CN102174554A - 双控双调节原核表达载体系统及其构建方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学基因工程领域，具体涉及一种双控双调节原核表达载体系统及其构建方法和用途。该载体系统由两个表达载体共同完成目的基因的表达，其中一个表达载体为主表达载体，目的基因克隆到此表达载体上，另一个表达载体为辅助表达载体，该辅助表达载体控制调节主表达载体启动子的开关，主表达载体含有SP6启动子和乳糖调节基因，辅助表达载体含有arab启动子、araC调节基因和SP6RNA聚合酶基因，主表达载体和辅助表达载体的表达目的基因受诱导物控制和/或调节。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学基因工程领域，具体涉及一种双控双调节原核表达载体系统及其构建方法和用途。
背景技术
原核细胞中基因表达(蛋白质合成)载体一股都是单载体，即一个感受态细胞中转入一种质粒，完成目的基因的表达，实现目的蛋白质的合成。这种形式的表达载体在把表达载体往感受态细胞中转化时操作程序简单，转化效率高。但是，该种表达载体在基因表达(蛋白质合成)过程中，载体上的控制调节系统对基因表达的控制不严格，经常有漏表达，造成一些表达产物对大肠杆菌宿主细胞有毒性的一些基因难已表达，从而限制了现有的一些表达载体的广泛应用。该种形式的表达载体可参考以下文献：Yanisch-Perron，C.，Vieira，J.andJames W.Warren，Jennifer R.Walker，John R.Roth，et al.Construction andCharacterization of a Highly Regulable Expression Vector，pLAC11，and ItsMultipurpose Derivatives，pLAC22and pLAC33.Plasmid(2000)44，138-151；Studier，F.W.(1991).Use of bacteriophage-T7lysozyme to improve an inducible T7expressionsystem.J.Mol.Biol.219，37-44；Studier，F.W.，and Moffatt，B.A.(1986).Useof bacteriophage T7RNA polymerase to direct selective high-level expression ofcloned genes.J.Mol.Biol.189，113-130；Studier，F.W.，Rosenberg，A.H.，Dunn，J.J.，and Dubendorff，J.W.(1990).Use of T7RNA-polymerase to direct expressionof cloned genes.In“Methods in Enzymology”(D.V.Goeddel，Ed.)，Academic Press，San Diego.Vol.185，pp.60-89；Vieira，J.，and Messing，J.(1982).The pUC plasmids，an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with syntheticuniversal primers.Gene 19，259-268；Glass，R.E.(1982).“Gene Function：E.coliand Its Heritable Elements.”Univ.California Press，Berkeley and Los Angeles；Godson，G.N.(1991).An over-expression plasmid for Escherichia coli primase.Gene100，59-64；Mu¨ller-Hill，B.(1975).Lac repressor and lac operator.Prog.Biophys.Mol.Biol.30，227-252；Mu¨ller-Hill，B.(1996).“The lac Operon：A Short Historyof a Genetic Paradigm.”de Gruyter，Berlin；Bolivar，F.，Rodriguez，R.L.，Greene，P.J.，Betlach，M.C.，Heyneker，H.L.，Boyer，H.W.，Crosa，J.H.，and Falkow，S.(1977).Construction and characterization of new cloning vehicles II.A multipurposecloning system.Gene 2，95-113；Brosius，J.(1988).Expression vectors employinglambda-，trp-，lac-，and lpp-derived promoters.Biotechnology 10，205-225；Brosius，J.，and Holy，A.