JP6799072B2 - 変異体ポア - Google Patents

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Description

本発明は、ＣｓｇＧの変異体形態に関する。本発明はまた、ＣｓｇＧを使用した分析物検出及び特徴付けに関する。
ナノポアセンシングは、分析物分子と受容体との間の個々の結合または相互作用の事象の観察に依拠するセンシングの手法である。ナノポアセンサは、ナノメートル寸法の単一のポアを絶縁膜内に置き、分析物分子の存在下でポアを通る電圧駆動イオン輸送を測定することによって作製され得る。分析物の同一性は、その固有の電流シグネチャ、とりわけ電流ブロックの時間及び程度、ならびに電流レベルの変動を通して明らかになる。Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄによって販売される、電子チップと一体となったナノポアのアレイを含むＭｉｎＩＯＮ（商標）デバイスなどの、かかるナノポアセンサが市販されている。
幅広い用途にわたって、迅速かつ安価な核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）シークエンシング技術が現在必要とされている。既存の技術は、主に、大量の核酸を生成するために増幅技術に依拠し、シグナル検出のための専門の蛍光薬剤が大量に必要とするため、時間がかかりかつ高価である。ナノポアセンシングは、必要とされるヌクレオチド及び試薬の量を減らすことによって迅速かつ安価な核酸シークエンシングを提供する可能性を有する。
ナノポアセンシングを使用した核酸のシークエンシングの不可欠な要素のうちの２つは、（１）ポアを通る核酸移動の制御、及び（２）核酸ポリマーがポアを通る際のヌクレオチドの識別である。過去に、ヌクレオチドの識別を達成するために、核酸は、溶血毒の変異体を通されてきた。これは、配列依存性であることが示されてきた電流シグネチャを提供した。溶血毒ポアを使用したときに、認められた電流に多数のヌクレオチドが寄与することも示し、これは、認められた電流とポリヌクレオチドとの間の直接的な関係を困難にした。
ヌクレオチドの識別のための電流範囲は、溶血毒ポアの変異体を通して改善されてきたものの、ヌクレオチド間の電流差をさらに改善させることができれば、シークエンシングシステムは、より高い性能を有することができるであろう。さらに、核酸がポアを通って移動すると、いくつかの電流状態が高い変動性を示すことが認められた。いくつかの変異体溶血毒ポアが他のものよりも高い変動を呈することも示された。これらの状態の変動は配列特異情報を含有し得る一方、システムを簡略化するために低い変動を有するポアを生成することが望ましい。また、認められた電流に寄与するヌクレオチドの数を減らすことも望ましい。
発明者らは、驚くことに、ＣｓｇＧ及びその新規の変異体を使用して、ポリヌクレオチドなどの分析物を特徴付けることができることを実証した。本発明は、変異体ＣｓｇＧモノマーに関する。発明者らは、驚くことに、新規の変異体モノマーを含むポアが、ポリヌクレオチドの配列などの分析物の特徴を推定する向上した能力を有することを実証した。発明者らは、驚くことに、ポアに対する、例えばそれを通る標的ポリヌクレオチドのより一貫した移動をもたらす変異体ポアを作製した。発明者らは、驚くことに、特徴付け精度の改善を提示する変異体ポアを作製した。とりわけ、発明者らは、驚くことに、異なるヌクレオチド間の識別を容易にする電流範囲の増加、及びシグナル対ノイズ比を増加させる状態の変動の低下を提示する変異体ポアを作製した。さらに、発明者らは、驚くことに、より容易にヌクレオチド及びポリヌクレオチドを捕捉する変異体ポアを作製した。変異体ＣｓｇＧモノマーにおいて、１９２位におけるアルギニン（Ｒ）は、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、フェニルアラニン（Ｆ）、セリン（Ｓ）、またはトレオニン（Ｔ）で置換されてもよい。発明者らは、驚くことに、かかるモノマー、特にＲ１９２Ｄ置換を含むモノマーが、１９２位における置換を含まないモノマーよりも発現させることがはるかに容易であることを実証した。
本明細書に開示される全てのアミノ酸置換、欠失、及び／または付加は、別段記載されない限り、配列番号２に示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーに関連する。
配列番号２に示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーへの言及は、以下に開示されるさらなる配列番号に記載される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーを包含する。配列番号２に示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーに関連して本明細書に開示されるそれらの置換、欠失、及び／または付加と同等である、全てのアミノ酸置換、欠失、及び／または付加は、配列番号２に示される以外の配列のバリアントを含むＣｓｇＧモノマーに行われ得る。
変異体モノマーは、単離されたモノマーと考えられ得る。
本発明は、特に、９７位におけるアルギニン（Ｒ）がトリプトファン（Ｗ）で置換され、９３位におけるアルギニン（Ｒ）がトリプトファン（Ｗ）で置換され、９３位及び９７位におけるアルギニン（Ｒ）がトリプトファン（Ｗ）で置換された、変異体ＣｓｇＧモノマーに関する。
本発明はまた、配列番号２に示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーを提供し、該バリアントは、（ａ）Ｆ１９１Ｔ、（ｂ）Ｖ１０５、Ａ１０６、及びＩ１０７の欠失、ならびに／またはＲ１９２位、Ｆ１９３位、Ｉ１９４位、Ｄ１９５位、Ｙ１９６位、Ｑ１９７位、Ｒ１９８位、Ｌ１９９位、Ｌ２００位、及びＥ２０１のうちの１つ以上の欠失、例えばＦ１９３、Ｉ１９４、Ｄ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、及びＬ１９９の欠失、またはＤ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、及びＬ１９９の欠失を含む。
本発明はまた、
−Ｒ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／Ｔを含む配列番号２に示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマー、
−（ａ）Ｒ１９２Ｄ、（ｂ）Ｒ９７Ｗ／Ｙ及び／もしくはＲ９３Ｗ／Ｙ、好ましくはＲ９７Ｗ、Ｒ９３ＷもしくはＲ９３Ｙ、及びＲ９７Ｙ、（ｃ）Ｋ９４Ｑ／Ｎ、（ｄ）Ｇ１０３Ｋ／Ｒ及び／またはＴ１０４Ｋ／Ｒ、ならびに／または（ｅ）Ｆ１９１Ｔ、Ｖ１０５、Ａ１０６、及びＩ１０７の欠失、及び／もしくはＦ１９３、Ｉ１９４、Ｄ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、及びＬ１９９の欠失を含む変異体ＣｓｇＧモノマーを提供する。
変異体ＣｓｇＧモノマーは、好ましくは、Ｙ５１Ａ及びＦ５６Ｑをさらに含む。
本発明によって提供される特定の変異体ＣｓｇＧモノマーは、以下の変異を含む配列番号２に示される配列のバリアントを含む：
（１）Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ、及びＲ１９２Ｄ；
（２）Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ、及びＲ９７Ｗ。
（３）Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ、Ｒ１９２Ｄ、及びＲ９７Ｗ；
（４）Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ、Ｒ１９２Ｄ、及びＲ９３Ｗ；
（５）Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ、Ｒ１９２Ｄ、Ｒ９３Ｙ、及びＲ９７Ｙ；または
（６）Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ、Ｒ１９２Ｄ、及びＲ９３Ｗ。
（７）（１）〜（６）のうちのいずれか１つの変異、ならびに：
（ａ）Ｖ１０５、Ａ１０６、及びＩ１０７の欠失。
（ｂ）Ｋ９４ＱまたはＫ９４Ｎ；
（ｃ）Ｄ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、及びＬ１９９の欠失、またはＦ１９３、Ｉ１９４、Ｄ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、及びＬ１９９の欠失；ならびに／または
（ｄ）Ｆ１９１Ｔ。
（８）（１）〜（６）のうちのいずれか１つの変異、ならびに：
（ｉ）Ｋ９４Ｑ、ならびにＶ１０５、Ａ１０６、及びＩ１０７の欠失；
（ｉｉ）Ｋ９４Ｎ、ならびにＶ１０５、Ａ１０６、及びＩ１０７の欠失；
（ｉｉｉ）Ｆ１９１Ｔ、ならびにＶ１０５、Ａ１０６、及びＩ１０７の欠失；
（ｉｖ）Ｋ９４Ｑ及びＦ１９１Ｔ；
（ｖ）Ｋ９４Ｎ及びＦ１９１Ｔ；
（ｖｉ）Ｋ９４Ｑ、Ｆ１９１Ｔ、ならびにＶ１０５、Ａ１０６、及びＩ１０７の欠失；または
（ｖｉｉ）Ｋ９４Ｎ、Ｆ１９１Ｔ、ならびにＶ１０５、Ａ１０６、及びＩ１０７の欠失。
（９）（１）〜（８）のうちのいずれか１つの変異、ならびに：
−Ｔ１０４ＫもしくはＴ１０４Ｒ；
−Ｌ９０Ｒ；
−Ｎ９１Ｒ；
−Ｉ９５Ｒ；
−Ａ９９Ｒ；
−Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｎ、Ｅ１０１Ｑ、Ｅ１０１Ｔ、もしくはＥ１０１Ｈ；
−Ｅ４４ＮもしくはＥ４４Ｑ；及び／または
−Ｑ４２Ｋ。
本発明はまた、以下のものを提供する：
−２つ以上の共有結合したＣｓｇＧモノマーを含む構造体であって、モノマーのうちの少なくとも１つが本発明の変異体モノマーである、構造体；
−本発明の変異体モノマーまたは本発明の構造体をコードするポリヌクレオチド；
−本発明の同一の変異体モノマーまたは本発明の同一の構造体を含むＣｓｇＧに由来するホモオリゴマーポア；
−本発明の少なくとも１つの変異体モノマーまたは本発明の少なくとも１つの構造体を含むＣｓｇＧに由来するヘテロオリゴマーポア；
−標的分析物の存在、不在、または１つ以上の特徴を判定するための方法であって、
（ａ）標的分析物がポアに対して移動するように、標的分析物を本発明のポアと接触させることと、
（ｂ）分析物がポアに対して移動する間に１つ以上の測定値を取り、それにより分析物の存在、不在、または１つ以上の特徴を判定することと、を含む、方法；
−標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサを形成する方法であって、本発明のポアとポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体を形成し、それにより標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサを形成することを含む、方法；
−標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサであって、本発明のポアとポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体を含む、センサ；
−標的分析物の存在、不在、または１つ以上の特徴を判定するための、本発明のポアの使用；
−（ａ）本発明のポアと、（ｂ）膜の構成要素と、を含む、標的分析物を特徴付けるためのキット；
−（ａ）本発明の複数のポアと、（ｂ）複数の膜と、を含む、試料中の標的分析物を特徴付けるための装置；
−標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、
ａ）ポリメラーゼによってリン酸標識種が標的ポリヌクレオチドに順次付加されるように、標的ポリヌクレオチドを、本発明のポア、ポリメラーゼ、及び標識ヌクレオチドと接触させることであって、リン酸種が、各ヌクレオチドに特異的な標識を含有する、接触させることと、
ｂ）ポアを使用してリン酸標識種を検出し、それによりポリヌクレオチドを特徴付けることと、を含む、方法；ならびに
−本発明の変異体モノマーまたは本発明の構造体を生成する方法であって、好適な宿主細胞において本発明のポリヌクレオチドを発現させ、それにより本発明の変異体モノマーまたは構造体を生成することを含む、方法。
Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＣｓｇＧを示す。 ＣｓｇＧの寸法を示す。 １０Å／ｎｓでの単一のＧ転移を示す。ＣｓｇＧ−ＥｃｏにおけるＦ５６環へのグアニンの進入に対する大きな障壁が存在する。＊＝ＧがＦ５６環に進入する。Ａ＝Ｇが、５６環との相互作用を止める。Ｂ＝Ｇが、５５環との相互作用を止める。Ｃ＝Ｇが、５１環との相互作用を止める。 １００Å／ｎｓでのｓｓＤＮＡ転移を示す。ＣｓｇＧ−Ｅｃｏの狭窄部位を通してＤＮＡを引くためにより大きな力が必要とされる。 １０Å／ｎｓでのＤＮＡ転移を示す。ＣｓｇＧ−Ｆ５６Ａ−Ｎ５５Ｓ及びＣｓＧ−Ｆ５６Ａ−Ｎ５５Ｓ−Ｙ５１Ａ変異体はどちらも、ｓｓＤＮＡ転移に対するより低い障壁を有する。 野生型（ＷＴ）と比較して増加した範囲を示す変異体ポア。 野生型（ＷＴ）と比較して増加した範囲を示す変異体ポア。 野生型（ＷＴ）と比較して増加した範囲を示す変異体ポア。 野生型（ＷＴ）と比較して増加したスループットを示す変異体ポア。 野生型（ＷＴ）と比較して増加したスループットを示す変異体ポア。 野生型（ＷＴ）と比較して増加した挿入を示す変異体ポア。 野生型（ＷＴ）と比較して増加した挿入を示す変異体ポア。 実施例２に使用されるＤＮＡ構造体Ｘを示す。１と標識された領域は、３０個のＳｐＣ３スペーサに対応した。２と標識された領域は、配列番号４２に対応した。３と標識された領域は、４個のｉＳｐ１８スペーサに対応した。４と標識された領域は、配列番号４３に対応した。５と標識された区画は、４個の５−ニトロインドールに対応した。６と標識された領域は、配列番号４４に対応した。７と標識された領域は、配列番号４５に対応した。８と標識された領域は、配列番号４６に対応し、配列番号４６の３’末端に結合した４個のｉＳｐ１８スペーサ（９と標識された領域）を有した。ｉＳｐ１８スペーサの反対側の端部には、３’コレステロールテザー（１０と標識された）があった。１１と標識された領域は、４個のＳｐＣ３スペーサに対応した。 ＣｓｇＧタンパク質のＳｔｒｅｐ ｔｒａｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）精製の例示的なクロマトグラフィーのトレースを示す（ｘ軸ラベル＝溶出量（ｍＬ）、Ｙ軸ラベル＝吸光度（ｍＡｕ））。２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ ＤＤＭに試料を投入し、１０ｍＭデスチオビオチンで溶出した。ＣｓｇＧタンパク質が溶出した溶出ピークは、Ｅ１と標識されている。 初期ｓｔｒｅｐ精製後のＣｓｇＧタンパク質の典型的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ視覚化の例を示す。１Ｘ ＴＧＳ緩衝液中で、４〜２０％のＴＧＸ Ｇｅｌ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）を３００Ｖで２２分間泳動した。Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ染料でゲルを染色した。レーン１〜３は、矢印で示されるようにＣｓｇＧタンパク質を含有した、主溶出ピーク（図１４でＥ１と標識された）を示す。レーン４〜６は、汚染物質を含有した、主溶出ピーク（図１４でＥ１と標識された）のテールの溶出分画に対応した。Ｍは、使用された分子量マーカーを示し、これはＮｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄであった（単位＝ｋＤ）。 ＣｓｇＧタンパク質のサイズ排除クロマトグラム（ＳＥＣ）を示す（１２０ｍＬ Ｓ２００ ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ｘ軸ラベル＝溶出量（ｍＬ）、ｙ軸ラベル＝吸光度（ｍＡｕ））。ＳＥＣは、ｓｔｒｅｐ精製、及びタンパク質試料の加熱の後に行われた。ＳＥＣの泳動用緩衝液は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ ＤＤＭ、０．１％ ＳＤＳ、ｐＨ８．０であり、カラムは、１ｍＬ／分の速度で泳動された。Ｘと標識されたトレースは、２２０ｎｍでの吸光度を示し、Ｙと標識されたトレースは、２８０ｎｍでの吸光度を示す。星で標識されたピークを回収した。 ＳＥＣ後のＣｓｇＧタンパク質の典型的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ視覚化の例を示す。１Ｘ ＴＧＳ緩衝液中で、４〜２０％のＴＧＸ Ｇｅｌ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）を３００Ｖで２２分間泳動し、Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ染料でゲルを染色した。レーン１は、ｓｔｒｅｐ精製及び加熱の後であるが、ＳＥＣ前のＣｓｇＧタンパク質試料を示す。レーン２〜８は、図１６の約４８ｍＬ〜６０ｍＬで泳動し、図１６において星で標識されたピークにわたって回収された分画を示す（中央ピーク＝５５ｍＬ）。Ｍは、使用された分子量マーカーを示し、これはＮｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄであった（単位＝ｋＤ）。ＣｓｇＧ−Ｅｃｏポアに対応するバーは、矢印によって示されている。 野生型（ＷＴ）と比較して増加した範囲を示す変異体ポア。 野生型（ＷＴ）と比較して増加した範囲を示す変異体ポア。 野生型（ＷＴ）と比較して増加した範囲を示す変異体ポア。 野生型（ＷＴ）と比較して増加した範囲を示す変異体ポア。 野生型（ＷＴ）と比較して増加した範囲を示す変異体ポア。 野生型（ＷＴ）と比較して増加した範囲を示す変異体ポア。 野生型（ＷＴ）と比較して増加した範囲を示す変異体ポア。 野生型（ＷＴ）と比較して増加した範囲を示す変異体ポア。 野生型（ＷＴ）と比較して増加した範囲を示す変異体ポア。 野生型（ＷＴ）と比較して増加した範囲を示す変異体ポア。 野生型（ＷＴ）と比較して増加した範囲を示す変異体ポア。 野生型（ＷＴ）と比較して増加した範囲を示す変異体ポア。 野生型（ＷＴ）と比較して増加した範囲を示す変異体ポア。 シミュレーション（ラン１〜３）中に０及び２０ｎｓで撮られた、ポア（ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端ポア変異体Ｎｏ．２０において結合している））の上にある酵素（Ｔ４ Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ）（Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ変異、次いで（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２を含む配列番号２４））のスナップショットを示す。 シミュレーション（ラン１〜３）中に３０及び４０ｎｓで撮られた、ポア（ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端ポア変異体Ｎｏ．２０において結合している））の上にある酵素（Ｔ４ Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ）（Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ変異、次いで（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２を含む配列番号２４））のスナップショットを示す。 実施例５に記載されるシミュレーション中に撮られた、ポアＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端ポア変異体Ｎｏ．２６において結合している）の上にある酵素（Ｔ４ Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ）（変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ、次いで（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２を含む配列番号２４）のスナップショットを示す。 酵素の制御を伴わずにＭｓｐＡ変異体ｘ＝ＭｓｐＡ−（（Ｄｅｌ−Ｌ７４／Ｇ７５／Ｄ１１８／Ｌ１１９）Ｄ５６Ｆ／Ｅ５９Ｒ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋ）８（変異Ｄ５６Ｆ／Ｅ５９Ｒ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋ、及びアミノ酸Ｌ７４／Ｇ７５／Ｄ１１８／Ｌ１１９の欠失を含む配列番号５０）を通るＤＮＡ（配列番号５１）の転移を示す電流トレースの２つの１０秒間のスクリーンショットを示す。 酵素の制御を伴わずにＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）は、配列番号４７であり、Ｃ末端に結合している）を通るＤＮＡ（配列番号５１）の転移を示す電流トレースの２つの１０秒間のスクリーンショットを示す。 酵素の制御を伴わずにＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｅ１０１Ｓ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｅ１０１Ｓ／Ｒ１９２Ｄを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）は、配列番号４７であり、Ｃ末端に結合している）を通るＤＮＡ（配列番号５１）の転移を示す電流トレースの２つの１０秒間のスクリーンショットを示す。 ＣｓｇＧ変異体ポアＡ）ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）は、配列番号４７であり、Ｃ末端に結合している）及びＢ）ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）は、配列番号４７であり、Ｃ末端に結合している）の２つのゲル濾過クロマトグラム（１２０ｍｌ Ｓ２００カラム）のオーバーレイを示す。ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９についてのＡ２８０での吸光度がＡと標識され、ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９についてはＡ２８０での吸光度がＢと標識されている。両方の構造体は、５００ｍｌの培養液中で増殖された。両方のタンパク質の発現及び精製は全く同じプロトコルを使用して行われ、同じ量がカラムに装填された。泳動用緩衝液は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ ＤＤＭ、０．１％ ＳＤＳ、ｐＨ８であった。ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９ポアでの分数遅延は、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ １０で使用された異なる接続構成に起因した。吸光値の差は、発現されたタンパク質の量を示し、より高い吸光値は、発現されたタンパク質のより多い量を示す。 ＣｓｇＧナノポアのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーンＡ〜Ｃは、ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９を含有し、レーンＤ〜Ｆは、ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９を含有し、レーンＭは、分子量マーカーを含有した。２つのポアは、全く同じプロトコルを使用して発現及び精製された。ポアは、ＴＧＳ緩衝液中４〜２０％のＴＧＸゲル（Ｂｉｏ ｒａｄカタログ番号＃５６７１０９３）上で、３００Ｖで２２分間電気泳動に供された。Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ染料（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号＃Ｓ１２００）でゲルを視覚化した。精製後に得られたタンパク質の量を比較するために、各ポア試料から同じ量がゲルに装填され、レーンＡ及びＤは５ｕＬを含有し、レーンＢ及びＥは１０ｕＬを含有し、レーンＣ及びＦは１５ｕＬを含有した。 ベースラインポアである変異体２８（ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ）９）のベースコール精度と比較した、８個のＣｓｇＧ変異体ポアのベースコール精度を示す。Ｄ１９５−Ｌ１９９の欠失（変異体Ａ）、Ｆ１９３−Ｌ１９９の欠失（変異体Ｂ）、もしくはＶ１０５−Ｉ１０７の欠失（変異体Ｄ）、またはＦ１９１Ｔの置換（変異体Ｃ）は、変異体２８におけるＲ９７Ｗ及びＲ１９２Ｄ置換によってもたらされる精度の改善に加え、さらなる精度の改善をもたらす。Ｖ１０５−Ｉ１０７の欠失のベースコール精度への影響はまた、追加のＫ９４Ｑ変異（変異体Ｅ）を含有する変異体ポアにおいても試験され、ベースライン変異体２８と比較した精度の改善が依然として認められた。Ｒ９７Ｗ変異（ベースライン変異体２８）の代わりに、Ｒ９３Ｗ変異（変異体Ｆ）、またはＲ９３Ｙ及びＲ９７Ｗ変異の両方（変異体Ｈ）を導入することによって、ベースコール精度が増加した。Ｒ９３Ｗの付加（変異体Ｇ）に加えたＤ１９５〜Ｌ１９９の欠失は、ベースコール精度の向上をもたらした。 ベースライン変異体２８ ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ）９、及び追加の欠失Ｖ１０５−Ｉ１０７を含む変異体Ｄの鋳型速度分布（Ａ）及び鋳型精度分布（Ｂ）を示す。鋳型ＤＮＡは、実施例に記載されるように調製され、変異体ポアを通された。鋳型速度及び精度は、実施例に記載されるように判定された。図４０Ａは、ベースライン変異体と比較して変異体Ｄを使用したときに速度分布がより密であったことを示す。図４０Ｂは、ベースライン変異体と比較して変異体Ｄが鋳型精度のより密な分布を有することを示す。 ベースライン変異体２８ ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ）９、及び追加の欠失Ｖ１０５−Ｉ１０７を含む変異体Ｄの鋳型速度分布（Ａ）及び鋳型精度分布（Ｂ）を示す。鋳型ＤＮＡは、実施例に記載されるように調製され、変異体ポアを通された。鋳型速度及び精度は、実施例に記載されるように判定された。図４０Ａは、ベースライン変異体と比較して変異体Ｄを使用したときに速度分布がより密であったことを示す。図４０Ｂは、ベースライン変異体と比較して変異体Ｄが鋳型精度のより密な分布を有することを示す。 ベースライン変異体２８ ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ）９によって呈される「ノイズの多い」ポアエラーモードを示す例示的な「くねった線」を表示する。図４１の上のパネルは、「良好な」ポア状態の間及び「ノイズの多い」ポア状態の間の、ポアを通る電流の流れの差を示す。図４１の下のパネルは、「良好な」状態から「ノイズの多い」状態への移行の拡大図を示す。 少なくとも５回の泳動の平均を取った、ベースライン変異体２８と比較した場合の、追加のＫ９４Ｎ変異（変異体Ｉ）または追加のＫ９４Ｑ変異（変異体Ｊ）と共にＹ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ変異を含有するベースライン変異体２８と同じ配列を有する変異体ポアのノイズの多い状態の低減を示す。 その両端にアダプターがライゲーションされた鋳型鎖の構造を示す。アダプターには、Ｔ４ Ｄｄａヘリカーゼ酵素が予め結合している。実施例に使用されるアダプターの様々な部分の配列は、配列番号５２〜５５に示される。 Ｑ４２Ｋ（変異体Ｋ）、Ｅ４４Ｎ（変異体Ｌ）、Ｅ４４Ｑ（変異体Ｍ）、Ｌ９０Ｒ（変異体Ｎ）、Ｎ９１Ｒ（変異体Ｏ）、Ｉ９５Ｒ（変異体Ｐ）、Ａ９９Ｒ（変異体Ｑ）、Ｅ１０１Ｈ（変異体Ｒ）、Ｅ１０１Ｋ（変異体Ｓ）、Ｅ１０１Ｎ（変異体Ｔ）、Ｅ１０１Ｑ（変異体Ｕ）、Ｅ１０１Ｔ（変異体Ｖ）、及びＱ１１４Ｋ（変異体Ｗ）の置換のうちの１つの含む変異体ＣｓｇＧナノポアのトロンビン結合アプタマー（ＴＢＡ）事象間の時間の中央値を示す。時間の中央値は変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）（ベースライン変異体Ｅ）を含むベースラインポアと比較して著しく低減され、それらは全て、試験された１３個の変異体の各々に含まれている。図４４は、Ｑ４２Ｋ、Ｅ４４Ｎ、Ｅ４４Ｑ、Ｌ９０Ｒ、Ｎ９１Ｒ、Ｉ９５Ｒ、Ａ９９Ｒ、Ｅ１０１Ｈ、Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｎ、Ｅ１０１Ｑ、Ｅ１０１Ｔ、及びＱ１１４Ｋ置換の各々が、鋳型ＤＮＡ捕捉率を増加させることを示す。 配列番号２、５、６、７、２７、２８、２９、３０、３２、３６、３、３５、３１、４０、３３、３４、３７、３９、３８、４１、及び４に対応する２１個のＣｓｇＧ相同体の配列アラインメントを示す。 配列番号２、５、６、７、２７、２８、２９、３０、３２、３６、３、３５、３１、４０、３３、３４、３７、３９、３８、４１、及び４に対応する２１個のＣｓｇＧ相同体の配列アラインメントを示す。 配列番号２、５、６、７、２７、２８、２９、３０、３２、３６、３、３５、３１、４０、３３、３４、３７、３９、３８、４１、及び４に対応する２１個のＣｓｇＧ相同体の配列アラインメントを示す。 推測されるアルファヘリックス二次構造領域がさらに網掛けされた、図４５と同じ相対的な配列アラインメントを示す。 推測されるアルファヘリックス二次構造領域がさらに網掛けされた、図４５と同じ相対的な配列アラインメントを示す。 推測されるアルファヘリックス二次構造領域がさらに網掛けされた、図４５と同じ相対的な配列アラインメントを示す。 推測されるベータシート二次構造領域がさらに網掛けされた、図４５と同じ相対的な配列アラインメントを示す。 推測されるベータシート二次構造領域がさらに網掛けされた、図４５と同じ相対的な配列アラインメントを示す。 推測されるベータシート二次構造領域がさらに網掛けされた、図４５と同じ相対的な配列アラインメントを示す。 ポアＡＱ及びポア９７Ｗの生の電気的データの２つの例を示す。
配列表の説明
配列番号１は、Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株ＭＣ４１００亜株に由来する野生型ＣｓｇＧモノマーをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。このモノマーは、シグナル配列を欠いている。
配列番号２は、Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株ＭＣ４１００亜株に由来する野生型ＣｓｇＧモノマーの成熟型のアミノ酸配列を示す。このモノマーは、シグナル配列を欠いている。このＣｓｇＧに使用される省略形＝ＣｓｇＧ−Ｅｃｏである。
配列番号３は、配列番号２と９９％同一である、仮想タンパク質ＣＫＯ＿０２０３２［Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−８９５］のＹＰ＿００１４５３５９４．１：１−２４８のアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、配列番号２と９８％同一である、ｃｕｒｌｉ産生集合体（ｃｕｒｌｉ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ）／輸送成分ＣｓｇＧ、部分［Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ］のＷＰ＿００１７８７１２８．１：１６−２３８のアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、配列番号２と９８％同一である、ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送タンパク質ＣｓｇＧ［Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ］のＫＥＹ４４９７８．１｜：１６−２７７のアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、配列番号２と９７％同一である、ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送成分［Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ ＩＣＣ１６８］のＹＰ＿００３３６４６９９．１：１６−２７７のアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、配列番号２と９４％同一である、ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送成分ＣｓｇＧ［Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｓｂｕｒｉａｅ ＬＦ７ａ］のＹＰ＿００４８２８０９９．１：１６−２７７のアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号９は、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０は、Ｅ．ｃｏｌｉからのｓｂｃＢ 遺伝子に由来するコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。これは、Ｅ．ｃｏｌｉからのエキソヌクレアーゼＩ酵素（ＥｃｏＥｘｏ Ｉ）をコードする。
配列番号１１は、Ｅ．ｃｏｌｉからのエキソヌクレアーゼＩ酵素（ＥｃｏＥｘｏ Ｉ）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１２は、Ｅ．ｃｏｌｉからのｘｔｈＡ遺伝子に由来するコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。これは、Ｅ．ｃｏｌｉからのエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素をコードする。
配列番号１３は、Ｅ．ｃｏｌｉからのエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素のアミノ酸配列を示す。この酵素は、５’一リン酸ヌクレオシドの分配性消化（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｖｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の一方の鎖から３’−５’方向で行う。鎖上の酵素開始は、約４個のヌクレオチドの５’オーバーハングを必要とする。
配列番号１４は、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのｒｅｃＪ遺伝子に由来するコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。これは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＲｅｃＪ酵素（ＴｔｈＲｅｃＪ−ｃｄ）をコードする。
配列番号１５は、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＲｅｃＪ酵素（ＴｔｈＲｅｃＪ−ｃｄ）のアミノ酸配列を示す。この酵素は、５’一リン酸ヌクレオシドの加工性消化（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）をｓｓＤＮＡから５’−３’方向で行う。鎖上の酵素開始は、約４個のヌクレオチドを必要とする。
配列番号１６は、バクテリオファージラムダｅｘｏ（ｒｅｄＸ）遺伝子に由来するコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。これは、バクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼをコードする。
配列番号１７は、バクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。配列は、トリマーを形成する３つの同一のサブユニットのうちの１つである。酵素は、高度な加工性消化をｄｓＤＮＡの一方の鎖から５’−３’方向に行う（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂｅｃｏｍｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｒｏｄｕｃｔＭ０２６２．ａｓｐ）。鎖上の酵素開始は、優先的に、５’リン酸を有する約４個のヌクレオチドの５’オーバーハングを必要とする。
配列番号１８は、Ｈｅｌ３０８ Ｍｂｕのアミノ酸配列を示す。
配列番号１９は、Ｈｅｌ３０８ Ｃｓｙのアミノ酸配列を示す。
配列番号２０は、Ｈｅｌ３０８ Ｔｇａのアミノ酸配列を示す。
配列番号２１は、Ｈｅｌ３０８ Ｍｈｕのアミノ酸配列を示す。
配列番号２２は、ＴｒａＩ Ｅｃｏのアミノ酸配列を示す。
配列番号２３は、ＸＰＤ Ｍｂｕのアミノ酸配列を示す。
配列番号２４は、Ｄｄａ １９９３のアミノ酸配列を示す。
配列番号２５は、Ｔｒｗｃ Ｃｂａのアミノ酸配列を示す。
配列番号２６は、配列番号２と９１％同一である、輸送体［Ｙｏｋｅｎｅｌｌａ ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇｅｉ］のＷＰ＿００６８１９４１８．１：１９−２８０のアミノ酸配列を示す。
配列番号２７は、配列番号２と８９％同一である、ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送タンパク質ＣｓｇＧ［Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｐｕｌｖｅｒｉｓ］のＷＰ＿０２４５５６６５４．１：１６−２７７のアミノ酸配列を示す。
配列番号２８は、配列番号２と８４％同一である、ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送タンパク質ＣｓｇＧ［Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ ＨＸ２］のＹＰ＿００５４００９１６．１：１６−２７７のアミノ酸配列を示す。
配列番号２９は、配列番号２と８２％同一である、ＣｓｇＧファミリーｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送成分［Ｋｌｕｙｖｅｒａ ａｓｃｏｒｂａｔａ ＡＴＣＣ ３３４３３］のＫＦＣ９９２９７．１：２０−２７８のアミノ酸配列を示す。
配列番号３０は、配列番号２と８１％同一である、ＣｓｇＧファミリーｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送成分［Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ ＡＴＣＣ １３３３７］のＫＦＣ８６７１６．１｜：１６−２７４のアミノ酸配列を示す。
配列番号３１は、配列番号２と７６％同一である、ｃｕｒｌｉポリマーの形成に関与する性質不明のタンパク質［Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ細菌株ＦＧＩ ５７］のＹＰ＿００７３４０８４５．１｜：１６−２７０のアミノ酸配列を示す。
配列番号３２は、配列番号２と７０％同一である、ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送タンパク質ＣｓｇＧ［Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ］のＷＰ＿０１０８６１７４０．１：１７−２７４のアミノ酸配列を示す。
配列番号３３は、配列番号２と６０％同一である、ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送外膜リポタンパク質成分ＣｓｇＧ［Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ ＥＳ１１４］のＹＰ＿２０５７８８．１：２３−２７０のアミノ酸配列を示す。
配列番号３４は、配列番号２と５９％同一である、ｃｕｒｌｉ産生集合体タンパク質ＣｓｇＧ［Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ ｌｏｇｅｉ］のＷＰ＿０１７０２３４７９．１：２３−２７０のアミノ酸配列を示す。
配列番号３５は、配列番号２と５７％同一である、Ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送成分ＣｓｇＧ［Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＡＫ１５］のＷＰ＿００７４７０３９８．１：２２−２７５のアミノ酸配列を示す。
配列番号３６は、配列番号２と５６％同一である、のアミノ酸配列を示す。ｃｕｒｌｉ産生集合体タンパク質ＣｓｇＧ［Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｖｅｒｏｎｉｉ］のＷＰ＿０２１２３１６３８．１：１７−２７７のアミノ酸配列を示す。
配列番号３７は、配列番号２と５６％同一である、ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送タンパク質ＣｓｇＧ［Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ＥＣＳＭＢ１４１０１］のＷＰ＿０３３５３８２６７．１：２７−２６５のアミノ酸配列を示す。
配列番号３８は、配列番号２と５４％同一である、ｃｕｒｌｉ産生集合体タンパク質ＣｓｇＧ［Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ］のＷＰ＿００３２４７９７２．１：３０−２６２のアミノ酸配列を示す。
配列番号３９は、配列番号２と５３％同一である、ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送成分ＣｓｇＧ［Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｖｉｏｌａｃｅａ ＤＳＳ１２］のＹＰ＿００３５５７４３８．１：１−２３４のアミノ酸配列を示す。
配列番号４０は、配列番号２と５３％同一である、ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送タンパク質ＣｓｇＧ［Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ］のＷＰ＿０２７８５９０６６．１：３６−２８０のアミノ酸配列を示す。
配列番号４１は、配列番号２と５０％同一である、Ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送成分ＣｓｇＧ［Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｒａｎｉｍｅｎｓｅ Ｇ３１１］のＣＥＪ７０２２２．１：２９−２６２のアミノ酸配列を示す。
配列番号４２は、実施例２に使用されたポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号４３は、実施例２に使用されたポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号４４は、実施例２に使用されたポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号４５は、実施例２に使用されたポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号４６は、実施例２に使用されたポリヌクレオチド配列を示す。配列番号４６の３’末端には、６つのｉＳｐ１８スペーサが結合しており、これらは２つのチミン及び３’コレステロールＴＥＧの反対側に結合している。
配列番号４７は、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）のポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号４８は、Ｐｒｏのポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号４９は、野生型ＭｓｐＡモノマーをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。この変異体は、シグナル配列を欠いている。
配列番号５０は、野生型ＭｓｐＡモノマーの成熟型のアミノ酸配列を示す。この変異体は、シグナル配列を欠いている。
配列番号５１は、実施例７及び１１に使用されたトロンビン結合アプタマーのポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号５２は、Ｙアダプターの上の鎖のポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号５３は、Ｙアダプターブロッカー鎖のポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号５４は、Ｙアダプターコレステロールテザー鎖のポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号５５は、Ｙアダプターの下の鎖のポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号５６は、実施例に使用された３．６ｋｂ二本鎖ＤＮＡ標的配列のポリヌクレオチド配列を示す。
開示される生成物及び方法の異なる適用が、当該技術分野における特定の必要性に適合され得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、本発明の特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、限定的であることは意図されないことも理解されたい。
さらに、本明細書及び添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に示さない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド」への言及は２つ以上のポリヌクレオチドを含み、「ポリヌクレオチド結合タンパク質」への言及は２つ以上のかかるタンパク質を含み、「ヘリカーゼ」への言及は２つ以上のヘリカーゼを含み、「モノマー」への言及は２つ以上のモノマーを指し、「ポア」への言及は２つ以上のポアなどを含む。
上記または下記の本明細書に引用される全ての出版物、特許、及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
変異体ＣｓｇＧモノマー
本発明の一態様は、変異体ＣｓｇＧモノマーを提供する。変異体ＣｓｇＧモノマーを使用して、本発明のポアを形成することができる。変異体ＣｓｇＧモノマーは、その配列が野生型ＣｓｇＧモノマーとは異なり、ポアを形成する能力を保持するモノマーである。変異体モノマーのポアを形成する能力を確認するための方法は、当該技術分野で周知であり、以下により詳細に論じられる。
修飾Ｒ９７Ｗを含む本発明のいくつかの実施形態のＣｓｇＧモノマーから構成されたポアは、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける（またはシークエンシングする）ときに、９７における修飾を含まない、さもなければ同一なポアと比較して増加した精度を提示する。増加した精度は、Ｒ９７Ｗの代わりに、本発明のＣｓｇＧモノマーが修飾Ｒ９３Ｗまたは修飾Ｒ９３Ｙ及びＲ９７Ｙを含む場合にも見られる。したがって、ポアは、修飾がアミノ酸の疎水性を増加させるように、配列番号２のＲ９７またはＲ９３における修飾を含む１つ以上の変異体ＣｓｇＧモノマーから構成され得る。例えば、かかる修飾には、例えばＷ及びＹを含むがこれらに限定されない疎水性側鎖を含有する任意のアミノ酸でのアミノ酸置換が含まれ得る。
Ｒ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／Ｔを含む本発明のいくつかの実施形態のＣｓｇＧモノマーは、１９２位における置換を含まないモノマーよりも発現させることが容易であり、これは正電荷の低減に起因し得る。したがって、１９２位は、正電荷を低減させるアミノ酸で置換されてもよい。Ｒ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／Ｔを含む本発明のモノマーはまた、モノマーから形成された変異体ポアの、ポリヌクレオチドなどの分析物と相互作用し、かつそれらを特徴付ける能力を改善させる追加の修飾を含んでもよい。
Ｖ１０５、Ａ１０６、及びＩ１０７の欠失、Ｆ１９３、Ｉ１９４、Ｄ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、及びＬ１９９の欠失、またはＤ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、及びＬ１９９の欠失、ならびに／またはＦ１９１Ｔを含む、本発明のいくつかの実施形態のＣｓｇＧモノマーを含むポアは、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける（またはシークエンシングする）ときに、増加した精度を提示する。１０５から１０７位におけるアミノ酸は、ナノポアのキャップ内のシス−ループに対応し、１９３〜１９９位におけるアミノ酸は、ポアの他方の末端におけるトランス−ループに対応する。理論によって拘束されることを望むものではないが、シス−ループの欠失は、酵素のポアとの相互作用を改善させ、トランス−ループの除去は、最高のトランス側のＤＮＡ間の望ましくない相互作用を減少させると考えられている。
Ｋ９４ＱまたはＫ９４Ｎを含む、本発明のいくつかの実施形態のＣｓｇＧモノマーを含むポアは、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける（またはシークエンシングする）ときに、９４における変異を含まない同一のポアと比較して、ノイズの多いポアポア（すなわち、シグナル：ノイズ比の増加をもたらすポア）の数の低減を示す。９４位は、ポアの玄関内に見出され、電流シグナルのノイズに関して特に敏感な位置であることが見出された。
Ｔ１０４ＫもしくはＴ１０４Ｒ、Ｎ９１Ｒ、Ｅ１０１Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｈ、Ｅ４４Ｎ／Ｑ、Ｑ１１４Ｋ、Ａ９９Ｒ、Ｉ９５Ｒ、Ｎ９１Ｒ、Ｌ９０Ｒ、Ｅ４４Ｑ／Ｎ、及び／またはＱ４２Ｋを含む本発明のいくつかの実施形態のＣｓｇＧモノマーを含むポアは全て、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける（またはシークエンスする）ために使用された場合、これらの位置における置換を含まない同一のポアと比較して改善した標的ポリヌクレオチド捕捉能力を示す。
膜貫通ポアを使用するポリヌクレオチドの特徴付け、例えばシークエンシングは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２３４３号（ＷＯ２０１３／０４１８７８として公開）に開示されるように実施され得る。標的ポリヌクレオチドがポアに対して、またはそれを通って移動するにつれて、分析物は、生成された固有のイオン電流シグネチャから、典型的には、ポアを通るイオン電流を測定することによって特徴付けられ得る。任意の特定の時間で測定された電流レベルは、典型的には、ｋポリマー（例えばヌクレオチド）単位の基に依拠し、ｋは、正の整数であり、典型的な電流シグネチャは、特定のｋ−マーを示す一連の電流レベルとして表され得る。ポアに対する、例えばそれを通るポリヌクレオチドの移動は、１つのｋ−マーから別のものへの移動、またはｋ−マーからｋ−マーへの移動として見ることができる。ポリヌクレオチドを特徴付ける分析技術は、例えば、ニューラルネットワークであるＨＭＭ、及び例えばＦｏｒｗａｒｄｓ ＢａｃｋｗａｒｄｓアルゴリズムまたはＶｉｔｅｒｂｉアルゴリズムの使用を伴って、特定の配列に対応する一連の測定の可能性を判定する場合がある。代替的には、ポリヌクレオチドは、特徴ベクトルを判定し、該特徴ベクトルを別の特徴ベクトルと比較することによって特徴づけられてもよく、これは既知であり得、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５０３８１号（ＷＯ２０１３／１２１２２４として公開）に開示されている。しかしながら、ポリヌクレオチドを特徴付けるために使用される分析技術は、必ずしも上記の例に制限されない。
本発明のモノマーが膜貫通ポアを形成し、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためにポリヌクレオチド結合タンパク質と共に使用される場合、修飾された位置のうちのいくつかは、ポリヌクレオチド結合タンパク質と相互作用する。例えば、モノマーが膜貫通ポアを形成し、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためにポリヌクレオチド結合タンパク質と共に使用される場合、Ｒ９７Ｗは、ポリヌクレオチド結合タンパク質と相互作用する。本発明に従うＣｓｇＧモノマーの修飾は、典型的には、モノマーを含む膜貫通ポアに対する、例えばそれを通る標的ポリヌクレオチドのより一貫した移動を提供する。修飾（複数可）は、典型的には、ポアに対して、例えばそれを通って標的ポリヌクレオチドが移動する間の、より一貫した、１つのｋ−マーから別のものへ、またはｋ−マーからｋ−マーへの移動を提供する。修飾（複数可）は、典型的には、標的ポリヌクレオチドが、膜貫通ポアに対して、例えばそれを通ってより滑らかに移動することを可能にする。修飾（複数可）は、典型的には、膜貫通ポアに対する、例えばそれを通る標的ポリヌクレオチドの、より規則的な、またはより不規則でない移動を提供する。
本発明に従うＣｓｇＧモノマーの修飾（例えば、Ｒ９７Ｗ）は、典型的には、モノマーを含むポアに対する、例えばそれを通る標的ポリヌクレオチドの移動に関連付けられる前滑りの量を低減する。実施例に使用されるＤｄａヘリカーゼを含むいくつかのヘリカーゼは、ポリヌクレオチドに沿って５’から３’方向に移動する。ポリヌクレオチドの５’末端（ヘリカーゼがそこから離れて移動する末端）がポアによって捕捉されると、ヘリカーゼは、印加された電位によってもたらされる電界の方向に働き、ねじ状ポリヌクレオチドをポア内及びトランスチャンバ内に移動させる。前滑りは、ＤＮＡが、少なくとも４個の連続したヌクレオチド、典型的には１０個超の連続したヌクレオチドをポアに対して前に（すなわち、その３’に向かって、かつその５’末端から離れて）移動することを伴う。前滑りは、１００個以上の連続したヌクレオチドを前に移動させることを伴う場合があり、これは各鎖において一度より多く生じ得る。
ＣｓｇＧモノマーの修飾は、モノマーを含む膜貫通ポアに対する、例えばそれを通る標的ポリヌクレオチドの移動に関連付けられるノイズを低減し得る。シグナルが分析されている間の任意の寸法における標的ポリヌクレオチドの望ましくない移動は、典型的には、ｋ−マーの電流シグネチャまたは電流レベルにおけるノイズをもたらす。修飾は、標的ポリヌクレオチドにおける１つ以上のｋ−マー、例えば各ｋ−マーに関連付けられる望ましくない移動を低減することによって、このノイズを低減し得る。修飾は、標的ポリヌクレオチドにおける１つ以上のｋ−マー、例えば各ｋ−マーの電流レベルまたはシグネチャに関連付けられるノイズを低減し得る。
ポリヌクレオチドの移動のために用いられる酵素モーターは、ＡＴＰが加水分解されて、ポリヌクレオチドを１塩基分前に移動させる完全な触媒サイクルにおいて複数のサブステップ（例えば、ＡＴＰ．Ｍｇの結合、ＡＤＰ．Ｐ．Ｍｇを生成するための加水分解、ポリヌクレオチドを１塩基分前に移動させること、及びＡＤＰ／Ｐ／Ｍｇ副生成物の放出）を有する。各サブステッププロセスは、プロセスの動力学によって決定される、特有の滞留時間分布を有する。触媒サイクルのこれらのサブステップのうちのいずれかによって読み取り装置内のポリヌクレオチドの位置が移動した場合（例えば、酵素に対してポリヌクレオチドを移動させることによって、またはポアの上部の酵素の位置を変えることによって）、これは、その変化が取得電子装置によって検出されるのに十分な長さにわたって持続する限り、ポアを通る電流の変化として認められる。サブステッププロセスがポリヌクレオチドの立体構造の変化もしくはシフトをもたらさないか、またはそれらが生じたが観察するには短すぎた場合、理想的なシステムでは、完全な触媒サイクルは、ポリヌクレオチドが１整数塩基分前に移動するための電流における１ステップの変化のみがもたらされる。
Ｒ９７Ｗを含有しないポア（例えば、Ｐｒｏ−ＣＰ１−Ｅｃｏ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９）については、モデルによって予測される長い滞留時間レベルが認められ、ＡＴＰ．Ｍｇ濃度に依拠する近似的な指数滞留分布を伴う。ポアＡＱについても、図４８に印されるように、主要レベル間のサブステップ電流レベルを短くした。サブステップ電流レベルを短くしたため、それらは、２つの広く分離した電流レベル間の間隙において最も容易に認められる。サブステップレベルは、ポリヌクレオチドの中間の約０．５塩基移動に対応し、これらの条件下で、約３ミリ秒のＡＴＰ．Ｍｇ独立滞留時間を有する。
Ｒ９７Ｗを含有するポア（例えば、Ｐｒｏ−ＣＰ１−Ｅｃｏ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９）は、ＡＴＰ．Ｍｇ依存滞留時間と同様のより長く持続する主要レベルを示すが、これらの条件下で、またはこの取得周波数においてはっきりとした中間サブステップ電流レベルの兆候を全く示さない（考えられる説明は、それらが生じていないこと、生じるが観察するには短すぎること、またはサブステップが生じかつ原理的には観察するのに十分にゆっくりであるが、実践的には例えば酵素がポアと相互作用する方法に起因して観察されないことである）。
生データトレース（図４８）は、ポアＰｒｏ−ＣＰ１−Ｅｃｏ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（ポア９７Ｗ）及びＰｒｏ−ＣＰ１−Ｅｃｏ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（ポアＡＱ）の、ナノポアを通る酵素制御ＤＮＡ鎖転移のイオン電流（ｙ軸、ｐＡ）対時間（ｘ軸、秒）のトレースを示す。各電流レベルは、イオンの流れを改変するナノポア読み取り装置によって保持された配列の結果であり、ポリヌクレオチドがナノポア内で位置を変えるとき、例えば酵素が鎖全体を１塩基分前に移動させるときに、電流の段階的な変化が認められる。この場合、ＤＮＡ鎖は、反復配列（ＧＧＴＴ）ｎを部分的に含有する。データは、Ｄｄａ酵素を合成ＤＮＡポリヌクレオチド上に装填し、生データ出力を記録するＭｉｎＩＯＮ（Ｃｉｓ緩衝液：５００ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）、０．６ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．６ｍＭ ＡＴＰ、１４０ｍＶ、３７ｄｅｇＣ、５ｋＨｚ取得周波数）上で泳動することによって取得された。ポア９７Ｗは、ポリヌクレオチドの整数の段階的移動からの主要電流レベルのみを示し、レベル間の顕著なデータ密度はなかった。対照的に、ポアＡＱは、図４８において矢印で印されるように、顕著な中間サブステップレベルを有する。
変異体モノマーは、好ましくは、改善したポリヌクレオチド読み取り特性を有し、すなわち、ポリヌクレオチド捕捉及びヌクレオチド識別の改善を提示する。とりわけ、変異体モノマーから構成されたポアは、好ましくは、野生型よりも容易にヌクレオチド及びポリヌクレオチドを捕捉する。さらに、変異体モノマーから構成されたポアは、好ましくは、異なるヌクレオチド間の識別を容易にする電流範囲の増加、及びシグナル対ノイズ比を増加させる状態の変動の低下を提示する。
さらに、変異体から構成されたポアを通ってポリヌクレオチドが移動する間の、電流に寄与するヌクレオチドの数は、好ましくは、減少する。これは、ポアを通ってポリヌクレオチドが移動する間に認められた電流と、ポリヌクレオチド配列との間の直接的な関係性を特定することを容易にする。さらに、変異体モノマーから構成されたポアは、増加したスループットを提示し得、すなわち、ポリヌクレオチドなどの分析物と相互作用する可能性がより高い。これは、ポアを使用して分析物を特徴付けることをより容易にする。変異体モノマーから構成されたポアは、より容易に膜内に挿入し得る。本発明の変異体モノマーは、配列番号２に示される配列のバリアントを含む。配列番号２は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株ＭＣ４１００亜株に由来する野生型ＣｓｇＧモノマーである。配列番号２のバリアントは、配列番号２のものとは異なるアミノ酸配列を有し、かつポアを形成する能力を保持するポリペプチドである。ポアを形成する変異体の能力は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用してアッセイすることができる。例えば、バリアントは、他の適切なサブユニットと共に両親媒性層内に挿入され得、ポアを形成するそのオリゴマー形成能力が判定され得る。サブユニットを両親媒性層などの膜内に挿入するための方法は、当該技術分野で既知である。例えば、サブユニットは、それが膜に拡散され、膜に結合し機能状態を形成することによって挿入されるように、トリブロックコポリマー膜を含有する溶液中に精製された形態で懸濁され得る。
