CN106047917B - 产脂肪酶的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法 - Google Patents

产脂肪酶的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及构建产脂肪酶的毕赤酵母基因工程菌株及其构建方法。脂肪酶在酶催化反应中,反应如在油水界面促进酯水解,而在有机相中可以酶促合成和酯交换。因此可以以地沟油或工业废油和低碳醇为原料用来合成生物柴油。通过将重组脂肪酶Lip14基因转入毕赤酵母X33中从而大量发酵脂肪酶。通过以对硝基苯基棕榈酸酯为底物测定脂肪酶对长链脂类的水解能力,对硝基苯基月桂酸酯和对硝基苯基辛酸酯测定脂肪酶对中链脂类的水解能力,对硝基苯基丁酸酯测定脂肪酶对短链脂肪酶的水解能力。确定其对中长短链脂类的水解活性。为将其在催化生产生物柴油的实验中奠定了基础。

Description

产脂肪酶的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法
技术领域
本发明涉及构建一株产脂肪酶的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法。
背景技术
脂肪酶在酶催化反应中,反应如在油水界面促进酯水解,而在有机相中可以酶促合成和酯交换。因此可以以地沟油或工业废油和低碳醇为原料用来合成生物柴油。
生物柴油的基本原料是地沟油或工业废弃油,可以周而复始得使用、绵延不绝,彻底改变了石油资源采一桶少一桶的局面。开发生物柴油对实现经济可持续发展,推进能源替代,减轻环境压力,增强国家战略安全具有深远意义。且生物柴油不含二氧化硫、铅、卤等有害物,燃烧时排出的有害物比普通柴油大大减少,有利于环境保护环境,作为绿色替代燃料。目前生物柴油的生产主要是用化学法,即动植物油脂与甲醇在高强度酸或碱催化下制备,但存在工艺复杂、醇消耗量大、产物不易回收、环境污染大等缺点。
酶法生产生物柴油是利用脂肪酶的催化作用,实现油脂与低碳醇的酯交换反应。酶法生产柴油对原料要求低,且反应条件温和、工艺环保、产物与原料分离简单,逐渐成为生物柴油工业化生产的主流发展方向。但是目前脂肪酶大多数为进口，价格昂贵且转化率并不高，使得生物柴油的升本过高。
发明内容
本发明是为解决脂肪酶大多数为进口，价格昂贵导致生物柴油成本过高的问题，提供产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，以及脂肪酶的发酵并测定其对短、中长链脂类的水解活性。
本发明产脂肪酶工程菌株的细胞为毕赤酵母X33，出芽生殖，菌落呈圆形，颜色为乳白色，表面光滑，基因工程构建产脂肪酶基因的重组子在含有橄榄油的BMMY培养基上有明显的水圈，在含有罗丹明B的BMMY培养基上在紫外光照射下有明显的荧光。
1.产脂肪酶的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法，其特征在于按以下步骤进行：一、脂肪酶基因来源于假丝酵母Candida sp.99-125基因组；通过提取试剂盒提取假丝酵母Candida sp.99-125基因组；二、Lip14基因的PCR扩增：以步骤一提取的假丝酵母Candidasp.99-125基因组为模板进行PCR扩增，将产物通过电泳检测，并将目的基因条带通过胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的基因Lip14；PCR扩增的正向引物为5’-GGAATTCGTTCTATCTACAGTCATTGGAGAATGGT-3’，反向引物为5’-GCTCTAGAAAAAAGATGGTGGAACCGTTGG-3’三、重组表达载体pPICZα-Lip14的构建：将步骤二纯化的Lip14基因以EcoR I和Xba I进行双酶切，再通过PCR回收试剂盒进行纯化回收，表达载体pPICZαA以EcoR I和Xba