CN110923216B - 一种生产米黑根毛霉脂肪酶pRML酶粉的方法 - Google Patents

Abstract

一种生产米黑根毛霉脂肪酶pRML酶粉的方法，包括步骤：构建含4拷贝数脂肪酶基因pro‑rml的能够表达Pro‑RML的工程菌株；培养工程菌株；经诱导表达获得含米黑根毛霉脂肪酶的发酵液；将发酵液离心，取上清，调节pH至8.0，之后置于低温环境中，直至上清液表面出现结冰；向上清液中加入预冷丙酮，静置，弃上清，收集沉淀；风干沉淀得米黑根毛霉脂肪酶pRML酶粉。本发明的一种生产米黑根毛霉脂肪酶pRML酶粉的方法，以40mL发酵液为研究对象，将其pH调到8.0，丙酮和发酵液的体积比为2:1，获得酶粉的重量为1.5029g，酶粉的比活为13227.5U/g，酶粉的回收率为93.9％，为该酶的储存、运输和使用提供新的方式。

Description

一种生产米黑根毛霉脂肪酶pRML酶粉的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程领域，具体涉及一种生产米黑根毛霉脂肪酶pRML酶粉的方法。

背景技术

脂肪酶(E C3.1.1.3)是可以水解三酰甘油的一类酶，可催化多种化学反应如：水解、酯化、转酯化、氨解等，且具有反应条件温和、专一性强、无污染等优点被广泛的应用于食品、医药、化妆品、石油等行业，被称之为第三大工业用酶。酶粉是常用的保存酶的形式之一，具有方便保存、运输和稳定性好等优点。米黑根毛霉脂肪酶是一种1，3位置专一性的脂肪酶，可被用于制备奶味香精、生产生物柴油等多个方面。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产米黑根毛霉脂肪酶pRML酶粉的方法。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一种生产米黑根毛霉脂肪酶pRML酶粉的方法，包括步骤：

S1：构建含4拷贝数脂肪酶基因pro-rml的能够表达Pro-RML的工程菌株；

S2：培养工程菌株；

S3：经诱导表达获得含米黑根毛霉脂肪酶的发酵液；

S4：将发酵液离心，取上清，调节pH至8.0，之后置于低温环境中，直至上清液表面出现结冰；

S5：向上清液中加入预冷丙酮，静置，弃上清，收集沉淀；

S6：风干沉淀，得米黑根毛霉脂肪酶pRML酶粉。

进一步的，所述工程菌株为巴斯德毕赤酵母。

进一步的，所述步骤S3中的诱导条件为每24小时补充一次诱导物甲醇，至甲醇终浓度为1.0％(v/v)。

进一步的，所述步骤S4具体包括：将发酵液于4℃，5000rpm条件下离心10min，之后取发酵液上清40体积份置于容器中，调节pH至8.0，将容器放置在-20℃的环境内，直至容器内的液体表面出现结冰。

进一步的，所述步骤S5具体包括：向容器中加入8体积份-20℃预冷的丙酮，边加边缓慢搅拌，之后-20℃静置10min，再向容器中缓慢加入72体积份-20℃预冷的丙酮，边加边缓慢搅拌，之后-20℃静置2-3h，将容器中的混合液于8000rpm、4℃条件下离心10min，弃上清，收集沉淀。

本发明的有益效果：本发明的一种生产米黑根毛霉脂肪酶pRML酶粉的方法，以40mL发酵液为研究对象，丙酮和发酵液的体积比为2:1，获得酶粉的重量为1.5029g，酶粉的比活为13227.5U/g，酶粉的回收率为93.9％，为该酶的储存、运输和使用提供了新的方式。

附图说明

图1为目的基因DNA酶切回收电泳图，其中，泳道1为DNA标准分子量(kb)：4.5，3.0，2.0，1.2，0.8，0.5，0.2；泳道2箭头所指处为目的基因DNA酶切回收1017bp片段；

图2为2拷贝表达质粒构建流程图；

图3为2拷贝表达质粒双酶切电泳图，其中，泳道1为DNA标准分子量(kb)：15，10，7.5，5，2.5，1，0.25；泳道2：2拷贝表达质粒pPICZα+Mα-2prorml经Bgl II和BamH I双酶切后的结果，箭头所指为表达框；

