CN103436549B - 重组Sushi多肽的表达质粒体系、其构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组Sushi多肽的表达质粒体系、其构建方法及应用。作为本发明技术方案的典型实施方案之一，其可以包括：利用蛋白质体外剪切系统，在特定位点断开鲎C因子中能与内毒素结合的功能片段，分别连接到断裂蛋白质内含子的N端片段(IN)和C端片段(IC)在大肠杆菌中表达，表达产物经纯化，复性以及内毒素去除后，体外诱导该蛋白质内含子发生剪切，得到C因子中CES12片段，即，具有内毒素结合活性的重组Sushi多肽。本发明能够实现鲎C因子中具有内毒素结合活性的功能片段的快速、大量以及低成本表达，并可有效避免宿主细胞中所含LPS的影响，有利于低成本内毒素检测试剂的规模化生产和应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组多肽，尤其涉及一种重组Sushi多肽的制备方法。
背景技术
细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外层上特有的结构，其化学成分为脂多糖(LPS)。细菌内毒素可引起人体发热、休克甚至死亡，但它又普遍存在且不易灭活，因而在制药和医疗器械制造中内毒素检测尤为重要。此外，内毒素检测也可以用于临床上相关疾病的诊断和预防。
鳖试剂是国际上至今为止检测内毒素最常用的试剂，然而鲎数量有限以及鲎试剂批次间不均一性等局限性，迫切需要开发鲎试剂的替代品。研究表明，鲎C因子(FactorC)是鲎试剂中对内毒素具有高亲和力的丝氨酸蛋白酶原，且其N端的3个Sushi结构域是LPS的主要结合部位。Ding利用昆虫表达系统生产重组FactorC用于内毒素检测，并合成Sushi3区域中与LPS结合的34个氨基酸的多肽，可用于内毒素中和与检测。王东宁等利用大肠杆菌表达了FactorC，并证实重组蛋白对LPS有中和活性。尽管大肠杆菌表达重组蛋白具有快速、大量以及低成本等优点，但是由于大肠杆菌中含有LPS，严重限制了该种重组蛋白的大批量生产与应用。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种重组Sushi多肽的表达质粒体系、其构建方法及其在制备重组Sushi多肽中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：
一种重组Sushi多肽的表达质粒体系，包含分别与断裂蛋白质内含子的N端片段和C端片段连接的第一基因和第二基因，其中，所述第一基因和第二基因由用于编码鲎C因子中能与内毒素结合的功能片段的基因在选定位点断裂而形成。
作为较为优选的实施方案之一，所述用于编码鲎C因子中能与内毒素结合的功能片段的基因包括用于编码sushi1和/或sushi3区域的基因。
进一步的，所述选定位点可选自对应于鲎C因子序列的第492和第493个核苷酸之间的位置。
如上所述重组Sushi多肽的表达质粒体系的构建方法，包括：
(1)提供第一选定载体，并将鲎C因子中能与内毒素结合的功能片段的基因序列克隆到所述第一选定载体上，再将断裂蛋白质内含子插入所述基因序列的选定位点，获得第一质粒；
(2)以第一质粒为模板，经PCR获得N片段，以及，PstI和NdeI分步酶切第一质粒，获得C片段；
(3)另取第一选定载体，并将所述N片段和所述C片段分别克隆到第一选定载体上，而后PstI和NdeI双酶切分别连接到第二选定载体上，得到两种目标表达质粒。
其中，所述第一选定载体包括PTA2载体，所述第二选定载体包括pTWIN1载体，但均不限于此。
作为较佳的应用方案之一，该构建方法可以具体包括：
(1)将鲎C因子的CES12的编码基因序列TA克隆到PTA2载体上；
将断裂蛋白质内含子插入所述CES12的编码基因序列的选定位点，得到质粒pTA2/his-DnaX-CES12；
(2)以所述质粒pTA2/his-DnaX-CES12作为模板，经PCR得到N端片段，以及，PstI和NdeI分步酶切pTA2/his-DnaX-CES12获得C端片段；
(3)将N、C端片段分别经TA克隆到PTA2载体，并PstI和NdeI双酶切分别连接到pTWIN1载体上，获得目标表达质粒pTWIN1/his-DnaX-CES12-N和pTWIN1/his-DnaX-CES12-C。
如上所述重组Sushi多肽的表达质粒体系在制备重组Sushi多肽中的应用。
