CN105601749A - 一种重组华支睾吸虫分泌型磷脂酶a2蛋白及其体外可溶性表达与纯化制备方法 - Google Patents

一种重组华支睾吸虫分泌型磷脂酶a2蛋白及其体外可溶性表达与纯化制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组华支睾吸虫分泌型磷脂酶A2蛋白及其体外可溶性表达与纯化制备方法。现有表达技术获得的<i>Cs</i>sPLA2？蛋白是包涵体，没有酶活性，即使包涵体复性后酶活性也非常微弱。本发明所述重组<i>Cs</i>sPLA2？蛋白，含有<i>Cs</i>sPLA2？？蛋白和MBP标签蛋白。本发明通过广泛而深入的研究，通过特殊表达方式的优化，？首次实现了<i>Cs</i>sPLA2？蛋白的可溶性表达，并制备获得了具有生物活性的重组<i>Cs</i>sPLA2？蛋白，有效地克服了现有表达技术中所存在的问题。

Description

一种重组华支睾吸虫分泌型磷脂酶A2蛋白及其体外可溶性表达与纯化制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组华支睾吸虫分泌型磷脂酶A2蛋白及其体外可溶性表达与纯化制备方法。
背景技术
现有针对华支睾吸虫分泌型磷脂酶A2蛋白(亦即，CssPLA2蛋白，GenBank登录号：ABL07371.1)的表达技术只能以包涵体形式表达出无生物活性的华支睾吸虫分泌型磷脂酶A2蛋白，由于所表达出的华支睾吸虫分泌型磷脂酶A2蛋白不具有生物活性，而不能用于进行该蛋白的功能研究。即使进行复杂的蛋白复性技术处理后，所得蛋白的生物性活性仍然相当低。
例如：现有文献F.Huetal./Molecular&BiochemicalParasitology167(2009)127–134以华支睾吸虫cDNA文库编号为Cs4e05的质粒为模板，应用设计的特异引物，进行PCR扩增目的基因。将目的基因和原核表达质粒pET-28a酶切、回收、连接及转化，构建重组质粒pET-28a-CssPLA2.将构建的重组质粒转化入BL21(DE3)感受态细胞，将CssPLA2重组工程菌液大量培养、IPTG诱导表达后，重组蛋白以包涵体形式表达，12％SDS-PAGE电泳显示在分子量约34kDa处出现一明显条带。由于重组蛋白以包涵体形式表达，破菌得到的包涵体经6M尿素变性、稀释和透析复性后，经过金属离子亲和层析柱，在不同低浓度咪唑梯度漂洗后，用200mmol/L咪唑洗脱，获得分子量约34kDa的单一蛋白。MTT法和流式细胞仪检测了CssPLA2蛋白刺激人肝星状细胞LX-2增殖，半定量RT-PCR检测了CssPLA2蛋白可促进人肝星状细胞LX-2Ⅲ型胶原的mRNA表达上调，从而导致肝纤维化。
至今，现有技术中尚未见能够实现华支睾吸虫分泌型磷脂酶A2蛋白可溶性表达的技术。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种重组华支睾吸虫分泌型磷脂酶A2蛋白(亦即，重组CssPLA2蛋白)及其体外可溶性表达与纯化制备方法。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种重组CssPLA2蛋白，含有CssPLA2蛋白和MBP标签蛋白。
优选地，所述CssPLA2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，具体为：KPRSISRDKPHAELEWSGKLSDNQTIHIWTVASKGLFGEISKPAWIQVDIRGSNSSQDAIRLIFDQEHRLRYCVFGTDTVETSVSLDDADLLTRNPIYLEHFFFTSANEFLRACKELRRASEEPAKLVRRPRTAYRANPMIMPGTLWCGKGNAATRERTFGDEIETDMCCRTHDRCFENIQSLTSKFGYYNPSPVTISNCECDDEFLSCLENAGTEAATRVGNLYFNVFKIPCFLRRTERICTHNDESGACGQFENREDIELFRPQRFVAPYITV。
优选地，所述MBP标签蛋白的氨基酸序列为pMAL-c2X质粒上MBP标签蛋白编码序列所对应的氨基酸序列。