本明細書中の全ての論議において、アミノ酸の標準的な１文字のコードが使用される。それらは以下の通りである：アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、及びバリン（Ｖ）。標準的な置換記法も使用され、すなわち、Ｑ４２Ｒは、４２位におけるＱがＲで置換されていることを意味する。
本発明の変異体モノマーの一実施形態では、配列番号２のバリアントは、（ａ）以下の位置、Ｉ４１、Ｒ９３、Ａ９８、Ｑ１００、Ｇ１０３、Ｔ１０４、Ａ１０６、Ｉ１０７、Ｎ１０８、Ｌ１１３、Ｓ１１５、Ｔ１１７、Ｙ１３０、Ｋ１３５、Ｅ１７０、Ｓ２０８、Ｄ２３３、Ｄ２３８、及びＥ２４４における１つ以上の変異（すなわち、これらの位置のうちの１つ以上における変異）、ならびに／または（ｂ）Ｄ４３Ｓ、Ｅ４４Ｓ、Ｆ４８Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｙ／Ｗ／Ｉ／Ｖ／Ｈ／Ｒ／Ｋ、Ｑ８７Ｎ／Ｒ／Ｋ、Ｎ９１Ｋ／Ｒ、Ｋ９４Ｒ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｓ／Ｎ、Ｒ９７Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｖ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｑ／Ｈ、Ｅ１０１Ｉ／Ｌ／Ａ／Ｈ、Ｎ１０２Ｋ／Ｑ／Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｓ／Ｈ、Ｒ１１０Ｆ／Ｇ／Ｎ、Ｑ１１４Ｒ／Ｋ、Ｒ１４２Ｑ／Ｓ、Ｔ１５０Ｙ／Ａ／Ｖ／Ｌ／Ｓ／Ｑ／Ｎ、Ｒ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／Ｔ、及びＤ２４８Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｋ／Ｒのうちの１つ以上を含む。バリアントは、（ａ）、（ｂ）、または（ａ）及び（ｂ）を含み得る。
本発明のいくつかの実施形態では、配列番号２のバリアントは、Ｒ９７Ｗを含む。
本発明のいくつかの実施形態では、配列番号２のバリアントは、Ｒ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／Ｔ、好ましくはＲ１９２Ｄ／Ｑ、より好ましくはＲ１９２Ｄを含む。（ａ）において、バリアントは、これらの位置のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９個などの任意の数及び組み合わせの位置において修飾を含み得る。（ａ）において、バリアントは、好ましくは、Ｉ４１Ｎ、Ｒ９３Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｎ／Ｑ／Ｓ、Ａ９８Ｋ／Ｒ、Ｑ１００Ｋ／Ｒ、Ｇ１０３Ｆ／Ｗ／Ｓ／Ｎ／Ｋ／Ｒ、Ｔ１０４Ｒ／Ｋ、Ａ１０６Ｒ／Ｋ、Ｉ１０７Ｒ／Ｋ／Ｗ／Ｆ／Ｙ／Ｌ／Ｖ、Ｎ１０８Ｒ／Ｋ、Ｌ１１３Ｋ／Ｒ、Ｓ１１５Ｒ／Ｋ、Ｔ１１７Ｒ／Ｋ、Ｙ１３０Ｗ／Ｆ／Ｈ／Ｑ／Ｎ、Ｋ１３５Ｌ／Ｖ／Ｎ／Ｑ／Ｓ、Ｅ１７０Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｋ／Ｒ、Ｓ２０８Ｖ／Ｉ／Ｆ／Ｗ／Ｙ／Ｌ／Ｔ、Ｄ２３３Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｋ／Ｒ、Ｄ２３８Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｋ／Ｒ、及びＥ２４４Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｋ／Ｒのうちの１つ以上を含む。
（ａ）において、バリアントは、好ましくは、モノマーを含む膜貫通ポアに対する、例えばそれを通る標的ポリヌクレオチドのより一貫した移動を提供する１つ以上の修飾を含む。とりわけ、（ａ）において、バリアントは、好ましくは、以下の位置、Ｒ９３、Ｇ１０３、Ｉ１０７における１つ以上の変異（すなわち、これらの位置のうちの１つ以上における変異）を含む。バリアントは、Ｒ９３；Ｇ１０３；Ｉ１０７；Ｒ９３及びＧ１０３；Ｒ９３及びＩ１０７；Ｇ１０３及びＩ１０７；またはＲ９３、Ｇ１０３及びＩ１０７を含み得る。バリアントは、好ましくは、Ｒ９３Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｎ／Ｑ／Ｓ、Ｇ１０３Ｆ／Ｗ／Ｓ／Ｎ／Ｋ／Ｒ、及びＩ１０７Ｒ／Ｋ／Ｗ／Ｆ／Ｙ／Ｌ／Ｖのうちの１つ以上を含む。これらは、Ｒ９３位、Ｇ１０３位、及びＩ１０７位について示される任意の組み合わせで存在し得る。
（ａ）において、バリアントは、好ましくは、変異体モノマーから構成されたポアが、好ましくはヌクレオチド及びプリヌクレオチドをより容易に捕捉することを可能にする、１つまたは修飾を含む。とりわけ、（ａ）において、バリアントは、好ましくは、以下の位置、Ｉ４１、Ｔ１０４、Ａ１０６、Ｎ１０８、Ｌ１１３、Ｓ１１５、Ｔ１１７、Ｅ１７０、Ｄ２３３、Ｄ２３８、及びＥ２４４における１つ以上の変異（すなわち、これらの位置のうちの１つ以上における変異）を含む。バリアントは、これらの位置のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個などの任意の数及び組み合わせの位置において修飾を含み得る。バリアントは、好ましくは、Ｉ４１Ｎ、Ｔ１０４Ｒ／Ｋ、Ａ１０６Ｒ／Ｋ、Ｎ１０８Ｒ／Ｋ、Ｌ１１３Ｋ／Ｒ、Ｓ１１５Ｒ／Ｋ、Ｔ１１７Ｒ／Ｋ、Ｅ１７０Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｋ／Ｒ、Ｄ２３３Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｋ／Ｒ、Ｄ２３８Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｋ／Ｒ、及びＥ２４４Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｋ／Ｒのうちの１つ以上を含む。さらに、または代替的に、バリアントは、（ｃ）Ｑ４２Ｋ／Ｒ、Ｅ４４Ｎ／Ｑ、Ｌ９０Ｒ／Ｋ、Ｎ９１Ｒ／Ｋ、Ｉ９５Ｒ／Ｋ、Ａ９９Ｒ／Ｋ、Ｅ１０１Ｈ／Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、及び／またはＱ１１４Ｋ／Ｒを含んでもよい。
（ａ）において、バリアントは、好ましくは、より一貫した移動を提供し、かつ捕捉を増加させる１つ以上の修飾を含む。とりわけ、（ａ）において、バリアントは、好ましくは、以下の位置、（ｉ）Ａ９８、（ｉｉ）Ｑ１００、（ｉｉｉ）Ｇ１０３、及び（ｉｖ）Ｉ１０７における１つ以上の変異（すなわち、これらの位置のうちの１つ以上における変異）を含む。バリアントは、好ましくは、（ｉ）Ａ９８Ｒ／Ｋ、（ｉｉ）Ｑ１００Ｋ／Ｒ、（ｉｉｉ）Ｇ１０３Ｋ／Ｒ、及び（ｉｖ）Ｉ１０７Ｒ／Ｋのうちの１つ以上を含む。バリアントは、｛ｉ｝；｛ｉｉ｝；｛ｉｉｉ｝；｛ｉｖ｝；｛ｉ，ｉｉ｝；｛ｉ，ｉｉｉ｝；｛ｉ，ｉｖ｝；｛ｉｉ，ｉｉｉ｝；｛ｉｉ，ｉｖ｝；｛ｉｉｉ，ｉｖ｝；｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ｝；｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ｝；｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝；｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝；または｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝を含んでもよい。
ポリヌクレオチドなどの分析物の捕捉の増加を提供する特に好ましい変異体モノマーは、Ｑ４２位、Ｅ４４位、Ｅ４４位、Ｌ９０位、Ｎ９１位、Ｉ９５位、Ａ９９位、Ｅ１０１位、及びＱ１１４のうちの１つ以上における変異を含み、これらの変異は、変異した位置において負電荷を除去し、かつ／または正電荷を増加させる。とりわけ、分析物、好ましくはポリヌクレオチドを捕捉する改善した能力を有するＣｓｇＧモノマーを生成するために、以下の変異、Ｑ４２Ｋ、Ｅ４４Ｎ、Ｅ４４Ｑ、Ｌ９０Ｒ、Ｎ９１Ｒ、Ｉ９５Ｒ、Ａ９９Ｒ、Ｅ１０１Ｈ、Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｎ、Ｅ１０１Ｑ、Ｅ１０１Ｔ、及びＱ１１４Ｋが本発明の変異体モノマーに含まれ得る。他の有益な変異と組み合わせて、これらの変異のうちの１つを含む特定の変異体モノマーの例は、実施例１１に記載される。
（ａ）において、バリアントは、好ましくは、特徴付け精度の増加を提供する１つ以上の修飾を含む。とりわけ、（ａ）において、バリアントは、好ましくは、以下の位置、Ｙ１３０、Ｋ１３５、及びＳ２０８、例えばＹ１３０；Ｋ１３５；Ｓ２０８；Ｙ１３０及びＫ１３５；Ｙ１３０及びＳ２０８；Ｋ１３５及びＳ２０８；またはＹ１３０、Ｋ１３５、及びＳ２０８、における１つ以上の変異（すなわち、これらの位置のうちの１つ以上における変異）を含む。バリアントは、好ましくは、Ｙ１３０Ｗ／Ｆ／Ｈ／Ｑ／Ｎ、Ｋ１３５Ｌ／Ｖ／Ｎ／Ｑ／Ｓ、及びＲ１４２Ｑ／Ｓのうちの１つ以上を含む。これらの置換は、Ｙ１３０、Ｋ１３５、及びＳ２０８について記載されるように、任意の数及び組み合わせで存在し得る。
（ｂ）において、バリアントは、これらの置換のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個などの任意の数及び組み合わせの置換を含み得る。（ｂ）において、バリアントは、好ましくは、モノマーを含む膜貫通ポアに対する、例えばそれを通る標的ポリヌクレオチドのより一貫した移動を提供する１つ以上の修飾を含む。とりわけ、（ｂ）において、バリアントは、好ましくは、（ｉ）Ｑ８７Ｎ／Ｒ／Ｋ、（ｉｉ）Ｋ９４Ｒ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｓ／Ｎ、（ｉｉｉ）Ｒ９７Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｖ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｑ／Ｈ、（ｉｖ）Ｎ１０２Ｋ／Ｑ／Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｓ／Ｈ、及び（ｖ）Ｒ１１０Ｆ／Ｇ／Ｎのうちの１つ以上１つ以上を含む。より好ましくは、バリアントは、Ｋ９４ＤもしくはＫ９４Ｑ、及び／またはＲ９７ＷもしくはＲ９７Ｙを含む。バリアントは、｛ｉ｝；｛ｉｉ｝；｛ｉｉｉ｝；｛ｉｖ｝；｛ｖ｝；｛ｉ，ｉｉ｝；｛ｉ，ｉｉｉ｝；｛ｉ，ｉｖ｝；｛ｉ，ｖ｝；｛ｉｉ，ｉｉｉ｝；｛ｉｉ，ｉｖ｝；｛ｉｉ，ｖ｝；｛ｉｉｉ，ｉｖ｝；｛ｉｉｉ，ｖ｝；｛ｉｖ，ｖ｝；｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ｝；｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ｝；｛ｉ，ｉｉ，ｖ｝；｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝；｛ｉ，ｉｉｉ，ｖ｝；｛ｉ，ｉｖ，ｖ｝；｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝；｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ｝；｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ｝；｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝；｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝；｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ｝；｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ｝；｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝；｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝；または｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝を含んでもよい。モノマーを含む膜貫通ポアに対する、例えばそれを通る標的ポリヌクレオチドのより一貫した移動を提供するために修飾された他の好ましいバリアントは、（ｖｉ）Ｒ９３Ｗ及びＲ９３Ｙを含む。好ましいバリアントは、Ｒ９３Ｗ及びＲ９７Ｗ、Ｒ９３Ｙ及びＲ９７Ｗ、Ｒ９３Ｗ及びＲ９７Ｗ、またはより好ましくはＲ９３Ｙ及びＲ９７Ｙを含み得る。バリアントは、｛ｖｉ｝；｛ｉ，ｖｉ｝；｛ｉｉ，ｖｉ｝；｛ｉｉｉ，ｖｉ｝；｛ｉｖ，ｖｉ｝；｛ｖ，ｖｉ｝；｛ｉ，ｉｉ，ｖｉ｝；｛ｉ，ｉｉｉ，ｖｉ｝；｛ｉ，ｉｖ，ｖｉ｝；｛ｉ，ｖ，ｖｉ｝；｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉ｝；｛ｉｉ，ｉｖ，ｖｉ｝；｛ｉｉ，ｖ，ｖｉ｝；｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ｝；｛ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ｝；｛ｉｖ，ｖ，ｖｉ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉ｝；｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖｉ｝；｛ｉ，ｉｉ，ｖ，ｖｉ｝、｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ｝；｛ｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ｝；｛ｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ｝；｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ｝；｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ｝；｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ｝；｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ｝；｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ｝；｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ｝；｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ｝；または｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ｝を含んでもよい。
（ｂ）において、バリアントは、好ましくは、変異体モノマーから構成されたポアが、好ましくはヌクレオチド及びプリヌクレオチドをより容易に捕捉することを可能にする、１つまたは修飾を含む。とりわけ、（ｂ）において、バリアントは、好ましくは、（ｉ）Ｄ４３Ｓ、（ｉｉ）Ｅ４４Ｓ、（ｉｉｉ）Ｎ９１Ｋ／Ｒ、（ｉｖ）Ｑ１１４Ｒ／Ｋ、及び（ｖ）Ｄ２４８Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｋ／Ｒのうちの１つ以上を含む。バリアントは、｛ｉ｝；｛ｉｉ｝；｛ｉｉｉ｝；｛ｉｖ｝；｛ｖ｝；｛ｉ，ｉｉ｝；｛ｉ，ｉｉｉ｝；｛ｉ，ｉｖ｝；｛ｉ，ｖ｝；｛ｉｉ，ｉｉｉ｝；｛ｉｉ，ｉｖ｝；｛ｉｉ，ｖ｝；｛ｉｉｉ，ｉｖ｝；｛ｉｉｉ，ｖ｝；｛ｉｖ，ｖ｝；｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ｝；｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ｝；｛ｉ，ｉｉ，ｖ｝；｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝；｛ｉ，ｉｉｉ，ｖ｝；｛ｉ，ｉｖ，ｖ｝；｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝；｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ｝；｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ｝；｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝；｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝；｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ｝；｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ｝；｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝；｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝；または｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝を含んでもよい。
（ｂ）において、バリアントは、好ましくは、より一貫した移動を提供し、かつ捕捉を増加させる１つ以上の修飾を含む。とりわけ、（ｂ）において、バリアントは、好ましくは、Ｑ８７Ｒ／Ｋ、Ｅ１０１Ｉ／Ｌ／Ａ／Ｈ、及びＮ１０２Ｋ、例えばＱ８７Ｒ／Ｋ；Ｅ１０１Ｉ／Ｌ／Ａ／Ｈ；Ｎ１０２Ｋ；Ｑ８７Ｒ／Ｋ及びＥ１０１Ｉ／Ｌ／Ａ／Ｈ；Ｑ８７Ｒ／Ｋ及びＮ１０２Ｋ；Ｅ１０１Ｉ／Ｌ／Ａ／Ｈ及びＮ１０２Ｋ；またはＱ８７Ｒ／Ｋ、Ｅ１０１Ｉ／Ｌ／Ａ／Ｈ、及びＮ１０２Ｋ、のうちの１つ以上を含む。
（ｂ）において、バリアントは、好ましくは、特徴付け精度の増加を提供する１つ以上の修飾を含む。とりわけ、（ａ）において、バリアントは、好ましくは、Ｆ４８Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｙ／Ｗ／Ｉ／Ｖを含む。
（ｂ）において、バリアントは、好ましくは、増加した特徴付け精度及び増加した捕捉を提供する１つ以上の修飾を含む。とりわけ、（ａ）において、バリアントは、好ましくは、Ｆ４８Ｈ／Ｒ／Ｋを含む。
バリアントは、（ａ）及び（ｂ）の両方において修飾を含んでもよく、これはより一貫した移動を提供する。バリアントは、（ａ）及び（ｂ）の両方において修飾を含んでもよく、これは増加した捕捉を提供する。
本発明は、バリアントを含むポアを使用してポリヌクレオチドなどの分析物を特徴付けるためのアッセイの増加したスループットを提供する配列番号２のバリアントを提供する。かかるバリアントは、Ｋ９４における変異、好ましくはＫ９４ＱまたはＫ９４Ｎ、より好ましくはＫ９４Ｑを含み得る。他の有益な変異と組み合わせて、Ｋ９４ＱまたはＫ９４Ｎ変異を含む特定の変異体モノマーの例は、実施例１０及び１１に記載される。
本発明は、バリアントを含むポアを使用してポリヌクレオチドなどの分析物を特徴付けるためのアッセイの増加した特徴付け精度を提供する配列番号２のバリアントを提供する。かかるバリアントには、Ｆ１９１における変異、好ましくはＦ１９１Ｔ；Ｖ１０５〜Ｉ１０７の欠失；Ｆ１９３〜Ｌ１９９もしくはＤ１９５〜Ｌ１９９の欠失；ならびに／またはＲ９３及び／もしくはＲ９７における変異、好ましくはＲ９３Ｙ、Ｒ９７Ｙ、もしくはより好ましくはＲ９７Ｗ、Ｒ９３Ｗ、もしくはＲ９７Ｙ及びＲ９７Ｙの両方を含むバリアントが含まれる。他の有益な変異と組み合わせて、これらの変異のうちの１つ以上を含む特定の変異体モノマーの例は、実施例９に記載される。
本発明の変異体モノマーの別の実施形態では、配列番号２のバリアントは、（Ａ）１つ以上のＲ１９２位、Ｆ１９３位、Ｉ１９４位、Ｄ１９５位、Ｙ１９６位、Ｑ１９７位、Ｒ１９８位、Ｌ１９９位、Ｌ２００位、及びＥ２０１位の欠失、ならびに／または（Ｂ）Ｖ１３９／Ｇ１４０／Ｄ１４９／Ｔ１５０／Ｖ１８６／Ｑ１８７／Ｖ２０４／Ｇ２０５（本明細書においてバンド１と呼ばれる）、Ｇ１３７／Ｇ１３８／Ｑ１５１／Ｙ１５２／Ｙ１８４／Ｅ１８５／Ｙ２０６／Ｔ２０７（本明細書においてバンド２と呼ばれる）、及びＡ１４１／Ｒ１４２／Ｇ１４７／Ａ１４８／Ａ１８８／Ｇ１８９／Ｇ２０２／Ｅ２０３（本明細書においてバンド３と呼ばれる）のうちの１つ以上の欠失を含む。
（Ａ）において、バリアントは、これらの位置のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個などの任意の数及び組み合わせの欠失を含み得る。（Ａ）において、バリアントは、好ましくは、
−Ｄ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、及びＬ１９９の欠失；
−Ｒ１９２、Ｆ１９３、Ｉ１９４、Ｄ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、Ｌ１９９、及びＬ２００の欠失；
−Ｑ１９７、Ｒ１９８、Ｌ１９９、及びＬ２００の欠失；
−Ｉ１９４、Ｄ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、及びＬ１９９の欠失；
−Ｄ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、Ｌ１９９、及びＬ２００の欠失；
−Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、Ｌ１９９、Ｌ２００、及びＥ２０１の欠失；
−Ｑ１９７、Ｒ１９８、Ｌ１９９、Ｌ２００、及びＥ２０１の欠失；
−Ｑ１９７、Ｒ１９８、Ｌ１９９の欠失；または
−Ｆ１９３、Ｉ１９４、Ｄ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、及びＬ１９９の欠失を含む。
より好ましくは、バリアントは、Ｄ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、及びＬ１９９、またはＦ１９３、Ｉ１９４、Ｄ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、及びＬ１９９の欠失を含む。（Ｂ）において、バンド１〜３の任意の数及び組み合わせ、例えばバンド１；バンド２；バンド３；バンド１及び２；バンド１及び３；バンド２及び３；またはバンド１、２、及び３が欠失され得る。
バリアントは、（Ａ）；（Ｂ）；または（Ａ）及び（Ｂ）に従う欠失を含み得る。
上記の（Ａ）及び／または（Ｂ）に従う１つ以上の位置の欠失を含むバリアントは、上記及び下記の修飾または置換をさらに含んでもよい。配列番号２における欠失位置の後に現れる１つ以上の位置で修飾または置換が行われる場合、修飾または置換の１つ以上の位置の付番は、それに応じて調節されるべきである。例えば、Ｌ１９９が欠失した場合、Ｅ２４４は、Ｅ２４３となる。同様に、バンド１が欠失した場合、Ｒ１９２は、Ｒ１８６となる。
本発明の変異体モノマーの別の実施形態では、配列番号２のバリアントは、（Ｃ）１つ以上の位置、Ｖ１０５、Ａ１０６、及びＩ１０７の欠失を含む。（Ｃ）に従う欠失は、（Ａ）及び／または（Ｂ）に従う欠失に加えて行われ得る。
上記の欠失は、典型的には、モノマーを含む膜貫通ポアに対する、例えばそれを通る標的ポリヌクレオチドの移動に関連付けられるノイズを低減する。結果として、標的ポリヌクレオチドは、より正確に特徴付けられ得る。
上記の段落において特定の位置における異なるアミノ酸が／記号によって分けられている場合、それらの／記号は、「または」を意味する。例えば、Ｑ８７Ｒ／Ｋは、Ｑ８７ＲまたはＱ８７Ｋを意味する。
本発明は、ポリヌクレオチドなどの分析物の増加した捕捉を提供する配列番号２のバリアントを提供する。かかるバリアントは、Ｔ１０４における変異、好ましくはＴ１０４ＲもしくはＴ１０４Ｋ、Ｎ９１における変異、好ましくはＮ９１Ｒ、Ｅ１０１における変異、好ましくはＥ１０１Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｈ、Ｅ４４位における変異、好ましくはＥ４４ＮもしくはＥ４４Ｑ、及び／またはＱ４２位における変異、好ましくはＱ４２Ｋを含み得る。
配列番号２中の異なる位置における変異は、あらゆる可能な方法で組み合わせてもよい。とりわけ、本発明のモノマーは、精度を改善させる１つ以上の変異、ノイズを低減する１つ以上の変異、及び／または分析物の捕捉を向上させる１つ以上の変異を含み得る。
本発明の変異体モノマーにおいて、配列番号２のバリアントは、好ましくは、以下の（ｉ）以下の位置、Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｒ９７、Ｅ１０１、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｔ１５０、及びＲ１９２における１つ以上の変異（すなわち、これらの位置のうちの１つ以上における変異）、例えば以下の位置、Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｅ１０１、Ｅ１３１、及びＴ１５０、またはＮ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｅ１０１、及びＥ１３１における１つ以上の変異（すなわち、これらの位置のうちの１つ以上における変異）；（ｉｉ）Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６、またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異；（ｉｉｉ）Ｑ４２ＲまたはＱ４２Ｋ；（ｉｖ）Ｋ４９Ｒ；（ｖ）Ｎ１０２Ｒ、Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１０２Ｙ、またはＮ１０２Ｗ；（ｖｉ）Ｄ１４９Ｎ、Ｄ１４９Ｑ、またはＤ１４９Ｒ；（ｖｉｉ）Ｅ１８５Ｎ、Ｅ１８５Ｑ、またはＥ１８５Ｒ；（ｖｉｉｉ）Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１９５Ｑ、またはＤ１９５Ｒ；（ｉｘ）Ｅ２０１Ｎ、Ｅ２０１Ｑ、またはＥ２０１Ｒ；（ｘ）Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０３Ｑ、またはＥ２０３Ｒ；ならびに（ｘｉ）以下の位置、Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６、及びＳ５７のうちの１つ以上の欠失、のうちの１つ以上を含む。バリアントは、（ｉ）〜（ｘｉ）の任意の組み合わせを含んでもよい。とりわけ、バリアントは、｛ｉ｝｛ｉｉ｝｛ｉｉｉ｝｛ｉｖ｝｛ｖ｝｛ｖｉ｝｛ｖｉｉ｝｛ｖｉｉｉ｝｛ｉｘ｝｛ｘ｝｛ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ｝｛ｉ，ｉｖ｝｛ｉ，ｖ｝｛ｉ，ｖｉ｝｛ｉ，ｖｉｉ｝｛ｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｘ｝｛ｉ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ｝｛ｉｉ，ｉｖ｝｛ｉｉ，ｖ｝｛ｉｉ，ｖｉ｝｛ｉｉ，ｖｉｉ｝｛ｉｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｉ，ｉｘ｝｛ｉｉ，ｘ｝｛ｉｉ，ｘｉ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ｝｛ｉｉｉ，ｖ｝｛ｉｉｉ，ｖｉ｝｛ｉｉｉ，ｖｉｉ｝｛ｉｉｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉｉｉ，ｘ｝｛ｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉｖ，ｖ｝｛ｉｖ，ｖｉ｝｛ｉｖ，ｖｉｉ｝｛ｉｖ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｖ，ｉｘ｝｛ｉｖ，ｘ｝｛ｉｖ，ｘｉ｝｛ｖ，ｖｉ｝｛ｖ，ｖｉｉ｝｛ｖ，ｖｉｉｉ｝｛ｖ，ｉｘ｝｛ｖ，ｘ｝｛ｖ，ｘｉ｝｛ｖｉ，ｖｉｉ｝｛ｖｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｖｉ，ｉｘ｝｛ｖｉ，ｘ｝｛ｖｉ，ｘｉ｝｛ｖｉｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｖｉｉ，ｉｘ｝｛ｖｉｉ，ｘ｝｛ｖｉｉ，ｘｉ｝｛ｖｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｖｉｉｉ，ｘ｝｛ｖｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉｘ，ｘ｝｛ｉｘ，ｘｉ｝｛ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖｉｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖｉｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖｉ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖｉｉ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖｉｉｉ｝｛ｉ，ｉｖ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｖ，ｘ｝｛ｉ，ｉｖ，ｘｉ｝｛ｉ，ｖ，ｖｉ｝｛ｉ，ｖ，ｖｉｉ｝｛ｉ，ｖ，ｖｉｉｉ｝｛ｉ，ｖ，ｉｘ｝｛ｉ，ｖ，ｘ｝｛ｉ，ｖ，ｘｉ｝｛ｉ，ｖｉ，ｖｉｉ｝｛ｉ，ｖｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉ，ｖｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｖｉ，ｘ｝｛ｉ，ｖｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉ，ｖｉｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｖｉｉ，ｘ｝｛ｉ，ｖｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｖｉｉｉ，ｘ｝｛ｉ，ｖｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｘ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖｉ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｉｘ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｘ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｖ，ｖｉ｝｛ｉｉ，ｖ，ｖｉｉ｝｛ｉｉ，ｖ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｉ，ｖ，ｉｘ｝｛ｉｉ，ｖ，ｘ｝｛ｉｉ，ｖ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉ｝｛ｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｉ，ｖｉ，ｉｘ｝｛ｉｉ，ｖｉ，ｘ｝｛ｉｉ，ｖｉ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｉ，ｖｉｉ，ｉｘ｝｛ｉｉ，ｖｉｉ，ｘ｝｛ｉｉ，ｖｉｉ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ｝｛ｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｉｘ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｘ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｘｉ｝｛ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ｝｛ｉｉｉ，ｖ，ｖｉｉ｝｛ｉｉｉ，ｖ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｉｉ，ｖ，ｉｘ｝｛ｉｉｉ，ｖ，ｘ｝｛ｉｉｉ，ｖ，ｘｉ｝｛ｉｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉ｝｛ｉｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｉｉ，ｖｉ，ｉｘ｝｛ｉｉｉ，ｖｉ，ｘ｝｛ｉｉｉ，ｖｉ，ｘｉ｝｛ｉｉｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｉｉ，ｖｉｉ，ｉｘ｝｛ｉｉｉ，ｖｉｉ，ｘ｝｛ｉｉｉ，ｖｉｉ，ｘｉ｝｛ｉｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖ，ｖｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖ，ｖｉｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖ，ｖｉｉｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖｉ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖｉｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖｉｉ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉｉｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖｉ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖｉｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖｉｉ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉｉ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖ，ｘ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｘ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖｉｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖｉｉ，ｘ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖｉｉｉ，ｘ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｖ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｖ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｖ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ｝｛ｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉ，ｖ，ｖｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｖ，ｖｉ，ｘ｝｛ｉ，ｖ，ｖｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉ，ｖ，ｖｉｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｖ，ｖｉｉ，ｘ｝｛ｉ，ｖ，ｖｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｖ，ｖｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｖ，ｖｉｉｉ，ｘ｝｛ｉ，ｖ，ｖｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｖ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｖ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｖ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｘ｝｛ｉ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｘ｝｛ｉ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｖｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｖｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｖｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ｝｛ｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｖｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｉｘ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｘ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｉｘ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｘ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉ，ｉｘ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉ，ｘ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉｉ，ｉｘ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉｉ，ｘ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉｉ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｉｘ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｘ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｉｘ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｘ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉ，ｉｘ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉ，ｘ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉｉ，ｘ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ｝｛ｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｉｘ｝｛ｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｘ｝｛ｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｉ，ｖ，ｖｉｉ，ｉｘ｝｛ｉｉ，ｖ，ｖｉｉ，ｘ｝｛ｉｉ，ｖ，ｖｉｉ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｖ，ｖｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉｉ，ｖ，ｖｉｉｉ，ｘ｝｛ｉｉ，ｖ，ｖｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｖ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉｉ，ｖ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｖ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ｝｛ｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｘ｝｛ｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｘ｝｛ｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｖｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉｉ，ｖｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｖｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ｝｛ｉｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｖｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｉｘ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｘ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｘｉ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｉｘ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｘ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｘｉ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉ，ｉｘ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉ，ｘ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ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，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉ

ｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝または｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ，ｖｉ，ｖｉｉ，ｖｉｉｉ，ｉｘ，ｘ，ｘｉ｝を含み得る（スペースによって分けられた括弧｛｝内の各バリアントは、バリアントのリストからの任意のバリアント、すなわち、｛ｉ｝または｛ｉｉ｝または｛ｉｉｉ｝または｛ｉｖ｝または｛ｖ｝などを表す）。
バリアントが、（ｉ）及び（ｉｉｉ）〜（ｘｉ）のうちのいずれか１つを含む場合、それはさらに、Ｙ５１、Ｎ５５、及びＦ５６のうちの１つ以上、例えばＹ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６、またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含み得る。
（ｉ）において、バリアントは、Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｒ９７、Ｅ１０１、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｔ１５０、及びＲ１９２の任意の数及び組み合わせにおける変異を含み得る。（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、以下の位置、Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｅ１０１、Ｅ１３１、及びＴ１５０における１つ以上の変異（すなわち、これらの位置のうちの１つ以上における変異）を含む。（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、以下の位置、Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｅ１０１、及びＥ１３１における１つ以上の変異（すなわち、これらの位置のうちの１つ以上における変異）を含む。（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｓ５４及び／またはＳ５７における変異を含む。（ｉ）において、バリアントは、より好ましくは、（ａ）Ｓ５４及び／またはＳ５７における変異、ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５、及びＦ５６のうちの１つ以上、例えばＹ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６、またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。Ｓ５４及びＳ５７が（ｘｉ）において欠失されている場合、それ／それらは（ｉ）において変異され得ず、逆もまた同様である。（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｔ１５０における変異、例えばＴ１５０Ｉを含む。代替的には、バリアントは、好ましくは、（ａ）Ｔ１５０における変異、ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５、及びＦ５６のうちの１つ以上、例えばＹ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６、またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｑ６２における変異、例えばＱ６２ＲまたはＱ６２Ｋを含む。代替的には、バリアントは、好ましくは、（ａ）Ｑ６２における変異、ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５、及びＦ５６のうちの１つ以上、例えばＹ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６、またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。バリアントは、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｑ６２、またはこれらの任意の組み合わせ、例えばＤ４３、Ｅ４４、Ｑ６２、Ｄ４３／Ｅ４４、Ｄ４３／Ｑ６２、Ｅ４４／Ｑ６２、またはＤ４３／Ｅ４４／Ｑ６２における変異を含み得る。代替的には、バリアントは、好ましくは、（ａ）Ｄ４３、Ｅ４４、Ｑ６２、Ｄ４３／Ｅ４４、Ｄ４３／Ｑ６２、Ｅ４４／Ｑ６２、またはＤ４３／Ｅ４４／Ｑ６２における変異、ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５、及びＦ５６のうちの１つ以上、例えばＹ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６、またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。
（ｉｉ）及び本出願の他の箇所において異なる位置が／記号によって分けられている場合、それらの／記号は、「及び」を意味し、Ｙ５１／Ｎ５５は、Ｙ５１及びＮ５５である。（ｉｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｙ５１／Ｎ５５における変異を含む。ＣｓｇＧ中の狭窄部位は、残基Ｙ５１、Ｎ５５、及びＦ５６の側鎖によって形成された３つの積み重ねられた同心円状リングで構成されることが提案されてきた（Ｇｏｙａｌ ｅｔ ａｌ，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ，５１６，２５０−２５３）。したがって、（ｉｉ）におけるこれらの残基の変異は、ポアを通ってポリヌクレオチドが移動する間の電流に寄与するヌクレオチドの数を減らし、それにより（ポアを通ってポリヌクレオチドが移動する間に）認められた電流とポリヌクレオチドとの間の直接的な関係性を特定することを容易にし得る。Ｆ５６は、本発明の方法において有用なバリアント及びポアに関連して以下に論じられる方法のいずれかで変異され得る。
（ｖ）において、バリアントは、Ｎ１０２Ｒ、Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１０２Ｙ、またはＮ１０２Ｗを含み得る。バリアントは、好ましくは、（ａ）Ｎ１０２Ｒ、Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１０２Ｙ、またはＮ１０２Ｗ、ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５、及びＦ５６のうちの１つ以上、例えばＹ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６、またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。
（ｘｉ）において、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６、及びＳ５７の任意の数及び組み合わせが欠失され得る。好ましくは、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、及びＳ５７のうちの１つ以上が欠失され得る。Ｙ５１、Ｎ５５、及びＦ５６のうちのいずれかが（ｘｉ）において欠失されている場合、それ／それらは（ｉｉ）において変異され得ず、逆もまた同様である。
（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、以下の置換、Ｎ４０Ｒ、Ｎ４０Ｋ、Ｄ４３Ｎ、Ｄ４３Ｑ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｋ、Ｅ４４Ｎ、Ｅ４４Ｑ、Ｅ４４Ｒ、Ｅ４４Ｋ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ５７Ｐ、Ｑ６２Ｒ、Ｑ６２Ｋ、Ｒ９７Ｎ、Ｒ９７Ｇ、Ｒ９７Ｌ、Ｅ１０１Ｎ、Ｅ１０１Ｑ、Ｅ１０１Ｒ、Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｆ、Ｅ１０１Ｙ、Ｅ１０１Ｗ、Ｅ１２４Ｎ、Ｅ１２４Ｑ、Ｅ１２４Ｒ、Ｅ１２４Ｋ、Ｅ１２４Ｆ、Ｅ１２４Ｙ、Ｅ１２４Ｗ、Ｅ１３１Ｄ、Ｒ１４２Ｅ、Ｒ１４２Ｎ、Ｔ１５０Ｉ、Ｒ１９２Ｅ、及びＲ１９２Ｎのうちの１つ以上、例えばＮ４０Ｒ、Ｎ４０Ｋ、Ｄ４３Ｎ、Ｄ４３Ｑ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｋ、Ｅ４４Ｎ、Ｅ４４Ｑ、Ｅ４４Ｒ、Ｅ４４Ｋ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ５７Ｐ、Ｑ６２Ｒ、Ｑ６２Ｋ、Ｅ１０１Ｎ、Ｅ１０１Ｑ、Ｅ１０１Ｒ、Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｆ、Ｅ１０１Ｙ、Ｅ１０１Ｗ、Ｅ１３１Ｄ、及びＴ１５０Ｉのうちの１つ以上、またはＮ４０Ｒ、Ｎ４０Ｋ、Ｄ４３Ｎ、Ｄ４３Ｑ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｋ、Ｅ４４Ｎ、Ｅ４４Ｑ、Ｅ４４Ｒ、Ｅ４４Ｋ、Ｅ１０１Ｎ、Ｅ１０１Ｑ、Ｅ１０１Ｒ、Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｆ、Ｅ１０１Ｙ、Ｅ１０１Ｗ、及びＥ１３１Ｄのうちの１つ以上を含む。バリアントは、これらの置換の任意の数及び組み合わせを含んでもよい。（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｓ５４Ｐ及び／またはＳ５７Ｐを含む。（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、（ａ）Ｓ５４Ｐ及び／またはＳ５７Ｐ、ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５、及びＦ５６のうちの１つ以上、例えばＹ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６、またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。Ｙ５１、Ｎ５５、及びＦ５６のうちの１つ以上における変異は、以下に論じられるもののいずれかであってもよい。（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｆ５６Ａ／Ｓ５７ＰまたはＳ５４Ｐ／Ｆ５６Ａを含む。バリアントは、好ましくは、Ｔ１５０Ｉを含む。代替的には、バリアントは、好ましくは、（ａ）Ｔ１５０Ｉにおける変異、ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５、及びＦ５６のうちの１つ以上、例えばＹ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６、またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。
（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｑ６２ＲまたはＱ６２Ｋを含む。代替的には、バリアントは、好ましくは、（ａ）Ｑ６２ＲまたはＱ６２Ｋ、ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５、及びＦ５６のうちの１つ以上、例えばＹ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６、またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。バリアントは、Ｄ４３Ｎ、Ｅ４４Ｎ、Ｑ６２Ｒ、もしくはＱ６２Ｋ、またはそれらの任意の組み合わせ、例えばＤ４３Ｎ、Ｅ４４Ｎ、Ｑ６２Ｒ、Ｑ６２Ｋ、Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ、Ｄ４３Ｎ／Ｑ６２Ｒ、Ｄ４３Ｎ／Ｑ６２Ｋ、Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２Ｒ、Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２Ｋ、Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２Ｒ、またはＤ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２Ｋを含み得る。代替的には、バリアントは、好ましくは、（ａ）Ｄ４３Ｎ、Ｅ４４Ｎ、Ｑ６２Ｒ、Ｑ６２Ｋ、Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ、Ｄ４３Ｎ／Ｑ６２Ｒ、Ｄ４３Ｎ／Ｑ６２Ｋ、Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２Ｒ、Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２Ｋ、Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２Ｒ、またはＤ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２Ｋ、ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５、及びＦ５６のうちの１つ以上、例えばＹ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６、またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。
（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｄ４３Ｎを含む。
（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｅ１０１Ｒ、Ｅ１０１Ｓ、Ｅ１０１Ｆ、またはＥ１０１Ｎを含む。
（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｅ１２４Ｎ、Ｅ１２４Ｑ、Ｅ１２４Ｒ、Ｅ１２４Ｋ、Ｅ１２４Ｆ、Ｅ１２４Ｙ、Ｅ１２４Ｗ、またはＥ１２４Ｄ、例えばＥ１２４Ｎを含む。
（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｒ１４２Ｅ及びＲ１４２Ｎを含む。
（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｒ９７Ｎ、Ｒ９７Ｇ、またはＲ９７Ｌを含む。
（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｒ１９２Ｅ及びＲ１９２Ｎを含む。
（ｉｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｇ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｔ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｔ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｔ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｔ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｔ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｔ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｒ，Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｔ、Ｆ５６Ｎ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｎ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｎ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｎ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｌ、Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｖ、Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ａ、Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｎ、Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｑ、Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｓ、Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１

Ｎ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｑ，Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｅ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ｅ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ｄ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ｄ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｅ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｄ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｅ、またはＦ５６Ｋ／Ｎ５５Ｄを含む。
（ｉｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｙ５１Ｒ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｎ／Ｆ５６Ｎ、Ｙ５１Ｍ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｌ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｉ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｖ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｐ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｇ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｃ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｑ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｎ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｓ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｅ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｄ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｋ／Ｆ５６Ｑ、またはＹ５１Ｈ／Ｆ５６Ｑを含む。
（ｉｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｑ／Ｆ５６Ｑ、またはＹ５１Ａ／Ｆ５６Ｑを含む。
（ｉｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｆ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｍ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｌ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｉ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｖ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｐ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｇ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｃ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｎ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｔ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｓ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｅ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｄ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｋ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｈ、またはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｒを含む。
（ｉｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｙ５１Ｔ／Ｎ５５Ｑ、Ｙ５１Ｔ／Ｎ５５Ｓ、またはＹ５１Ｔ／Ｎ５５Ａを含む。
（ｉｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｆ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｌ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｉ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｖ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｐ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｇ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｃ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｎ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｔ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｓ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｅ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｄ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｋ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｈ、またはＹ５１Ａ／Ｆ５６Ｒを含む。
（ｉｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｙ５１Ｃ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｅ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｄ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｋ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｈ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｑ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｎ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｓ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｐ／Ｆ５６Ａ、またはＹ５１Ｖ／Ｆ５６Ａを含む。
（ｘｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｙ５１／Ｐ５２の欠失、Ｙ５１／Ｐ５２／Ａ５３の欠失、Ｐ５０〜Ｐ５２の欠失、Ｐ５０〜Ａ５３の欠失、Ｋ４９〜Ｙ５１の欠失、Ｋ４９〜Ａ５３及び単一のプロリン（Ｐ）による置換、Ｋ４９〜Ｓ５４の欠失及び単一のＰによる置換、Ｙ５１〜Ａ５３の欠失、Ｙ５１〜Ｓ５４の欠失、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失、Ｎ５５〜Ｓ５７の欠失、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失及び単一のＰによる置換、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失及び単一のグリシン（Ｇ）による置換、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失及び単一のアラニン（Ａ）による置換、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失及び単一のＰによる置換ならびにＹ５１Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失及び単一のＰによる置換ならびにＹ５１Ｑ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失及び単一のＰによる置換ならびにＹ５１Ｓ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失及び単一のＧによる置換ならびにＹ５１Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失及び単一のＧによる置換ならびにＹ５１Ｑ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失及び単一のＧによる置換ならびにＹ５１Ｓ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失及び単一のＡによる置換ならびにＹ５１Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失及び単一のＡ／Ｙ５１Ｑによる置換、またはＮ５５／Ｆ５６の欠失及び単一のＡによる置換ならびにＹ５１Ｓを含む。
バリアントは、より好ましくは、Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０１Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ２０１Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０１Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ２０１Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｄ１９５Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｄ１９５Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｄ１９５Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｄ１９５Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｑ、Ｅ１３１Ｄ／Ｋ４９Ｒ、Ｅ１０１Ｎ／Ｎ１０２Ｆ、Ｅ１０１Ｎ／Ｎ１０２Ｙ、Ｅ１０１Ｎ／Ｎ１０２Ｗ、Ｅ１０１Ｆ／Ｎ１０２Ｆ、Ｅ１０１Ｆ／Ｎ１０２Ｙ、Ｅ１０１Ｆ／Ｎ１０２Ｗ、Ｅ１０１Ｙ／Ｎ１０２Ｆ、Ｅ１０１Ｙ／Ｎ１０２Ｙ、Ｅ１０１Ｙ／Ｎ１０２Ｗ、Ｅ１０１Ｗ／Ｎ１０２Ｆ、Ｅ１０１Ｗ／Ｎ１０２Ｙ、Ｅ１０１Ｗ／Ｎ１０２Ｗ、Ｅ１０１Ｎ／Ｎ１０２Ｒ、Ｅ１０１Ｆ／Ｎ１０２Ｒ、Ｅ１０１Ｙ／Ｎ１０２Ｒ、またはＥ１０１Ｗ／Ｎ１０２Ｆを含む。
ポアを通ってポリヌクレオチドが移動する間により少ないヌクレオチドが電流に寄与する、ポアを形成する本発明の好ましいバリアントは、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｎ、Ｙ５１Ｉ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｌ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｉ／Ｆ５６Ｎ、Ｙ５１Ｌ／Ｆ５６ＮもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｎ、またはより好ましくはＹ５１Ｉ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｌ／Ｆ５６Ａ、もしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ａを含む。上記のように、これは、ポアを通ってポリヌクレオチドが移動する間に認められた電流と、ポリヌクレオチドとの間の直接的な関係性を特定することを容易にする。
増加した範囲を提示するポアを形成する好ましいバリアントは、以下の位置、
Ｙ５１、Ｆ５６、Ｄ１４９、Ｅ１８５、Ｅ２０１、及びＥ２０３；
Ｎ５５及びＦ５６；
Ｙ５１及びＦ５６；
Ｙ５１、Ｎ５５、及びＦ５６；または
Ｆ５６及びＮ１０２における変異を含む。
増加した範囲を提示するポアを形成する好ましいバリアントは、
Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ、Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５Ｒ、Ｅ２０１Ｎ、及びＥ２０３Ｎ；
Ｎ５５Ｓ及びＦ５６Ｑ；
Ｙ５１Ａ及びＦ５６Ａ；
Ｙ５１Ａ及びＦ５６Ｎ；
Ｙ５１Ｉ及びＦ５６Ａ；
Ｙ５１Ｌ及びＦ５６Ａ；
Ｙ５１Ｔ及びＦ５６Ａ；
Ｙ５１Ｉ及びＦ５６Ｎ；
Ｙ５１Ｌ及びＦ５６Ｎ；
Ｙ５１Ｔ及びＦ５６Ｎ；
Ｙ５１Ｔ及びＦ５６Ｑ；
Ｙ５１Ａ、Ｎ５５Ｓ、及びＦ５６Ａ；
Ｙ５１Ａ、Ｎ５５Ｓ、及びＦ５６Ｎ；
Ｙ５１Ｔ、Ｎ５５Ｓ、及びＦ５６Ｑ；または
Ｆ５６Ｑ及びＮ１０２Ｒを含む。
ポアを通ってポリヌクレオチドが移動する間により少ないヌクレオチドが電流に寄与する、ポアを形成する好ましいバリアントは、以下の位置、
Ｎ５５及びＦ５６における変異、例えばＮ５５Ｘ及びＦ５６Ｑ（Ｘは、任意のアミノ酸である）；または
Ｙ５１及びＦ５６における変異、例えばＹ５１Ｘ及びＦ５６Ｑ（Ｘは、任意のアミノ酸である）を含む。
特に好ましいバリアントは、Ｙ５１Ａ及びＦ５６Ｑを含む。
増加したスループットを提示するポアを形成する好ましいバリアントは、以下の位置、
Ｄ１４９、Ｅ１８５、及びＥ２０３；
Ｄ１４９、Ｅ１８５、Ｅ２０１、及びＥ２０３；または
Ｄ１４９、Ｅ１８５、Ｄ１９５、Ｅ２０１、及びＥ２０３における変異を含む。
増加したスループットを提示するポアを形成する好ましいバリアントは、
Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５Ｎ、及びＥ２０３Ｎ；
Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５Ｎ、Ｅ２０１Ｎ、及びＥ２０３Ｎ；
Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５Ｒ、Ｄ１９５Ｎ、Ｅ２０１Ｎ、及びＥ２０３Ｎ；または
Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５Ｒ、Ｄ１９５Ｎ、Ｅ２０１Ｒ、及びＥ２０３Ｎを含む。
ポリヌクレオチドの捕捉が増加したポアを形成する好ましいバリアントは、以下の変異、
Ｄ４３Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ；
Ｅ４４Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ；
Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ；
Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ６２Ｒ；
Ｄ４３Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ６２Ｒ；
Ｅ４４Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ６２Ｒ；または
Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ６２Ｒを含む。
好ましいバリアントは、以下の変異、
Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３ＲもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｒ；
Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３ＮもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ；
Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３ＲもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｒ
Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３ＲもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｒ；
Ｅ２０３ＲもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ２０３Ｒ；
Ｅ２０３ＮもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ２０３Ｎ；
Ｅ２０１ＲもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ２０１Ｒ；
Ｅ２０１ＮもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ２０１Ｎ；
Ｅ１８５ＲもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１８５Ｒ；
Ｅ１８５ＮもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１８５Ｎ；
Ｄ１４９ＲもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｄ１４９Ｒ；
Ｄ１４９ＮもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｄ１４９Ｎ；
Ｒ１４２ＥもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１４２Ｅ；
Ｒ１４２ＮもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１４２Ｎ；
Ｒ１９２ＥもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１９２Ｅ；または
Ｒ１９２ＮもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１９２Ｎを含む。
好ましいバリアントは、以下の変異、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１０１Ｎ／Ｎ１０２Ｒ；
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｎ／Ｎ１０２Ｇ；
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｎ／Ｎ１０２Ｒ；
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｎ；
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｇ；
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｌ；
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ１０２Ｒ；
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ１０２Ｆ；
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ１０２Ｇ；
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１０１Ｒ；
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１０１Ｆ；
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１０１Ｎ；または
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１０１Ｇを含む
バリアントは、好ましくは、Ｔ１５０における変異をさらに含む。増加した挿入を提示するポアを形成する好ましいバリアントは、Ｔ１５０Ｉを含む。Ｔ１５０における変異、例えばＴ１５０Ｉは、上記の変異のいずれかまたは上記の変異の組み合わせと組み合わされ得る。
配列番号２の好ましいバリアントは、（ａ）Ｒ９７Ｗ、ならびに（ｂ）Ｙ５１及び／またはＦ５６における変異を含む。配列番号２の好ましいバリアントは、（ａ）Ｒ９７Ｗ、ならびに（ｂ）Ｙ５１Ｒ／Ｈ／Ｋ／Ｄ／Ｅ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｑ／Ｃ／Ｇ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ｍ及び／またはＦ５６ Ｒ／Ｈ／Ｋ／Ｄ／Ｅ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｑ／Ｃ／Ｇ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ｍを含む。配列番号２の好ましいバリアントは、（ａ）Ｒ９７Ｗ、ならびに（ｂ）Ｙ５１Ｌ／Ｖ／Ａ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｇ及び／またはＦ５６Ａ／Ｑ／Ｎを含む。配列番号２の好ましいバリアントは、（ａ）Ｒ９７Ｗ、ならびに（ｂ）Ｙ５１Ａ及び／またはＦ５６Ｑを含む。配列番号２の好ましいバリアントは、Ｒ９７Ｗ、Ｙ５１Ａ、及びＦ５６Ｑを含む。
本発明の変異体モノマーにおいて、配列番号２のバリアントは、好ましくは、Ｒ１９２における変異を含む。バリアントは、好ましくは、Ｒ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｅ、Ｒ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／Ｔ、またはＲ１９２Ｄ／Ｑを含む。配列番号２の好ましいバリアントは、（ａ）Ｒ９７Ｗ、（ｂ）Ｙ５１及び／またはＦ５６における変異、ならびに（ｃ）Ｒ１９２における変異、例えばＲ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｅ、Ｒ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／Ｔ、またはＲ１９２Ｄ／Ｑを含む。配列番号２の好ましいバリアントは、（ａ）Ｒ９７Ｗ、（ｂ）Ｙ５１Ｒ／Ｈ／Ｋ／Ｄ／Ｅ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｑ／Ｃ／Ｇ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ｍ及び／またはＦ５６ Ｒ／Ｈ／Ｋ／Ｄ／Ｅ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｑ／Ｃ／Ｇ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ｍ、ならびに（ｃ）Ｒ１９２における変異、例えばＲ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｅ、Ｒ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／Ｔ、またはＲ１９２Ｄ／Ｑを含む。配列番号２の好ましいバリアントは、（ａ）Ｒ９７Ｗ、（ｂ）Ｙ５１Ｌ／Ｖ／Ａ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｇ及び／またはＦ５６Ａ／Ｑ／Ｎ、ならびに（ｃ）Ｒ１９２における変異、例えばＲ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｅ、Ｒ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／Ｔ、またはＲ１９２Ｄ／Ｑを含む。配列番号２の好ましいバリアントは、（ａ）Ｒ９７Ｗ、（ｂ）Ｙ５１Ａ及び／またはＦ５６Ｑ、ならびに（ｃ）Ｒ１９２における変異、例えばＲ１９２ Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｅ、Ｒ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／Ｔ、またはＲ１９２Ｄ／Ｑを含む。配列番号２の好ましいバリアントは、Ｒ９７Ｗ、Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ、及びＲ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／ＴまたはＲ１９２Ｄ／Ｑを含む。配列番号２の好ましいバリアントは、Ｒ９７Ｗ、Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ、及びＲ１９２Ｄを含む。配列番号２の好ましいバリアントは、Ｒ９７Ｗ、Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ、及びＲ１９２Ｑを含む。上記の段落において特定の位置における異なるアミノ酸が／記号によって分けられている場合、それらの／記号は、「または」を意味する。例えば、Ｒ１９２Ｄ／Ｑは、Ｒ１９２ＤまたはＲ１９２Ｑを意味する。
本発明の変異体モノマーにおいて、配列番号２のバリアントは、好ましくは、Ｒ９３における変異を含む。配列番号２の好ましいバリアントは、（ａ）Ｒ９３Ｗ、ならびに（ｂ）Ｙ５１及び／またはＦ５６における変異、好ましくはＹ５１Ａ及びＦ５６Ｑを含む。Ｖ１０５、Ａ１０６、及びＩ１０７のＤまたはＲ１９２Ｎ．欠失。
上記の配列番号２の好ましいバリアントはいずれも、Ｋ９４Ｎ／Ｑ変異を含んでもよい。上記の配列番号２の好ましいバリアントはいずれも、Ｆ１９１Ｔ変異を含んでもよい。本発明はまた、実施例に開示されるバリアントにおいて存在する変異の組み合わせを含む、配列番号２に示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーを提供する。
天然型アミノ酸を導入または置換するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、メチオニン（Ｍ）は、変異体モノマーをコードするポリヌクレオチドの関連する位置においてメチオニンのコドン（ＡＴＧ）をアルギニンのコドン（ＣＧＴ）に置き換えることによってアルギニン（Ｒ）で置換され得る。ポリヌクレオチドはその後、下記のように発現され得る。
非天然型アミノ酸を導入または置換するための方法も、当該技術分野で周知である。例えば、非天然型アミノ酸は、変異体モノマーを発現させるために使用されるＩＶＴＴシステム中に合成アミノアシル−ｔＲＮＡを含むことによって導入され得る。代替的には、それらは、合成（すなわち、非天然）類似体の存在下で、特定のアミノ酸について栄養要求性であるＥ．ｃｏｌｉ 中で変異体モノマーを発現させることによって導入され得る。それらはまた、変異体モノマーが部分的ペプチド合成を使用して精製される場合、ネイキッドライゲーション（ｎａｋｅｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ）によって生成され得る。
バリアント
上記の特定の変異に加えて、バリアントは、他の変異を含んでもよい。配列番号２のアミノ酸配列の全長にわたって、バリアントは、好ましくは、アミノ酸同一性に基づき、その配列に対して少なくとも５０％の相同性を有する。より好ましくは、バリアントは、配列全体にわたって、アミノ酸同一性に基づき、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％、または９９％の相同性を有し得る。１００個以上、例えば１２５個、１５０個、１７５個、または２００個以上の連続したアミノ酸のストレッチにわたって、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、または９５％のアミノ酸同一性があってもよい（「ハードホモロジー（ｈａｒｄ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」）。
相同性を判定するために、当該技術分野における標準的な方法が使用され得る。例えば、ＵＷＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅは、例えばそのデフォルト設定で使用されて、相同性を計算するために使用され得るＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ （１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，ｐ３８７−３９５）。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３） Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ ｅｔ ａｌ （１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−１０に記載されるように、ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、相同性を計算するか、または配列を並べる（同等の残基または対応する配列を同定する（典型的には、それらのデフォルト設定において））ことができる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて一般に利用可能である。
配列番号２は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株ＭＣ４１００亜株に由来する野生型ＣｓｇＧモノマーである。配列番号２のバリアントは、別のＣｓｇＧ相同体に存在する置換のいずれかを含み得る。好ましいＣｓｇＧ相同体は、配列番号３〜７及び２６〜４１に示される。バリアントは、配列番号２と比較して配列番号３〜７及び２６〜４１に存在する置換のうちの１つ以上の組み合わせを含んでもよい。例えば、変異は、配列番号２と配列番号３〜７及び配列番号２６〜４１との間で異なる、配列番号２の位置のうちの１つ以上において行われ得る。かかる変異は、配列番号２のアミノ酸の、配列番号３〜７及び配列番号２６〜４１のいずれかの対応する位置からのアミノ酸による置換であり得る。代替的には、これらの位置のうちのいずれか１つにおける変異は、任意のアミノ酸による置換であり得るか、または欠失もしくは挿入変異、例えば２〜８個もしくは３〜６個のアミノ酸などの１〜１０個のアミノ酸の欠失もしくは挿入であり得る。本明細書に開示される変異以外では、配列番号２と、配列番号３〜７及び配列番号２６〜４１の全てとの間で保存されたアミノ酸は、好ましくは、本発明のバリアントにおいて存在する。しかしながら、保存的変異は、配列番号２と、配列番号３〜７及び配列番号２６〜４１の全てとの間で保存された、これらの位置のうちのいずれか１つ以上において行われ得る。
本発明は、配列番号２の特定の位置に対応するＣｓｇＧモノマーの構造の位置において、配列番号２の特定の位置に置換される、本明細書に記載されるアミノ酸のうちのいずれか１つ以上を含むポア形成ＣｓｇＧ変異体モノマーを提供する。対応する位置は、当該技術分野における標準的な技術によって判定され得る。例えば、上述のＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、ＣｓｇＧモノマーの配列を配列番号２と整列させることができ、それによって対応する残基を同定することができる。
とりわけ、本発明は、以下の、
−配列番号２のＲ９７に対応する位置におけるＷ；
−配列番号２のＲ９３に対応する位置におけるＷ；
−配列番号２のＲ９７に対応する位置におけるＹ；
−配列番号２のＲ９３に対応する位置におけるＹ；
−配列番号２のＲ９３及びＲ９７に対応する位置の各々におけるＹ；
−配列番号２のＲ１９２に対応する位置におけるＤ；
−配列番号２のＶ１０５〜Ｉ１０７に対応する位置における残基の欠失；
−配列番号２のＦ１９３〜Ｌ１９９に対応する位置のうちの１つ以上における残基の欠失；
−配列番号２のＦ１９５〜Ｌ１９９に対応する位置における残基の欠失；
−配列番号２のＦ１９３〜Ｌ１９９に対応する位置における残基の欠失；
−配列番号２のＦ１９１に対応する位置におけるＴ；
−配列番号２のＫ４９に対応する位置におけるＱ；
−配列番号２のＫ４９に対応する位置におけるＮ；
−配列番号２のＫ４２に対応する位置におけるＱ；
−配列番号２のＥ４４に対応する位置におけるＱ；
−配列番号２のＥ４４に対応する位置におけるＮ；
−配列番号２のＬ９０に対応する位置におけるＲ；
−配列番号２のＬ９１に対応する位置におけるＲ；
−配列番号２のＩ９５に対応する位置におけるＲ；
−配列番号２のＡ９９に対応する位置におけるＲ；
−配列番号２のＥ１０１に対応する位置におけるＨ；
−配列番号２のＥ１０１に対応する位置におけるＫ；
−配列番号２のＥ１０１に対応する位置におけるＮ；
−配列番号２のＥ１０１に対応する位置におけるＱ；
−配列番号２のＥ１０１に対応する位置におけるＴ；
−配列番号２のＱ１１４に対応する位置におけるＫ、のうちのいずれか１つ以上を含むポア形成ＣｓｇＧ変異体モノマーを提供する。
本発明のＣｓｇＧポア形成モノマーは、好ましくは、配列番号２のＹ５１に対応する位置におけるＡ、及び／または配列番号２のＦ５６に対応する位置におけるＱをさらに含む。
ポア形成変異体モノマーは、典型的には、野生型ＣｓｇＧモノマーと同じ３Ｄ構造、例えば配列番号２を有するＣｓｇＧモノマーと同じ３Ｄ構造を形成する能力を保持する。ＣｓｇＧの３Ｄ構造は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃａｏ ｅｔ ａｌ（２０１４）ＰＮＡＳ Ｅ５４３９−Ｅ５４４４に開示されている。本明細書に記載される変異に加えて任意の数の変異が野生型ＣｓｇＧ配列において行われ得るが、但し、ＣｓｇＧ変異体モノマーが、本発明の変異によってそれに付与された改善された特性を保持することを条件とする。
典型的には、ＣｓｇＧモノマーは、３つのアルファヘリックス及び５つのベータシートを含む構造を形成する能力を保持することになる。本発明者らは、特に、ポリペプチドを転移させることができる膜貫通ポアを形成するＣｓｇＧモノマーの能力に影響を及ぼすことなく、少なくとも第１のアルファヘリックスに対してＮ末端であるＣｓｇＧの領域において（配列番号２のＳ６３において開始する）、第２のアルファヘリックスにおいて（配列番号２のＧ８５〜Ａ９９）、第２のアルファヘリックスと第１のベータシートとの間のループにおいて（配列番号２のＱ１００〜Ｎ１２０）、第４及び第５のベータシートにおいて（それぞれ、配列番号２のＳ１７３〜Ｒ１９２及びＲ１９８〜Ｔ１０７）、ならびに第４のベータシートと第５のベータシートとの間のループにおいて（配列番号２のＦ１９３〜Ｑ１９７）、変異が行われ得ることを示している。したがって、ポリヌクレオチドを転移させることができるポアを形成するモノマーの能力に影響を及ぼすことなく、任意のＣｓｇＧモノマーのこれらの領域のいずれかにおいてさらなる変異が行われ得ることが想定される。また、ポリヌクレオチドを転移させることができるポアを形成するモノマーの能力に影響を及ぼすことなく、アルファヘリックスのいずれかにおいて（配列番号２Ｓ６３〜Ｒ７６、Ｇ８５〜Ａ９９、もしくはＶ２１１〜Ｌ２３６）、またはベータシートのいずれかにおいて（配列番号２のＩ１２１〜Ｎ１３３、Ｋ１３５〜Ｒ１４２、Ｉ１４６〜Ｒ１６２、Ｓ１７３〜Ｒ１９２、もしくはＲ１９８〜Ｔ１０７）などの他の領域において変異が行われ得ることも予想される。また、ポリヌクレオチドを転移させることができるポアを形成するモノマーの能力に影響を及ぼすことなく、アルファヘリックスとベータシートとを結合するループ領域において、ならびに／またはＣｓｇＧモノマーのＮ末端及び／もしくはＣ末端領域において１つ以上のアミノ酸の欠失が行われ得ることも予想される。
上記のものに加えて、配列番号２のアミノ酸配列に対するアミノ酸置換、例えば最大で１、２、３、４、５、１０、２０、または３０個の置換が行われ得る。保存的置換は、アミノ酸を、類似の化学構造、類似の化学的特性、または類似の側鎖量の他のアミノ酸で置き換える。導入されるアミノ酸は、それらが置き換えるアミノ酸と類似の極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性、中性、または荷電性を有し得る。代替的には、保存的置換は、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに、芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入してもよい。保存的アミノ酸変化は、当該技術分野で周知であり、以下の表２に定義されるように、２０個のアミノ酸の特性に従って選択され得る。アミノ酸が類似の極性を有する場合、これはまた、表３におけるアミノ酸側鎖の疎水性スケールを参照して判定することもできる。
配列番号２のアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸残基は、上記のポリペプチドからさらに欠失され得る。最大で１、２、３、４、５、１０、２０、または３０個以上の残基が欠失され得る。
バリアントは、配列番号２の断片を含み得る。かかる断片は、ポア形成活性を保持する。断片は、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、または少なくとも２５０アミノ酸長であり得る。かかる断片を使用して、ポアを生成することができる。断片は、好ましくは、配列番号２の膜貫通ドメイン、すなわちＫ１３５〜Ｑ１５３及びＳ１８３〜Ｓ２０８を含む。
代替的に、またはさらに、１つ以上のアミノ酸が上記のポリペプチドに付加されてもよい。配列番号２のアミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端、またはそのポリペプチドバリアントもしくは断片に伸長が提供されてもよい。伸長は非常に短くてもよく、例えば、１〜１０アミノ酸長であってもよい。代替的には、伸長はより長くてもよく、例えば、最大で５０〜１００個のアミノ酸であってもよい。本発明によるアミノ酸配列に、担体タンパク質が融合されてもよい。他の融合タンパク質は、以下により詳細に論じられる。
上記のように、バリアントは、配列番号２とは異なるアミノ酸配列を有し、かつポアを形成するその能力を保持するポリペプチドである。バリアントは、典型的には、ポア形成を担う配列番号２の領域を含有する。β−バレルを含有する、ＣｓｇＧのポア形成能力は、各サブユニットのβ−シートによって提供される。配列番号２のバリアントは、典型的には、β−シートを形成する配列番号２の領域、すなわちＫ１３５〜Ｑ１５３及びＳ１８３〜Ｓ２０８を含む。得られるバリアントが、ポアを形成するその能力を保持する限り、β−シートを形成する配列番号２の領域に１つ以上の修飾が行われてもよい。配列番号２のバリアントは、好ましくは、そのα−ヘリックス及び／またはループ領域内に、１つ以上の修飾、例えば置換、付加、または欠失を含む。
例えば、モノマーがそのような配列を天然に含有しない細胞からのそれらの分泌を促進するための、ストレプトアビジンタグの付加によって、またはシグナル配列の付加によって、ＣｓｇＧに由来するモノマーを修飾して、それらの同定または純化を補助することができる。他の好適なタグは、以下により詳細に論じられる。モノマーは、顕示標識（ｒｅｖｅａｌｉｎｇ ｌａｂｅｌ）で標識されてもよい。顕示標識は、モノマーが検出されることを可能にする任意の好適な標識であり得る。好適な標識は、以下に記載される。
ＣｓｇＧに由来するモノマーはまた、Ｄ−アミノ酸を使用して生成され得る。例えば、ＣｓｇＧに由来するモノマーは、Ｌ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸の混合物を含み得る。これは、かかるタンパク質またはペプチドを生成するための当該技術分野における従来法である。
ＣｓｇＧに由来するモノマーは、ヌクレオチド識別を促進するために１つ以上の特異的修飾を含有する。ＣｓｇＧに由来するモノマーはまた、それらがポア形成に干渉しない限り、他の非特異的修飾を含有してもよい。いくつかの非特異的側鎖修飾は当該技術分野で既知であり、ＣｓｇＧに由来するモノマーの側鎖に行われ得る。かかる修飾には、例えば、アルデヒドとの反応に続くＮａＢＨ４での還元によるアミノ酸の還元アルキル化、メチルアセトイミデート（ｍｅｔｈｙｌａｃｅｔｉｍｉｄａｔｅ）によるアミジン化、または無水酢酸でのアシル化が含まれる。
ＣｓｇＧに由来するモノマーは、当該技術分野で既知の標準的な方法を使用して生成することができる。ＣｓｇＧに由来するモノマーは、合成的に、または組み換え手段によって作製され得る。例えば、モノマーは、インビトロ翻訳及び転写（ＩＶＴＴ）によって合成され得る。ポア及びモノマーを生成するための好適な方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）、または同第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に論じられている。ポアを膜内に挿入するための方法が論じられている。
いくつかの実施形態では、変異体モノマーは、化学修飾される。変異体モノマーは、任意の方法で、任意の部位において化学修飾され得る。変異体モノマーは、好ましくは、１つ以上のシステインへの分子の結合（システイン結合）、１つ以上のリジンへの分子の結合、１つ以上の非天然型アミノ酸への分子の結合、エピトープの酵素修飾、または末端の修飾によって化学修飾される。かかる修飾を実施するための好適な方法は、当該技術分野で周知である。変異体モノマーは、任意の分子の結合によって化学修飾され得る。例えば、変異体モノマーは、色素またはフルオロフォアの結合によって化学修飾され得る。
いくつかの実施形態では、変異体モノマーは、モノマーを含むポアと標的ヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチド配列との間の相互作用を促進する分子アダプターによって化学修飾される。アダプターの存在は、ポア及びヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列のホスト−ゲストケミストリーを改善し、それにより変異体モノマーから形成されたポアのシークエンシング能力を改善する。ホスト−ゲストケミストリーの原理は、当該技術分野で周知である。アダプターは、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列とのその相互作用を改善させるポアの物理的または化学的特性に対する効果を有する。アダプターは、ポアのバレルまたはチャネルの電荷を改変し得るか、またはヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド配列と特異的に相互作用するかもしくはそれらに結合し、それによりポアとのその相互作用を促進し得る。
分子アダプターは、好ましくは、環状分子、シクロデキストリン、ハイブリダイゼーションが可能な種、ＤＮＡ結合剤もしくは相互キレート剤（ｉｎｔｅｒｃｈｅｌａｔｏｒ）、ペプチドもしくはペプチド類似体、合成ポリマー、芳香族平面分子、正に荷電した小分子、または水素結合が可能な小分子である。
アダプターは、環状であってもよい。環状アダプターは、好ましくは、ポアと同じ対称性を有する。ＣｓｇＧが典型的に中心軸の周りに８または９個のサブユニットを有するため、アダプターは、好ましくは、８回対称性または９回対称性を有する。これは、以下により詳細に論じられる。
アダプターは、典型的には、ホスト−ゲストケミストリーを介してヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列と相互作用する。アダプターは、典型的には、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列と相互作用することができる。アダプターは、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列と相互作用することができる１つ以上の化学基を含む。１つ以上の化学基は、好ましくは、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、π−カチオン相互作用、及び／または静電力などの非共有結合相互作用によって、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列と相互作用する。ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列と相互作用することができる１つ以上の化学基は、好ましくは、正に荷電している。ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列と相互作用することができる１つ以上の化学基は、より好ましくはアミノ基を含む。アミノ基は、第１級、第２級、または第３級炭素原子に結合し得る。アダプターは、さらにより好ましくは、アミノ基の環、例えば、６、７、または８個のアミノ基の環を含む。アダプターは、最も好ましくは、８個のアミノ基の環を含む。プロトン化されたアミノ基の環は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列中の負に荷電したリン酸基と相互作用し得る。
ポア内でのアダプターの正しい位置付けは、アダプターと変異体モノマーを含むポアとの間のホスト−ゲストケミストリーによって促進され得る。アダプターは、好ましくは、ポア内の１つ以上のアミノ酸と相互作用することができる１つ以上の化学基を含む。アダプターは、より好ましくは、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、π−カチオン相互作用、及び／または静電力などの非共有結合相互作用を介して、ポア内の１つ以上のアミノ酸と相互作用することができる１つ以上の化学基を含む。ポア内の１つ以上のアミノ酸と相互作用することができる化学基は、典型的には、ヒドロキシルまたはアミンである。ヒドロキシル基は、第１級、第２級、または第３級炭素原子に結合し得る。ヒドロキシル基は、ポア内の荷電していないアミノ酸と水素結合を形成し得る。ポアとヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列との間の相互作用を促進する任意のアダプターを使用することができる。
好適なアダプターには、シクロデキストリン、環状ペプチド、及びククルビツリルが含まれるが、これらに限定されない。アダプターは、好ましくは、シクロデキストリンまたはその誘導体である。シクロデキストリンまたはその誘導体は、Ｅｌｉｓｅｅｖ，Ａ．Ｖ．，ａｎｄ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｈ−Ｊ．（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６，６０８１−６０８８に開示されるもののいずれかであり得る。アダプターは、より好ましくは、ヘプタキス−６−アミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ７−βＣＤ）、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ１−βＣＤ）、またはヘプタキス−（６−デオキシ−６−グアニジノ）−シクロデキストリン（ｇｕ７−βＣＤ）である。ｇｕ７−βＣＤのグアニジノ基は、ａｍ７−βＣＤの第１級アミンよりもはるかに高いｐＫａを有するため、より正に荷電されている。測定される残留電流の精度を高めるため、ならびに高温または低いデータ取得率における塩基検出率を高めるために、このｇｕ７−βＣＤアダプターを使用して、ポア中のヌクレオチドの滞留時間を増加させることができる。
以下により詳細に論じられるようにスクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）架橋剤が使用される場合、アダプターは、好ましくは、ヘプタキス（６−デオキシ−６−アミノ）−６−Ｎ−モノ（２−ピリジル）ジチオプロパノイル−β−シクロデキストリン（ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ）である。
より好適なアダプターには、９個の糖単位を含む（及びしたがって、９回対称性を有する）、γ−シクロデキストリンが含まれる。γ−シクロデキストリンは、リンカー分子を含有し得るか、または上記のβ−シクロデキストリン例において使用された修飾された糖単位のうちの全て以上を含むように修飾され得る。
分子アダプターは、好ましくは、変異体モノマーと共有結合している。アダプターは、当該技術分野で既知の任意の方法を使用してポアと共有結合し得る。アダプターは、典型的には、化学結合を介して結合している。分子アダプターがシステイン結合を介して結合している場合、１つ以上のシステインが、好ましくは、置換によって変異体、例えばバレル内に導入され得る。変異体モノマーは、分子アダプターの、変異体モノマー中の１つ以上のシステインへの結合によって化学修飾され得る。１つ以上のシステインは、天然型、すなわち配列番号２の１位及び／または２１５位における天然型であってもよい。代替的には、変異体モノマーは、分子の、他の位置において導入された１つ以上のシステインへの結合によって化学修飾され得る。２１５位におけるシステインは、分子アダプターが１位におけるシステインまたは別の位置に導入されたシステインの代わりにその位置に結合しないことを確かにするために、例えば置換によって除去され得る。
システイン残基の反応性は、隣接する残基の修飾によって増強され得る。例えば、側方のアルギニン、ヒスチジン、またはリジン残基の塩基性基は、システインチオール基のｐＫａを、より反応性のＳ−基のものに変えることになる。システイン残基の反応性は、ｄＴＮＢなどのチオール保護基によって保護され得る。これらは、リンカーが結合する前に、変異体モノマーの１つ以上のシステイン残基と反応され得る。
分子は、変異体モノマーと直接結合してもよい。分子は、好ましくは、化学架橋剤またはペプチドリンカーなどのリンカーを使用して変異体モノマーに結合している。
好適な化学架橋剤は、当該技術分野で周知である。好ましい架橋剤には、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）ブタノエート、及び２，５−ジオキソピロリジン−１−イル８−（ピリジン−２−イルジスルファニル）オクタナノエート（ｏｃｔａｎａｎｏａｔｅ）が含まれる。最も好ましい架橋剤は、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）である。典型的には、分子は、分子／架橋剤複合体が変異体モノマーと共有結合する前に二官能性架橋剤と共有結合しているが、二官能性架橋剤／モノマー複合体が分子に結合する前に二官能性架橋剤をモノマーと共有結合させることも可能である。
リンカーは、好ましくは、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）に耐性である。好適なリンカーには、ヨードアセトアミド系及びマレイミド系リンカーが含まれるが、これらに限定されない。
他の実施形態では、モノマーは、ポリヌクレオチド結合タンパク質に結合してもよい。これは、本発明のシークエンシングの方法に使用され得るモジュラーシークエンシング（ｍｏｄｕｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）システムを形成する。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、以下に論じられる。
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、好ましくは、変異体モノマーと共有結合している。タンパク質は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用してモノマーと共有結合し得る。モノマー及びタンパク質は、化学的に融合されるかまたは遺伝的に融合されてもよい。構造体全体が単一のポリヌクレオチド配列から発現される場合、モノマー及びタンパク質は、遺伝的に融合される。モノマーのポリヌクレオチド結合タンパク質への遺伝的融合は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）に論じられている。
ポリヌクレオチド結合タンパク質がシステイン結合を介して結合している場合、１つ以上のシステインは、好ましくは、置換によって変異体に導入されている。１つ以上のシステインは、好ましくは、変異または挿入が許容され得ることを示す相同体間の保存が低いループ領域内に導入される。それらはしたがって、ポリヌクレオチド結合タンパク質の結合に好適である。かかる実施形態では、２５１位における天然型システインが除去されてもよい。システイン残基の反応性は、上記の修飾によって増強され得る。
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、変異体モノマーに直接結合してもよく、または１つ以上のリンカーを介して結合してもよい。分子は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号（ＷＯ２０１０／０８６６０２として公開）に記載されるハイブリダイゼーションリンカーを使用して変異体モノマーに結合してもよい。代替的には、ペプチドリンカーを使用してもよい。ペプチドリンカーは、アミノ酸配列である。ペプチドリンカーの長さ、可動性、及び親水性は、典型的には、それがモノマー及び分子の機能を妨げないように設計される。好ましい可動性ペプチドリンカーは、２〜２０個、例えば４、６、８、１０、または１６個のセリン及び／またはグリシンアミノ酸のストレッチである。より好ましい可動性リンカーは、（ＳＧ）１、（ＳＧ）２、（ＳＧ）３、（ＳＧ）４、（ＳＧ）５、及び（ＳＧ）８を含み、式中、Ｓはセリンであり、Ｇはグリシンである。好ましい剛直なリンカーは、２〜３０個、例えば４、６、８、１６、または２４個のプロリンアミノ酸のストレッチである。より好ましい剛直なリンカーは、（Ｐ）１２を含み、式中、Ｐはプロリンである。
変異体モノマーは、分子アダプター及びポリヌクレオチド結合タンパク質によって化学修飾され得る。
分子（それによってモノマーが化学修飾されている）は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）、または同第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に開示されるように、モノマーに直接結合してもよく、またはリンカーを介して結合してもよい。
本発明の変異体モノマー及びポアなどの本明細書に記載されるタンパク質はいずれも、例えば、ポリペプチドがそのような配列を天然に含有しない細胞からのそれらの分泌を促進するための、ヒスチジン残基（ｈｉｓタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグ、ｆｌａｇタグ、ＳＵＭＯタグ、ＧＳＴタグ、もしくはＭＢＰタグの付加によって、またはシグナル配列の付加によって修飾して、それらの同定または純化を補助することができる。遺伝的タグを導入することの代替法は、タンパク上の天然のまたは操作された位置上にタグを化学反応させることである。これの例は、ゲルシフト試薬を、タンパク質の外側に操作されたシステインに反応させることであろう。これは、溶血毒ヘテロオリゴマーを分離するための方法として実証されている（Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．１９９７ Ｊｕｌ；４（７）：４９７−５０５）。
本発明の変異体モノマー及びポアなどの本明細書に記載されるタンパク質はいずれも、顕示標識で標識されてもよい。顕示標識は、タンパク質が検出されることを可能にする任意の好適な標識であり得る。好適な標識には、蛍光分子、放射性同位体、例えば、１２５Ｉ、３５Ｓ、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチド、及びビオチンなどのリガンドが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の変異体モノマー及びポアなどの本明細書に記載されるタンパク質はいずれも、合成的に、または組み換え手段によって作製され得る。例えば、タンパク質は、インビトロ翻訳及び転写（ＩＶＴＴ）によって合成され得る。タンパク質のアミノ酸配列は、非天然型アミノ酸を含むように、またはタンパク質の安定性を増加させるように修飾され得る。タンパク質が合成手段によって生成される場合、かかるアミノ酸は、生成中に導入され得る。タンパク質はまた、合成または組み換え生成のいずれかに続いて改変され得る。
タンパク質はまた、Ｄ−アミノ酸を使用して生成され得る。例えば、タンパク質は、Ｌ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸の混合物を含み得る。これは、かかるタンパク質またはペプチドを生成するための当該技術分野における従来法である。
タンパク質はまた、それらがタンパク質の機能に干渉しない限り、他の非特異的修飾を含有してもよい。いくつかの非特異的側鎖修飾は当該技術分野で既知であり、タンパク質（複数可）の側鎖に行われ得る。かかる修飾には、例えば、アルデヒドとの反応に続くＮａＢＨ４での還元によるアミノ酸の還元アルキル化、メチルアセトイミデート（ｍｅｔｈｙｌａｃｅｔｉｍｉｄａｔｅ）によるアミジン化、または無水酢酸でのアシル化が含まれる。
本発明のモノマー及びポアを含む本明細書に記載されるタンパク質はいずれも、当該技術分野で既知の標準的な方法を使用して生成することができる。タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当該技術分野における標準的な方法を使用して得られ、複製され得る。タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当該技術分野における標準的な方法を使用して細菌宿主細胞において発現され得る。タンパク質は、組み換え発現ベクターからのポリペプチドのインサイツ発現によって細胞内で生成され得る。発現ベクターは、任意に、ポリペプチドの発現を制御するために誘導性プロモーターを担持する。これらの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されている。
タンパク質は、タンパク質生成有機体から、任意のタンパク質液体クロマトグラフィーシステムによる精製に続いて、または組み換え発現の後に大規模に生成され得る。典型的なタンパク質液体クロマトグラフィーシステムには、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡシステム、Ｂｉｏ−Ｃａｄシステム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＢｉｏＬｏｇｉｃシステム、及びＧｉｌｓｏｎ ＨＰＬＣシステムが含まれる。
構造体
本発明はまた、２つ以上の共有結合したＣｓｇＧモノマーを含む構造体であって、モノマーのうちの少なくとも１つが本発明の変異体モノマーである、構造体を提供する。本発明の凹像体は、ポアを形成するその能力を保持する。これは、上記のように判定され得る。本発明の１つ以上の構造体を使用して、ポリヌクレオチドの特徴付け、例えばシークエンシングのためのポアを形成することができる。構造体は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個のモノマーを含んでもよい。構造体は、好ましくは、２個のモノマーを含む。２個以上のモノマーは、同じであるか、または異なる。
構造体中の少なくとも１つのモノマーは、本発明の変異体モノマーである。構造体中の２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上のモノマーが、本発明の変異体モノマーであってもよい。構造体中のモノマーは全て、好ましくは、本発明の変異体モノマーである。変異体モノマーは、同じであるか、または異なってもよい。好ましい実施形態では、構造体は、２個の本発明の変異体モノマーを含む。
構造体中の本発明の変異体モノマーは、好ましくは、およそ同じ長さであるか、または同じ長さである。構造体中の本発明の変異体モノマーのバレルは、好ましくは、およそ同じ長さであるか、または同じ長さである。長さは、アミノ酸の数及び／または長さの単位で測定され得る。
構造体は、本発明の変異体モノマーではない１つ以上のモノマーを含み得る。本発明の変異体モノマーではないＣｓｇＧ変異体モノマーには、配列番号２、３、４、５、６、７、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、もしくは４１を含むモノマー、または上記のアミノ酸／位置が一切変異されていない配列番号２、３、４、５、６、７、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、もしくは４１の比較バリアントが含まれる。構造体中の少なくとも１つのモノマーは、配列番号２、３、４、５、６、７、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、もしくは４１を含むモノマー、または配列番号２、３、４、５、６、７、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、もしくは４１に示される配列の比較バリアントを含み得る。配列番号２、３、４、５、６、７、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または４１の比較バリアントは、その配列全体にわたって、アミノ酸同一性に基づき、配列番号２、３、４、５、６、７、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または４１に対して少なくとも５０％の相同性を有する。より好ましくは、比較バリアントは、配列全体にわたって、アミノ酸同一性に基づき、配列番号２、３、４、５、６、７、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または４１のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％、または９９％の相同性を有し得る。
構造体中のモノマーは、好ましくは、遺伝的に融合されている。構造体全体が単一のポリヌクレオチド配列から発現される場合、モノマーは、遺伝的に融合される。モノマーのコード配列は、任意の方法で組み合わされて、構造体をコードする単一のポリヌクレオチド配列を形成し得る。
