 포스필드 및 SPC water 모델에 의해 GROMACS package 버전 4.0.5를 사용하여 모의를 수행하였다.
CsgG-Eco-(Y51T/F56Q)-StrepII(C))9(돌연변이 Y51T/F56Q를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단 기공 돌연변이체 20호에서 부착됨) 모델은 단백질 데이터 은행, 수탁 코드 4UV3 및 4Q79에서 발견되는 CsgG의 결정 구조에 기초한다. PyMOL을 이용하여 관련 돌연변이를 만들었다. 생성된 기공 모델을 이후 가장 가파른 디센트 알고리즘을 이용하여 에너지 최소화하였다. T4 Dda-(E94C/C109A/C136A/A360C)(돌연변이 E94C/C109A/C136A/A360C 및 이후 (ΔM1)G1G2를 갖는 서열 번호 24) 모델은 단백질 데이터 은행, 수탁 코드 3UPU에서 발견되는 Dda1993 구조에 기초한다. 다시, PyMOL을 이용하여 관련 돌연변이를 만들고, 모델을 가장 가파른 디센트 알고리즘을 이용하여 에너지 최소화하였다.
이후, T4 Dda-(E94C/C109A/C136A/A360C)(돌연변이 E94C/C109A/C136A/A360C 및 이후 (ΔM1)G1G2를 갖는 서열 번호 24) 모델을 CsgG-Eco-(Y51T/F56Q)-StrepII(C))9(돌연변이 Y51T/F56Q를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단 기공 돌연변이체 20호에서 부착됨) 위에 배치하였다. 상이한 초기 효소 입체구조에 의해 3개의 모의를 수행하였다(실행 1 내지 3(0ns), 도 31 참조):
모든 효소 입체구조에서, DNA의 5' 말단이 기공을 향해 향하도록 효소를 배향하고, 모의에 걸쳐 효소를 비구속하였다. 기공 골격을 구속하고, 모의 박스를 용매화하였다. 300K로 Berendsen 서모스탯 및 Berendsen 바로스탯을 사용하여 시스템을 40ns 동안 NPT ensemble에서 모의하였다.
GROMACS 분석 소프트웨어 및 또한 국소로 쓰인 코드 둘 다를 사용하여 효소와 기공 사이의 접촉을 분석하였다. 하기 표는 효소 아미노산과 기공 둘 다에 관찰된 접촉의 수를 보여준다. 표 6 내지 표 8은 효소에서의 아미노산 접촉 점과 상호작용하는 기공에서의 아미노산 접촉 점을 보여준다. 3개 중 2개의 모의에서, 효소는 기공의 상부에서 기울어진다(실행 2 및 3(20, 30 및 40ns) 참조, 도 31 및 32). 실행 1은 효소가 기울어지지 않는다는 것을 보여주고, 그래서 표 6에서 높은 상호작용을 갖는 것으로 보인 점은 기공 캡에서 효소 안정성을 증가시키기 위해 최적화될 수 있다.
실시예 5
이 실시예는 a) CsgG-Eco-(Y51A/F56Q)-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단 기공 돌연변이체 25호에서 부착됨)와 T4 Dda-(E94C/F98W/C109A/C136A/K194L/A360C)(돌연변이 E94C/F98W/C109A/C136A/K194L/A360C 및 이후 (ΔM1)G1G2를 갖는 서열 번호 24) 사이 및 b) CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W)-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97W를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단 기공 돌연변이체 26호에서 부착됨)와 T4 Dda-(E94C/F98W/C109A/C136A/K194L/A360C)(돌연변이 E94C/F98W/C109A/C136A/K194L/A360C 및 이후 (ΔM1)G1G2를 갖는 서열 번호 24) 사이의 상호작용을 조사하기 위해 실행되는 모의를 조사한다.
모의 방법
실시예 4에 기재된 바대로 모의를 수행하였다.
CsgG-Eco-(Y51A/F56Q)-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단 기공 돌연변이체 25호에서 부착됨) 및 CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W)-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97W를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단 기공 돌연변이체 26호에서 부착됨) 모델은 단백질 데이터 은행, 수탁 코드 4UV3 및 4Q79에서 발견되는 CsgG의 결정 구조에 기초한다. PyMOL을 이용하여 관련 돌연변이를 만들었다. 생성된 기공 모델을 이후 가장 가파른 디센트 알고리즘을 이용하여 에너지 최소화하였다.
T4 Dda-(E94C/F98W/C109A/C136A/K194L/A360C)(돌연변이 E94C/F98W/C109A/C136A/K194L/A360C 및 이후 (ΔM1)G1G2를 갖는 서열 번호 24) 모델은 단백질 데이터 은행, 수탁 코드 3UPU에서 발견되는 Dda1993 구조에 기초한다. 다시, PyMOL을 이용하여 관련 돌연변이를 만들고, 모델을 가장 가파른 디센트 알고리즘을 이용하여 에너지 최소화하였다.
이후, T4 Dda-(E94C/F98W/C109A/C136A/K194L/A360C)(돌연변이 E94C/F98W/C109A/C136A/K194L/A360C 및 이후 (ΔM1)G1G2를 갖는 서열 번호 24) 모델을 돌연변이체 기공 25 및 26 위에 배치하였다.
모의에서, DNA의 5' 말단이 기공을 향해 향하도록 효소를 배향하고, 모의에 걸쳐 효소를 비구속하였다. 조사된 각각의 돌연변이체 기공에 대해 2개의 모의를 실행하였다 - 처음에 기공 골격을 구속하고, 모의 박스를 용매화하고, 둘째로 기공 골격을 캡 영역을 제외하고 구속하고, 모의를 용매화하였다. 300K로 Berendsen 서모스탯 및 Berendsen 바로스탯을 사용하여 시스템을 40ns 동안 NPT 앙상블에서 모의하였다.
GROMACS 분석 소프트웨어 및 또한 국소로 쓰인 코드 둘 다를 사용하여 효소와 기공 사이의 접촉을 분석하였다. 하기 표는 효소 아미노산과 기공 둘 다에 관찰된 접촉의 수를 보여준다(T4 Dda-(E94C/F98W/C109A/C136A/K194L/A360C)를 갖는 돌연변이체 25 및 26에 대해). 표 9(구속된 기공 골격) 및 표 10(비구속된 캡 영역에 의해 구속된 기공 골격)은 기공 돌연변이체 25에서의 아미노산 접촉 점 및 이들이 효소(T4 Dda-(E94C/F98W/C109A/C136A/K194L/A360C))에 의해 만든 접촉의 수를 보여준다. 표 11(구속된 기공 골격) 및 표 12(비구속된 캡 영역에 의해 구속된 기공 골격)는 효소에서의 아미노산 접촉 점(T4 Dda-(E94C/F98W/C109A/C136A/K194L/A360C))과 상호작용하는 기공 돌연변이체 25(CsgG-Eco-(Y51A/F56Q)-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q를 갖는 서열 번호 2)(여기서, 단계II(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)에서의 아미노산 접촉 점을 보여준다. 표 13(구속된 기공 골격) 및 표 14(비구속된 캡 영역에 의해 구속된 기공 골격)는 기공 돌연변이체 26에서의 아미노산 접촉 점 및 이것이 효소(T4 Dda-(E94C/F98W/C109A/C136A/K194L/A360C))와 만드는 접촉의 수를 보여준다. 표 15(구속된 기공 골격) 및 표 16(비구속된 캡 영역에 의해 구속된 기공 골격)은 효소에서의 아미노산 접촉 점(T4 Dda-(E94C/F98W/C109A/C136A/K194L/A360C))과 상호작용하는 기공 돌연변이체 26(CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W)-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97W를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)에서의 아미노산 접촉 점을 보여준다. 도 33은 기공 돌연변이체 26 및 T4 Dda-(E94C/F98W/C109A/C136A/K194L/A360C)의 초기 스냅샷을 보여준다.
실시예 6
이 실시예는 개선된 규명 정확성을 보여주는 몇몇 CsgG 돌연변이체의 규명을 기재한다.
재료 및 방법
이 실시예에서 사용된 재료 및 방법은 실시예 2에 대해 상기 기재된 것과 동일하다. 이동을 제어하기 위해 사용된 효소는 1 = T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C(돌연변이 E94C/C109A/C136A/A360C를 갖는 서열 번호 24) 또는 효소 2 = T4 Dda - E94C/F98W/C109A/C136A/K194L/A360C(돌연변이 E94C/F98W/C109A/C136A/K194L/A360C를 갖는 서열 번호 24) 중 어느 하나였다.
국제 출원 제PCT/GB2012/052343호(WO/2013/041878로 공개됨)에 개시된 바와 같은 방법을 이용하여 1D 정확성 규명 측정을 계산하였다.
결과
T4 Dda-E94C/F98W/C109A/C136A/K194L/A360C에 의해 제어된 DNA 전좌를 갖는 MspA 돌연변이체 x = MspA-((Del-L74/G75/D118/L119)D56F/E59R/L88N/D90N/D91N/Q126R/D134R/E139K)8(돌연변이 D56F/E59R/L88N/D90N/D91N/Q126R/D134R/E139K 및 아미노산 L74/G75/D118/L119의 결실을 갖는 서열 번호 50)에 대한 1D 베이스콜 규명 정확성은 68.7%이었다. 시험된 모든 돌연변이체(하기 표 17 참조)는 MspA 돌연변이체 X와 비교하여 개선된 1D 베이스콜 규명 정확성을 보여주었다.
27 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W/R192Q-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97W/R192Q를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
28 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W/R192D-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97W/R192D를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
29 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/K135L/T150I/S208V-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/K135L/T150I/S208V를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
30 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/T150I/S208V-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/T150I/S208V를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
31 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/S208V-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/S208V를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
32 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/T150I-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/T150I를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
33 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/K135V/T150Y-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/K135V/T150Y를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
34 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/K135L-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/K135L을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
35 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97F/R192D-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97F/R192D를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
36 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/K135L/T150I-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/K135L/T150I를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
37 - CsgG-Eco-((Del-D195/Y196/Q197/R198/L199)-Y51A/F56Q-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q 및 아미노산 D195/Y196/Q197/R198/L199의 결실을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
38 - CsgG-Eco-((Del-R192/F193/I194/D195/Y196/Q197/R198/L199/L200)-Y51A/F56Q-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q 및 아미노산 R192/F193/I194/D195/Y196/Q197/R198/L199/L200의 결실을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
39 - CsgG-Eco-((Del-Q197/R198/L199/L200)-Y51A/F56Q-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q 및 아미노산 Q197/R198/L199/L200의 결실을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
40 - CsgG-Eco-((Del-I194/D195/Y196/Q197/R198/L199)-Y51A/F56Q-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q 및 아미노산 I194/D195/Y196/Q197/R198/L199의 결실을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
41 - CsgG-Eco-((Del-V139/G140/D149/T150/V186/Q187/V204/G205)-Y51A/F56Q-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q 및 아미노산 V139/G140/D149/T150/V186/Q187/V204/G205의 결실을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
42 - CsgG-Eco-((Del-D195/Y196/Q197/R198/L199/L200)-Y51A/F56Q-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q 및 아미노산 D195/Y196/Q197/R198/L199/L200의 결실을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
43 - CsgG-Eco-((Del-Y196/Q197/R198/L199/L200/E201)-Y51A/F56Q-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q 및 아미노산 Y196/Q197/R198/L199/L200/E201의 결실을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
44 - CsgG-Eco-((Del-Q197/R198/L199)-Y51A/F56Q-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q 및 아미노산 Q197/R198/L199의 결실을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
45 - CsgG-Eco-((Del-F193/I194/D195/Y196/Q197/R198/L199)-Y51A/F56Q-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q 및 아미노산 F193/I194/D195/Y196/Q197/R198/L199의 결실을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
46 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R192T-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R192T를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
47 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/N102S-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/N102S를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
48 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/Q42R-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/Q42R을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
49 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R192S-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R192S를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
50 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/G103N-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/G103N을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
51 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97N/N102R-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97N/N102R을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
52 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97L-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97L을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
53 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R192D-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R192D를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
54 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97N/N102G-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97N/N102G를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
55 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/F48S-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/F48S를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
56 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/G103S-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/G103S를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
57 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/E101L-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/E101L을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
58 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R192Q-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R192Q를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
59 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/K135N/R142N/R192N-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/K135N/R142N/R192N을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
60 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97N-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97N을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
61 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R192N-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R192N을 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
62 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/Y130W-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/Y130W를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
63 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/E101G-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/E101G를 갖는 서열 번호 2)(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)
실시예 7
이 실시예는 다수의 상이한 돌연변이체 나노기공의 DNA 포획을 포함한다.
재료 및 방법
완충제(25mM K 인산염 완충제, 150mM 칼륨 페로시아나이드(II), 150mM 칼륨 페리시아나이드(III), pH 8.0) 중에 블록 공중합체에서 삽입된 다양한 단일 CsgG 또는 MspA 나노기공으로부터 전기 측정을 획득하였다. 블록 공중합체에서 삽입된 단일 기공을 달성한 후, 완충제(2㎖, 25mM K 인산염 완충제, 150mM 칼륨 페로시아나이드(II), 150mM 칼륨 페리시아나이드(III), pH 8.0)는 시스템을 통해 유동시켜 임의의 과량의 나노기공을 제거하였다. 이후, 150㎕의 500mM KCl, 25mM K 포스페이트, 1.5mM MgCl2, 1.5mM ATP(pH 8.0)를 시스템을 통해 유동시켰다. 10분 후, 150㎕의 DNA(서열 번호 51, 200nM)는 이후 단일 나노기공 실험 시스템으로 유동시켰다. 실험을 -120mV에서 실행하고, 헬리카제 제어된 DNA 이동을 모니터링하였다.
결과
CsgG 돌연변이체 CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W/E101S/R192D-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97W/E101S/R192D를 갖는 서열 번호 2(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)(도 36 참조)는 MspA-((Del-L74/G75/D118/L119)D56F/E59R/L88N/D90N/D91N/Q126R/D134R/E139K)8(도 34 참조)보다 더 높은 포획 속도(예를 들어, 더 쉽게 DNA 폴리뉴클레오타이드를 포획함)를 보여준다. 전류 트레이스에서의 각각의 스파이크는 효소에 의해 제어함이 없이 나노기공을 통한 DNA 폴리뉴클레오타이드(서열 번호 51)의 전좌에 상응한다. 도 34에서의 10초 전류 트레이스는 CsgG 나노기공 - CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W/E101S/R192D-StrepII(C))9에 대해 10초 전류 트레이스보다 더 적은 DNA 전좌를 보여준다.
위치 E101 내지 E101S의 돌연변이는 E101S 돌연변이 없이 CsgG 돌연변이체와 비교할 때 포획 속도의 증가를 발생시켰다. 도 35는 CsgG 돌연변이체 CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W/R192D-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97W/R192D를 갖는 서열 번호 2(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨)에 대한 10초 전류 트레이스가 CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W/E101S/R192D-StrepII(C))9보다 더 적은 전좌를 나타낸다는 것을 보여준다. CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W/R192D-StrepII(C))9에 대한 전좌의 평균 수는 초마다 7.25(n = 12)이고, CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W/E101S/R192D-StrepII(C))9에 대한 평균 수는 초마다 18(n = 14)이다.
실시예
8
이 실시예는 2개의 상이한 CsgG 돌연변이체 기공의 발현의 수준을 비교한다.
재료 및 방법
이 실시예에서 나노기공(A = CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W)-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97W를 갖는 서열 번호 2(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨) 및 B = CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W/R192D)-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97W/R192D를 갖는 서열 번호 2(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨))을 제조하기 위해 사용된 재료 및 방법은 실시예 3에 대해 상기 기재된 것과 동일하다.
결과
2개의 나노기공 A = CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W)-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97W를 갖는 서열 번호 2(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨) 및 B = CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W/R192D)-StrepII(C))9(돌연변이 Y51A/F56Q/R97W/R192D를 갖는 서열 번호 2(여기서, StrepII(C)는 서열 번호 47이고, C 말단에서 부착됨))를 정확하게 동일한 프로토콜을 이용하여 발현시키고 정제하고, 겔 여과 크로마토그램(120㎖ S200 칼럼, 도 37 참조) 및 SDS-PAGE 분석(도 38 참조)을 이용하여 각각의 나노기공의 동일한 용적을 분석하였다. B에 대한 흡광도 값(470.3mAu)은 A(11.4mAu)보다 훨씬 더 높고, 이는 CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W/R192D)-StrepII(C))9가 CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W)-StrepII(C))9보다 훨씬 더 높은 수준에서 발현된다는 것을 나타낸다. 도 38에서의 밴드의 강도는 또한 2개의 기공의 발현 수준을 나타낸다. 밴드 A 내지 C(CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W)-StrepII(C))9 함유)는 밴드 D 내지 E(CsgG-Eco-(Y51A/F56Q/R97W/R192D)-StrepII(C))9 함유)보다 덜 강하다. 분석의 2개의 방법은 둘 다 R192D 돌연변이의 부가가 CsgG 돌연변이체의 관찰된 발현을 크게 증가시킨다는 것을 나타냈다.
실시예
9
이 실시예는 개선된 규명 정확성을 보여주는 몇몇 CsgG 돌연변이체의 규명을 기재한다.
재료 및 방법
CsG 기공
하기 8개의 CsgG 돌연변이체 기공을 시험하였다. 상기 실시예 X에 기재된 돌연변이체 28을 기준 기공으로서 사용하였다. 돌연변이는 서열 번호 2에서 만들어지고, 정제 태그 StrepII는 서열 번호 47에 기재된 서열을 갖는다.
기준 기공(돌연변이체 28): CsgG-(WT-Y51A/F56Q/R97W/R192D-StrepII)9
돌연변이체 A: CsgG-(WT-Y51A/F56Q/R97W/R192D-StrepII)9-del(D195-L199)
돌연변이체 B: CsgG-(WT-Y51A/F56Q/R97W/R192D-StrepII)9-del(F193-L199)
돌연변이체 C: CsgG-(WT-Y51A/F56Q/R97W/R192D-StrepII)9-F191T
돌연변이체 D: CsgG-(WT-Y51A/F56Q/R97W/R192D-del(V105-I107)-StrepII)9
돌연변이체 E: CsgG-(WT-Y51A/F56Q/K94Q/R97W/R192D-del(V105-I107)
돌연변이체 F: CsgG-(WT-Y51A/F56Q/R192D-StrepII)9-R93W
돌연변이체 G: CsgG-(WT-Y51A/F56Q/R192D-StrepII)9-R93W-del(D195-L199)
돌연변이체 H: CsgG-(WT-Y51A/F56Q/R192D-StrepII)9-R93Y/R97Y
나노기공
제조
각각 단일 CsgG 돌연변이체 나노기공이 삽입된 블록 공중합체 막의 다수의 웰을 함유하는 나노기공 어레이 칩을 제조하기 위해, 하기 방법을 이용하였다. 이. 콜라이에서 발현된 CsgG 돌연변이체를 정제하고, 25mM 트리스, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 0.01% DDM, 0.1% SDS, 0.1% Brij 58(pH 8)을 함유하는 완충제 중에 저장하였다. 이 돌연변이체 CsgG 기공을 25mM 인산칼륨, 150mM 칼륨 페로시아나이드(II), 150mM 칼륨 페리시아나이드(III)(pH 8.0)를 함유하는 완충제를 사용하여 100만 중 1로 희석하고, 칩에 첨가하여 각각의 웰에서 단일 기공을 얻었다. 기공 삽입 후, 어레이 칩을 25mM 인산칼륨, 150mM 칼륨 페로시아나이드(II), 150mM 칼륨 페리시아나이드(III)(pH 8.0)를 함유하는 1㎖ 완충제에 의해 세척하여 과량의 기공을 제거하였다. 몇 분 후, 각각의 칩을 470mM KCl, 25mM HEPES, 11mM ATP 및 10mM MgCl2를 함유하는 500㎖의 서열분석 믹스에 의해 플러싱하였다.
DNA 샘플 제조
하기 방법을 이용하여 서열분석에 대해 DNA 샘플을 제조하였다. 1㎍의 DNA 분석물질을 10분 동안 어댑터 및 무딘 TA 리가제에 예비 결합된 T4 Dda 헬리카제 효소를 함유하는 40nM의 어댑터 믹스와 항온처리하였다(https://store.nanoporetech.com/으로부터 이용 가능). 어댑터의 구조는 도 43에 도시되어 있고, 어댑터에 함유된 서열은 서열 번호 52 내지 55에 기재되어 있다. 이후, 결찰 혼합물을 정제하여 Spri 정제를 사용하여 비결찰된 유리 어댑터를 제거하였다. 최종 결찰된 혼합물을 40mM CAPS(pH 10), 40mM KCl 및 400nM 콜레스테롤 테터를 함유하는 25㎕의 용리 완충제 중에 용리시켰다. 각각의 칩에 대해, 12㎕의 DNA-어댑터 결찰된 혼합물을 서열분석 혼합물(150㎕의 최종 용적)과 혼합하고, 서열분석을 위해 칩에 첨가하였다. 이후, 160mV에서 6시간 동안 실험을 실행하였다.