I进行双酶切，再通过琼脂糖凝胶电泳和胶回收试剂盒进行纯化回收；将两者的回收产物用T4连接酶于16℃过夜连接，得到重组质粒pPICZa-Lip14；并将重组质粒转入Top10感受态细胞中进行重组质粒的扩增并挑取测序正确的单菌落进行甘油保存；四、产脂肪酶基因工程菌株的构建：将保存于Top10的重组质粒扩增并通过质粒提取试剂盒提取，并通过限制性内切酶Pme I对重组质粒进行酶切线性化；线性化酶切产物通过乙醇沉淀回收，再以无菌水溶解，接着与毕赤酵母X33感受态细胞混合进行电击转化，然后将菌液涂布于含有Zeocin抗性的YPDS培养基上，30℃恒温培养箱培养至长出菌落，随机挑取YPDS培养基上的单菌落进行菌落PCR，标记有目的基因Lip14条带的单菌落；将单菌落以种田的方式分别接于含有橄榄油和罗丹明B的BMMY固体培养基中，每天在30℃培养箱中以甲醇诱导培养，诱导5天后，在含有橄榄油的BMMY固体培养基发现接种的菌落周围出现肉眼可见的水圈，在含有罗丹明B的BMMY固体培养基发现菌落在紫外光照射条件下出现肉眼可见的荧光，即证基因工程菌株构建成功；五、脂肪酶的表达及脂肪酶对短中长链脂类的水解能力：将有脂肪酶活力的基因工程菌株接于BMMY诱导培养基中，30℃摇床诱导培养5天，离心取上清液，以对硝基苯基棕榈酸酯为底物测定脂肪酶对长链脂类的水解能力,对硝基苯基月桂酸酯和对硝基苯基辛酸酯测定脂肪酶对中链脂类的水解能力,对硝基苯基丁酸酯测定脂肪酶对短链脂肪酶的水解能力。
2.PCR扩增体系如下：5×Ps Buffer 10μl，dNTP 10μl，上游引物2μl，下游引物2μl，假丝酵母Candida sp.99-125基因组1μl，DNA polymerase 0.5μl，双蒸水30.5μl。PCR程序设置为：94℃预变性3分钟，98℃变性10秒，57℃退火15秒，72℃延伸2分钟，再重复28次，共29个循环，延伸10分钟，4℃保存。
3.根据权利要求1所述的产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤三的目的基因和质粒以EcoR I和Xba I分别进行双酶切的体系如下：Lip14基因、pPICZαA质粒分别43μl，限制性内切酶XbaI 3μl，限制性内切酶EcoRI 3μl，10×Buffer M 8μl，双蒸水23μl。酶切反应条件：37℃，2h。
4.根据权利要求1所述的产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤三中连接反应体系如下：Lip14双酶切回收产物4μl，pPICZαA双酶切回收产物1μl，Ligase10×Buffer 2μl，T4DNA Ligase连接酶0.5μl，双蒸水12.5μl。
5.根据权利要求1所述的产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤四中的酶切体系如下：pPICZα-Lip14重组质粒43μl，限制性内切酶PmeI 2μl，双蒸水27μl。酶切之后,于65℃放置15min使内切酶失活。
6.根据权利要求1所述的产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤四中的乙醇沉淀步骤如下：
(1)将上一步骤所得DNA溶液取70μl加入7μl乙酸钠溶液充分混匀；乙酸钠溶液浓度为3mol/L,pH＝5.2
(2)加入4μl的Dr.GenTLEPrecipitationCarrier,均匀混合；
(3)加入175μl的无水乙醇,充分混合均匀；
(4)在12,000rpm4℃条件下离心15min；
(5)弃上清液,留白色沉淀；
(6)加入175μl的浓度为70％的乙醇,同样条件下离心5min；
(7)弃上清液并干燥沉淀。
7.所述构建方法所构建的产脂肪酶的毕赤酵母基因工程菌株，其特征在于，脂肪酶Lip14对短、中和长链脂类的水解能力测定方法如下：
