CN106834327A

CN106834327A - Patatin样磷脂酶Ⅲ的可溶性表达制备方法

Info

Publication number: CN106834327A
Application number: CN201710139489.4A
Authority: CN
Inventors: 李鹏鹏; 王道营; 张玉梅; 邹烨; 孙芝兰; 孙冲; 张牧焓; 耿志明; 徐为民
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-03-10
Filing date: 2017-03-10
Publication date: 2017-06-13

Abstract

本发明公开了一种Patatin样磷脂酶Ⅲ的可溶性表达制备方法，该方法包括如下步骤：A、构建第一重组表达载体：将SEQ ID NO：1所示核苷酸序列插入表达载体质粒，并同时引入tev酶切位点；B、构建第一重组表达载体：将SEQ ID NO：2所示核苷酸序列插入步骤A所得第一重组表达载体的多克隆位点处，测序鉴定；C、受体转染与培养：将步骤B所得第二重组表达载体转化进大肠杆菌中，当菌体长到特定程度后低温诱导培养菌体；D、目的蛋白提取：从步骤C所得菌体中提取具有高活性的Patatin样磷脂酶Ⅲ PLP3。本发明提供了一种利用原核表达系统高效可溶性表达Patatin样磷脂酶Ⅲ的方法。

Description

Patatin样磷脂酶Ⅲ的可溶性表达制备方法

技术领域

本发明涉及一种基因工程技术领域，尤其是一种使用原核表达系统高效可溶性表达Patatin样磷脂酶Ⅲ的方法。

背景技术

Patatin样磷脂酶3（Patatin-Like Phospholipase 3 ，PLP3）是近年来在动物细胞新发现的膜结合蛋白，含有一个保守的Patatin结构域，该结构域包含 Ser-Asp 催化水解二元体，能非特异性的催化脂质酰基水解；人和小鼠的PLP3均为四次跨膜蛋白，能催化磷脂膜上的酰基水解，释放出游离脂肪酸（FFA）参与多种细胞内生理过程。在细胞内，PLP3与膜结合，催化磷脂酯水解，释放出FFA参与多种细胞内生理过程发挥重要作用，如参与细胞内信号传递，促进细胞凋亡。在人体内，PLP3的148M突变导致胰岛素分泌增加、肥胖、肝功能异常、肝纤维化及非酒精性脂肪肝等；在小鼠骨骼肌细胞中，PLP7保护线粒体膜心磷脂不被过氧化，参与膜和磷脂的重塑；另外，有研究证明PLP3基因的高表达与瘦肉型猪的育成显著相关。

磷脂酶的活力发挥首先需要底物磷脂进入酶的结合结构域内与酶结合，底物结合导致酶的构象发生变化，暴露酶的催化活性中心才能有效完成磷脂水解反应。因此磷脂酶的底物结合结构域和催化活性中心是其发挥水解活性的关键，决定了其水解能力和关键影响因素；而磷脂酶与底物的结合位点、底物结合的特异性/选择性和水解磷脂的位点将决定磷脂酶的底物作用范围和水解产物。PLP3作为一种膜结合蛋白，能水解膜上的磷脂释放出FFA参与多种细胞内生理过程发挥重要作用，但是PLP3与磷脂膜的结合位点尚未有定论。小鼠PLP2通过氨基酸序列322-395结合脂质。借助同源结构模拟及氢氘交换质谱技术的间接推测，PLP1可能通过一段亲水性氨基酸与磷脂双分子层的极性头部相互作用，但是因为缺少PLP家族的蛋白质三维结构模型，仍然不能直接证实PLP3与磷脂的结合性质。