WO 제2013/041878호에 개시된 바와 같은 방법을 이용하여 1D 정확성 규명 측정을 계산하였다.
주형 속도 측정
하기 방법에 의해 주형 속도를 측정하였다. 각각의 스퀴글의 베이스콜을 기준 서열로 정렬하였다. 정렬에 걸친 염기의 수(정렬 출발 위치로부터 공제된 정렬 종료 위치)를 정렬의 종료에 상응하는 사건과 정렬의 시작에 상응하는 사건 사이의 시간으로 나눈다.
결과
베이스콜 정확성
도 39에 도시된 바대로, 모든 8개의 CsgG 돌연변이체 기공은 실시예 6에 기재된 돌연변이체 28(CsgG-(WT-Y51A/F56Q/R97W/R192D-StrepII)9)인 기준 기공과 비교하여 개선된 베이스콜 정확성을 갖는 것으로 발견되었다. 표 17에 기재된 바대로, 돌연변이체 28은, 실시예 5에 기재된 돌연변이체 25(CsgG-(WT-Y51A/F56Q-StrepII)9)가 기준 돌연변이체인, 실시예 6에서 시험된 모든 CsgG 돌연변이체의 가장 높은 베이스콜 정확성(80.2%)을 보여주었다. 따라서, D195-L199, F193-L199 또는 V105-I107의 결실, 또는 F191T의 치환은 돌연변이체 28에서의 R97W 및 R192D 치환으로부터 생긴 정확성의 개선 이외에 정확성의 추가의 개선을 발생시킨다.
D195-L199, F193-L199 또는 V105-I107의 결실, 또는 F191T의 치환은 각각 또한 CsgG 서열에서의 다른 돌연변이의 존재 또는 R97W, R192D, Y51A 및/또는 F56Q 돌연변이의 부재 하에 정확성을 개선하는 것으로 예상될 것이다. 예를 들어, del(V105-I107) 돌연변이 이외에 돌연변이 K94Q를 함유하는 돌연변이체 E는, R97W 치환을 함유하지 않지만, 대신에 R93W 치환을 함유하는 del(V105-I107) 함유 돌연변이체 G가 그런 것처럼, 돌연변이체 28과 비교하여 개선된 정확성을 갖는다.
실시예 26에서의 표 17은 R97W 치환을 함유하는 돌연변이체 26이 돌연변이체 28(80.2%)만큼 거의 양호한 베이스콜 정확성(79.2%)을 갖는다는 것을 보여준다. 이것은 R97W 돌연변이가 증가한 베이스콜 정확성의 근거가 된다는 것을 제안한다. 이 실시예에서, R97W 돌연변이를 함유하지 않는(또한 R192D 돌연변이를 함유하지 않는), 대신에 R93W 치환(돌연변이체 F) 또는 R93Y 치환 및 R97Y 치환(돌연변이체 H) 둘 다를 함유하는 2개의 돌연변이체를 시험하고, 돌연변이체 28보다 더 높은 베이스콜 정확성을 갖는 것으로 발견되었다. 이것은 R93W 및 R93Y/R97Y 치환이 CsgG 나노기공의 베이스콜 정확성을 개선하기 위해 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
주형 속도 및 주형 정확성
도 40a에 도시된 바대로, 돌연변이체 D(CsgG-(WT-Y51A/F56Q/R97W/R192D-del(V105-I107)-StrepII)9)은 기준 돌연변이체 28 CsgG-(WT-Y51A/F56Q/R97W/R192D-StrepII)9와 비교하여 속도 집단의 치밀해진 분포를 갖는다.
도 40b는 돌연변이체 D(CsgG-(WT-Y51A/F56Q/R97W/R192D-del(V105-I107)-StrepII)9)가 기준 돌연변이체 28 CsgG-(WT-Y51A/F56Q/R97W/R192D-StrepII)9와 비교하여 주형 정확성의 치밀해진 분포를 갖는다는 것을 보여준다.
데이터의 변동이 없으므로, 치밀해진 속도 및 정확성 분포를 갖는 것이 이점이다. 또한, 데이터의 중앙치 정확성이 생성된 더 낮은 정확성 데이터의 양을 감소시킴으로써 증가할 것이다. 따라서, CsgG 나노기공의 V105 내지 I107의 아미노산의 결실은 폴리뉴클레오타이드를 규명하기 위한 개선된 특성을 갖는 CsgG 나노기공을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
실시예
10
이 실시예는 노이지 기공 신호의 감소를 보여주는 CsgG 돌연변이체의 규명을 기재한다.
재료 및 방법
CsG 기공
하기 CsgG 돌연변이체 기공을 시험하였다. 상기 실시예 X에 기재된 돌연변이체 28을 기준 기공으로서 사용하였다. 돌연변이는 서열 번호 2에서 만들어지고, 정제 태그 StrepII는 서열 번호 47에 기재된 서열을 갖는다.
기준 기공(돌연변이체 28): CsgG-(WT-Y51A/F56Q/R97W/R192D-StrepII)9
돌연변이체 I: CsgG-(WT-Y51A/F56Q/R97W/R192D-StrepII)9-K94N.
돌연변이체 J: CsgG-(WT-Y51A/F56Q/R97W/R192D-StrepII)9-K94Q.
나노기공
제조
각각 단일 CsgG 돌연변이체 나노기공이 삽입된 블록 공중합체 막의 다수의 웰을 함유하는 칩을 실시예 9에 기재된 바대로 제조하였다.
DNA 샘플 제조
실시예 9에 기재된 방법을 이용하여 서열분석에 대해 DNA 샘플을 제조하였다.
노이지 기공 상태에서 지난 시간의 결정
노이지 기공 상태에서 지난 시간의 백분율을 하기한 바대로 계산하였다. 각각의 채널 내의 사건 검출된 신호는 비중첩하는 짧은 윈도우로 분할되었다. 각각의 윈도우에 대해, 현재의 수준의 평균 평균값 및 현재의 수준의 분산을 계산하였다. 이후, 얻은 값을 분류기로 통과시키고, 이것은 윈도우가 노이지 신호를 함유하는지를 나타내는 라벨을 반송한다. 예비 표지된 데이터를 제공함으로써 노이지 신호를 검출하도록 분류기를 훈련시켰다.
결과
노이지 기공 상태
도 41은 기준 돌연변이체 28 CsgG-(WT-Y51A/F56Q/R97W/R192D-StrepII)9에 의해 나타난 "노이지" 기공 오차 방식을 보여주는 예시적인 "스쿼글"을 나타낸다. 도 41의 상부 패널은 "양호한" 및 "노이지" 기공 상태 동안 기공을 통한 전류의 흐름의 차이를 보여준다. 도 41의 하부 패널은 "양호한" 상태로부터 "노이지" 상태로이 이행의 확대도를 보여준다.
도 42는, 적어도 5회 실행에 걸쳐 평균이 된, 기준 돌연변이체 28과 비교할 때 돌연변이체 기공 I 및 J의 노이지 기공 상태의 감소를 보여준다.
돌연변이체 J 및 돌연변이체 I 둘 다에 의해 노이즈 기공 상태에서 지난 시간의 백분율은 기준치와 비교하여 유의미하게 감소하였다. 돌연변이체 I 및 J는 바로 1개의 잔기에서 기준으로서 사용된 돌연변이체 28과 다르다. 돌연변이체 I 및 돌연변이체 J 둘 다는 K94의 치환을 함유한다. 돌연변이체 I는 K94N 돌연변이를 함유하고, 돌연변이체 II는 K94Q 돌연변이를 함유한다. 따라서, CsgG 나노기공에서의 K94의 치환, 특히 N 또는 Q에 의한 치환은 폴리뉴클레오타이드를 규명하기 위해 개선된 특성을 갖는 CsgG 나노기공을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
실시예
11
이 실시예는 증가한 포획 활성을 보여주는 몇몇 CsgG 돌연변이체의 규명을 기재한다.
재료 및 방법
CsG 기공
하기 CsgG 돌연변이체 기공을 시험하였다. 상기 실시예 9에 기재된 돌연변이체 E를 기준 기공으로서 사용하였다. 돌연변이는 서열 번호 2에서 만들어지고, 정제 태그 StrepII는 서열 번호 47에 기재된 서열을 갖는다.
기준치(돌연변이체 E): CsgG-(WT-Y51A/F56Q/K94Q/R97W/R192D-del(V105-I107).
돌연변이체 K: CsgG-(WT-Y51A/F56Q/K94Q/R97W/R192D-del(V105-I107)-Q42K
돌연변이체 L: CsgG-(WT-Y51A/F56Q/K94Q/R97W/R192D-del(V105-I107)-E44N
돌연변이체 M: CsgG-(WT-Y51A/F56Q/K94Q/R97W/R192D-del(V105-I107)-E44Q
돌연변이체 N: CsgG-(WT-Y51A/F56Q/K94Q/R97W/R192D-del(V105-I107)-L90R
돌연변이체 O: CsgG-(WT-Y51A/F56Q/K94Q/R97W/R192D-del(V105-I107)-N91R
돌연변이체 P: CsgG-(WT-Y51A/F56Q/K94Q/R97W/R192D-del(V105-I107)-I95R
돌연변이체 Q: CsgG-(WT-Y51A/F56Q/K94Q/R97W/R192D-del(V105-I107)-A99R
돌연변이체 R: CsgG-(WT-Y51A/F56Q/K94Q/R97W/R192D-del(V105-I107)-E101H
돌연변이체 S: CsgG-(WT-Y51A/F56Q/K94Q/R97W/R192D-del(V105-I107)-E101K
돌연변이체 T: CsgG-(WT-Y51A/F56Q/K94Q/R97W/R192D-del(V105-I107)-E101N
돌연변이체 U: CsgG-(WT-Y51A/F56Q/K94Q/R97W/R192D-del(V105-I107)-E101Q
돌연변이체 V: CsgG-(WT-Y51A/F56Q/K94Q/R97W/R192D-del(V105-I107)-E101T
돌연변이체 W: CsgG-(WT-Y51A/F56Q/K94Q/R97W/R192D-del(V105-I107)-Q114K
나노기공
제조
각각 단일 CsgG 돌연변이체 나노기공이 삽입된 블록 공중합체 막의 다수의 웰을 함유하는 나노기공 어레이 칩을 제조하기 위해, 하기 방법을 이용하였다. 이. 콜라이에서 발현된 CsgG 돌연변이체를 정제하고, 25mM 트리스, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 0.01% DDM, 0.1% SDS, 0.1% Brij 58(pH 8)을 함유하는 완충제 중에 저장하였다. 이 돌연변이체 CsgG 기공을 25mM 인산칼륨, 150mM 칼륨 페로시아나이드(II), 150mM 칼륨 페리시아나이드(III)(pH 8.0)를 함유하는 완충제를 사용하여 100만 중 1로 희석하고, 칩에 첨가하여 각각의 웰에서 단일 기공을 얻었다. 기공 삽입 후, 칩을 25mM 인산칼륨, 150mM 칼륨 페로시아나이드(II), 150mM 칼륨 페리시아나이드(III)(pH 8.0)를 함유하는 1㎖ 완충제에 의해 세척하여 과량의 기공을 제거하였다. 25mM 인산칼륨, 150mM 칼륨 페로시아나이드(II), 150mM 칼륨 페리시아나이드(III)(pH 8.0) 중의 240nM TBA 분석물질을 함유하는 1㎖의 용액을 칩으로 플러싱하였다.
포획 능력의 결정
이후, 트롬빈 결합 압타머(TBA)(서열 번호 51)를 포획하는 능력에 의해 DNA 분석물질을 포획하는 돌연변이체 기공의 능력을 평가하였다. 180mV에서 실험을 실행하였다. 기공에 의한 TBA 포획을 측정하기 위해, TBA 사건 사이의 중앙치 시간을 계산하였다.
결과
도 44에 도시된 바대로, 13개의 돌연변이체에 대한 TBA 사건 사이의 중앙치 시간은 기준치와 비교하여 유의미하게 감소하였고, 이는 모든 13개의 돌연변이체가 주형 DNA의 증가한 포획 속도를 나타탠다는 것을 나타낸다.
각각의 13개의 돌연변이체는 기준 기공과 비교하여 단일 아미노산 치환을 갖는다. 특정한 치환은 Q42K, E44N, E44Q, L90R, N91R, I95R, A99R, E101H, E101K, E101N, E101Q, E101T 및 Q114K이었다. 모든 이 돌연변이는 비하전된 아미노산 또는 양으로 하전된 아미노산에 의한 음으로 하전된 아미노산의 치환, 또는 양으로 하전된 아미노산에 의한 비하전된 아미노산의 치환을 수반한다. 따라서, 음전하를 제거하고/하거나 이 위치에서 양전하를 증가시키는 아미노산에 의한 Q42, E44, E44, L90, N91, I95, A99, E101 및 Q114 위치의 하나 이상에서의 아미노산의 치환이 폴리뉴클레오타이드의 증가한 포획을 발생시킨다고 결론지어질 수 있다.
다양한
CsgG
동족체의 서열 정렬
도 45는 상기 기재된 바와 같은 21개의 CsgG 동족체 사이의 서열 정렬을 보여준다. 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40 및 서열 번호 41에서 다수의 서열 정렬을 수행하였다.
상동성-연장된 및 2차 구조 정보를 통합한 다중 서열 정렬 툴박스인 프랄린 소프트웨어(Praline software)는 정렬을 수행하기 위해 이용되었다 http://www.ibi.vu.nl/programs/pralinewww/, 또한 문헌[Simossis VA1, Heringa J.; Nucleic Acids Res. 2005 Jul 1;33(Web Server issue):W289-94]을 참조한다. BLOSUM62 잔기 교환 매트릭스를 이용하여 정렬을 순위 매겼다. 이 방법의 세부사항을 위해, 예를 들어 문헌[Henikoff S, Henikoff JG; Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 89, pp. 10915-10919, November 1992]을 참조한다. 갭 오프닝 및 12 및 1의 연장 패널티를 각각 이용하였다. PSIPRED를 이용한 2차 구조 예측을 이용하여 정렬을 가이드하였다. 이 방법의 세부사항을 위해, 예를 들어 문헌[Jones D.T.; J Mol Biol. 1999 Sep 17; 292(2):195-202]을 참조한다. 서열을 정렬하기 위해 이용된 상기 방법은 예시적이고, 당해 분야에 공지된 서열 정렬의 다른 방법을 이용할 수 있다.
도 45의 서열 정렬과 관련하여, 서열 정렬의 각각의 부문에서 각각의 위치에서의 보존은 히스토그램 및 점수로 표시된다. 스케일에서 숫자 0 내지 9는 증가하는 보존을 나타내고, 보존된 아미노의 것과 유사한 특성을 생성시키는 돌연변이를 갖는 열은 플러스('+')로 표시되고, 별 기호('*')는 그 위치에서의 100%의 서열 동일성을 나타낸다. 많은 잔기가 매우 높은 또는 심지어 완벽한 서열 동일성을 보여준다는 것을 서열 정렬의 보존 값으로부터 볼 수 있고, 이것은 이 21개의 동족체가 밀접하게 관련된다는 것을 나타낸다.
도 46은 예측된 알파 나선 2차 구조 영역이 추가로 회색으로 음영이 있는 도 45와 동일한 상대 서열 정렬을 보여준다. 도 47은 예측된 베타 시트 2차 구조 영역이 추가로 회색으로 음영이 있는 도 45와 동일한 상대 서열 정렬을 보여준다. 도 46 및 도 47은 CsgG 나노기공에 대한 중요한 2차 구조인 이 동족체의 예측된 알파 나선 및 베타 시트의 영역이 매우 보존된다는 것을 보여준다.
다수의 서열 정렬은 서열이 관련된다는 것을 강하게 제안한다; 정렬을 따른 보존의 높은 정도가 있을 뿐만 아니라, 예측된 2차 구조적 요소가 또한 정렬된다.
도 45, 도 46 및 도 47에서의 서열 정렬은 서로에 정렬되는 상대 위치를 보여주도록 참고로 사용될 수 있다. 따리서, 서열 번호 2와 관련하여 확인된 아미노산 잔기 및 다른 CsgG 동족체에서 상응하는 아미노산 잔기는 확인될 수 있다. 확인의 용이를 위해, 잔기 R97 및 R192는 별표로 배치된다. 예를 들어, 서열 번호 2의 R192가 서열 번호 32의 잔기 R191 및 서열 번호 37의 잔기 K177에 상응한다는 것을 표로부터 볼 수 있다.
도 45 내지 47을 참조하여 용이하게 이해될 수 있는 것처럼, CsgG 단량체는 고도로 보존된다. 더구나, 서열 번호 2와 관련한 돌연변이의 지식으로부터, 서열 번호 2의 것과 다른 CsgG 단량체의 돌연변이에 대한 동등한 위치를 결정할 수 있다.