モノマーは、任意の構成で遺伝的に融合されてもよい。モノマーは、それらの末端アミノ酸を介して融合されてもよい。例えば、１つのモノマーのアミノ末端は、別のモノマーのカルボキシ末端に融合され得る。構造体中の第２の後続のモノマー（アミノからカルボキシ方向において）は、それらのアミノ末端（その各々は、前のモノマーのカルボキシ末端に融合されている）においてメチオニンを含み得る。例えば、Ｍがモノマー（アミノ末端メチオニンを含まない）であり、ｍＭが、アミノ末端メチオニンを含むモノマーである場合、構造体は、配列Ｍ−ｍＭ、Ｍ−ｍＭ−ｍＭ、またはＭ−ｍＭ−ｍＭ−ｍＭを含み得る。これらのメチオニンの存在は、典型的に、構造体全体をコードするポリヌクレオチド内の第２または後続のモノマーをコードするポリヌクレオチドの５’末端における開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）の発現からもたらされる。構造体中の第１のモノマー（アミノからカルボキシ方向において）も、メチオニンを含み得る（例えば、ｍＭ−ｍＭ、ｍＭ−ｍＭ−ｍＭ、またはｍＭ−ｍＭ−ｍＭ−ｍＭ）。
２つ以上のモノマーは、直接共に遺伝的に融合されてもよい。モノマーは、好ましくは、リンカーを使用して遺伝的に融合される。リンカーは、モノマーの移動を制約するように設計され得る。好ましいリンカーは、アミノ酸配列（すなわち、ペプチドリンカー）である。上記のペプチドリンカーのいずれかを使用することができる。
別の好ましい実施形態では、モノマーは、化学的に融合されている。２つの部分が、例えば化学架橋剤を介して化学結合している場合、２つのモノマーは化学的に融合されている。上記の化学架橋剤のいずれかを使用することができる。リンカーは、本発明の変異体モノマー内に導入された１つ以上のシステイン残基に結合してもよい。代替的には、リンカーは、構造体中のモノマーのうちの１つの末端に結合してもよい。
構造体が異なるモノマーを含有する場合、モノマーのそれら自体への架橋は、モノマーを大幅に超えてリンカーの濃度を維持することによって防止される。代替的には、２つのリンカーが使用される「ロックアンドキー」配置を使用してもよい。各リンカーの一方の端部のみが互いに反応してより長いリンカーを形成し、リンカーの他方の端部は各々、異なるモノマーと反応し得る。かかるリンカーは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号（ＷＯ２０１０／０８６６０２として公開）に記載されている。
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の変異体モノマーをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。変異体モノマーは、上記のもののいずれかであり得る。ポリヌクレオチド配列は、好ましくは、配列全体にわたって、ヌクレオチド同一性に基づき、配列番号１の配列に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の相同性を有する配列を含む。３００個以上、例えば３７５個、４５０個、５２５個、または６００個以上の連続したヌクレオチドのストレッチにわたって、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、または９５％のヌクレオチド同一性があってもよい（「ハードホモロジー」）。相同性は、上記のように計算することができる。ポリヌクレオチド配列は、遺伝暗号の縮重に基づき、配列番号１と異なる配列を含み得る。
本発明はまた、遺伝的に融合された本発明の構造体のいずれかをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。ポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１に示される配列の２つ以上のバリアントを含む。ポリヌクレオチド配列は、好ましくは、配列全体にわたって、ヌクレオチド同一性に基づき、配列番号１に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の相同性を有する２つ以上の配列を含む。６００個以上、例えば７５０個、９００個、１０５０個、または１２００個以上の連続したヌクレオチドのストレッチにわたって、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、または９５％のヌクレオチド同一性があってもよい（「ハードホモロジー」）。相同性は、上記のように計算することができる。
ポリヌクレオチド配列は、当該技術分野における標準的な方法を使用して得られ、複製され得る。野生型ＣｓｇＧをコードする染色体ＤＮＡは、ポア生成有機体、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉから抽出され得る。ポアサブユニットをコードする遺伝子は、特異的プライマーを伴うＰＣＲを使用して増幅され得る。増幅された配列は、次いで、部位特異的変異誘発を経ることがある。部位特異的変異誘発の好適な方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、化合連鎖反応が含まれる。本発明の構造体をコードするポリヌクレオチドは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．（２００１）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されるものなどの、周知の技術を使用して作製され得る。
得られたポリヌクレオチド配列は、次いで、複製可能な組み換えベクター、例えばクローニングベクターに組み込まれ得る。ベクターを使用して、適合する宿主細胞においてポリヌクレオチドを複製することができる。したがって、ポリヌクレオチド配列は、複製可能なベクター内にポリヌクレオチドを導入し、適合する宿主細胞内にベクターを導入し、ベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって作製され得る。ベクターは、宿油脂細胞から回収され得る。ポリヌクレオチドのクローニングのために好適な宿主細胞は、当該技術分野で既知であり、以下により詳細に記載される。
ポリヌクレオチド配列は、好適な発現ベクターへとクローニングされ得る。発現ベクターにおいて、ポリヌクレオチド配列は、典型的には、宿主細胞によるコード配列の発現を提供することができる制御配列に作動可能に結合している。かかる発現ベクターを使用して、ポアサブユニットを発現させることができる。
「作動可能に結合している」という用語は、並置を指し、記載される構成要素は、それらの意図される様式で機能することを可能にする関係性にある。コード配列に「作動可能に結合した」制御配列は、コード配列の発現が制御配列に適合した条件下で達成されるような方法でライゲーションされる。同じまたは異なるポリヌクレオチド配列の複数のコピーが、ベクター内に導入されてもよい。
発現ベクターは、次いで、好適な宿主細胞内に導入され得る。したがって、本発明の変異体モノマーまたはポアは、発現ベクター内にポリヌクレオチド配列を挿入し、適合する細菌宿主細胞内にベクターを導入し、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって作製され得る。組み換え発現されたモノマーまたは構造体は、宿主細胞膜のポア内に自己組織化し得る。代替的には、この方法で生成された組み換えポアは、宿主細胞から除去され、別の膜内に挿入されてもよい。少なくとも２つの異なるモノマーまたは構造体を含むポアを生成するとき、異なるモノマーまたは構造体は、上記のように異なる宿主細胞内で別個に発現され、宿主細胞から取り出され、ウサギ細胞膜または合成膜などの別個の膜のポアを形成してもよい。
ベクターは、例えば、プラスミド、または複製開始点を伴うウイルスまたはファージベクター、任意に当該ポリヌクレオチド配列の発現のためのプロモーター、及び任意にプロモーターのレギュレーターであり得る。ベクターは、１つ以上の選択的マーカー遺伝子、例えば、テトラサイクリン抵抗性遺伝子を含有し得る。プロモーター及び他の発現調節シグナルは、そのために発現ベクターが設計される宿主細胞に適合するように選択され得る。Ｔ７、ｔｒｃ、ｌａｃ、ａｒａ、またはλＬプロモーターが典型的に使用される。
宿主細胞は、典型的に、モノマーまたは構造体を高レベルで発現する。ポリヌクレオチド配列によって形質転換された宿主細胞は、細胞を形質転換するために使用された発現ベクターと適合するように選択されることになる。宿主細胞は、典型的に細菌であり、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。λＤＥ３溶原菌を有する任意の細胞、例えば、Ｃ４１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＴＵＮＥＲ、Ｏｒｉｇａｍｉ及びＯｒｉｇａｍｉ Ｂは、Ｔ７プロモーターを含むベクターを発現することができる。上に列挙された条件に加えて、Ｃａｏ ｅｔ ａｌ，２０１４，ＰＮＡＳ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｎａｍｅｒｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ，ｄｏｉ−１４１１９４２１１１及びＧｏｙａｌ ｅｔ ａｌ，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ，５１６，２５０−２５３ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ ＣｓｇＧに引用される方法のいずれかを使用して、ＣｓｇＧタンパク質を発現することができる。
本発明はまた、本発明の変異体モノマーまたは本発明の構造体を生成する方法を含む。本方法は、好適な宿主細胞において本発明のポリヌクレオチドを発現させることを含む。ポリヌクレオチドは、好ましくは、ベクターの一部であり、好ましくは、プロモーターに作動可能に結合している。
ポア
本発明はまた、様々なポアを提供する。本発明のポアは、それらが異なるヌクレオチドを高度の感受性で識別することができるため、ポリヌクレオチド配列の特徴付け、例えばシークエンシングに理想的である。ポアは、驚くことに、ＤＮＡ及びＲＮＡ中の４つのヌクレオチドを識別することができる。本発明のポアは、さらに、メチル化ヌクレオチド及び非メチル化ヌクレオチドを識別することができる。本発明のポアの塩基分解能は驚くほど高い。ポアは、４つのＤＮＡヌクレオチドの全てのほぼ完全な分離を示す。ポアはさらに、ポア中の滞留時間及びポアを通って流れる電流に基づき、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）とメチル−ｄＣＭＰを識別する。
本発明のポアはまた、一定範囲の条件下で異なるヌクレオチドを識別することができる。とりわけ、ポアは、核酸の特徴付け、例えばシークエンシングに好都合な条件下でヌクレオチドを識別することになる。本発明のポアが異なるヌクレオチドを識別することができる程度は、印加される電位、塩濃度、緩衝液、温度、ならびに尿素、ベタイン、及びＤＴＴなどの添加剤の存在を変えることによって制御することができる。これは、特にシークエンシングの際に、ポアの機能を微調整することを可能にする。これは、以下により詳細に論じられる。本発明を使用して、ヌクレオチドごとに行うのではなく、１つ以上のモノマーとの相互作用からポリヌクレオチドポリマーを同定することもできる。
本発明のポアは、単離されているか、実質的に単離されているか、精製されているか、または実質的に精製されていてもよい。本発明のポアは、それが脂質または他のポアなどの任意の他の構成要素を一切含まない場合、単離または精製されている。ポアは、それが、その意図される使用に干渉しない担体または希釈剤と混合されている場合、実質的に単離されている。例えば、ポアは、それが、１０％未満、５％未満、２％未満、または１％未満の他の構成要素、例えばトリブロックコポリマー、脂質、または他のポアを含む形態で存在する場合、実質的に単離されているか、または実質的に精製されている。代替的には、本発明のポアは、膜内に存在してもよい。好適な膜は、以下に論じられる。
本発明のポアは、個々のポア、または単一のポアとして存在し得る。代替的には、本発明のポアは、２つ以上のポアの相同性または異種性集団において存在してもよい。
ホモオリゴマーポア
本発明はまた、本発明の同一の変異体モノマーを含むＣｓｇＧに由来するホモオリゴマーポアを提供する。ホモオリゴマーポアは、本発明の変異体のいずれかを含んでもよい。本発明のホモオリゴマーポアは、ポリヌクレオチドの特徴付け、例えばシークエンシングに理想的である。本発明のホモオリゴマーポアは、上記の利点のいずれかを有し得る。
ホモオリゴマーポアは、任意の数の変異体モノマーを含有し得る。ポアは、典型的に、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個の同一の変異体モノマー、例えば７、８、９、または１０個の変異体モノマーを含む。ポアは、好ましくは、８または９個の同一の変異体モノマーを含む。変異体モノマーのうちの１個以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個は、好ましくは、上記のように化学修飾されている。
ポアを作製するための方法は、以下により詳細に論じられる。
ヘテロオリゴマーポア
本発明はまた、少なくとも１つの本発明の変異体モノマーを含むＣｓｇＧに由来するヘテロオリゴマーポアを提供する。本発明のヘテロオリゴマーポアは、ポリヌクレオチドの特徴付け、例えばシークエンシングに理想的である。ヘテロオリゴマーポアは、当該技術分野で既知の方法を使用して作製することができる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２００２ Ｊｕｌ；１１（７）：１８１３−２４）。
ヘテロオリゴマーポアは、ポアを形成するために十分なモノマーを含有する。モノマーは、任意の種類であり得る。ポアは、典型的に、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個のモノマー、例えば７、８、９、または１０個のモノマーを含む。ポアは、好ましくは、８または９個のモノマーを含む。
好ましい実施形態では、モノマーの全て（例えば、モノマーのうちの１０、９、８、または７個）は、本発明の変異体モノマーであり、それらのうちの少なくとも１個は、他のものとは異なる。より好ましい実施形態では、ポアは、８または９個の本発明の変異体モノマーを含み、それらのうちの少なくとも１個は、他のものとは異なる。それらは全て互いと異なっていてもよい。
ポア中の本発明の変異体モノマーは、好ましくは、およそ同じ長さであるか、または同じ長さである。ポア中の本発明の変異体モノマーのバレルは、好ましくは、およそ同じ長さであるか、または同じ長さである。長さは、アミノ酸の数及び／または長さの単位で測定され得る。
別の好ましい実施形態では、変異体モノマーのうちの少なくとも１個は、本発明の変異体モノマーではない。この実施形態では、残りのモノマーは、好ましくは、本発明の変異体モノマーである。したがって、ポアは、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個の本発明の変異体モノマーを含み得る。ポア中の任意の数のモノマーは、本発明の変異体モノマーでなくてもよい。ポアは、好ましくは、７または８個の本発明の変異体モノマー、及び本発明のモノマーではない１個のモノマーを含む。本発明の変異体モノマーは、同じであるか、または異なってもよい。
構造体中の本発明の変異体モノマーは、好ましくは、およそ同じ長さであるか、または同じ長さである。構造体中の本発明の変異体モノマーのバレルは、好ましくは、およそ同じ長さであるか、または同じ長さである。長さは、アミノ酸の数及び／または長さの単位で測定され得る。
ポアは、本発明の変異体モノマーではない１個以上のモノマーを含み得る。本発明の変異体モノマーではないＣｓｇＧ変異体モノマーには、配列番号２、３、４、５、６、７、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、もしくは４１を含むモノマー、または上記のアミノ酸／位置が一切変異／置換されていない配列番号２、３、４、５、６、７、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、もしくは４１の比較バリアントが含まれる。配列番号２、３、４、５、６、７、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または４１の比較バリアントは、典型的には、その配列全体にわたって、アミノ酸同一性に基づき、配列番号２、３、４、５、６、７、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または４１に対して少なくとも５０％の相同性を有する。より好ましくは、比較バリアントは、配列全体にわたって、アミノ酸同一性に基づき、配列番号２、３、４、５、６、７、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または４１のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％、または９９％の相同性を有し得る。
上記の全ての実施形態では、変異体モノマーのうちの１個以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個は、好ましくは、上記のように化学修飾されている。
ポアを作製するための方法は、以下により詳細に論じられる。
構造体含有ポア
本発明はまた、少なくとも１個の本発明の構造体を含むポアを提供する。本発明の構造体は、ＣｓｇＧに由来する２個以上の共有結合したモノマーを含み、モノマーのうちの少なくとも１個は、本発明の変異体モノマーである。換言すれば、構造体は、１個超のモノマーを含有しなければならない。ポアは、ポアを形成するために十分は構造体と、必要であれば、モノマーとを含有する。例えば、オクタマーポアは、（ａ）各々２個の構造体を含む４個の構造体、（ｂ）各々４個のモノマーを含む２個の構造体、または（ｂ）２個のモノマーを含む１個の構造体、及び構造体の一部を成さない６個のモノマーを含み得る。例えば、ノナマーポアは、（ａ）各々２個の構造体を含む４個の構造体、及び構造体の一部を成さない１個のモノマー、（ｂ）各々４個のモノマーを含む２個の構造体、及び構造体の一部を成さない１個のモノマー、または（ｂ）２個のモノマーを含む１個の構造体、及び構造体の一部を成さない７個のモノマーを含み得る。構造体及びモノマーの他の組み合わせが当業者によって想定され得る。
ポア中のモノマーのうちの少なくとも２個は、本発明の構造体の形態にある。構造体、故にポアは、少なくとも１個の本発明の変異体モノマーを含む。ポアは、典型的に、合計で少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個のモノマー、例えば７、８、９、または１０個のモノマーを含む（そのうちの少なくとも２個は、構造体中になければならない）。ポアは、好ましくは、８または９個のモノマーを含む（そのうちの少なくとも２個は構造体中になければならない）。
構造体含有ポアは、ホモオリゴマー（すなわち、同一の構造体を含む）であっても、またはヘテロオリゴマーポア（すなわち、少なくとも１個の構造体が他のものと異なる）であってもよい。
ポアは、典型的に、（ａ）２個のモノマーを含む１個の構造体、及び（ｂ）５、６、７、または８個のモノマーを含有する。構造体は、上述のもののいずれかであり得る。モノマーは、上記のように、配列番号２、３、４、５、６、７、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、もしくは４１を含むモノマーである、本発明の変異体モノマー、または配列番号２、３、４、５、６、７、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、もしくは４１の比較バリアントを含む変異体モノマーを含む、上記のもののいずれかであり得る。
別の典型的なポアは、１個超の本発明の構造体、例えば２、３、または４個の本発明の構造体を含む。必要であれば、かかるポアは、ポアを形成するために十分な追加のモノマーまたは構造体をさらに含む。追加のモノマー（複数可）は、上記のように、配列番号２、３、４、５、６、７、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、もしくは４１を含むモノマーである、本発明の変異体モノマー、または配列番号２、３、４、５、６、７、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、もしくは４１の比較バリアントを含む変異体モノマーを含む、上記のもののいずれかであり得る。追加の構造体（複数可）は、上記のもののいずれかであってもよく、または配列番号２、３、４、５、６、７、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、もしくは４１を含むモノマー、もしくは配列番号２、３、４、５、６、７、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、もしくは４１の比較バリアントを各々含む２つ以上の共有結合したＣｓｇＧモノマーを含む構造体であってもよい。
本発明のさらなるポアは、２個のモノマーを含む構造体のみを含み、例えば、ポアは、２個のモノマーを含む４、５、６、７、または８個の構造体を含み得る。少なくとも１個の構造体は、本発明の構造体であり、すなわち、少なくとも１個の構造体中の少なくとも１個のモノマー、好ましくは少なくとも１個の構造体中の各モノマーは、本発明の変異体モノマーである。２個のモノマーを含む構造体は全て、本発明の構造体であり得る。
本発明による特異的ポアは、２個のモノマーを各々含む本発明の４個の構造体を含み、各構造体中の少なくとも１個のモノマー、好ましくは各構造体中の各モノマーは、本発明の変異体モノマーである。構造体は、各構造体の１個のみのモノマーがポアのチャネルに寄与するような構造で、ポア内にオリゴマー形成し得る。典型的には、構造体の他のモノマーは、ポアのチャネルの外側にあることになる。例えば、本発明のポアは、２個のモノマーを含む７、８、９、または１０個の構造体を含み得、チャネルは、７、８、９、または１０個のモノマーを含む。
変異は、上記のように構造体内に導入され得る。変異は交互であってもよく、すなわち、変異は２個のモノマー構造体以内の各モノマーについて異なり、構造体はホモオリゴマーとして形成され、交互修飾をもたらす。換言すれば、ＭｕｔＡ及びＭｕｔＢを含むモノマーは、融合及び組織化されてＡ−Ｂ：Ａ−Ｂ：Ａ−Ｂ：Ａ−Ｂポアを形成する。代替的には、変異は隣接していてもよく、すなわち、同一の変異が構造体中の２個のモノマー内に導入され、これは次いで、異なる変異体モノマーまたは構造体とオリゴマー形成される。換言すれば、ＭｕｔＡを含むモノマーは融合され、続いてＭｕｔＢ含有モノマーとオリゴマー形成されて、Ａ−Ａ：Ｂ：Ｂ：Ｂ：Ｂ：Ｂ：Ｂを形成する。
構造体含有ポア中の本発明のモノマーのうちの１個以上は、上記のように化学修飾されていてもよい。
分析物の特徴付け
本発明は、標的分析物の存在、不在、または１つ以上の特徴を判定する方法を提供する。本方法は、標的分析物がポアに対して、例えばそれを通して移動するように、標的分析物を本発明のポアと接触させることと、分析物がポアに関して移動する間に１つ以上の測定値を取り、それにより分析物の存在、不在、または１つ以上の特徴を判定することと、を伴う。標的分析物はまた、鋳型分析物または目的の分析物とも呼ばれ得る。
ステップ（ａ）及び（ｂ）は、好ましくは、ポアにわたって電位が印加された状態で実施される。以下により詳細に論じられるように、印加される電位は、典型的には、ポアとポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体の形成をもたらす。印加される電位は、電圧電位であり得る。代替的には、印加される電位は、化学的電位であり得る。この例は、両親媒性層にわたって塩勾配を使用することである。塩勾配は、Ｈｏｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２００７ Ｊｕｌ １１；１２９（２７）：８６５０−５に開示されている。
本方法は、標的分析物の存在、不在、または１つ以上の特徴を判定するためのものである。本方法は、少なくとも１つの分析物の存在、不在、または１つ以上の特徴を判定するためのものであってもよい。本方法は、２つ以上の分析物の存在、不在、または１つ以上の特徴を判定することに関してもよい。本方法は、任意の数の分析物、例えば２、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００個、またはそれ以上の分析物の存在、不在、または１つ以上の特徴を判定することを含んでもよい。１つ以上の分析物の任意の数の特徴、例えば１、２、３、４、５、１０個、またはそれ以上の特徴が判定され得る。
標的分析物は、好ましくは、金属イオン、無機塩、ポリマー、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、染料、漂白剤、医薬品、診断薬、レクリエーショナルドラッグ、爆発物、または環境汚染物質である。本方法は、２つ以上の同じ種類の分析物、例えば２つ以上のタンパク質、２つ以上のヌクレオチド、または２つ以上の医薬品の存在、不在、または１つ以上の特徴を判定することに関してもよい。代替的には、本方法は、２つ以上の異なる種類の分析物、例えば１つ以上のタンパク質、１つ以上のヌクレオチド、及び１つ以上の医薬品の存在、不在、または１つ以上の特徴を判定することに関してもよい。
標的分析物は、細胞から分泌され得る。代替的には、標的分析物は、細胞の内部に存在する分析物であり得、その場合、分析物は、本発明が実施され得る前に細胞から抽出されなければならない。
分析物は、好ましくは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、及び／またはタンパク質である。アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、天然型であっても非天然型であってもよい。ポリペプチドまたはタンパク質は、それらの中に合成または修飾アミノ酸を含み得る。アミノ酸へのいくつかの異なる種類の修飾が当該技術分野で既知である。好適なアミノ酸及びその修飾は、上記である。本発明の目的において、標的分析物は、当該技術分野で利用可能な任意の方法によって修飾され得ることを理解されたい。
タンパク質は、酵素、抗体、ホルモン、成長因子、または成長調節タンパク質、例えばサイトカインであり得る。サイトカインは、インターロイキン、好ましくは、ＩＦＮ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１３、インターフェロン、好ましくは、ＩＬ−γ、ならびに他のサイトカイン、例えばＴＮＦ−αから選択され得る。タンパク質は、細菌タンパク質、真菌タンパク質、ウイルスタンパク質、または寄生虫由来のタンパク質であり得る。
標的分析物は、好ましくは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドである。ヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、以下に論じられる。オリゴヌクレオチドは、典型的に５０個以下のヌクレオチド、例えば４０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下、または５個以下のヌクレオチドを有する短いヌクレオチドポリマーである。オリゴヌクレオチドは、脱塩基及び修飾ヌクレオチドを含む、下記のヌクレオチドのいずれかを含んでもよい。
標的分析物、例えば標的ポリヌクレオチドは、下記の好適な試料のいずれかに存在し得る。
ポアは典型的に、下記のように、膜内に存在する。標的分析物は、下記の方法を使用して膜に結合または送達され得る。
下記の測定値のいずれかを使用して、標的分析物の存在、不在、または１つ以上の特徴を判定することができる。本方法は、好ましくは、標的分析物がポアに対して移動するように、例えばそれを通して移動するように、標的分析物をポアと接触させることと、分析物がポアに関して移動する間にポアを通過する電流を測定し、それにより分析物の存在、不在、または１つ以上の特徴を判定することと、を含む。
分析物について特異的な方法で電流がポアを通過する場合（すなわち、分析物に関連付けられる固有の電流がポアを通過することが検出された場合）、標的分析物は存在する。ヌクレオチドについて特異的な方法で電流がポアを通過しない場合、分析物は不在である。分析物の存在下で対照実験を実施して、それがポアを通過する電流にどのように影響を及ぼすかを判定することができる。
本発明を使用して、それらがポアを通過する電流にもたらす異なる影響に基づいて、類似構造の分析物を区別することができる。個々の分析物は、それらがポアと相互作用するときの電流振幅から、単一分子レベルで同定することができる。本発明を使用して、試料中に特定の分析物が存在するか否かを判定することもできる。本発明を使用して、試料中の特定の分析物の濃度を測定することもできる。ＣｓｇＧ以外のポアを使用した分析物の特徴付けは、当該技術分野で既知である。
ポリヌクレオチド特徴付け
本発明は、標的ポリヌクレオチドの特徴付けの方法、例えばポリヌクレオチドのシークエンシングの方法を提供する。ナノポアを使用してポリヌクレオチドの特徴付けまたはシークエンシングを行うためには、２つの主要な戦略、すなわち鎖の特徴付け／シークエンシング及びエキソヌクレアーゼの特徴付け／シークエンシングが存在する。本発明の方法は、いずれかの方法を伴い得る。
鎖シークエンシングにおいて、ＤＮＡは、印加された電位と共にまたはそれに対して、ナノポアを通して転移される。二本鎖ＤＮＡ上で進行的または前進的に作用するエキソヌクレアーゼをポアのシス側に使用して、印加された電位化で、または逆電位下のトランス側で、残りの一本鎖を貫通接続することができる。同様に、二本鎖ＤＮＡを解くヘリカーゼも、類似の方法で使用することができる。ポリメラーゼも使用することができる。印加された電位に対する鎖転移を必要とするシークエンシングアプリケーションの可能性もあるが、ＤＮＡはまず、逆電位下または電位のない状態下で酵素によって「捕まら」なければならない。その後、結合に続いて電位が戻されると、鎖は、ポアをシスからトランスへと通り、電流によって拡張された立体構造で保持されることになる。一本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼまたは一本鎖ＤＮＡ依存性ポリメラーゼは分子モーターとして作用して、印加された電位に対して、新たに転移された一本鎖を、制御された様式でポアを通してトランスからシスへと引き戻すことができる。
一実施形態では、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法は、標的配列を、本発明のポア及びヘリカーゼ酵素と接触させることを伴う。本方法において、任意のヘリカーゼを使用することができる。好適なヘリカーゼは、以下に論じられる。ヘリカーゼは、ポアに対して２つのモードで働き得る。第１に、本方法は、好ましくは、それが、印加された電位から生じる電界と共にポアを通る標的配列の移動を制御するように、ヘリカーゼを使用して実施される。このモードにおいて、ＤＮＡの５’末端がまずポア内に捕捉され、酵素は、それが最終的に二分子層のトランス側を通って転移するまで、標的配列が電界と共にポアに通されるように、ＤＮＡのポア内への移動を制御する。代替的には、本方法は、好ましくは、ヘリカーゼ酵素が、印加された電位から生じる電界に対してポアを通る標的配列の移動を制御するように実施される。このモードにおいて、ＤＮＡの３’末端がまずポア内に捕捉され、酵素は、標的配列が、最終的に二分子層のシス側に戻って排出されるまで、印加された電界に対してポアの外に引き出されるように、ポアを通るＤＮＡの移動を制御する。
エキソヌクレアーゼシークエンシングにおいて、エキソヌクレアーゼは、個々のヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドの一方の末端から放出し、これらの個々のヌクレオチドは、以下のように同定される。別の実施形態では、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法は、標的配列をポア及びエキソヌクレアーゼ酵素と接触させることを伴う。本方法において、下記のエキソヌクレアーゼのいずれかを使用することができる。酵素は、下記のように、ポアと共有結合していてもよい。
エキソヌクレアーゼは、典型的に、ポリヌクレオチドの一方の末端にラッチされ、その末端から１個ずつのヌクレオチドで配列を消化する酵素である。エキソヌクレアーゼは、５’から３’方向または３’から５’方向でポリヌクレオチドを消化することができる。エキソヌクレアーゼが結合するポリヌクレオチドの末端は、典型的には、使用される酵素の選択を介して、かつ／または当該技術分野で既知の方法を使用して判定される。典型的には、ポリヌクレオチドの両端におけるヒドロキシル基またはキャップ構造を使用して、ポリヌクレオチドの特定の末端へのエキソヌクレアーゼの結合を防止または促進することができる。
本方法は、上記のようなヌクレオチドの一部の特徴付けまたは同定を可能にする速度でヌクレオチドがポリヌクレオチドの末端から消化されるように、ポリヌクレオチドをエキソヌクレアーゼと接触させることを伴う。これを行う方法は、当該技術分野で周知である。例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用してそれらが同定され得るように、ポリペプチドの末端から単一のアミノ酸を連続的に消化するためにエドマン分解が使用される。本発明において、相同法を使用することができる。
エキソヌクレアーゼが機能する速度は、典型的には、野生型エキソヌクレアーゼの最適速度よりも遅い。本発明の方法におけるエキソヌクレアーゼの活性の好適な速度は、毎秒０．５〜１０００ヌクレオチド、毎秒０．６〜５００ヌクレオチド、毎秒０．７〜２００ヌクレオチド、毎秒０．８〜１００ヌクレオチド、毎秒０．９〜５０ヌクレオチド、毎秒１〜２０または１０ヌクレオチドの消化を伴う。速度は、好ましくは、毎秒１、１０、１００、５００、または１０００ヌクレオチドである。エキソヌクレアーゼ活性の好適な速度は、様々な方法で達成することができる。例えば、活性の低減された最適速度を有するバリアントエキソヌクレアーゼが本発明に従って使用され得る。
鎖特徴付け実施形態では、本方法は、ポアに対して、例えばそれを通してポリヌクレオチドが移動するように、ポリヌクレオチドを本発明のポアと接触させることと、ポリヌクレオチドがポアに対して移動する間に１つ以上の測定値を取ることであって、測定値はポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を示す、取ることによって、標的ポリヌクレオチドを特徴付けることと、を含む。
エキソヌクレオチド特徴付け実施形態では、本方法は、エキソヌクレアーゼが標的ポリヌクレオチドの一方の末端から個々のヌクレオチドを消化し、かつ個々のヌクレオチドがポアに対して、例えばそれを通して移動するように、ポリヌクレオチドを本発明のポア及びエキソヌクレアーゼと接触させることと、個々のヌクレオチドがポアに対して移動する間に１つ以上の測定値を取ることであって、測定値は個々のヌクレオチドの１つ以上の特徴を示す、取ることによって、標的ポリヌクレオチドを特徴付けることと、を含む。
個々のヌクレオチドは、単一のヌクレオチドである。個々のヌクレオチドは、ヌクレオチド結合によって別のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと結合していないものである。ヌクレオチド結合は、ヌクレオチドのリン酸基のうちの１つが、別のヌクレオチドの糖基に結合することを伴う。個々のヌクレオチドは、典型的には、ヌクレオチドによって、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、または少なくとも５０００ヌクレオチドの別のポリヌクレオチドに結合していないものである。例えば、個々のヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド配列、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ鎖から消化されている。ヌクレオチドは、下記のもののいずれかであり得る。
個々のヌクレオチドは、任意の方法及び任意の部位でポアと相互作用することができる。ヌクレオチドは、好ましくは、上記のようなアダプターを介してまたはそれと併せて、ポアに逆向きに結合する。ヌクレオチドは、最も好ましくは、それらが膜にわたってポアを通過する間に、アダプターを介してまたはそれと併せて、ポアに逆向きに結合する。ヌクレオチドはまた、それらが膜にわたってポアを通過する間に、アダプターを介してまたはそれと併せて、ポアのバレルまたはチャネルに逆向きに結合し得る。
個々のヌクレオチドとポアとの相互作用の間、ヌクレオチドは、典型的には、そのヌクレオチドについて特異的な方法でポアを通過する電流に影響を及ぼす。例えば、特定のヌクレオチドは、特定の平均時間にわたり、かつ特定の程度まで、ポアを通過する電流を低減させることになる。換言すれば、ポアを通る電流は、特定のヌクレオチドについて固有である。分析物の存在下で対照実験を実施して、ポアを通過する電流に対して特定のヌクレオチドが有する影響を判定することができる。試験試料上で本発明の方法を実施した結果を、その後、かかる対照実験から得られた結果と比較して、試料中の特定のヌクレオチドを同定するか、または特定のヌクレオチドが試料中に存在するかどうかを判定することができる。特定のヌクレオチドを示す様式でポアを通過する電流が影響される周波数を使用して、試料中のそのヌクレオチドの濃度を判定することができる。試料内の異なるヌクレオチドの割合も計算することができる。例えば、ｄＣＭＰ対メチルｄＣＭＰの割合を計算することができる。
本方法は、標的ポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を測定することを伴う。標的ポリヌクレオチドはまた、鋳型ポリヌクレオチドまたは目的のポリヌクレオチドとも呼ばれ得る。
この実施形態はまた、本発明のポアを使用する。標的分析物に関して上記のポア及び実施形態のいずれかが使用され得る。
ポリヌクレオチド
核酸などのポリヌクレオチドは、２つ以上のヌクレオチドを含む高分子である。ポリヌクレオチドはまたは核酸は、任意のヌクレオチドの任意の組み合わせを含み得る。ヌクレオチドは、天然であっても人工であってもよい。ポリヌクレオチド中の１つ以上のヌクレオチドは、酸化またはメチル化されてもよい。ポリヌクレオチド中の１つ以上のヌクレオチドは、損傷していてもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、ピリミジンダイマーを含んでもよい。かかるダイマーは、典型的には、紫外線による損傷に関連付けられ、皮膚メラノーマの主因である。ポリヌクレオチド中の１つ以上のヌクレオチドは、例えば標識またはタグによって修飾され得る。好適な標識は、以下に記載される。ポリヌクレオチドは、１つ以上のスペーサを含み得る。
ヌクレオチドは、典型的には、核酸塩基、糖、及び少なくとも１つのリン酸基を含有する。核酸塩基及び糖は、ヌクレオシドを形成する。
核酸塩基は、典型的には、複素環である。核酸塩基には、プリン及びピリミジン、より具体的には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、及びシトシン（Ｃ）が含まれるが、これらに限定されない。
糖は、典型的には、五炭糖である。ヌクレオチド糖には、リボース及びデオキシリボースが含まれるが、これらに限定されない。糖は、好ましくは、デオキシリボースである。
ポリヌクレオチドは、好ましくは、以下のヌクレオシド、デオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシウリジン（ｄＵ）及び／またはチミジン（ｄＴ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）、ならびにデオキシシチジン（ｄＣ）を含む。
ヌクレオチドは、典型的には、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは、典型的には、一リン酸、二リン酸、または三リン酸を含有する。ヌクレオチドは、３個超のリン酸、例えば４または５個のリン酸を含み得る。リン酸は、ヌクレオチドの５’または３’側に結合し得る。ヌクレオチドには、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、５−メチルシチジン一リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン一リン酸、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、及びデオキシメチルシチジン一リン酸が含まれるが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ、及びｄＵＭＰから選択される。
ヌクレオチドは、脱塩基（すなわち、核酸塩基を欠く）であってもよい。ヌクレオチドはまた、核酸塩基及び糖を欠いてもよい（すなわち、Ｃ３スペーサである）。
ポリヌクレオチド中のヌクレオチドは、任意の方法で互いに結合し得る。ヌクレオチドは、典型的には、核酸と同様に、それらの糖及びリン酸基によって結合している。ヌクレオチドは、ピリミジンダイマーと同様に、それらの核酸塩基を介して接続し得る。
ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。ポリヌクレオチドは、好ましくは、一本鎖である。一本鎖ポリヌクレオチド特徴付けは、実施例において１Ｄと称される。ポリヌクレオチドの少なくとも一部は、二本鎖であってもよい。
ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸であり得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの１本の鎖にハイブリダイズされたＲＮＡの１本の鎖を含み得る。ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の任意の合成核酸、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはヌクレオチド側鎖を有する他の合成ポリマーであり得る。ＰＮＡ骨格は、ペプチド結合によって連結した繰り返しＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位で構成されている。ＧＮＡ骨格は、ホスホジエステル結合によって連結した繰り返しグリコール単位で構成されている。ＴＮＡ骨格は、ホスホジエステル結合によって共に連結した繰り返しトレオース糖で構成されている。ＬＮＡは、上記のように、リボース部分における２’酸素及び４’炭素を接続する余分な架橋を有するリボヌクレオチドから形成される。架橋核酸（ＢＮＡ）は、修飾ＲＮＡヌクレオチドである。それらはまた、拘束ＲＮＡまたは隔絶ＲＮＡとも呼ばれ得る。ＢＮＡモノマーは、「固定」Ｃ３’−ｅｎｄｏ糖パッカリングを有する、５員、６員、またはさらには７員の架橋構造を含有し得る。２’，４’−ＢＮＡモノマーを生成するために、架橋は、リボースの２’，４’位置に合成的に組み込まれる。
ポリヌクレオチドは、最も好ましくは、リボ核酸核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
ポリヌクレオチドは、任意の長さであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００、または少なくとも５００ヌクレオチドまたはヌクレオチド対の長さであり得る。ポリヌクレオチドは、１０００以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対、５０００以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対の長さ、または１０００００以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対の長さであり得る。
任意の数のポリヌクレオチドを調査することができる。例えば、本発明の方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、１００、またはそれ以上のポリヌクレオチドの特徴付けに関し得る。２個以上のポリヌクレオチドが特徴付けられた場合、それらは、異なるポリヌクレオチドであるか、または同じポリヌクレオチドの２個の実例であり得る。
ポリヌクレオチドは、天然であっても人工であってもよい。例えば、本方法を使用して、製造されたオリゴヌクレオチドの配列を確かめることができる。本方法は、典型的には、インビトロで実施される。
試料
ポリヌクレオチドは、典型的には、任意の好適な試料中に存在する。本発明は、典型的には、ポリヌクレオチドを含有することが既知であるか、それを含有する疑いがある試料上で実施される。代替的には、本発明は、試料中のその存在が既知であるかまたは予想されるポリヌクレオチドの同一性を確認するために、試料上で実施されてもよい。
試料は、生体試料であり得る。本発明は、任意の有機体または微生物から得られたかまたは抽出された試料を使用してインビトロで実施され得る。有機体または微生物は、典型的には、古細菌、原核生物、または真核生物であり、典型的には、植物界、動物界、真菌界、モネラ界、及び原生生物界の５つ界のうちの１つに属する。本発明は、任意のウイルスから得られたかまたは抽出された試料上でインビトロで実施され得る。試料は、好ましくは、液体試料である。試料は、典型的には、患者の体液を含む。試料は、尿、リンパ液、唾液、粘液、または羊水であり得るが、好ましくは、血液、血漿、または血清である。
典型的には、試料は、人間起源であるが、代替的には、別の哺乳動物、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、サカナ、ニワトリ、またはブタなどの商業用飼育動物であり得るか、または代替的には、ネコまたはイヌなどの愛玩動物であり得る。代替的には、試料は、植物起源であってもよく、例えば、穀物、マメ科植物、果物、または野菜などの商業用作物、例えば、小麦、大麦、オート麦、セイヨウアブラナ、トウモロコシ、大豆、米、ルバーブ、バナナ、リンゴ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、タバコ、豆、レンズ豆、サトウキビ、ココア、綿から得られた試料であってもよい。
試料は、非生体試料であってもよい。非生体試料は、好ましくは、液体試料である。非生体試料の例としては、外科用流体、水、例えば飲料水、海水、または河川水、及び臨床検査用の試薬が挙げられる。
試料は、典型的には、本発明において使用される前に、例えば、遠心分離によって、または不必要な分子もしくは細胞を濾過して取り除く膜を通した通過によって、処理される。それは、採取された直後に測定されてもよい。試料はまた、典型的には、アッセイの前に、好ましくは−７０℃未満で保管され得る。
特徴付け
本方法は、ポリヌクレオチドの２つ、３つ、４つ、または５つ以上の特徴を測定することを伴い得る。１つ以上の特徴は、好ましくは、（ｉ）ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）ポリヌクレオチドの二次構造、及び（ｖ）ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択される。｛ｉ｝、｛ｉｉ｝、｛ｉｉｉ｝、｛ｉｖ｝、｛ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ｝、｛ｉ，ｉｉｉ｝、｛ｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ｝、｛ｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉｉ，ｖ｝、｛ｉｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉｖ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、または｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝などの（ｉ）〜（ｖ）の任意の組み合わせが本発明に従って測定され得る。（ｉ）〜（ｖ）の異なる組み合わせは、第２のポリヌクレオチドと比較して、第１のポリヌクレオチドについて測定され得、上記に列挙された組み合わせのいずれかが含まれる。
（ｉ）について、ポリヌクレオチドの長さは、例えば、ポリヌクレオチドとポアとの間の相互作用の数またはポリヌクレオチドとポアとの間の相互作用の持続時間を判定することによって測定され得る。
（ｉｉ）について、ポリヌクレオチドの同一性は、いくつかの方法で測定され得る。ポリヌクレオチドの同一性は、ポリヌクレオチドの配列の測定と併せて、またはポリヌクレオチドの配列の測定を伴わずに測定され得る。前者は簡単であり、ポリヌクレオチドがシークエンシングされ、それにより同定される。後者は、いくつかの方法で行うことができる。例えば、ポリヌクレオチド中の特定のモチーフの存在が測定され得る（ポリヌクレオチドの残りの配列を測定することなく）。代替的には、本方法における特定の電気的及び／または光学的シグナルの測定は、特定の供給源から得られるものとしてポリヌクレオチドを同定することができる。
（ｉｉｉ）について、ポリヌクレオチドの配列は、前述のように判定することができる。好適なシークエンシング方法、特に電気的測定を使用するものは、Ｓｔｏｄｄａｒｔ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，１２；１０６（１９）：７７０２−７、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ＫＲ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１０；１３２（５０）：１７９６１−７２、及び国際出願第ＷＯ２０００／２８３１２号に記載されている。
（ｉｖ）について、二次構造は、様々な方法で測定され得る。例えば、方法が電気的測定を伴う場合、二次構造は、滞留時間の変化またはポアを通過する電流の変化を使用して測定され得る。これは、一本鎖及び二本鎖ポリヌクレオチドの領域を識別することを可能にする。
（ｖ）について、任意の修飾の存在または不在が測定され得る。本方法は、好ましくは、メチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つ以上のタンパク質によって、または１つ以上の標識、タグ、もしくはスペーサによってポリヌクレオチドが修飾されているか否かを判定することを含む。特異的修飾は、ポアとの特異的相互作用をもたらすことになり、これは下記の方法を使用して測定することができる。例えば、メチルシオチン（ｍｅｔｈｙｌｃｙｏｔｓｉｎｅ）は、各ヌクレオチドとのその相互作用中にポアを通過する電流に基づき、シトシンと区別され得る。
標的ポリヌクレオチドは、本発明のポアと接触する。ポアは、典型的には、膜内に存在する。好適な膜は、以下に論じられる。本方法は、ポアが膜内に存在する膜／ポアシステムを調査するために好適な任意の装置を使用して実施することができる。本方法は、膜貫通ポアセンシングのために好適な任意の装置を使用して実施することができる。例えば、装置は、水溶液を含むチャンバと、チャンバを２つの区画に分ける障壁とを備える。障壁は、典型的には、ポアを含有する膜が形成される孔を有する。代替的には、障壁は、ポアが存在する膜を形成する。
本方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２号（ＷＯ２００８／１０２１２０）に記載される装置を使用して実施することができる。
様々な異なる種類の測定を行うことができる。これには、電気的測定及び光学的測定が含まれるが、これらに限定されない。考えられる電気的測定としては、電流測定、インピーダンス測定、トンネル効果測定（Ｉｖａｎｏｖ ＡＰ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１１ Ｊａｎ １２；１１（１）：２７９−８５）、及びＦＥＴ測定（国際出願第ＷＯ２００５／１２４８８８号）が挙げられる。光学的測定は、電気的測定と組み合わせられ得る（Ｓｏｎｉ ＧＶ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖ Ｓｃｉ Ｉｎｓｔｒｕｍ．２０１０ Ｊａｎ；８１（１）：０１４３０１）。測定は、膜貫通電流測定、例えば、ポアを通過するイオン電流の測定であり得る。
電気的測定は、Ｓｔｏｄｄａｒｔ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，１２；１０６（１９）：７７０２−７、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ＫＲ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１０；１３２（５０）：１７９６１−７２、及び国際出願第ＷＯ２０００／２８３１２号に記載されるような標準的なシングルチャネルレコーディング装置を使用して行うことができる。代替的には、例えば、国際出願第ＷＯ２００９／０７７７３４号及び国際出願第ＷＯ２０１１／０６７５５９号に記載されるような電気的測定は、マルチチャネルシステムを使用して行うことができる。
本方法は、好ましくは、膜にわたって電位が印加された状態で実施される。印加される電位は、電圧電位であり得る。代替的には、印加される電位は、化学的電位であり得る。この例は、両親媒性層などの膜にわたって塩勾配を使用することがである。塩勾配は、Ｈｏｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２００７ Ｊｕｌ １１；１２９（２７）：８６５０−５に開示されている。いくつかの実例において、ポリヌクレオチドの配列を推定または判定するために、ポアに対してポリヌクレオチドが移動する間の、ポアを通過する電流が使用される。これは、鎖シークエンシングである。
本方法は、ポアに対してポリヌクレオチドが移動する間の、ポアを通過する電流を測定することを伴う。したがって、本方法に使用される装置はまた、電位を印加し、膜及びポアにわたる電気シグナルを測定することができる電気回路を含み得る。本方法は、パッチクランプまたは電圧クランプを使用して実施され得る。本方法は、好ましくは、電圧クランプの使用を伴う。
本発明の方法は、ポアに対してポリヌクレオチドが移動する間の、ポアを通過する電流の測定を伴う。膜貫通タンパク質ポアを通るイオン電流を測定するために好適な条件は、当該技術で既知であり、実施例において開示される。本方法は、典型的には、膜及びポアにわたって電圧が印加された状態で実施される。使用される電圧は、典型的には、＋５Ｖ〜−５Ｖ、例えば＋４Ｖ〜−４Ｖ、＋３Ｖ〜−３Ｖ、または＋２Ｖ〜−２Ｖである。使用される電圧は、典型的には、−６００ｍＶ〜＋６００ｍＶまたは−４００ｍＶ〜＋４００ｍＶである。使用される電圧は、好ましくは、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶ、及び０ｍＶから選択される下限と、＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶ、及び＋４００ｍＶから独立して選択される上限とを有する範囲内である。使用される電圧は、より好ましくは、１００ｍＶ〜２４０ｍＶの範囲内、最も好ましくは、１２０ｍＶ〜２２０ｍＶの範囲内である。増加した印加電位を使用することによって、ポアによる異なるヌクレオチド間の識別を増加させることが可能である。
本方法は、典型的には、金属塩、例えばアルカリ金属塩、ハロゲン塩、例えば塩化物塩、例えばアルカリ金属塩化物塩などの任意のチャージキャリアの存在下で実施される。チャージキャリアには、イオン性液体または有機塩、例えば、塩化テトラメチルアンモニウム、塩化トリメチルフェニルアンモニウム、塩化フェニルトリメチルアンモニウム、または１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロリドが含まれ得る。上記の例示的な装置において、塩は、チャンバ内の水溶液中に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）、またはフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物が典型的に使用される。ＫＣｌ、ＮａＣｌ、及びフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物が好ましい。チャージキャリアは、膜にわたって不斉であり得る。例えば、チャージキャリアの種類及び／または濃度は、膜の各側で異なり得る。
塩濃度は、飽和であり得る。塩濃度は、３Ｍ以下であり得、典型的には、０．１〜２．５Ｍ、０．３〜１．９Ｍ、０．５〜１．８Ｍ、０．７〜１．７Ｍ、０．９〜１．６Ｍ、または１Ｍ〜１．４Ｍである。塩濃度は、好ましくは、１５０ｍＭ〜１Ｍである。本方法は、好ましくは、少なくとも０．３Ｍ、例えば少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも２．０Ｍ、少なくとも２．５Ｍ、または少なくとも３．０Ｍの塩濃度を使用して実施される。高い塩濃度は、高いシグナル対ノイズ比をもたらし、通常の電流変動のバックグラウンドに対して、ヌクレオチドの存在を示す電流の同定を可能にする。
本方法は、典型的には、緩衝液の存在下で実施される。上記の例示的な装置において、緩衝液は、チャンバ内の水溶液中に存在する。本発明の方法において、任意の緩衝液を使用することができる。典型的には、緩衝液は、リン酸緩衝液である。他の好適な緩衝液は、ＨＥＰＥＳ及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液である。本方法は、典型的には、４．０〜１２．０、４．５〜１０．０、５．０〜９．０、５．５〜８．８、６．０〜８．７、または７．０〜８．８、または７．５〜８．５のｐＨで実施される。使用されるｐＨは、好ましくは、約７．５である。
本方法は、０℃〜１００℃、１５℃〜９５℃、１６℃〜９０℃、１７℃〜８５℃、１８℃〜８０℃、１９℃〜７０℃、または２０℃〜６０℃で実施され得る。本方法は、典型的には、室温で実施される。本方法は、任意に、酵素機能を支持する温度、例えば約３７℃で実施される。
ポリヌクレオチド結合タンパク質
鎖特徴付け方法は、好ましくは、タンパク質が、ポアに対する、例えばそれを通るポリヌクレオチドの移動を制御するように、ポリヌクレオチドをポリヌクレオチド結合タンパク質と接触させることを含む。
より好ましくは、本方法は、（ａ）タンパク質が、ポアに対する、例えばそれを通るポリヌクレオチドの移動を制御するように、ポリヌクレオチドを本発明のポアと接触させることと、（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに対して移動する間に１つ以上の測定値を取ることであって、測定値はポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を示す、取ることによって、標的ポリヌクレオチドを特徴付けることと、を含む。
より好ましくは、本方法は、（ａ）タンパク質が、ポアに対する、例えばそれを通るポリヌクレオチドの移動を制御するように、ポリヌクレオチドを本発明のポアと接触させることと、（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに対して移動する間にポアを通る電流を測定することであって、電流はポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を示す、測定することによって、標的ポリヌクレオチドを特徴付けることと、を含む。
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、ポリヌクレオチドに結合し、かつポアを通るその移動を制御することができる任意のタンパク質であり得る。タンパク質がポリヌクレオチドに結合するか否かを判定することは、当該技術分野において簡単である。タンパク質は、典型的には、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの特性と相互作用するか、またはそれを修飾する。タンパク質は、それを開裂して個々のヌクレオチドまたはヌクレオチドのより短い鎖、例えばジヌクレオチドまたはトリヌクレオチドを形成することによってポリヌクレオチドを修飾し得る。タンパク質は、特定の位置にそれを配向するか、またはそれを移動させる、すなわちその移動を制御することによってポリヌクレオチドを修飾し得る。
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、好ましくは、ポリヌクレオチドハンドリング酵素（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｈａｎｄｌｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）に由来する。ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの特性と相互作用しかつそれを修飾することができるポリペプチドである。酵素は、それを開裂して個々のヌクレオチドまたはヌクレオチドのより短い鎖、例えばジヌクレオチドまたはトリヌクレオチドを形成することによってポリヌクレオチドを修飾し得る。酵素は、特定の位置にそれを配向するか、またはそれを移動させることによってポリヌクレオチドを修飾し得る。ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、それが、ポリヌクレオチドに結合し、かつポアを通るその移動を制御することができる限り、酵素活性を提示する必要がない。例えば、酵素は、その酵素活性を除去するように修飾されてもよく、または酵素として作用することを防ぐ条件下で使用されてもよい。かかる条件は、以下により詳細に論じられる。
ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、好ましくは、核酸分解酵素に由来する。酵素の構造体に使用されるポリヌクレオチドハンドリング酵素は、より好ましくは、酵素分類（ＥＣ）群３．１．１１、３．１．１３、３．１．１４、３．１．１５、３．１．１６、３．１．２１、３．１．２２、３．１．２５、３．１．２６、３．１．２７、３．１．３０、及び３．１．３１のうちのいずれかのメンバーに由来する。酵素は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に開示されるもののいずれかであり得る。
好ましい酵素は、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、及びトポイソメラーゼ、例えばジャイレースである。好適な酵素には、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のエキソヌクレアーゼＩ（配列番号１１）、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素（配列番号１３）、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＲｅｃＪ（配列番号１５）、及びバクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼ（配列番号１７）、ＴａｔＤエキソヌクレアーゼ、及びそれらのバリアントが含まれるが、これらに限定されない。配列番号１５に示される配列またはそのバリアントを含む３つのサブユニットは相互作用して、トリマーエキソヌクレアーゼを形成する。これらのエキソヌクレアーゼはまた、本発明のエキソヌクレアーゼ方法にも使用することができる。ポリメラーゼは、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ（登録商標）３１７３ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている）、ＳＤポリメラーゼ（Ｂｉｏｒｏｎ（登録商標）から市販されている）、またはそれらのバリアントであり得る。酵素は、好ましくは、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号９）またはそのバリアントであり得る。トポイソメラーゼは、好ましくは、部分分類（ＥＣ）群５．９９．１．２及び５．９９．１．３のうちのいずれかのメンバーである。
酵素は、最も好ましくは、ヘリカーゼ、例えばＨｅｌ３０８ Ｍｂｕ（配列番号１８）、Ｈｅｌ３０８ Ｃｓｙ（配列番号１９）、Ｈｅｌ３０８ Ｔｇａ（配列番号２０）、Ｈｅｌ３０８ Ｍｈｕ（配列番号２１）、ＴｒａＩ Ｅｃｏ（配列番号２２）、ＸＰＤ Ｍｂｕ（配列番号２３）、またはそれらのバリアントに由来する。本発明において、任意のヘリカーゼを使用することができる。ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、例えばＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒｗＣヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼ、またはＤｄａヘリカーゼであり得るか、またはそれらに由来する。ヘリカーゼは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２５７９号（ＷＯ２０１３／０５７４９５として公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１３／０９８５６２として公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７３号（ＷＯ２０１３０９８５６１として公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２５号（ＷＯ２０１４／０１３２６０として公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号（ＷＯ２０１４／０１３２５９として公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２８号（ＷＯ２０１４／０１３２６２として公開）、及び同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３６号に開示されるヘリカーゼ、修飾ヘリカーゼ、またはヘリカーゼ構造体のいずれかであり得る。
ヘリカーゼは、好ましくは、配列番号２５に示される配列（Ｔｒｗｃ Ｃｂａ）もしくはそのバリアント、配列番号１８に示される配列（Ｈｅｌ３０８ Ｍｂｕ）もしくはそのバリアント、または配列番号２４に示される配列（Ｄｄａ）もしくはそのバリアントを含む。バリアントは、膜貫通ポアについて以下に論じられる任意の方法で天然配列とは異なり得る。好ましい配列番号２４のバリアントは、（ａ）Ｅ９４Ｃ及びＡ３６０Ｃ、または（ｂ）Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０Ｃ、Ｃ１０９Ａ、及びＣ１３６Ａ、ならびに任意に（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２（すなわち、Ｍ１の欠失、及びその後Ｇ１及びＧ２の付加）を含む。
本発明に従い、任意の数のヘリカーゼを使用することができる。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のヘリカーゼが使用され得る。いくつかの実施形態では、異なる数のヘリカーゼが使用され得る。
本発明の方法は、好ましくは、ポリヌクレオチドを２つ以上のヘリカーゼと接触させることを含む。２つ以上のヘリカーゼは、典型的には、同じヘリカーゼである。２つ以上のヘリカーゼは、異なるヘリカーゼであってもよい。
２つ以上のヘリカーゼは、上述のヘリカーゼの任意の組み合わせであり得る。２つ以上のヘリカーゼは、２つ以上のＤｄａヘリカーゼであり得る。２つ以上のヘリカーゼは、１つ以上のＤｄａヘリカーゼ及び１つ以上のＴｒｗＣヘリカーゼであり得る。２つ以上のヘリカーゼは、同じヘリカーゼの異なるバリアントであり得る。
２つ以上のヘリカーゼは、好ましくは、互いに結合している。２つ以上のヘリカーゼは、より好ましくは、互いに共有結合している。ヘリカーゼは、任意の順序で、かつ任意の方法を使用して結合し得る。本発明における使用のための好ましいヘリカーゼ構造体は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２５号（ＷＯ２０１４／０１３２６０として公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号（ＷＯ２０１４／０１３２５９として公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２８号（ＷＯ２０１４／０１３２６２として公開）、及び同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３６号に記載されている。
配列番号９、１１、１３、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のバリアントは、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のものとは異なるアミノ酸配列を有し、かつポリヌクレオチド結合能力を保持する酵素である。これは、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して測定することができる。例えば、バリアントは、ポリヌクレオチドと接触させることができ、ポリヌクレオチドに結合し、かつそれに沿って移動するその能力を測定することができる。バリアントは、高い塩濃度及び／または室温において、ポリヌクレオチドの結合を促進し、かつ／またはその活性を促進する修飾を含んでもよい。バリアントは、それらがポリヌクレオチドに結合する（すなわち、ポリヌクレオチド結合能力を保持する）がヘリカーゼとして機能しない（すなわち、移動を促進するために必要な全ての構成要素、例えば、ＡＴＰ及びＭｇ２＋を提供されたときに、ポリペプチドに沿って移動しない）ように修飾され得る。かかる修飾は、当該技術分野で既知である。例えば、ヘリカーゼにおけるＭｇ２＋結合ドメインの修飾は、典型的には、ヘリカーゼとして機能しないバリアントをもたらす。これらの種類のバリアントは、分子ブレーキとして作用し得る（下記を参照されたい）。
配列番号９、１１、１３、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のアミノ酸配列の全長にわたって、バリアントは、好ましくは、アミノ酸同一性に基づき、その配列に対して少なくとも５０％の相同性を有することになる。より好ましくは、バリアントポリペプチドは、配列全体にわたって、アミノ酸同一性に基づき、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％、または９９％の相同性を有し得る。２００個以上、例えば２３０個、２５０個、２７０個、２８０個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、または１０００個以上の連続したアミノ酸のストレッチにわたって、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、または９５％のアミノ酸同一性があってもよい（「ハードホモロジー」）。相同性は、上記のように判定される。バリアントは、上記の配列番号２に関して上記の方法のいずれかにおいて野生型配列とは異なる。酵素は、ポアと共有結合していてもよい。任意の方法を使用して、酵素をポアと共有結合させることができる。
好ましい分子ブレーキは、ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ５９４Ａ（変異Ｑ５９４Ａを含む配列番号２５）である。このバリアントは、ヘリカーゼとして機能しない（すなわち、ポリヌクレオチドに結合するが、移動を促進するために必要な全ての構成要素、例えば、ＡＴＰ及びＭｇ２＋を提供されたときに、それらに沿って移動しない）。
鎖シークエンシングにおいて、ポリヌクレオチドは、印加された電位と共にまたはそれに対して、ポアを通して転移される。二本鎖ポリヌクレオチド上で進行的または前進的に作用するエキソヌクレアーゼをポアのシス側に使用して、印加された電位化で、または逆電位下のトランス側で、残りの一本鎖を貫通接続することができる。同様に、二本鎖ＤＮＡを解くヘリカーゼも、類似の方法で使用することができる。ポリメラーゼも使用することができる。印加された電位に対する鎖転移を必要とするシークエンシングアプリケーションの可能性もあるが、ＤＮＡはまず、逆電位下または電位のない状態下で酵素によって「捕まら」なければならない。その後、結合に続いて電位が戻されると、鎖は、ポアをシスからトランスへと通り、電流によって拡張された立体構造で保持されることになる。一本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼまたは一本鎖ＤＮＡ依存性ポリメラーゼは分子モーターとして作用して、印加された電位に対して、新たに転移された一本鎖を、制御された様式でポアを通してトランスからシスへと引き戻すことができる。
本方法において、任意のヘリカーゼを使用することができる。ヘリカーゼは、ポアに対して２つのモードで働き得る。第１に、本方法は、好ましくは、それが、印加された電位から生じる電界と共にポアを通してポリヌクレオチドを移動させるように、ヘリカーゼを使用して実施される。このモードにおいて、ポリヌクレオチドの５’末端がまずポア内に捕捉され、ヘリカーゼは、それが最終的に膜のトランス側を通って転移するまで、それが電界と共にポアに通されるように、ポリヌクレオチドをポア内へと移動させる。代替的には、本方法は、好ましくは、ヘリカーゼが、印加された電位から生じる電界に対して、ポアを通ってポリヌクレオチドを移動させるように実施される。このモードにおいて、ポリヌクレオチドの３’末端がまずポア内に捕捉され、ヘリカーゼは、それが、最終的に膜のシス側に戻って排出されるまで、印加された電界に対してポアの外に引き出されるように、ポアを通ってポリヌクレオチドを移動させる。
本方法はまた、逆方向で実施されてもよい。ポリヌクレオチドの３’末端がまずポア内に捕捉され得、ヘリカーゼは、それが最終的に膜のトランス側を通って転移するまで、それが電界と共にポアに通されるように、ポリヌクレオチドをポア内へと移動させ得る。
ヘリカーゼが、移動を促進するために必要な構成要素を含まないか、またはその移動を妨げるかもしくは防ぐように修飾されている場合、それはポリヌクレオチドに結合し、印加された電界によってポア内に引き込まれたときにポリヌクレオチドの移動を遅らせるブレーキとして作用する。不活性モードにおいて、ポリヌクレオチドが３’または５’を下にして捕捉されているかにかかわらず、トランス側に向かってポア内にポリヌクレオチドを引くのは、印加された電界であり、酵素ががブレーキとして作用する。不活性モードにあるとき、ヘリカーゼによるポリヌクレオチドの移動の制御は、ラチェッティング、スライディング、及びグレーキングを含むいくつかの方法で説明することができる。ヘリカーゼ活性を欠くヘリカーゼバリアントも、この方法において使用することができる。
ポリヌクレオチドは、任意の順序でポリヌクレオチド結合タンパク質及びポアと接触させることができる。ポリヌクレオチドが、ヘリカーゼなどのポリヌクレオチド結合タンパク質及びポアと接触される場合、ポリヌクレオチドはまず、タンパク質と複合体を形成することが好ましい。ポアにわたって電圧が印加されると、ポリヌクレオチド／タンパク質複合体は次いで、ポアと複合体を形成し、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御する。
ポリヌクレオチド結合タンパク質を使用する方法における任意のステップは、典型的には、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似体、及びポリヌクレオチド結合タンパク質の作用を促進する酵素補因子の存在下で実施される。遊離ヌクレオチドは、上記の個々のヌクレオチドのうちの１つ以上であり得る。遊離ヌクレオチドには、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）、及びデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）が含まれるが、これらに限定されない。遊離ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、またはｄＣＭＰから選択される。遊離ヌクレオチドは、好ましくは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。酵素補因子は、構造体が機能することを可能にする因子である。酵素補因子は、好ましくは、二価金属カチオンである。二価金属カチオンは、好ましくは、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、またはＣｏ２＋である。酵素補因子は、最も好ましくは、Ｍｇ２＋である。
ヘリカーゼ（複数可）及び分子ブレーキ（複数可）
好ましい実施形態では、本方法は、
（ａ）ポリヌクレオチドに結合した１つ以上のヘリカーゼ及び１つ以上の分子ブレーキを有するポリヌクレオチドを提供することと、
（ｂ）１つ以上のヘリカーゼ及び１つ以上の分子ブレーキが共に集められ、その両方が、ポアに対する、例えばそれを通るポリヌクレオチドの移動を制御するように、ポリヌクレオチドを本発明のポアと接触させ、ポアにわたって電位を印加することと、
（ｃ）ポリヌクレオチドがポアに対して移動する間に、１つ以上の測定値を取ることであって、測定値がポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を示す、取ることによって、ポリヌクレオチドを特徴付けることと、を含む。
この種類の方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３７号に詳細に論じられている。
１つ以上のヘリカーゼは、上記のもののいずれかであり得る。１つ以上の分子ブレーキは、ポリヌクレオチドに結合し、かつポアを通るポリヌクレオチドの移動を遅らせる任意の化合物または分子であり得る。１つ以上の分子ブレーキは、好ましくは、ポリヌクレオチドに結合する１つ以上の化合物を含む。１つ以上の化合物は、好ましくは、１つ以上の大環状分子である。好適な大環状分子には、シクロデキストリン、カリックスアレーン、環状ペプチド、クラウンエーテル、ククルビツリル、ピララレン（ｐｉｌｌａｒａｒｅｎｅ）、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。シクロデキストリンまたはその誘導体は、Ｅｌｉｓｅｅｖ，Ａ．Ｖ．，ａｎｄ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｈ−Ｊ．（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６，６０８１−６０８８に開示されるもののいずれかであり得る。薬剤は、より好ましくは、ヘプタキス−６−アミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ７−βＣＤ）、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ１−βＣＤ）、またはヘプタキス−（６−デオキシ−６−グアニジノ）−シクロデキストリン（ｇｕ７−βＣＤ）である。
１つ以上の分子ブレーキは、好ましくは、１つ以上の一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）である。１つ以上の分子ブレーキは、より好ましくは、実効負電荷を有しないカルボキシ末端（Ｃ末端）領域を含む一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）、または（ｉｉ）そのＣ末端領域に、Ｃ末端領域の実効負電荷を減少させる１つ以上の修飾を含む修飾ＳＳＢである。１つ以上の分子ブレーキは、最も好ましくは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号（ＷＯ２０１４／０１３２５９として公開）に開示されるＳＳＢのうちの１つである。
１つ以上の分子ブレーキは、好ましくは、１つ以上のポリヌクレオチド結合タンパク質である。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、ポリヌクレオチドに結合し、かつポアを通るその移動を制御することができる任意のタンパク質であり得る。タンパク質がポリヌクレオチドに結合するか否かを判定することは、当該技術分野において簡単である。タンパク質は、典型的には、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの特性と相互作用するか、またはそれを修飾する。タンパク質は、それを開裂して個々のヌクレオチドまたはヌクレオチドのより短い鎖、例えばジヌクレオチドまたはトリヌクレオチドを形成することによってポリヌクレオチドを修飾し得る。部分は、特定の位置にそれを配向するか、またはそれを移動させる、すなわちその移動を制御することによってポリヌクレオチドを修飾し得る。
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、好ましくは、ポリヌクレオチドハンドリング酵素に由来する。１つ以上の分子ブレーキは、上記のポリヌクレオチドハンドリング酵素のいずれかに由来し得る。分子ブレーキとして作用するＰｈｉ２９ポリメラーゼ（配列番号８）の修飾バージョンは、米国特許第５，５７６，２０４号に開示されている。１つ以上の分子ブレーキは、好ましくは、ヘリカーゼに由来する。
ヘリカーゼに由来する任意の数の分子ブレーキが使用され得る。例えば、分子ブレーキとして、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上のヘリカーゼが使用され得る。２つ以上のヘリカーゼが分子ブレーキとして使用される場合、２つ以上のヘリカーゼは、典型的には、同じヘリカーゼである。２つ以上のヘリカーゼは、異なるヘリカーゼであってもよい。
２つ以上のヘリカーゼは、上述のヘリカーゼの任意の組み合わせであり得る。２つ以上のヘリカーゼは、２つ以上のＤｄａヘリカーゼであり得る。２つ以上のヘリカーゼは、１つ以上のＤｄａヘリカーゼ及び１つ以上のＴｒｗＣヘリカーゼであり得る。２つ以上のヘリカーゼは、同じヘリカーゼの異なるバリアントであり得る。
２つ以上のヘリカーゼは、好ましくは、互いに結合している。２つ以上のヘリカーゼは、より好ましくは、互いに共有結合している。ヘリカーゼは、任意の順序で、かつ任意の方法を使用して結合し得る。ヘリカーゼに由来する１つ以上の分子ブレーキは、好ましくは、少なくとも１つの立体構造状態においてポリペプチドがヘリカーゼから解かれることができる、ポリヌクレオチド結合ドメイン内の開口部の大きさを低減するように修飾される。これは、ＷＯ２０１４／０１３２６０に開示されている。
本発明における使用のための好ましいヘリカーゼ構造体は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２５号（ＷＯ２０１４／０１３２６０として公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号（ＷＯ２０１４／０１３２５９として公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２８号（ＷＯ２０１４／０１３２６２として公開）、及び同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３６号に記載されている。
１つ以上のヘリカーゼが活性モードで使用される場合（すなわち、１つ以上のヘリカーゼが、移動を促進するために必要な全ての構成要素、例えば、ＡＴＰ及びＭｇ２＋を提供されているとき）、１つ以上の分子ブレーキは、好ましくは、（ａ）不活性モードで使用される（すなわち、移動を促進するために必要な構成要素の不在下で使用されるか、もしくは活性移動が不可能である）か、（ｂ）１つ以上の分子ブレーキが１つ以上のヘリカーゼに対して反対方向に移動する、活性モードで使用されるか、または（ｃ）１つ以上の分子ブレーキが１つ以上のヘリカーゼと同じ方向に、かつ１つ以上のヘリカーゼよりも遅く移動する、活性モードで使用される。
１つ以上のヘリカーゼが不活性モードで使用される場合（すなわち、１つ以上のヘリカーゼが、移動を促進するために必要な全ての構成要素、例えば、ＡＴＰ及びＭｇ２＋を提供されていないか、または活性移動が不可能であるとき）、１つ以上の分子ブレーキは、好ましくは、（ａ）不活性モードで使用される（すなわち、移動を促進するために必要な構成要素の不在下で使用されるか、もしくは活性移動が不可能である）か、または（ｂ）１つ以上の分子ブレーキが、ポリヌクレオチドと同じ方向にポリヌクレオチドに沿ってポアを通って移動する、活性モードで使用される。
１つ以上のヘリカーゼ及び１つ以上の分子ブレーキは、それらが共に集められ、その両方が、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するように、任意の位置でポリヌクレオチドに結合し得る。１つ以上のヘリカーゼ及び１つ以上の分子ブレーキは、少なくとも１ヌクレオチド離れており、例えば、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１０，０００、少なくとも５０，０００ヌクレオチド、またはそれ以上離れている。本方法が、一方の末端にＹアダプター、及び他方の末端にヘアピンループアダプターを提供された二本鎖ポリヌクレオチドに関する場合、１つ以上のヘリカーゼは、好ましくは、Ｙアダプターに結合し、１つ以上の分子ブレーキは、好ましくは、ヘアピンループアダプターに結合する。この実施形態では、１つ以上の分子ブレーキは、好ましくは、それらがポリヌクレオチドに結合するがヘリカーゼとして機能しないように修飾された、１つ以上のヘリカーゼである。Ｙアダプターに結合した１つ以上のヘリカーゼは、好ましくは、以下により詳細に論じられるように、スペーサにおいて停止される。ヘアピンループアダプターに結合した１つ以上の分子ブレーキは、好ましくは、スペーサにおいて停止されない。１つ以上のヘリカーゼ及び１つ以上の分子ブレーキは、好ましくは、１つ以上のヘリカーゼがヘアピンループに達したときに共に集められる。１つ以上のヘリカーゼは、Ｙアダプターがポリヌクレオチドに結合する前、またはＹアダプターがポリヌクレオチドに結合した後に、Ｙアダプターに結合し得る。１つ以上の分子ブレーキは、ヘアピンループアダプターがポリヌクレオチドに結合する前、またはヘアピンループアダプターがポリヌクレオチドに結合した後に、ヘアピンループアダプターに結合し得る。
１つ以上のヘリカーゼ及び１つ以上の分子ブレーキは、好ましくは、互いに結合していない。１つ以上のヘリカーゼ及び１つ以上の分子ブレーキは、より好ましくは、互いに共有結合していない。１つ以上のヘリカーゼ及び１つ以上の分子ブレーキは、好ましくは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２５号（ＷＯ２０１４／０１３２６０として公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４（ＷＯ２０１４／０１３２５９として公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２８号（ＷＯ２０１４／０１３２６２として公開）、及び同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３６号に記載されるように、結合していない。
スペーサ
１つ以上のヘリカーゼは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５０１７５号において論じられるように、１つ以上のスペーサにおいて停止され得る。この国際出願に開示される１つ以上のヘリカーゼ及び１つ以上のスペーサの任意の構成が本発明に使用され得る。
ポリヌクレオチドの一部がポアに進入し、印加された電位から生じる電界に沿ってポアを通って移動すると、１つ以上のヘリカーゼは、ポリヌクレオチドがポアを通って移動する間に、ポアによりスペーサを通り過ぎて移動される。これは、ポリヌクレオチド（１つ以上のスペーサを含む）がポアを通って移動し、１つ以上のヘリカーゼがポアの上部に残るためである。
１つ以上のスペーサは、好ましくは、ポリヌクレオチドの一部であり、例えば、それらはポリヌクレオチド配列に割り込む。１つ以上のスペーサは、好ましくは、ポリヌクレオチドにハイブリダイズされたスピードバンプなどの１つ以上の封鎖分子の一部ではない。
任意の数のスペーサ、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上のスペーサがポリヌクレオチド中にあってもよい。好ましくは、２、４、または６つのスペーサがポリヌクレオチド中にある。１つ以上のスペーサがポリヌクレオチドの異なる領域中にあってもよく、例えば、Ｙアダプター及び／またはヘアピンループアダプター中に１つ以上のスペーサがあってもよい。
１つ以上のスペーサは各々、１つ以上のヘリカーゼが活性モードにおいても越えることができないエネルギー障壁を提供する。１つ以上のスペーサは、ヘリカーゼの牽引を低減することによって（例えば、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドから塩基を除去することによって）、または１つ以上のヘリカーゼの移動を物理的に封鎖することによって（例えば、嵩高い化学基を使用して）、１つ以上のヘリカーゼを停止させ得る。
１つ以上のスペーサは、１つ以上のヘリカーゼを停止させる任意の分子または分子の組み合わせを含み得る。１つ以上のスペーサは、１つ以上のヘリカーゼがポリヌクレオチドに沿って移動することを防ぐ任意の分子または分子の組み合わせを含み得る。膜貫通ポア及び印加された電位の不在下で、１つ以上のヘリカーゼが１つ以上のスペーサにおいて停止されたか否かを判定することは簡単である。例えば、スペーサを通り過ぎて移動し、かつＤＮＡの相補鎖に取って代わるヘリカーゼの能力は、ＰＡＧＥによって測定することができる。
１つ以上のスペーサは、典型的には、ポリマーなどの線状分子を含む。１つ以上のスペーサは、典型的には、ポリヌクレオチドとは異なる構造を有する。例えば、ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、１つ以上のスペーサは、典型的には、ＤＮＡではない。とりわけ、ポリヌクレオチドがデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である場合、１つ以上のスペーサは、好ましくは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはヌクレオチド側鎖を有する合成ポリマーを含む。１つ以上のスペーサは、ポリヌクレオチドと反対方向に、１つ以上のヌクレオチドを含み得る。例えば、ポリヌクレオチドが５’から３’方向にある場合、１つ以上のスペーサは、１つ以上のヌクレオチドを３’から５’方向に含み得る。ヌクレオチドは、上記のもののいずれかであり得る。
１つ以上のスペーサは、好ましくは、１つ以上のニトロインドール、例えば１つ以上の５−ニトロインドール、１つ以上のイノシン、１つ以上のアクリジン、１つ以上の２−アミノプリン、１つ以上の２−６−ジアミノプリン、１つ以上の５−ブロモ−デオキシウリジン、１つ以上の逆位チミジン（逆位ｄＴ）、１つ以上の逆位ジデオキシ−チミジン（ｄｄＴ）、１つ以上のジデオキシ−シチジン（ｄｄＣ）、１つ以上の５−メチルシチジン、１つ以上の５−ヒドロキシメチルシチジン、１つ以上の２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、１つ以上のイソ−デオキシシチジン（Ｉｓｏ−ｄＣ）、１つ以上のイソ−デオキシグアノシン（Ｉｓｏ−ｄＧ）、１つ以上のｉＳｐＣ３基（すなわち、糖及び塩基を欠くヌクレオチド）、１つ以上の光開裂可能な（ＰＣ）基、１つ以上のヘキサンジオール基、１つ以上のスペーサ９（ｉＳｐ９）基、１つ以上のスペーサ１８（ｉＳｐ１８）基、ポリマー、または１つ以上のチオール接続を含む。１つ以上のスペーサは、これらの基の任意の組み合わせを含み得る。これらの基の多くは、ＩＤＴ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））から市販されている。
１つ以上のスペーサは、任意の数のこれらの基を含有し得る。例えば、２−アミノプリン、２−６−ジアミノプリン、５−ブロモ−デオキシウリジン、逆位ｄＴ、ｄｄＴ、ｄｄＣ、５−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、Ｉｓｏ−ｄＣｓ、Ｉｓｏ−ｄＧ、ｉＳｐＣ３基、ＰＣ基、ヘキサンジオール基、及びチオール接続の場合、１つ以上のスペーサは、好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、またはそれ以上を含む。１つ以上のスペーサは、好ましくは、２、３、４、５、６、７、８個、またはそれ以上のｉＳｐ９基を含む。１つ以上のスペーサは、好ましくは、２、３、４、５、または６個以上のｉＳｐ１８基を含む。最も好ましいスペーサは、４個のｉＳｐ１８基である。
ポリマーは、好ましくは、ポリペプチドまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ポリペプチドは、好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、またはそれ以上のアミノ酸を含む。ＰＥＧは、好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、またはそれ以上のモノマー単位を含む。
１つ以上のスペーサは、好ましくは、１個以上の脱塩基ヌクレオチド（すなわち、核酸塩基を欠くヌクレオチド）、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、またはそれ以上の脱塩基ヌクレオチドを含む。核酸塩基は、脱塩基ヌクレオチドにおいて−Ｈ（ｉｄＳｐ）または−ＯＨによって置き換えられ得る。脱塩基スペーサは、１つ以上の隣接するヌクレオチドから核酸塩基を除去することによって、ポリヌクレオチド中に挿入され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、３−メチルアデニン、７−メチルグアニン、１，Ｎ６−エテノアデニンイノシン、またはヒポキサンチンを含むように修飾され得、核酸塩基は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）を使用してこれらのヌクレオチドから除去され得る。代替的には、ポリヌクレオチドは、ウラシルを含むように修飾され得、核酸塩基は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）によって除去され得る。一実施形態では、１つ以上のスペーサは、脱塩基ヌクレオチドを一切含まない。
１つ以上のヘリカーゼは、各線状分子によって（すなわちその前に）、またはその上で停止され得る。線状分子スペーサが使用される場合、ポリヌクレオチドは、好ましくは、それを通りすぎて１つ以上のヘリカーゼが移動される各スペーサの末端に隣接するポリヌクレオチドの二本鎖領域を提供される。二本鎖領域は、典型的には、隣接するスペーサ上で１つ以上のヘリカーゼを停止させることを補助する。二本鎖領域（複数可）の存在は、本方法が約１００ｍＭ以下の塩濃度で実施される場合に特に好ましい。各二本鎖領域は、典型的には、少なくとも１０、例えば少なくとも１２ヌクレオチド長である。本発明において使用されるポリヌクレオチドが一本鎖である場合、より短いポリヌクレオチドを、スペーサに隣接する領域にハイブリダイズすることによって、二本鎖領域が形成され得る。より短いポリヌクレオチドは、典型的には、ポリヌクレオチドと同じヌクレオチドから形成されるが、異なるヌクレオチドから形成されてもよい。例えば、より短いポリヌクレオチドは、ＬＮＡから形成され得る。
線状分子スペーサが使用される場合、ポリヌクレオチドは、好ましくは、それを通りすぎて１つ以上のヘリカーゼが移動される各スペーサの末端における封鎖分子を提供される。これは、１つ以上のヘリカーゼが各スペーサ上で停止されたままであることを保証することを補助し得る。また、それ／それらが溶液中に核酸する場合に、１つ以上のヘリカーゼをポリヌクレオチド上に保持することも補助し得る。封鎖分子は、１つ以上のヘリカーゼを物理的に停止させる下記の化学基のいずれかであり得る。封鎖分子は、ポリヌクレオチドの二本鎖領域であり得る。
１つ以上のスペーサは、好ましくは、１つ以上のヘリカーゼを物理的に停止させる１つ以上の化学基を含む。１つ以上の化学基は、好ましくは、１つ以上のペンダント化学基である。１つ以上の化学基は、ポリヌクレオチド中の１つ以上の核酸塩基に結合し得る。１つ以上の化学基は、ポリヌクレオチド骨格に結合し得る。任意の数のこれらの化学基、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、またはそれ以上が存在し得る。好適な基には、フルオロフォア、ストレプトアビジン及び／またはビオチン、コレステロール、メチレンブルー、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ジゴキシゲニン及び／または抗ジゴキシゲニン、ならびにジベンジルシクロオクチン基が含まれるが、これらに限定されない。
ポリヌクレオチド中の異なるスペーサは、異なる停止分子（ｓｔａｌｌｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を含み得る。例えば、１つのスペーサは、上記の線状分子のうちの１つを含み得、別のスペーサは、１つ以上のヘリカーゼを物理的に停止させる１つ以上の化学基を含み得る。スペーサは、上記の線状分子のいずれか、及び１つ以上のヘリカーゼを物理的に停止させる１つ以上の化学基、例えば１つ以上の脱塩基及びフルオロフォアを含み得る。
好適なスペーサは、ポリヌクレオチドの種類及び本発明の方法が実施される条件に応じて設計され得る。ほとんどのヘリカーゼは、ＤＮＡに結合し、それに沿って移動するため、ＤＮＡではない任意のものを使用して停止され得る。好適な分子は、上に論じられる。
本発明の方法は、好ましくは、遊離ヌクレオチドの存在下及び／またはヘリカーゼ補因子の存在下で実施される。これは、以下により詳細に論じられる。膜貫通ポア及び印加された電位の不在下で、１つ以上のスペーサは、好ましくは、遊離ヌクレオチドの存在下及び／またはヘリカーゼ補因子の存在下で、１つ以上のヘリカーゼを停止させることができる。
本発明の方法が、下記のように（１つ以上のヘリカーゼが活性モードであるように）遊離ヌクレオチド及びヘリカーゼ補因子の存在下で実施される場合、それらが膜貫通ポアと接触され電位が印加される前に１つ以上のヘリカーゼがポリヌクレオチド上で停止されていることを保証するために、１つ以上のより長いスペーサが典型的に使用される。１つ以上のより短いスペーサは、（１つ以上のヘリカーゼが不活性モードであるように）遊離ヌクレオチド及びヘリカーゼ補因子の不在下で使用され得る。
塩濃度もまた、１つ以上のスペーサの１つ以上のヘリカーゼを停止させる能力に影響を与える。膜貫通ポア及び印加された電位の不在下で、１つ以上のスペーサは、好ましくは、約１００ｍＭ以下の塩濃度で、１つ以上のヘリカーゼを停止させることができる。本発明の方法において使用される塩濃度が高ければ高いほど、典型的に使用される１つ以上のスペーサは短くなり、その逆も同様である。
特徴の好ましい組み合わせを、以下の表４に示す。
本方法は、スペーサを通り過ぎて２つ以上のヘリカーゼを移動させることに関する。かかる実例において、ポア及び印加された電位の不在下で後続ヘリカーゼがスペーサを通り過ぎて先行ヘリカーゼを押すことを防ぐために、スペーサ長は典型的に増加している。本方法が、１つ以上のスペーサを通り過ぎて２つ以上のヘリカーゼを移動させることに関する場合、上記のスペーサ長は、少なくとも１．５倍、例えば２倍、２．５倍、または３倍に増加し得る。例えば、本方法が、１つ以上のスペーサを通過して２つ以上のヘリカーゼを移動させることに関する場合、表４の３列目のスペーサ長は、１．５倍、２倍、２．５倍、または３倍に増加し得る。
膜
本発明のポアは、膜内に存在し得る。本発明の方法において、ポリヌクレオチドは、典型的には、膜内で本発明のポアと接触される。本発明に従い、任意の膜を使用することができる。好適な膜は、当該技術分野で周知である。膜は、好ましくは、両親媒性層である。両親媒性層は、親水及び親油特性の両方を有する、リン脂質などの両親媒性分子から形成された層である。両親媒性分子は、合成または天然であり得る。非天然型両親媒性物質及び単分子層を形成する両親媒性物質は、当該技術分野で既知であり、例えば、ブロックコポリマー（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００９，２５，１０４４７−１０４５０）が含まれる。ブロックコポリマーは、２つ以上のモノマーサブユニットが共に重合されて単一ポリマー鎖を作製する、ポリマー材料である。ブロックコポリマーは、典型的には、各モノマーサブユニットによって寄与される特性を有する。しかしながら、ブロックコポリマーは、個々のサブユニットから形成されたポリマーが保有しない固有の特性を有し得る。ブロックコポリマーは、モノマーサブユニットのうちの１つが疎水性（すなわち、親油性）である一方、他のサブユニット（複数可）が水性媒体中で親水性であるように操作することができる。この場合、ブロックコポリマーは、両親媒性特性を保有し得、生体膜を模倣する構造を形成し得る。ブロックコポリマーは、ジブロック（２つのモノマーサブユニットからなる）であり得るが、３つ以上のモノマーサブユニットから構築されて、両親媒性物質として挙動するより複雑な配置でもあり得る。コポリマーは、トリブロック、テトラブロック、またはペンタブロックコポリマーであってもよい。膜は、好ましくは、トリブロックコポリマー膜である。
古細菌二極性テトラエーテル脂質は、脂質が単分子層膜を形成するように構築される天然型脂質である。これらの脂質は、一般に、厳しい生物環境で生き残る好極限性細菌、好熱菌、好塩菌、及び好酸球において見出される。それらの安定性は、最終二分子層の融合性質から得られると考えられている。一般モチーフ親水性−疎水性−親水性を有するトリブロックポリマーを作製することによってこれらの生物学的存在を模倣するブロックコポリマーを構築することは簡単である。この材料は、脂質二分子層と同様に挙動するモノマー膜を形成し、ベシクルから層状膜に至るまで幅広い相挙動を包含し得る。これらのトリブロックコポリマーから形成された膜は、生体脂質膜に対していくつかの利点を有する。トリブロックコポリマーは合成されているため、その性格な構造を慎重に制御して、膜を形成し、ポア及び他のタンパク質と相互作用するために必要とされる正しい鎖長及び特性を提供することができる。
ブロックコポリマーはまた、脂質サブ材料として分類されないサブユニットから構築されてもよく、例えば、疎水性ポリマーは、シロキサンまたは他の非炭化水素系モノマーから作製され得る。ブロックコポリマーの親水性サブセクションはまた、低いタンパク質結合特性を保有し得、これは、生の生体試料に曝露されたときに高度に耐性である膜の作製を可能にする。このヘッドグループ単位はまた、非分類脂質ヘッド基に由来してもよい。
トリブロックコポリマー膜はまた、生体脂質膜と比較して増加した機械的及び環境的安定性、例えば、はるかに高い動作温度またはｐＨ範囲を有する。ブロックコポリマーの合成性質は、ポリマー系膜を幅広い用途のためにカスタマイズする基盤を提供する。
膜は、最も好ましくは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５２７６６号または同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５２７６７号に記載される膜のうちの１つである。
両親媒性分子は、ポリヌクレオチドへの結合を促進するように化学修飾または官能化され得る。
両親媒性層は、一分子層または二分子層であり得る。両親媒性層は、典型的には、平面である。両親媒性層は、湾曲してもよい。両親媒性層は、支持されてもよい。
両親媒性膜は、典型的には、天然に移動性であり、約１０−８ｃｍ ｓ−１の脂質拡散速度を有する２次元流体として本質的に作用する。これは、ポア及び結合したポリヌクレオチドが、典型的には、両親媒性膜内で移動することができることを意味する。
膜は、脂質二分子層膜であり得る。脂質二分子層は、細胞膜のモデルであり、幅広い実験研究のための優秀な基盤として働く。例えば、脂質二分子層は、シングルチャネルレコーディングによる膜タンパク質のインビトロ調査のために使用することができる。代替的には、脂質二分子層は、幅広い物質の存在を検出するためのバイオセンサとして使用することができる。脂質に二分子層は、任意の脂質二分子層であり得る。好適な脂質二分子層には、平面脂質二分子層、支持二分子層、またはリポソームが含まれるが、これらに限定されない。脂質二分子層は、好ましくは、平面脂質二分子層である。好適な脂質二分子層は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６３号（ＷＯ２００８／１０２１２１として公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）、及び国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に開示されている。
脂質二分子層を形成するための方法は、当該技術分野で既知である。脂質二分子層は、Ｍｏｎｔａｌ ａｎｄ Ｍｕｅｌｌｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９７２；６９：３５６１−３５６６）の方法によって一般に形成され、この方法において、脂質一分子層は、水溶液／空気界面上で、その界面に対して直角な孔の両側を通り過ぎて担持される。脂質は、通常、最初にそれを有機溶媒中に溶解し、次いで少量の溶媒を孔の両側で水溶液の界面上で蒸発させることによって、電解質水溶液の界面に添加される。いったん有機溶媒が蒸発すると、孔の両側の溶液／空気界面は、二分子層が形成されるまで、孔を通り過ぎて物理的に上下に動かされる。平面脂質二分子層は、膜内の孔にわたって、または陥凹部内への開口部にわたって形成され得る。
Ｍｏｎｔａｌ＆Ｍｕｅｌｌｅｒの方法は、費用効果があり、かつタンパク質ポア挿入のために好適である高品質の脂質二分子層を形成する比較的簡単な形成方法であるため、普及している。二分子層形成の他の一般的な方法には、先端浸漬（ｔｉｐ−ｄｉｐｐｉｎｇ）、二分子層の塗装（ｐａｉｎｔｉｎｇ ｂｉｌａｙｅｒｓ）、及びリポソーム二分子層のパッチクランプが含まれる。
先端浸漬二分子層形成は、孔表面（例えば、ピペット先端）を、脂質の一分子層を担持する試験溶液の界面上に接触させることを伴う。ここでまた、脂質一分子層は、有機溶媒中に溶解した少量の脂質を溶液界面において蒸発させることによって、溶液／空気界面において最初に生成される。次いで、二分子層は、Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｓｃｈａｅｆｅｒプロセスによって形成され、孔を溶液界面に対して移動させるために機械的自動化を必要とする。
二分子層の塗装について、有機溶媒中に溶解した少量の脂質が孔に直接塗布され、これが、試験水溶液中に沈められる。脂質溶液は、塗装用刷毛などを使用して孔にわたって薄く広げられる。溶媒を薄くすることは、脂質二分子層の形成をもたらす。しかしながら、二分子層からの溶媒の完全な除去は困難であり、したがって、この方法によって形成された二分子層は安定性が低く、電気化学的測定中にノイズを生じやすい。
パッチクランプは、生体細胞膜の研究において一般的に使用される。細胞膜は吸引によりピペットの端部に留められ、孔にわたって膜のパッチが付着する。この方法は、リポソームを留め、それが次いで破裂してピペットの孔にわたる脂質二分子層シールを残すことにより、脂質二分子層を生成するために適合されてきた。この方法は、安定した、巨大かつ単層のリポソームと、ガラス表面を有する材料における微小孔を作ることとを必要とする。
リポソームは、超音波処理、押出、またはＭｏｚａｆａｒｉ法によって形成することができる（Ｃｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｉｃｒｏｎ ３８：８４１−８４７）。
好ましい実施形態では、脂質二分子層は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）に記載されるように形成される。有利には、本方法において、脂質二分子層は、乾燥脂質から形成される。最も好ましい実施形態では、脂質二分子層は、ＷＯ２００９／０７７７３４（ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７）に記載されるように、開口部にわたって形成される。
脂質二分子層は、脂質の２つの対向する層から形成される。２つの脂質層は、それらの疎水性テール基が互いに向き合って疎水性の内部を形成するように配置される。脂質の親水性ヘッド基は、二分子層の両側で水性環境に向かって外側に向いている。二分子層は、液体不規則相（流体層状）、液体規則相、固体規則相（層状ゲル相、交互ゲル相）、及び平面二分子層結晶（層状サブゲル相、層状結晶相）を含むがこれらに限定されないいくつかの脂質相中に存在し得る。
脂質二分子層を形成する任意の脂質組成物を使用することができる。脂質組成物は、必要とする特性、例えば表面荷電、膜タンパク質を支持する能力、充填密度、または機械的特性を有する脂質二分子層が形成されるように選択される。脂質組成物は、１つ以上の異なる脂質を含んでもよい。例えば、脂質組成物は、最大で１００種の脂質を含有し得る。脂質組成物は、好ましくは、１〜１０種の脂質を含有する。脂質組成物は、天然型脂質及び／または人工脂質を含んでもよい。
脂質は、典型的には、ヘッド基、界面部分、及び同じであるかまたは異なり得る２つの疎水性テール基を含む。好適なヘッド基には、中性ヘッド基、例えばジアシルグリセリド（ＤＧ）及びセラミド（ＣＭ）；双イオン性ヘッド基、例えばホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、及びスフィンゴミエリン（ＳＭ）；負に荷電したヘッド基、例えばホスファチジルグリセロール（ＰＧ）；ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、リン酸（ＰＡ）、及びカルジオリピン（ＣＡ）；ならびに正に荷電したヘッド基、例えばトリメチルアンモニウム−プロパン（ＴＡＰ）が含まれるが、これらに限定されない。好適な界面部分には、天然型界面部分、例えばグリセロール系またはセラミド系部分が含まれるが、これらに限定されない。好適な疎水性テール基には、飽和炭化水素鎖、例えばラウリン酸（ｎ−ドデカノール酸（ｎ−Ｄｏｄｅｃａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ））、ミリスチン酸（ｎ−テトラデコノニン酸（ｎ−Ｔｅｔｒａｄｅｃｏｎｏｎｉｃ ａｃｉｄ））、パルミチン酸（ｎ−ヘキサデカン酸）、ステアリン酸（ｎ−オクタデカン酸）、及びアラキジン酸（ｎ−エイコサン酸）；不飽和炭化水素鎖、例えばオレイン酸（シス−９−オクタデカン酸）；ならびに分岐炭化水素鎖、例えばフィタノイルが含まれるが、これらに限定されない。鎖の長さ、ならびに不飽和炭化水素鎖中の二重結合の位置及び数は変化し得る。鎖の長さ、ならびに分岐炭化水素鎖中のメチル基などの分岐の位置及び数は変化し得る。疎水性テール基は、エーテルまたはエステルとして界面部分に結合し得る。脂質は、ミコール酸であり得る。
脂質はまた、化学修飾されてもよい。脂質のヘッド基またはテール基は、化学修飾され得る。そのヘッド基が化学修飾されている好適な脂質には、ＰＥＧ修飾脂質、例えば１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］；官能化ＰＥＧ脂質、例えば１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３ ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ビオチニル（ポリエチレングリコール）２０００］；ならびにコンジュゲーションのために修飾された脂質、例えば１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（スクシニル）及び１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（ビオチニル）が含まれるが、これらに限定されない。そのテール基が化学修飾されている好適な脂質には、重合性脂質、例えば１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル（ｔｒｉｃｏｓａｄｉｙｎｏｙｌ））−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；フッ化脂質、例えば１−パルミトイル−２−（１６−フルオロパルミトイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；重水素化脂質、例えば１，２−ジパルミトイル−Ｄ６２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；及びエーテル結合脂質、例えば１，２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンが含まれるが、これらに限定されない。脂質は、ポリヌクレオチドへの結合を促進するように化学修飾または官能化され得る。
両親媒性層、例えば、脂質組成物は、典型的には、層の特性に影響を与える１つ以上の添加剤を含む。好適な添加剤には、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ミリスチン酸、及びオレイン酸；脂肪アルコール、例えばパルミチン酸アルコール、ミリスチン酸アルコール、及びオレイン酸アルコール；ステロール、例えばコレステロール、エルゴステロール、ラノステロール、シトステロール、及びスチグマステロール；リゾリン脂質、例えば１−アシル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ならびにセラミドが含まれるが、これらに限定されない。
別の好ましい実施形態では、膜は、固体層を含む。固体層は、微細電子材料、絶縁材料、例えばＳｉ３Ｎ４、Ａ１２Ｏ３、及びＳｉＯ、有機及び無機ポリマー、例えばポリアミド、プラスチック、例えばＴｅｆｌｏｎ（登録商標）またはエラストマー、例えば二成分付加硬化シリコンゴム、及びガラスを含むがこれらに限定されない有機及び無機材料の両方から形成することができる。固体層は、グラフェンから形成され得る。好適なグラフェン層は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１０６３７号（ＷＯ２００９／０３５６４７として公開）に開示されている。膜が固体層を含む場合、ポアは、典型的には、固体層内、例えば固体層内の穴、ウェル、間隙、チャネル、溝、または切れ目内に含まれる両親媒性膜または層内に存在する。当業者であれば、好適な固体／両親媒性ハイブリッド系を調製することができる。好適な系は、ＷＯ２００９／０２０６８２及びＷＯ２０１２／００５８５７に開示されている。上記の両親媒性膜または層のいずれかを使用することができる。
本方法は、典型的には、（ｉ）ポアを含む人工両親媒性層、（ｉｉ）ポアを含む単離された天然型脂質二分子層、または（ｉｉｉ）ポアが内部に挿入された細胞を使用して実施される。本方法は、典型的には、人工両親媒性層、例えば人工トリブロックコポリマー層を使用して実施される。層は、ポアに加えて、他の膜貫通タンパク質及び／または膜内タンパク質、ならびに他の分子を含んでもよい。好適な装置及び条件は、以下に論じられる。本発明の方法は、典型的には、インビトロで実施される。
結合
ポリヌクレオチドは、好ましくは、ポアを含む膜に結合する。本方法は、ポリヌクレオチドを、ポアを含む膜に結合させることを含み得る。ポリヌクレオチドは、好ましくは、１つ以上のアンカーを使用して膜に結合する。ポリヌクレオチドは、任意の既知の方法を使用して膜に結合し得る。
各アンカーは、ポリヌクレオチドに結合（ｃｏｕｐｌｅ）（または結合（ｂｉｎｄ））する基と、膜に結合（ｃｏｕｐｌｅ）（または結合（ｂｉｎｄ））する基とを含む。各アンカーは、ポリヌクレオチド及び／または膜と共有結合（ｃｏｕｐｌｅ）（または結合（ｂｉｎｄ））してもよい。Ｙアダプター及び／またはヘアピンループアダプターが使用される場合、ポリヌクレオチドは、好ましくは、アダプター（複数可）を使用して膜に結合する。
ポリヌクレオチドは、任意の数のアンカー、例えば２、３、４つ、またはそれ以上のアンカーを使用して膜に結合し得る。例えば、ポリヌクレオチドは、その各々がポリヌクレオチド及び膜の両方に別々に結合（ｃｏｕｐｌｅ）（または結合（ｂｉｎｄ））する、２つのアンカーを使用して膜に結合し得る。
１つ以上のアンカーは、１つ以上のヘリカーゼ及び／または１つ以上の分子ブレーキを含み得る。
膜が、コポリマー膜または脂質二分子層などの両親媒性層である場合、１つ以上のアンカーは、好ましくは、膜内に存在するポリペプチドアンカー及び／または膜内に存在する疎水性アンカーを含む。疎水性アンカーは、好ましくは、脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブ、ポリペプチド、タンパク質、またはアミノ酸、例えば、コレステロール、パルミチン酸、またはトコフェロールである。好ましい実施形態では、１つ以上のアンカーは、ポアではない。
両親媒性分子、コポリマー、または脂質などの膜の成分は、１つ以上のアンカーを形成するように化学修飾または官能化され得る。好適な化学修飾及び膜の成分の官能化の好適な方法は、以下により詳細に論じられる。任意の割合、例えば、少なくとも０．０１％、少なくとも０．１％、少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、または１００％の膜成分が官能化され得る。
ポリヌクレオチドは、膜に直接結合してもよい。ポリヌクレオチドを膜に結合するために使用される１つ以上のアンカーは、好ましくは、リンカーを含む。１つ以上のアンカーは、１つ以上、例えば２、３、４つ、またはそれ以上のリンカーを含み得る。１つのリンカーを使用して、１つ超、例えば２、３、４つ、またはそれ以上のポリヌクレオチドを膜に結合させることができる。
好ましいリンカーには、ポリマー、例えばポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、多糖類、及びポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。これらのリンカーは、線状、分岐、または環状であり得る。例えば、リンカーは、環状ポリヌクレオチドであり得る。ポリヌクレオチドは、環状ポリヌクレオチドリンカー上の相補的配列にハイブリダイズし得る。
１つ以上のアンカーまたは１つ以上のリンカーは、分解されるように切断され得る成分、例えば制限部位または感光性基を含んでもよい。
官能化リンカー、及びそれらが分子に結合し得る方法は、当該技術分野で既知である。例えば、マレイミド基で官能化されたリンカーは、タンパク質中のシステイン残基と反応し、それに結合することになる。本発明の文脈において、タンパク質は、膜内に存在し得るか、またはポリヌクレオチドに結合（ｃｏｕｐｌｅ）（または結合（ｂｉｎｄ））するために使用され得る。これは、以下により詳細に論じられる。
「ロックアンドキー」配置を使用して、ポリヌクレオチドの架橋を回避することができる。各リンカーの一方の末端のみが共に反応してより長いリンカーを形成し得、リンカーの他方の末端は、それぞれポリヌクレオチドまたは膜と各々反応する。かかるリンカーは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号（ＷＯ２０１０／０８６６０２として公開）に記載されている。
下記のシークエンシング実施形態において、リンカーの使用が好ましい。それがポアと相互作用する際に切り離されない（すなわち、ステップ（ｂ）または（ｅ）において切り離されない）という意味で、ポリヌクレオチドが永久的に膜に直接結合している場合、膜とポアとの間の距離に起因して、シークエンシングランがポリヌクレオチドの末端まで続けることができないため、一部の配列データが失われることになる。リンカーが使用される場合、ポリヌクレオチドは完了するまで処理することができる。
結合は、永久的であるか、または安定であり得る。換言すれば、結合は、ポアとの相互作用の際にポリヌクレオチドが膜に結合したままにするようなものである。
結合は、一時的であり得る。換言すれば、結合は、ポアとの相互作用の際にポリヌクレオチドが膜から分離するようなものである。
アプタマー検出などの特定の用途の場合、結合の一時的な性質が好ましい。永久的または安定リンカーがポリヌクレオチドの５’または３’末端のいずれかに直接結合し、リンカーが膜と膜貫通ポアのチャネルとの間の距離よりも短い場合、シークエンシングランがポリヌクレオチドの末端まで続けることができないため、一部の配列データが失われることになる。結合が一時的である場合、結合した末端がランダムに膜から分離されると、ポリヌクレオチドは完了するまで処理することができる。永久的／安定または一時的結合を形成する化学基は、以下により詳細に論じられる。ポリヌクレオチドは、コレステロールまたは脂肪アシル鎖を使用して両親媒性層またはトリブロックコポリマー膜に一時的に結合し得る。ヘキサデカン酸などの６〜３０個の炭素原子の長さを有する任意の脂肪アシル鎖を使用することができる。
好ましい実施形態では、核酸などのポリヌクレオチドは、両親媒性層、例えばトリブロックコポリマー膜または脂質二分子層に結合する。核酸の合成脂質二分子層への結合は、以前に、様々な異なるテザリング方法を用いて実施されてきた。これらを、以下の表５に要約する。
合成ポリヌクレオチド及び／またはリンカーは、コレステロール、トコフェロール、パルミチン酸、チオール、脂質、及びビオチン基などの好適なアンカー基の直接付加のために容易に適合可能である、修飾ホスホロアミダイトを合成反応中に使用して官能化され得る。これらの異なる結合化学は、ポリヌクレオチドへの結合のための一式のオプションを与える。欠く異なる修飾基は、わずかに異なる方法でポリヌクレオチドに結合し、結合は、必ずしも永久的ではないため、ポリヌクレオチドについて異なる滞留時間を膜に与える。一時的結合の利点は、上に論じられる。
ポリヌクレオチドのリンカーまたは官能化膜への結合はまた、いくつかの他の手段によって達成することができるが、但し、相補的反応性基またはアンカー基がポリヌクレオチドに付加され得ることを条件とする。ポリヌクレオチドのいずれかの末端への反応性基の付加は、以前に報告されている。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ及びＡＴＰγＳを使用して、チオール基をｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡの５’に付加することができる（Ｇｒａｎｔ，Ｇ．Ｐ．ａｎｄ Ｐ．Ｚ．Ｑｉｎ（２００７）．「Ａ ｆａｃｉｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｔｔａｃｈｉｎｇ ｎｉｔｒｏｘｉｄｅ ｓｐｉｎ ｌａｂｅｌｓ ａｔ ｔｈｅ ５’ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ．」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５（１０）：ｅ７７）。Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ及びγ−［２−アジドエチル］−ＡＴＰまたはγ−［６−アジドヘキシル］−ＡＴＰを使用して、アジド基をｓｓＤＮＡのｄｓＤＮＡの５’−リン酸に付加することができる。チオールまたはクリックケミストリーを使用して、チオール、ヨードアセトアミドＯＰＳＳ、またはマレイミド基（チオールに対して反応性）、またはＤＩＢＯ（ジベンゾシクロオキシチン（ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｘｔｙｎｅ））、またはアルキン基（アジドに対して反応性）のいずれかを含有するテザー（ｔｅｔｈｅｒ）は、ポリヌクレオチドと共有結合し得る。ビオチン、チオール、及びフルオロフォアなどの化学基のより多様な選択は、修飾オリゴヌクレオチドをｓｓＤＮＡの３’に組み込むために、末端トランスフェラーゼを使用して付加することができる（Ｋｕｍａｒ，Ａ．，Ｐ．Ｔｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）．「Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ ｗｉｔｈ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．」Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １６９（２）：３７６−８２）。任意の他のポリヌクレオチドについて、ストレプトアビジン／ビオチン及び／またはストレプトアビジン／デスチオビオチン結合を使用することができる。以下の実施例は、ストレプトアビジン／ビオチン及びストレプトアビジン／デスチオビオチンを使用してポリヌクレオチドがどのように膜に結合し得るかを説明する。また、好適な修飾ヌクレオチド（例えば、コレステロールまたはパルミチン酸）を有する末端トランスフェラーゼを使用して、アンカーがポリヌクレオチドに直接付加され得ることも可能であり得る。