优选地，CssPLA2蛋白的N端与MBP标签蛋白的C端连接。
优选地，所述CssPLA2蛋白和MBP标签蛋白之间通过连接肽连接。
进一步优选地，所述连接肽的氨基酸序列为pMAL-c2x质粒上MBP标签蛋白编码序列之后到Xba1酶切位点之前的核苷酸序列所对应的氨基酸序列。
本发明的第二方面，提供了一种重组CssPLA2蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)获得CssPLA2目的基因；
(2)构建重组质粒：将步骤(1)所得CssPLA2目的基因以及载体质粒采用相同的限制性内切酶切割，然后进行连接，获得重组质粒；
(3)将步骤(2)所得重组质粒导入感受态细胞，转化；
(4)筛选阳性克隆，并将正确的重组质粒转化宿主感受态细胞；
(5)诱导表达重组CssPLA2蛋白。
优选地，步骤(1)中，CssPLA2目的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，具体为：
AAACCACGGTCAATTTCAAGGGACAAGCCACATGCTGAATTGGAATGGAGTGGAAAGTTGTCAGACAATCAGACAATTCATATATGGACAGTAGCATCGAAAGGACTATTTGGAGAGATCTCGAAACCGGCTTGGATCCAGGTTGATATCCGAGGCTCAAATTCCAGTCAAGACGCCATTCGTCTGATATTCGATCAAGAGCATCGACTCCGTTATTGTGTGTTCGGTACAGACACTGTCGAAACATCAGTCAGTCTGGACGACGCGGATTTACTGACCAGAAATCCCATCTATCTGGAGCACTTTTTTTTCACGTCGGCCAATGAATTCCTTCGAGCGTGTAAAGAGCTCCGGAGGGCGTCAGAAGAGCCGGCCAAACTGGTCCGTCGTCCGAGAACTGCCTACCGGGCTAACCCGATGATAATGCCTGGCACACTATGGTGTGGCAAAGGTAATGCTGCCACGCGCGAACGAACATTTGGTGACGAAATCGAGACTGACATGTGCTGTCGAACTCATGACCGATGTTTTGAAAACATCCAGAGTCTGACGAGTAAATTCGGATACTACAATCCATCGCCAGTGACGATTTCAAATTGTGAATGCGACGATGAGTTCCTCAGCTGTCTTGAAAACGCAGGAACTGAAGCAGCCACTCGAGTTGGAAACCTGTACTTCAATGTATTCAAAATTCCGTGTTTCTTGCGGCGCACCGAACGCATTTGTACCCACAATGACGAAAGCGGAGCATGTGGACAATTTGAAAATAGAGAAGATATTGAACTGTTCCGCCCGCAACGTTTTGTTGCTCCGTACATTACTGTATGA。
优选地，步骤(2)中，所述载体质粒为pMAL-c2x质粒。
优选地，步骤(2)中，所述限制性内切酶为Xba1和HindIII。
优选地，步骤(3)中，所述感受态细胞为肠杆菌DH5α感受态细胞。
优选地，步骤(4)中，所述宿主感受态细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
优选地，步骤(5)中，所述诱导为IPTG诱导。
本发明的第三方面，提供前述重组CssPLA2蛋白作为催化磷脂二位酰基水解酶中的用途。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过广泛而深入的研究，通过特殊表达方式的优化，首次实现了CssPLA2蛋白的可溶性表达，并制备获得了具有生物活性的重组CssPLA2蛋白。有效地克服了现有表达技术中所存在的问题，例如现有文献F.Huetal./Molecular&BiochemicalParasitology167(2009)127–134所得的CssPLA2蛋白是包涵体，没有酶活性，即使包涵体复性后酶活性也损失很大，本领域技术人员有重复过这个实验，结果发现包涵体复性后酶活性非常微弱，远远低于本发明所得重组CssPLA2蛋白的活性。