PLP3属于钙非依赖型磷脂酶A2，但是人类PLP3同时具有PLA2、三甘油酯水解酶和酰基转移酶等多种功能。虽然禽类与人和小鼠等哺乳动物PLP3都包含Paptatin结构域，但是禽类与哺乳动物的PLP3序列同源性仅有约45%，且目前鲜有关于禽类PLP3的生理特性及酶学性质的研究。PLP3属于膜蛋白，很难从体内制备，而在大肠杆菌中所表达的蛋白全部形成无活性的包涵体，较难应用于实际应用和研究。目前对PLP3的研究都只能在哺乳动物细胞系内表达但是很难纯化，且哺乳动物细胞表达制备蛋白既复杂又昂贵，至今尚未有该酶的大规模制备与纯化方法，为该酶的活性研究和应用造成了极大的不便。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用原核表达系统高效可溶性表达Patatin样磷脂酶Ⅲ的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

Patatin样磷脂酶Ⅲ的可溶性表达制备方法，该方法包括如下步骤：

A、构建第一重组表达载体：将SEQ ID NO：1所示核苷酸序列插入表达载体质粒，并同时引入tev酶切位点；

B、构建第一重组表达载体：将SEQ ID NO：2所示核苷酸序列插入步骤A所得第一重组表达载体的多克隆位点处，测序鉴定；

C、受体转染与培养：将步骤B所得第二重组表达载体转化进大肠杆菌中，当菌体长到特定程度后低温诱导培养菌体；

D、目的蛋白提取：从步骤C所得菌体中提取具有高活性的Patatin样磷脂酶Ⅲ PLP3。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中，从大肠杆菌基因组中扩增MBP编码基因malE，上游引入Nde1、下游引入Sac1，酶切后插入pCold1中，并将6×His标签从N-端切除，融合到C-端；经PCR鉴定并提取质粒做DNA测序验证，保存pCold1-MBP质粒得到第一重组表达载体。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤B中，首先设计Patatin样磷脂酶Ⅲ PLP3的特异引物对，上游引入BamH1内切酶位点、下游引入Sal1内切酶位点，然后利用所设计的特异引物以麻鸭cDNA为模板扩增PLP3编码基因，将所得基因与步骤A所得第一重组表达载体pCold1-MBP相连构建第二重组表达载体pCold1-MBP-PLP3，测序鉴定。

作为本发明的一种优选技术方案，所述特异引物对包含SEQ ID NO：3所示的上游引物和SEQ ID NO：4所示的下游引物。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤C中，通过转染操作将步骤B所得第二重组表达载体pCold1-MBP-PLP3转化入大肠杆菌Transetta2中，培养菌体，当菌体长到OD600为0.7时，加入IPTG至终浓度为0.25mM ，22℃低温诱导培养菌体14小时，收集菌体并超声破碎，离心收集上清液。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤D中，将步骤C所得上清液用镍亲和层析柱初步纯化PLP3蛋白，所得蛋白溶液经超滤管浓缩后再用凝胶过滤层析柱Superdex 200进一步纯化，即得高纯度的活性Patatin样磷脂酶ⅢPLP3融合蛋白。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明构建的系统方法首次实现了在大肠杆菌系统中表达得到可溶性的活性PLP3融合蛋白，为重组PLP3的体外制备提供了一种全新的路径，本发明的制备方法在蛋白收率、宏观产量、工艺简便性和规模应用便利性等方面均具有良好表现。

现有基因重组技术制备Patatin样磷脂酶Ⅲ（PLP3）时以包涵体形式表达，蛋白质的氨基酸不能形成正确的空间结构从而不具备活性；本研究提供的制备方法完全解决了PLP3蛋白在大肠杆菌中表达以包涵体形式存在而无法获得应用的技术缺陷，且表现出高表达、高可溶性、高稳定性的优点，具有重要的科研和应用价值。

本发明开发了受体菌的低温诱导表达系统，诱导PLP3在大肠杆菌中进行高效率的可溶性表达，操作上省时省力且成本低廉，能够快速得出大量目的产物。

本发明纯化PLP3的方法使用His-tag与镍柱的亲和层析，兼容利用MBP与amyloseresin的亲和层析，能够高效率且方便快捷的纯化获取活性PLP3融合蛋白。