图4为拷贝数确定的标准曲线；

图5为过表达HAC1载体的构建流程图；

图6为过表达HAC1的菌株摇瓶发酵结果比较图。

具体实施方式：

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液100ml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。所涉及的酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。引物合成及测序由英骏(Invitrogen)生物公司完成。

本发明从米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)菌株中克隆到包含前导肽的1,3-位置专一性的脂肪酶(Pro-RML)基因pro-rml，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该基因全长为(1017)bp，分析表明，GC含量为(48.9)％，编码(339)个氨基酸组成的蛋白。由该基因编码的米黑根毛霉脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。该蛋白大小45—66kDa,等电点预测为4.89(http://web.expasy.org/compute_pi/)，活性中心是214位Ser，257位His，273位Asp。实验表明由该基因编码的脂肪酶具有较高的酶活。通过酶学性质测定，该酶的最适反应温度为35℃，最适反应pH值为6.0，在pH 5～10条件下稳定。为便于表述，将该脂肪酶命名为Pro-RML。

实施例1米黑根毛霉cDNA的制备

1.1米黑根毛霉总RNA的提取

(1)取适量的米黑根毛霉菌丝，滤纸吸干水分，液氮研磨，加入1ml Trizol试剂(Invitrogen)，振荡器振荡5min，室温静置1min；

(2)加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min；

(3)4℃，12000rpm，15min；

(4)吸取上清，加入等体积异丙醇，-20℃沉淀30min；

(5)4℃，12000rpm，15min；

(6)倒掉上清，用1ml 75％乙醇洗涤沉淀，7500rpm，4℃，5min；

(7)重复(6)步骤一次；

(8)倒掉上清，干燥10min；

(9)加入适量的DEPC水溶解，得到总RNA；

1.2米黑根毛霉cDNA第一链的制备

反转录采用由Promega公司生产的反转录酶(MMLV)具体操作如下：

25μl反应体系将以下成分加到一个无核酸酶的离心管中：

然后，42℃温浴60min；

之后，95℃加热5min终止反应，冷冻保存。

实施例2含前导肽的米黑根毛霉脂肪酶基因pro-rml的引物设计

2.1引物设计

根据GenBank中rml基因的序列(GenBank登录号为A02536.1)，设计合成了以下一对引物：

FW(P1)：5’—CGGAATTCGTGCCAATCAAGAG—3’(SEQ ID No.3)

REV(P2)：5’—TAGTCTAGAGTACAGAGGCCTGTG—3’(SEQ ID No.4)

其中，P1、P2两端分别设计有EcoR I和Not I酶切位点(下划线部分)。

2.2含前导肽的米黑根毛霉脂肪酶pro-rml的PCR扩增

采用P1、P2引物，以米黑根毛霉(Boel E，Huge-Jensen B，Christensen M，Thim L，Fiil N:Rhizomucor miehei triglyceride lipase is synthesized as aprecursor.Lipids 1988，23(7):701-706.)cDNA为模板，PCR反应体系为：

反应条件为：95℃ 5min，5℃ 40s，60℃ 40s，72℃ 1min，循环30次，72℃ 10min，4℃ 2min。

2.3从PCR反应产物中回收目的片段

从PCR产物中纯化回收目的基因片段采用切胶过柱的方法，PCR反应产物经过琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯的照射下切下目的基因DNA，如图1所示，目的基因长度为1017bp，按照DNA回收试剂盒说明书(购自天根公司，产品编号为DP209-02)的方法进行回收。

2.4TA克隆

将PCR回收产物连接到载体pMD18-T-Simple上(购自TaKaRa公司)，连接反应按照TaKaRa公司所提供的试剂盒(Code No.D104A)说明书操作。

2.5目的基因连接到巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZα+Mα。

2.5.1 2拷贝表达质粒构建

用限制性内切酶EcoR I和Not I分别对pMD18-T-prorml和pPICZα+Mα进行双酶切，然后对目的片段进行回收，用T4连接酶将其连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α(购自上海生工生物工程有限公司)。得到单拷贝表达质粒pPICZα+Mα-prorml。将带有单拷贝pPICZα+Mα-prorml进行BamHⅠ和BglⅡ双酶切，得到含有prorml片段的表达框；将pPICZα+Mα-prorml进行BamHⅠ单酶切得到含有单拷贝prorml的pPICZα+Mα载体片段；将上述表达框和载体片段连接即得到2拷贝的pPICZα+Mα-2prorml载体。表达质粒pPICZα+Mα-2prorml转入大肠杆菌DH5α中进行扩增并PCR检测，送invitrogn公司测序。构建流程图见附图2，双酶切检测图见附图3。