따라서, 청구항 및 본 명세서에서 그 외 기재된 바와 같은 서열 번호 2에 기재된 바와 같은 서열의 변이체를 포함하는 돌연변이체 CsgG 단량체 및 이의 특정한 아미노산 돌연변이의 언급은 또한 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40 및 서열 번호 41에 기재된 바와 같은 서열의 변이체를 포함하는 돌연변이체 CsgG 단량체 및 이의 상응하는 아미노산 돌연변이를 포함한다. 마찬가지로, 청구항 및 본 명세서에서 그 외 기재된 바와 같은 서열 번호 2에 기재된 바와 같은 서열의 변이체를 포함하는 돌연변이체 CsgG 단량체 및 이의 특정한 아미노산 돌연변이에 관한 작제물, 기공 또는 기공의 사용에 수반하는 방법의 언급은 또한 상기 개시된 서열 번호에 따른 서열의 변이체를 포함하는 돌연변이체 CsgG 단량체 및 이의 상응하는 아미노산 돌연변이에 관한 작제물, 기공 또는 방법을 포함한다. 본 발명이 고도로 보존된 영역을 나타내는 본 명세서에서 명확히 확인되지 않은 다른 변이체 CsgG 단량체로 연장된다는 것이 추가로 이해될 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> OXFORD NANOPORE TECHNOLOGIES LIMITED
<120> MUTANT PORE
<130> N407645WO
<140> TBC
<141> TBC
<150> GB1603656.8
<151> 2016-03-02
<150> GB1603657.6
<151> 2016-03-02
<150> GB1603658.4
<151> 2016-03-02
<160> 56
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 786
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 1
tgtctgaccg caccgccgaa agaagcggca cgtccgaccc tgatgccgcg tgcacagtct 60
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atccaggacg aaaccggtca atttaaaccg tacccggcga gtaatttctc cacggccgtt 180
ccgcagagtg caaccgctat gctggtcacg gcactgaaag attcccgttg gttcattccg 240
ctggaacgcc agggcctgca aaacctgctg aatgaacgta aaattatccg cgcagctcag 300
gaaaacggta ccgtggccat taacaatcgt attccgctgc aaagcctgac cgccgcaaac 360
atcatggttg aaggctctat catcggttac gaatcaaacg tcaaatcggg cggtgtgggc 420
gcacgttatt ttggcattgg tgctgatacc cagtaccaac tggaccagat cgcagttaac 480
ctgcgcgtgg ttaatgtcag caccggcgaa attctgagct ctgtgaatac cagcaaaacg 540
atcctgtctt acgaagtgca ggctggtgtt tttcgtttca ttgattatca acgcctgctg 600
gaaggcgaag tcggttacac ctcaaacgaa ccggtgatgc tgtgtctgat gtcggcgatt 660
gaaacgggtg ttattttcct gatcaatgat ggcatcgacc gtggtctgtg ggatctgcag 720
aacaaagccg aacgtcaaaa tgacattctg gtgaaatacc gccacatgag tgttccgccg 780
gaatcc 786
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<211> 262
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 2
Cys Leu Thr Ala Pro Pro Lys Glu Ala Ala Arg Pro Thr Leu Met Pro
1 5 10 15
Arg Ala Gln Ser Tyr Lys Asp Leu Thr His Leu Pro Ala Pro Thr Gly
20 25 30
Lys Ile Phe Val Ser Val Tyr Asn Ile Gln Asp Glu Thr Gly Gln Phe
35 40 45
Lys Pro Tyr Pro Ala Ser Asn Phe Ser Thr Ala Val Pro Gln Ser Ala
50 55 60
Thr Ala Met Leu Val Thr Ala Leu Lys Asp Ser Arg Trp Phe Ile Pro
65 70 75 80
Leu Glu Arg Gln Gly Leu Gln Asn Leu Leu Asn Glu Arg Lys Ile Ile
85 90 95
Arg Ala Ala Gln Glu Asn Gly Thr Val Ala Ile Asn Asn Arg Ile Pro
100 105 110
Leu Gln Ser Leu Thr Ala Ala Asn Ile Met Val Glu Gly Ser Ile Ile
115 120 125
Gly Tyr Glu Ser Asn Val Lys Ser Gly Gly Val Gly Ala Arg Tyr Phe
130 135 140
Gly Ile Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Gln Leu Asp Gln Ile Ala Val Asn
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Leu Arg Val Val Asn Val Ser Thr Gly Glu Ile Leu Ser Ser Val Asn
165 170 175
Thr Ser Lys Thr Ile Leu Ser Tyr Glu Val Gln Ala Gly Val Phe Arg
180 185 190
Phe Ile Asp Tyr Gln Arg Leu Leu Glu Gly Glu Val Gly Tyr Thr Ser
195 200 205
Asn Glu Pro Val Met Leu Cys Leu Met Ser Ala Ile Glu Thr Gly Val
210 215 220
Ile Phe Leu Ile Asn Asp Gly Ile Asp Arg Gly Leu Trp Asp Leu Gln
225 230 235 240
Asn Lys Ala Glu Arg Gln Asn Asp Ile Leu Val Lys Tyr Arg His Met
245 250 255
Ser Val Pro Pro Glu Ser
260
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<211> 248
<212> PRT
<213> Citrobacter koseri
<400> 3
Met Pro Arg Ala Gln Ser Tyr Lys Asp Leu Thr His Leu Pro Met Pro
1 5 10 15
Thr Gly Lys Ile Phe Val Ser Val Tyr Asn Ile Gln Asp Glu Thr Gly
20 25 30
Gln Phe Lys Pro Tyr Pro Ala Ser Asn Phe Ser Thr Ala Val Pro Gln
35 40 45
Ser Ala Thr Ala Met Leu Val Thr Ala Leu Lys Asp Ser Arg Trp Phe
50 55 60
Ile Pro Leu Glu Arg Gln Gly Leu Gln Asn Leu Leu Asn Glu Arg Lys
65 70 75 80
Ile Ile Arg Ala Ala Gln Glu Asn Gly Thr Val Ala Ile Asn Asn Arg
85 90 95
Ile Pro Leu Gln Ser Leu Thr Ala Ala Asn Ile Met Val Glu Gly Ser
100 105 110
Ile Ile Gly Tyr Glu Ser Asn Val Lys Ser Gly Gly Val Gly Ala Arg
115 120 125
Tyr Phe Gly Ile Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Gln Leu Asp Gln Ile Ala
130 135 140
Val Asn Leu Arg Val Val Asn Val Ser Thr Gly Glu Ile Leu Ser Ser
145 150 155 160
Val Asn Thr Ser Lys Thr Ile Leu Ser Tyr Glu Val Gln Ala Gly Val
165 170 175
Phe Arg Phe Ile Asp Tyr Gln Arg Leu Leu Glu Gly Glu Ile Gly Tyr
180 185 190
Thr Ser Asn Glu Pro Val Met Leu Cys Leu Met Ser Ala Ile Glu Thr
195 200 205
Gly Val Ile Phe Leu Ile Asn Asp Gly Ile Asp Arg Gly Leu Trp Asp
210 215 220
Leu Gln Asn Lys Ala Glu Arg Gln Asn Asp Ile Leu Val Lys Tyr Arg
225 230 235 240
His Met Ser Val Pro Pro Glu Ser
245
<210> 4
<211> 223
<212> PRT
<213> Salmonella enterica
<400> 4
Cys Leu Thr Ala Pro Pro Lys Gln Ala Ala Lys Pro Thr Leu Met Pro
1 5 10 15
Arg Ala Gln Ser Tyr Lys Asp Leu Thr His Leu Pro Ala Pro Thr Gly
20 25 30
Lys Ile Phe Val Ser Val Tyr Asn Ile Gln Asp Glu Thr Gly Gln Phe
35 40 45
Lys Pro Tyr Pro Ala Ser Asn Phe Ser Thr Ala Val Pro Gln Ser Ala
50 55 60
Thr Ala Met Leu Val Thr Ala Leu Lys Asp Ser Arg Trp Phe Ile Pro
65 70 75 80
Leu Glu Arg Gln Gly Leu Gln Asn Leu Leu Asn Glu Arg Lys Ile Ile
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Arg Ala Ala Gln Glu Asn Gly Thr Val Ala Met Asn Asn Arg Ile Pro
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Leu Gln Ser Leu Thr Ala Ala Asn Ile Met Val Glu Gly Ser Ile Ile
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Gly Tyr Glu Ser Asn Val Lys Ser Gly Gly Val Gly Ala Arg Tyr Phe
130 135 140
Gly Ile Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Gln Leu Asp Gln Ile Ala Val Asn
145 150 155 160
Leu Arg Val Val Asn Val Ser Thr Gly Glu Ile Leu Ser Ser Val Asn
165 170 175
Thr Ser Lys Thr Ile Leu Ser Tyr Glu Val Gln Ala Gly Val Phe Arg
180 185 190
Phe Ile Asp Tyr Gln Arg Leu Leu Glu Gly Glu Ile Gly Tyr Thr Ser
195 200 205
Asn Glu Pro Val Met Leu Cys Leu Met Ser Ala Ile Glu Thr Gly
210 215 220
<210> 5
<211> 262
<212> PRT
<213> Citrobacter amalonaticus
<400> 5
Cys Leu Thr Ala Pro Pro Lys Glu Ala Ala Lys Pro Thr Leu Met Pro
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Arg Ala Gln Ser Tyr Lys Asp Leu Thr His Leu Pro Ile Pro Thr Gly
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Lys Ile Phe Val Ser Val Tyr Asn Ile Gln Asp Glu Thr Gly Gln Phe
35 40 45
Lys Pro Tyr Pro Ala Ser Asn Phe Ser Thr Ala Val Pro Gln Ser Ala
50 55 60
Thr Ala Met Leu Val Thr Ala Leu Lys Asp Ser Arg Trp Phe Val Pro
65 70 75 80
Leu Glu Arg Gln Gly Leu Gln Asn Leu Leu Asn Glu Arg Lys Ile Ile
85 90 95
Arg Ala Ala Gln Glu Asn Gly Thr Val Ala Ile Asn Asn Arg Ile Pro
100 105 110
Leu Gln Ser Leu Thr Ala Ala Asn Ile Met Val Glu Gly Ser Ile Ile
115 120 125
Gly Tyr Glu Ser Asn Val Lys Ser Gly Gly Val Gly Ala Arg Tyr Phe
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Gly Ile Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Gln Leu Asp Gln Ile Ala Val Asn
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Leu Arg Val Val Asn Val Ser Thr Gly Glu Ile Leu Ser Ser Val Asn
165 170 175
Thr Ser Lys Thr Ile Leu Ser Tyr Glu Val Gln Ala Gly Val Phe Arg
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Ile Phe Leu Ile Asn Asp Gly Ile Asp Arg Gly Leu Trp Asp Leu Gln
225 230 235 240
Asn Lys Ala Asp Arg Gln Asn Asp Ile Leu Val Lys Tyr Arg His Met
245 250 255
Ser Val Pro Pro Glu Ser
260
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<211> 262
<212> PRT
<213> Citrobacter rodentium
<400> 6
Cys Leu Thr Thr Pro Pro Lys Glu Ala Ala Lys Pro Thr Leu Met Pro
1 5 10 15
Arg Ala Gln Ser Tyr Lys Asp Leu Thr His Leu Pro Val Pro Thr Gly
20 25 30
Lys Ile Phe Val Ser Val Tyr Asn Ile Gln Asp Glu Thr Gly Gln Phe
35 40 45
Lys Pro Tyr Pro Ala Ser Asn Phe Ser Thr Ala Val Pro Gln Ser Ala
50 55 60
Thr Ala Met Leu Val Thr Ala Leu Lys Asp Ser Arg Trp Phe Ile Pro
65 70 75 80
Leu Glu Arg Gln Gly Leu Gln Asn Leu Leu Asn Glu Arg Lys Ile Ile
85 90 95
Arg Ala Ala Gln Glu Asn Gly Thr Val Ala Ile Asn Asn Arg Ile Pro
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Leu Pro Ser Leu Thr Ala Ala Asn Ile Met Val Glu Gly Ser Ile Ile
115 120 125
Gly Tyr Glu Ser Asn Val Lys Ser Gly Gly Ala Gly Ala Arg Tyr Phe
130 135 140
Gly Ile Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Gln Leu Asp Gln Ile Ala Val Asn
145 150 155 160
Leu Arg Val Val Asn Val Ser Thr Gly Glu Ile Leu Ser Ser Val Asn
165 170 175
Thr Ser Lys Thr Ile Leu Ser Tyr Glu Val Gln Ala Gly Val Phe Arg
180 185 190
Phe Ile Asp Tyr Gln Arg Leu Leu Glu Gly Glu Ile Gly Tyr Thr Ser
195 200 205
Asn Glu Pro Val Met Leu Cys Leu Met Ser Ala Ile Glu Thr Gly Val
210 215 220
Ile Phe Leu Ile Asn Asp Gly Ile Asp Arg Gly Leu Trp Asp Leu Gln
225 230 235 240
Asn Lys Ala Asp Arg Gln Asn Asp Ile Leu Val Lys Tyr Arg Gln Met
245 250 255
Ser Val Pro Pro Glu Ser
260
<210> 7
<211> 262
<212> PRT
<213> Enterobacter asburiae
<400> 7
Cys Leu Thr Ala Pro Pro Lys Glu Ala Ala Lys Pro Thr Leu Met Pro
1 5 10 15
Arg Ala Gln Ser Tyr Arg Asp Leu Thr His Leu Pro Ala Pro Thr Gly
20 25 30
Lys Ile Phe Val Ser Val Tyr Asn Ile Gln Asp Glu Thr Gly Gln Phe
35 40 45
Lys Pro Tyr Pro Ala Ser Asn Phe Ser Thr Ala Val Pro Gln Ser Ala
50 55 60
Thr Ala Met Leu Val Thr Ala Leu Lys Asp Ser His Trp Phe Ile Pro
65 70 75 80
Leu Glu Arg Gln Gly Leu Gln Asn Leu Leu Asn Glu Arg Lys Ile Ile
85 90 95
Arg Ala Ala Gln Glu Asn Gly Thr Val Ala Asn Asn Asn Arg Met Pro
100 105 110
Leu Gln Ser Leu Ala Ala Ala Asn Val Met Ile Glu Gly Ser Ile Ile
115 120 125
Gly Tyr Glu Ser Asn Val Lys Ser Gly Gly Val Gly Ala Arg Tyr Phe
130 135 140
Gly Ile Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Gln Leu Asp Gln Ile Ala Val Asn
145 150 155 160
Leu Arg Val Val Asn Val Ser Thr Gly Glu Val Leu Ser Ser Val Asn
165 170 175
Thr Ser Lys Thr Ile Leu Ser Tyr Glu Val Gln Ala Gly Val Phe Arg
180 185 190
Phe Ile Asp Tyr Gln Arg Leu Leu Glu Gly Glu Ile Gly Tyr Thr Ser
195 200 205
Asn Glu Pro Val Met Met Cys Leu Met Ser Ala Ile Glu Thr Gly Val
210 215 220
Ile Phe Leu Ile Asn Asp Gly Ile Asp Arg Gly Leu Trp Asp Leu Gln
225 230 235 240
Asn Lys Ala Asp Ala Gln Asn Pro Val Leu Val Lys Tyr Arg Asp Met
245 250 255
Ser Val Pro Pro Glu Ser
260
<210> 8
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<212> DNA
<213> Bacteriophage phi-29
<400> 8
atgaaacaca tgccgcgtaa aatgtatagc tgcgcgtttg aaaccacgac caaagtggaa 60
gattgtcgcg tttgggccta tggctacatg aacatcgaag atcattctga atacaaaatc 120
ggtaacagtc tggatgaatt tatggcatgg gtgctgaaag ttcaggcgga tctgtacttc 180
cacaacctga aatttgatgg cgcattcatt atcaactggc tggaacgtaa tggctttaaa 240
tggagcgcgg atggtctgcc gaacacgtat aataccatta tctctcgtat gggccagtgg 300
tatatgattg atatctgcct gggctacaaa ggtaaacgca aaattcatac cgtgatctat 360
gatagcctga aaaaactgcc gtttccggtg aagaaaattg cgaaagattt caaactgacg 420
gttctgaaag gcgatattga ttatcacaaa gaacgtccgg ttggttacaa aatcaccccg 480
gaagaatacg catacatcaa aaacgatatc cagatcatcg cagaagcgct gctgattcag 540
tttaaacagg gcctggatcg catgaccgcg ggcagtgata gcctgaaagg tttcaaagat 600
atcatcacga ccaaaaaatt caaaaaagtg ttcccgacgc tgagcctggg tctggataaa 660
gaagttcgtt atgcctaccg cggcggtttt acctggctga acgatcgttt caaagaaaaa 720
gaaattggcg agggtatggt gtttgatgtt aatagtctgt atccggcaca gatgtacagc 780
cgcctgctgc cgtatggcga accgatcgtg ttcgagggta aatatgtttg ggatgaagat 840
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catctgacgg gcaccgaaat cccggatgtg attaaagata tcgttgatcc gaaaaaactg 1440
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tacaccgata tcaaattcag tgtgaaatgc gccggcatga cggataaaat caaaaaagaa 1620
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tggagccacc cgcagtttga aaaataataa 1830
<210> 9
<211> 608
<212> PRT
<213> Bacteriophage phi-29
<400> 9
Met Lys His Met Pro Arg Lys Met Tyr Ser Cys Ala Phe Glu Thr Thr
1 5 10 15
Thr Lys Val Glu Asp Cys Arg Val Trp Ala Tyr Gly Tyr Met Asn Ile
20 25 30
Glu Asp His Ser Glu Tyr Lys Ile Gly Asn Ser Leu Asp Glu Phe Met
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Ala Trp Val Leu Lys Val Gln Ala Asp Leu Tyr Phe His Asn Leu Lys
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Phe Asp Gly Ala Phe Ile Ile Asn Trp Leu Glu Arg Asn Gly Phe Lys
65 70 75 80
Trp Ser Ala Asp Gly Leu Pro Asn Thr Tyr Asn Thr Ile Ile Ser Arg
85 90 95
Met Gly Gln Trp Tyr Met Ile Asp Ile Cys Leu Gly Tyr Lys Gly Lys
100 105 110
Arg Lys Ile His Thr Val Ile Tyr Asp Ser Leu Lys Lys Leu Pro Phe
115 120 125
Pro Val Lys Lys Ile Ala Lys Asp Phe Lys Leu Thr Val Leu Lys Gly
130 135 140
Asp Ile Asp Tyr His Lys Glu Arg Pro Val Gly Tyr Lys Ile Thr Pro
145 150 155 160
Glu Glu Tyr Ala Tyr Ile Lys Asn Asp Ile Gln Ile Ile Ala Glu Ala
165 170 175
Leu Leu Ile Gln Phe Lys Gln Gly Leu Asp Arg Met Thr Ala Gly Ser
180 185 190
Asp Ser Leu Lys Gly Phe Lys Asp Ile Ile Thr Thr Lys Lys Phe Lys
195 200 205
Lys Val Phe Pro Thr Leu Ser Leu Gly Leu Asp Lys Glu Val Arg Tyr
210 215 220
Ala Tyr Arg Gly Gly Phe Thr Trp Leu Asn Asp Arg Phe Lys Glu Lys
225 230 235 240
Glu Ile Gly Glu Gly Met Val Phe Asp Val Asn Ser Leu Tyr Pro Ala
245 250 255
Gln Met Tyr Ser Arg Leu Leu Pro Tyr Gly Glu Pro Ile Val Phe Glu
260 265 270
Gly Lys Tyr Val Trp Asp Glu Asp Tyr Pro Leu His Ile Gln His Ile
275 280 285
Arg Cys Glu Phe Glu Leu Lys Glu Gly Tyr Ile Pro Thr Ile Gln Ile
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Lys Arg Ser Arg Phe Tyr Lys Gly Asn Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Gly
305 310 315 320
Gly Glu Ile Ala Asp Leu Trp Leu Ser Asn Val Asp Leu Glu Leu Met
325 330 335
Lys Glu His Tyr Asp Leu Tyr Asn Val Glu Tyr Ile Ser Gly Leu Lys
340 345 350
Phe Lys Ala Thr Thr Gly Leu Phe Lys Asp Phe Ile Asp Lys Trp Thr
355 360 365
Tyr Ile Lys Thr Thr Ser Glu Gly Ala Ile Lys Gln Leu Ala Lys Leu
370 375 380
Met Leu Asn Ser Leu Tyr Gly Lys Phe Ala Ser Asn Pro Asp Val Thr
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Gly Lys Val Pro Tyr Leu Lys Glu Asn Gly Ala Leu Gly Phe Arg Leu
405 410 415
Gly Glu Glu Glu Thr Lys Asp Pro Val Tyr Thr Pro Met Gly Val Phe
420 425 430
Ile Thr Ala Trp Ala Arg Tyr Thr Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Cys
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Tyr Asp Arg Ile Ile Tyr Cys Asp Thr Asp Ser Ile His Leu Thr Gly
450 455 460
Thr Glu Ile Pro Asp Val Ile Lys Asp Ile Val Asp Pro Lys Lys Leu
465 470 475 480
Gly Tyr Trp Ala His Glu Ser Thr Phe Lys Arg Ala Lys Tyr Leu Arg
485 490 495
Gln Lys Thr Tyr Ile Gln Asp Ile Tyr Met Lys Glu Val Asp Gly Lys
500 505 510
Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Asp Tyr Thr Asp Ile Lys Phe Ser Val
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Lys Cys Ala Gly Met Thr Asp Lys Ile Lys Lys Glu Val Thr Phe Glu
530 535 540
Asn Phe Lys Val Gly Phe Ser Arg Lys Met Lys Pro Lys Pro Val Gln
545 550 555 560