(1984).Regulation of ribosomal 150WARREN ET AL.RNA promoters witha synthetic lac operator.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，6929-6933；Amann，E.，andBrosius，J.(1985).ATG vectors for regulated high-level expression of cloned genesin Escherichia coli.Gene 40，183-190；Amann，E.，Ochs，B.，and Abel，K-J.(1988). Tightly regulated tac vectors useful for the expression of unfused and fused proteinsin Escherichia
现有的大肠杆菌表达载体经常有目的基因不表达的情况发生，原因是在单控单调节的情况下由启动子、操纵子、调节基因组成的控制调节系统不严格，即目的基因表达(转录和翻译)控制调节不严格，在非诱导表达时也能够(漏表达)进行少量的目的基因表达，合成出蛋白质。有些目的基因的表达产物还会对宿主细胞有毒性作用，造成宿主细胞的死亡，不能获得要表达的目的蛋白。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种双控双调节原核表达载体系统，用双载体控制调节目的基因的表达，即SP6启动子(promoter)+乳糖(lac)调节基因表达系统和araB启动子(promoter)+araC调节基因表达系统，分别由乳糖类似物IPTG和阿拉伯糖(L-arabinose)诱导目的基因的表达。在该双控双调节原核表达载体系统中，由两个表达载体共同完成目的基因的表达。其中一个为主表达载体，即目的基因克隆到此表达载体上，另一个为辅助表达载体，该辅助表达载体控制调节主表达载体的启动子(SP6)。若实现主表达载体表达目的基因，必须经过辅助表达载体的控制调节系统和自身载体上的控制调节系统双调控实现目的基因的表达。双控双调节原核表达载体系统实现双控双调节基因表达的原理如图1所示。
为了实现上述的发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种双控双调节原核表达载体系统，由两个表达载体共同完成目的基因的表达；其中一个表达载体为主表达载体，目的基因克隆到此表达载体上，另一个表达载体为辅助表达载体，该辅助表达载体控制调节主表达载体启动子的开关；主表达载体含有SP6启动子和乳糖调节基因，辅助表达载体含有araB启动子、araC调节基因和SP6RNA聚合酶基因；主表达载体和辅助表达载体的表达目的基因受诱导物控制和/或调节。主表达载体的诱导物是乳糖类似物IPTG，辅助表达载体的诱导物是阿拉伯糖。
上述双控双调节原核表达载体系统的构建方法，包括以下步骤：
1)以SEQ ID NO：1和2所示序列为引物，以质粒pET11a为模板，进行PCR扩增，用BglII酶切PCR产物，回收目的片段后直接进行连接反应，构建pESP-1载体；将目的基因片段插入pESP-1载体中，构建含有目的基因的主表达载体；
2)将质粒pARA13用Pst I和HindIII双酶切，回收目的片段，与SP6RNA聚合酶基因连接，构建质粒pARA-SP6作为辅助表达载体；
3)将主表达载体和辅助表达载体同时转化大肠杆菌，同时使用主表达载体诱导物和辅助表达载体诱导物控制和/或调节目的基因表达。
本发明还提供了上述双控双调节原核表达载体系统用于表达目的基因的用途。
本发明具有以下技术效果：1)本发明提供的基因表达载体系统，在目的基因表达过程中，表达控制高度严格而且可调。2)本发明提供的表达载体系统解决了目的基因表达过程中的漏表达问题，从而能表达一些难以表达的基因，即载体表达目的基因(蛋白质合成)的广谱性增强。3)本发明的基因表达载体系统广谱性强。
附图说明：
图1：双控双调节原核表达载体系统表达原理示意图
图2：pESP-1载体结构示意图
SP6启动子在质粒pESP-1中432-448的位置，Lac操纵基因(operator)在405-429的位置，Lac I编码序列在835-1914的位置。
pESP-1载体克隆表达区域(cloning/expression region)为：
图3：神经酰胺鞘酯脱酰基酶的pET11a载体和pESP-1载体基因表达产物SDS-PAGE电泳图
泳道1为低分子量标记(low marker)；泳道6为pET11a-SCDase表达载体，IPTG浓度为0.5mmol/L，箭头所指处没有目的蛋白带；泳道7为pESP-1-SCDase表达载体，阿拉伯糖浓度为0.05％，箭头所指处为目的蛋白带；泳道8为pET11a-SCDase表达载体，IPTG为1.0mmol/L，箭头所指处没有目的蛋白带；泳道9为pESP-1-SCDase表达载体，阿拉伯糖浓度为0.1％，箭头所指处为目的蛋白带；泳道12为高分子量标记(high marker)。
图4：碱性磷酸酶基因表达产物(碱性磷酸酶蛋白)电泳图
泳道1为在IPTG浓度为1mmol/L，阿拉伯糖浓度为0.1％条件下进行诱导表达，箭头所指处有目的蛋白带。泳道2为没有添加IPTG和阿拉伯糖即没有经过诱导的对照，箭头所指处没有目的蛋白带。