一种宿主细胞，包含如上所述的重组Sushi多肽的表达质粒体系。
一种重组Sushi多肽的制备方法，包括：将如上所述重组Sushi多肽的表达质粒体系于宿主细胞中进行融合表达，获得N端前体蛋白和C端前体蛋白，而后依次经纯化和去内毒素后，再诱导断裂蛋白质内含子剪接反应，获得具有LPS中和活性的目标产物。
作为较佳的应用方案之一，所述N端前体蛋白包含鲎C因子的CES12的N端部分和SspDnaX的N端部分及与其直接相连的His6组氨酸标签，所述C端前体蛋白包含SspDnaX的C端部分及与其直接相连的His6标签和CES12的C端部分。
本发明系采用了蛋白质反式剪接技术而实现的，即，利用断裂蛋白质内含子N端片段(IN)和C端片段(IC)的相互识别和结合，在IN和IC紧密结合的状态下，使断裂蛋白质内含子正确折叠而重建活性中心，释放断裂蛋白质内含子，连接蛋白质外显子，进而实现将一个蛋白质分两段表达后再剪接起来形成完整的蛋白质。
作为本发明的一个典型实施方案之一，可以通过OverlapextensionPCR技术在特定位点断开CES12基因(鲎C因子的Cys-rich、EGF-like和Sushi1、Sushi2区)，并分别连接到断裂蛋白质内含子SspDnaX的N端片段(IN)和C端片段(IC)进行融合表达、纯化和去内毒素后，诱导内含子剪接反应，得到了有LPS中和活性的目标蛋白。
需要指出的是，前述断裂蛋白质内含子可选自但不限于SspDnaX等。
前述鲎C因子可来源于美洲鲎、东方鲎、南方鲎或圆尾鲎等。
与现有技术相比，本发明的优点至少在于：能够实现鲎C因子中具有内毒素结合活性的功能片段(重组Sushi蛋白)的快速、大量以及低成本表达，并可有效避免宿主细胞中所含LPS的影响，有利于低成本内毒素检测试剂的规模化生产和应用。
附图说明
图1是本发明一较佳实施方案中鲎C因子功能片段CES12的反式剪接合成流程图，其中，a为N端前体蛋白，b为C端前体蛋白，c为目标蛋白；
图2是pTWIN1/his-DnaX-CES12-N和pTWIN1/his-DnaX-CES12-C构建图；
图3是酶切鉴定质粒的AgaroseGel电泳图，其中，1-对照质粒；2-BamHI酶切pTA2/his-DnaX-CES12，得到400bp的正确条带；3-PstI/NdeI双酶切pTWIN1/his-DnaX-CES12-N得到800bp的正确条带；4-PstI/NdeI双酶切pTWIN1/his-DnaX-CES12-C得到387bp的正确条带。
图4是His-DnaX-CES12-N和His-DnaX-CES12-C融合蛋白的表达的SDS-PAGE图，其中，1，未诱导菌液沉淀；2，N端蛋白菌液上清(25℃诱导)；3，N端蛋白菌液沉淀(25℃诱导)；4，N端蛋白菌液上清(37℃诱导)；5，N端蛋白菌液沉淀(37℃诱导)；6，C端蛋白菌液上清(37℃诱导)；7，C端蛋白菌液沉淀(37℃诱导)
图5是前体蛋白His-DnaX-CES12-N和His-DnaX-CES12-C及其反式剪接产物的SDS-PAGE检测图谱(PageRulerTMPlusPrestainedProteinLadder)；
图6a是鲎试剂与一定梯度内毒素反应的荧光曲线。Ex＝360nm；Em＝460nm.内毒素含量从左到右依次为：0.05，0.1，0.25，0.5，1，2，5，10EUmL-1；
图6b是内毒素含量对反应时间的双对数标准曲线.Y＝1.2444-0.2270*X；R2＝0.9977。
具体实施方式
概括的讲，作为本发明的一个方面，主要是利用蛋白质反式剪切体系表达鲎C因子的CES12区域，且剪切得到的蛋白具有内毒素结合活性，能够实现在大肠杆菌系统中低成本地开发内毒素检测试剂。
进一步的讲，本发明是利用蛋白质反式剪切体系表达鲎C因子的CES12基因，在该蛋白质反式剪切体系的构建过程中，选择的断裂位点可以是在鲎C因子的Sushi1中与内毒素结合的34个氨基酸区域，并且，利用该蛋白质反式剪切体系分段表达的两个前体蛋白均不具备LPS结合活性，而剪切后所获目标蛋白CES12具有内毒素中和活性。