将对硝基苯基酯溶于DMSO中,加入1×PBS配成10mM的混合物,在96孔板中每个孔加入190ul 10mM对硝基苯基酯,再加入1ml发酵液,在40℃条件下反应10min后,因为对硝基苯基苯酚显黄色,故测在波长为405nm条件下的光吸收。；分别以对硝基苯基棕榈酸酯为底物测定脂肪酶对长链脂类的水解能力,以对硝基苯基月桂酸酯和对硝基苯基辛酸酯为底物测定脂肪酶对中链脂类的水解能力,以对硝基苯基丁酸酯为底物测定脂肪酶对短链脂类的水解能力。以纯品对硝基苯酚做标准曲线,酶活(U)定义为:40℃下1ml酶液每分钟水解底物产生对硝基苯酚的umol数。
脂肪酶的表达及脂肪酶对短中长链脂类的水解能力：将有脂肪酶活力的基因工程菌株接于BMMY诱导培养基中，30℃摇床诱导培养5天，离心取上清液，以对硝基苯基棕榈酸酯为底物测定脂肪酶对长链脂类的水解能力,对硝基苯基月桂酸酯和对硝基苯基辛酸酯测定脂肪酶对中链脂类的水解能力,对硝基苯基丁酸酯测定脂肪酶对短链脂肪酶的水解能力。
本发明的有益效果；
本发明构建的产脂肪酶毕赤酵母基因工程菌株生物发酵产生的脂肪酶Lip14对长链脂类的水解酶活为559.26U/(ml*min)，中链脂类水解酶活分别为310.14U/(ml*min)和364.89U/(ml*min)，短链脂类水解酶活为274.59U/(ml*min)，比未导入重组质粒的X33酵母的酶活有着显著的提高。
具体实施方式
1.产脂肪酶的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法，其特征在于按以下步骤进行：一、脂肪酶基因来源于假丝酵母Candida sp.99-125基因组；通过提取试剂盒提取假丝酵母Candida sp.99-125基因组；二、Lip14基因的PCR扩增：以步骤一提取的假丝酵母Candidasp.99-125基因组为模板进行PCR扩增，将产物通过电泳检测，并将目的基因条带通过胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的基因Lip14；PCR扩增的正向引物为5’-GGAATTCGTTCTATCTACAGTCATTGGAGAATGGT-3’，反向引物为5’-GCTCTAGAAAAAAGATGGTGGAACCGTTGG-3’三、重组表达载体pPICZα-Lip14的构建：将步骤二纯化的Lip14基因以EcoR I和Xba I进行双酶切，再通过PCR回收试剂盒进行纯化回收，表达载体pPICZαA以EcoR I和Xba I进行双酶切，再通过琼脂糖凝胶电泳和胶回收试剂盒进行纯化回收；将两者的回收产物用T4连接酶于16℃过夜连接，得到重组质粒pPICZa-Lip14；并将重组质粒转入Top10感受态细胞中进行重组质粒的扩增并挑取测序正确的单菌落进行甘油保存；四、产脂肪酶基因工程菌株的构建：将保存于Top10的重组质粒扩增并通过质粒提取试剂盒提取，并通过限制性内切酶Pme I对重组质粒进行酶切线性化；线性化酶切产物通过乙醇沉淀回收，再以无菌水溶解，接着与毕赤酵母X33感受态细胞混合进行电击转化，然后将菌液涂布于含有Zeocin抗性的YPDS培养基上，30℃恒温培养箱培养至长出菌落，随机挑取YPDS培养基上的单菌落进行菌落PCR，标记有目的基因Lip14条带的单菌落；将单菌落以种田的方式分别接于含有橄榄油和罗丹明B的BMMY固体培养基中，每天在30℃培养箱中以甲醇诱导培养，诱导5天后，在含有橄榄油的BMMY固体培养基发现接种的菌落周围出现肉眼可见的水圈，在含有罗丹明B的BMMY固体培养基发现菌落在紫外光照射条件下出现肉眼可见的荧光，即证基因工程菌株构建成功；五、脂肪酶的表达及脂肪酶对短中长链脂类的水解能力：将有脂肪酶活力的基因工程菌株接于BMMY诱导培养基中，30℃摇床诱导培养5天，离心取上清液，以对硝基苯基棕榈酸酯为底物测定脂肪酶对长链脂类的水解能力,对硝基苯基月桂酸酯和对硝基苯基辛酸酯测定脂肪酶对中链脂类的水解能力,对硝基苯基丁酸酯测定脂肪酶对短链脂肪酶的水解能力。
Prime STAR PCR扩增体系
脂肪酶基因PCR程序设置
EcoRI/XbaI双酶切体系
酶切反应条件：37℃，2h。
T4连接酶体系
PmeI质粒线性化酶切体系
酶切之后,于65℃放置15min使内切酶失活。
脂肪酶Lip14对短、中和长链脂类的水解能力测定方法如下：