附图说明
图1：CssPLA2目的基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
图2：重组质粒pMAL-c2X/CssPLA2的双酶切鉴定图，M1，M2：DNA标准分子量；1：空质粒XbaI和HindIII双酶切；2：重组质粒XbaI和HindIII双酶切；3：CssPLA2目的基因PCR产物。
图3：重组质粒pMAL-c2X/CssPLA2在大肠埃希菌BL21/DE3的表达产物的12％SDS-PAGE电泳分析图，M：蛋白标准分子量；1：重组质粒pMAL-c2X/CssPLA2IPTG诱导前；2：重组质粒pMAL-c2X/CssPLA2IPTG诱导后上清；3：重组质粒pMAL-c2X/CssPLA2IPTG诱导后沉淀；4：树脂亲和纯化后重组CssPLA2蛋白。
图4：阴离子交换层析法纯化重组CssPLA2蛋白(即MBP-CssPLA2融合蛋白)。
图5：12％SDS-PAGE分析纯化重组CssPLA2蛋白的纯度。
图6：Westernblotting鉴定重组CssPLA2蛋白。
图7：质谱(Massspectrum)鉴定重组CssPLA2蛋白。
图8：重组CssPLA2蛋白酶活性测定图，sPLA2(分泌型磷脂酶A2)酶活检测试剂盒检测出实施例1中所得重组CssPLA2蛋白(MBP-CssPLA2融合蛋白)具有酶活性。
图9：温度对重组CssPLA2蛋白酶活性的影响。
图10：酶浓度对重组CssPLA2蛋白酶活性的影响。
图11：底物浓度对重组CssPLA2蛋白酶活性的影响。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。
实施例1重组CssPLA2蛋白(即MBP-CssPLA2融合蛋白)的克隆表达
1.1以华支睾吸虫成虫cDNA文库中CssPLA2基因的克隆质粒(编号为Cs4e05)为模板(Template)，应用设计的特异引物，进行PCR扩增目的基因：
CssPLA2上游引物(P1)：5’-CTAGTCTAGAAAACCACGGTCAATTTCA-3’(SEQIDNO.2)下划线为XbaI酶切位点)；
CssPLA2下游引物(P2)：5’-GGGAAGCTTGCTCATACAGTAATGTACG-3’(SEQIDNO.3)下划线为HindIII酶切位点)。
通过ExTaqTM酶进行PCR扩增，反应条件如下：
95℃预变性10min，反应循环参数为95℃30s，57℃30s，72℃1min，共进行30个循环；72℃10min。
PCR反应体系如下：
10×Ex Taq Buffer(Mg2+plus) 5.0μl
dNTPs(10mmol/L) 4.0μl
P1CssPLA2上游引物(10μmol/L) 2.0μl
P2CssPLA2下游引物(10μmol/L) 2.0μl
Template 1.0μl
Ex Taq(5U/μL) 0.5μl
dd H2O 35.5μl
Total volume 50.0μl
将所得目的基因的扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定：
(1)称取0.6g琼脂糖粉溶于1×TAE60ml溶液中，加热煮沸3-4min，待冷却至50℃左右时加入2.5μl的EB替代物(10mg/ml)至终浓度为0.5μg/ml，混匀后灌胶；
(2)电泳：将DNA样品(亦即，目的基因的扩增产物，约5μl)与1μl的6×LoadingBuffer混合后加于加样孔中，5μlDL2000Marker加于加样孔中，100V电压下开始电泳，直到样品条带至胶面2/3位置即可；
(3)取出凝胶，凝胶成像仪下拍照。
如图1所示，所得目的基因的扩增产物，分子量为828bp，与预期相符。
1.2目的基因(CssPLA2基因)和质粒pMAL-c2x的双酶切、回收纯化：
(1)接种含有原核表达质粒pMAL-c2x的DH5α，用质粒小量提取试剂盒提取空质粒pMAL-c2x(按试剂盒说明书操作)，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，与预期相符；