Val Pro Gly Gly Val Val Leu Val Asp Asp Thr Phe Thr Ile Lys Ser
565 570 575
Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser
580 585 590
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
595 600 605
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<211> 1390
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 10
atgatgaacg atggcaaaca gcagagcacc ttcctgtttc atgattatga aaccttcggt 60
acccatccgg ccctggatcg tccggcgcag tttgcggcca ttcgcaccga tagcgaattc 120
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ggctataaca atgtgcgctt cgatgatgaa gttacccgta atatctttta tcgtaacttt 360
tatgatccgt atgcgtggag ctggcagcat gataacagcc gttgggatct gctggatgtg 420
atgcgcgcgt gctatgcgct gcgcccggaa ggcattaatt ggccggaaaa cgatgatggc 480
ctgccgagct ttcgtctgga acatctgacc aaagccaacg gcattgaaca tagcaatgcc 540
catgatgcga tggccgatgt ttatgcgacc attgcgatgg cgaaactggt taaaacccgt 600
cagccgcgcc tgtttgatta tctgtttacc caccgtaaca aacacaaact gatggcgctg 660
attgatgttc cgcagatgaa accgctggtg catgtgagcg gcatgtttgg cgcctggcgc 720
ggcaacacca gctgggtggc cccgctggcc tggcacccgg aaaatcgtaa cgccgtgatt 780
atggttgatc tggccggtga tattagcccg ctgctggaac tggatagcga taccctgcgt 840
gaacgcctgt ataccgccaa aaccgatctg ggcgataatg ccgccgtgcc ggtgaaactg 900
gttcacatta acaaatgccc ggtgctggcc caggcgaaca ccctgcgccc ggaagatgcg 960
gatcgtctgg gtattaatcg ccagcattgt ctggataatc tgaaaatcct gcgtgaaaac 1020
ccgcaggtgc gtgaaaaagt ggtggcgatc ttcgcggaag cggaaccgtt caccccgagc 1080
gataacgtgg atgcgcagct gtataacggc ttctttagcg atgccgatcg cgcggcgatg 1140
aaaatcgttc tggaaaccga accgcgcaat ctgccggcgc tggatattac ctttgttgat 1200
aaacgtattg aaaaactgct gtttaattat cgtgcgcgca attttccggg taccctggat 1260
tatgccgaac agcagcgttg gctggaacat cgtcgtcagg ttttcacccc ggaatttctg 1320
cagggttatg cggatgaact gcagatgctg gttcagcagt atgccgatga taaagaaaaa 1380
gtggcgctgc 1390
<210> 11
<211> 485
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 11
Met Met Asn Asp Gly Lys Gln Gln Ser Thr Phe Leu Phe His Asp Tyr
1 5 10 15
Glu Thr Phe Gly Thr His Pro Ala Leu Asp Arg Pro Ala Gln Phe Ala
20 25 30
Ala Ile Arg Thr Asp Ser Glu Phe Asn Val Ile Gly Glu Pro Glu Val
35 40 45
Phe Tyr Cys Lys Pro Ala Asp Asp Tyr Leu Pro Gln Pro Gly Ala Val
50 55 60
Leu Ile Thr Gly Ile Thr Pro Gln Glu Ala Arg Ala Lys Gly Glu Asn
65 70 75 80
Glu Ala Ala Phe Ala Ala Arg Ile His Ser Leu Phe Thr Val Pro Lys
85 90 95
Thr Cys Ile Leu Gly Tyr Asn Asn Val Arg Phe Asp Asp Glu Val Thr
100 105 110
Arg Asn Ile Phe Tyr Arg Asn Phe Tyr Asp Pro Tyr Ala Trp Ser Trp
115 120 125
Gln His Asp Asn Ser Arg Trp Asp Leu Leu Asp Val Met Arg Ala Cys
130 135 140
Tyr Ala Leu Arg Pro Glu Gly Ile Asn Trp Pro Glu Asn Asp Asp Gly
145 150 155 160
Leu Pro Ser Phe Arg Leu Glu His Leu Thr Lys Ala Asn Gly Ile Glu
165 170 175
His Ser Asn Ala His Asp Ala Met Ala Asp Val Tyr Ala Thr Ile Ala
180 185 190
Met Ala Lys Leu Val Lys Thr Arg Gln Pro Arg Leu Phe Asp Tyr Leu
195 200 205
Phe Thr His Arg Asn Lys His Lys Leu Met Ala Leu Ile Asp Val Pro
210 215 220
Gln Met Lys Pro Leu Val His Val Ser Gly Met Phe Gly Ala Trp Arg
225 230 235 240
Gly Asn Thr Ser Trp Val Ala Pro Leu Ala Trp His Pro Glu Asn Arg
245 250 255
Asn Ala Val Ile Met Val Asp Leu Ala Gly Asp Ile Ser Pro Leu Leu
260 265 270
Glu Leu Asp Ser Asp Thr Leu Arg Glu Arg Leu Tyr Thr Ala Lys Thr
275 280 285
Asp Leu Gly Asp Asn Ala Ala Val Pro Val Lys Leu Val His Ile Asn
290 295 300
Lys Cys Pro Val Leu Ala Gln Ala Asn Thr Leu Arg Pro Glu Asp Ala
305 310 315 320
Asp Arg Leu Gly Ile Asn Arg Gln His Cys Leu Asp Asn Leu Lys Ile
325 330 335
Leu Arg Glu Asn Pro Gln Val Arg Glu Lys Val Val Ala Ile Phe Ala
340 345 350
Glu Ala Glu Pro Phe Thr Pro Ser Asp Asn Val Asp Ala Gln Leu Tyr
355 360 365
Asn Gly Phe Phe Ser Asp Ala Asp Arg Ala Ala Met Lys Ile Val Leu
370 375 380
Glu Thr Glu Pro Arg Asn Leu Pro Ala Leu Asp Ile Thr Phe Val Asp
385 390 395 400
Lys Arg Ile Glu Lys Leu Leu Phe Asn Tyr Arg Ala Arg Asn Phe Pro
405 410 415
Gly Thr Leu Asp Tyr Ala Glu Gln Gln Arg Trp Leu Glu His Arg Arg
420 425 430
Gln Val Phe Thr Pro Glu Phe Leu Gln Gly Tyr Ala Asp Glu Leu Gln
435 440 445
Met Leu Val Gln Gln Tyr Ala Asp Asp Lys Glu Lys Val Ala Leu Leu
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Lys Ala Leu Trp Gln Tyr Ala Glu Glu Ile Val Ser Gly Ser Gly His
465 470 475 480
His His His His His
485
<210> 12
<211> 804
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 12
atgaaatttg tctcttttaa tatcaacggc ctgcgcgcca gacctcacca gcttgaagcc 60
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ggtaatgtca ccgtgatcaa cggttacttc ccgcagggtg aaagccgcga ccatccgata 360
aaattcccgg caaaagcgca gttttatcag aatctgcaaa actacctgga aaccgaactc 420
aaacgtgata atccggtact gattatgggc gatatgaata tcagccctac agatctggat 480
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<210> 13
<211> 268
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 13
Met Lys Phe Val Ser Phe Asn Ile Asn Gly Leu Arg Ala Arg Pro His
1 5 10 15
Gln Leu Glu Ala Ile Val Glu Lys His Gln Pro Asp Val Ile Gly Leu
20 25 30
Gln Glu Thr Lys Val His Asp Asp Met Phe Pro Leu Glu Glu Val Ala
35 40 45
Lys Leu Gly Tyr Asn Val Phe Tyr His Gly Gln Lys Gly His Tyr Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Pro Gly Asp Asp Glu Glu Ala Gln Arg Arg Ile Ile Met Ala Glu Ile
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100 105 110
Gly Glu Ser Arg Asp His Pro Ile Lys Phe Pro Ala Lys Ala Gln Phe
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Tyr Gln Asn Leu Gln Asn Tyr Leu Glu Thr Glu Leu Lys Arg Asp Asn
130 135 140
Pro Val Leu Ile Met Gly Asp Met Asn Ile Ser Pro Thr Asp Leu Asp
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Ile Gly Ile Gly Glu Glu Asn Arg Lys Arg Trp Leu Arg Thr Gly Lys
165 170 175
Cys Ser Phe Leu Pro Glu Glu Arg Glu Trp Met Asp Arg Leu Met Ser
180 185 190
Trp Gly Leu Val Asp Thr Phe Arg His Ala Asn Pro Gln Thr Ala Asp
195 200 205
Arg Phe Ser Trp Phe Asp Tyr Arg Ser Lys Gly Phe Asp Asp Asn Arg
210 215 220
Gly Leu Arg Ile Asp Leu Leu Leu Ala Ser Gln Pro Leu Ala Glu Cys
225 230 235 240
Cys Val Glu Thr Gly Ile Asp Tyr Glu Ile Arg Ser Met Glu Lys Pro
245 250 255
Ser Asp His Ala Pro Val Trp Ala Thr Phe Arg Arg
260 265
<210> 14
<211> 1275
<212> DNA
<213> Thermus thermophilus
<400> 14
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gatcatcata cgccgggcaa aacgccgccg ccgggtctgg tcgtgcatcc ggcgctgacg 420
ccggatctga aagaaaaacc gaccggcgca ggcgtggcgt ttctgctgct gtgggcactg 480
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ggcaaagcgg tcgaagtcgc tttccgcatc gcgccgcgca tcaatgcggc ttcccgcctg 720
ggcgaagcgg aaaaagccct gcgcctgctg ctgacggatg atgcggcaga agctcaggcg 780
ctggtcggcg aactgcaccg tctgaacgcc cgtcgtcaga ccctggaaga agcgatgctg 840
cgcaaactgc tgccgcaggc cgacccggaa gcgaaagcca tcgttctgct ggacccggaa 900
ggccatccgg gtgttatggg tattgtggcc tctcgcatcc tggaagcgac cctgcgcccg 960
gtctttctgg tggcccaggg caaaggcacc gtgcgttcgc tggctccgat ttccgccgtc 1020
gaagcactgc gcagcgcgga agatctgctg ctgcgttatg gtggtcataa agaagcggcg 1080
ggtttcgcaa tggatgaagc gctgtttccg gcgttcaaag cacgcgttga agcgtatgcc 1140
gcacgtttcc cggatccggt tcgtgaagtg gcactgctgg atctgctgcc ggaaccgggc 1200
ctgctgccgc aggtgttccg tgaactggca ctgctggaac cgtatggtga aggtaacccg 1260
gaaccgctgt tcctg 1275
<210> 15
<211> 425
<212> PRT
<213> Thermus thermophilus
<400> 15
Met Phe Arg Arg Lys Glu Asp Leu Asp Pro Pro Leu Ala Leu Leu Pro
1 5 10 15
Leu Lys Gly Leu Arg Glu Ala Ala Ala Leu Leu Glu Glu Ala Leu Arg
20 25 30
Gln Gly Lys Arg Ile Arg Val His Gly Asp Tyr Asp Ala Asp Gly Leu
35 40 45
Thr Gly Thr Ala Ile Leu Val Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gly Ala Asp
50 55 60
Val His Pro Phe Ile Pro His Arg Leu Glu Glu Gly Tyr Gly Val Leu
65 70 75 80
Met Glu Arg Val Pro Glu His Leu Glu Ala Ser Asp Leu Phe Leu Thr
85 90 95
Val Asp Cys Gly Ile Thr Asn His Ala Glu Leu Arg Glu Leu Leu Glu
100 105 110
Asn Gly Val Glu Val Ile Val Thr Asp His His Thr Pro Gly Lys Thr
115 120 125
Pro Pro Pro Gly Leu Val Val His Pro Ala Leu Thr Pro Asp Leu Lys
130 135 140
Glu Lys Pro Thr Gly Ala Gly Val Ala Phe Leu Leu Leu Trp Ala Leu
145 150 155 160
His Glu Arg Leu Gly Leu Pro Pro Pro Leu Glu Tyr Ala Asp Leu Ala
165 170 175
Ala Val Gly Thr Ile Ala Asp Val Ala Pro Leu Trp Gly Trp Asn Arg
180 185 190
Ala Leu Val Lys Glu Gly Leu Ala Arg Ile Pro Ala Ser Ser Trp Val
195 200 205
Gly Leu Arg Leu Leu Ala Glu Ala Val Gly Tyr Thr Gly Lys Ala Val
210 215 220
Glu Val Ala Phe Arg Ile Ala Pro Arg Ile Asn Ala Ala Ser Arg Leu
225 230 235 240
Gly Glu Ala Glu Lys Ala Leu Arg Leu Leu Leu Thr Asp Asp Ala Ala
245 250 255
Glu Ala Gln Ala Leu Val Gly Glu Leu His Arg Leu Asn Ala Arg Arg
260 265 270
Gln Thr Leu Glu Glu Ala Met Leu Arg Lys Leu Leu Pro Gln Ala Asp
275 280 285
Pro Glu Ala Lys Ala Ile Val Leu Leu Asp Pro Glu Gly His Pro Gly
290 295 300
Val Met Gly Ile Val Ala Ser Arg Ile Leu Glu Ala Thr Leu Arg Pro
305 310 315 320
Val Phe Leu Val Ala Gln Gly Lys Gly Thr Val Arg Ser Leu Ala Pro
325 330 335
Ile Ser Ala Val Glu Ala Leu Arg Ser Ala Glu Asp Leu Leu Leu Arg
340 345 350
Tyr Gly Gly His Lys Glu Ala Ala Gly Phe Ala Met Asp Glu Ala Leu
355 360 365
Phe Pro Ala Phe Lys Ala Arg Val Glu Ala Tyr Ala Ala Arg Phe Pro
370 375 380
Asp Pro Val Arg Glu Val Ala Leu Leu Asp Leu Leu Pro Glu Pro Gly
385 390 395 400
Leu Leu Pro Gln Val Phe Arg Glu Leu Ala Leu Leu Glu Pro Tyr Gly
405 410 415
Glu Gly Asn Pro Glu Pro Leu Phe Leu
420 425
<210> 16
<211> 738
<212> DNA
<213> Bacteriophage lambda
<400> 16
tccggaagcg gctctggtag tggttctggc atgacaccgg acattatcct gcagcgtacc 60
gggatcgatg tgagagctgt cgaacagggg gatgatgcgt ggcacaaatt acggctcggc 120
gtcatcaccg cttcagaagt tcacaacgtg atagcaaaac cccgctccgg aaagaagtgg 180
cctgacatga aaatgtccta cttccacacc ctgcttgctg aggtttgcac cggtgtggct 240
ccggaagtta acgctaaagc actggcctgg ggaaaacagt acgagaacga cgccagaacc 300
ctgtttgaat tcacttccgg cgtgaatgtt actgaatccc cgatcatcta tcgcgacgaa 360
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aaatgcccgt ttacctcccg ggatttcatg aagttccggc tcggtggttt cgaggccata 480
aagtcagctt acatggccca ggtgcagtac agcatgtggg tgacgcgaaa aaatgcctgg 540
tactttgcca actatgaccc gcgtatgaag cgtgaaggcc tgcattatgt cgtgattgag 600
cgggatgaaa agtacatggc gagttttgac gagatcgtgc cggagttcat cgaaaaaatg 660
gacgaggcac tggctgaaat tggttttgta tttggggagc aatggcgatc tggctctggt 720
tccggcagcg gttccgga 738
<210> 17
<211> 226
<212> PRT
<213> Bacteriophage lambda
<400> 17
Met Thr Pro Asp Ile Ile Leu Gln Arg Thr Gly Ile Asp Val Arg Ala
1 5 10 15
Val Glu Gln Gly Asp Asp Ala Trp His Lys Leu Arg Leu Gly Val Ile
20 25 30
Thr Ala Ser Glu Val His Asn Val Ile Ala Lys Pro Arg Ser Gly Lys
35 40 45
Lys Trp Pro Asp Met Lys Met Ser Tyr Phe His Thr Leu Leu Ala Glu
50 55 60
Val Cys Thr Gly Val Ala Pro Glu Val Asn Ala Lys Ala Leu Ala Trp
65 70 75 80
Gly Lys Gln Tyr Glu Asn Asp Ala Arg Thr Leu Phe Glu Phe Thr Ser
85 90 95
Gly Val Asn Val Thr Glu Ser Pro Ile Ile Tyr Arg Asp Glu Ser Met
100 105 110
Arg Thr Ala Cys Ser Pro Asp Gly Leu Cys Ser Asp Gly Asn Gly Leu
115 120 125
Glu Leu Lys Cys Pro Phe Thr Ser Arg Asp Phe Met Lys Phe Arg Leu
130 135 140
Gly Gly Phe Glu Ala Ile Lys Ser Ala Tyr Met Ala Gln Val Gln Tyr
145 150 155 160
Ser Met Trp Val Thr Arg Lys Asn Ala Trp Tyr Phe Ala Asn Tyr Asp
165 170 175
Pro Arg Met Lys Arg Glu Gly Leu His Tyr Val Val Ile Glu Arg Asp
180 185 190
Glu Lys Tyr Met Ala Ser Phe Asp Glu Ile Val Pro Glu Phe Ile Glu
195 200 205
Lys Met Asp Glu Ala Leu Ala Glu Ile Gly Phe Val Phe Gly Glu Gln
210 215 220
Trp Arg
225
<210> 18
<211> 760
<212> PRT
<213> Methanococcoides burtonii
<400> 18
Met Met Ile Arg Glu Leu Asp Ile Pro Arg Asp Ile Ile Gly Phe Tyr
1 5 10 15
Glu Asp Ser Gly Ile Lys Glu Leu Tyr Pro Pro Gln Ala Glu Ala Ile
20 25 30
Glu Met Gly Leu Leu Glu Lys Lys Asn Leu Leu Ala Ala Ile Pro Thr
35 40 45
Ala Ser Gly Lys Thr Leu Leu Ala Glu Leu Ala Met Ile Lys Ala Ile
50 55 60
Arg Glu Gly Gly Lys Ala Leu Tyr Ile Val Pro Leu Arg Ala Leu Ala
65 70 75 80
Ser Glu Lys Phe Glu Arg Phe Lys Glu Leu Ala Pro Phe Gly Ile Lys
85 90 95
Val Gly Ile Ser Thr Gly Asp Leu Asp Ser Arg Ala Asp Trp Leu Gly
100 105 110
Val Asn Asp Ile Ile Val Ala Thr Ser Glu Lys Thr Asp Ser Leu Leu
115 120 125
Arg Asn Gly Thr Ser Trp Met Asp Glu Ile Thr Thr Val Val Val Asp
130 135 140
Glu Ile His Leu Leu Asp Ser Lys Asn Arg Gly Pro Thr Leu Glu Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Lys Leu Met Arg Leu Asn Pro Asp Val Gln Val Val Ala
165 170 175
Leu Ser Ala Thr Val Gly Asn Ala Arg Glu Met Ala Asp Trp Leu Gly
180 185 190
Ala Ala Leu Val Leu Ser Glu Trp Arg Pro Thr Asp Leu His Glu Gly
195 200 205
Val Leu Phe Gly Asp Ala Ile Asn Phe Pro Gly Ser Gln Lys Lys Ile
210 215 220
Asp Arg Leu Glu Lys Asp Asp Ala Val Asn Leu Val Leu Asp Thr Ile
225 230 235 240
Lys Ala Glu Gly Gln Cys Leu Val Phe Glu Ser Ser Arg Arg Asn Cys
245 250 255
Ala Gly Phe Ala Lys Thr Ala Ser Ser Lys Val Ala Lys Ile Leu Asp
260 265 270
Asn Asp Ile Met Ile Lys Leu Ala Gly Ile Ala Glu Glu Val Glu Ser
275 280 285
Thr Gly Glu Thr Asp Thr Ala Ile Val Leu Ala Asn Cys Ile Arg Lys
290 295 300
Gly Val Ala Phe His His Ala Gly Leu Asn Ser Asn His Arg Lys Leu
305 310 315 320
Val Glu Asn Gly Phe Arg Gln Asn Leu Ile Lys Val Ile Ser Ser Thr
325 330 335
Pro Thr Leu Ala Ala Gly Leu Asn Leu Pro Ala Arg Arg Val Ile Ile
340 345 350
Arg Ser Tyr Arg Arg Phe Asp Ser Asn Phe Gly Met Gln Pro Ile Pro
355 360 365
Val Leu Glu Tyr Lys Gln Met Ala Gly Arg Ala Gly Arg Pro His Leu
370 375 380
Asp Pro Tyr Gly Glu Ser Val Leu Leu Ala Lys Thr Tyr Asp Glu Phe
385 390 395 400
Ala Gln Leu Met Glu Asn Tyr Val Glu Ala Asp Ala Glu Asp Ile Trp
405 410 415
Ser Lys Leu Gly Thr Glu Asn Ala Leu Arg Thr His Val Leu Ser Thr
420 425 430
Ile Val Asn Gly Phe Ala Ser Thr Arg Gln Glu Leu Phe Asp Phe Phe
435 440 445
Gly Ala Thr Phe Phe Ala Tyr Gln Gln Asp Lys Trp Met Leu Glu Glu
450 455 460
Val Ile Asn Asp Cys Leu Glu Phe Leu Ile Asp Lys Ala Met Val Ser
465 470 475 480
Glu Thr Glu Asp Ile Glu Asp Ala Ser Lys Leu Phe Leu Arg Gly Thr
485 490 495
Arg Leu Gly Ser Leu Val Ser Met Leu Tyr Ile Asp Pro Leu Ser Gly
500 505 510
Ser Lys Ile Val Asp Gly Phe Lys Asp Ile Gly Lys Ser Thr Gly Gly
515 520 525
Asn Met Gly Ser Leu Glu Asp Asp Lys Gly Asp Asp Ile Thr Val Thr
530 535 540
Asp Met Thr Leu Leu His Leu Val Cys Ser Thr Pro Asp Met Arg Gln
545 550 555 560
Leu Tyr Leu Arg Asn Thr Asp Tyr Thr Ile Val Asn Glu Tyr Ile Val
565 570 575
Ala His Ser Asp Glu Phe His Glu Ile Pro Asp Lys Leu Lys Glu Thr
580 585 590
Asp Tyr Glu Trp Phe Met Gly Glu Val Lys Thr Ala Met Leu Leu Glu
595 600 605
Glu Trp Val Thr Glu Val Ser Ala Glu Asp Ile Thr Arg His Phe Asn
610 615 620
Val Gly Glu Gly Asp Ile His Ala Leu Ala Asp Thr Ser Glu Trp Leu
625 630 635 640
Met His Ala Ala Ala Lys Leu Ala Glu Leu Leu Gly Val Glu Tyr Ser