作为本发明的一种较为优选的实施方案，本发明中蛋白质反式剪切体系的建立过程可以包括：根据SspDnaX的剪接活性，选择在鲎C因子的基因序列492和493核苷酸之间将CES12断裂成N端和C端两部分，其中的N端前体蛋白包含鲎C因子功能片段CES12的N端部分(1～492位核苷酸)，SspDnaX的N端部分(DnaX-N)以及与之直接相连的His6组氨酸标签(参阅图1(a))，而C端前体蛋白包含SspDnaX的C端部分(DnaX-C)以及与之直接相连的His6标签和CES12的C端部分(493～723位核苷酸)(参阅图1(b))。这两种前体蛋白都在T7启动子的控制下，分别加入IPTG诱导表达，纯化(包涵体需复性)，在剪接缓冲液中等量混合，借助DnaX-N和DnaX-C之间强的结合力，释放DnaX后，CES12的N端和C端部分结合形成完整的目标蛋白(参阅图1(c))。
以下结合一较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
本实施例中所采用的材料及其来源如下：
大肠杆菌DH5α和大肠杆菌BL21(DE3)购自美国NEB公司；质粒载体pTWIN1和断裂蛋白质内含子SspDnaX来自本实验室已构建的质粒；TaqDNA聚合酶，T4DNA连接酶和各种限制性内切酶均购自美国NEB公司；质粒小抽试剂盒和胶回收试剂盒为Qiagen产品；His-binding-resin购自上海Solarbio公司；其余试剂均为国产分析纯；PCR引物均由上海生工合成。鲎血细胞，内毒素检测试剂盒，内毒素去除试剂盒由厦门市鲎试剂实验厂有限公司馈赠。荧光底物购于美国sigma公司。
但需要指出的是，很显然，本领域技术人员亦可采用业界悉知的其他公知途径获取和应用与上述材料等同的其他材料。
本实施例的实施过程包括：
1、pTWIN1/his-DnaX-CES12-N和pTWIN1/his-DnaX-CES12-C表达质粒的构建
参阅图2，该步骤是将内含子SspDnaX插入到质粒pTA2CES12中，得到pTA2/his-DnaX-CES12，然后分别通过PCR和酶切，构建质粒pTA2/his-DnaX-CES12-N和pTA2/his-DnaX-CES12-C，最后通过酶切转换到PTWIN1表达载体。
进一步的，该步骤包括：
以RT-PCR从鲎血细胞中得到东方鲎C因子的全长cDNA序列并通过PCR得到CES12的编码序列(上游引物Primer1和下游引物Primer2)，TA克隆到PTA2载体上。PCR扩增断裂蛋白质内含子片段(上游引物Primer3和下游引物Primer4)。然后用OverlapPCR方法将断裂蛋白质内含子插入选定位点，得到质粒pTA2/his-DnaX-CES12。以此作为模板，经PCR得到N端片段(上游引物Primer5和下游引物Primer6)。PstI和NdeI分步酶切pTA2/his-DnaX-CES12可得C端片段。N、C端片段分别经TA克隆到PTA2载体并PstI和NdeI双酶切分别连接到pTWIN1载体上，得到pTWIN1/his-DnaX-CES12-N和pTWIN1/his-DnaX-CES12-C表达质粒，PCR及酶切鉴定并做进一步DNA序列测定。参阅图3，酶切结果显示构建的质粒条带大小正确，测序证明表达质粒中插入片段核苷酸无突变。
2、His-DnaX-CES12-N和His-DnaX-CES12-C融合蛋白的表达和纯化
表达质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，转化菌株涂布于含100μg/mLAmpicillin的LB固体培养基，37℃培养过夜。挑取单菌落接种于5mL含100μg/mLAmpicillin的LB液体培养基，37℃，220r/min培养过夜。过夜培养物以1∶50的比例接种于500mL含100μg/mLAmpicillin的新鲜LB液体培养基中37℃，220r/min培养，培养至OD600＝0.6，加入IPTG至终浓度为0.8mM，37℃，220r/min诱导蛋白表达3h。
4℃，5000g离心收集500mL细菌培养液，用20mL破菌缓冲液(20～50mMTris-HCl，pH7.3-8.3，含0.25M～0.5MNaCl)重悬沉淀。工作5s，间隔10s，130w*50％超声破菌15～20min。4℃，5000g离心，分别取少量上清以及沉淀经煮沸处理后，用SDS-PAGE电泳分析产物的表达部位。经SDS-PAGE检测，N端前体蛋白集中在包涵体中，C端前体蛋白在上清部分有较高表达(图4)。