附图说明

图1为实施例2中构建的原核重组表达载体质粒pCold1-MBP-PLP3的物理图谱。

图2为实施例2中pCold1-MBP-PLP3重组质粒的BamH I1+Sal I1双酶切鉴定结果。

图3为实施例3中pCold1-MBP-PLP3工程菌表达PLP3蛋白的可溶性分析；图中，M为蛋白分子量标准；泳道1为未经IPTG诱导表达的pCold1-MBP-PLP3重组菌体蛋白；泳道2为IPTG诱导表达的pCold1-MBP-PLP3重组菌体细胞裂解液沉淀；泳道3为IPTG诱导表达的pCold1-MBP-PLP3重组菌体细胞裂解液上清。

图4为实施例4中MBP-PLP3融合蛋白的Ni-NTA亲和层析后SDS-PAGE电泳检测图谱；图中，M为蛋白分子量标准；泳道1: 20 mM咪唑缓冲液洗脱蛋白；泳道2,3: 50 mM咪唑缓冲液洗脱蛋白；4,5,6: 250 mM咪唑缓冲液洗脱蛋白。

图5为实施例4中MBP-PLP3融合蛋白进一步使用凝胶过滤层析纯化色谱图及SDS-PAGE电泳检测图谱。

图6为实施例5中纯化所得MBP-PLP3融合蛋白的磷脂酶活性测定图。

具体实施方式

实施例1、含有MalE基因序列的第一表达载体的构建与鉴定。

根据大肠杆菌MalE基因序列设计引物，并在上游和下游引物分别引入内切酶Nde1和Sac1序列，引物如下MalE-F：CGCCATATGAAAATAAAAACAGGT（SEQ ID NO：5）和MalE-R：CTCGTATCACCAAGGAGCTCATA（SEQ ID NO：6）。提取大肠杆菌基因组DNA为模板，通过高保真PCR酶扩增获得MalE基因编码序列。用Nde1和Sac1双酶切分别处理基因MalE和表达载体pCold1。酶切产物进行跑胶并回收，用T4 DNA连接酶连接MalE和pCold1，转化至DH5α感受态细胞，将菌液涂在含氨苄青霉素的固体培养基上，37℃培养过夜，然后挑取阳性单菌落进行培养，经菌落PCR及双酶切鉴定重组质粒，正确的重组质粒送至上海生工生物工程股份有限公司测序。将测序无误的重组质粒命名为pCold1-MBP。

实施例2、原核表达载体的构建与鉴定。

提取麻鸭总RNA，按照TaKaRa公司的TRIzol说明书进行操作。取胸肌100mg，提取总RNA，总RNA经电泳检测，Eppendorf公司核酸定量分析仪测定OD_260/280比值及浓度，以1μg总RNA为模板，按照cDNA合成试剂盒说明书进行反转录。反转录程序：37℃ 15min，85℃ 5min，4℃保存，长期保存应放于-20℃。设计PLP3基因的特异性引物，上游引物F：5'-cgcGGATCCATGCAGCCCTGT-3'(SEQ ID NO：3；下划线是BamH1酶切位点)；下游引物R：5'-ATTCCAGAAAATGTCGACgtc-3'（SEQ ID NO：4；下划线是Sal1酶切位点）。以cDNA为模板进行PCR扩增，扩增Hsp90α基因全长及片段N，M，C，具体结果如图2所示。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测（具体如图2所示）。用BamH1和Sal1双酶切分别处理PCR 产物和pCold1-MBP载体，用T4 DNA连接酶连接PLP3至pCold1-MBP载体，转化至DH5α感受态细胞，将菌液涂在含100μg/mL氨苄青霉素的固体培养基上，37℃培养过夜，然后挑取阳性单菌落进行培养，经菌落PCR及双酶切鉴定重组质粒（见图1），正确的重组质粒pCold1-MBP-PLP3送至上海生工生物工程股份有限公司测序。将测序无误的重组质粒分别转化进入表达感受态细胞Transetta2。