645 650 655
Ser His Ala Tyr Ser Leu Glu Lys Arg Ile Arg Tyr Gly Ser Gly Leu
660 665 670
Asp Leu Met Glu Leu Val Gly Ile Arg Gly Val Gly Arg Val Arg Ala
675 680 685
Arg Lys Leu Tyr Asn Ala Gly Phe Val Ser Val Ala Lys Leu Lys Gly
690 695 700
Ala Asp Ile Ser Val Leu Ser Lys Leu Val Gly Pro Lys Val Ala Tyr
705 710 715 720
Asn Ile Leu Ser Gly Ile Gly Val Arg Val Asn Asp Lys His Phe Asn
725 730 735
Ser Ala Pro Ile Ser Ser Asn Thr Leu Asp Thr Leu Leu Asp Lys Asn
740 745 750
Gln Lys Thr Phe Asn Asp Phe Gln
755 760
<210> 19
<211> 707
<212> PRT
<213> Cenarchaeum symbiosum
<400> 19
Met Arg Ile Ser Glu Leu Asp Ile Pro Arg Pro Ala Ile Glu Phe Leu
1 5 10 15
Glu Gly Glu Gly Tyr Lys Lys Leu Tyr Pro Pro Gln Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Lys Ala Gly Leu Thr Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Ser Ala Pro Thr
35 40 45
Ala Ser Gly Lys Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala Met Ile Ser His Leu
50 55 60
Ser Arg Asn Arg Gly Lys Ala Val Tyr Leu Ser Pro Leu Arg Ala Leu
65 70 75 80
Ala Ala Glu Lys Phe Ala Glu Phe Gly Lys Ile Gly Gly Ile Pro Leu
85 90 95
Gly Arg Pro Val Arg Val Gly Val Ser Thr Gly Asp Phe Glu Lys Ala
100 105 110
Gly Arg Ser Leu Gly Asn Asn Asp Ile Leu Val Leu Thr Asn Glu Arg
115 120 125
Met Asp Ser Leu Ile Arg Arg Arg Pro Asp Trp Met Asp Glu Val Gly
130 135 140
Leu Val Ile Ala Asp Glu Ile His Leu Ile Gly Asp Arg Ser Arg Gly
145 150 155 160
Pro Thr Leu Glu Met Val Leu Thr Lys Leu Arg Gly Leu Arg Ser Ser
165 170 175
Pro Gln Val Val Ala Leu Ser Ala Thr Ile Ser Asn Ala Asp Glu Ile
180 185 190
Ala Gly Trp Leu Asp Cys Thr Leu Val His Ser Thr Trp Arg Pro Val
195 200 205
Pro Leu Ser Glu Gly Val Tyr Gln Asp Gly Glu Val Ala Met Gly Asp
210 215 220
Gly Ser Arg His Glu Val Ala Ala Thr Gly Gly Gly Pro Ala Val Asp
225 230 235 240
Leu Ala Ala Glu Ser Val Ala Glu Gly Gly Gln Ser Leu Ile Phe Ala
245 250 255
Asp Thr Arg Ala Arg Ser Ala Ser Leu Ala Ala Lys Ala Ser Ala Val
260 265 270
Ile Pro Glu Ala Lys Gly Ala Asp Ala Ala Lys Leu Ala Ala Ala Ala
275 280 285
Lys Lys Ile Ile Ser Ser Gly Gly Glu Thr Lys Leu Ala Lys Thr Leu
290 295 300
Ala Glu Leu Val Glu Lys Gly Ala Ala Phe His His Ala Gly Leu Asn
305 310 315 320
Gln Asp Cys Arg Ser Val Val Glu Glu Glu Phe Arg Ser Gly Arg Ile
325 330 335
Arg Leu Leu Ala Ser Thr Pro Thr Leu Ala Ala Gly Val Asn Leu Pro
340 345 350
Ala Arg Arg Val Val Ile Ser Ser Val Met Arg Tyr Asn Ser Ser Ser
355 360 365
Gly Met Ser Glu Pro Ile Ser Ile Leu Glu Tyr Lys Gln Leu Cys Gly
370 375 380
Arg Ala Gly Arg Pro Gln Tyr Asp Lys Ser Gly Glu Ala Ile Val Val
385 390 395 400
Gly Gly Val Asn Ala Asp Glu Ile Phe Asp Arg Tyr Ile Gly Gly Glu
405 410 415
Pro Glu Pro Ile Arg Ser Ala Met Val Asp Asp Arg Ala Leu Arg Ile
420 425 430
His Val Leu Ser Leu Val Thr Thr Ser Pro Gly Ile Lys Glu Asp Asp
435 440 445
Val Thr Glu Phe Phe Leu Gly Thr Leu Gly Gly Gln Gln Ser Gly Glu
450 455 460
Ser Thr Val Lys Phe Ser Val Ala Val Ala Leu Arg Phe Leu Gln Glu
465 470 475 480
Glu Gly Met Leu Gly Arg Arg Gly Gly Arg Leu Ala Ala Thr Lys Met
485 490 495
Gly Arg Leu Val Ser Arg Leu Tyr Met Asp Pro Met Thr Ala Val Thr
500 505 510
Leu Arg Asp Ala Val Gly Glu Ala Ser Pro Gly Arg Met His Thr Leu
515 520 525
Gly Phe Leu His Leu Val Ser Glu Cys Ser Glu Phe Met Pro Arg Phe
530 535 540
Ala Leu Arg Gln Lys Asp His Glu Val Ala Glu Met Met Leu Glu Ala
545 550 555 560
Gly Arg Gly Glu Leu Leu Arg Pro Val Tyr Ser Tyr Glu Cys Gly Arg
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Gly Leu Leu Ala Leu His Arg Trp Ile Gly Glu Ser Pro Glu Ala Lys
580 585 590
Leu Ala Glu Asp Leu Lys Phe Glu Ser Gly Asp Val His Arg Met Val
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Glu Ser Ser Gly Trp Leu Leu Arg Cys Ile Trp Glu Ile Ser Lys His
610 615 620
Gln Glu Arg Pro Asp Leu Leu Gly Glu Leu Asp Val Leu Arg Ser Arg
625 630 635 640
Val Ala Tyr Gly Ile Lys Ala Glu Leu Val Pro Leu Val Ser Ile Lys
645 650 655
Gly Ile Gly Arg Val Arg Ser Arg Arg Leu Phe Arg Gly Gly Ile Lys
660 665 670
Gly Pro Gly Asp Leu Ala Ala Val Pro Val Glu Arg Leu Ser Arg Val
675 680 685
Glu Gly Ile Gly Ala Thr Leu Ala Asn Asn Ile Lys Ser Gln Leu Arg
690 695 700
Lys Gly Gly
705
<210> 20
<211> 720
<212> PRT
<213> Thermococcus gammatolerans
<400> 20
Met Lys Val Asp Glu Leu Pro Val Asp Glu Arg Leu Lys Ala Val Leu
1 5 10 15
Lys Glu Arg Gly Ile Glu Glu Leu Tyr Pro Pro Gln Ala Glu Ala Leu
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Gly Arg Tyr Asp Ile Ile Val Ala Thr Ala Glu Lys Phe Asp Ser Leu
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Met Ile Leu Thr His Met Leu Gly Arg Ala Gln Ile Leu Ala Leu Ser
165 170 175
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180 185 190
Leu Val Val Ser Asp Trp Arg Pro Val Gln Leu Arg Arg Gly Val Phe
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
Ala Leu Ser Lys Leu Val Ser Ser His Leu Thr Lys Pro Glu Lys Arg
260 265 270
Ala Leu Glu Ser Leu Ala Ser Gln Leu Glu Asp Asn Pro Thr Ser Glu
275 280 285
Lys Leu Lys Arg Ala Leu Arg Gly Gly Val Ala Phe His His Ala Gly
290 295 300
Leu Ser Arg Val Glu Arg Thr Leu Ile Glu Asp Ala Phe Arg Glu Gly
305 310 315 320
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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Arg Ala Arg Ala Leu Tyr Asn Ala Gly Phe Arg Ser Val Glu Ala Ile
660 665 670
Ala Asn Ala Lys Pro Ala Glu Leu Leu Ala Val Glu Gly Ile Gly Ala
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Lys Ile Leu Asp Gly Ile Tyr Arg His Leu Gly Ile Glu Lys Arg Val
690 695 700
Thr Glu Glu Lys Pro Lys Arg Lys Gly Thr Leu Glu Asp Phe Leu Arg
705 710 715 720
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<212> PRT
<213> Methanospirillum hungatei
<400> 21
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Lys Ala Leu Ala Gln Glu Leu Arg Arg Leu Arg Asp Arg Asp Glu Gly
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Asp Trp Ala Asp Glu Phe Ser Glu Gly Met Ile Glu Glu Arg Tyr Gly
580 585 590
Ile Gly Ala Gly Asp Leu Tyr Asn Ile Val Asp Ser Gly Lys Trp Leu
595 600 605
Leu His Gly Thr Glu Arg Leu Val Ser Val Glu Met Pro Glu Met Ser
610 615 620
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<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 22
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225 230 235 240
Ile Arg Glu Ala Val Gly Glu Asp Ala Ser Leu Lys Ser Arg Asp Val
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325 330 335
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Val Ile Glu Arg Ala Arg Ala Gly Ile Asp Glu Ala Ile Ser Arg Glu
355 360 365
Gln Leu Ile Pro Leu Asp Arg Glu Lys Gly Leu Phe Thr Ser Gly Ile
370 375 380
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385 390 395 400
Lys Gln Asn Arg Val Thr Val His Pro Glu Lys Ser Val Pro Arg Thr
405 410 415
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Leu Ala Ile Val Ser Gly Gln Gly Gly Ala Ala Gly Gln Arg Glu Arg
435 440 445
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Ile Ile Ala Ala Asp Arg Arg Ser Gln Met Asn Leu Lys Gln Asp Glu
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Arg Leu Ser Gly Glu Leu Ile Thr Gly Arg Arg Gln Leu Leu Glu Gly
485 490 495
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Gln Gly Gly Glu Gln Arg Pro Ala Thr Ile Ile Ser Glu Pro Asp Arg
565 570 575
Asn Val Arg Tyr Ala Arg Leu Ala Gly Asp Phe Ala Ala Ser Val Lys
580 585 590
Ala Gly Glu Glu Ser Val Ala Gln Val Ser Gly Val Arg Glu Gln Ala
595 600 605
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610 615 620
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Ser Arg Ser Arg Tyr Leu Arg Asp Met Tyr Arg Pro Gly Met Val Met
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675 680 685
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1340 1345 1350
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1355 1360 1365
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1745 1750 1755
<210> 23
<211> 726
<212> PRT
<213> Methanococcoides burtonii
<400> 23
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Gln Gln Gln Leu Val Leu Phe Glu Gly Ala Cys Gly Thr Gly Lys Thr
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Leu Ser Ala Leu Val Pro Ala Leu His Val Gly Lys Met Leu Gly Lys
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130 135 140
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Lys Glu Ile Asp Ala Val Glu Glu Lys Ala Arg Gly Leu Arg Asp Arg
165 170 175
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180 185 190
Arg Glu Trp Leu Tyr Lys Glu Val Arg Ser Pro Glu Glu Ile Asn Asp
195 200 205
His Ala Ile Lys Asp Gly Met Cys Gly Tyr Glu Leu Val Lys Arg Glu
210 215 220
Leu Lys His Ala Asp Leu Leu Ile Cys Asn Tyr His His Val Leu Asn
225 230 235 240
Pro Asp Ile Phe Ser Thr Val Leu Gly Trp Ile Glu Lys Glu Pro Gln
245 250 255
Glu Thr Ile Val Ile Phe Asp Glu Ala His Asn Leu Glu Ser Ala Ala
260 265 270
Arg Ser His Ser Ser Leu Ser Leu Thr Glu His Ser Ile Glu Lys Ala
275 280 285
Ile Thr Glu Leu Glu Ala Asn Leu Asp Leu Leu Ala Asp Asp Asn Ile
290 295 300
His Asn Leu Phe Asn Ile Phe Leu Glu Val Ile Ser Asp Thr Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Arg Phe Lys Phe Gly Glu Arg Glu Arg Val Arg Lys Asn Trp Tyr
325 330 335
Asp Ile Arg Ile Ser Asp Pro Tyr Glu Arg Asn Asp Ile Val Arg Gly
340 345 350
Lys Phe Leu Arg Gln Ala Lys Gly Asp Phe Gly Glu Lys Asp Asp Ile
355 360 365
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370 375 380
Thr Tyr Arg Asp Gln Tyr Lys Lys Gly Leu Ser Ser Val Met Lys Arg
385 390 395 400
Ser His Ile Arg Tyr Val Ala Asp Phe Met Ser Ala Tyr Ile Glu Leu
405 410 415
Ser His Asn Leu Asn Tyr Tyr Pro Ile Leu Asn Val Arg Arg Asp Met
420 425 430
Asn Asp Glu Ile Tyr Gly Arg Val Glu Leu Phe Thr Cys Ile Pro Lys
435 440 445
Asn Val Thr Glu Pro Leu Phe Asn Ser Leu Phe Ser Val Ile Leu Met
450 455 460
Ser Ala Thr Leu His Pro Phe Glu Met Val Lys Lys Thr Leu Gly Ile
465 470 475 480
Thr Arg Asp Thr Cys Glu Met Ser Tyr Gly Thr Ser Phe Pro Glu Glu
485 490 495
Lys Arg Leu Ser Ile Ala Val Ser Ile Pro Pro Leu Phe Ala Lys Asn
500 505 510
Arg Asp Asp Arg His Val Thr Glu Leu Leu Glu Gln Val Leu Leu Asp
515 520 525
Ser Ile Glu Asn Ser Lys Gly Asn Val Ile Leu Phe Phe Gln Ser Ala
530 535 540
Phe Glu Ala Lys Arg Tyr Tyr Ser Lys Ile Glu Pro Leu Val Asn Val
545 550 555 560
Pro Val Phe Leu Asp Glu Val Gly Ile Ser Ser Gln Asp Val Arg Glu
565 570 575
Glu Phe Phe Ser Ile Gly Glu Glu Asn Gly Lys Ala Val Leu Leu Ser
580 585 590
Tyr Leu Trp Gly Thr Leu Ser Glu Gly Ile Asp Tyr Arg Asp Gly Arg
595 600 605
Gly Arg Thr Val Ile Ile Ile Gly Val Gly Tyr Pro Ala Leu Asn Asp
610 615 620
Arg Met Asn Ala Val Glu Ser Ala Tyr Asp His Val Phe Gly Tyr Gly
625 630 635 640
Ala Gly Trp Glu Phe Ala Ile Gln Val Pro Thr Ile Arg Lys Ile Arg
645 650 655
Gln Ala Met Gly Arg Val Val Arg Ser Pro Thr Asp Tyr Gly Ala Arg
660 665 670
Ile Leu Leu Asp Gly Arg Phe Leu Thr Asp Ser Lys Lys Arg Phe Gly
675 680 685
Lys Phe Ser Val Phe Glu Val Phe Pro Pro Ala Glu Arg Ser Glu Phe
690 695 700
Val Asp Val Asp Pro Glu Lys Val Lys Tyr Ser Leu Met Asn Phe Phe
705 710 715 720
Met Asp Asn Asp Glu Gln
725
<210> 24
<211> 439
<212> PRT
<213> Dickeya dadantii
<400> 24
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20 25 30
Pro Ala Gly Thr Gly Lys Thr Thr Leu Thr Lys Phe Ile Ile Glu Ala
35 40 45
Leu Ile Ser Thr Gly Glu Thr Gly Ile Ile Leu Ala Ala Pro Thr His
50 55 60
Ala Ala Lys Lys Ile Leu Ser Lys Leu Ser Gly Lys Glu Ala Ser Thr
65 70 75 80
Ile His Ser Ile Leu Lys Ile Asn Pro Val Thr Tyr Glu Glu Asn Val
85 90 95
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385 390 395 400
Met Ser Val Asp Arg Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Cys Ile His Tyr Ala
405 410 415
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435
<210> 25
<211> 970
<212> PRT
<213> Unknown
<400> 25
Met Leu Ser Val Ala Asn Val Arg Ser Pro Ser Ala Ala Ala Ser Tyr
1 5 10 15
Phe Ala Ser Asp Asn Tyr Tyr Ala Ser Ala Asp Ala Asp Arg Ser Gly
20 25 30
Gln Trp Ile Gly Asp Gly Ala Lys Arg Leu Gly Leu Glu Gly Lys Val
35 40 45
Glu Ala Arg Ala Phe Asp Ala Leu Leu Arg Gly Glu Leu Pro Asp Gly
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Thr Phe Ser Val Pro Lys Ser Trp Ser Leu Leu Ala Leu Val Gly Lys
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100 105 110
His Trp Ala Glu Lys Asn Ala Ala Glu Thr Arg Val Val Glu Lys Gly
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Asn Asp Arg Leu Trp Gln Leu Asn Thr Thr Leu Asn Ser Ile Ala Met
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Ala Arg Phe Arg Val Ala Val Glu Lys Leu Gly Tyr Glu Pro Gly Pro
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210 215 220
Val Met Ala Phe Ser Thr Arg Arg Lys Glu Val Leu Glu Ala Arg Arg
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Gly Pro Gly Leu Asp Ala Gly Arg Ile Ala Ala Leu Asp Thr Arg Ala
245 250 255
Ser Lys Glu Gly Ile Glu Asp Arg Ala Thr Leu Ser Lys Gln Trp Ser
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Glu Ala Ala Gln Ser Ile Gly Leu Asp Leu Lys Pro Leu Val Asp Arg
275 280 285
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Ser Leu Val Glu Arg Gly Arg Ala Trp Leu Ser Arg Phe Ala Ala His
305 310 315 320
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340 345 350
Arg His Leu Ser Gln Arg Glu Ala Ala Phe Glu Arg Thr Ala Leu Tyr
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Lys Ala Ala Leu Asp Phe Gly Leu Pro Thr Thr Ile Ala Asp Val Glu
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Lys Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Ser Gly Asp Leu Ile Ala Gly Lys
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Gly Glu His Lys Gly Trp Leu Ala Ser Arg Asp Ala Val Val Thr Glu
405 410 415
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435 440 445
Thr Gly Gln Gly Phe Arg Leu Asn Glu Gly Gln Leu Ala Ala Ala Arg
450 455 460
Leu Ile Leu Ile Ser Lys Asp Arg Thr Ile Ala Val Gln Gly Ile Ala
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Gly Ala Gly Lys Ser Ser Val Leu Lys Pro Val Ala Glu Val Leu Arg
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Leu Ala Asn Leu Ala Gly Val His Arg Leu Val Leu Ile Gly Asp Arg
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645 650 655
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<212> PRT
<213> yokenella regensburgei
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<213> rahnella aquatilis
<400> 28
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260
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<212> PRT
<213> kluyvera ascobata
<400> 29
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Ile Val Pro
<210> 30
<211> 259