图5：PNGaseF基因表达产物(PNGaseF蛋白)电泳图
泳道1为在IPTG浓度为1mmol/L，阿拉伯糖浓度为0.1％条件下进行诱导表达，箭头所指处有目的蛋白带。泳道2为没有添加IPTG和阿拉伯糖即没有经过诱导的对照，箭头所指处没有目的蛋白带。
图6：目的基因表达量的控制调节电泳图
泳道2为阿拉伯糖浓度为0.003％的表达产物电泳，箭头所指处为目的蛋白带；泳道4为阿拉伯糖浓度为0.01％的表达产物电泳，箭头所指处为目的蛋白带；泳道6为阿拉伯糖浓度为0.03％的表达产物电泳，箭头所指处为目的蛋白带；泳道8为阿拉伯糖浓度为0.1％的表达产物电泳，箭头所指处为目的蛋白带；泳道10为没有添加阿拉伯糖的表达产物电泳，箭头所指处没有目的蛋白带。
具体实施方式
以下实验操作质粒提取用到的试剂及试剂盒购自ProMega公司；切胶回收使用的试剂及试剂盒购自Vitagene公司；使用的脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶等，如无特别说明均购自Takara公司，所有实验均按分子生物学实验的常规操作。
实施例1：双控双调节原核表达载体系统pESP-1载体(vector)的构建
设计引物：
在下游引物Primer2引物中引入BglII酶切位点和SP6启动子序列SP6启动子序列(ATTTAGGTGACACTATAGAA)，上下游引物序列如下：
Primer1：
ATCGAGATCTCGATCCTCTACGCCG(SEQ ID NO：1)
Primer2：
GGATAGATCTCGATCCCGCGAAATATTTAGGTGACACTATAGAAGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCC(SEQID NO：2)
PCR反应：
以质粒pET11a(如SEQ ID NO：11所示)为模板，进行PCR扩增。
PCR体系为：10×PCR缓冲液5μl，15mM MgCl24μl，10mM dNTPmix 1μl，10μM Primer1、2各2μl，模板DNA 20～200pg，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl，补水至50μl。
反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃伸长反应150秒；30个循环。
PCR产物酶切反应：
将PCR产物回收、用BglII酶切：在20μl反应体系中，加入10×酶切缓冲液2μl，DNA500ng，限制性内切酶0.5μl(10U/μl)，加无菌双蒸水补至20μl，37℃反应1～2小时。琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，回收目的片段。
连接反应：
将回收的片段直接进行自身连接反应，10μl反应体系中加入100pg的回收片段，1单位T4DNA连接酶，根据不同公司的试剂选用不同的反应温度和时间，一股16℃连接4小时或4℃过夜连接。
采用常规方法转化大肠杆菌：
1.取100μl感受态细胞加5μl连接产物，轻轻混匀，冰置30分钟；
2.于42℃水中热激90秒，迅速置于冰上冷却1～2分钟；
3.加800μl LB液体培养基，37℃水浴或温和震荡培养45分钟至1小时；
4.取50～200μl菌液均匀涂布于含适当抗生素(氨苄青霉素50μg/ml)的LB平板上，37℃倒置过夜培养。
采用常规碱裂解法小量制备质粒DNA：
1.挑取单菌落接种于含适当抗生素的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜；
2.取1.5ml菌液于小离心管中，每分钟10,000转离心30秒；
3.菌体沉淀重悬于100μl溶液I中，震荡混匀；
4.加入新配制的200μl溶液II，轻弹混匀，室温放置4分钟，至溶液较清；
5.加入150μl溶液III，轻弹混匀，室温放置6分钟；
6.加入450μl酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)的混合液，混匀后每分钟12,000转离心5分钟；
7.取上清，加入等体积异戊醇，静置5分钟；
8.每分钟12,000转离心4分钟，倒净管中液体；
9.加入200μl双蒸水溶解沉淀，然后加入100μl 7.5M醋酸铵，冰上静置5分钟，每分钟12,000转离心4分钟；
10.取上清，转移至另一EP管中，加入2倍体积冷的无水乙醇，-20℃放置5分钟；
11.每分钟12,000转离心5分钟，弃上清，用70％冷乙醇清洗沉淀，每分钟12,000转离心3分钟，弃去上清，自然干燥或抽干所得DNA，溶于适当水中或以干粉形式保存。
测序反应：
委托测序公司把纯化好的质粒pESP-1进行测序，结果与目的序列一致，证明pESP-1质粒构建成功。如图2所示。
实施例2：双控双调节原核表达载体系统pARA-SP6质粒(plasmid)的构建
pARA载体片段的制备：