(2)将1.1中所得目的基因扩增产物进行1.0％的琼脂糖凝胶电泳，根据基因分子量大小切胶，用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化(按试剂盒说明书操作)，回收产物取少量进行1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，与预期相符；
(3)将质粒pMAL-c2x和已回收纯化的目的基因扩增产物分别同时用XbaI和HindIII进行双酶切，双酶切体系如下：
10×K Buffer 2.0μl
PCR Produt/pMAL-c2Xvector 8.0μl
XbaI 1.0μl
HindIII 1.0μl
dd H2O 8.0μl
Total volume 20.0μl
(4)将上述双酶切体系混匀后置于37℃水浴中反应30min，将反应产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，根据各自的分子量大小切胶，用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化双酶切产物，保存于-20℃备用。
1.3目的基因(CssPLA2基因)和表达载体pMAL-c2x的连接：
将1.2中回收纯化的目的基因双酶切产物和pMAL-c2x双酶切产物按体积比为4：1混合，建立20μl的连接反应体系：
将上述连接反应体系的各组分点动混匀(亦即，采用一个小的离心机将各样品组分混匀)后室温反应1h，获得连接产物。
1.4连接产物的转化
(1)将10μl上述1.3中所得连接产物加至200μlDH5α/DE3感受态细胞中，轻柔混匀，冰浴30min；
(2)然后置于42℃水浴90sec(时间需严格控制且不能摇动)；
(3)立即取出置于冰上5min；
(4)超净台内于往EP管中加入800μlLB培养基，轻柔混匀，封口；
(5)37℃，150rpm，慢摇1～1.5h；
(6)4℃，4,000rpm离心5min，弃800μl上清；
(7)用移液器轻吹起沉淀混匀，然后将200μl细菌悬液涂布于氨苄青霉素抗性固体琼脂培养板上，置于37℃培养箱中培养，待平板干燥后倒置平板，继续培养14～16h。
1.5阳性克隆鉴定：
(1)挑取培养板上长出的单克隆菌落，接入5ml含有5μl氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，250rpm振摇过夜；
(2)以菌液为模板，用上述1.1中的所述引物和反应条件对目的基因进行PCR扩增，用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定；
(3)选取阳性菌液(含有目的基因)，用质粒小量提取试剂盒提取阳性菌的重组质粒，经上述1.2中双酶切体系酶切，酶切产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳以鉴定重组是否成功。结果如图2所示，表明重组质粒pMAL-c2X/CssPLA2重组成功。
(4)将鉴定成功的阳性克隆进行测序(由广州艾基生物技术有限公司完成)，保证阳性克隆重组质粒中插入片段的准确性。
根据测序结果，目的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2示，具体为：
AAACCACGGTCAATTTCAAGGGACAAGCCACATGCTGAATTGGAATGGAGTGGAAAGTTGTCAGACAATCAGACAATTCATATATGGACAGTAGCATCGAAAGGACTATTTGGAGAGATCTCGAAACCGGCTTGGATCCAGGTTGATATCCGAGGCTCAAATTCCAGTCAAGACGCCATTCGTCTGATATTCGATCAAGAGCATCGACTCCGTTATTGTGTGTTCGGTACAGACACTGTCGAAACATCAGTCAGTCTGGACGACGCGGATTTACTGACCAGAAATCCCATCTATCTGGAGCACTTTTTTTTCACGTCGGCCAATGAATTCCTTCGAGCGTGTAAAGAGCTCCGGAGGGCGTCAGAAGAGCCGGCCAAACTGGTCCGTCGTCCGAGAACTGCCTACCGGGCTAACCCGATGATAATGCCTGGCACACTATGGTGTGGCAAAGGTAATGCTGCCACGCGCGAACGAACATTTGGTGACGAAATCGAGACTGACATGTGCTGTCGAACTCATGACCGATGTTTTGAAAACATCCAGAGTCTGACGAGTAAATTCGGATACTACAATCCATCGCCAGTGACGATTTCAAATTGTGAATGCGACGATGAGTTCCTCAGCTGTCTTGAAAACGCAGGAACTGAAGCAGCCACTCGAGTTGGAAACCTGTACTTCAATGTATTCAAAATTCCGTGTTTCTTGCGGCGCACCGAACGCATTTGTACCCACAATGACGAAAGCGGAGCATGTGGACAATTTGAAAATAGAGAAGATATTGAACTGTTCCGCCCGCAACGTTTTGTTGCTCCGTACATTACTGTATGA。充分说明阳性克隆重组质粒中插入片段完整正确。
1.6重组质粒在大肠杆菌BL21/DE3中的诱导表达：
(1)将经测序和比对验证正确的重组质粒pMAL-c2X/CssPLA2转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于氨苄青霉素抗性琼脂培养板上，置于37℃培养箱中培养，待平板干燥后将平板倒置，继续培养14～16h；挑取单克隆，接入5mlLB液体培养基中，37℃、250rpm振摇培养后经菌液PCR和双酶切鉴定；
(2)将经验证正确的重组体及空质粒pMAL-c2x分别接入5ml氨苄青霉素抗性的LB培养基中，37℃、250rpm振摇培养过夜；
(3)次日按照1：100的体积比例(菌液的体积：培养基的体积)将过夜热菌转接LB培养基，37℃、250rpm振摇培养至OD600＝0.5～0.6；
(4)吸取1ml菌液作为未诱导表达的对照；分别加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG，37℃、250rpm诱导培养4h；吸取1ml菌液作为诱导表达后的样品；
(5)将对照和样品离心后挑取少许沉淀，分别加入5μlDTT和95μl1×SDS，混匀点动后煮沸5-10min；
(6)13,000rpm离心1min，吸取10μl上清进行SDS-PAGE(12％)；
(7)考马斯亮蓝R250室温下染胶30min，煮沸脱色后观察重组CssPLA2蛋白是否表达。
1.7重组CssPLA2蛋白(即MBP-CssPLA2融合蛋白)的大量表达及纯化
首先，进行重组CssPLA2蛋白的大量表达：
(1)将重组体接于5ml氨苄青霉素抗性LB培养基中，37℃、250rpm摇过夜；
(2)次日从过夜菌中按1：100的体积比例转接至LB培养基中，37℃、250rpm振摇培养至OD600＝0.5～0.6；分别加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG，37℃、250rpm诱导表达4h；
(3)将菌液在4℃、8,000rpm条件下离心15min收集菌体；
(4)重悬菌体，按1：20的体积比例(20mMTris7.4：培养基)加入1×结合缓冲液(20mMTris7.4)；
(5)菌体悬液置于冰上超声破碎2次(超声1sec后停2sec，每次超声15min)；
(6)4℃、13,000rpm离心20min后分别收集上清与沉淀，吸取上清30μl，加入2μlDTT及8μl4×SDS上样缓冲液；挖取少量沉淀，加入5μlDTT和95μl1×SDS上样缓冲液，样品混匀后煮沸5-10min，12％SDS-PAGE观察重组CssPLA2蛋白表达情况，结果如图3所示。
接下来，进行重组CssPLA2蛋白的亲和纯化：
(1)Amyloseresin(直链淀粉树脂)亲和层析柱预处理：3倍体积去离子水；3倍体积0.1％SDS；1倍体积去离子水；3倍体积过柱缓冲液(20mMTris7.4，200mMNacl,1mMEDTA)；