<212> PRT
<213> hafnia alvei
<400> 30
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Ile Val Pro
<210> 31
<211> 255
<212> PRT
<213> Enterobacteriaceae bacterium
<400> 31
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Leu Arg Ile Val Asn Val His Thr Gly Glu Val Leu Ser Ser Val Asn
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Phe Ile Asp Tyr Gln Arg Leu Leu Glu Gly Glu Ala Gly Phe Thr Thr
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Asn Ala Ala Asp Ile Asn Ser Glu Val Leu Thr Arg Tyr Arg Lys
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<210> 32
<211> 258
<212> PRT
<213> plesiomonas shigelloides
<400> 32
Ile Thr Glu Val Pro Lys Glu Ala Ala Lys Pro Thr Leu Met Pro Arg
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195 200 205
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225 230 235 240
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Val Pro
<210> 33
<211> 248
<212> PRT
<213> Vibrio fischeri
<400> 33
Pro Glu Thr Ser Glu Ser Pro Thr Leu Met Gln Arg Gly Ala Asn Tyr
1 5 10 15
Ile Asp Leu Ile Ser Leu Pro Lys Pro Gln Gly Lys Ile Phe Val Ser
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Val Tyr Asp Phe Arg Asp Gln Thr Gly Gln Tyr Lys Pro Gln Pro Asn
35 40 45
Ser Asn Phe Ser Thr Ala Val Pro Gln Gly Gly Thr Ala Leu Leu Thr
50 55 60
Met Ala Leu Leu Asp Ser Glu Trp Phe Tyr Pro Leu Glu Arg Gln Gly
65 70 75 80
Leu Gln Asn Leu Leu Thr Glu Arg Lys Ile Ile Arg Ala Ala Gln Lys
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Lys Gln Glu Ser Ile Ser Asn His Gly Ser Thr Leu Pro Ser Leu Leu
100 105 110
Ser Ala Asn Val Met Ile Glu Gly Gly Ile Val Ala Tyr Asp Ser Asn
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Ile Lys Thr Gly Gly Ala Gly Ala Arg Tyr Leu Gly Ile Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gln Tyr Arg Ala Asp Gln Val Thr Val Asn Ile Arg Ala Val Asp
145 150 155 160
Val Arg Ser Gly Lys Ile Leu Thr Ser Val Thr Thr Ser Lys Thr Ile
165 170 175
Leu Ser Tyr Glu Val Ser Ala Gly Ala Phe Arg Phe Val Asp Tyr Lys
180 185 190
Glu Leu Leu Glu Val Glu Leu Gly Tyr Thr Asn Asn Glu Pro Val Asn
195 200 205
Ile Ala Leu Met Ser Ala Ile Asp Ser Ala Val Ile His Leu Ile Val
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Lys Gly Val Gln Gln Gly Leu Trp Arg Pro Ala Asn Leu Asp Thr Arg
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Asn Asn Pro Ile Phe Lys Lys Tyr
245
<210> 34
<211> 248
<212> PRT
<213> Aliivibrio logei
<400> 34
Pro Asp Ala Ser Glu Ser Pro Thr Leu Met Gln Arg Gly Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Leu Asp Leu Ile Ser Leu Pro Lys Pro Gln Gly Lys Ile Tyr Val Ser
20 25 30
Val Tyr Asp Phe Arg Asp Gln Thr Gly Gln Tyr Lys Pro Gln Pro Asn
35 40 45
Ser Asn Phe Ser Thr Ala Val Pro Gln Gly Gly Thr Ala Leu Leu Thr
50 55 60
Met Ala Leu Leu Asp Ser Glu Trp Phe Tyr Pro Leu Glu Arg Gln Gly
65 70 75 80
Leu Gln Asn Leu Leu Thr Glu Arg Lys Ile Ile Arg Ala Ala Gln Lys
85 90 95
Lys Gln Glu Ser Ile Ser Asn His Gly Ser Thr Leu Pro Ser Leu Leu
100 105 110
Ser Ala Asn Val Met Ile Glu Gly Gly Ile Val Ala Tyr Asp Ser Asn
115 120 125
Ile Lys Thr Gly Gly Ala Gly Ala Arg Tyr Leu Gly Ile Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gln Tyr Arg Ala Asp Gln Val Thr Val Asn Ile Arg Ala Val Asp
145 150 155 160
Val Arg Ser Gly Lys Ile Leu Thr Ser Val Thr Thr Ser Lys Thr Ile
165 170 175
Leu Ser Tyr Glu Leu Ser Ala Gly Ala Phe Arg Phe Val Asp Tyr Lys
180 185 190
Glu Leu Leu Glu Val Glu Leu Gly Tyr Thr Asn Asn Glu Pro Val Asn
195 200 205
Ile Ala Leu Met Ser Ala Ile Asp Ser Ala Val Ile His Leu Ile Val
210 215 220
Lys Gly Ile Glu Glu Gly Leu Trp Arg Pro Glu Asn Gln Asn Gly Lys
225 230 235 240
Glu Asn Pro Ile Phe Arg Lys Tyr
245
<210> 35
<211> 254
<212> PRT
<213> Photobacterium sp
<400> 35
Pro Glu Thr Ser Lys Glu Pro Thr Leu Met Ala Arg Gly Thr Ala Tyr
1 5 10 15
Gln Asp Leu Val Ser Leu Pro Leu Pro Lys Gly Lys Val Tyr Val Ser
20 25 30
Val Tyr Asp Phe Arg Asp Gln Thr Gly Gln Tyr Lys Pro Gln Pro Asn
35 40 45
Ser Asn Phe Ser Thr Ala Val Pro Gln Gly Gly Ala Ala Leu Leu Thr
50 55 60
Thr Ala Leu Leu Asp Ser Arg Trp Phe Met Pro Leu Glu Arg Glu Gly
65 70 75 80
Leu Gln Asn Leu Leu Thr Glu Arg Lys Ile Ile Arg Ala Ala Gln Lys
85 90 95
Lys Asp Glu Ile Pro Thr Asn His Gly Val His Leu Pro Ser Leu Ala
100 105 110
Ser Ala Asn Ile Met Val Glu Gly Gly Ile Val Ala Tyr Asp Thr Asn
115 120 125
Ile Gln Thr Gly Gly Ala Gly Ala Arg Tyr Leu Gly Val Gly Ala Ser
130 135 140
Gly Gln Tyr Arg Thr Asp Gln Val Thr Val Asn Ile Arg Ala Val Asp
145 150 155 160
Val Arg Thr Gly Arg Ile Leu Leu Ser Val Thr Thr Ser Lys Thr Ile
165 170 175
Leu Ser Lys Glu Leu Gln Thr Gly Val Phe Lys Phe Val Asp Tyr Lys
180 185 190
Asp Leu Leu Glu Ala Glu Leu Gly Tyr Thr Thr Asn Glu Pro Val Asn
195 200 205
Leu Ala Val Met Ser Ala Ile Asp Ala Ala Val Val His Val Ile Val
210 215 220
Asp Gly Ile Lys Thr Gly Leu Trp Glu Pro Leu Arg Gly Glu Asp Leu
225 230 235 240
Gln His Pro Ile Ile Gln Glu Tyr Met Asn Arg Ser Lys Pro
245 250
<210> 36
<211> 261
<212> PRT
<213> Aeromonas veronii
<400> 36
Cys Ala Thr His Ile Gly Ser Pro Val Ala Asp Glu Lys Ala Thr Leu
1 5 10 15
Met Pro Arg Ser Val Ser Tyr Lys Glu Leu Ile Ser Leu Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Gly Lys Ile Val Ala Ala Val Tyr Asp Phe Arg Asp Gln Thr Gly
35 40 45
Gln Tyr Leu Pro Ala Pro Ala Ser Asn Phe Ser Thr Ala Val Thr Gln
50 55 60
Gly Gly Val Ala Met Leu Ser Thr Ala Leu Trp Asp Ser Gln Trp Phe
65 70 75 80
Val Pro Leu Glu Arg Glu Gly Leu Gln Asn Leu Leu Thr Glu Arg Lys
85 90 95
Ile Val Arg Ala Ala Gln Asn Lys Pro Asn Val Pro Gly Asn Asn Ala
100 105 110
Asn Gln Leu Pro Ser Leu Val Ala Ala Asn Ile Leu Ile Glu Gly Gly
115 120 125
Ile Val Ala Tyr Asp Ser Asn Val Arg Thr Gly Gly Ala Gly Ala Lys
130 135 140
Tyr Phe Gly Ile Gly Ala Ser Gly Glu Tyr Arg Val Asp Gln Val Thr
145 150 155 160
Val Asn Leu Arg Ala Val Asp Ile Arg Ser Gly Arg Ile Leu Asn Ser
165 170 175
Val Thr Thr Ser Lys Thr Val Met Ser Gln Gln Val Gln Ala Gly Val
180 185 190
Phe Arg Phe Val Glu Tyr Lys Arg Leu Leu Glu Ala Glu Ala Gly Phe
195 200 205
Ser Thr Asn Glu Pro Val Gln Met Cys Val Met Ser Ala Ile Glu Ser
210 215 220
Gly Val Ile Arg Leu Ile Ala Asn Gly Val Arg Asp Asn Leu Trp Gln
225 230 235 240
Leu Ala Asp Gln Arg Asp Ile Asp Asn Pro Ile Leu Gln Glu Tyr Leu
245 250 255
Gln Asp Asn Ala Pro
260
<210> 37
<211> 239
<212> PRT
<213> Shewanella sp.
<400> 37
Ala Ser Ser Ser Leu Met Pro Lys Gly Glu Ser Tyr Tyr Asp Leu Ile
1 5 10 15
Asn Leu Pro Ala Pro Gln Gly Val Met Leu Ala Ala Val Tyr Asp Phe
20 25 30
Arg Asp Gln Thr Gly Gln Tyr Lys Pro Ile Pro Ser Ser Asn Phe Ser
35 40 45
Thr Ala Val Pro Gln Ser Gly Thr Ala Phe Leu Ala Gln Ala Leu Asn
50 55 60
Asp Ser Ser Trp Phe Ile Pro Val Glu Arg Glu Gly Leu Gln Asn Leu
65 70 75 80
Leu Thr Glu Arg Lys Ile Val Arg Ala Gly Leu Lys Gly Asp Ala Asn
85 90 95
Lys Leu Pro Gln Leu Asn Ser Ala Gln Ile Leu Met Glu Gly Gly Ile
100 105 110
Val Ala Tyr Asp Thr Asn Val Arg Thr Gly Gly Ala Gly Ala Arg Tyr
115 120 125
Leu Gly Ile Gly Ala Ala Thr Gln Phe Arg Val Asp Thr Val Thr Val
130 135 140
Asn Leu Arg Ala Val Asp Ile Arg Thr Gly Arg Leu Leu Ser Ser Val
145 150 155 160
Thr Thr Thr Lys Ser Ile Leu Ser Lys Glu Ile Thr Ala Gly Val Phe
165 170 175
Lys Phe Ile Asp Ala Gln Glu Leu Leu Glu Ser Glu Leu Gly Tyr Thr
180 185 190
Ser Asn Glu Pro Val Ser Leu Cys Val Ala Ser Ala Ile Glu Ser Ala
195 200 205
Val Val His Met Ile Ala Asp Gly Ile Trp Lys Gly Ala Trp Asn Leu
210 215 220
Ala Asp Gln Ala Ser Gly Leu Arg Ser Pro Val Leu Gln Lys Tyr
225 230 235
<210> 38
<211> 233
<212> PRT
<213> Pseudomonas putida
<400> 38
Gln Asp Ser Glu Thr Pro Thr Leu Thr Pro Arg Ala Ser Thr Tyr Tyr
1 5 10 15
Asp Leu Ile Asn Met Pro Arg Pro Lys Gly Arg Leu Met Ala Val Val
20 25 30
Tyr Gly Phe Arg Asp Gln Thr Gly Gln Tyr Lys Pro Thr Pro Ala Ser
35 40 45
Ser Phe Ser Thr Ser Val Thr Gln Gly Ala Ala Ser Met Leu Met Asp
50 55 60
Ala Leu Ser Ala Ser Gly Trp Phe Val Val Leu Glu Arg Glu Gly Leu
65 70 75 80
Gln Asn Leu Leu Thr Glu Arg Lys Ile Ile Arg Ala Ser Gln Lys Lys
85 90 95
Pro Asp Val Ala Glu Asn Ile Met Gly Glu Leu Pro Pro Leu Gln Ala
100 105 110
Ala Asn Leu Met Leu Glu Gly Gly Ile Ile Ala Tyr Asp Thr Asn Val
115 120 125
Arg Ser Gly Gly Glu Gly Ala Arg Tyr Leu Gly Ile Asp Ile Ser Arg
130 135 140
Glu Tyr Arg Val Asp Gln Val Thr Val Asn Leu Arg Ala Val Asp Val
145 150 155 160
Arg Thr Gly Gln Val Leu Ala Asn Val Met Thr Ser Lys Thr Ile Tyr
165 170 175
Ser Val Gly Arg Ser Ala Gly Val Phe Lys Phe Ile Glu Phe Lys Lys
180 185 190
Leu Leu Glu Ala Glu Val Gly Tyr Thr Thr Asn Glu Pro Ala Gln Leu
195 200 205
Cys Val Leu Ser Ala Ile Glu Ser Ala Val Gly His Leu Leu Ala Gln
210 215 220
Gly Ile Glu Gln Arg Leu Trp Gln Val
225 230
<210> 39
<211> 234
<212> PRT
<213> Shewanella violacea
<400> 39
Met Pro Lys Ser Asp Thr Tyr Tyr Asp Leu Ile Gly Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Gln Gly Ser Met Leu Ala Ala Val Tyr Asp Phe Arg Asp Gln Thr Gly
20 25 30
Gln Tyr Lys Ala Ile Pro Ser Ser Asn Phe Ser Thr Ala Val Pro Gln
35 40 45
Ser Gly Thr Ala Phe Leu Ala Gln Ala Leu Asn Asp Ser Ser Trp Phe
50 55 60
Val Pro Val Glu Arg Glu Gly Leu Gln Asn Leu Leu Thr Glu Arg Lys
65 70 75 80
Ile Val Arg Ala Gly Leu Lys Gly Glu Ala Asn Gln Leu Pro Gln Leu
85 90 95
Ser Ser Ala Gln Ile Leu Met Glu Gly Gly Ile Val Ala Tyr Asp Thr
100 105 110
Asn Ile Lys Thr Gly Gly Ala Gly Ala Arg Tyr Leu Gly Ile Gly Val
115 120 125
Asn Ser Lys Phe Arg Val Asp Thr Val Thr Val Asn Leu Arg Ala Val
130 135 140
Asp Ile Arg Thr Gly Arg Leu Leu Ser Ser Val Thr Thr Thr Lys Ser
145 150 155 160
Ile Leu Ser Lys Glu Val Ser Ala Gly Val Phe Lys Phe Ile Asp Ala
165 170 175
Gln Asp Leu Leu Glu Ser Glu Leu Gly Tyr Thr Ser Asn Glu Pro Val
180 185 190
Ser Leu Cys Val Ala Gln Ala Ile Glu Ser Ala Val Val His Met Ile
195 200 205
Ala Asp Gly Ile Trp Lys Arg Ala Trp Asn Leu Ala Asp Thr Ala Ser
210 215 220
Gly Leu Asn Asn Pro Val Leu Gln Lys Tyr
225 230
<210> 40
<211> 245
<212> PRT
<213> Marinobacterium jannaschii
<400> 40
Leu Thr Arg Arg Met Ser Thr Tyr Gln Asp Leu Ile Asp Met Pro Ala
1 5 10 15
Pro Arg Gly Lys Ile Val Thr Ala Val Tyr Ser Phe Arg Asp Gln Ser
20 25 30
Gly Gln Tyr Lys Pro Ala Pro Ser Ser Ser Phe Ser Thr Ala Val Thr
35 40 45
Gln Gly Ala Ala Ala Met Leu Val Asn Val Leu Asn Asp Ser Gly Trp
50 55 60
Phe Ile Pro Leu Glu Arg Glu Gly Leu Gln Asn Ile Leu Thr Glu Arg
65 70 75 80
Lys Ile Ile Arg Ala Ala Leu Lys Lys Asp Asn Val Pro Val Asn Asn
85 90 95
Ser Ala Gly Leu Pro Ser Leu Leu Ala Ala Asn Ile Met Leu Glu Gly
100 105 110
Gly Ile Val Gly Tyr Asp Ser Asn Ile His Thr Gly Gly Ala Gly Ala
115 120 125
Arg Tyr Phe Gly Ile Gly Ala Ser Glu Lys Tyr Arg Val Asp Glu Val
130 135 140
Thr Val Asn Leu Arg Ala Ile Asp Ile Arg Thr Gly Arg Ile Leu His
145 150 155 160
Ser Val Leu Thr Ser Lys Lys Ile Leu Ser Arg Glu Ile Arg Ser Asp
165 170 175
Val Tyr Arg Phe Ile Glu Phe Lys His Leu Leu Glu Met Glu Ala Gly
180 185 190
Ile Thr Thr Asn Asp Pro Ala Gln Leu Cys Val Leu Ser Ala Ile Glu
195 200 205
Ser Ala Val Ala His Leu Ile Val Asp Gly Val Ile Lys Lys Ser Trp
210 215 220
Ser Leu Ala Asp Pro Asn Glu Leu Asn Ser Pro Val Ile Gln Ala Tyr
225 230 235 240
Gln Gln Gln Arg Ile
245
<210> 41
<211> 234
<212> PRT
<213> Chryseobacterium oranimense
<400> 41
Pro Ser Asp Pro Glu Arg Ser Thr Met Gly Glu Leu Thr Pro Ser Thr
1 5 10 15
Ala Glu Leu Arg Asn Leu Pro Leu Pro Asn Glu Lys Ile Val Ile Gly
20 25 30
Val Tyr Lys Phe Arg Asp Gln Thr Gly Gln Tyr Lys Pro Ser Glu Asn
35 40 45
Gly Asn Asn Trp Ser Thr Ala Val Pro Gln Gly Thr Thr Thr Ile Leu
50 55 60
Ile Lys Ala Leu Glu Asp Ser Arg Trp Phe Ile Pro Ile Glu Arg Glu
65 70 75 80
Asn Ile Ala Asn Leu Leu Asn Glu Arg Gln Ile Ile Arg Ser Thr Arg
85 90 95
Gln Glu Tyr Met Lys Asp Ala Asp Lys Asn Ser Gln Ser Leu Pro Pro
100 105 110
Leu Leu Tyr Ala Gly Ile Leu Leu Glu Gly Gly Val Ile Ser Tyr Asp
115 120 125
Ser Asn Thr Met Thr Gly Gly Phe Gly Ala Arg Tyr Phe Gly Ile Gly
130 135 140
Ala Ser Thr Gln Tyr Arg Gln Asp Arg Ile Thr Ile Tyr Leu Arg Ala
145 150 155 160
Val Ser Thr Leu Asn Gly Glu Ile Leu Lys Thr Val Tyr Thr Ser Lys
165 170 175
Thr Ile Leu Ser Thr Ser Val Asn Gly Ser Phe Phe Arg Tyr Ile Asp
180 185 190
Thr Glu Arg Leu Leu Glu Ala Glu Val Gly Leu Thr Gln Asn Glu Pro
195 200 205
Val Gln Leu Ala Val Thr Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Arg Ser Leu
210 215 220
Ile Ile Glu Gly Thr Arg Asp Lys Ile Trp
225 230
<210> 42
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Example 2
<400> 42
tttttttttt tt 12
<210> 43
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Example 2
<400> 43
ggttgtttct gttggtgctg atattgc 27
<210> 44
<211> 3635
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Example 2
<400> 44
gccatcagat tgtgtttgtt agtcgctgcc atcagattgt gtttgttagt cgcttttttt 60
ttttggaatt ttttttttgg aatttttttt ttgcgctaac aacctcctgc cgttttgccc 120
gtgcatatcg gtcacgaaca aatctgatta ctaaacacag tagcctggat ttgttctatc 180
agtaatcgac cttattccta attaaataga gcaaatcccc ttattggggg taagacatga 240
agatgccaga aaaacatgac ctgttggccg ccattctcgc ggcaaaggaa caaggcatcg 300
gggcaatcct tgcgtttgca atggcgtacc ttcgcggcag atataatggc ggtgcgttta 360
caaaaacagt aatcgacgca acgatgtgcg ccattatcgc ctagttcatt cgtgaccttc 420
tcgacttcgc cggactaagt agcaatctcg cttatataac gagcgtgttt atcggctaca 480
tcggtactga ctcgattggt tcgcttatca aacgcttcgc tgctaaaaaa gccggagtag 540
aagatggtag aaatcaataa tcaacgtaag gcgttcctcg atatgctggc gtggtcggag 600
ggaactgata acggacgtca gaaaaccaga aatcatggtt atgacgtcat tgtaggcgga 660
gagctattta ctgattactc cgatcaccct cgcaaacttg tcacgctaaa cccaaaactc 720
aaatcaacag gcgccggacg ctaccagctt ctttcccgtt ggtgggatgc ctaccgcaag 780
cagcttggcc tgaaagactt ctctccgaaa agtcaggacg ctgtggcatt gcagcagatt 840
aaggagcgtg gcgctttacc tatgattgat cgtggtgata tccgtcaggc aatcgaccgt 900
tgcagcaata tctgggcttc actgccgggc gctggttatg gtcagttcga gcataaggct 960
gacagcctga ttgcaaaatt caaagaagcg ggcggaacgg tcagagagat tgatgtatga 1020
gcagagtcac cgcgattatc tccgctctgg ttatctgcat catcgtctgc ctgtcatggg 1080
ctgttaatca ttaccgtgat aacgccatta cctacaaagc ccagcgcgac aaaaatgcca 1140
gagaactgaa gctggcgaac gcggcaatta ctgacatgca gatgcgtcag cgtgatgttg 1200
ctgcgctcga tgcaaaatac acgaaggagt tagctgatgc taaagctgaa aatgatgctc 1260
tgcgtgatga tgttgccgct ggtcgtcgtc ggttgcacat caaagcagtc tgtcagtcag 1320
tgcgtgaagc caccaccgcc tccggcgtgg ataatgcagc ctccccccga ctggcagaca 1380
ccgctgaacg ggattatttc accctcagag agaggctgat cactatgcaa aaacaactgg 1440
aaggaaccca gaagtatatt aatgagcagt gcagatagag ttgcccatat cgatgggcaa 1500
ctcatgcaat tattgtgagc aatacacacg cgcttccagc ggagtataaa tgcctaaagt 1560
aataaaaccg agcaatccat ttacgaatgt ttgctgggtt tctgttttaa caacattttc 1620