将质粒pARA13(GenBank：AF121783.1)分别用Pst I和HindIII双酶切：在20μl反应体系中，加入10×酶切缓冲液2μl，DNA 500ng，限制性内切酶0.5μl(10U/μl)，加无菌双蒸水补至20μl，37℃反应1～2小时。琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，回收目的片段。
SP6RNA聚合酶(SP6RNA polymerase)基因插入片段的制备：
设计引物：
以SP6RNA聚合酶基因(GenBank：Y00105.1)序列为参考，委托生物工程公司进行SP6RNA聚合酶片段全基因合成。
设计上游引物Primer3，下游引物Primer4，上游引物引入Pst I酶切位点，下游引物引入HindIII酶切位点，上下游引物序列如下：
Primer3：GGGGCTGCAGAATGCAAGATTTACACGCTATCCAGC(SEQ ID NO：3)
Primer4：GGGGAAGCTTTTAGGCAAATACGTATTCAGAATCC(SEQ ID NO：4)
PCR反应：
以SP6RNA聚合酶片段为模板，进行PCR扩增。
PCR体系为：10×PCR缓冲液5μl，15mM MgCl24μl，10mM dNTPmix 1μl，10μM Primer3、4各2μl，模板DNA 20～200pg，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl，补水至50μl。
反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃伸长反应120秒；30个循环。
PCR产物酶切反应：
将PCR产物用限制性内切酶Pst I、HindIII双酶切：在20μl反应体系中，加入10×酶切缓冲液2μl，DNA 1μg，限制性内切酶0.5μl(10U/μl)，加无菌双蒸水补至20μl，37℃反应1～2小时。琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，回收目的片段。
连接反应：
将回收的pARA载体片段和SP6RNA聚合酶基因插入片段直接进行连接反应，10μl反应体系中加入3∶1比例的插入片段和载体片段，1U T4DNA连接酶，根据不同公司的试剂选用不同的反应温度和时间，一股16℃连接4小时或4℃过夜连接。
采用常规方法转化大肠杆菌：
1.取100μl感受态细胞加5μl连接产物，轻轻混匀，冰置30分钟；
2.于42℃水中热激90秒，迅速置于冰上冷却1～2分钟；
3.加800μl LB液体培养基，37℃水浴或温和震荡培养45分钟至1小时；
4.取50～200μl菌液均匀涂布于含适当抗生素(明确具体的抗生素以及使用量)的LB平板上，37℃倒置过夜培养。
采用常规碱裂解法小量制备质粒DNA：
1.挑取单菌落接种于含适当抗生素的LB液体培养基中，37℃震荡过夜培养；
2.取1.5ml菌液于小离心管中，每分钟10,000转离心30秒；
3.菌体沉淀重悬于100μl溶液I中，震荡混匀；
4.加入新配制的200μl溶液II，轻弹混匀，室温放置4分钟，至溶液较清；
5.加入150μl溶液III，轻弹混匀，室温放置6分钟；
6.加入450μl酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)的混合液，混匀后每分钟12,000转离心5分钟；
7.取上清，加入等体积异戊醇，静置5分钟；
8.每分钟12,000转离心4分钟，倒净管中液体；
9.加入200μl双蒸水溶解沉淀，然后加入100μl 7.5M醋酸铵，冰上静置5分钟，每分钟12,000转离心4分钟；
10.取上清，转移至另一EP管中，加入2倍体积无水乙醇，-20℃放置5分钟；
11.每分钟12,000转离心5分钟，弃上清，用70％乙醇清洗沉淀，每分钟12,000转离心3分钟，弃去上清，自然干燥或抽干所得DNA，溶于适当水中或以干粉形式保存。
质粒酶切反应：
将纯化好的质粒分别用Pst I、HindIII双酶切：在20μl反应体系中，加入10×酶切缓冲液2μl，DNA 1μg，限制性内切酶0.5μl(10U/μl)，加无菌双蒸水补至20μl，37℃反应1～2小时。
琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，载体片段和插入片段的大小与目的片段大小一致。
测序反应：
委托测序公司把纯化好的质粒pARA-SP6进行测序，结果与目的序列一致，证明pARA-SP6构建成功。
实施例3：pET11a-SCDase和pESP-1-SCDase质粒的构建及基因表达
SCDase插入片段的制备：
神经酰胺鞘酯脱酰基酶(Sphingolipid ceramide deacylase，Genbank No.：AB079849)全基因(2979bp)除去C末端324个氨基酸(972bp)得神经酰胺鞘酯脱酰基酶高活性基因(2007bp)(Masako Furusato，Noriyuki Sueyoshi，Susumu Mitsutake，et al.MolecularCloning and Characterization of Sphingolipid Ceramide N-Deacylase from a MarineBacterium，Shewanella alga G8.J.Biol.Chem.，2002，277(19)：17300-17307)，委托生物工程公司进行基因合成。