１つ以上のアンカーは、好ましくは、ハイブリダイゼーションを介してポリヌクレオチドを膜に結合させる。１つ以上のアンカーにおけるハイブリダイゼーションは、上記のような一時的な方法での結合を可能にする。ハイブリダイゼーションは、１つ以上のアンカーの任意の部分、例えば、１つ以上のアンカーとポリヌクレオチドとの間、１つ以上のアンカー内、または１つ以上のアンカーと膜との間に存在する。例えば、リンカーは、共にハイブリダイズされた２つ以上のポリヌクレオチド、例えば３、４、または５つのポリヌクレオチドを含み得る。１つ以上のアンカーは、ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得る。１つ以上のアンカーは、ポリヌクレオチドに直接、またはポリヌクレオチドに結合したＹアダプター及び／またはリーダー配列に直接、またはポリヌクレオチドに結合したヘアピンループアダプターに直接ハイブリダイズし得る（以下に論じられるように）。代替的には、１つ以上のアンカーは、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドに結合したＹアダプター及び／もしくはリーダー配列、またはポリヌクレオチドに結合したヘアピンループアダプターにハイブリダイズされた１つ以上、例えば２または３つの中間ポリヌクレオチド（または「スプリント」）にハイブリダイズされ得る（以下に論じられるように）。
１つ以上のアンカーは、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドを含み得る。アンカーの一部は、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションされ得る。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩを使用した、ｓｓＤＮＡの短片のライゲーションが報告されている（Ｔｒｏｕｔ，Ａ．Ｂ．，Ｍ．Ｇ．ＭｃＨｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）．「Ｌｉｇａｔｉｏｎ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ＰＣＲ：ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｉｄｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９（２０）：９８２３−５）。代替的には、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかを、二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションし、その後２本の鎖を熱変性または化学的変性によって分離することができる。二本鎖ポリヌクレオチドに、一本鎖ポリヌクレオチドの片を二本鎖の末端の一方または両方に付加するか、または二本鎖ポリヌクレオチドを一方または両方の末端に付加するかのいずれかが可能である。一本鎖ポリヌクレオチドの二本鎖ポリヌクレオチドへの付加の場合、一本鎖ポリヌクレオチドの他の領域へのライゲーションについては、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩを使用して達成することができる。二本鎖ポリヌクレオチドの二本鎖ポリヌクレオチドへの付加の場合、ライゲーションは、ポリヌクレオチド上の相補的３’ｄＡ／ｄＴテール、及びそれぞれ付加されたポリヌクレオチド（コンカテマーまたはダイマーの形成を防ぐために、多くの試料調製用途において日常的に行われるように）を有する「平滑末端」であり得るか、またはポリヌクレオチドの制限消化及び適合性アダプターのライゲーションによって生成された「付着末端」を使用することができる。次いで、二本鎖が融解すると、各一本鎖は、一本鎖ポリヌクレオチドがライゲーションに使用された場合、５’または３’修飾のいずれかを有することになり、二本鎖ポリヌクレオチドがライゲーションに使用された場合、５’末端、３’末端、またはその両方における修飾を有することになる。
ポリヌクレオチドが合成鎖である場合、ポリヌクレオチドの化学合成中に１つ以上のアンカーが組み込まれ得る。例えば、ポリヌクレオチドは、反応性基が結合したプライマーを使用して合成することができる。
アデニル化ポリヌクレオチドは、ライゲーション反応における中間体であり、アデノシン−一リン酸がポリヌクレオチドの５’−リン酸に結合している。この中間体の生成のために様々なキット、例えばＮＥＢの５’ＤＮＡ Ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔが利用可能である。反応中に修飾ヌクレオチド三リン酸をＡＴＰで置換することによって、反応性基（例えばチオール、アミン、ビオチン、アジドなど）のポリヌクレオチドの５’への付加が可能となり得る。また、好適に修飾されたヌクレオチド（例えば、コレステロールまたはパルミチン酸）と共に５’ＤＮＡアデニル化キットを使用して、アンカーがポリヌクレオチドに直接付加され得ることも可能であり得る。
ゲノムＤＮＡの区画の増幅のための一般的な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することである。ここでは、２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＤＮＡの同じ区画のいくつかのコピーを生成することができ、各コピーについて、二本鎖中の各鎖の５’が、合成ポリヌクレオチドとなる。ポリメラーゼを用いることによって、単一または複数のヌクレオチドを一本鎖または二本鎖ＤＮＡの３’末端に付加することができる。使用され得るポリメラーゼの例としては、末端トランスフェラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ、及びＥ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌｙ（Ａ）ポリメラーゼ）が挙げられるがこれらに限定されない。反応中に修飾ヌクレオチド三リン酸をＡＴＰで置換することによって、コレステロール、チオール、アミン、アジド、ビオチン、または脂質などのアンカーが二本鎖ポリヌクレオチド内に組み込まれ得る。したがって、増幅ポリヌクレオチドの各コピーは、アンカーを含有することになる。
理想的には、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドを官能化することを必要とせずに膜に結合する。これは、ポリヌクレオチド結合タンパク質または化学基などの１つ以上のアンカーを膜に結合し、１つ以上のアンカーにポリヌクレオチドと相互作用させることによって、または膜を官能化させることによって達成することができる。１つ以上のアンカーは、本明細書に記載される方法のいずれかによって膜に結合し得る。とりわけ、１つ以上のアンカーは、マレイミド官能化リンカーなどの１つ以上のリンカーを含み得る。
この実施形態では、ポリヌクレオチドは、典型的には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡ、またはＬＮＡであり、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。この実施形態は、ゲノムＤＮＡポリヌクレオチドに特に適している。
１つ以上のアンカーは、一本鎖もしくは二本鎖ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド内の特定のヌクレオチド配列、もしくはポリヌクレオチド内の修飾ヌクレオチドのパターンに結合（ｃｏｕｐｌｅ）するか、それに結合（ｂｉｎｄ）するか、もしくはそれと相互作用する任意の基、またはポリヌクレオチド上に存在する任意の他のリガンドを含み得る。
アンカーにおける使用のための好適な結合タンパク質には、以下に列挙されるものを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ 一本鎖結合タンパク質、Ｐ５一本鎖結合タンパク質、Ｔ４ ｇｐ３２一本鎖結合タンパク質、ＴＯＰＯ Ｖ ｄｓＤＮＡ結合領域、ヒトヒストンタンパク質、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＵ ＤＮＡ結合タンパク質、及び他の古細菌、原核生物、または真核生物の一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド（または核酸）結合タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
特定のヌクレオチド配列は、転写因子、リボソーム、エンドヌクレアーゼ、トポイソメラーゼ、または複製開始因子によって認識される配列であり得る。修飾ヌクレオチドのパターンは、メチル化または損傷のパターンであり得る。
１つ以上のアンカーは、ポリヌクレオチドに結合（ｃｏｕｐｌｅ）するか、結合（ｂｉｎｄ）するか、それにインターカレートするか、またはそれと相互作用する任意の基を含み得る。基は、静電気、水素結合、またはファンデルワールス相互作用を介してポリヌクレオチドにインターカレートするかまたはそれと相互作用する。かかる基には、リジンモノマー、ポリ−リジン（ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡと相互作用することになる）、臭化エチジウム（ｄｓＤＮＡにインターカレートすることになる）、ユニバーサル塩基またはユニバーサルヌクレオチド（任意のポリヌクレオチドにハイブリダイズし得る）、及びオスミウム錯体（メチル化塩基に対して反応し得る）が含まれる。ポリヌクレオチドは、したがって、膜に結合した１つ以上のユニバーサルヌクレオチドを使用して膜に結合し得る。各ユニバーサルヌクレオチドは、１つ以上のリンカーを使用して膜に結合し得る。ユニバーサルヌクレオチド好ましくは、以下の核酸塩基、ヒポキサンチン、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、６−ニトロインドール、ホルミルインドール、３−ニトロピロール、ニトロイミダゾール、４−ニトロピラゾール、４−ニトロベンゾイミダゾール、５−ニトロインダゾール、４−アミノベンゾイミダゾール、またはフェニル（Ｃ６芳香族環）のうちの１つを含む。ユニバーサルヌクレオチドは、より好ましくは、以下のヌクレオシド、２’−デオキシイノシン、イノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、７−デアザ−イノシン、２−アザ−デオキシイノシン、２−アザ−イノシン、２−Ｏ’−メチルイノシン、４−ニトロインドール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロインドールリボヌクレオシド、５−ニトロインドール２’−デオキシリボヌクレオシド、５−ニトロインドールリボヌクレオシド、６−ニトロインドール２’−デオキシリボヌクレオシド、６−ニトロインドールリボヌクレオシド、３−ニトロピロール２’−デオキシリボヌクレオシド、３−ニトロピロールリボヌクレオシド、ヒポキサンチンの非環状糖、ニトロイミダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、ニトロイミダゾールリボヌクレオシド、４−ニトロピラゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロピラゾールリボヌクレオシド、４−ニトロベンゾイミダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロベンゾイミダゾールリボヌクレオシド、５−ニトロインダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、５−ニトロインダゾールリボヌクレオシド、４−アミノベンゾイミダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−アミノベンゾイミダゾールリボヌクレオシド、フェニルＣ−リボヌクレオシド、フェニルＣ−２’−デオキシリボシルヌクレオシド、２’−デオキシネブラリン、２’−デオキシイソグアノシン、Ｋ−２’−デオキシリボース、Ｐ−２’−デオキシリボース、及びピロリジンのうちの１つを含む。ユニバーサルヌクレオチドは、より好ましくは、２’−デオキシイノシンを含む。ユニバーサルヌクレオチドは、より好ましくは、ＩＭＰまたはｄＩＭＰである。ユニバーサルヌクレオチドは、最も好ましくは、ｄＰＭＰ（２’−デオキシ−Ｐ−ヌクレオシド一リン酸）またはｄＫＭＰ（Ｎ６−メトキシ−２，６−ジアミノプリン一リン酸）である。
１つ以上のアンカーは、フーグスティーン水素結合（２つの核酸塩基が水素結合によって共に保持されている）、または逆フーグスティーン水素結合（一方の核酸塩基が他方の核酸塩基に対して１８０°回転している）を介して、ポリヌクレオチドに結合（ｃｏｕｐｌｅ）（または結合（ｂｉｎｄ））し得る。例えば、１つ以上のアンカーは、ポリヌクレオチドとフーグスティーン水素結合または逆フーグスティーン水素結合を形成する１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のオリゴヌクレオチド、または１つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。これらの種類の水素結合は、第３のポリヌクレオチド鎖が二本鎖ヘリックスに巻き付き、三本鎖を形成することを可能にする。１つ以上のアンカーは、二本鎖構造と共に三本鎖を形成することによって、二本鎖ポリヌクレオチドに結合（ｃｏｕｐｌｅ）（または結合（ｂｉｎｄ））し得る。
この実施形態では、少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、または１００％の膜成分が官能化され得る。
１つ以上のアンカーがタンパク質を含むとき、例えばそれが、膜に適合する外部の疎水性領域を既に有する場合、それらはさらなる官能化を伴わずに膜内に直接固定することできる。かかるタンパク質の例としては、膜貫通タンパク質、膜内タンパク質、及び膜タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。代替的には、タンパク質は、膜に適合する遺伝的に融合された疎水性領域によって発現され得る。かかる疎水性タンパク質領域は、当該技術分野で既知である。
１つ以上のアンカーは、好ましくは、膜との接触の前にポリヌクレオチドと混合されるが、１つ以上のアンカーは膜と接触され、その後にポリヌクレオチドと接触されてもよい。
別の態様では、ポリヌクレオチドは、それが特異的結合基によって認識され得るように、上記の方法を使用して官能化されてもよい。具体的には、ポリヌクレオチドは、ビオチン（ストレプトアビジンへの結合のため）、アミロース（マルトース結合タンパク質または融合タンパク質への結合のため）、Ｎｉ−ＮＴＡ（ポリ−ヒスチジンまたはポリ−ヒスチジンタグタンパク質）、またはペプチド（例えば、抗原）などのリガンドによって官能化され得る。
好ましい実施形態に従い、１つ以上のアンカーを使用して、ポア内に優先的に入るリーダー配列にポリヌクレオチドが結合しているときに、ポリヌクレオチドを膜に結合させることができる。リーダー配列は、以下により詳細に論じられる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ポア内に優先的に入るリーダー配列に結合（例えばライゲーション）している。かかるリーダー配列は、ホモポリマーポリヌクレオチドまたは脱塩基領域を含み得る。リーダー配列は、典型的には、直接、または１つ以上の中間ポリヌクレオチド（もしくはスプリント）を介して、１つ以上のアンカーにハイブリダイズするように設計される。かかる実例において、１つ以上のアンカーは、典型的には、リーダー配列中の配列または１つ以上の中間ポリヌクレオチド（もしくはスプリント）中の配列に対して相補的ポリヌクレオチド配列を含む。かかる実例において、１つ以上のスプリントは、典型的には、リーダー配列中の配列に対して相補的ポリヌクレオチド配列を含む。
化学的結合に使用される分子の例は、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド）である。市販のキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｉｅｒｃｅ、部品番号２２９８０）を使用して、反応性基をポリヌクレオチドの５’に付加することもできる。好適な方法には、ヒスチジン残基及びＮｉ−ＮＴＡを使用する一時的親和性結合、ならびに反応性システイン、リジン、または非天然型アミノ酸によるより強固な共有結合が含まれるが、これらに限定されない。
二本鎖ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチドは、二本鎖であってもよい。ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、本方法は、好ましくは、接触ステップの前に、ヘアピンループなどの架橋部分をポリヌクレオチドの１つの末端にライゲーションすることをさらに含む。ポリヌクレオチドの２本の鎖は、その後、本発明に従いポリヌクレオチドがポアに接触される間に、またはその前に分けられる。２本の鎖は、ポアを通るポリヌクレオチドの移動が、ヘリカーゼなどのポリヌクレオチド結合タンパク質または分子ブレーキによって制御される間に分けられてもよい。
この方法で二本鎖構造体上の両方の鎖を結合し、調べることは、特徴付けの効率及び精度を増加させる。
架橋部分は、標的ポリヌクレオチドの２本の鎖を結合することができる。架橋部分は、典型的には、標的ポリヌクレオチドの２本の鎖を共有結合させる。架橋部分は、標的ポリヌクレオチドの２本の鎖を結合することができる任意のものであり得るが、但し、架橋部分が、膜貫通ポアを通る一本鎖ポリヌクレオチドの移動に干渉しないことを条件とする。
架橋部分は、当該技術分野で既知の任意の好適な手段によって標的ポリヌクレオチド に結合し得る。架橋部分は、別個に合成され、標的ポリヌクレオチドに化学的に結合するか、またはそれに酵素的にライゲーションし得る。代替的には、架橋部分は、標的ポリヌクレオチドの処理中に生成されてもよい。
架橋部分は、標的ポリヌクレオチドの１つの末端において、またはその近くで標的ポリヌクレオチドに結合する。架橋部分は、好ましくは、標的ポリヌクレオチドの末端の１０ヌクレオチド以内で標的ポリヌクレオチドに結合する。
好適な架橋部分には、ポリマーリンカー、化学リンカー、ポリヌクレオチド、またはポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、架橋部分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ（例えば、脱塩基ＤＮＡ）、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、またはＰＥＧを含む。架橋部分は、より好ましくは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
架橋部分は、最も好ましくは、ヘアピンループまたはヘアピンループアダプターである。好適なヘアピンアダプターは、当該技術分で既知の方法を使用して設計することができる。ヘアピンループは、任意の長さであり得る。ヘアピンループは、典型的には、１１０ヌクレオチド長以下、例えば１００ヌクレオチド長以下、９０ヌクレオチド長以下、８０ヌクレオチド長以下、７０ヌクレオチド長以下、６０ヌクレオチド長以下、５０ヌクレオチド長以下、４０ヌクレオチド長以下、３０ヌクレオチド長以下、２０ヌクレオチド長以下、または１０ヌクレオチド長以下である。ヘアピンループは、好ましくは、約１〜１１０、２〜１００、５〜８０、または６〜５０ヌクレオチド長である。ループがアダプターの分別選択性に関与する場合、ヘアピンループのより長い長さ、例えば５０〜１１０ヌクレオチドが好ましい。同様に、ループが下記の選択的結合に関与していない場合、ヘアピンループのより短い長さ、例えば１〜５ヌクレオチドが好ましい。
ヘアピンアダプターは、第１及び／または第２のポリヌクレオチドのいずれかの末端、すなわち５’または３’末端にライゲーションされ得る。ヘアピンアダプターは、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、第１及び／または第２のポリヌクレオチドにライゲーションされ得る。ヘアピンアダプターは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｍａ ＤＮＡリガーゼ、及び９ｏＮ ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼを使用してライゲーションされ得る。
ポリヌクレオチドの２本の鎖は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して分けられ得る。例えば、それらは、ポリヌクレオチド結合タンパク質によって、または脱ハイブリダイゼーションを好む条件を使用して分けられ得る（脱ハイブリダイゼーションを好む条件には、恒温、高ｐＨ、及び水素結合または塩基対合を破壊することができる薬剤、例えばホルムアミド及び尿素の添加が含まれるが、これらに限定されない）。
ヘアピンアダプターは、好ましくは、選択的結合部分を含む。これは、第１及び／または第２のポリヌクレオチドが精製または単離されることを可能にする。選択的結合部分は、その結合特性に基づいて選択され得る部分である。したがって、選択的結合部分は、好ましくは、表面に特異的に結合する部分である。それが、本発明に使用される任意の他の部分よりもはるかに大きい程度で表面に結合する場合、選択的結合部分は表面に特異的に結合する。好ましい実施形態では、部分は、本発明に使用される他の部分が結合しない表面に結合する。
好適な選択的結合部分は、当該技術分野で既知である。好ましい選択的結合部分には、ビオチン、ポリヌクレオチド配列、抗体、抗体断片、例えばＦａｂ及びＳｃＳｖ、抗原、ポリヌクレオチド結合タンパク質、ポリヒスチジンテール、ならびにＧＳＴタグが含まれるが、これらに限定されない。最も好ましい選択的結合部分は、ビオチン及び選択的ポリヌクレオチド配列である。ビオチンは、アビジンでコーティングされた表面に特異的に結合する。選択的ポリヌクレオチド配列は、相同配列でコーティングされた表面に特異的に結合する（すなわち、ハイブリダイズする）。代替的には、選択的ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド結合タンパク質でコーティングされた表面に特異的に結合する。
ヘアピンアダプター及び／または選択的結合部分は、切断、ニック、開裂、または加水分解され得る領域を含んでもよい。かかる領域は、精製または単離後に、第１及び／または第２のポリヌクレオチドが、それが結合する表面から除去されることを可能にするように設計され得る。好適な領域は、当該技術分野で既知である。好適な領域には、ＲＮＡ領域、デスチオビオチン及びストレプトアビジンを含む領域、ジスルフィド結合、ならびに光開裂可能な領域が含まれるが、これらに限定されない。
二本鎖標的ポリヌクレオチドは、好ましくは、ヘアピンループまたはヘアピンループアダプターなどの架橋部分の反対の末端にリーダー配列を含む。リーダー配列は、以下により詳細に論じられる。
ラウンドザコーナー（Ｒｏｕｎｄ ｔｈｅ ｃｏｒｎｅｒ）シークエンシング
好ましい実施形態では、標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ヘアピンループまたはヘアピンループアダプターなどの架橋部分を１つの末端に提供され、本方法は、ポアを通してポリヌクレオチドの両方の鎖が移動するように、ポリヌクレオチドをポアと接触させることと、ポリヌクレオチドの両方の鎖がポアに対して移動する間に１つ以上の測定値を取ることであって、測定値はポリヌクレオチドの鎖の１つ以上の特徴を示す、取ることによって、標的二本鎖ポリヌクレオチドを特徴付けることと、を含む。別の好ましい実施形態では、標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ヘアピンループまたはヘアピンループアダプターなどの架橋部分を１つの末端に提供され、本方法は、ポリヌクレオチドの両方の鎖が消化されて個々のヌクレオチドを形成するように、ポリヌクレオチドをポア及びエキソヌクレアーゼと接触させることを含む。上記の実施形態のいずれも、この実施形態に同等に適用される。
リーダー配列
鎖特徴付け／シークエンシング方法における接触ステップの前に、本方法は、好ましくは、ポア内に優先的に入るリーダー配列をポリヌクレオチドに結合させることを含む。リーダー配列は、本発明の方法を促進する。リーダー配列は、ポア内に優先的に入り、それによりポアを通るポリヌクレオチドの移動を促進するように設計される。リーダー配列を使用して、上記のようにポリヌクレオチドを１つ以上のアンカーに結合することもできる。
リーダー配列は、典型的には、ポリマーを含むポリマーは、好ましくは、負に荷電されている。ポリマーは、好ましくは、ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡ、修飾ポリヌクレオチド（例えば、脱塩基ＤＮＡ）、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはポリペプチドである。リーダーは、好ましくは、ポリヌクレオチドを含み、より好ましくは、一本鎖ポリヌクレオチドを含むリーダー配列は、上記のポリヌクレオチドのいずれかを含んでもよい。一本鎖リーダー配列は、最も好ましくは、ＤＮＡの一本鎖、例えばポリｄＴセクションを含む。リーダー配列は、好ましくは、１つ以上のスペーサを含む。
リーダー配列は、任意の長さであり得るが、典型的には、１０〜１５０ヌクレオチド長、例えば２０〜１５０ヌクレオチド長である。リーダーの長さは、典型的には、本方法に使用される膜貫通ポアに依拠する。
リーダー配列は、好ましくは、以下に定義されるようにＹアダプターの一部である。
二重結合
本発明の方法は、二本鎖ポリヌクレオチドの二重結合を伴い得る。好ましい実施形態では、本発明の方法は、
（ａ）二本鎖ポリヌクレオチドに、一方の末端においてＹアダプター、及び他方の末端においてヘアピンループアダプターなどの架橋部分アダプターを提供することであって、Ｙアダプターは、ポリヌクレオチドを膜に結合させるための１つ以上の第１のアンカーを含み、架橋部分アダプターは、ポリヌクレオチドを膜に結合させるための１つ以上の第２のアンカーを含み、架橋部分アダプターの膜への結合強度が、Ｙアダプターの膜への結合強度よりも大きい、提供することと、
（ｂ）ポアに対して、例えばそれを通してポリヌクレオチドが移動するように、ステップ（ａ）において提供されたポリヌクレオチドを本発明のポアと接触させることと、
（ｃ）ポリヌクレオチドがポアに対して移動する間に、１つ以上の測定値を取ることであって、測定値がポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を示す、取ることによって、標的ポリヌクレオチドを特徴付けることと、を含む。
この種類の方法は、英国出願第１４０６１４７．７号に詳細に論じられている。
二本鎖ポリヌクレオチドは、一方の末端においてＹアダプター、及び他方の末端において架橋部分アダプターを提供される。Ｙアダプター及び／または架橋部分アダプターは、典型的には、ポリヌクレオチドアダプターである。それらは、上記のポリヌクレオチドのいずれかから形成され得る。
Ｙアダプターは、典型的には、（ａ）二本鎖領域と、（ｂ）一本鎖領域または他方の末端において相補的ではない領域と、を含むＹアダプターは、それが一本鎖領域を含む場合、オーバーハングとして説明することができる。Ｙアダプター中の非相補領域の存在は、二本鎖部分とは異なり２本の鎖が典型的には互いにハイブリダイズしないため、アダプターにＹ形状を与える。Ｙアダプターは、１つ以上の第１のアンカーを含む。アンカーは、上により詳細に論じられる。
Ｙアダプターは、好ましくは、ポア内に優先的に入るリーダー配列を含む。これは、上に論じられる。
架橋部分アダプターは、好ましくは、上記のように選択的結合部分を含む。架橋部分アダプター及び／または選択的結合部分は、切断、ニック、開裂、または加水分解され得る領域を含んでもよい。
上記のように１つ以上のヘリカーゼ及び１つ以上の分子ブレーキが使用される場合、Ｙアダプターは、好ましくは、１つ以上のヘリカーゼを含み、架橋部分アダプターは、好ましくは、１つ以上の分子ブレーキを含む。
Ｙアダプター及び／または架橋部分アダプターは、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、ポリヌクレオチドにライゲーションされ得る。アダプターのうちの一方または両方は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｍａ ＤＮＡリガーゼ、及び９ｏＮ ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼを使用してライゲーションされ得る。代替的には、アダプターは、以下に論じられる本発明の方法を使用して、ポリヌクレオチドに付加され得る。
好ましい実施形態では、本方法のステップａ）は、それが一方の末端においてＹアダプター、及び他方の末端位おいて架橋部分アダプターを含むように、二本鎖ポリヌクレオチドを修飾することを含む。任意の修飾方法を使用することができる。本方法は、好ましくは、本発明に従って二本鎖ポリヌクレオチドを修飾することを含む。これは、以下により詳細に論じられる。修飾及び特徴付けの方法は、任意の方法で組み合わせられ得る。
架橋部分アダプターの膜への結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）（または結合（ｂｉｎｄｉｎｇ））強度は、Ｙアダプターの膜への結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）（または結合（ｂｉｎｄｉｎｇ））強度よりも大きい。これは、任意の方法で測定することができる。結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）（または結合（ｂｉｎｄｉｎｇ））強度を測定するための好適な方法は、英国特許第１４０６１４７．７号の実施例において開示されている。
架橋部分アダプターの結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）（または結合（ｂｉｎｄｉｎｇ））強度は、好ましくは、Ｙアダプターの結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）（または結合（ｂｉｎｄｉｎｇ））強度の少なくとも１．５倍、例えば、Ｙアダプターの結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）（または結合（ｂｉｎｄｉｎｇ））強度の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍である。架橋部分アダプターの膜に対する親和定数（Ｋｄ）は、好ましくは、Ｙアダプターの親和定数の少なくとも１．５倍、例えばＹアダプターの結合強度の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍である。
架橋部分アダプターが、Ｙアダプターよりも強く膜に結合（ｃｏｕｐｌｅ）（または結合（ｂｉｎｄ））するいくつかの方法がある。例えば、架橋部分アダプターは、Ｙアダプターよりも多いアンカーを含み得る。例えば、架橋部分アダプターは、２つ、３つ、またはそれ以上の第２のアンカーを含み得る一方、Ｙアダプターは、１つの第１のアンカーを含み得る。
１つ以上の第２のアンカーの膜への結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）（または結合（ｂｉｎｄｉｎｇ））強度は、１つ以上の第１のアンカーの膜への結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）（または結合（ｂｉｎｄｉｎｇ））強度よりも大きくてもよい。１つ以上の第２のアンカーの架橋部分アダプターへの結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）（または結合（ｂｉｎｄｉｎｇ））強度は、１つ以上の第１のアンカーのＹアダプターへの結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）（または結合（ｂｉｎｄｉｎｇ））強度よりも大きくてもよい。１つ以上の第１のアンカー及び１つ以上の第２のアンカーは、ハイブリダイゼーションを介してそれらのそれぞれのアダプターに結合し得、ハイブリダイゼーション強度は、１つ以上の第１のアンカーにおけるよりも１つ以上の第２のアンカーにおいてより大きい。本発明において、これらの実施形態の任意の組み合わせを使用することもできる。結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）（または結合（ｂｉｎｄｉｎｇ））強度は、当該技術分野で既知の技術を使用して測定することができる。
１つ以上の第２のアンカーは、好ましくは、膜に結合（ｃｏｕｐｌｅ）（または結合（ｂｉｎｄ））する１つ以上の第１のアンカー中の１つ以上の基よりも大きい強度で膜に結合（ｃｏｕｐｌｅ）（または結合（ｂｉｎｄ））する１つ以上の基を含む。好ましい実施形態では、架橋部分アダプター／１つ以上の第２のアンカーは、コレステロールを使用して膜に結合（ｃｏｕｐｌｅ）（または結合（ｂｉｎｄ））し、Ｙアダプター／１つ以上の第１のアンカーは、パルミチン酸を使用して膜に結合（ｃｏｕｐｌｅ）（または結合（ｂｉｎｄ））する。コレステロールは、パルミチン酸よりも強くトリブロックコポリマー膜及び脂質膜に結合する。代替的な実施形態では、架橋部分アダプター／１つ以上の第２のアンカーは、パルミチン酸などのモノアシル種を使用して膜に結合（ｃｏｕｐｌｅ）（または結合（ｂｉｎｄ））し、Ｙアダプター／１つ以上の第１のアンカーは、ジパルミトイルホスファチジルコリンなどのジアシル種を使用して膜に結合（ｃｏｕｐｌｅ）（または結合（ｂｉｎｄ））する。
ヘアピンループ及びリーダー配列の付加
提供される前に、二本鎖ポリヌクレオチドは、ＭｕＡトランスポザーゼ及び二本鎖ＭｕＡ基質の集団と接触され得、集団中の基質の一部は、リーダー配列を含むＹアダプターであり、集団中の気質の一部は、ヘアピンループアダプターである。トランスポザーゼは、二本鎖ポリヌクレオチド分析物を断片化し、ＭｕＡ基質を断片の一方または両方の末端にライゲーションする。これにより、一方の末端においてリーダー配列、及び他方の末端においてヘアピンループを含む複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドが生成される。修飾二本鎖ポリヌクレオチドは、次いで、本発明の方法を使用して調査され得る。
集団中の各基質は、トランスポザーゼが鋳型ポリヌクレオチドを断片化し、二本鎖断片の一方または両方の末端に基質をライゲーションし、それにより複数の断片／基質構造体を生成するように、好ましくは、ユニバーサルヌクレオチドの少なくとも１つのオーバーハングを含み、本方法は、オーバーハングを構造体中の断片にライゲーションし、それにより複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを生成することをさらに含む。好適なユニバーサルヌクレオチドは、上に論じられる。オーバーハングは、好ましくは、５ヌクレオチド長である。
代替的には、集団中の各基質は、好ましくは、（ｉ）少なくとも１つのオーバーハングと、（ｉｉ）トランスポザーゼが鋳型ポリヌクレオチドを断片化し、二本鎖断片の一方または両方の末端に基質をライゲーションし、それにより複数の断片／基質構造体を生成するように、鋳型ポリヌクレオチド中に存在しないヌクレオシドを含む、少なくとも１つのオーバーハングと同じ鎖内の少なくとも１つのヌクレオチドと、を含み、本方法は、（ａ）少なくとも１つのヌクレオチドを選択的に除去することによって構造体からオーバーハングを除去し、それにより一本鎖ギャップを含む複数の二本鎖構造体を生成することと、（ｂ）構造体中の一本鎖ギャップを修復し、それにより複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを生成することと、をさらに含む。ポリヌクレオチドは、典型的には、ヌクレオシド、デオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシウリジン（ｄＵ）及び／またはチミジン（ｄＴ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）、ならびにデオキシシチジン（ｄＣ）を含む。ポリヌクレオチド中に存在しないヌクレオシドは、好ましくは、脱塩基、アデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、シチジン（Ｃ）、もしくはグアノシン（Ｇ）であるか、または尿素、５，６ジヒドロキシチミン、チミングリコール、５−ヒドロキシ−５メチルヒダントン（ｍｅｔｈｙｌｈｙｄａｎｔｏｎ）、ウラシルグリコール、６−ヒドロキシ−５，６−ジヒドロチミン、メチルタルトロニル尿素（ｍｅｔｈｙｌｔａｒｔｒｏｎｙｌｕｒｅａ）、７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニン（８−オキソグアニン）、８−オキソアデニン、ｆａｐｙ−グアニン、メチル−ｆａｐｙ−グアニン、ｆａｐｙ−アデニン、アフラトキシンＢ１−ｆａｐｙ−グアニン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシ−ウラシル、３−メチルアデニン、７−メチルグアニン、１，Ｎ６−エテノアデニン、ヒポキサンチン、５−ヒドロキシウラシル、５−ヒドロキシメチルｌウラシル、５−ホルミルウラシル、またはシス−ｓｙｎ−シクロブタンピリミジンダイマーを含む。少なくとも１つのヌクレオチドは、好ましくは、オーバーハングから１０ヌクレオチド以下である。少なくとも１つのヌクレオチドは、オーバーハング中の最初のヌクレオチドである。オーバーハング中の全てのヌクレオチドは、好ましくは、鋳型ポリヌクレオチド中に存在しないヌクレオシドを含む。
これらのＭｕＡに基づく方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２５０５号に開示されている。これらはまた、英国出願第１４０６１４７．７号に詳細に論じられている。
１つ以上のヘリカーゼは、それらが二本鎖ポリヌクレオチド及びＭｕＡトランスポザーゼと接触する前に、ＭｕＡ基質のＹアダプターに結合し得る。代替的には、１つ以上のヘリカーゼは、それらが二本鎖ポリヌクレオチド及びＭｕＡトランスポザーゼと接触する前に、ＭｕＡ基質のＹアダプターに結合し得る。
１つ以上の分子ブレーキは、それらが二本鎖ポリヌクレオチド及びＭｕＡトランスポザーゼと接触する前に、ＭｕＡ基質のヘアピンループアダプターに結合し得る。代替的には、１つ以上の分子ブレーキは、それらが二本鎖ポリヌクレオチド及びＭｕＡトランスポザーゼと接触する前に、ＭｕＡ基質のヘアピンループアダプターに結合し得る。
切り離し
本発明の方法は、複数の標的ポリヌクレオチドを特徴付けることと、少なくとも第１の標的ポリヌクレオチドを切り離すことと、を伴い得る。
好ましい実施形態では、本発明は、２つ以上の標的ポリヌクレオチドを特徴付けることを伴い得る。本方法は、
（ａ）第１の試料中の第１のポリヌクレオチドを提供することと、
（ｂ）第２の試料中の第２のポリヌクレオチドを提供することと、
（ｃ）第１の試料中の第１のポリヌクレオチドを、１つ以上のアンカーを使用して膜に結合させることと、
（ｄ）ポアに対して、例えばそれを通してポリヌクレオチドが移動するように、第１のポリヌクレオチドを本発明のポアと接触させることと、
（ｅ）第１のポリヌクレオチドがポアに対して移動する間に、１つ以上の測定値を取ることであって、測定値が第１のポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を示す、取ることによって、第１のポリヌクレオチドを特徴付けることと、
（ｆ）第１のポリヌクレオチドを膜から切り離すことと、
（ｇ）第２の試料中の第２のポリヌクレオチドを、１つ以上のアンカーを使用して膜に結合させることと、
（ｈ）ポアに対して、例えばそれを通して第２のポリヌクレオチドが移動するように、第２のポリヌクレオチドを本発明のポアと接触させることと、
（ｉ）第２のポリヌクレオチドがポアに対して移動する間に、１つ以上の測定値を取ることであって、測定値が第２のポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を示す、取ることによって、第２のポリヌクレオチドを特徴付けることと、を含む。
この種類の方法は、英国出願第１４０６１５５．０号に詳細に論じられている。
ステップ（ｆ）（すなわち、第１のポリヌクレオチドの切り離し）は、ステップ（ｇ）の前（すなわち、第２のポリヌクレオチドを膜に結合させる前）に行われ得る。ステップ（ｇ）は、ステップ（ｆ）の前に行われ得る。第２のポリヌクレオチドが、第１のポリヌクレオチドが切り離される前に膜に結合する場合、ステップ（ｆ）は、好ましくは、第１のポリヌクレオチドを膜から選択的に切り離す（すなわち、膜から第１のポリヌクレオチドを切り離すが、第２のポリヌクレオチドは切り離されない）ことを含む。当業者であれば、選択的切り離しが達成されるシステムを設計することができる。ステップ（ｆ）及び（ｇ）は、同時に実施され得る。これは、以下により詳細に論じられる。
ステップ（ｆ）において、第１のポリヌクレオチドの少なくとも１０％は、好ましくは、膜から切り離される。例えば、第１のポリヌクレオチドの少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、膜から切り離され得る。好ましくは、第１のポリヌクレオチドの全てが膜から切り離される。膜から切り離される第１のポリヌクレオチドの量は、ポアを使用して判定され得る。これは、実施例に開示されている。
第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、互いに異なり得る。代替的には、第１及び第２のポリヌクレオチドは、異なるポリヌクレオチドであり得る。かかる実例において、第２のポリヌクレオチドを添加する前に、第１の試料の少なくとも一部を除去する必要がない場合がある。これは、以下により詳細に論じられる。本方法が３つ以上のポリヌクレオチドを調査することを伴う場合、それらは全て互いに異なり得るか、またはそれらのうちのいくつかは互いに異なり得る。
第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチドの２つの実例であり得る。第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドと同一であり得る。これは、プルーフリーディングを可能にする。本方法が３つ以上のポリヌクレオチドを調査することを伴う場合、それらは全て同じポリヌクレオチドの３つ以上の実例であり得るか、またはそれらのうちのいくつかは同じポリヌクレオチドの別個の実例であり得る。
第１の試料及び第２の試料は、互いに異なり得る。例えば、第１の試料は、ヒトに由来し得、第２の試料は、ウイルスに由来し得る。第１及び第２の試料が互いに異なる場合、それらは同じ第１及び第２のポリヌクレオチドを含有し得るか、または含有することが疑われる。本方法が３つ以上の試料を調査することを伴う場合、それらは全て互いに異なり得るか、またはそれらのうちのいくつかは互いに異なり得る。
第１の試料及び第２の試料は、好ましくは、同じ試料の２つの実例である。第１の試料は、好ましくは、第２の試料と同一である。これは、プルーフリーディングを可能にする。本方法が３つ以上の試料を調査することを伴う場合、それらは全て同じ試料の３つ以上の実例であり得るか、またはそれらのうちのいくつかは同じ試料の別個の実例であり得る。
任意の数のポリヌクレオチドを調査することができる。例えば、本発明の方法は、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、１００、またはそれ以上のポリヌクレオチドの特徴付けに関し得る。本発明の方法を使用して３つ以上のポリヌクレオチドが調査される場合、第２のポリヌクレオチドも膜から切り離され、第３のポリヌクレオチドについて必要なステップ数が追加される。４つ以上のポリヌクレオチドの場合も同様である。
本発明の方法は、第１のポリヌクレオチドを膜から切り離すことを伴う。本発明の方法は、３つ以上のポリヌクレオチドが調査される場合、第２のポリヌクレオチドを膜から切り離すことを伴い得る。
第１のポリヌクレオチドは、任意の既知の方法を使用して膜から切り離され得る。第１のポリヌクレオチドは、好ましくは、ステップ（ｆ）において膜貫通ポアを使用して膜から切り離されていない。第１のポリヌクレオチドは、好ましくは、電圧または印加された電位を使用して膜から切り離されていない。
ステップ（ｆ）は、好ましくは、１つ以上のアンカーを膜から除去することによって第１のポリヌクレオチドを膜から切り離すことを含む。アンカーが除去されると、第２のポリヌクレオチドは、他の（または別個の）アンカーを使用して膜に結合する。第２のポリヌクレオチドを結合するために使用されるアンカーは、第１のポリヌクレオチドを結合するために使用されるアンカーと同じ種類であるか、または異なる種類のアンカーであり得る。
ステップ（ｆ）は、より好ましくは、１つ以上のアンカーを、アンカーが膜に対して有するよりも高い１つ以上のアンカーに対する親和性を有する薬剤と接触させることを含む。分子の特異的結合能力を判定するための競合結合またはイムノラジオメトリックアッセイの多様なプロトコルが、当該技術分野で周知である（例えば、Ｍａｄｄｏｘ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８，１２１１−１２２６，１９９３を参照されたい）。薬剤は、アンカー（複数可）を膜から除去し、それにより第１のポリヌクレオチドを切り離す。薬剤は、好ましくは、糖である。１つ以上のアンカーが膜に対して有するよりも高い親和性で１つ以上のアンカーに結合する任意の糖を使用することができる。糖は、下記のように、シクロデキストリンまたはその誘導体であり得る。
１つ以上のアンカーがコレステロールなどの疎水性アンカーを含む場合、薬剤は、好ましくは、シクロデキストリンもしくはその誘導体、または脂質である。シクロデキストリンまたはその誘導体は、Ｅｌｉｓｅｅｖ，Ａ．Ｖ．，ａｎｄ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｈ−Ｊ．（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６，６０８１−６０８８に開示されるもののいずれかであり得る。薬剤は、より好ましくは、ヘプタキス−６−アミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ７−βＣＤ）、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ１−βＣＤ）、またはヘプタキス−（６−デオキシ−６−グアニジノ）−シクロデキストリン（ｇｕ７−βＣＤ）である。本明細書に開示される脂質のいずれかを使用することができる。
アンカーが、ストレプトアビジン、ビオチン、またはデスチオビオチンを含む場合、薬剤は、好ましくは、ビオチン、デスチオビオチン、またはストレプトアビジンである。ビオチン及びデスチオビオチンはいずれも、ストレプトアビジンが膜に結合するよりも高い親和性でストレプトアビジンに結合し、逆もまた同様である。ビオチンは、ストレプトアビジンに対してデスチオビオチンよりも強い親和性を有する。ストレプトアビジンを含むアンカーは、したがって、ビオチンまたはストレプトアビジンを使用して膜から除去され得、逆もまた同様である。
アンカーがタンパク質を含む場合、薬剤は、好ましくは、タンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片である。抗体は、それが優先的または高い親和性でタンパク質に結合する場合に、タンパク質に特異的に結合するが、他のまたは異なるタンパク質には結合しないか、または低い親和性でのみ結合する。抗体は、それが１×１０−６Ｍ以下、より好ましくは１×１０−７Ｍ以下、５×１０−８Ｍ以下、より好ましくは１×１０−８Ｍ以下、またはより好ましくは５×１０−９Ｍ以下のＫｄで結合する場合に、優先的または高い親和性で結合する。抗体は、それが１×１０−６Ｍ以上、より好ましくは１×１０−５Ｍ以上、より好ましくは１×１０−４Ｍ以上、より好ましくは１×１０−３Ｍ以上、さらにより好ましくは１×１０−２Ｍ以上のＫｄで結合する場合に、低い親和性で結合する。任意の方法を使用して、結合または特異的結合を検出することができる。抗体のタンパク質への結合を定量的に測定する方法は、当該技術分野で周知である。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。抗体の好適な断片には、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）、及びＦ（ａｂ’）２断片、ならびに一本鎖抗体が含まれるが、これらに限定されない。さらに、抗体またはその断片は、キメラ抗体もしくはその断片、ＣＤＲ移植抗体もしくはその断片、またはヒト化抗体もしくはその断片であり得る。
ステップ（ｆ）は、好ましくは、１つ以上のアンカーを、１つ以上のアンカーの膜への結合能力を低減させる薬剤と接触させることを含む。例えば、薬剤は、１つ以上のアンカーの構造及び／または疎水性に干渉し、それによりそれらの膜への結合能力を低減させることができる。アンカーがコレステロールを含む場合、薬剤は、好ましくは、コレステロールデヒドロゲナーゼである。アンカーが脂質を含む場合、薬剤は、好ましくは、ホスホリパーゼである。アンカーがタンパク質を含む場合、薬剤は、好ましくは、プロテイナーゼまたは尿素である。好適なアンカー及び薬剤の他の組み合わせは、当業者には明らかになるであろう。
ステップ（ｆ）は、好ましくは、第１のポリヌクレオチドを１つ以上のアンカーから分けることによって第１のポリヌクレオチドを膜から切り離すことを含む。これは、任意の方法で行うことができる。例えば、リンカーが、リンカーを含むアンカー内で切断され得る。この実施形態は、ハイブリダイゼーションを介した結合を伴うアンカーに特に適用可能である。かかるアンカーは、上に論じられる。
ステップ（ｆ）は、より好ましくは、第１のポリヌクレオチド及び１つ以上のアンカーを、１つ以上のアンカーへの結合について第１のポリヌクレオチドと競合する薬剤と接触させることによって、第１のポリヌクレオチドを膜から切り離すことを含む。競合結合を判定及び測定するための方法は、当該技術分野で既知である。薬剤は、好ましくは、１つ以上のアンカーへのハイブリダイゼーションについて第１のポリヌクレオチドと競合するポリヌクレオチドである。例えば、第１のポリヌクレオチドがハイブリダイゼーションを伴う１つ以上のアンカーを使用して膜に結合している場合、１つ以上のアンカーを、ハイブリダイゼーション部位にまたハイブリダイズするポリヌクレオチドと接触させることによって、ポリヌクレオチドは切り離され得る。ポリヌクレオチド薬剤は、典型的には、第１のポリヌクレオチド及び１つ以上のアンカーの濃度よりも高い濃度で添加される。代替的には、ポリヌクレオチド薬剤は、第１のポリヌクレオチドよりも強く１つ以上のアンカーにハイブリダイズし得る。
ステップ（ｆ）は、より好ましくは、（ｉ）第１のポリヌクレオチド及び１つ以上のアンカーを、尿素、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ストレプトアビジンもしくはビオチン、紫外線、酵素、または結合剤と接触させること、（ｉｉ）第１のポリヌクレオチド及び１つ以上のアンカーを加熱すること、または（ｉｉｉ）ｐＨを変えることを含む。尿素、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、またはジチオトレイトール（ＤＴＴ）は、アンカーを破壊し、第１のポリヌクレオチドを膜から分離することができる。アンカーがストレプトアビジン−ビオチン結合を含む場合、ストレプトアビジン薬剤は、ビオチンへの結合について競合することになる。アンカーがストレプトアビジン−デスチオビオチン結合を含む場合、ビオチン薬剤は、ストレプトアビジンへの結合について競合することになる。紫外線を使用して、感光性基を分解することができる。酵素及び結合剤を使用して、アンカーを切断、分解、または解くことができる。好ましい酵素には、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、またはヘリカーゼが含まれるが、これらに限定されない。好ましい結合剤には、酵素、抗体もしくはその断片、または一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）が含まれるが、これらに限定されない。下記の酵素または上記の抗体のいずれかを使用することができる。熱及びｐＨを使用して、ハイブリダイゼーション及び他の結合を破壊することができる。
第１のポリヌクレオチドを１つ以上のアンカーから分けることによって第１のポリヌクレオチドが膜から切り離される場合、１つ以上のアンカーは、膜内に残ることになる。ステップ（ｇ）は、好ましくは、第１のポリヌクレオチドから分けられた１つ以上のアンカーを使用して、第２のポリヌクレオチドを膜に結合させることを含む。例えば、第２のポリヌクレオチドはまた、膜内に残る１つ以上のアンカーにハイブリダイズする１つ以上のポリヌクレオチドを提供され得る。代替的には、ステップ（ｇ）は、好ましくは、第１のポリヌクレオチドから分けられたものからの１つ以上の別個のアンカー（すなわち、１つ以上の他のアンカー）を使用して、第２のポリヌクレオチドを膜に結合させることを含む。１つ以上の別個のアンカーは、第１のポリヌクレオチドを膜に結合するために使用されるアンカーと同じ種類であるか、または異なる種類のアンカーであり得る。ステップ（ｇ）は、好ましくは、第１のポリヌクレオチドから分けられた１つ以上のアンカーからの１つ以上の異なるアンカーを使用して、第２のポリヌクレオチドを膜に結合させることを含む。
好ましい実施形態では、ステップ（ｆ）及び（ｇ）は、第２のポリヌクレオチドが、１つ以上のアンカーへの結合について第１のポリヌクレオチドと競合し、第１のポリヌクレオチドに取って代わるように、膜を第２のポリヌクレオチドと接触させることによって、第１のポリヌクレオチドを膜から切り離すことを含む。例えば、第１のポリヌクレオチドがハイブリダイゼーションを伴う１つ以上のアンカーを使用して膜に結合している場合、１つ以上のアンカーを、１つ以上のアンカーにおけるハイブリダイゼーション部位にまたハイブリダイズするポリヌクレオチドに結合した第２のポリヌクレオチドと接触させることによって、第１のポリヌクレオチドは切り離され得る。第２のポリヌクレオチドは、典型的には、第１のポリヌクレオチド及び１つ以上のアンカーの濃度よりも高い濃度で添加される。代替的には、第２のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドよりも強く１つ以上のアンカーにハイブリダイズし得る。
除去または洗浄
ステップ（ｆ）において第１のポリヌクレオチドは膜から切り離されるが、それは必ずしも除去されるかまたは洗い流されない。第２のポリヌクレオチドが第１のポリヌクレオチドと容易に識別され得る場合、第１のポリヌクレオチドを除去する必要はない。
ステップ（ｆ）と（ｇ）との間で、本方法は、好ましくは、第１の試料の少なくとも一部を膜から除去することをさらに含む。第１の試料の少なくとも１０％が除去されてもよく、例えば、第１の試料の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が除去されてもよい。
本方法は、より好ましくは、第１の試料の全てを膜から除去することをさらに含む。これは、任意の方法で行うことができる。例えば、膜は、第１のポリヌクレオチドが切り離された後に、緩衝液で洗浄され得る。好適な緩衝液は、以下に論じられる。
修飾ポリヌクレオチド
特徴付けの前に、標的ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼが標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用して修飾ポリヌクレオチドを形成する条件下で、ポリヌクレオチドをポリメラーゼ及び遊離ヌクレオチドの集団と接触させることによって、修飾され得、ポリメラーゼは、修飾ポリヌクレオチドを形成する際に、標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチド種のうちの１つ以上を異なるヌクレオチド種で置き換える。修飾ポリヌクレオチドは次いで、ポリヌクレオチドに結合した１つ以上のヘリカーゼ、及びポリヌクレオチドに結合した１つ以上の分子ブレーキを提供される。この種類の修飾は、英国出願第１４０３０９６．９号に記載されている。上記のポリメラーゼのいずれかを使用することができる。ポリメラーゼは、好ましくは、Ｋｌｅｎｏｗまたは９ｏ Ｎｏｒｔｈである。
鋳型ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼが鋳型ポリヌクレオチドを鋳型として使用して修飾ポリヌクレオチドを形成する条件下でポリメラーゼと接触される。かかる条件は、当該技術分野で既知である。例えば、ポリヌクレオチドは、典型的には、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）からの緩衝液などの市販のポリメラーゼ緩衝液中でポリメラーゼと接触される。温度は、好ましくは、Ｋｌｅｎｏｗの場合は２０〜３７℃、９ｏ Ｎｏｒｔｈの場合は６０〜７５℃である。プライマーまたは３’ヘアピンは、典型的には、ポリメラーゼ伸長のための核形成点として使用される。
膜貫通ポアを使用するポリヌクレオチドの特徴付け、例えばシークエンシングは、典型的には、ｋ個（ｋは正の整数である）のヌクレオチドからなるポリマー単位（すなわち、「ｋ−マー」）を分析することを伴う。これは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２３４３号（ＷＯ２０１３／０４１８７８として公開）に論じられている。異なるｋ−マーについての電流測定間に明確な分離があることが望ましいものの、これらの測定の一部が重複することは一般的である。特に、ｋ−マー中のポリマー単位の数が多い（すなわち、ｋの値が大きい）場合、異なるｋ−マーによって生成された測定値を分析することが難しくなり得、ポリヌクレオチドに関する情報の取得、例えば、ポリヌクレオチドの基礎となる配列の推定に不利益となる。
標的ポリヌクレオチド中の１つ以上のヌクレオチド種を、修飾ポリヌクレオチド中の異なるヌクレオチド種で置き換えることによって、修飾ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドにおけるものとは異なるｋ−マーを含有する。修飾ポリヌクレオチド中の異なるｋ−マーは、標的ポリヌクレオチド中のｋ−マーとは異なる電流測定値を生成することができ、そのため、修飾ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドとは異なる情報を提供する。修飾ポリヌクレオチドからの追加の情報は、標的ポリヌクレオチドを特徴付けることをより容易にし得る。いくつかの実例において、修飾ポリヌクレオチド自体が、特徴付けることが容易である場合がある。例えば、修飾ポリヌクレオチドは、それらの電流測定値間の増加した分離もしくは明確な分離を有するｋ−マー、または減少したノイズを有するｋ−マーを含むように設計され得る。
ポリメラーゼは、好ましくは、修飾ポリヌクレオチドを形成する際に、標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチド種のうちの２つ以上を異なるヌクレオチド種で置き換える。ポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチド中の２つ以上のヌクレオチド種の各々を固有のヌクレオチド種で置き換え得る。ポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチド中の２つ以上のヌクレオチド種の各々を同じヌクレオチド種で置き換え得る。