tgcgccgcca caaattttgg ctgcatcgac agttttcttc tgcccaattc cagaaacgaa 1680
gaaatgatgg gtgatggttt cctttggtgc tactgctgcc ggtttgtttt gaacagtaaa 1740
cgtctgttga gcacatcctg taataagcag ggccagcgca gtagcgagta gcattttttt 1800
catggtgtta ttcccgatgc tttttgaagt tcgcagaatc gtatgtgtag aaaattaaac 1860
aaaccctaaa caatgagttg aaatttcata ttgttaatat ttattaatgt atgtcaggtg 1920
cgatgaatcg tcattgtatt cccggattaa ctatgtccac agccctgacg gggaacttct 1980
ctgcgggagt gtccgggaat aattaaaacg atgcacacag ggtttagcgc gtacacgtat 2040
tgcattatgc caacgccccg gtgctgacac ggaagaaacc ggacgttatg atttagcgtg 2100
gaaagatttg tgtagtgttc tgaatgctct cagtaaatag taatgaatta tcaaaggtat 2160
agtaatatct tttatgttca tggatatttg taacccatcg gaaaactcct gctttagcaa 2220
gattttccct gtattgctga aatgtgattt ctcttgattt caacctatca taggacgttt 2280
ctataagatg cgtgtttctt gagaatttaa catttacaac ctttttaagt ccttttatta 2340
acacggtgtt atcgttttct aacacgatgt gaatattatc tgtggctaga tagtaaatat 2400
aatgtgagac gttgtgacgt tttagttcag aataaaacaa ttcacagtct aaatcttttc 2460
gcacttgatc gaatatttct ttaaaaatgg caacctgagc cattggtaaa accttccatg 2520
tgatacgagg gcgcgtagtt tgcattatcg tttttatcgt ttcaatctgg tctgacctcc 2580
ttgtgttttg ttgatgattt atgtcaaata ttaggaatgt tttcacttaa tagtattggt 2640
tgcgtaacaa agtgcggtcc tgctggcatt ctggagggaa atacaaccga cagatgtatg 2700
taaggccaac gtgctcaaat cttcatacag aaagatttga agtaatattt taaccgctag 2760
atgaagagca agcgcatgga gcgacaaaat gaataaagaa caatctgctg atgatccctc 2820
cgtggatctg attcgtgtaa aaaatatgct taatagcacc atttctatga gttaccctga 2880
tgttgtaatt gcatgtatag aacataaggt gtctctggaa gcattcagag caattgaggc 2940
agcgttggtg aagcacgata ataatatgaa ggattattcc ctggtggttg actgatcacc 3000
ataactgcta atcattcaaa ctatttagtc tgtgacagag ccaacacgca gtctgtcact 3060
gtcaggaaag tggtaaaact gcaactcaat tactgcaatg ccctcgtaat taagtgaatt 3120
tacaatatcg tcctgttcgg agggaagaac gcgggatgtt cattcttcat cacttttaat 3180
tgatgtatat gctctctttt ctgacgttag tctccgacgg caggcttcaa tgacccaggc 3240
tgagaaattc ccggaccctt tttgctcaag agcgatgtta atttgttcaa tcatttggtt 3300
aggaaagcgg atgttgcggg ttgttgttct gcgggttctg ttcttcgttg acatgaggtt 3360
gccccgtatt cagtgtcgct gatttgtatt gtctgaagtt gtttttacgt taagttgatg 3420
cagatcaatt aatacgatac ctgcgtcata attgattatt tgacgtggtt tgatggcctc 3480
cacgcacgtt gtgatatgta gatgataatc attatcactt tacgggtcct ttccggtgaa 3540
aaaaaaggta ccaaaaaaaa catcgtcgtg agtagtgaac cgtaagccgt tctgtttatg 3600
tttcttggac actgattgac acggtttagt agaac 3635
<210> 45
<211> 3636
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Example 2
<400> 45
tttttttttt tttttttttt ttttttttca agaaacataa acagaacgtg cttacggttc 60
actactcacg acgatgtttt ttttggtacc ttttttttca ccggaaagga cccgtaaagt 120
gataatgatt atcatctaca tatcacaacg tgcgtggagg ccatcaaacc acgtcaaata 180
atcaattatg acgcaggtat cgtattaatt gatctgcatc aacttaacgt aaaaacaact 240
tcagacaata caaatcagcg acactgaata cggggcaacc tcatgtcaac gaagaacaga 300
acccgcagaa caacaacccg caacatccgc tttcctaacc aaatgattga acaaattaac 360
atcgctcttg agcaaaaagg gtccgggaat ttctcagcct gggtcattga agcctgccgt 420
cggagactaa cgtcagaaaa gagagcatat acatcaatta aaagtgatga agaatgaaca 480
tcccgcgttc ttccctccga acaggacgat attgtaaatt cacttaatta cgagggcatt 540
gcagtaattg agttgcagtt ttaccacttt cctgacagtg acagactgcg tgttggctct 600
gtcacagact aaatagtttg aatgattagc agttatggtg atcagtcaac caccagggaa 660
taatccttca tattattatc gtgcttcacc aacgctgcct caattgctct gaatgcttcc 720
agagacacct tatgttctat acatgcaatt acaacatcag ggtaactcat agaaatggtg 780
ctattaagca tattttttac acgaatcaga tccacggagg gatcatcagc agattgttct 840
ttattcattt tgtcgctcca tgcgcttgct cttcatctag cggttaaaat attacttcaa 900
atctttctgt atgaagattt gagcacgttg gccttacata catctgtcgg ttgtatttcc 960
ctccagaatg ccagcaggac cgcactttgt tacgcaacca atactattaa gtgaaaacat 1020
tcctaatatt tgacataaat catcaacaaa acacaaggag gtcagaccag attgaaacga 1080
taaaaacgat aatgcaaact acgcgccctc gtatcacatg gaaggtttta ccaatggctc 1140
aggttgccat ttttaaagaa atattcgatc aagtgcgaaa agatttagac tgtgaattgt 1200
tttattctga actaaaacgt cacaacgtct cacattatat ttactatcta gccacagata 1260
atattcacat cgtgttagaa aacgataaca ccgtgttaat aaaaggactt aaaaaggttg 1320
taaatgttaa attctcaaga aacacgcatc ttatagaaac gtcctatgat aggttgaaat 1380
caagagaaat cacatttcag caatacaggg aaaatcttgc taaagcagga gttttccgat 1440
gggttacaaa tatccatgaa cataaaagat attactatac ctttgataat tcattactat 1500
ttactgagag cattcagaac actacacaaa tctttccacg ctaaatcata acgtccggtt 1560
tcttccgtgt cagcaccggg gcgttggcat aatgcaatac gtgtacgcgc taaaccctgt 1620
gtgcatcgtt ttaattattc ccggacactc ccgcagagaa gttccccgtc agggctgtgg 1680
acatagttaa tccgggaata caatgacgat tcatcgcacc tgacatacat taataaatat 1740
taacaatatg aaatttcaac tcattgttta gggtttgttt aattttctac acatacgatt 1800
ctgcgaactt caaaaagcat cgggaataac accatgaaaa aaatgctact cgctactgcg 1860
ctggccctgc ttattacagg atgtgctcaa cagacgttta ctgttcaaaa caaaccggca 1920
gcagtagcac caaaggaaac catcacccat catttcttcg tttctggaat tgggcagaag 1980
aaaactgtcg atgcagccaa aatttgtggc ggcgcagaaa atgttgttaa aacagaaacc 2040
cagcaaacat tcgtaaatgg attgctcggt tttattactt taggcattta tactccgctg 2100
gaagcgcgtg tgtattgctc acaataattg catgagttgc ccatcgatat gggcaactct 2160
atctgcactg ctcattaata tacttctggg ttccttccag ttgtttttgc atagtgatca 2220
gcctctctct gagggtgaaa taatcccgtt cagcggtgtc tgccagtcgg ggggaggctg 2280
cattatccac gccggaggcg gtggtggctt cacgcactga ctgacagact gctttgatgt 2340
gcaaccgacg acgaccagcg gcaacatcat cacgcagagc atcattttca gctttagcat 2400
cagctaactc cttcgtgtat tttgcatcga gcgcagcaac atcacgctga cgcatctgca 2460
tgtcagtaat tgccgcgttc gccagcttca gttctctggc atttttgtcg cgctgggctt 2520
tgtaggtaat ggcgttatca cggtaatgat taacagccca tgacaggcag acgatgatgc 2580
agataaccag agcggagata atcgcggtga ctctgctcat acatcaatct ctctgaccgt 2640
tccgcccgct tctttgaatt ttgcaatcag gctgtcagcc ttatgctcga actgaccata 2700
accagcgccc ggcagtgaag cccagatatt gctgcaacgg tcgattgcct gacggatatc 2760
accacgatca atcataggta aagcgccacg ctccttaatc tgctgcaatg ccacagcgtc 2820
ctgacttttc ggagagaagt ctttcaggcc aagctgcttg cggtaggcat cccaccaacg 2880
ggaaagaagc tggtagcgtc cggcgcctgt tgatttgagt tttgggttta gcgtgacaag 2940
tttgcgaggg tgatcggagt aatcagtaaa tagctctccg cctacaatga cgtcataacc 3000
atgatttctg gttttctgac gtccgttatc agttccctcc gaccacgcca gcatatcgag 3060
gaacgcctta cgttgattat tgatttctac catcttctac tccggctttt ttagcagcga 3120
agcgtttgat aagcgaacca atcgagtcag taccgatgta gccgataaac acgctcgtta 3180
tataagcgag attgctactt agtccggcga agtcgagaag gtcacgaatg aactaggcga 3240
taatggcgca catcgttgcg tcgattactg tttttgtaaa cgcaccgcca ttatatctgc 3300
cgcgaaggta cgccattgca aacgcaagga ttgccccgat gccttgttcc tttgccgcga 3360
gaatggcggc caacaggtca tgtttttctg gcatcttcat gtcttacccc caataagggg 3420
atttgctcta tttaattagg aataaggtcg attactgata gaacaaatcc aggctactgt 3480
gtttagtaat cagatttgtt cgtgaccgat atgcacgggc aaaacggcag gaggttgtta 3540
gcgcaaaaaa aaaattccaa aaaaaaaatt ccaaaaaaaa aaagcgacta acaaacacaa 3600
tctgatggca gcgactaaca aacacaatct gatggc 3636
<210> 46
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Example 2
<400> 46
gcaatatcag caccaacaga aacaacct 28
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> StrepII (C)
<400> 47
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5 10
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pro
<400> 48
Met Gln Arg Leu Phe Leu Leu Val Ala Val Met Leu Leu Ser Gly
1 5 10 15
<210> 49
<211> 558
<212> DNA
<213> Mycobacterium smegmatis
<400> 49
atgggcctgg ataacgaact tagcctggtg gacggccaag atcgcacgct gacggtgcaa 60
caatgggata ccttcctgaa tggtgtgttt ccgctggatc gtaaccgcct gacccgtgaa 120
tggtttcatt ccggtcgcgc aaaatatatc gtcgcaggcc cgggtgctga cgaattcgaa 180
ggcacgctgg aactgggtta tcagattggc tttccgtggt cactgggcgt tggtatcaac 240
ttctcgtaca ccacgccgaa tattctgatc gatgacggtg atattaccgc accgccgttt 300
ggcctgaaca gcgtgattac gccgaacctg tttccgggtg ttagcatctc tgccgatctg 360
ggcaacggtc cgggcattca agaagtggca acctttagtg tggacgtttc cggcgctgaa 420
ggcggtgtcg cggtgtctaa tgcccacggt accgttacgg gcgcggccgg cggtgtcctg 480
ctgcgtccgt tcgcgcgcct gattgcgagc accggcgact ctgttacgac ctatggcgaa 540
ccgtggaata tgaactaa 558
<210> 50
<211> 184
<212> PRT
<213> Mycobacterium smegmatis
<400> 50
Gly Leu Asp Asn Glu Leu Ser Leu Val Asp Gly Gln Asp Arg Thr Leu
1 5 10 15
Thr Val Gln Gln Trp Asp Thr Phe Leu Asn Gly Val Phe Pro Leu Asp
20 25 30
Arg Asn Arg Leu Thr Arg Glu Trp Phe His Ser Gly Arg Ala Lys Tyr
35 40 45
Ile Val Ala Gly Pro Gly Ala Asp Glu Phe Glu Gly Thr Leu Glu Leu
50 55 60
Gly Tyr Gln Ile Gly Phe Pro Trp Ser Leu Gly Val Gly Ile Asn Phe
65 70 75 80
Ser Tyr Thr Thr Pro Asn Ile Leu Ile Asp Asp Gly Asp Ile Thr Ala
85 90 95
Pro Pro Phe Gly Leu Asn Ser Val Ile Thr Pro Asn Leu Phe Pro Gly
100 105 110
Val Ser Ile Ser Ala Asp Leu Gly Asn Gly Pro Gly Ile Gln Glu Val
115 120 125
Ala Thr Phe Ser Val Asp Val Ser Gly Ala Glu Gly Gly Val Ala Val
130 135 140
Ser Asn Ala His Gly Thr Val Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Leu Leu
145 150 155 160
Arg Pro Phe Ala Arg Leu Ile Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr Thr
165 170 175
Tyr Gly Glu Pro Trp Asn Met Asn
180
<210> 51
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thrombin Binding Aptamer
<400> 51
tttttttttt tttttttttt ggttggtgtg gttgg 35
<210> 52
<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y Adaptor Top Strand
<220>
<221> C3 Spacer
<222> (1)..(30)
<223> C3 Spacer phosphoramidite (Integrated DNA technologies: 5SpC3)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (64)..(67)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> 18 Spacer
<222> (80)..(83)
<223> 18-atom hexa-ethyleneglycol spacer (Integrated DNA technologies:
iSp18)
<400> 52
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ggcgtctgct tgggtgttta accttttttt 60
tttnnnnaat gtacttcgtt cagttacgta ttgct 95
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y Adaptor Blocker Strand
<400> 53
ttccgcagac gaacccacaa attgg 25
<210> 54
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y Adaptor Cholesterol Tether
<220>
<221> 5' Cholesterol tag
<222> (1)..(1)
<400> 54
ttgaccgctc gcctc 15
<210> 55
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y Adaptor Bottom Strand
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> 5 Phos
<400> 55
aactggcgag cggagttttt acatgaagca agtcaatgca taacg 45
<210> 56
<211> 3561
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3.6kb target sequence
<400> 56
gccatcagat tgtgtttgtt agtcgctttt tttttttgga attttttttt tggaattttt 60
tttttgcgct aacaacctcc tgccgttttg cccgtgcata tcggtcacga acaaatctga 120
ttactaaaca cagtagcctg gatttgttct atcagtaatc gaccttattc ctaattaaat 180
agagcaaatc cccttattgg gggtaagaca tgaagatgcc agaaaaacat gacctgttgg 240
ccgccattct cgcggcaaag gaacaaggca tcggggcaat ccttgcgttt gcaatggcgt 300
accttcgcgg cagatataat ggcggtgcgt ttacaaaaac agtaatcgac gcaacgatgt 360
gcgccattat cgcctagttc attcgtgacc ttctcgactt cgccggacta agtagcaatc 420
tcgcttatat aacgagcgtg tttatcggct acatcggtac tgactcgatt ggttcgctta 480
tcaaacgctt cgctgctaaa aaagccggag tagaagatgg tagaaatcaa taatcaacgt 540
aaggcgttcc tcgatatgct ggcgtggtcg gagggaactg ataacggacg tcagaaaacc 600
agaaatcatg gttatgacgt cattgtaggc ggagagctat ttactgatta ctccgatcac 660
cctcgcaaac ttgtcacgct aaacccaaaa ctcaaatcaa caggcgccgg acgctaccag 720
cttctttccc gttggtggga tgcctaccgc aagcagcttg gcctgaaaga cttctctccg 780
aaaagtcagg acgctgtggc attgcagcag attaaggagc gtggcgcttt acctatgatt 840
gatcgtggtg atatccgtca ggcaatcgac cgttgcagca atatctgggc ttcactgccg 900
ggcgctggtt atggtcagtt cgagcataag gctgacagcc tgattgcaaa attcaaagaa 960
gcgggcggaa cggtcagaga gattgatgta tgagcagagt caccgcgatt atctccgctc 1020
tggttatctg catcatcgtc tgcctgtcat gggctgttaa tcattaccgt gataacgcca 1080
ttacctacaa agcccagcgc gacaaaaatg ccagagaact gaagctggcg aacgcggcaa 1140
ttactgacat gcagatgcgt cagcgtgatg ttgctgcgct cgatgcaaaa tacacgaagg 1200
agttagctga tgctaaagct gaaaatgatg ctctgcgtga tgatgttgcc gctggtcgtc 1260
gtcggttgca catcaaagca gtctgtcagt cagtgcgtga agccaccacc gcctccggcg 1320
tggataatgc agcctccccc cgactggcag acaccgctga acgggattat ttcaccctca 1380
gagagaggct gatcactatg caaaaacaac tggaaggaac ccagaagtat attaatgagc 1440
agtgcagata gagttgccca tatcgatggg caactcatgc aattattgtg agcaatacac 1500
acgcgcttcc agcggagtat aaatgcctaa agtaataaaa ccgagcaatc catttacgaa 1560
tgtttgctgg gtttctgttt taacaacatt ttctgcgccg ccacaaattt tggctgcatc 1620
gacagttttc ttctgcccaa ttccagaaac gaagaaatga tgggtgatgg tttcctttgg 1680
tgctactgct gccggtttgt tttgaacagt aaacgtctgt tgagcacatc ctgtaataag 1740
cagggccagc gcagtagcga gtagcatttt tttcatggtg ttattcccga tgctttttga 1800
agttcgcaga atcgtatgtg tagaaaatta aacaaaccct aaacaatgag ttgaaatttc 1860
atattgttaa tatttattaa tgtatgtcag gtgcgatgaa tcgtcattgt attcccggat 1920
taactatgtc cacagccctg acggggaact tctctgcggg agtgtccggg aataattaaa 1980
acgatgcaca cagggtttag cgcgtacacg tattgcatta tgccaacgcc ccggtgctga 2040
cacggaagaa accggacgtt atgatttagc gtggaaagat ttgtgtagtg ttctgaatgc 2100
tctcagtaaa tagtaatgaa ttatcaaagg tatagtaata tcttttatgt tcatggatat 2160
ttgtaaccca tcggaaaact cctgctttag caagattttc cctgtattgc tgaaatgtga 2220
tttctcttga tttcaaccta tcataggacg tttctataag atgcgtgttt cttgagaatt 2280
taacatttac aaccttttta agtcctttta ttaacacggt gttatcgttt tctaacacga 2340
tgtgaatatt atctgtggct agatagtaaa tataatgtga gacgttgtga cgttttagtt 2400
cagaataaaa caattcacag tctaaatctt ttcgcacttg atcgaatatt tctttaaaaa 2460
tggcaacctg agccattggt aaaaccttcc atgtgatacg agggcgcgta gtttgcatta 2520
tcgtttttat cgtttcaatc tggtctgacc tccttgtgtt ttgttgatga tttatgtcaa 2580
atattaggaa tgttttcact taatagtatt ggttgcgtaa caaagtgcgg tcctgctggc 2640
attctggagg gaaatacaac cgacagatgt atgtaaggcc aacgtgctca aatcttcata 2700
cagaaagatt tgaagtaata ttttaaccgc tagatgaaga gcaagcgcat ggagcgacaa 2760
aatgaataaa gaacaatctg ctgatgatcc ctccgtggat ctgattcgtg taaaaaatat 2820
gcttaatagc accatttcta tgagttaccc tgatgttgta attgcatgta tagaacataa 2880
ggtgtctctg gaagcattca gagcaattga ggcagcgttg gtgaagcacg ataataatat 2940
gaaggattat tccctggtgg ttgactgatc accataactg ctaatcattc aaactattta 3000
gtctgtgaca gagccaacac gcagtctgtc actgtcagga aagtggtaaa actgcaactc 3060
aattactgca atgccctcgt aattaagtga atttacaata tcgtcctgtt cggagggaag 3120
aacgcgggat gttcattctt catcactttt aattgatgta tatgctctct tttctgacgt 3180
tagtctccga cggcaggctt caatgaccca ggctgagaaa ttcccggacc ctttttgctc 3240
aagagcgatg ttaatttgtt caatcatttg gttaggaaag cggatgttgc gggttgttgt 3300
tctgcgggtt ctgttcttcg ttgacatgag gttgccccgt attcagtgtc gctgatttgt 3360
attgtctgaa gttgttttta cgttaagttg atgcagatca attaatacga tacctgcgtc 3420
ataattgatt atttgacgtg gtttgatggc ctccacgcac gttgtgatat gtagatgata 3480
atcattatca ctttacgggt cctttccggt gaaaaaaaag gtaccaaaaa aaacatcgtc 3540
gtgagtagtg aaccgtaagc a 3561
Claims (49)
- 서열 번호 2에 기재된 서열의 변이체를 포함하는 돌연변이체 CsgG 단량체로서 K94N, K94Q, K94R, K94F, K94Y, K94W, K94L 또는 K94S를 포함하는, 돌연변이체 CsgG 단량체.