实施例3、融合蛋白原核表达及可溶性分析。

以阳性重组质粒转化大肠杆菌Transetta2感受态细胞，挑取单菌落接种至5mL含100μg/mL 氨苄的 LB培养基中，37℃，200r/min震荡培养，当菌液浓度OD₆₀₀值为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为0.1-0.5mM（最佳0.25mM），18-25℃（22℃最佳），200r/min震荡培养诱导12-16小时。用不加IPTG诱导的菌液做对照，离心收集沉淀，用PBS重悬沉淀，于超声波细胞破碎仪上破碎5min，12000r/min离心5min，分别取出上清、沉淀，加入SDS-PAGE 电泳上样缓冲液，95℃加热10 min，用12% SDS-PAGE电泳检测融合蛋白是否为可溶性蛋白。结论：参见图3，MBP作为分子伴侣能实现融合蛋白的大量可溶性表达。

实施例4、重组融合蛋白的诱导表达及纯化。

诱导表达：将上述鉴定所得能可溶性表达的菌落接种于500mL含LB培养基中进行诱导表达；4500r/min离心15min收集菌体，用pH为7.6含有50mM的磷酸盐，150mM的NaCl，5mM的咪唑的Binding Buffer缓冲液重悬菌体，冰浴条件下超声破碎18-22min，超声参数为：功率20%，超声1s，间停3s；再12000r/min离心28-32min，4℃收集上清，弃菌体沉淀。

初步纯化：将上一步所得上清加入镍亲和层析柱中，用不同浓度的咪唑洗脱液洗脱并收集，蛋白得到初步纯化，取样液加入SDS-PAGE 电泳上样缓冲液，95℃加热10 min，用12% SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达情况；参见图4。

进一步纯化：将上一步所得样品用10kDa的超滤管离心浓缩4℃，4000 r/min，10min/次，再用Superdex ^TM200进一步纯化，然后再次用SDS-PAGE检测纯化的产物并离心浓缩；用考马斯亮蓝染色的方法测定蛋白浓度，并至于-80℃保存；参见图5。

实施例5、PLP3磷脂酶活性测定。

使用EnzChek Phospholipase A₂ Assay Kit，先将10 μL纯化得到的PLP3（稀释到不同浓度）与40 μL反应缓冲液混合，每孔加入50微升PLP3稀释液（使用黑色96孔板），再每孔加入荧光磷脂底物50 μL，在25℃，室温反应10 min后，设定多功能酶标仪的激发光波长为470nm，发射光波长为515 nm，读取荧光强度，水解产物越多荧光强度越强；参见图6。