设计引物：
以神经酰胺鞘酯脱酰基酶高活性基因(2007bp)序列为参考，设计上游引物Primer5，下游引物Primer6，上游引物引入BamH I酶切位点，下游引物引入Bpu1102酶切位点，上下游引物序列如下：
Primer5：ATCGGGATCCATGAAAAAGCTAATCGGACATGG(SEQ ID NO：5)
Primer6：GGATGCTCAGCTCAGAGCTGGACTTCCAC(SEQ ID NO：6)
PCR反应：
以神经酰胺鞘酯脱酰基酶高活性基因合成片段为模板，进行PCR扩增。
PCR体系为：10×PCR缓冲液5μl，15mM MgCl24μl，10mM dNTPmix 1μl，10μM Primer5、6各2μl，模板DNA 20～200pg，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl，补水至50μl。
反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃伸长反应120秒；30个循环。
PCR产物酶切反应：
将PCR产物用BamH I、Bpu1102双酶切：在20μl反应体系中，加入10×酶切缓冲液2μl，DNA 500ng，限制性内切酶0.5μl(10U/μl)，加无菌双蒸水补至20μl，37℃反应1～2小时。
琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，回收目的片段。
载体片段pET11a和pESP-1的制备：
将质粒pET11a和pESP-1用BamH I、Bpu1102双酶切：在20μl反应体系中，加入10×酶切缓冲液2μl，DNA200ng，限制性内切酶0.5μl(10U/μl)，加无菌双蒸水补至20μl，37℃反应1～2小时。
琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，回收目的大片段。
连接反应：
将回收的载体片段pET11a、pESP-1与SCDase插入片段直接进行连接反应，10μl反应体系中加入3∶1比例的插入片段和载体片段，1U T4DNA连接酶，根据不同公司的试剂选用不同的反应温度和时间，一股16℃连接4小时或4℃过夜连接。
采用常规方法转化大肠杆菌：
1.取100μl感受态细胞加5μl连接产物，轻轻混匀，冰置30分钟；
2.于42℃水中热激90秒，迅速置于冰上冷却1～2分钟；
3.加800μl LB液体培养基，37℃水浴或温和震荡培养45分钟至1小时；
4.取50～200μl菌液均匀涂布于含适当抗生素(氨苄青霉素50μg/ml)的LB平板上，37℃倒置过夜培养。
采用常规碱裂解法小量制备质粒DNA：
1.挑取单菌落接种于含适当抗生素的LB液体培养基中，37℃震荡过夜培养；
2.取1.5ml菌液于小离心管中，每分钟10,000转离心30秒；
3.菌体沉淀重悬于100μl溶液I中，震荡混匀；
4.加入新配制的200μl溶液II，轻弹混匀，室温放置4分钟，至溶液较清；
5.加入150μl溶液III，轻弹混匀，室温放置6分钟；
6.加入450μl酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)的混合液，混匀后每分钟12,000转离心5分钟；
7.取上清，加入等体积异戊醇，静置5分钟；
8.每分钟12,000转离心4分钟，倒净管中液体；
9.加入200μl双蒸水溶解沉淀，然后加入100μl 7.5M醋酸铵，冰上静置5分钟，每分钟12,000转离心4分钟；
10.取上清，转移至另一EP管中，加入2倍体积无水乙醇，-20℃放置5分钟；
11.每分钟12,000转离心5分钟，弃上清，用70％乙醇清洗沉淀，每分钟12,000转离心3分钟，弃去上清，自然干燥或抽干所得DNA，溶于适当水中或以干粉形式保存。
质粒酶切反应：
将纯化好的质粒分别用BamH I、Bpu1102双酶切：在20μl反应体系中，加入10×酶切缓冲液2μl，DNA 1μg，限制性内切酶0.5μl(10U/μl)，加无菌双蒸水补至20μl，37℃反应1～2小时。
琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，载体片段和插入片段的大小与目的片段大小一致。
测序反应：
委托测序公司把纯化好的质粒pET11a-SCDase和pESP-1-SCDase进行测序，结果与目的序列一致，证明pET11a-SCDase和pESP-1-SCDase质粒构建成功。
质粒pET11a-SCDase和pESP-1-SCDase转化到大肠杆菌中：
1.取100μl感受态细胞分别加100pg pET11a-SCDase和pESP-1-SCDase质粒，同时加入100pg pARA-SP6质粒，轻轻混匀，冰置30分钟；
2.于42℃水中热激90秒，迅速置于冰上冷却1～2分钟；
3.加800μl LB液体培养基，37℃水浴或温和震荡培养45分钟至1小时；
4.取50～200μl菌液均匀涂布于含适当抗生素的LB平板上，37℃倒置过夜培养。
神经酰胺鞘酯脱酰基酶(SCDase)的表达：