将对硝基苯基酯溶于DMSO中,加入1×PBS配成10mM的混合物,在96孔板中每个孔加入190ul 10mM对硝基苯基酯,再加入1ml发酵液,在40℃条件下反应10min后,因为对硝基苯基苯酚显黄色,故测在波长为405nm条件下的光吸收。分别以对硝基苯基棕榈酸酯为底物测定脂肪酶对长链脂类的水解能力,以对硝基苯基月桂酸酯和对硝基苯基辛酸酯为底物测定脂肪酶对中链脂类的水解能力,以对硝基苯基丁酸酯为底物测定脂肪酶对短链脂类的水解能力。以纯品对硝基苯酚做标准曲线,酶活(U)定义为:40℃下1ml酶液每分钟水解底物产生对硝基苯酚的umol数。
步骤四中所述
1、YPD-Zeocin:2％(w/v)酵母浸粉，1％(w/v)牛肉蛋白胨，2％(w/v)D-葡萄糖，灭菌后等温度降到60℃以下时加入一定量的Zeocin抗生素；
2、YPDS固体培养基:2％(w/v)酵母浸粉，1％(w/v)牛肉蛋白胨，2％(w/v)D-葡萄糖，1M山梨醇，1.5％(w/v)琼脂；
4、BMGY培养基:1％(w/v)酵母浸粉，2％(w/v)蛋白胨，1％(w/v)甘油,100mM磷酸缓冲液pH 6.0,1.34％(w/v)YNB,4×10-5％(w/v)生物素
5、BMMY培养基:1％(w/v)酵母浸粉,2％(w/v)蛋白胨,1％(v/v)甲醇,100mM磷酸缓冲液pH 6.0,1.34％(w/v)YNB,4×10-5％(w/v)生物素。
6、BMMY-橄榄油平板:1％(w/v)酵母浸粉,2％(w/v)蛋白胨,1％(v/v)甲醇,100mM磷酸缓冲液pH 6.0,1.34％(w/v)YNB；4x 10-5％(w/v)生物素；1.5％(w/v)琼脂，0.5％(v/v)橄榄油。
7、BMMY-罗丹明平板:在BMMY平板中加入1mg/L的罗丹明B(罗丹明B可事先配成100×的母液)。
对硝基苯酚法测定脂肪酶酶活：
酶活定义为：40℃下1ml酶液每分钟水解底物产生对硝基苯酚的mol数。底物根据对不同链长分别选择长链脂类为对硝基苯基棕榈酸酯，中链脂类为对硝基苯基月桂酸酯和对硝基苯基辛酸酯，短链脂类为对硝基苯基丁酸酯。根据吸光值增长速率的初速度和对硝基苯酚(p-nitrophenol)的毫摩尔吸光系数(ε＝9.6mM-1cm-1)计算酶活。
l:光路长度(cm)；t:反应时间(min)；Vt:反应的总体积(mL)；Vs:样品的体积(mL)。

Claims (7)

1.产脂肪酶的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法，其特征在于按以下步骤进行：一、脂肪酶基因来源于假丝酵母Candida sp.99-125基因组；通过提取试剂盒提取假丝酵母Candida sp.99-125基因组；二、Lip14基因的PCR扩增：以步骤一提取的假丝酵母Candidasp.99-125基因组为模板进行PCR扩增，将产物通过电泳检测，并将目的基因条带通过胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的基因Lip14；PCR扩增的正向引物为5’-GGAATTCGTTCTATCTACAGTCATTGGAGAATGGT-3’，反向引物为5’-GCTCTAGAAAAAAGATGGTGGAACCGTTGG-3’三、重组表达载体pPICZα-Lip14的构建：将步骤二纯化的Lip14基因以EcoR I和Xba I进行双酶切，再通过PCR回收试剂盒进行纯化回收，表达载体pPICZαA以EcoR I和Xba I进行双酶切，再通过琼脂糖凝胶电泳和胶回收试剂盒进行纯化回收；将两者的回收产物用T4连接酶于16℃过夜连接，得到重组质粒pPICZa-Lip14；并将重组质粒转入Top10感受态细胞中进行重组质粒的扩增并挑取测序正确的单菌落进行甘油保存；四、产脂肪酶基因工程菌株的构建：将保存于Top10的重组质粒扩增并通过质粒提取试剂盒提取，并通过限制性内切酶Pme