(2)将上述得到的上清用0.45μm滤膜过滤两次；当缓冲液降至接近树脂表面时，加入上清样品，过柱三次，同时保留流出液；
(3)至少100倍体积的1×结合缓冲液冲洗以除去杂蛋白；
(4)加入10倍体积的10mMmaltose(麦芽糖)洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；
(5)用3倍体积去离子水；3倍体积0.1％SDS；1倍体积去离子水；3倍体积过柱缓冲液；3倍体积20％乙醇冲洗Amyloseresin(直链淀粉树脂)，并将树脂保存于20％乙醇中；
(6)吸取洗脱液30μl，加入2μlDTT与8μl4×SDS上样缓冲液，煮沸5-10min后12％SDS-PAGE分析纯化重组CssPLA2蛋白的纯度，如图3所示；
(7)根据电泳结果，将含有较纯重组CssPLA2蛋白的洗脱液装入透析袋中，在4℃、Tris缓冲液(pH8.0)中透析，每隔4小时左右更换一次透析液，总共换液3～4次；
(8)使用中高压层析系统和阴离子交换柱(HiTrapQFF)用阴离子交换层析(Anionexchangechromatography)的方法进一步纯化重组CssPLA2蛋白；先用15ml缓冲液(20mMTris-HCL,PH8.0)冲洗柱子，然后加入重组CssPLA2蛋白样品，再用5mM-500mM的Nacl缓冲液(20mMTris-HCL,PH8.0，5mM-500mM的NaCl)梯度洗脱，收集洗脱液；当使用100mM和300-400mMNacl缓冲液洗脱时分别可见明显洗脱峰，如图4所示。分别吸取各个梯度的洗脱液30μl，加入2μlDTT与8μl4×SDS上样缓冲液，煮沸5-10min后12％SDS-PAGE分析纯化重组CssPLA2蛋白的纯度；300-400mMNacl缓冲液洗脱时的洗脱峰为目的重组CssPLA2蛋白(即MBP-CssPLA2融合蛋白)，12％SDS-PAGE如图5中，可见一分子量约为76kDa的单一条带，说明所得重组CssPLA2蛋白(MBP-CssPLA2融合蛋白)的分子量大小与预期是相符的。CssPLA2蛋白分子量约为34kDa，pMAL-c2x质粒上附带的MBP标签蛋白的分子量约为42kDa，因此，重组CssPLA2蛋白(MBP-CssPLA2融合蛋白)的分子量约为76kDa。
1.8Westernblot和质谱鉴定重组CssPLA2蛋白：
使用CssPLA2单克隆抗体和质谱方法分别鉴定重组CssPLA2蛋白。
首先，采用Westernblotting鉴定重组CssPLA2蛋白：
(1)重组CssPLA2蛋白进行12％SDS-PAGE后，将凝胶置于电转移缓冲液中浸泡15min；
(2)准备PVDF膜和数张滤纸，PVDF膜按如下顺序依次处理：100％甲醇中10sec→去离子水中5min→电转移缓冲液中浸泡10min，同时将滤纸直接浸泡于电转移液中；
(3)孔板安装顺序依次为：黑孔板、凝胶纤维垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、凝胶纤维垫、白孔板；凝胶、PVDF膜、滤纸要对齐，每层的气泡均要排尽，安装完正确置于电转移槽中；
(4)100V恒压，冰上转膜1～1.5h；
(5)将PVDF膜浸泡在甲醇中10sec，取出用滤纸使其完全干燥；
(6)将PVDF膜浸于5％脱脂奶粉溶液中，室温封闭2h；
(7)用PBST洗膜3次，5min/次；
(8)将PVDF膜与按1：300稀释(稀释液为1％BSA)的华支睾吸虫CssPLA2单克隆抗体孵育，4℃过夜；
(9)用PBST洗膜5次，5min/次；
(10)将PVDF膜与HRP标记的兔抗小鼠IgG(1：2,000稀释)孵育,室温孵育1h；
(11)用PBST洗膜5次，5min/次；
(12)用滤纸将膜完全干燥，浸入ECL发光液显色(A、B液各取1ml)，使用荧光、化学发光成像分析系统拍照。结果如图6所示，说明实施例1所得重组CssPLA2蛋白是正确的。
重组CssPLA2蛋白的质谱鉴定由中山大学中山医学院蛋白组学中心鉴定。结果如图7所示，同样说明，实施例1所得重组CssPLA2蛋白是正确的。