上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> Patatin样磷脂酶Ⅲ的可溶性表达制备方法

<160> 6

<210> 1

<211> 1191

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

ATGAAAATAA AAACAGGTGC ACGCATCCTC GCATTATCCG CATTAACGAC GATGATGTTT 60

TCCGCCTCGG CTCTCGCCAA AATCGAAGAA GGTAAACTGG TAATCTGGAT TAACGGCGAT 120

AAAGGCTATA ACGGTCTCGC TGAAGTCGGT AAGAAATTCG AGAAAGATAC CGGAATTAAA 180

GTCACCGTTG AGCATCCGGA TAAACTGGAA GAGAAATTCC CTCAGGTTGC GGCAACTGGC 240

GATGGCCCTG ACATTATCTT CTGGGCGCAC GACCGCTTTG GTGGCTACGC TCAATCTGGC 300

CTGTTGGCTG AAATCACCCC GGACAAAGCG TTCCAGGACA AGCTGTATCC GTTTACCTGG 360

GATGCCGTAC GTTACAACGG CAAGCTGATT GCTTACCCGA TCGCTGTTGA AGCGTTATCG 420

CTGATTTATA ACAAAGATCT GCTACCGAAC CCGCCAAAAA CCTGGGAAGA GATCCCGGCG 480

CTGGATAAAG AACTGAAAGC GAAAGGTAAG AGCGCGCTGA TGTTCAACCT GCAAGAACCG 540

TACTTCACCT GGCCGCTGAT TGCTGCTGAC GGGGGTTATG CGTTCAAGTA TGAAAACGGC 600

AAGTACGACA TTAAAGACGT GGGCGTGGAT AACGCTGGCG CGAAAGCGGG TCTGACCTTC 660

CTGGTTGACC TGATTAAAAA CAAACACATG AATGCAGACA CCGATTACTC CATCGCAGAA 720

GCTGCCTTTA ATAAAGGCGA AACAGCGATG ACTATCAACG GCCCGTGGGC ATGGTCCAAC 780

ATCGACACCA GCAAAGTGAA TTATGGTGTA ACGGTACTGC CGACCTTCAA GGGTCAACCA 840

TCTAAACCGT TCGTTGGCGT GCTGAGCGCC GGTATTAACG CCGCCAGTCC GAACAAAGAG 900

CTGGCGAAAG AGTTCCTCGA AAACTATCTG CTGACTGACG AAGGTCTGGA AGCGGTTAAT 960

AAAGACAAAC CGCTGGGTGC CGTAGCGCTG AAGTCTTACG AGGAAGAGTT GGCGAAAGAT 1020

CCACGTATTG CAGCCACCAT GGAAAACGCC CAGAAAGGTG AAATCATGCC GAACATCCCG 1080

CAGATGTCCG CTTTCTGGTA TGCCGTGCGT ACTGCGGTGA TCAACGCCGC CAGCGGTCGT 1140

CAGACTGTCG ATGAAGCCCT GAAAGACGCG CAGACTCGTA TCACCAAGTA A 1191

<210> 2

<211> 1422

<212> DNA

<213> 麻鸭(Anas platyrhnchos)