实施例3 2拷贝的pPICZα+Mα-2prorml载体电转化到巴斯德毕赤酵母X-33中的分泌表达

3.1巴斯德毕赤酵母X-33(Invitrogen公司购买)电转化感受态细胞的制备及其电击转化

(1)挑取新鲜的单菌落于5ml YPD液体培养基中，于30℃，250rpm培养12-14小时；

(2)以0.1％的接种量接种到含500ml YPD培养基的2L三角瓶中，于30℃，250rpm培养12-14小时，使其OD₆₀₀＝1.3-1.5；

(3)在4℃下1500rpm离心5分钟，收集细胞；

(4)用500-250ml冰预冷的无菌水洗涤细胞两次；

(5)用20ml冰预冷的1M山梨醇溶液洗涤细胞一次；

(6)用1ml冰预冷的1M山梨醇溶液重悬细胞，至终体积为1.5ml左右，以80μl分装于小离心管。

3.2巴斯德毕赤酵母酵母细胞的电击转化

(1)将准备好的约100μg/μl的非线性化2个拷贝目的基因的表达质粒约10μl，与80μl酵母感受态细胞混匀，在冰上放置约5分钟；

(2)把混合了DNA的感受态细胞转入冰预冷的0.2cm的电转杯；

在1.5千伏的电压下转化；

(3)然后马上加入1ml冰预冷的1M山梨醇溶液于经转化的细胞中，把细胞混匀，转入1.5ml小离心管，30℃静止1-2h。

(4)取50-200ul涂布于含有100ug/ml YPDS平板(yeast extract 1％，peptone2％，dextrose 2％，Sorbitol 1M，agar 2％，)，于30℃培养2至3天观察结果。

3.3含4拷贝数的pro-rml基因的重组菌株的筛选

3.3.1酵母菌落PCR法鉴定正确整合的转化子

在平板上选到阳性菌落，以5’AOX1、3’AOX1为引物，利用酵母菌落PCR的方法进一步验证得到正确整合的转化子。

引物序列为：

5’AOX1：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′(SEQ ID No.5)

3’AOX1：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′(SEQ ID No.6)

模板的处理方法：

(1)用无菌的吸头挑取菌落少许，溶解到50μl的D2-Buffer(1L：异硫氰酸胍472.64g，1mol/L pH8.0Tris·HCl缓冲液50ml，β-巯基乙醇7ml)中混匀；

(2)将混合液于100℃沸水浴5min；

(3)12000rpm，离心30s，弃上清；

(4)用无菌水洗涤沉淀2次；

(5)将沉淀溶于20μl的ddH₂O，95℃作用5min；

(6)离心后得到上清液即为模板。

PCR反应体系：

反应条件：95℃ 5min；95℃ 40s，60℃ 40s，72℃ 1min 30s，30cycles；72℃10min。

3.3.2采用qPCR法确定4拷贝菌株

用TIANGEN酵母基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Yeast DNA Kit，货号：DP307-02)提取筛选得到的毕赤酵母重组子的的基因组，用只含有一个拷贝pro-rml的重组子的基因组为模板，选取甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(gap)为内参基因，将模板进行不同浓度的稀释，Q-PCR检测，分别得到目的基因pro-rml和内参基因gap的模板量的log值与Ct值之间的标准曲线如图4所示。未知样品ma-4pRML-X33的检测参数如表1所示，将未知样品的目的基因的Ct(pro-rml)和内参基因Ct(gap)代入公式得到目的基因和内参基因的模板量pro-rml(copy quantity)和gap(copy quantity)获得4拷贝菌株。