1.挑取单菌落接种于含适当抗生素的2ml LB液体培养基中，37℃震荡过夜培养；
2.分别取50μl菌液接种于提前准备好的4个加入适当抗生素的5ml LB培养基(不含葡萄糖)中，每分钟135转震荡，37℃培养，3个小时后测OD600分别为0.720、0.715、0.732、0.705；
3.往含有pET11a-SCDase试管中分别加入IPTG，使终浓度为0.5mmole/L、1.0mmol/L；往含有pESP-1-SCDase的试管中加入IPTG，终浓度为1.0mmol/L。并且加入L-arabinose，使终浓度分别为0.05％、0.1％(W/V，每100ml溶液中含溶质的克数)；
4.诱导3个小时；
5.收集菌体，进行SDS-PAGE电泳。
神经酰胺鞘酯脱酰基酶的pET11a构建载体没有表达产物，而神经酰胺鞘酯脱酰基酶的pESP-1构建载体表达产物非常明显，并且随着L-alabinose的添加量增加，目的蛋白的表达量增加。如图3所示。
实施例4：pESP-1-BAP质粒的构建及基因表达
BAP插入片段的制备：
设计引物：
以大肠杆菌来源的碱性磷酸酶(BAP，Alkaline phosphatase)基因序列(Genbank No.：NP_286121)为参考，委托生物工程公司进行BAP全基因合成。设计上游引物Primer7，下游引物Primer8，上游引物引入BamH I酶切位点，下游引物引入Bpu1102酶切位点，上下游引物序列如下：
Primer7：ATCGGGATCCATGTCCCGACCTCGACTTATCG(SEQ ID NO：7)
Primer8：GGATGCTCAGCTTACTTCTCGCCCTCAGCAGCCTTC(SEQ ID NO：8)
PCR反应：
以BAP全基因合成片段为模板，进行PCR扩增。
PCR体系为：10×PCR缓冲液5μl，15mM MgCl24μl，10mM dNTPmix 1μl，10μM Primer7、8各2μl，模板DNA 20～200pg，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl，补水至50μl。
反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃伸长反应90秒；30个循环。
PCR产物酶切反应：
将PCR产物用BamH I、Bpu1102双酶切：在20μl反应体系中，加入10×酶切缓冲液2μl，DNA 500ng，限制性内切酶0.5μl(10U/μl)，加无菌双蒸水补至20μl，37℃反应1～2小时。
琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，回收目的片段。
载体片段pESP-1的制备：
将质粒pESP-1用BamH I、Bpu1102双酶切：在20μl反应体系中，加入10×酶切缓冲液2μl，DNA200ng，限制性内切酶0.5μl(5U)，加无菌双蒸水补至20μl，37℃反应1～2小时。琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，回收目的片段。
连接反应：
将回收的载体片段pESP-1和BAP插入片段直接进行连接反应，10μl反应体系中加入3∶1比例的插入片段和载体片段，1U T4DNA连接酶，根据不同公司的试剂选用不同的反应温度和时间，一股16℃连接4小时或4℃过夜连接。
大肠杆菌的转化：
1.取100μl感受态细胞加5μl连接产物，轻轻混匀，冰置30分钟；
2.于42℃水中热激90秒，迅速置于冰上冷却1～2分钟；
3.加800μl LB液体培养基，37℃水浴或温和震荡培养45分钟至1小时；
4.取50～200μl菌液均匀涂布于含适当抗生素的LB平板上，37℃倒置过夜培养。
碱裂解法小量制备质粒DNA：
1.挑取单菌落接种于含适当抗生素的LB液体培养基中，37℃震荡过夜培养；
2.取1.5ml菌液于小离心管中，每分钟10,000转离心30秒；
3.菌体沉淀重悬于100μl溶液I中，震荡混匀；
4.加入新配制的200μl溶液II，轻弹混匀，室温放置4分钟，至溶液较清；
5.加入150μl溶液III，轻弹混匀，室温放置6分钟；
6.加入450μl酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)的混合液，混匀后每分钟12,000转离心5分钟；
7.取上清，加入等体积异戊醇，静置5分钟；
8.每分钟12,000转离心4分钟，倒净管中液体；
9.加入200μl双蒸水溶解沉淀，然后加入100μl 7.5M醋酸铵，冰上静置5分钟，每分钟12,000转离心4分钟；
10.取上清，转移至另一EP管中，加入2倍体积无水乙醇，-20℃放置5分钟；
11.每分钟12,000转离心5分钟，弃上清，用70％乙醇清洗沉淀，每分钟12,000转离心3分钟，弃去上清，自然干燥或抽干所得DNA，溶于适当水中或以干粉形式保存。
质粒酶切反应：
将纯化好的质粒分别用BamH I、Bpu1102双酶切：在20μl反应体系中，加入10×酶切缓冲液2μl，DNA 1μg，限制性内切酶0.5μl(10U/μl)，加无菌双蒸水补至20μl，37℃反应1～2小时。琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，载体片段和插入片段的大小与目的片段大小一致。