- 제1항에 있어서, 상기 변이체가 K94Q 또는 K94N을 포함하는 것인, 돌연변이체 CsgG 단량체.
- 제1항에 있어서, 상기 변이체가 Q42K 또는 Q42R; E44N 또는 E44Q; L90R 또는 L90K; N91R 또는 N91K; I95R 또는 I95K; A99R 또는 A99K; E101H, E101K, E101N, E101Q 또는 E101T; 및 Q114K 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 돌연변이체 CsgG 단량체.
- 제1항에 있어서, 상기 변이체가
- 하기 중 하나 이상: D43S; E44S; F48S, F48N, F48Q, F48Y, F48W, F48I, F48V, F48H, F48R 또는 F48K; Q87N, Q87R 또는 Q87K; N91K 또는 N91R; R97F, R97Y, R97W, R97V, R97I, R97K, R97S, R97Q 또는 R97H; E101I, E101L, E101A 또는 E101H; N102K, N102Q, N102L, N102I, N102V, N102S 또는 N102H; R110F, R110G 또는 R110N; Q114R 또는 Q114K; R142Q 또는 R142S; T150Y, T150A, T150V, T150L, T150S, T150Q 또는 T150N; 및 D248S, D248N, D248Q, D248K 또는 D248R;
- 하기 중 하나 이상: I41N; R93F, R93Y, R93W, R93L, R93I, R93V, R93N, R93Q 또는 R93S; A98K 또는 A98R; Q100K 또는 Q100R; G103F, G103W, G103S, G103N, G103K 또는 G103R; T104R 또는 T104K; A106R 또는 A106K; I107R, I107K, I107W, I107F, I107Y, I107L 또는 I107V; N108R 또는 N108K; L113K 또는 L113R; S115R 또는 S115K; T117R 또는 T117K; Y130W, Y130F, Y130H, Y130Q 또는 Y130N; K135L, K135V, K135N, K135Q 또는 K135S; E170S, E170N, E170Q, E170K 또는 E170R; S208V, S208I, S208F, S208W, S208Y, S208L 또는 S208T; D233S, D233N, D233Q, D233K 또는 D233R; D238S, D238N, D238Q, D238K 또는 D238R; 및 E244S, E244N, E244Q, E244K 또는 E244R;
- 하기 중 하나 이상: R93F, R93Y, R93W, R93L, R93I, R93V, R93N, R93Q 또는 R93S; G103F, G103W, G103S, G103N, G103K 또는 G103R; 및 I107R, I107K, I107W, I107F, I107Y, I107L 또는 I107V;
- 하기 중 하나 이상: I41N; T104R 또는 T104K; A106R 또는 A106K; N108R 또는 N108K; L113K 또는 L113R; S115R 또는 S115K; T117R 또는 T117K; E170S, E170N, E170Q, E170K 또는 E170R; D233S, D233N, D233Q, D233K 또는 D233R; D238S, D238N, D238Q, D238K 또는 D238R; 및 E244S, E244N, E244Q, E244K 또는 E244R;
- 하기 중 하나 이상: (i) A98R 또는 A98K; (ii) Q100K 또는 Q100R; (iii) G103K 또는 G103R; 및 (iv) I107R 또는 I107K;
- 하기 중 하나 이상: Y130W, Y130F, Y130H, Y130Q 또는 Y130N; K135L, K135V, K135N, K135Q 또는 K135S; 및 R142Q 또는 R142S;
- 하기 중 하나 이상: (i) Q87N, Q87R 또는 Q87K; (ii) R97F, R97Y, R97W, R97V, R97I, R97K, R97S, R97Q 또는 R97H; (iii) N102K, N102Q, N102L, N102I, N102V, N102S 또는 N102H; 및 (iv) R110F, R110G 또는 R110N;
- 하기 중 하나 이상: (i) D43S; (ii) E44S; (iii) N91K 또는 N91R; (iv) Q114R 또는 Q114K; 및 (v) D248S, D248N, D248Q, D248K 또는 D248R;
- 하기 중 하나 이상: Q87R 또는 Q87K; E101I, E101L, E101A 또는 E101H; 및 N102K;
- Q87R 또는 Q87K;
- E101I, E101L, E101A 또는 E101H;
- N102K;
- Q87R 또는 Q87K, 및 E101I, E101L, E101A or E101H;
- Q87R 또는 Q87K, 및 N102K;
- E101I, E101L, E101A 또는 E101H, 및 N102K;
- Q87R 또는 Q87K;
- E101I, E101L, E101A 또는 E101H, 및 N102K;
- F48S, F48N, F48Q, F48Y, F48W, F48I, 또는 F48V; 또는
- F48H, F48R 또는 F48K
을 추가로 포함하는 것인, 돌연변이체 CsgG 단량체. - 제1항에 있어서, 상기 변이체가
(A) R192, F193, I194, D195, Y196, Q197, R198, L199, L200 및 E201 위치 중 하나 이상의 결실; 및
(B) 하기 (i) 내지 (iii) 중 하나 이상의 결실:
(i) V139, G140, D149, T150, V186, Q187, V204 및 G205;
(ii) G137, G138, Q151, Y152, Y184, E185, Y206 및 T207; 및
(iii) A141, R142, G147, A148, A188, G189, G202 및 E203
중에서 어느 하나 또는 이들 모두를 추가로 포함하는 것인, 돌연변이체 CsgG 단량체. - 제5항에 있어서, 상기 변이체가
- D195, Y196, Q197, R198 및 L199;
- R192, F193, I194, D195, Y196, Q197, R198, L199 및 L200;
- Q197, R198, L199 및 L200;
- I194, D195, Y196, Q197, R198 및 L199;
- D195, Y196, Q197, R198, L199 및 L200;
- Y196, Q197, R198, L199, L200 및 E201;
- Q197, R198, L199, L200 및 E201;
- Q197, R198, 및 L199; 또는
- F193, I194, D195, Y196, Q197, R198 및 L199의 결실을 포함하는 것인, 돌연변이체 CsgG 단량체. - 제5항에 있어서, 상기 변이체가 R97F, R97Y, R97W, R97V, R97I, R97K, R97S, R97Q 또는 R97H를 포함하는 것인, 돌연변이체 CsgG 단량체.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체가
(i) R192D, R192Q, R192F, R192S, R192T, R192N 또는 R192E; 및
(ii) R97W; R93W; R93Y 및 R97Y; F191T; 또는 V105, A106 및 I107의 결실
중 어느 하나 또는 이들 모두를 포함하는 것인, 돌연변이체 CsgG 단량체. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체가
(a) 하기 중 하나 이상: (i) Q42R 또는 Q42K; (ii) K49R; (iii) N102R, N102F, N102Y 또는 N102W; (iv) D149N, D149Q 또는 D149R; (v) E185N, E185Q 또는 E185R; (vi) D195N, D195Q 또는 D195R; (vii) E201N, E201Q 또는 E201R; (viii) E203N, E203Q 또는 E203R; 및 (ix) F48, K49, P50, Y51, P52, A53, S54, N55, F56 및 S57 위치 중 하나 이상의 결실;
(b) 하기 치환 중 하나 이상: N40R 또는 N40K; D43N, D43Q, D43R 또는 D43K; E44N, E44Q, E44R 또는 E44K; S54P; S57P; Q62R 또는 Q62K; R97N, R97G 또는 R97L; E101N, E101Q, E101R, E101K, E101F, E101Y 또는 E101W; E124N, E124Q, E124R, E124K, E124F, E124Y 또는 E124W; E131D; R142E 또는 R142N; T150I; 및 R192E 또는 R192N;
(c) 하기 치환 중 하나 이상: (i) F56N, F56Q, F56R, F56S, F56G, F56A 또는 F56K; (ii) N55Q, N55R, N55K, N55S, N55G, N55A 또는 N55T; 및 (iii) Y51L, Y51V, Y51A, Y51N, Y51Q, Y51S 또는 Y51G; 및
(d) (i) Y51 및 P52; Y51, P52 및 A53; P50 내지 P52; P50 내지 A53; K49 내지 Y51; K49 내지 A53; K49 내지 S54; Y51 내지 A53; Y51 내지 S54; N55 및 F56; 또는 N55 내지 S57의 단일 프롤린(P)에 의한 대체; (ii) N55 및 F56의 단일 글라이신(G) 또는 단일 알라닌(A)에 의한 대체; (iii) N55 및 F56의 단일 P에 의한 대체 및 돌연변이 Y51N, Y51Q 또는 Y51S; (iv) N55 및 F56의 단일 G에 의한 대체 및 돌연변이 Y51N, Y51Q 또는 Y51S; 또는 (v) N55 및 F56의 단일 A에 의한 대체 및 돌연변이 Y51N, Y51Q 또는 Y51S
중에서 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 돌연변이체 CsgG 단량체. - 2개 이상의 공유 결합으로 부착된 CsgG 단량체를 포함하는 단백질 작제물로서, 상기 단량체 중 적어도 하나는 제1항에 따른 돌연변이체 단량체인, 단백질 작제물.
- 제10항에 있어서, 상기 2개 이상의 돌연변이체 단량체가 동일하거나 상이한, 단백질 작제물.
- 제10항에 있어서, 상기 2개 이상의 돌연변이체 단량체가 유전자 융합된, 단백질 작제물.
- 제10항에 있어서, 상기 2개 이상의 돌연변이체 단량체가 하나 이상의 링커를 통해 부착된, 단백질 작제물.
- 제10항에 있어서, 2개의 돌연변이체 단량체를 포함하는 것인, 단백질 작제물.
- 제1항에 따른 돌연변이체 단량체를 코딩하는, 폴리뉴클레오타이드.
- 제12항에 따른 단백질 작제물을 코딩하는, 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항에 따른 동일한 돌연변이체 단량체를 포함하는, CsgG로부터 유래된 동종올리고머 기공.
- 제17항에 있어서, 9개의 동일한 돌연변이체 단량체를 포함하는 것인, 동종올리고머 기공.
- 제1항에 따른 적어도 하나의 돌연변이체 단량체를 포함하는, CsgG로부터 유래된 이종올리고머 기공.
- (a) 적어도 하나가 다른 것들과 서로 상이한 제1항에 따른 9개의 돌연변이체 단량체 또는 (b) 제1항에 따른 하나 이상의 돌연변이체 단량체 및 서열 번호 2를 포함하는 추가 단량체를 포함하는 것인, CsgG로부터 유래된 이종올리고머 기공.
- 제10항에 따른 적어도 하나의 단백질 작제물을 포함하는, CsgG로부터 유래된 기공.
- 표적 분석물질의 존재, 부재 또는 하나 이상의 특징을 결정하는 방법으로서,
(a) 상기 표적 분석물질이 기공과 관련하여 이동하도록 상기 표적 분석물질을 제1항에 따른 동일한 돌연변이체 단량체를 포함하는 CsgG로부터 유래된 동종올리고머 기공, 또는 제1항에 따른 적어도 하나의 돌연변이체 단량체를 포함하는 CsgG로부터 유래된 이종올리고머 기공과 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 분석물질이 상기 기공과 관련하여 이동하면서 하나 이상의 측정을 하고, 이로써 상기 표적 분석물질의 존재, 부재 또는 하나 이상의 특징을 결정하는 단계를 포함하는, 방법. - 제22항에 있어서, 상기 표적 분석물질이 금속 이온, 무기 염, 중합체, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 염료, 표백제, 약제, 진단제, 기분 전환 약물(recreational drug), 폭발성 또는 환경적 오염물질인, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 표적 분석물질이 표적 폴리뉴클레오타이드인, 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 방법이 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하기 위한 것으로,
a) 표적 폴리뉴클레오타이드가 기공과 관련하여 이동하도록 폴리뉴클레오타이드를 상기 기공과 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 기공과 관련하여 이동하면서 하나 이상의 측정을 하여, 이로써 상기 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하고, 상기 측정은 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 특징을 나타내는 것인 단계를 포함하는, 방법. - 제25항에 있어서, 상기 하나 이상의 특징이 (ⅰ) 상기 폴리뉴클레오타이드의 길이, (ⅱ) 상기 폴리뉴클레오타이드의 식별, (ⅲ) 상기 폴리뉴클레오타이드의 서열, (ⅳ) 상기 폴리뉴클레오타이드의 2차 구조 및 (ⅴ) 상기 폴리뉴클레오타이드가 변형되는지 여부로부터 선택되는 것인, 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 특징이
(a) 전기 측정; 및
(b) 광학 측정
중 어느 하나 또는 이들 모두에 의해 측정되는, 방법. - 제27항에 있어서, 상기 전기 측정은 전류 측정, 임피던스 측정, 터널링 측정 또는 전계 트랜지스터(field effect transistor: FET) 측정인, 방법.
- 제25항에 있어서, 단계 a)가 기공을 통한 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어하도록 상기 폴리뉴클레오타이드를 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제29항에 있어서,
a) 기공과 관련하여 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어하도록, 폴리뉴클레오타이드를 기공 및 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질과 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 기공과 관련하여 이동하면서 기공을 통해 흐르는 전류를 측정하여, 이로써 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하고, 상기 전류는 상기 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 특징을 나타내는 것인 단계를 포함하는, 방법. - 제29항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질이 헬리카제이거나, 헬리카제로부터 유래된 것인 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 방법이 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하기 위한 것으로서,
a) 엑소뉴클레아제(exonucleoase)가 표적 폴리뉴클레오타이드의 일 말단으로부터 개별 뉴클레오타이드를 분해하고, 상기 개별 뉴클레오타이드가 상기 기공과 관련하여 이동하도록, 폴리뉴클레오타이드를 제1항에 따른 동일한 돌연변이체 단량체를 포함하는 CsgG로부터 유래된 동종올리고머 기공, 또는 제1항에 따른 적어도 하나의 돌연변이체 단량체를 포함하는 CsgG로부터 유래된 이종올리고머 기공 및 엑소뉴클레오아제와 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 개별 뉴클레오타이드가 상기 기공과 관련하여 이동하면서 하나 이상의 측정을 하여, 이로써 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하고, 상기 측정은 상기 개별 뉴클레오타이드의 하나 이상의 특징을 나타내는 것인 단계를 포함하는, 방법. - 제22항에 있어서, 상기 기공이 막인 방법.
- 제33항에 있어서, 상기 막이 양친매성 층이거나 고체 상태 층을 포함하는 것인 방법.
- 제33항에 있어서, 상기 표적 분석물질이 상기 기공과 접촉하기 전에 상기 막에 커플링되는, 방법.
- 제33항에 있어서, 상기 표적 분석물질이 상기 막을 향해 상기 분석물질을 전달하는 마이크로입자에 부착된 것인, 방법.
- 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하기 위한 센서를 형성하는 방법으로서, 제1항에 따른 동일한 돌연변이체 단량체를 포함하는 CsgG로부터 유래된 동종올리고머 기공, 또는 제1항에 따른 적어도 하나의 돌연변이체 단량체를 포함하는 CsgG로부터 유래된 이종올리고머 기공과 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질 사이에 복합체를 형성하여, 이로써 상기 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하기 위한 센서를 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 복합체가 (a) 상기 표적 폴리뉴클레오타이드의 존재 하에 상기 기공 및 상기 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질을 접촉시키는 단계 및 (b) 상기 기공에 걸쳐 전위를 인가하는 단계에 의해 형성되는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 전위는 전압 전위 또는 화학 전위인, 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 복합체가 상기 기공을 상기 단백질에 공유 결합으로 부착함으로써 형성되는 것인, 방법.
- 제1항에 따른 동일한 돌연변이체 단량체를 포함하는 CsgG로부터 유래된 동종올리고머 기공, 또는 제1항에 따른 적어도 하나의 돌연변이체 단량체를 포함하는 CsgG로부터 유래된 이종올리고머 기공과 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질 사이의 복합체를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하기 위한 센서.
- (a) 제1항에 따른 동일한 돌연변이체 단량체를 포함하는 CsgG로부터 유래된 동종올리고머 기공, 또는 제1항에 따른 적어도 하나의 돌연변이체 단량체를 포함하는 CsgG로부터 유래된 이종올리고머 기공 및 (b) 막의 성분을 포함하는, 표적 분석물질을 규명하기 위한 키트.
- (a) 제1항에 따른 동일한 돌연변이체 단량체를 포함하는 동종올리고머 기공, 또는 제1항에 따른 적어도 하나의 돌연변이체 단량체를 포함하는 이종올리고머 기공인, CsgG로부터 유래된 복수의 기공 및 (b) 복수의 막을 포함하는, 샘플에서 표적 분석물질을 규명하기 위한 장치.
- 제43항에 있어서, 상기 장치는
기공 및 막을 사용하여 분석물질 규명을 수행하도록 조작 가능한 복수의 기공 및 막을 지지할 수 있는 센서 장치; 및
상기 규명을 수행하기 위한 재료의 전달을 위한 적어도 하나의 포트를 포함하는, 장치. - 제44항에 있어서, 상기 장치는
기공 및 막을 사용하여 분석물질 규명을 수행하도록 조작 가능한 복수의 기공 및 막을 지지할 수 있는 센서 장치; 및
상기 규명을 수행하기 위한 재료를 보유하기 위한 적어도 하나의 저장소를 포함하는, 장치. - 제44항에 있어서, 상기 장치는
상기 적어도 하나의 저장소로부터 상기 센서 장치로 재료를 제어 가능하게 공급하도록 구성된 유체 시스템; 및
각각의 샘플을 수용하기 위한 복수의 용기를 추가로 포함하고, 상기 유체 시스템은 상기 용기로부터 상기 센서 장치로 상기 샘플을 선택적으로 공급하도록 구성된, 장치. - 표적 폴리뉴클레오타이드를 규명하는 방법으로서,
a) 표적 폴리뉴클레오타이드를 제1항에 따른 동일한 돌연변이체 단량체를 포함하는 CsgG로부터 유래된 동종올리고머 기공, 또는 제1항에 따른 적어도 하나의 돌연변이체 단량체를 포함하는 CsgG로부터 유래된 이종올리고머 기공, 중합효소 및 포스페이트 표지된 뉴클레오타이드와 접촉시켜 포스페이트 표지된 종이 상기 중합효소에 의해 상기 표적 폴리뉴클레오타이드에 순차적으로 첨가되도록 하는 단계로서, 상기 포스페이트 표지된 종은 각각의 뉴클레오타이드에 특이적인 라벨을 함유하는 것인 단계; 및
b) 상기 기공을 사용하여 상기 포스페이트 표지된 종을 검출하고, 이로써 상기 폴리뉴클레오타이드를 규명하는 단계
를 포함하는 방법. - 제15항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 적합한 숙주 세포에서 발현시키고, 이로써 제1항에 따른 돌연변이체 단량체를 제조하는 단계를 포함하는, 제1항의 돌연변이체 단량체를 제조하는 방법.
- 제16항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 적합한 숙주 세포에서 발현시키고, 이로써 제12항에 따른 단백질 작제물을 제조하는 단계를 포함하는, 제12항에 따른 단백질 작제물을 제조하는 방법.
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| Proc Natl Acad Sci U S A, 111(50): E5439-44 (2014.12.01.)* |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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