具体的，重组CssPLA2蛋白，含有CssPLA2蛋白和MBP标签蛋白。所述CssPLA2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，具体为：
KPRSISRDKPHAELEWSGKLSDNQTIHIWTVASKGLFGEISKPAWIQVDIRGSNSSQDAIRLIFDQEHRLRYCVFGTDTVETSVSLDDADLLTRNPIYLEHFFFTSANEFLRACKELRRASEEPAKLVRRPRTAYRANPMIMPGTLWCGKGNAATRERTFGDEIETDMCCRTHDRCFENIQSLTSKFGYYNPSPVTISNCECDDEFLSCLENAGTEAATRVGNLYFNVFKIPCFLRRTERICTHNDESGACGQFENREDIELFRPQRFVAPYITV。CssPLA2所述MBP标签蛋白的氨基酸序列为pMAL-c2x质粒上MBP标签蛋白编码序列所对应的氨基酸序列。蛋白的N端与MBP标签蛋白的C端连接。所述CssPLA2蛋白和MBP标签蛋白之间通过连接肽连接。所述连接肽的核苷酸编码序列具体是pMAL-c2x质粒上MBP标签蛋白编码序列之后到Xba1酶切位点之前的核苷酸序列。
小结：本发明经过广泛而深入的研究，曾经尝试过多个原核表达质粒，如pET-30a、pET-32a、pET-26b、pGEX-4T-1、pMAL-c2x，最后发现只有pMAL-c2x质粒能够表达出可溶性且具有生物活性的CssPLA2蛋白。
实施例2实施例1所得重组CssPLA2蛋白的酶活性测定
使用分泌型PLA2(sPLA2)酶活测定试剂盒测定实施例1所得重组CssPLA2蛋白的酶活性，用蜜蜂分泌型PLA2作为阳性对照，用MBP标签蛋白(麦芽糖结合蛋白)作为阴性对照。
原理：磷脂酶A2(PhospholipaseA2)，简称PLA2，它能够水解甘油磷脂的第二位脂酰键(sn-2)，生成溶血磷脂和脂肪酸。
操作步骤：
(1)阴性对照组：在酶标板小孔中加人10ulDTNB，5ul反应缓冲液和10ulMBP对照蛋白；
(2)阳性对照组：在酶标板小孔中加人10ulDTNB，5ul反应缓冲液和10ul蜜蜂PLA2蛋白；
(3)实验组：在酶标板小孔中加人10ulDTNB，5ul反应缓冲液和10ulMBP-CssPLA2融合蛋白(尽量使MBP-CssPLA2融合蛋白浓度达到1-4mg/ml，相当于每10ul待测样品中含有10-40μg蛋白)；
(4)在每个小孔中加入200ul磷脂底物(DiheptanoylThio-PC)启动反应，轻柔晃动酶标板混匀反应液；
(5)使用多功能酶标仪检测414nm处吸光度。
结果如图8所示，sPLA2(分泌型磷脂酶A2)酶活检测试剂盒检测出实施例1中所得重组CssPLA2蛋白(MBP-CssPLA2融合蛋白)具有酶活性。而现有表达技术，例如现有文献F.Huetal./Molecular&BiochemicalParasitology167(2009)127–134所得的CssPLA2蛋白是包涵体，没有酶活性，即使包涵体复性后酶活性也损失很大，本领域技术人员有重复过这个实验，结果发现包涵体复性后酶活性非常微弱，远远低于本发明所得重组CssPLA2蛋白的活性。
温度、酶浓度、底物浓度对酶活性的影响分别如图9～11所示。从来图9中，可以看出，本发明实施例1所得重组CssPLA2蛋白在50度时仍有较好的酶活性，说明其稳定性特别好。
实施例3去除重组CssPLA2蛋白的内毒素
3.1根据Detoxi-GelTMEndotoxinRemovingGel试剂盒说明书，操作如下：
(1)待树脂在室温自然沉降约30min恢复活性；
(2)再生Detoxi-Gel树脂：用5倍树脂体积的1％脱氧胆酸钠清洗树脂，然后加入3～5倍体积的注射用水去除清洁剂；
(3)平衡树脂：在柱子内加入3～5倍体积的注射用水。
(4)加样：将实施例1所得重组CssPLA2蛋白溶液装入透析袋中，在4℃、PBS缓冲液(pH7.4)中透析，每隔4小时左右更换一次透析液，总共换液3-4次；将透析完成的透析袋放入蔗糖中，利用蔗糖吸水性，浓缩蛋白；加入1ml浓缩后的重组CssPLA2蛋白溶液，为了获得更高的结合效率，待重组CssPLA2蛋白进入树脂中，室温孵育1-1.5h；然后再加入注射用水，收集流出液；