I对重组质粒进行酶切线性化；线性化酶切产物通过乙醇沉淀回收，再以无菌水溶解，接着与毕赤酵母X33感受态细胞混合进行电击转化，然后将菌液涂布于含有Zeocin抗性的YPDS培养基上，30℃恒温培养箱培养至长出菌落，随机挑取YPDS培养基上的单菌落进行菌落PCR，标记有目的基因Lip14条带的单菌落；将单菌落以种田的方式分别接于含有橄榄油和罗丹明B的BMMY固体培养基中，每天在30℃培养箱中以甲醇诱导培养，诱导5天后，在含有橄榄油的BMMY固体培养基发现接种的菌落周围出现肉眼可见的水圈，在含有罗丹明B的BMMY固体培养基发现菌落在紫外光照射条件下出现肉眼可见的荧光，即证基因工程菌株构建成功；五、脂肪酶的表达及脂肪酶对短中长链脂类的水解能力：将有脂肪酶活力的基因工程菌株接于BMMY诱导培养基中，30℃摇床诱导培养5天，离心取上清液，以对硝基苯基棕榈酸酯为底物测定脂肪酶对长链脂类的水解能力,对硝基苯基月桂酸酯和对硝基苯基辛酸酯测定脂肪酶对中链脂类的水解能力,对硝基苯基丁酸酯测定脂肪酶对短链脂肪酶的水解能力。
2.根据权利要求1所述的产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，PCR扩增体系如下：5×PsBuffer 10μl，dNTP 10μl，上游引物2μl，下游引物2μl，假丝酵母Candida sp.99-125基因组1μl，DNA polymerase 0.5μl，双蒸水30.5μl；PCR程序设置为：94℃预变性3分钟，98℃变性10秒，57℃退火15秒，72℃延伸2分钟，再重复28次，共29个循环，延伸10分钟，4℃保存。
3.根据权利要求1所述的产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤三的目的基因和质粒以EcoR I和Xba I分别进行双酶切的体系如下：Lip14基因、pPICZαA质粒分别43μl，限制性内切酶XbaI 3μl，限制性内切酶EcoRI 3μl，10×Buffer M 8μl，双蒸水23μl；酶切反应条件：37℃，2h。
4.根据权利要求1所述的产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤三中连接反应体系如下：Lip14双酶切回收产物4μl，pPICZαA双酶切回收产物1μl，Ligase 10×Buffer 2μl，T4 DNA Ligase连接酶0.5μl，双蒸水12.5μl。
5.根据权利要求1所述的产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤四中的酶切体系如下：pPICZα-Lip14重组质粒43μl，限制性内切酶PmeI 2μl，双蒸水27μl；酶切之后,于65℃放置15min使内切酶失活。
6.根据权利要求1所述的产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤四中的乙醇沉淀步骤如下：
(1)将上一步骤所得DNA溶液取70μl加入7μl乙酸钠溶液充分混匀；乙酸钠溶液浓度为3mol/L,pH＝5.2；
(2)加入4μl的Dr.GenTLEPrecipitationCarrier,均匀混合；
(3)加入175μl的无水乙醇,充分混合均匀；
(4)在12,000rpm4℃条件下离心15min；
(5)弃上清液,留白色沉淀；
(6)加入175μl的浓度为70％的乙醇,同样条件下离心5min；
(7)弃上清液并干燥沉淀。
7.测定权利要求1所述产脂肪酶的毕赤酵母基因工程菌株发酵产生的脂肪酶的水解能力的方法，其特征在于脂肪酶Lip14对短、中和长链脂类的水解能力测定方法如下：将对硝基苯基酯溶于DMSO中,加入1×PBS配成10mM的混合物,在96孔板中每个孔加入190ul 10mM对硝基苯基酯,再加入1ml发酵液,在40℃条件下反应10min后,在波长为405nm条件下的光吸收；分别以对硝基苯基棕榈酸酯为底物测定脂肪酶对长链脂类的水解能力,以对硝基苯基月桂酸酯和对硝基苯基辛酸酯为底物测定脂肪酶对中链脂类的水解能力,以对硝基苯基丁酸酯为底物测定脂肪酶对短链脂类的水解能力；以纯品对硝基苯酚做标准曲线,酶活定义为:40℃下1ml酶液每分钟水解底物产生对硝基苯酚的umol数。
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