標的ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、修飾中の異なるヌクレオチド種は、典型的には、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、もしくはメチルシトシンとは異なる核酸塩基を含み、かつ／またはデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシシチジン、もしくはデオキシメチルシチジンとは異なるヌクレオシドを含む。標的ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、修飾ポリヌクレオチド中の異なるヌクレオチド種は、典型的には、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、もしくはメチルシトシンとは異なる核酸塩基を含み、かつ／またはアデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、もしくはメチルシチジンとは異なるヌクレオシドを含む。異なるヌクレオチド種は、上記のユニバーサルヌクレオチドのいずれかであり得る。
ポリメラーゼは、１つ以上のヌクレオチド種を、１つ以上のヌクレオチド種に不在である化学基または原子を含む異なるヌクレオチド種で置き換えることができる。化学基は、プロピニル基、チオ基、オキソ基、メチル基、ヒドロキシメチル基、ホルミル基、カルボキシ基、カルボニル基、ベンジル基、プロパルギル基、またはプロパルギルアミン基であり得る。
ポリメラーゼは、１つ以上のヌクレオチド種を、１つ以上のヌクレオチド種中に存在する化学基または原子を欠く異なるヌクレオチド種で置き換えることができる。ポリメラーゼは、ヌクレオチド種のうちの１つ以上を、改変された電気陰性度を有する異なるヌクレオチド種で置き換えることができる。改変された電気陰性度を有する異なるヌクレオチド種は、好ましくは、ハロゲン原子を含む。
本方法は、好ましくは、核酸塩基を修飾ポリヌクレオチド中の１つ以上の異なるヌクレオチド種から選択的に除去することをさらに含む。
分析物送達
標的分析物は、好ましくは、分析物を膜に向けて送達する微粒子に結合している。この種類の送達は、英国出願第１４１８４６９．１号に開示されている。任意の種類の微粒子及び結合を使用してもよい。
他の特徴付け方法
別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドに付加され、その後解放された標識種を検出することによって特徴づけられる。ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドを鋳型として使用する。各標識種は、各ヌクレオチドに特異的である。ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼによってリン酸標識種がポリヌクレオチドに順次付加されるように、本発明のポア、例えば本発明のポア、ポリメラーゼ、及び標識ヌクレオチドと接触され、リン酸種は、各ヌクレオチドに特異的な標識を含有する。標識種は、それらがヌクレオチドから解放される前に（すなわち、標的ポリヌクレオチドに付加される間に）、またはそれらがヌクレオチドから解放された後に、ポアを使用して検出することができる。
ポリメラーゼは、上記のもののいずれかであり得る。リン酸標識種はポアを使用して検出され、それによりポリヌクレオチドを特徴付ける。この種類の方法は、欧州出願第１３１８７１４９．３号（ＥＰ２６８２４６０として公開）に開示されている。上記の実施形態のいずれも、この方法に同等に適用される。
標識種の例としては、ポリマー、ポリエチレングリコール、糖、シクロデキストリン、フルオロフォア、薬物、代謝物、ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。かかるタグの非限定的な例は、Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１２；２：６８４．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｓｅｐ ２１の研究に見出すことができる。
センサの形成方法
本発明はまた、標識ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサの形成方法を提供する。本方法は、本発明のポアと、ヘリカーゼまたはエキソヌクレアーゼなどのポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体を形成することを含む。複合体は、ポア及びタンパク質を標的ポリヌクレオチドの存在下で接触させることと、その後、ポアにわたって電位を印加することと、によって形成され得る。印加される電位は、上記のように化学的電位または電圧電位であり得る。代替的には、複合体は、ポアをタンパク質に共有結合させることによって形成され得る。共有結合のための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）及び同第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に開示されている。複合体は、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサである。本方法は、好ましくは、本発明のポアとヘリカーゼとの複合体を形成することを含む。上記の実施形態のいずれも、この方法に同等に適用される。
本発明はまた、標識ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサを提供する。センサは、本発明のポアとポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体を含む。上記の実施形態のいずれも、本発明のセンサに同等に適用される。
キット
本発明はまた、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのキットを提供する。キットは、本発明のポアと、膜の構成要素と、を含む。膜は、好ましくは、構成要素から形成される。ポアは、好ましくは、膜内に存在する。キットは、上に開示される膜、例えば両親媒性層またはトリブロックコポリマー膜のいずれかの構成要素を含み得る。
キットは、ポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含み得る。上記のポリヌクレオチド結合タンパク質のいずれかを使用することができる。
キットは、ポリヌクレオチドを膜に結合させるための１つ以上のアンカーをさらに含み得る。
キットは、好ましくは、二本鎖ポリヌクレオチドを特徴付けるためのものであり、好ましくは、Ｙアダプター及びヘアピンループアダプターを含む。Ｙアダプターには、好ましくは、１つ以上のヘリカーゼが結合し、ヘアピンループアダプターには、好ましくは、１つ以上の分子ブレーキが結合している。Ｙアダプターは、好ましくは、ポリヌクレオチドを膜に結合させるための１つ以上の第１のアンカーを含み、ヘアピンループアダプターは、好ましくは、ポリヌクレオチドを膜に結合させるための１つ以上の第２のアンカーを含み、ヘアピンループアダプターの膜への結合強度は、好ましくは、Ｙアダプターの膜への結合強度よりも大きい。
本発明のキットは、上記の実施形態のいずれかを実施することを可能にする１つ以上の他の試薬または器具をさらに含み得る。かかる試薬または器具には、好適な緩衝液（複数可）（水溶液）、対象から試料を得るための手段（容器もしくは針を含む器具）、ポリヌクレオチドを増幅及び／もしくは発現させるための手段、または電圧、またはパッチクランプ装置のうちの１つ以上が含まれる。試薬は、流体試料が試薬を再懸濁するように、乾燥状態でキット内に存在してもよい。キットはまた、任意に、キットが本発明の方法で使用されることを可能にするための使用説明書、または本方法が使用され得る有機体に関する詳細を含んでもよい。
装置
本発明はまた、標識ポリヌクレオチドなどの標的分析物を特徴づけるための装置を提供する。装置は、本発明の複数の本発明と、複数の膜とを含む。複数のポアは、好ましくは、複数の膜内に存在する。ポア及び膜の数は、好ましくは、等しい。好ましくは、各膜内に単一のポアが存在する。
装置は、好ましくは、本発明の方法を実施するための説明書をさらに含む。装置は、分析物分析のための任意の従来の装置、例えばアレイまたはチップであり得る。本発明の方法に関連して上に論じられる実施形態のいずれも、本発明の装置に同等に適用される。装置は、本発明のキットに存在する特徴のいずれかを含んでもよい。
装置は、好ましくは、本発明の方法を実施するように設定される。
装置は、好ましくは、
複数のポア及び膜を支持することができ、ポア及び膜を使用して分析物の特徴付けを実施するように動作可能であるセンサデバイスと、
特徴付けを実施するための材料の送達のための少なくとも１つのポートと、を含む。
代替的には、装置は、好ましくは、
複数のポア及び膜を支持することができ、ポア及び膜を使用して分析物の特徴付けを実施するように動作可能であるセンサデバイスと、
特徴付けを実施するための材料を保持するための少なくとも１つの貯蔵器と、を含む。
装置は、より好ましくは、
膜ならびに複数のポア及び膜を支持することができ、ポア及び膜を使用して分析物の特徴付けを実施するように動作可能であるセンサデバイスと、
特徴付けを実施するための材料を保持するための少なくとも１つの貯蔵器と、
材料を少なくとも１つの貯蔵器からセンサデバイスへと制御可能に供給するように構成された流体工学システムと、
それぞれの試料を受容するための１つ以上の容器であって、流体工学システムが、試料を１つ以上の容器からセンサデバイスへと選択的に供給するように構成されている、１つ以上の容器と、をさらに含む。
装置は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００７８９号（ＷＯ２０１０／１２２２９３として公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／００２２０６号（ＷＯ２０１１／０６７５５９として公開）、または国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５６７９号（ＷＯ００／２８３１２として公開）に記載されるもののいずれかであり得る。
以下の実施例は、本発明を例証する。
実施例１
この実施例は、ＣｓｇＧ内でのＤＮＡ挙動を調査するために行ったシミュレーションを説明する。
材料及び方法
ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ及び様々な変異体のＤＮＡ転移に対するエネルギー障壁の大きさを調査するために、操舵分子動力学シミュレーションを行った。ＧＲＯＭＡＣＳパッケージバージョン４．０．５を使用し、ＧＲＯＭＯＳ ５３ａ６力場及びＳＰＣ水モデルでシミュレーションを行った。ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ（配列番号２）の構造は、タンパク質データバンク、受託コード４ＵＶ３から取られた。ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ変異体のモデルを作製するために、ＰｙＭＯＬを使用して野生型タンパク質構造を変異させた。研究した変異体は、ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ａ）（変異Ｆ５６Ａを含む配列番号２）、ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ａ−Ｎ５５Ｓ）（変異Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓを含む配列番号２）、及びＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ａ−Ｎ５５Ｓ−Ｙ５１Ａ）（変異Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａを含む配列番号２）であった。
次いで、ＤＮＡをポア内に置いた。２つの異なるシステムを設定した：
ｉ．単一のグアニンヌクレオチドをポア内で、狭窄領域（残基５６環の上に約５〜１０オングストローム）のすぐ上に置いた。
ｉｉ．ＤＮＡの一本鎖（ｓｓＤＮＡ）をポア軸に沿って、５’末端をポアのベータ−バレル側に向けて置いた。この設定において、ｓｓＤＮＡをポアの全長にわたって予め通されていた。
その後、シミュレーションボックスを溶媒和させ、次いで、最急降下アルゴリズムを使用してエネルギーを最小化した。
Ｂｅｒｅｎｄｓｅｎサーモスタット及びＢｅｒｅｎｄｓｅｎバロスタットを３００Ｋまで使用して、各システムをＮＰＴアンサンブル中でシミュレーションした。シミュレーションを通して、ポアの骨格に拘束を適用した。
ポアを通してＤＮＡを引くために、単一グアニンシミュレーションにおいてリン原子に引張力を加えた。ｓｓＤＮＡシミュレーションにおいて、鎖の５’末端でリン原子に引張力を加えた。上記のＤＮＡリン原子と、ポア軸に対して平行に一定速度で移動する仮想点との間のバネを接続することによって、引張力を一定速度で加えた。ばねは、任意の形状を有しず、流体力学的抗力を一切経験しない。ばね定数は、５ｋＪｍｏｌ−１Å−２に等しかった。
結果
単一Ｇ転移
図３に示すように、引張力対時間のプロットは、野生型ＣｓｇＧ−Ｅｃｏポアにおけるフェニルアラニン残基Ｆ５６へのヌクレオチド進入には大きな障壁があることを示す。研究したＣｓｇＧ−Ｅｃｏ変異体について、グアニン転移の顕著な障壁は認められなかった。
ｓｓＤＮＡ転移
ｓｓＤＮＡ転移について、ポア当たり２つのシミュレーションを行い、各ランに、異なる引張速度（１００Å／ｎｓ及び１０Å／ｎｓ）を加えた。より速い引張速度シミュレーションを例証する図４に示すように、ＣｓｇＧ野生型ポアは、ｓｓＤＮＡ転移を可能にするために最も大きい引張力を必要とした。より遅い引張速度シミュレーションを例証する図５に示すように、ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ（野生型、配列番号２）及びＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ａ）ポアはいずれも、ｓｓＤＮＡ転移を可能にするために最も大きい加えられる力を必要とした。ＣｓｇＧ及びＭｓｐＡベースラインポアを通るｓｓＤＮＡ転移に必要とされる引張力は、同様のレベルのｓｓＤＮＡ転移を可能にするためにＣｓｇＧポアの変異が必要とされることを示す。
実施例２
この実施例は、いくつかのＣｓｇＧ変異体の特徴付けを説明する。
材料及び方法
実験を設定する前に、ＤＮＡ構造体Ｘ（最終濃度０．１ｎＭ、構造体Ｘの漫画描写の図１３及び説明を参照されたい）を室温で５分間、Ｔ４ Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃを含む配列番号２４、ナノポアシステムに添加した最終濃度は１０ｎＭであり、これは緩衝液（１５１．５ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、５％グリセロール、ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に提供された）と共に予めインキュベートした。５分後、ＴＭＡＤ（１００μＭ）をプレミックス中に添加し、混合物をさらに５分間インキュベートした。最後に、ＭｇＣｌ２（１．５ｍＭ最終濃度をナノポアシステムに添加）、ＡＴＰ（１．５ｍＭ最終濃度をナノポアシステムに添加）、ＫＣｌ（５００ｍＭ最終濃度をナノポアシステムに添加）、及びリン酸カリウム緩衝液（２５ｍＭ最終濃度をナノポアシステムに添加）をプレミックス中に添加した。
緩衝液（２５ｍＭ Ｋリン酸緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）中でブロックコポリマーに挿入された多様な単一ＣｓｇＧナノポアから電気的測定を得た。ブロックコポリマーに挿入された単一ポアを達成した後に、次いで、緩衝液（２ｍＬ、２５ｍＭ Ｋリン酸緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）をシステムに通して流して任意の余剰ＣｓｇＧナノポアを除去した。次いで、１５０ｕＬの５００ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ Ｋリン酸、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ ＡＴＰをシステムに通して流した。１０分後、１５０ｕＬの５００ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ ＡＴＰ、ｐＨ８．０をシステムに通して流し、次いで、酵素（Ｔ４ Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ、１０ｎＭ最終濃度）、ＤＮＡ構造体Ｘ（０．１ｎＭ最終濃度）、燃料（ＭｇＣｌ２ １．５ｍＭ最終濃度、ＡＴＰ １．５ｍＭ最終濃度）プレミックス（合計１５０μｌ）を次いで、単一ナノポア実験システム内に流した。実験は−１２０ｍＶで行い、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を監視した。
結果
増加した範囲を示すポア（図６〜８及び１８〜３０）
ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））（配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）は、約１０ｐＡの範囲を有する（図６（ａ）を参照されたい）一方、以下のＣｓｇＧ−Ｅｃｏポア変異体は、増加した電流範囲を呈した。
１−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｎ−Ｆ５６Ａ−Ｄ１４９Ｎ−Ｅ１８５Ｒ−Ｅ２０１Ｎ−Ｅ２０３Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｎ／Ｆ５６Ａ／Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）は、約３０ｐＡの範囲を呈した（図６（ｂ）を参照されたい）。
２−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｎ５５Ａ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｎ５５Ａを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）は、約３５ｐＡの範囲を呈した（図６（ｃ）を参照されたい）。
３−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｎ５５Ｓ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｎ５５Ｓを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）は、約４０ｐＡの範囲を呈した（図７（ａ）を参照されたい）。
４−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｎを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）は、約４０ｐＡの範囲を呈した（図７（ｂ）を参照されたい）。
５−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ−Ｆ５６Ａ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ａを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）は、約３０ｐＡの範囲を呈した（図７（ｃ）を参照されたい）。
６−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ−Ｆ５６Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｎを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）は、約２０ｐＡの範囲を呈した（図８（ａ）を参照されたい）。
７−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ−Ｎ５５Ｓ−Ｆ５６Ａ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｆ５６Ａを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）は、約３０ｐＡの範囲を呈した（図８（ｂ）を参照されたい）。
８−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ−Ｎ５５Ｓ−Ｆ５６Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｆ５６Ｎを含む配列番号２、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）は、約３０ｐＡの範囲を呈した（図８（ｃ）を参照されたい）。
１３−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ｈ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｆ５６Ｈを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）は、約３５ｐＡの範囲を呈した（図１８を参照されたい）。
１４−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）は、約４０ｐＡの範囲を呈した（図１９を参照されたい）。
１５−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ｔ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｆ５６Ｔを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）は、約３５ｐＡの範囲を呈した（図２０を参照されたい）。
１６−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｓ５４Ｐ／Ｆ５６Ａ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｓ５４Ｐ／Ｆ５６Ａを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）は、約３５ｐＡの範囲を呈した（図２１を参照されたい）。
１７−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ａ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ａを含む配列番号２であって、ＳｔｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）は、約３０ｐＡの範囲を呈した（図２２を参照されたい）。
１８−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ｐ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｆ５６Ｐを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）は、約３０ｐＡの範囲を呈した（図２３を参照されたい）。
１９−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ａ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｆ５６Ａを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）は、約４０ｐＡの範囲を呈した（図２４を参照されたい）。
２０−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）は、約３０ｐＡの範囲を呈した（図２５を参照されたい）。
２１−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｎ５５Ｓ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｎ５５Ｓ／Ｆ５６Ｑを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）は、約３５ｐＡの範囲を呈した（図２６を参照されたい）。
２２−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｎ５５Ｓ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｔ／Ｎ５５Ｓ／Ｆ５６Ｑを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）は、約３５ｐＡの範囲を呈した（図２７を参照されたい）。
２３−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ｑ／Ｎ１０２Ｒ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｆ５６Ｑ／Ｎ１０２Ｒを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）は、約３０ｐＡの範囲を呈した（図２８を参照されたい）。
２４−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｑ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｑ／Ｆ５６Ｑを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）は、約４０ｐＡの範囲を呈した（図２９を参照されたい）。
２５−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）は、約３５ｐＡの範囲を呈した（図３０を参照されたい）。
増加したスループットを示すポア（図９及び１０）
図９及び１０において見ることができるように、以下の変異体ポア（以下の９〜１２）は、チャネル毎に４時間で複数のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動（図９及び１０においてＸと標識される）を呈した一方、図９（ａ）に示されるＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、かつＣ末端において結合している、配列番号２）は、チャネル毎に４時間で１つまたは２つのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動（図９（ａ）においてＸと標識される）のみを呈し、代わりに延長したブロック領域（図９（ａ）においてＹと標識される）を呈した。
９−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｄ１４９Ｎ−Ｅ１８５Ｎ−Ｅ２０３Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｎを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）（図９（ｂ））
１０−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｄ１４９Ｎ−Ｅ１８５Ｎ−Ｅ２０１Ｎ−Ｅ２０３Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎを含む配列番号２であって、ＳｔｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）（図９（ｃ））
１１−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｄ１４９Ｎ−Ｅ１８５Ｒ−Ｄ１９５Ｎ−Ｅ２０１Ｎ−Ｅ２０３Ｎ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎを含む配列番号２であって、ＳｔｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）（図１０（ａ））
１２−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｄ１４９Ｎ−Ｅ１８５Ｒ−Ｄ１９５Ｎ−Ｅ２０１Ｒ−Ｅ２０３Ｎ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｎを含む配列番号２であって、ＳｔｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）（図１０（ｂ））
増加した挿入を示すポア（図１１及び１２）
１１及び１２を比較することによって見ることができるように、図１２に示される変異体ポアＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｔ１５０Ｉ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｔ１５０Ｉを含む配列番号２であって、ＳｔｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）は、ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））（配列番号２であって、ＳｔｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）ポア（図１１に示される）と比較して増加したポア数（約４〜５倍）で膜内に存在した。図１１及び１２における矢印は、４時間の実験中にブロックコポリマー内に挿入されたＣｓｇＧ−Ｅｃｏナノポアの数を例証した（図１１において１３０〜１４０、図１２において１〜１１、別個のナノポア実験に各々対応する）。ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））（ＳｔｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、かつＣ末端において結合している、配列番号２）の場合、３つの実験が１つのナノポアの挿入を示した一方、変異体ポア（ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｔ１５０Ｉ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９）の場合、各実験は少なくとも１つのナノポアの挿入を示し、いくつかの実験は複数のポア挿入を示した。
実施例３
この実施例は、ＣｓｇＧポアを精製するために開発されたＥ．Ｃｏｌｉ精製法を説明した。
材料及び方法
ポリペプチドＰｒｏ−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））（配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端に結合しており、かつＰｒｏが配列番号４８であり、Ｎ末端に結合している）をコードするＤＮＡをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．において合成し、アンピシリン耐性遺伝子を含有するｐＴ７ベクター内にクローニングした。ｐＴ７ベクターのタンパク質発現を、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘発した。ＤＮＡ溶液の濃度を４００ｎｇ／ｕＬに調節した。ＤＮＡ（１μｌ）を使用してＬｅｍｏ２１（ＤＥ３）コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（５０μｌ、ＮＥＢ、カタログ番号Ｃ２５２８Ｈ）を形質転換させた。形質転換の前に、Ｌｅｍｏ２１（ＤＥ３）細胞（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からＣｓｇＧ遺伝子をノックアウトした。次いで、アンピシリン（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天上に細胞をプレートアウトし、３７℃で約１６時間インキュベートした。
アンピシリンを含有するＬＢプレート上で細菌コロニーを増殖させ、ＣｓｇＧプラスミドを組み込んだ。１つのかかるコロニーを使用して、カルベニシリン（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地（１００ｍＬ）の種菌を植え付けた。ＯＤ６００が１．０〜１．２に達するまで、撹拌を伴って種菌を３７℃で増殖させた。種菌を使用して、カルベニシリン（０．１ｍｇ／ｍＬ）及びラムノース（５００μＭ）を含有する５００ｍＬの新鮮なＬＢ培地を０．１のＯ．Ｄ．６００まで植え付けた。ＯＤ６００が０．６に達するまで、撹拌を伴って培養菌を３７℃で増殖させた。その後、培養菌の温度を１８℃に調節し、ＩＰＴＧ（０．２ｍＭ最終濃度）の添加により誘発を開始した。誘発は、撹拌を伴って１８℃で約１８時間行った。
誘発に続き、培養菌を６，０００ｇで３０分間、遠心分離により造粒した。プロテアーゼ阻害剤（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ５３９１３８）、ベンゾナーゼヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｅ１０１４）、及び１Ｘバグバスター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ７０９２１）ｐＨ８．０（小粒１グラム当たり約１０ｍＬの緩衝液）を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ中に小粒を再懸濁させた。懸濁液を、十分に均質になるまでしっかりと混合し、その後、試料を４℃で約５時間ローラーミキサーに移した。可溶化液を２０，０００ｇで４５分間、遠心分離により造粒し、０．２２μＭ ＰＥＳシリンジフィルターを通して上清を濾過した。ＣｓｇＧ（試料１として知られる）を含有した上清をカラムクロマトグラフィーによる精製のために進めた。
試料１を、５ｍＬ Ｓｔｒｅｐ Ｔｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。１０カラム容量の安定したベースラインが維持されるまで、カラムを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ ＤＤＭ（ｐＨ８）で洗浄した。次いで、１５０ｍＭ緩衝液に戻す前に、カラムを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、２Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ ＤＤＭ（ｐＨ８）で洗浄した。１０ ｍＭデスチオビオチンを用いて溶出を行った。ＣｓｇＧタンパク質のＳｔｒｅｐ ｔｒａｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）精製のクロマトグラフィーのトレースの例を図１４に示す。溶出ピークは、Ｅ１と標識されている。図１５は、初期Ｓｔｒｅｐ精製後のＣｓｇＧ−Ｅｃｏタンパク質の典型的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ視覚化の例を示す。レーン１〜３は、矢印で示されるようにＣｓｇＧタンパク質を含有した主溶出ピーク（図１４でＥ１と標識された）を示す。レーン４〜６は、汚染物質を含有した主溶出ピーク（図１４でＥ１と標識された）のテールの溶出分画に対応した。
溶出ピークをプールし、６５℃で１５分間加熱して、熱不安定性不純タンパク質を除去した。加熱した溶液を２０，０００ｇで１０分間、遠心分離に供し、小粒を破棄した。上清を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ ＤＤＭ、０．１％ ＳＤＳ（ｐＨ８）中、１２０ｍＬ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｓ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でゲル濾過に供した。タンパク質の低トリプトファン成分に起因して、２２０ｎＭで監視を実施した。試料を約５５ｍＬ容量で溶出した（図１６は、サイズ排除カラムのトレースを示し、５５ｍＬ試料のピークは星で標識されている）。溶出ピークを４−２０％ ＴＧＸ（図１７を参照されたい、Ｂｉｏ Ｒａｄ）上で運転して、目的のポアＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））（配列番号２であって、ＳｔｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）の存在を確認した。識別した分画をプールし、５０ｋＤ Ａｍｉｃｏｎスピンカラムによって濃縮した。
実施例４
この実施例は、ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端ポア変異体Ｎｏ．２０において結合している）と、Ｔ４ Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ）（Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ変異、次いで（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２を含む配列番号２４）との相互作用を調査するために行ったシミュレーションを説明する。
シミュレーション方法
ＧＲＯＭＡＣＳパッケージバージョン４．０．５を使用し、ＧＲＯＭＯＳ ５３ａ６力場及びＳＰＣ水モデルでシミュレーションを行った。
ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端ポア変異体Ｎｏ．２０に結合している）モデルは、タンパク質データバンク、受託コード４ＵＶ３及び４Ｑ７９において見出されたＣｓｇＧの結晶構造に基づいた。関連する変異は、ＰｙＭＯＬを使用して作製した。次いで、最急降下アルゴリズムを使用して得られたポアモデルのエネルギーを最小化した。Ｔ４ Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ）（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ、次いで（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２を含む配列番号２４）モデルは、タンパク質データバンク、受託コード３ＵＰＵにおいて見出されたＤｄａ１９９３構造に基づいた。再び、ＰｙＭＯＬを使用して関連する変異を作製し、最急降下アルゴリズムを使用してモデルのエネルギーを最小化した。
その後、Ｔ４ Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ）（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ、次いで（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２を含む配列番号２４）モデルをＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端ポア変異体Ｎｏ．２０に結合している）の上に置いた。異なる初期酵素立体構造を用いて３つのシミュレーションを行った（ラン１〜３（０ｎｓ）、図３１を参照されたい）：
全ての酵素立体構造において、ＤＮＡの５’末端がポアに向くように酵素を配向し、酵素はシミュレーションを通して拘束しなかった。ポア骨格を拘束し、シミュレーションボックスを溶媒和させた。Ｂｅｒｅｎｄｓｅｎサーモスタット及びＢｅｒｅｎｄｓｅｎバロスタットを３００Ｋまで使用して、システムをＮＰＴアンサンブル中で４０ｎｓシミュレーションした。
ＧＲＯＭＡＣＳ分析ソフトウェア及びローカルに書かれたコードの両方を使用して、酵素とポアとの間の接触を分析した。以下の表は、ポア及び酵素アミノ酸の両方について認められた接触数を示す。表６〜８は、酵素上のアミノ酸接触点と相互作用するポア上のアミノ酸接触点を示す。３つのシミュレーションのうちの２つにおいて、酵素は、ポアの頂点で傾く（ラン２及び３（２０、３０、及び４０ｎｓ）、図３１及び３２）。ラン１は、酵素が傾かず、そのため表６において高い相互作用を有することが示される点は、ポアキャップ上の酵素安定性を増加させるために最適化され得る。
実施例５
この実施例は、ａ）ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端ポア変異体Ｎｏ．２５において結合している）とＴ４ Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ）（変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ、次いで（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２を含む配列番号２４）との相互作用、及びｂ） ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端ポア変異体Ｎｏ．２６において結合している）とＴ４ Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ）（変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ、次いで（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２を含む配列番号２４）との相互作用を調査するために行ったシミュレーションを説明する。
シミュレーション方法
実施例４に記載したようにシミュレーションを行った。
ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端ポア変異体Ｎｏ．２５に結合している）及びＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端ポア変異体Ｎｏ．２６に結合している）モデルは、タンパク質データバンク、受託コード４ＵＶ３及び４Ｑ７９において見出されたＣｓｇＧの結晶構造に基づいた。関連する変異は、ＰｙＭＯＬを使用して作製した。次いで、最急降下アルゴリズムを使用して得られたポアモデルのエネルギーを最小化した。
Ｔ４ Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ）（変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ、次いで（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２を含む配列番号２４）モデルは、タンパク質データバンク、受託コード３ＵＰＵにおいて見出されたＤｄａ１９９３構造に基づいた。再び、ＰｙＭＯＬを使用して関連する変異を作製し、最急降下アルゴリズムを使用してモデルのエネルギーを最小化した。
その後、Ｔ４ Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ）（変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ、次いで（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２を含む配列番号２４）モデルを、変異体ポア２５及び２６の上に置いた。
シミュレーションにおいて、ＤＮＡの５’末端がポアに向くように酵素を配向し、酵素はシミュレーションを通して拘束しなかった。調査した変異体ポアの各々について、２つのシミュレーションを行った。第１のシミュレーションでは、ポア骨格を拘束し、シミュレーションボックスを溶媒和させ、第２のシミュレーションでは、キャップ領域を除いてポア骨格を拘束し、シミュレーションボックスを溶媒和させた。Ｂｅｒｅｎｄｓｅｎサーモスタット及びＢｅｒｅｎｄｓｅｎバロスタットを３００Ｋまで使用して、システムをＮＰＴアンサンブル中で４０ｎｓシミュレーションした。
ＧＲＯＭＡＣＳ分析ソフトウェア及びローカルに書かれたコードの両方を使用して、酵素とポアとの間の接触を分析した。以下の表は、ポア及び酵素アミノ酸の両方について認められた接触数（変異体２５及び２６について、Ｔ４ Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ）との接触）を示す。表９（ポア骨格が拘束されている）及び表１０（ポア骨格が拘束され、キャップ領域は拘束されていない）は、ポア変異体２５上のアミノ酸接触点、及びそれらが酵素（Ｔ４ Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ））と接触する数を示す。表１１（ポア骨格が拘束されている）及び表１２（ポア骨格が拘束され、キャップ領域は拘束されていない）は、酵素（Ｔ４ Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ））上のアミノ酸接触点と相互作用するポア変異体２５（ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑを含む配列番号２であって、ＳｔｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）上のアミノ酸接触点を示す。表１３（ポア骨格が拘束されている）及び表１４（ポア骨格が拘束され、キャップ領域は拘束されていない）は、ポア変異体２６上のアミノ酸接触点、及びそれらが酵素（Ｔ４ Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ））と接触する数を示す。表１５（ポア骨格が拘束されている）及び表１６（ポア骨格が拘束され、キャップ領域は拘束されていない）は、酵素（Ｔ４ Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ））上のアミノ酸接触点と相互作用するポア変異体２６（ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）上のアミノ酸接触点を示す。図３３は、ポア変異体２６及びＴ４ Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ）の初期スナップショットを示す。
実施例６
この実施例は、改善された特徴付け精度を示すいくつかのＣｓｇＧ変異体の特徴付けを説明する。
材料及び方法
この実施例に使用した材料及び方法は、実施例２について上に記載されるものと同じである。移動を制御するために使用した酵素は、酵素１＝Ｔ４ Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃを含む配列番号２４）または酵素２＝Ｔ４ Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃを含む配列番号２４）のいずれかであった。
国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２３４３号（ＷＯ／２０１３／０４１８７８として公開）に開示される方法を使用して、１Ｄ精度特徴付け測定値を計算した。
結果
Ｔ４ Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０ＣによりＤＮＡ転移が制御されたＭｓｐＡ変異体×＝ＭｓｐＡ−（（Ｄｅｌ−Ｌ７４／Ｇ７５／Ｄ１１８／Ｌ１１９）Ｄ５６Ｆ／Ｅ５９Ｒ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋ）８（変異Ｄ５６Ｆ／Ｅ５９Ｒ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋ、及びアミノ酸Ｌ７４／Ｇ７５／Ｄ１１８／Ｌ１１９の欠失を含む配列番号５０）の１Ｄベースコール特徴付け精度は６８．７％であった。試験した変異体の全て（以下の表１７を参照されたい）は、ＭｓｐＡ変異体Ｘと比較して改善された１Ｄベースコール特徴付け精度を示した。
２７−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｑを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
２８−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
２９−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ１３５Ｌ／Ｔ１５０Ｉ／Ｓ２０８Ｖ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ１３５Ｌ／Ｔ１５０Ｉ／Ｓ２０８Ｖを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
３０−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｔ１５０Ｉ／Ｓ２０８Ｖ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｔ１５０Ｉ／Ｓ２０８Ｖを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
３１−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｓ２０８Ｖ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｓ２０８Ｖを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
３２−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｔ１５０Ｉ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｔ１５０Ｉを含む配列番号２であって、ＳｔｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
３３−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ１３５Ｖ／Ｔ１５０Ｙ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ１３５Ｖ／Ｔ１５０Ｙを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
３４−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ１３５Ｌ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ１３５Ｌを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
３５−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｆ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｆ／Ｒ１９２Ｄを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
３６−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ１３５Ｌ／Ｔ１５０Ｉ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ１３５Ｌ／Ｔ１５０Ｉを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
３７−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（（Ｄｅｌ−Ｄ１９５／Ｙ１９６／Ｑ１９７／Ｒ１９８／Ｌ１９９）−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合しており、及びアミノ酸Ｄ１９５／Ｙ１９６／Ｑ１９７／Ｒ１９８／Ｌ１９９の欠失）
３８−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（（Ｄｅｌ−Ｒ１９２／Ｆ１９３／Ｉ１９４／Ｄ１９５／Ｙ１９６／Ｑ１９７／Ｒ１９８／Ｌ１９９／Ｌ２００）−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合しており、及びアミノ酸Ｒ１９２／Ｆ１９３／Ｉ１９４／Ｄ１９５／Ｙ１９６／Ｑ１９７／Ｒ１９８／Ｌ１９９／Ｌ２００の欠失）
３９−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（（Ｄｅｌ−Ｑ１９７／Ｒ１９８／Ｌ１９９／Ｌ２００）−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合しており、及びアミノ酸Ｑ１９７／Ｒ１９８／Ｌ１９９／Ｌ２００の欠失）
４０−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（（Ｄｅｌ−Ｉ１９４／Ｄ１９５／Ｙ１９６／Ｑ１９７／Ｒ１９８／Ｌ１９９）−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合しており、及びアミノ酸Ｉ１９４／Ｄ１９５／Ｙ１９６／Ｑ１９７／Ｒ１９８／Ｌ１９９の欠失）
４１−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（（Ｄｅｌ−Ｖ１３９／Ｇ１４０／Ｄ１４９／Ｔ１５０／Ｖ１８６／Ｑ１８７／Ｖ２０４／Ｇ２０５）−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合しており、及びアミノ酸Ｖ１３９／Ｇ１４０／Ｄ１４９／Ｔ１５０／Ｖ１８６／Ｑ１８７／Ｖ２０４／Ｇ２０５の欠失）
４２−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（（Ｄｅｌ−Ｄ１９５／Ｙ１９６／Ｑ１９７／Ｒ１９８／Ｌ１９９／Ｌ２００）−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合しており、及びアミノ酸Ｄ１９５／Ｙ１９６／Ｑ１９７／Ｒ１９８／Ｌ１９９／Ｌ２００の欠失）
４３−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（（Ｄｅｌ−Ｙ１９６／Ｑ１９７／Ｒ１９８／Ｌ１９９／Ｌ２００／Ｅ２０１）−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合しており、及びアミノ酸Ｙ１９６／Ｑ１９７／Ｒ１９８／Ｌ１９９／Ｌ２００／Ｅ２０１の欠失）
４４−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（（Ｄｅｌ−Ｑ１９７／Ｒ１９８／Ｌ１９９）−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合しており、及びアミノ酸Ｑ１９７／Ｒ１９８／Ｌ１９９の欠失）
４５−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（（Ｄｅｌ−Ｆ１９３／Ｉ１９４／Ｄ１９５／Ｙ１９６／Ｑ１９７／Ｒ１９８／Ｌ１９９）−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合しており、及びアミノ酸Ｆ１９３／Ｉ１９４／Ｄ１９５／Ｙ１９６／Ｑ１９７／Ｒ１９８／Ｌ１９９の欠失）
４６−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１９２Ｔ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１９２Ｔを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
４７−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ１０２Ｓ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ１０２Ｓを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
４８−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ４２Ｒ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ４２Ｒを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
４９−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１９２Ｓ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１９２Ｓを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
５０−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｇ１０３Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｇ１０３Ｎを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
５１−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｎ／Ｎ１０２Ｒ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｎ／Ｎ１０２Ｒを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
５２−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｌ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｌを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
５３−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１９２Ｄを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
５４−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｎ／Ｎ１０２Ｇ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｎ／Ｎ１０２Ｇを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
５５−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｆ４８Ｓ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｆ４８Ｓを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
５６−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｇ１０３Ｓ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｇ１０３Ｓを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
５７−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１０１Ｌ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１０１Ｌを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
５８−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１９２Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１９２Ｑを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
５９−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ１３５Ｎ／Ｒ１４２Ｎ／Ｒ１９２Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ１３５Ｎ／Ｒ１４２Ｎ／Ｒ１９２Ｎを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
６０−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｎを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
６１−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１９２Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１９２Ｎを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
６２−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｙ１３０Ｗ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｙ１３０Ｗを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
６３−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１０１Ｇ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１０１Ｇを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）
実施例７
この実施例は、いくつかの異なる変異体ナノポアのＤＮＡ捕捉を比較する。
材料及び方法