(5)重复步骤(2)以去除残余内毒素，再生树脂；
(6)将树脂保存于25％乙醇中，2～8℃放置；
(7)将收集的各管流出液进行12％SDS-PAGE。
3.2鲎试剂检测去除内毒素后的重组CssPLA2蛋白是否合格
实验组：100μl重组CssPLA2蛋白样品+100μl检测用水；对照组：200μl检测用水。
将检测管中的溶液轻轻混匀后，封口膜封闭管口，垂直放入37℃水浴中，保温60min，结束后将检测管轻轻取出，缓缓倒转，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性(即含有内毒素)；未形成凝胶或形成的凝胶变形从管壁滑脱者为阴性(即不含内毒素)。在保温期间注意不要晃动以免影响形成凝胶。
经检测，去除内毒素后的重组CssPLA2蛋白合格，可用于后续的细胞实验。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (14)

1.一种重组CssPLA2蛋白，含有CssPLA2蛋白和MBP标签蛋白。
2.根据权利要求1所述的重组CssPLA2蛋白，其特征在于，所述CssPLA2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
3.根据权利要求1所述的重组CssPLA2蛋白，其特征在于，所述MBP标签蛋白的氨基酸序列为pMAL-c2X质粒上MBP标签蛋白编码序列所对应的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的重组CssPLA2蛋白，其特征在于，CssPLA2蛋白的N端与MBP标签蛋白的C端连接。
5.根据权利要求1所述的重组CssPLA2蛋白，其特征在于，所述CssPLA2蛋白和MBP标签蛋白之间通过连接肽连接。
6.根据权利要求5所述的重组CssPLA2蛋白，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列为pMAL-c2X质粒上MBP标签蛋白编码序列之后到Xba1酶切位点之前的核苷酸序列所对应的氨基酸序列。
7.一种如权利要求1～6任一权利要求所述重组CssPLA2蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)获得CssPLA2目的基因；
(2)构建重组质粒：将步骤(1)所得CssPLA2目的基因以及载体质粒采用相同的限制性内切酶切割，然后进行连接，获得重组质粒；
(3)将步骤(2)所得重组质粒导入感受态细胞，转化；
(4)筛选阳性克隆，并将正确的重组质粒转化宿主感受态细胞；
(5)诱导表达重组CssPLA2蛋白。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，CssPLA2目的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述载体质粒为pMAL-c2X质粒。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述限制性内切酶为Xba1和HindIII。
11.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述感受态细胞为大肠杆菌DH5α感受态细胞。
12.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述宿主感受态细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
13.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述诱导为IPTG诱导。
14.如权利要求1～6任一权利要求所述重组CssPLA2蛋白作为催化磷脂二位酰基水解酶中的用途。
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