<400> 2

ATGCAGCCCT GTGGCAGAAG TCAGGGAAGA GAGCAGCACA GTGTGCATGT GGAGCCTTGG 60

CACAAGGAAC GTAAAGGGAT TCCTGGTCCA GCTGAAGCTT GTGCAGATGT TCTGGCATTA 120

GCAAAAGAAG CTAGAAAGCG AAATCTTGGA CCTCTTCATC CTTCCTTCAA TGTGATAAAG 180

ATAATACGAG ATGGACTGAT GAGAAATCTT CCAGAAAACA CTCACCAGTT GTCTTCAGGC 240

AGACTGTGTA TTTCACTAAC CAGAGTATCA GATGGTAAAA ATACACTGAT ATCTAATTTT 300

AACTCTAAAG AAGAAGTTGT CCAGGCTTTG ATCTGTAGTT CATTTGTTCC CATTTATTGT 360

GGCCTAATTC CACCATCGTT TAGAGGTGTG CGCTATGTGG ATGGAGGAAT CAGTGACAAC 420

TTGCCTCAGT ATGAATCTAA GAATACAATC ACAGTTTCAC CTTTTGCTGG GGAGTGTGAT 480

ATCTGCCCAA AGGGGAACTC AGCCAATTTT CATGAAATGA ACTTGACCAA CACCAGCATT 540

CAGCTCAGTT TGGGGAACCT TTATCGTTTA ACACAAGCAC TCTTTCCACC AGAACCCAAG 600

GTACTAGGAG AGATTTGTGA GCAAGGATAT TCAGATGCTT TTAAATTCTT GAAAGAGAAT 660

GGTATTCTGA ATGACTCAAT TTATGTCAGC TTGTCCTTCA CTAAAAGAAA TCCTCATGAG 720

GCTATGCAAC ATGTTGGCTA TATGAAGAAA AAAAATAGTT CTGAAAACAA CAGGGTGGAA 780

ACTTCAAAAC TGGAAGTACT CAGTAACCAG AAAAAGCAAA ATTCATGGCC TTTGGAGAAG 840

AGCATATTTG AGAGTCTACC TCCTAGGCTT CGTAAAGCAC TGCAGGAAGC ATGTAAAGAA 900

CCAAATGGAT TCTATGCTCA GTTCTCTAAA CTCTTCCCAA TACGAGTGAT ATCCTATCTG 960

ATGCTACCAT ATACACTGCC TGTGGAGTCT GCTTATTCTG CTGCTATACG GTTAGTGAAC 1020

TGGTTTCCTG ACATGCCGGC TGATGTTCGA TGGATGCAAG AACAGTTTTG TCAGATTGCT 1080

GGTACAGTTT ATTCCCAGGC CAAAAGGAGG CTTCTCTGTA CATACAGGAA AGACAAATAT 1140

GCATCATTAA GGAAATGTCA AACTGCCCCA TCTGCTGTGG AATTTCATTC CTCATACTGT 1200

CATCTTAAAA TGCCTCACTC TTCTGCGGAC ATTGAAACCT GGCTCTGGGA ATCTTCACAA 1260

TACATGGACT CAGTTTTGAA ACATGTTTCT GGTAATCCAA AAGAGCAGTC AGACTCCTAT 1320

GCTAATTTTC TCCCAAATTC TGATGAGTCT GGACTGGAAA TAGATTTTGA CTCTTCCTCA 1380

GAGACAAGTT TCCAAACTTG TCCAGAATTA ATTCCAGAAA AT 1422

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

CGCGGATCCA TGCAGCCCTG T 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ATTCCAGAAA ATGTCGACGT C 21

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

CGCCATATGA AAATAAAAAC AGGT 24

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

CTCGTATCAC CAAGGAGCTC ATA 23

Claims

1.Patatin样磷脂酶Ⅲ的可溶性表达制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

A、构建第一重组表达载体：将SEQ ID NO：1所示核苷酸序列（MBP的编码基因malE）插入表达载体质粒，并同时引入tev酶切位点；

B、构建第一重组表达载体：将SEQ ID NO：2所示核苷酸序列（目的基因PLP3）插入步骤A所得第一重组表达载体的多克隆位点处，测序鉴定；

2.根据权利要求1所述的Patatin样磷脂酶Ⅲ的可溶性表达制备方法，其特征在于：步骤A中，从大肠杆菌基因组中扩增MBP编码基因malE，上游引入Nde1、下游引入Sac1，酶切后插入pCold1中，并将6×His标签从N-端切除，融合到C-端；经PCR鉴定并提取质粒做DNA测序验证，保存pCold1-MBP质粒得到第一重组表达载体。

3.根据权利要求1所述的Patatin样磷脂酶Ⅲ的可溶性表达制备方法，其特征在于：步骤B中，首先设计Patatin样磷脂酶Ⅲ PLP3的特异引物对，上游引入BamH1内切酶位点、下游引入Sal1内切酶位点，然后利用所设计的特异引物以麻鸭cDNA为模板扩增PLP3编码基因，将所得基因与步骤A所得第一重组表达载体pCold1-MBP相连构建第二重组表达载体pCold1-MBP-PLP3，测序鉴定。

4.根据权利要求3所述的Patatin样磷脂酶Ⅲ的可溶性表达制备方法，其特征在于：所述特异引物对包含SEQ ID NO：3所示的上游引物和SEQ ID NO：4所示的下游引物。

5.根据权利要求1所述的Patatin样磷脂酶Ⅲ的可溶性表达制备方法，其特征在于：步骤C中，通过转染操作将步骤B所得第二重组表达载体pCold1-MBP-PLP3转化入大肠杆菌Transetta2中，培养菌体，当菌体长到OD600为0.7时，加入IPTG至终浓度为0.25mM ，22℃低温诱导培养菌体14小时，收集菌体并超声破碎，离心收集上清液。

6.根据权利要求1所述的Patatin样磷脂酶Ⅲ的可溶性表达制备方法，其特征在于：步骤D中，将步骤C所得上清液用镍亲和层析柱初步纯化PLP3蛋白，所得蛋白溶液经超滤管浓缩后再用凝胶过滤层析柱Superdex 200进一步纯化，即得高纯度的活性Patatin样磷脂酶ⅢPLP3融合蛋白。