包涵体用洗杂缓冲液(1％TritonX-100，1mMEDTA，1Murea)洗三次，再用适量裂解缓冲液(100mMNaH2PO4，10mMTris.Cl，8Murea)重悬，留上清。用10倍柱体积破菌缓冲液(20～50mMTris-HCl，pH7.3～8.3，含0.25M～0.5MNaCl，8Murea)平衡纯化柱，上样后，用10倍体积含1mM咪唑的破菌缓冲液洗柱，然后用10～20倍柱体积含20mM咪唑的破菌缓冲液将杂蛋白从纯化柱上洗去，最后用4～10倍柱体积含200mM咪唑的破菌缓冲液洗脱目标蛋白，纯化后的蛋白保存于-20℃。
3、去除内毒素
按照内毒素去除试剂盒说明书操作。加入5mL预冷再生缓冲液活化树脂，调节流速控制器，保持流速在0.25mL/min(10滴/min)，流干后重复操作两次。加入6mL预冷平衡缓冲液，0.5mL/min流干后重复操作两次。然后加入样品，使流速不高于0.25mL/min。待流出液体积达到1.5mL后，使用无热原接收管接受样品。样品流干后，再加入1.5mL～3.0mL预冷平衡缓冲液淋洗，合并收集淋洗液。检测样品浓度及内毒素水平。
4、包涵体的复性
将变性蛋白转移到透析袋(MWCO：7,000，Houston，TX)中，然后依次将透析袋放入含有不同浓度尿素(6M，4M，2M，1M)的复性缓冲液(20mMTris-HCl，150mMNaCl，1mMEDTA，PH7.4～8)中，分别放置在搅拌器上透析1h，最后将透析袋转移到完全不含尿素的复性缓冲液(含2mMDTT)中。参阅图5，经IPTG诱导表达、His-bingding-resin纯化、透析复性，所获得的N端(泳道1)和C端前体蛋白(泳道2)的电泳纯度能达到90％以上。并且，SDS-PAGE所显示的N端和C端前体蛋白的表观分子量分别为30kDa和14.4kDa，与根据基因序列所推测的分子量是一致的。
5、体外剪接
纯化且复性的前体蛋白按摩尔比1∶1混合装入透析袋中，置入剪接缓冲液(20mMTris-HCl，150mMNaCl，1mMDTT，PH7.0)中，室温密封过夜反应，SDS-PAGE分析剪切结果，参阅图5(泳道4)，可以看到产生了26.6kD处目的蛋白。
6、剪接产物体外活性测定
利用动态荧光法检测内毒素含量变化来定性检测剪接产物的体外活性。
用细菌内毒素检查用水配制0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、5、10EU/mL的内毒素溶液，并准备好鲎试剂，荧光底物。利用动态荧光法制定标准曲线(见图6)，并测定剪接产物内毒素含量，结果显示低于0.1EU/mL。
参阅表2，测定剪切产物对LPS的结合活性。向A-H孔中分别加入表中相应浓度的蛋白(N端前体蛋白，C端前体蛋白，剪接产物或BSA标准蛋白)和内毒素，在37℃恒温箱孵育30min后，加入100μl鲎试剂及10μl荧光底物，用内毒素检查用水补足总体积至200μl。其中，H孔先将内毒素与剪接产物在37℃恒温箱孵育30min后，接着调节PH至5.0，并加入终浓度为万分之五的胃蛋白酶，37℃消化反应30min，PH值调回7～8，利用动态荧光法检测内毒素含量。
抑制试验：以2EU/mL标准内毒素为基准，加入剪接产物(对照为N端前体蛋白，C端前体蛋白，BSA标准蛋白)与内毒素结合反应后，利用动态荧光法测定内毒素含量变化。
抑制-释放试验：基于上述抑制试验，利用胃蛋白酶的酶消化作用，将发生抑制试验的剪接产物从内毒素上消化下来，使内毒素重新释放，利用动态荧光法测定内毒素含量变化。
由标准曲线计算测得的N端前体蛋白含内毒素的量为0.14EU/mL，C端前体蛋白含内毒素的量为0.10EU/mL；剪接产物含内毒素的量为0.20EU/mL.分别以N端前体蛋白，C端前体蛋白和BSA标准蛋白为对照，2EU/mL内毒素与剪接产物作用结合后，含量下降至0.73EU/mL，而对照组基本没有变化(分别为1.92，1.95，2.03EU/mL)说明此剪接产物可结合内毒素，后经胃蛋白酶消化释放后内毒素含量可回复至3.64EU/mL，推测在剪接过程中不可避免地引入了少量内毒素，故而酶消化之后测得的内毒素高于2EU。
需要指出的是，以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉该技术的人在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
表1引物序列
表2本发明实施例中测定剪切产物对LPS的结合活性的加样表
| 样品 | A孔 | B孔 | C孔 | D孔 | E孔 | F孔 | G孔 | H孔* |