测序反应：
委托测序公司把纯化好的质粒pESP-1-BAP进行测序，结果与目的序列一致，证明pESP-1-BAP质粒构建成功。
质粒pESP-1-BAP转化到大肠杆菌中：
1.取100μl感受态细胞分别加100pg pESP-1-BAP质粒，同时加入100pg pARA-SP6质粒，轻轻混匀，冰置30分钟；
2.于42℃水中热激90秒，迅速置于冰上冷却1～2分钟；
3.加800μl LB液体培养基，37℃水浴或温和震荡培养45分钟至1小时；
4.取50～200μl菌液均匀涂布于含适当抗生素的LB平板上，37℃倒置过夜培养。
碱性磷酸酶基因的表达：
1.挑取单菌落接种于含适当抗生素的LB液体培养基中，37℃震荡过夜培养；
2.分别取50μl菌液接种于提前准备好的2个加入适当抗生素的5ml LB培养基试管中，每分钟135转震荡，37℃培养，3个小时后测OD600分别为0.986、0.997；
3.往试管中分别加入IPTG，使终浓度分别为1.0mmol/L；加入L-arabinose，使终浓度分别为0、0.1％(W/V，每100ml溶液中含溶质的克数)；
4.诱导3个小时；
5.收集菌体，进行SDS-PAGE电泳。电泳结果如图4所示，加入诱导剂的碱性磷酸酶表达了，没有加入诱导剂的碱性磷酸酶没有表达。
实施例5：pESP-1-PNGaseF质粒的构建及基因表达
PNGaseF插入片段的制备：
设计引物：
以Chryseobacterium来源的N-糖酰胺酶F(PNGase F；EC 3.5.1.52，Taxonomic identifier172045[NCBI])为参考，委托生物工程公司进行PNGase F全基因合成。设计上游引物Primer9，下游引物Primer10，上游引物引入BamH I酶切位点，下游引物引入Bpu1102酶切位点，上下游引物序列如下：
Primer9：ATCGGGATCCATGGCTCCGGCAGATAATACG6(SEQ ID NO：9)
Primer10：GGATGCTCAGCTTAGTTTGTAACTACCGGAGC(SEQ ID NO：10)
PCR反应：
以PNGase F全基因合成片段为模板，进行PCR扩增。
PCR体系为：10×PCR缓冲液5μl，15mM MgCl24μl，10mM dNTPmix 1μl，10μM Primer9、10各2μl，模板DNA 20～200pg，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl，补水至50μl。
反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃伸长反应60秒；30个循环。
PCR产物酶切反应：
将PCR产物用BamH I、Bpu1102双酶切：在20μl反应体系中，加入10×酶切缓冲液2μl，DNA 500ng，限制性内切酶0.5μl(10U/μl)，加无菌双蒸水补至20μl，37℃反应1～2小时。琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，回收目的片段。
载体片段pESP-1的制备：
将质粒pESP-1用BamH I、Bpu1102双酶切：在20μl反应体系中，加入10×酶切缓冲液2μl，DNA200ng，限制性内切酶0.5μl(10U/μl)，加无菌双蒸水补至20μl，37℃反应1～2小时。琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，回收目的片段。
连接反应：
将回收的载体片段pESP-1和PNGaseF插入片段直接进行连接反应，10μl反应体系中加入3∶1比例的插入片段和载体片段，1单位T4DNA连接酶，根据不同公司的试剂选用不同的反应温度和时间，一股16℃连接4小时或4℃过夜连接。
大肠杆菌的转化：
1.取100μl感受态细胞加5μl连接产物，轻轻混匀，冰置30分钟；
2.于42℃水中热激90秒，迅速置于冰上冷却1～2分钟；
3.加800μl LB液体培养基，37℃水浴或温和震荡培养45分钟至1小时；
4.取50～200μl菌液均匀涂布于含适当抗生素的LB平板上，37℃倒置过夜培养。
碱裂解法小量制备质粒DNA：
1.挑取单菌落接种于含适当抗生素的LB液体培养基中，37℃震荡过夜培养；
2.取1.5ml菌液于小离心管中，每分钟10,000转离心30秒；
3.菌体沉淀重悬于100μl溶液I中，震荡混匀；
4.加入新配制的200μl溶液II，轻弹混匀，室温放置4分钟，至溶液较清；
5.加入150μl溶液III，轻弹混匀，室温放置6分钟；
6.加入450μl酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)的混合液，混匀后每分钟12,000转离心5分钟；
7.取上清，加入等体积异戊醇，静置5分钟；
8.每分钟12,000转离心4分钟，倒净管中液体；
9.加入200μl双蒸水溶解沉淀，然后加入100μl 7.5M醋酸铵，冰上静置5分钟，每分钟12,000转离心4分钟；
10.取上清，转移至另一EP管中，加入2倍体积无水乙醇，-20℃放置5分钟；