緩衝液（２５ｍＭ Ｋリン酸緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）中でブロックコポリマーに挿入された多様な単一ＣｓｇＧまたはＭｓｐＡナノポアから電気的測定を得た。ブロックコポリマーに挿入された単一ポアを達成した後に、次いで、緩衝液（２ｍＬ、２５ｍＭ Ｋリン酸緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）をシステムに通して流して任意の余剰ナノポアを除去した。次いで、１５０ｕＬの５００ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ Ｋリン酸、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ ＡＴＰをシステムに通して流した。１０分後、１５０ｕＬのＤＮＡ（配列番号５１、２００ｎＭ）を次いで、単一ナノポア実験システム内に流した。実験は−１２０ｍＶで行い、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を監視した。
結果
ＣｓｇＧ変異体ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｅ１０１Ｓ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｅ１０１Ｓ／Ｒ１９２Ｄを含む配列番号２であって、ＳｔｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）（図３６を参照されたい）は、ＭｓｐＡ−（（Ｄｅｌ−Ｌ７４／Ｇ７５／Ｄ１１８／Ｌ１１９）Ｄ５６Ｆ／Ｅ５９Ｒ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋ）８（図３４を参照されたい）よりも高い捕捉率を示す（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドをより容易に捕捉する）。電流トレースにおける各スパイクは、酵素に制御されることなくナノポアを通るＤＮＡポリヌクレオチド（配列番号５１）の転移に対応する。図３４における１０秒間の電流トレースは、ＣｓｇＧナノポア−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｅ１０１Ｓ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９についての１０秒間の電流トレースよりも少ないＤＮＡ転移を示す。
Ｅ１０１位のＥ１０１Ｓへの変異は、Ｅ１０１Ｓ変異を含まないＣｓｇＧ変異体と比較して、捕捉率の増加をもたらした。図３５は、ＣｓｇＧ変異体ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄを含む配列番号２であって、ＳｔｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４７であり、Ｃ末端において結合している）についての１０秒間の電流トレースが、ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｅ１０１Ｓ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９よりも少ない転移を呈したことを示す。ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９の転移の平均数は、１秒当たり７．２５であり（ｎ＝１２）、ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｅ１０１Ｓ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９の転移の平均数は、１秒当たり１８（ｎ＝１４）であった。
実施例８
この実施例は、２つの異なるＣｓｇＧ変異体ポアの発現レベルを比較する。
材料及び方法
この実施例においてナノポア（Ａ＝ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）は、配列番号４７であり、Ｃ末端に結合している）及びＢ＝ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）は、配列番号４７であり、Ｃ末端に結合している））を作製するために使用した材料及び方法は、実施例３について上に記載されたものと同じである。
結果
２つのナノポア（Ａ＝ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）は、配列番号４７であり、Ｃ末端に結合している）及びＢ＝ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄを含む配列番号２であって、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）は、配列番号４７であり、Ｃ末端に結合している））を、全く同じプロトコルを使用して発現及び精製し、同じ容量の各ナノポアを、ゲル濾過クロマトグラム（１２０ｍＬ Ｓ２００カラム、図３７を参照されたい）及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図３８を参照されたい）を使用して分析した。Ｂの吸光値（４７０．３ｍＡｕ）は、Ａ（１１．４ｍＡｕ）よりもはるかに高く、これは、ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９が、ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９よりもはるかに高いレベルで発現したことを示す。図３８におけるバンドの強度も、２つのポアの発現レベルを示す。バンドＡ〜Ｃ（ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９を含有する）は、バンドＤ〜Ｅ（ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９を含有する）よりも強度が低かった。２つの分析方法はいずれも、Ｒ１９２Ｄ変異の付加が、ＣｓｇＧ変異体の認められる発現を大きく増加させたことを示した。
実施例９
この実施例は、改善された特徴付け精度を示すいくつかのＣｓｇＧ変異体の特徴付けを説明する。
材料及び方法
ＣｓＧポア
以下の８個のＣｓｇＧ変異体ポアを試験した。上記の実施例Ｘに記載された変異体２８をベースラインポアとして使用した。配列番号２において変異を作製し、精製タグＳｔｒｅｐＩＩは、配列番号４７に示される配列を有する。
ナノポア調製
各々に単一のＣｓｇＧ変異体ナノポアが挿入されたブロックコポリマー膜の複数のウェルを含有するナノポアアレイチップを調製するために、以下の方法を使用した。Ｅ．ｃｏｌｉ中に発現されたＣｓｇＧ変異体を精製し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ ＤＤＭ、０．１％ ＳＤＳ、０．１％ Ｂｒｉｊ ５８（ｐＨ８）を含有する緩衝液中に保管した。２５ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）（ｐＨ８．０）を含む緩衝液を使用して、これらの変異体ＣｓｇＧポアを１００万分の１に希釈し、チップに添加してウェルの各々において単一のポアを得た。ポア挿入後、２５ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）（ｐＨ８．０）を含む１ｍＬ緩衝液でアレイチップを洗浄して、余剰ポアを除去した。数分後、４７０ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１１ｍＭ ＡＴＰ、及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する５００ｍＬのシークエンシングミックスで各チップを２回流した。
ＤＮＡ試料調製
以下の方法を使用してシークエンシングのためにＤＮＡ試料を調製した。１ μｇのＤＮＡ分析物を、アダプターに予め結合したＴ４ Ｄｄヘリカーゼ酵素及び平滑末端ＴＡリガーゼを含有する４０ｎＭのアダプターミックスと共に１０分間インキュベートした（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｔｏｒｅ．ｎａｎｏｐｏｒｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ／から入手可能）。アダプターの構造は図４３に示され、アダプター中に含まれる配列は、配列番号５２〜５５に記載される。次いで、ライゲーション混合物を精製して、ライゲーションされていない遊離アダプターを、Ｓｐｒｉ精製を使用して除去した。ライゲーションされた最終混合物を、４０ｍＭ ＣＡＰＳ（ｐＨ１０）、４０ｍＭ Ｋｃｌ、及び４００ｎＭコレステロールテザーを含有する２５μｌ溶出緩衝液中に溶出した。各チップについて、１２μｌのＤＮＡ−アダプターのライゲーションされたミックスを、シークエンシングミックス（１５０μｌの最終容量）と混合し、シークエンシングのためにチップに添加した。その後、実験を１６０ｍＶで６時間行った。
ＷＯ／２０１３／０４１８７８に開示される方法を使用して、１Ｄ精度特徴付け測定値を計算した。
鋳型速度の測定
鋳型速度を以下の方法によって測定した。各くねった線を参照配列と整列させた。アラインメントにわたる塩基の数（アラインメント開始位置からアラインメント終了位置を引く）を、アラインメントの終了に対応する事象と、アラインメントの開始に対応する事象との間の時間で割った。
結果
ベースコール精度
図３９に示すように、８個のＣｓｇＧ変異体ポアの全てが、実施例６に記載されるベースラインポアである変異体２８（ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ）９）と比較して改善したベースコール精度を有することが見出された。表１７に示すように、変異体２８は、実施例５に記載される変異体２５（ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ）９）がベースライン変異体であった実施例６で試験された全てのＣｓｇＧ変異体の中で最も高いベースライン精度（８０．２％）を示した。したがって、Ｄ１９５−Ｌ１９９、Ｆ１９３−Ｌ１９９、もしくはＶ１０５−Ｉ１０７の欠失、またはＦ１９１Ｔの置換は、変異体２８におけるＲ９７Ｗ及びＲ１９２Ｄ置換によってもたらされる精度の改善に加え、さらなる精度の改善をもたらす。
Ｄ１９５〜Ｌ１９９、Ｆ１９３〜Ｌ１９９、もしくはＶ１０５〜Ｉ１０７の欠失、またはＦ１９１Ｔの置換の各々もまた、ＣｓｇＧ配列における他の変異の存在下で、またはＲ９７Ｗ、Ｒ１９２Ｄ、Ｙ５１Ａ、及び／もしくはＦ５６Ｑ変異の不在下で精度を改善することが予想される。例えば、ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）変異に加えて変異Ｋ９４Ｑを含有する変異体Ｅは、変異体２８と比較して改善した精度を有し、Ｒ９７Ｗを含有しないが、代わりにＲ９３Ｗ置換を含有するｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）含有変異体Ｇも同様である。
実施例２６における表１７は、Ｒ９７Ｗ置換を含有する変異体２６が、変異体２８（８０．２％）にほぼ劣らないベースコール精度（７９．２％）を有することを示す。これは、Ｒ９７Ｗ変異が、増加したベースコール精度の基礎となっていることを示す。この実施例において、Ｒ９７Ｗ変異を含有しない（かつＲ１９２Ｄ変異も含有しない）２つの変異体であって、代わりに
Ｒ９３Ｗ置換を含有する（変異体Ｆ）か、またはＲ９３Ｙ置換及びＲ９７Ｙ置換の両方を含有する（変異体Ｈ）２つの変異体を試験し、それらは変異体２８よりも高いベースコール精度を有することが見出された。これは、Ｒ９３Ｗ及びＲ９３Ｙ／Ｒ９７Ｙ置換を使用して、ＣｓｇＧナノポアのベースコール精度を改善させることができることを示す。
鋳型速度及び鋳型精度
図４０Ａに示すように、変異体Ｄ（ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）−ＳｔｒｅｐＩＩ）９）は、ベースライン変異体２８ ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ）９と比較して、速度群の密になった分布を有する。
図４０Ｂは、変異体Ｄ（ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）−ＳｔｒｅｐＩＩ）９）が、ベースライン変異体２８ ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ）９と比較して、鋳型精度の密になった分布を示す。
データにおける変動が少ないため、密になった速度及び精度分布を有することは有利である。また、データの精度中央値は、生成されるより低い精度のデータの量を低減することによって増加することになる。したがって、ＣｓｇＧナノポアのＶ１０５〜Ｉ１０７からのアミノ酸の欠失を使用して、ポリヌクレオチドを特徴付けるための改善した特性を有するＣｓｇＧナノポアを生成することができる。
実施例１０
この実施例は、ノイズの多いポアシグナルの低減を示すＣｓｇＧ変異体の特徴付けを説明する。
材料及び方法
ＣｓＧポア
以下のＣｓｇＧ変異体ポアを試験した。上記の実施例Ｘに記載された変異体２８をベースラインポアとして使用した。配列番号２において変異を作製し、精製タグＳｔｒｅｐＩＩは、配列番号４７に示される配列を有する。
ナノポア調製
実施例９に記載されるように、各々に単一のＣｓｇＧ変異体ナノポアが挿入されたブロックコポリマー膜の複数のウェルを含有するチップを調製した。
ＤＮＡ試料調製
実施例９に記載される方法を使用してシークエンシングのためにＤＮＡ試料を調製した。
ノイズの多いポア状態での経過時間の判定
ノイズの多いポア状態での経過時間の割合を以下のように計算した。各チャネル内の事象検出シグナルを、非重複短ウィンドウに分割した。各ウィンドウについて、電流レベル及び電流レベルの分散の平均を計算した。次いで、ウィンドウがノイズの多いシグナルを含有するかどうかを表示する標識を返す分類器に得られた値を通した。分類器は、予め標識されたデータをそれに提供することによってノイズの多いシグナルを検出するように訓練された。
結果
ノイズの多いポア状態
図４１は、ベースライン変異体２８ ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ）９によって呈される「ノイズの多い」ポアエラーモードを示す例示的な「くねった線」を表示する。図４１の上のパネルは、「良好な」ポア状態の間及び「ノイズの多い」ポア状態の間の、ポアを通る電流の流れの差を示す。図４１の下のパネルは、「良好な」状態から「ノイズの多い」状態への移行の拡大図を示す。
図４２は、少なくとも５回の泳動の平均を取った、ベースライン変異体２８と比較した場合の、変異体Ｉ及び変異体Ｊのノイズの多い状態の低減を示す。
変異体Ｊ及び変異体Ｉの両方によるノイズの多いポア状態での経過時間の割合は、ベースラインと比較して著しく低減されている。変異体Ｉ及びＪは、ベースラインとして使用された変異体２８と、１つの残基においてのみ異なる。変異体Ｉ及び変異体Ｊはいずれも、Ｋ９４の置換を含有する。変異体Ｉは、Ｋ９４Ｎ変異を含有し、変異体ＩＩは、Ｋ９４Ｑ変異を含有する。したがって、ＣｓｇＧナノポアにおけるＫ９４の置換、特にＮまたはＱでの置換を使用して、ポリヌクレオチドを特徴付けるための改善した特性を有するＣｓｇＧナノポアを生成することができる。
実施例１１
この実施例は、改善した捕捉活性を示すいくつかのＣｓｇＧ変異体の特徴付けを説明する。
材料及び方法
ＣｓＧポア
以下のＣｓｇＧ変異体ポアを試験した。上記の実施例９に記載された変異体Ｅをベースラインポアとして使用した。配列番号２において変異を作製し、精製タグＳｔｒｅｐＩＩは、配列番号４７に示される配列を有する。
ナノポア調製
各々に単一のＣｓｇＧ変異体ナノポアが挿入されたブロックコポリマー膜の複数のウェルを含有するナノポアアレイチップを調製するために、以下の方法を使用した。Ｅ．ｃｏｌｉ中に発現されたＣｓｇＧ変異体を精製し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ ＤＤＭ、０．１％ ＳＤＳ、０．１％ Ｂｒｉｊ ５８（ｐＨ８）を含有する緩衝液中に保管した。２５ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）（ｐＨ８．０）を含む緩衝液を使用して、これらの変異体ＣｓｇＧポアを１００万分の１に希釈し、チップに添加してウェルの各々において単一のポアを得た。ポア挿入後、２５ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）（ｐＨ８．０）を含む１ｍＬ緩衝液でアレイチップを洗浄して、余剰ポアを除去した。２５ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）（ｐＨ８．０）中、２４０ｎＭ ＴＢＡ分析物を含有する１ｍＬの溶液をチップ内に流した。
捕捉活性の判定
トロンビン結合アプタマー（ＴＢＡ）（配列番号５１）を捕捉するその能力により、ＤＮＡ分析物を捕捉する変異体ポアの能力を評価した。実験を１８０ｍＶで行った。ポアによるＴＢＡ捕捉を測定するために、ＴＢＡ事象間の時間の中央値を計算した。
結果
図４４に示すように、１３個の変異体のＴＢＡ事象間の時間の中央値は、ベースラインと比較して著しく低減され、これは、１３個の変異体の全てが増加した鋳型ＤＮＡ捕捉率を呈することを示す。
１３個の変異体の各々は、ベースラインポアと比較して単一のアミノ酸置換を有した。個々の置換は、Ｑ４２Ｋ、Ｅ４４Ｎ、Ｅ４４Ｑ、Ｌ９０Ｒ、Ｎ９１Ｒ、Ｉ９５Ｒ、Ａ９９Ｒ、Ｅ１０１Ｈ、Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｎ、Ｅ１０１Ｑ、Ｅ１０１Ｔ、及びＱ１１４Ｋであった。これらの変異は全て、負に荷電したアミノ酸の、荷電していないアミノ酸または正に荷電したアミノ酸による置換、または荷電していないアミノ酸の、正に荷電したアミノ酸による置換を伴う。したがって、Ｑ４２位、Ｅ４４位、Ｅ４４位、Ｌ９０位、Ｎ９１位、Ｉ９５位、Ａ９９位、Ｅ１０１位、及びＱ１１４位のうちの１つ以上におけるアミノ酸の、負電荷を除去するか、または正電荷を増加させるアミノ酸によるこれらの位置における置換は、ポリヌクレオチドの増加した捕捉をもたらすと結論付けることができる。
様々なＣｓｇＧ相同体の配列アラインメント
図４５は、上に詳述される２１個のＣｓｇＧ相同体間の配列アラインメントを示す。配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、及び配列番号４１上で複数の配列アラインメントを行った。
相同性拡張及び二次構造情報を統合する複数の配列アラインメントツールボックスであるＰｒａｌｉｎｅソフトウェアを使用して、アラインメントを実施したｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｂｉ．ｖｕ．ｎｌ／ｐｒｏｇｒａｍｓ／ｐｒａｌｉｎｅｗｗｗ／、Ｓｉｍｏｓｓｉｓ ＶＡ１，Ｈｅｒｉｎｇａ Ｊ．；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００５ Ｊｕｌ １；３３（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ２８９−９４も参照されたい。ＢＬＯＳＵＭ６２残基交換マトリックスを使用してアラインメントをスコア化した。この方法の詳細については、例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ Ｓ，Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＪＧ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．８９，ｐｐ．１０９１５−１０９１９，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９２を参照されたい。１２及び１のギャップオープニング及びエクステンションペナルティをそれぞれ使用した。ＰＳＩＰＲＥＤを使用した二次構造推測を使用して、アラインメントをガイドした。この方法の詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ Ｄ．Ｔ．；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９９ Ｓｅｐ １７；２９２（２）：１９５−２０２を参照されたい。配列を整列させるために使用される上記の方法は例示的であり、当該技術分野で既知の他の配列アラインメント方法を使用してもよい。
図４５の配列アラインメントを参照すると、配列アラインメントの各区画各位置における保存は、ヒストグラム及びスコアによって示されている。スケール上の数字０〜９は、増加する保存を示し、保存されるアミノと類似する特性をもたらす変異を有する柱はプラス（「＋」）でマークされ、星印（「＊」）は、その位置における１００％の配列同一性を示す。残基の多くが、非常に高いか、またはさらに完全な配列同一性を示すことを配列アラインメントの保存値から見ることができ、これは、これらの２１個の相同体が密接に関連していることを示す。
図４６は、推測されるアルファヘリックス二次構造領域がさらに灰色に網掛けされた、図４５と同じ相対的な配列アラインメントを示す。図４７は、推測されるベータシート二次構造領域がさらに灰色に網掛けされた、図４５と同じ相対的な配列アラインメントを示す。図４６及び４７は、ＣｓｇＧナノポアの重要な二次構造である、これらの相同体の推測されるアルファヘリックス及びベータシートの領域が、高度に保存されていることを示す。
複数の配列アラインメントは、配列が関連していることを強く示し、アラインメントに沿って高度の保存が存在するだけでなく、推測される二次構造要素も整列されている。
図４５、４６、及び４７における配列アラインメントは、互いに整列する相対的位置を示す参照として使用され得る。したがって、配列番号２に対して同定されたアミノ酸残基、及び他のＣｓｇＧ相同体における対応するアミノ酸残基を同定することができる。同定を容易にするために、残基Ｒ９７及びＲ１９２の位置がアスタリスクで示されている。例えば、配列番号２のＲ１９２が配列番号３２の残基Ｒ１９１及び配列番号３７の残基Ｋ１７７に対応することを表から見ることができる。
図４５〜４７を参照して容易に理解されるように、ＣｓｇＧモノマーは高度に保存されている。さらに、配列番号２に関連する変異の知識から、配列番号２のもの以外のＣｓｇＧモノマーの変異の同等の位置を判定することができる。
したがって、特許請求の範囲及び本明細書中の他の箇所に記載される、配列番号２に示される配列のバリアント及びその特異的アミノ酸変異を含む変異体ＣｓｇＧモノマーは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、及び配列番号４１に示される配列のバリアント、ならびにそれらの対応するアミノ酸変異を含む変異体ＣｓｇＧモノマーも包含する。同様に、特許請求の範囲及び本明細書中の他の箇所に記載される、配列番号２に示される配列のバリアント及びその特異的アミノ酸変異を含む変異体ＣｓｇＧモノマーに関連する、構造体、ポア、またはポアの使用を伴う方法は、上に開示される配列番号による配列のバリアント及びそれらの対応するアミノ酸変異を含む変異体ＣｓｇＧモノマーに関連する構造体、ポア、または方法も包含する。本発明が、本明細書に明確に特定されていない、高度に保存された領域を示す他のバリアントＣｓｇＧモノマーに及ぶことがさらに理解されるであろう場合。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．Ｒ９７Ｗ；Ｒ９３Ｗ；Ｒ９３Ｙ及びＲ９７Ｙ；Ｆ１９１Ｔ；Ｖ１０５、Ａ１０６、及びＩ１０７の欠失；ならびに／またはＲ１９２位、Ｆ１９３位、Ｉ１９４位、Ｄ１９５位、Ｙ１９６位、Ｑ１９７位、Ｒ１９８位、Ｌ１９９位、Ｌ２００位、及びＥ２０１位のうちの１つ以上の欠失を含む、配列番号２に示される配列のバリアントを含む、変異体ＣｓｇＧモノマー。
２．前記バリアントが、Ｒ９７Ｗを含む、上記１に記載の変異体ＣｓｇＧモノマー。
３．Ｆ１９３、Ｉ１９４、Ｄ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、及びＬ１９９の欠失、またはＤ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、及びＬ１９９の欠失を含む、上記３または４に記載の変異体ＣｓｇＧモノマー。
３．前記バリアントが、（ｉ）以下の位置、Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｒ９７、Ｅ１０１、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｔ１５０、及びＲ１９２における１つ以上の変異、（ｉｉ）Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６、またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異、（ｉｉｉ）Ｑ４２ＲまたはＱ４２Ｋ、（ｉｖ）Ｋ４９ＲまたはＫ９４Ｑ、（ｖ）Ｎ１０２Ｒ、Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１０２Ｙ、またはＮ１０２Ｗ、（ｖｉ）Ｄ１４９Ｎ、Ｄ１４９Ｑ、またはＤ１４９Ｒ、（ｖｉｉ）Ｅ１８５Ｎ、Ｅ１８５Ｑ、またはＥ１８５Ｒ、（ｖｉｉｉ）Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１９５Ｑ、またはＤ１９５Ｒ、（ｉｘ）Ｅ２０１Ｎ、Ｅ２０１Ｑ、またはＥ２０１Ｒ、（ｘ）Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０３Ｑ、またはＥ２０３Ｒ、（ｘｉ）以下の位置、Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６、及びＳ５７のうちの１つ以上の欠失、ならびに（ｘｉｉ）以下の位置、Ｌ９０、Ｎ９１、Ｉ９５、Ａ９９、Ｑ１１４における１つ以上の変異、のうちの１つ以上を含む、上記１または２に記載の変異体ＣｓｇＧモノマー。
４．前記バリアントが、（ａ）Ｙ５１及び／もしくはＦ５６における変異、ならびに／または（ｂ）Ｒ１９２における変異を含む、上記１〜３のいずれかに記載の変異体モノマー。
５．前記Ｙ５１における変異が、Ｙ５１Ａであり、かつ／またはＹ５６における変異が、Ｆ５６Ｑである、上記４に記載の変異体モノマー。
６．前記Ｒ１９２における変異が、Ｒ１９２Ｄである、上記４または５に記載の変異体モノマー。
７．（ａ）前記バリアントが、以下の置換、Ｎ４０Ｒ、Ｎ４０Ｋ、Ｄ４３Ｎ、Ｄ４３Ｑ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｋ、Ｅ４４Ｎ、Ｅ４４Ｑ、Ｅ４４Ｒ、Ｅ４４Ｋ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ５７Ｐ、Ｑ６２Ｒ、Ｑ６２Ｋ、Ｒ９７Ｎ、Ｒ９７Ｇ、Ｒ９７Ｌ、Ｅ１０１Ｎ、Ｅ１０１Ｑ、Ｅ１０１Ｒ、Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｆ、Ｅ１０１Ｙ、Ｅ１０１Ｗ、Ｅ１０１Ｔ、Ｅ１２４Ｎ、Ｅ１２４Ｑ、Ｅ１２４Ｒ、Ｅ１２４Ｋ、Ｅ１２４Ｆ、Ｅ１２４Ｙ、Ｅ１２４Ｗ、Ｅ１３１Ｄ、Ｒ１４２Ｅ、Ｒ１４２Ｎ、Ｔ１５０Ｉ、Ｒ１９２Ｅ、及びＲ１９２Ｎのうちの１つ以上を含み、
（ｂ）前記バリアントが、（ｉｉ）において、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｇ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｔ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｔ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｔ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｔ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｔ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｔ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｒ，Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｔ、Ｆ５６Ｎ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｎ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｎ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｎ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｌ、Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｖ、Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ａ、Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｎ、Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｑ、Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｓ、Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５

１Ｎ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｅ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ｅ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ｄ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ｄ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｅ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｄ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｅ、もしくはＦ５６Ｋ／Ｎ５５Ｄを含み、
（ｃ）前記バリアントが、Ｙ５１／Ｐ５２の欠失、Ｙ５１／Ｐ５２／Ａ５３の欠失、Ｐ５０〜Ｐ５２の欠失、Ｐ５０〜Ａ５３の欠失、Ｋ４９〜Ｙ５１の欠失、Ｋ４９〜Ａ５３の欠失及び単一のプロリン（Ｐ）による置換、Ｋ４９〜Ｓ５４の欠失及び単一のＰによる置換、Ｙ５１〜Ａ５３の欠失、Ｙ５１〜Ｓ５４の欠失、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失、Ｎ５５〜Ｓ５７の欠失、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失及び単一のＰによる置換、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失及び単一のグリシン（Ｇ）による置換、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失及び単一のアラニン（Ａ）による置換、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失及び単一のＰによる置換ならびにＹ５１Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失及び単一のＰによる置換ならびにＹ５１Ｑ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失及び単一のＰによる置換ならびにＹ５１Ｓ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失及び単一のＧによる置換ならびにＹ５１Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失及び単一のＧによる置換ならびにＹ５１Ｑ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失及び単一のＧによる置換ならびにＹ５１Ｓ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失及び単一のＡによる置換ならびにＹ５１Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失及び単一のＡ／Ｙ５１Ｑによる置換、もしくはＮ５５／Ｆ５６の欠失及び単一のＡによる置換ならびにＹ５１Ｓによる置換を含み、かつ／または
（ｄ）前記バリアントが、Ｌ９０ＲもしくはＬ９０Ｋ、Ｎ９１ＲもしくはＮ９１Ｋ、Ｉ９５ＲもしくはＩ９５Ｋ、Ａ９９ＲもしくはＡ９９Ｋ、Ｑ１１４ＫもしくはＱ１１４Ｒのうちの１つ以上を含む、上記１〜６のいずれかに記載の変異体モノマー。
８．前記バリアントが、Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０１Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ２０１Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０１Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ２０１Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｄ１９５Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｄ１９５Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｄ１９５Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｄ１９５Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｑ、Ｅ１３１Ｄ／Ｋ４９Ｒ、Ｅ１０１Ｎ／Ｎ１０２Ｆ、Ｅ１０１Ｎ／Ｎ１０２Ｙ、Ｅ１０１Ｎ／Ｎ１０２Ｗ、Ｅ１０１Ｆ／Ｎ１０２Ｆ、Ｅ１０１Ｆ／Ｎ１０２Ｙ、Ｅ１０１Ｆ／Ｎ１０２Ｗ、Ｅ１０１Ｙ／Ｎ１０２Ｆ、Ｅ１０１Ｙ／Ｎ１０２Ｙ、Ｅ１０１Ｙ／Ｎ１０２Ｗ、Ｅ１０１Ｗ／Ｎ１０２Ｆ、Ｅ１０１Ｗ／Ｎ１０２Ｙ、Ｅ１０１Ｗ／Ｎ１０２Ｗ、Ｅ１０１Ｎ／Ｎ１０２Ｒ、Ｅ１０１Ｆ／Ｎ１０２Ｒ、Ｅ１０１Ｙ／Ｎ１０２Ｒ、またはＥ１０１Ｗ／Ｎ１０２Ｆを含む、上記１〜７のいずれかに記載の変異体。
９．前記バリアントが、Ｔ１５０における変異を含む、上記１〜８のいずれかに記載の変異体モノマー。
１０．２つ以上の共有結合したＣｓｇＧモノマーを含む構造体であって、前記モノマーのうちの少なくとも１つが、上記１〜９のいずれかに記載の変異体モノマーである、構造体。
１１．前記２つ以上の変異体モノマーが、同じであるか、または異なる、上記１０に記載の構造体。
１２．前記２つ以上の変異体モノマーが、遺伝的に融合されている、上記１０または１１に記載の構造体。
１３．前記２つ以上の変異体モノマーが、１つ以上のリンカーを介して結合している、上記１０〜１２のいずれかに記載の構造体。
１４．前記構造体が、上記１〜６のいずれかに記載の２つの変異体モノマーを含む、上記１０〜１３のいずれかに記載の構造体。
１５．上記１〜９のいずれかに記載の変異体モノマーまたは上記１２に記載の構造体をコードする、ポリヌクレオチド。
１６．上記１〜９のいずれかに記載の同一の変異体モノマーまたは上記１０〜１４のいずれかに記載の同一の構造体を含むＣｓｇＧに由来する、ホモオリゴマーポア。
１７．前記ポアが、上記１〜９のいずれかに記載の９つの同一の変異体モノマーを含む、上記１６に記載のホモオリゴマーポア。
１８．上記１〜９のいずれかに記載の少なくとも１つの変異体モノマーまたは上記１０〜１３のいずれかに記載の少なくとも１つの構造体を含むＣｓｇＧに由来する、ヘテロオリゴマーポア。
１９．前記ポアが、（ａ）上記１〜９のいずれかに記載の９つの変異体モノマーであって、それらのうちの少なくとも１つが他のものと異なる、９つの変異体モノマー、または（ｂ）上記１〜９のいずれかに記載の１つ以上の変異体モノマー及び配列番号２を含む十分な追加のモノマーを含む、上記１８に記載のヘテロオリゴマーポア。
２０．標的分析物の存在、不在、または１つ以上の特徴を判定するための方法であって、
（ａ）前記標的分析物が前記ポアに対して移動するように、前記標的分析物を、上記１６〜１９のいずれかに記載のポアと接触させることと、
（ｂ）前記分析物が前記ポアに対して移動する間に１つ以上の測定値を取り、それにより前記分析物の前記存在、不在、または１つ以上の特徴を判定することと、を含む、方法。
２１．前記標的分析物が、金属イオン、無機塩、ポリマー、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、染料、漂白剤、医薬品、診断薬、レクリエーショナルドラッグ、爆発物、または環境汚染物質である、上記１６〜２０のいずれかに記載の方法。
２２．前記標的分析物が、標的ポリヌクレオチドである、上記２１に記載の方法。
２３．前記方法が、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのものであり、前記方法が、
ａ）前記ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動するように、前記ポリヌクレオチドを前記ポアと接触させることと、
ｂ）前記ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動する間に、１つ以上の測定値を取ることであって、前記測定値が前記ポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を示す、取ることによって、前記標的ポリヌクレオチドを特徴付けることと、を含む、上記２２に記載の方法。
２４．前記１つ以上の特徴が、（ｉ）前記ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）前記ポリヌクレオチドの二次構造、及び（ｖ）前記ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択される、上記２３に記載の方法。
２５．前記ポリヌクレオチドの前記１つ以上の特徴が、電気的測定及び／または光学的測定によって測定される、上記２３または２４に記載の方法。
２６．前記電気的測定が、電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定、または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定である、上記２５に記載の方法。
２７．ステップａ）が、前記ポリヌクレオチドをポリヌクレオチド結合タンパク質と接触させ、それにより前記ポアを通る前記ポリヌクレオチドの移動を前記タンパク質が制御するようにすることをさらに含む、上記２３〜２６のいずれかに記載の方法。
２８．ａ）前記タンパク質が前記ポアに対する前記ポリヌクレオチドの移動を制御するように、前記ポリヌクレオチドを前記ポア及び前記ポリヌクレオチド結合タンパク質と接触させることと、
ｂ）前記ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動する間に、前記ポアを通過する前記電流を測定することであって、前記電流が前記ポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を示す、測定することによって、前記標的ポリヌクレオチドを特徴付けることと、を含む、上記２７に記載の方法。
２９．前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、ヘリカーゼであるか、またはヘリカーゼに由来する、上記２７または２８に記載の方法。
３０．前記方法が、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのものであり、前記方法が、
ａ）前記ポリヌクレオチドを、上記１３〜１６のいずれかに記載のポア及びエキソヌクレアーゼと接触させ、それにより前記エキソヌクレアーゼが前記標的ポリヌクレオチドの一方の末端からの個々のヌクレオチドを消化し、前記個々のヌクレオチドが前記ポアに対して移動するようにすることと、
ｂ）前記個々のヌクレオチドが前記ポアに対して移動する間に、１つ以上の測定値であって、前記測定値が前記個々のヌクレオチドの１つ以上の特徴を示す、１つ以上の測定値を取り、それにより前記標的ポリヌクレオチドを特徴付けることと、を含む、上記２２に記載の方法。
３１．前記ポアが、膜内にある、上記１７〜３０のいずれかに記載の方法。
３２．膜が、両親媒性層であるか、または固体層を含む、上記３１に記載の方法。
３３．前記標的分析物が、前記ポアと接触する前に、前記膜に結合する、上記２１または３２に記載の方法。
３４．前記標的分析物が、前記分析物を前記膜に向けて送達する微粒子に結合している、上記３１〜３３のいずれかに記載の方法。
３５．標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサを形成する方法であって、上記１６〜１９のいずれかに記載のポアとポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体を形成し、それにより前記標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサを形成することを含む、方法。
３６．前記複合体が、（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの存在下で前記ポア及び前記ポリヌクレオチド結合タンパク質を接触させることと、（ａ）前記ポアにわたって電位を印加することと、によって形成される、上記３５に記載の方法。
３７．前記電位が、電圧電位または化学的電位である、上記３６に記載の方法。
３８．前記複合体が、前記ポアを前記タンパク質に共有結合させることによって形成される、上記３５に記載の方法。
３９．標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサであって、上記１６〜１９のいずれかに記載のポアとポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体を含む、センサ。
４０．標的分析物の存在、不在、または１つ以上の特徴を判定するための、上記１６〜１９のいずれかに記載のポアの使用。
４１．（ａ）上記１６〜１９のいずれかに記載のポアと、（ｂ）膜の構成要素と、を含む、標的分析物を特徴付けるためのキット。
４２．（ａ）上記１６〜１９のいずれかに記載の複数のポアと、（ｂ）複数の膜と、を含む、試料中の標的分析物を特徴付けるための装置。
４３．前記複数のポア及び膜を支持することができ、前記ポア及び膜を使用して分析物の特徴付けを実施するように動作可能であるセンサデバイスと、
前記特徴付けを実施するための前記材料の送達のための少なくとも１つのポートと、を含む、上記４２に記載の装置。
４４．前記複数のポア及び膜を支持することができ、前記ポア及び膜を使用して分析物の特徴付けを実施するように動作可能であるセンサデバイスと、
前記特徴付けを実施するための材料を保持するための少なくとも１つの貯蔵器と、を含む、上記４３に記載の装置。
４５．材料を前記少なくとも１つの貯蔵器から前記センサデバイスへと制御可能に供給するように構成された流体工学システムと、
それぞれの試料を受容するための複数の容器であって、前記流体工学システムが、前記試料を前記容器から前記センサデバイスへと選択的に供給するように構成されている、複数の容器と、をさらに含む、上記４３または４４に記載の装置。
４６．標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、
ａ）ポリメラーゼによってリン酸標識種が前記標的ポリヌクレオチドに順次付加されるように、前記ポリヌクレオチドを、上記１６〜１９のいずれかに記載のポア、前記ポリメラーゼ、及び標識ヌクレオチドと接触させることであって、前記リン酸種が、各ヌクレオチドに特異的な標識を含有する、接触させることと、
ｂ）前記ポアを使用して前記リン酸標識種を検出し、それにより前記ポリヌクレオチドを特徴付けることと、を含む、方法。
４７．上記１〜９のいずれかに記載の変異体モノマー、または上記１２に記載の構造体を生成する方法であって、好適な宿主細胞において上記１５に記載のポリヌクレオチドを発現させ、それにより上記１〜９のいずれかに記載の変異体モノマー、または上記１２に記載の構造体を生成すること、を含む、方法。

Claims (49)

  1. 標的分析物の存在、不在、または１つ以上の特徴を判定するための方法であって、
    （ａ）前記標的分析物がＣｓｇＧポアに対して移動するように、前記標的分析物を、前記ポアと接触させることであって、前記ポアが、Ｒ９７Ｗ、Ｒ９３Ｗ、またはＲ９３Ｙ及びＲ９７Ｙ；Ｆ１９１Ｔ；Ｖ１０５、Ａ１０６、及びＩ１０７の欠失；ならびに／またはＲ１９２位、Ｆ１９３位、Ｉ１９４位、Ｄ１９５位、Ｙ１９６位、Ｑ１９７位、Ｒ１９８位、Ｌ１９９位、Ｌ２００位、及びＥ２０１位のうちの１つ以上の欠失を含む、配列番号２に示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーを含むことと、
    （ｂ）前記分析物が前記ポアに対して移動する間に１つ以上の測定値を取り、それにより前記分析物の前記存在、不在、または１つ以上の特徴を判定することと、を含む、方法。
  2. 前記バリアントが、Ｒ９７Ｗを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記バリアントが、Ｆ１９３、Ｉ１９４、Ｄ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、及びＬ１９９の欠失、またはＤ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、及びＬ１９９の欠失を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記バリアントが、Ｙ５１及び／もしくはＦ５６及び／もしくはＮ５５における変異をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記Ｙ５１における変異が、Ｙ５１Ａであり、かつ／またはＦ５６における変異が、Ｆ５６Ｑである、請求項４に記載の方法。
  6. 前記バリアント中のＹ５１及び／もしくはＦ５６及び／もしくはＮ５５における前記変異が、Ｆ５６Ｎ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｙ５１Ｔ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｔ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、またはＦ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｔである、請求項４に記載の方法。
  7. 前記バリアントが、Ｒ１９２における変異をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. Ｒ１９２における変異が、Ｒ１９２Ｄ、Ｒ１９２ＮまたはＲ１９２Ｅである、請求項７に記載の方法。
  9. 前記バリアントが、以下の置換：
    （ｉ）Ｅ４４Ｎ、Ｅ４４Ｑ、Ｅ４４ＲまたはＥ４４Ｋ；
    （ｉｉ）Ｅ１０１Ｎ、Ｅ１０１Ｑ、Ｅ１０１Ｒ、Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｆ、Ｅ１０１Ｙ、Ｅ１０１Ｗ、Ｅ１０１Ｔ、Ｅ１０１ＨまたはＥ１０１Ｌ；
    （ｉｉｉ）Ｒ１４２ＥまたはＲ１４２Ｎ；
    （ｉｖ）Ｔ１５０ＩまたはＴ１５０Ｙ；
    （ｖ）Ｑ４２ＲまたはＱ４２Ｋ；
    （ｖｉ）Ｋ９４ＮまたはＫ９４Ｑ；
    （ｖｉｉ）Ｎ１０２Ｒ、Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１０２Ｙ、Ｎ１０２Ｇ、Ｎ１０２ＳまたはＮ１０２Ｗ；
    （ｖｉｉｉ）Ｄ１４９Ｎ、Ｄ１４９ＱまたはＤ１４９Ｒ；
    （ｉｘ）Ｅ１８５Ｎ、Ｅ１８５ＱまたはＥ１８５Ｒ；
    （ｘ）Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１９５ＱまたはＤ１９５Ｒ；
    （ｘｉ）Ｅ２０１Ｎ、Ｅ２０１ＱまたはＥ２０１Ｒ；
    （ｘｉｉ）Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０３ＱまたはＥ２０３Ｒ；
    （ｘｉｉｉ）Ｌ９０ＲまたはＬ９０Ｋ；
    （ｘｉｖ）Ｎ９１ＲまたはＮ９１Ｋ；
    （ｘｖ）Ｉ９５ＲまたはＩ９５Ｋ；
    （ｘｖｉ）Ａ９９ＲまたはＡ９９Ｋ；及び
    （ｘｖｉｉ）Ｑ１１４ＫまたはＱ１１４Ｒ
    の１つ以上をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記バリアントが、Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０１Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３ＮまたはＤ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記標的分析物が、金属イオン、無機塩、ポリマー、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、染料、漂白剤、医薬品、診断薬、レクリエーショナルドラッグ、爆発物、または環境汚染物質である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記標的分析物が、標的ポリヌクレオチドである、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記方法が、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのものであり、前記方法が、
    ａ）前記ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動するように、前記ポリヌクレオチドを前記ポアと接触させることと、
    ｂ）前記ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動する間に、１つ以上の測定値であって、前記ポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を示す前記測定値を取り、それによって、前記標的ポリヌクレオチドを特徴付けることと、を含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記１つ以上の特徴が、（ｉ）前記ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）前記ポリヌクレオチドの二次構造、及び（ｖ）前記ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記ポリヌクレオチドの前記１つ以上の特徴が、電気的測定及び／または光学的測定によって測定される、請求項１３または１４に記載の方法。
  16. 前記電気的測定が、電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定、または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定である、請求項１５に記載の方法。
  17. ステップａ）が、前記ポリヌクレオチドをポリヌクレオチド結合タンパク質と接触させ、それにより前記ポアを通る前記ポリヌクレオチドの移動を前記タンパク質が制御するようにすることをさらに含む、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. ａ）前記タンパク質が前記ポアに対する前記ポリヌクレオチドの移動を制御するように、前記ポリヌクレオチドを前記ポア及び前記ポリヌクレオチド結合タンパク質と接触させることと、
    ｂ）前記ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動する間に、前記ポアを通過する電流であって、前記ポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を示す前記電流を測定し、それによって、前記標的ポリヌクレオチドを特徴付けることと、を含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、ヘリカーゼであるか、またはヘリカーゼに由来する、請求項１７または１８に記載の方法。
  20. 前記方法が、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのものであり、前記方法が、
    ａ）前記ポリヌクレオチドを、ポア及びエキソヌクレアーゼと接触させ、それにより前記エキソヌクレアーゼが前記標的ポリヌクレオチドの一方の末端からの個々のヌクレオチドを消化し、前記個々のヌクレオチドが前記ポアに対して移動するようにすることであって、前記ポアが、Ｒ９７Ｗ、Ｒ９３Ｗ、またはＲ９３Ｙ及びＲ９７Ｙ；Ｆ１９１Ｔ；Ｖ１０５、Ａ１０６、及びＩ１０７の欠失；ならびに／またはＲ１９２位、Ｆ１９３位、Ｉ１９４位、Ｄ１９５位、Ｙ１９６位、Ｑ１９７位、Ｒ１９８位、Ｌ１９９位、Ｌ２００位、及びＥ２０１位のうちの１つ以上の欠失を含む、配列番号２に示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーを含むことと、
    ｂ）前記個々のヌクレオチドが前記ポアに対して移動する間に、１つ以上の測定値であって、前記測定値が前記個々のヌクレオチドの１つ以上の特徴を示す、１つ以上の測定値を取り、それにより前記標的ポリヌクレオチドを特徴付けることと、を含む、請求項１２に記載の方法。
  21. 前記ポアが、膜内にある、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 膜が、両親媒性層であるか、または固体層を含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記標的分析物が、前記ポアと接触する前に、前記膜に結合する、請求項２１または２２に記載の方法。
  24. 前記標的分析物が、前記分析物を前記膜に向けて送達する微粒子に結合している、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. Ｒ９７Ｗ、Ｒ９３Ｗ、またはＲ９３Ｙ及びＲ９７Ｙ；Ｆ１９１Ｔ；ならびに／またはＲ１９２位、Ｆ１９３位、Ｉ１９４位、Ｄ１９５位、Ｙ１９６位、Ｑ１９７位、Ｒ１９８位、Ｌ１９９位、Ｌ２００位、及びＥ２０１位のうちの１つ以上の欠失を含む、配列番号２に示される配列のバリアントを含み、ポアを形成する能力を保持する、変異体ＣｓｇＧモノマー。
  26. バリアントが、Ｖ１０５、Ａ１０６、及びＩ１０７の欠失をさらに含む、及び／または請求項２〜１０のいずれか１項に規定されるモノマーである、請求項２５に記載の変異体ＣｓｇＧモノマー。
  27. ２つ以上の共有結合したＣｓｇＧモノマーを含む構造体であって、前記モノマーのうちの少なくとも１つが、請求項２５または２６に記載の変異体モノマーである、構造体。
  28. 前記２つ以上の変異体モノマーが、同じであるか、または異なる、請求項２７に記載の構造体。
  29. 前記２つ以上の変異体モノマーが、遺伝的に融合されている、請求項２７または２８に記載の構造体。
  30. 前記２つ以上の変異体モノマーが、１つ以上のリンカーを介して結合している、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の構造体。
  31. 前記構造体が、請求項２５または２６に記載の２つの変異体モノマーを含む、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の構造体。
  32. 請求項２５または２６に記載の変異体モノマーまたは請求項２９に記載の構造体をコードする、ポリヌクレオチド。
  33. 請求項２５または２６に記載の同一の変異体モノマーまたは請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の同一の構造体を含むＣｓｇＧに由来する、ホモオリゴマーポア。
  34. 前記ポアが、請求項２５または２６に記載の９つの同一の変異体モノマーを含む、請求項３３に記載のホモオリゴマーポア。
  35. 請求項２５または２６に記載の少なくとも１つの変異体モノマーまたは請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の少なくとも１つの構造体を含むＣｓｇＧに由来する、ヘテロオリゴマーポア。
  36. 前記ポアが、（ａ）請求項２５または２６に記載の９つの変異体モノマーであって、それらのうちの少なくとも１つが他のものと異なる、９つの変異体モノマー、または（ｂ）請求項２５または２６に記載の１つ以上の変異体モノマー及び配列番号２を含む追加のモノマーを含む、請求項３５に記載のヘテロオリゴマーポア。
  37. 標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサを形成する方法であって、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載のポアとポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体を形成し、それにより前記標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサを形成することを含む、方法。
  38. 前記複合体が、（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの存在下で前記ポア及び前記ポリヌクレオチド結合タンパク質を接触させることと、（ｂ）前記ポアにわたって電位を印加することと、によって形成される、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記電位が、電圧電位または化学的電位である、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記複合体が、前記ポアを前記タンパク質に共有結合させることによって形成される、請求項３７に記載の方法。
  41. 標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサであって、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載のポアとポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体を含む、センサ。
  42. 標的分析物の存在、不在、または１つ以上の特徴を判定するための、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載のポアの使用。
  43. （ａ）請求項３３〜３６のいずれか１項に記載のポアと、（ｂ）膜の構成要素と、を含む、標的分析物を特徴付けるためのキット。
  44. （ａ）請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の複数のポアと、（ｂ）複数の膜と、を含む、試料中の標的分析物を特徴付けるための装置。
  45. 前記複数のポア及び膜を支持することができ、前記ポア及び膜を使用して分析物の特徴付けを実施するように動作可能であるセンサデバイスと、
    前記特徴付けを実施するための前記材料の送達のための少なくとも１つのポートと、を含む、請求項４４に記載の装置。
  46. 前記複数のポア及び膜を支持することができ、前記ポア及び膜を使用して分析物の特徴付けを実施するように動作可能であるセンサデバイスと、
    前記特徴付けを実施するための材料を保持するための少なくとも１つの貯蔵器と、を含む、請求項４５に記載の装置。
  47. 材料を前記少なくとも１つの貯蔵器から前記センサデバイスへと制御可能に供給するように構成された流体工学システムと、
    それぞれの試料を受容するための複数の容器であって、前記流体工学システムが、前記試料を前記容器から前記センサデバイスへと選択的に供給するように構成されている、複数の容器と、をさらに含む、請求項４５または４６に記載の装置。
  48. 標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、
    ａ）ポリメラーゼによってリン酸標識種が前記標的ポリヌクレオチドに順次付加されるように、前記ポリヌクレオチドを、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載のポア、前記ポリメラーゼ、及び標識ヌクレオチドと接触させることであって、前記リン酸種が、各ヌクレオチドに特異的な標識を含有することと、
    ｂ）前記ポアを使用して前記リン酸標識種を検出し、それによ構造体り前記ポリヌクレオチドを特徴付けることと、を含む、方法。
  49. 請求項２５または２６に記載の変異体モノマー、または請求項２９に記載の構造体を生成する方法であって、好適な宿主細胞において請求項３２に記載のポリヌクレオチドを発現させ、それにより請求項２５または２６に記載の変異体モノマー、または請求項２９に記載の構造体を生成すること、を含む、方法。
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