| 内毒素(EU mL-1) | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| N端前体蛋白(ng mL-1) | 0.2 | 0 | 0 | 0.2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| C端前体蛋白(ng mL-1) | 0 | 0.2 | 0 | 0 | 0.2 | 0 | 0 | 0 |
| 剪接产物(ng mL-1) | 0 | 0 | 0.2 | 0 | 0 | 0 | 0.2 | 0.2 |
| BsA标准蛋白(ng mL-1) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.2 | 0 | 0 |
| 鲎试剂(μl) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 荧光底物(μl) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
Claims (8)
1.一种重组Sushi多肽的表达质粒体系，其特征在于包含分别与断裂蛋白质内含子的N端片段和C端片段连接的第一基因和第二基因，其中，所述第一基因和第二基因由鲎C因子中能与内毒素结合的功能片段的编码基因序列在选定位点断裂而形成；
其中，所述用于编码鲎C因子中能与内毒素结合的功能片段的基因包括用于编码sushi1区域的基因，而
所述选定位点对应于鲎C因子第492和第493核苷酸之间的位置。
2.如权利要求1所述重组Sushi多肽的表达质粒体系的构建方法，其特征在于，包括：
(1)提供第一选定载体，并将鲎C因子中能与内毒素结合的功能片段的基因序列克隆到所述第一选定载体上，再将断裂蛋白质内含子插入所述基因序列的选定位点，获得第一质粒；
(2)以第一质粒为模板，使用上游引物和下游引物经PCR获得N端片段，所述上游引物和下游引物的序列分别为：
5’-TACTCATATGAGAGGAGTAGATCTGG-3’
5’TCGACTGCAGTCAACCATGGTGATGATGGTGATGAC-3’，
以及，使用限制性内切酶PstI和NdeI分步酶切第一质粒，获得C端片段；
(3)另取第一选定载体，并将所述N端片段和所述C端片段分别克隆到第一选定载体上，而后使用限制性内切酶PstI和NdeI双酶切分别连接到第二选定载体上，得到两种目标表达质粒。
3.根据权利要求2所述的表达质粒体系的构建方法，其特征在于，所述第一选定载体包括pTA2载体，所述第二选定载体包括pTWIN1载体。
4.根据权利要求2所述的表达质粒体系的构建方法，其特征在于，具体包括：
(1)将鲎C因子的CES12的编码基因序列经TA克隆到pTA2载体上；
将断裂蛋白质内含子插入所述CES12的编码基因序列的选定位点，得到质粒pTA2/his-DnaX-CES12；
(2)以所述质粒pTA2/his-DnaX-CES12作为模板，经PCR得到N端片段，以及，使用限制性内切酶PstI和NdeI分步酶切pTA2/his-DnaX-CES12获得C端片段；
(3)将N、C端片段分别经TA克隆到pTA2载体，并使用限制性内切酶PstI和NdeI双酶切分别连接到pTWIN1载体上，获得目标表达质粒pTWIN1/his-DnaX-CES12-N和pTWIN1/his-DnaX-CES12-C。
5.如权利要求1所述重组Sushi多肽的表达质粒体系在制备重组Sushi多肽中的应用。
6.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求1所述的重组Sushi多肽的表达质粒体系。
7.一种重组Sushi多肽的制备方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述重组Sushi多肽的表达质粒体系于宿主细胞中进行融合表达，获得N端前体蛋白和C端前体蛋白，而后依次经纯化和去内毒素后，再诱导断裂蛋白质内含子剪接反应，获得具有LPS中和活性的目标产物。
8.根据权利要求7所述重组Sushi多肽的制备方法，其特征在于，
所述N端前体蛋白包含鲎C因子的CES12的N端部分和SspDnaX的N端部分及与其直接相连的His6组氨酸标签，所述C端前体蛋白包含SspDnaX的C端部分及与其直接相连的His6组氨酸标签和CES12的C端部分。
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