11.每分钟12,000转离心5分钟，弃上清，用70％乙醇清洗沉淀，每分钟12,000转离心3分钟，弃去上清，自然干燥或抽干所得DNA，溶于适当水中或以干粉形式保存。
质粒酶切反应：
将纯化好的质粒分别用BamH I、Bpu1102双酶切：在20μl反应体系中，加入10×酶切缓冲液2μl，DNA 1μg，限制性内切酶0.5μl(10U/μl)，加无菌双蒸水补至20μl，37℃反应1～2小时。
琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，载体片段和插入片段的大小与目的片段大小一致。
测序反应：
委托测序公司把纯化好的质粒pESP-1-PNGaseF进行测序，结果与目的序列一致，证明pESP-1-PNGaseF质粒构建成功。
质粒pESP-1-PNGaseF转化到大肠杆菌中：
1.取100μl感受态细胞分别加100pg pESP-1-PNGaseF质粒，同时加入100pg pARA-SP6质粒，轻轻混匀，冰置30分钟；
2.于42℃水中热激90秒，迅速置于冰上冷却1～2分钟；
3.加800μl LB液体培养基，37℃水浴或温和震荡培养45分钟至1小时；
4.取50～200μl菌液均匀涂布于含适当抗生素的LB平板上，37℃倒置过夜培养。
N-糖酰胺酶F基因的表达：
1.挑取单菌落接种于含适当抗生素的LB液体培养基中，37℃震荡过夜培养；
2.分别取50μl菌液接种于提前准备好的2个加入适当抗生素的5ml LB培养基中，每分钟135转震荡，37℃培养，3个小时后测OD600分别为0.564、0.565；
3.往试管中分别加入IPTG，使终浓度为1.0mmol/L；同时加入L-arabinose，使终浓度分别为0、0.1％；
4.诱导3个小时；
5.收集菌体，进行SDS-PAGE电泳。结果如图5所示，加入诱导剂的N-糖酰胺酶F基因表达了，没有加入诱导剂的N-糖酰胺酶F基因没有表达。
实施例6：目的基因表达量的控制调节实验
使用实施例4中的质粒pESP-1-BAP进行碱性磷酸酶基因表达，通过改变诱导剂阿拉伯糖的添加量，观察碱性磷酸酶基因表达量的变化。
质粒pESP-1-BAP转化到大肠杆菌中：
1.取100μl感受态细胞分别加100pg pESP-1-BAP质粒，同时加入100pg pARA-SP6质粒，轻轻混匀，冰置30分钟；
2.于42℃水中热激90秒，迅速置于冰上冷却1～2分钟；
3.加800μl LB液体培养基，37℃水浴或温和震荡培养45分钟至1小时；
4.取50～200μl菌液均匀涂布于含适当抗生素的LB平板上，37℃倒置过夜培养。
碱性磷酸酶基因的表达：
1.挑取单菌落接种于含适当抗生素的2ml LB液体培养基中，37℃震荡过夜培养；
2.分别取50μl菌液接种于提前准备好的5个加入适当抗生素的5ml LB培养基试管中，每分钟135转震荡，37℃培养，3个小时后测OD600分别为0.671、0.670、0.67、0.671、0.671；
3.5个试管中分别加入IPTG，使终浓度为1.0mmol/L；同时加入L-arabinose，使终浓度分别为0、0.003％、0.01％、0.03％、0.1％(W/V，每100ml液体中含溶质的克数)；
4.诱导4个小时；
5.收集菌体，进行SDS-PAGE电泳。结果如图6所示，随着L-arabinose添加量的增加、碱性磷酸酶基因表达量也逐渐增加，而没有加入阿拉伯糖的碱性磷酸酶基因没有表达。
Claims (4)
1.一种双控双调节原核表达载体系统，其特征在于由两个表达载体共同完成目的基因的表达；其中一个表达载体为主表达载体，目的基因克隆到此表达载体上，另一个表达载体为辅助表达载体，该辅助表达载体控制调节主表达载体启动子的开关；主表达载体含有SP6启动子和乳糖调节基因，辅助表达载体含有araB启动子、araC调节基因和SP6RNA聚合酶基因；主表达载体和辅助表达载体的表达目的基因受诱导物控制和/或调节。
2.如权利要求1所述的载体系统，其特征在于所述的诱导物是乳糖类似物IPT6，辅助表达载体的诱导物是阿拉伯糖。
3.如权利要求1或2所述双控双调节原核表达载体系统的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
1)以SEQ ID NO：1和2所示序列为引物，以质粒pET11a为模板，进行PCR扩增，用BglII酶切PCR产物，回收目的片段后直接进行连接反应，构建pESP-1载体；将目的基因片段插入pESP-1载体中，构建含有目的基因的主表达载体；
2)将质粒pARA13用Pst I和HindIII双酶切，回收目的片段，与SP6RNA聚合酶基因连接，构建质粒pARA-SP6作为辅助表达载体；
3)将主表达载体和辅助表达载体同时转化大肠杆菌，同时使用主表达载体诱导物和辅助表达载体诱导物控制和/或调节目的基因表达。
4.如权利要求1或2所述双控双调节原核表达载体系统的用途。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C04 | Withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Open date: 20110907 |