表1确定重组菌株的拷贝数

拷贝数计算公式为：

3.4将HAC1基因在4拷贝的上述菌中进行过表达

(1)HAC1基因片段的获得

以P_HAC1-F(CGGGATCCACCATGCCCGTAGATTCTTCTCATAAG)(SEQ ID No.7)和P_HAC1-R(ATAAGAATGCGGCCGCTCACCTGATCGCTATGCATG)(SEQ ID No.8)为引物，毕赤酵母X-33的基因组为模板(TIANGEN酵母基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Yeast DNAKit，货号：DP307-02)提取)，以下面的PCR体系及扩增条件获得HAC1基因的片段。

PCR反应体系：

反应条件：95℃ 5min；95℃ 40s，60℃ 40s，72℃ 2min，30cycles；72℃ 10min。

(2)过表达质粒HAC1-pPIC3.5K的构建

将HAC1基因的PCR回收产物连接到载体pMD18-T-Simple上(购自TaKaRa公司)，连接反应按照TaKaRa公司所提供的试剂盒(Code No.D104A)说明书操作。经测序获得正确的HAC1-pMD18T质粒。用限制性内切酶BamH I和Not I双酶切HAC1-pMD18T和pPIC3.5K，分别割胶回收HAC1片段和pPIC3.5K载体。用T4连接酶将其连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α。经质粒提取、PCR、BamHI和Not I双酶切验证筛选获得过表达质粒HAC1-pPIC3.5K。构建过程如图5所示。

(3)过表达载体HAC1-pPIC3.5K电转化到含有4拷贝脂肪酶基因的毕赤酵母及阳性菌株筛选。

HAC1-pPIC3.5K提取、线性化及电转化方法同3.2，阳性菌株的筛选过程同3.3.，所用引物为D-HAC1-F(ATGCCCGTAGATTCTTCTCATAAGACAGCTAGCCCACTTCCACCT)(SEQ ID No.9)和D-HAC1-R(GCAAATGGCATTCTGACATCC)(SEQ ID No.10)。PCR反应体系及扩增条件同3.3。

3.5.巴斯德毕赤酵母中目的脂肪酶的表达

NaOH滴定法测定脂肪酶酶活

(1)0.05M NaOH的配置：先用无CO₂水配置5M的NaOH储液；再准确稀释50倍后，称取100℃烘至恒重的邻苯二甲酸氢钾0.38g，溶于80ml无CO₂水中，标定出其准确浓度，再推算出储液浓度；0.05M的NaOH溶液以无CO₂水用储液现用现配；

(2)PVA－橄榄油乳化液底物的配置：将橄榄油100ml，300ml 2％PVA1750(聚乙烯醇)混合，加热溶化，用超声波乳化，功率300W，超声3s，间歇4s，99次，循环2次；

(3)取5ml乳化液底物，4ml 0.1M pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液加入到150ml三角瓶中，置于恒温水浴摇床35℃，150rpm温育5min；

(4)取1ml适当稀释的酶液加入到底物和缓冲液中，35℃150rpm反应10min后加入15ml无水乙醇终止反应；

(5)滴加4滴酚酞作指示剂，用0.05M NaOH滴定酶解产生的脂肪酸，至反应液变粉红色停止；

空白操作与上述一致，只是将发酵液与无水乙醇混合反应10min后加入到底物和缓冲液中。

酶活定义为在该测定条件下，1min释放1μmol脂肪酸的酶量为一个酶活单位。

挑取过表达HAC1的4拷贝菌株和中国发明专利201710402790X所涉及的2拷贝菌株的单菌落，接种于25ml BMGY培养基(1％酵母粉，2％蛋白胨，1％甘油)，于28℃，200rpm摇床培养至OD₆₀₀为4.0-8.0左右，转接到装有50ml BMMY培养基(1％酵母粉，2％蛋白胨，1.0％甲醇，100mmol/l磷酸缓冲液，pH 7.0)的500ml三角瓶中，相同培养条件继续培养，每24小时补加100％甲醇于培养基至终浓度为1.0％，诱导表达6天。每隔一定的时间取样，测量其细胞密度(OD₆₀₀)和胞外的米黑根毛霉脂肪酶的酶活。

检测结果对比如图6所示，在BMMY培养基(初始pH为7，培养温度为28℃)摇瓶培养的条件下96小时，含mα-4pRML-X33H酶活达到最高1078U/ml，胞外分泌效率可达43U/OD₆₀₀，超过了2拷贝菌株的26U/OD₆₀₀。

3.6酶粉的制备

(1)收集发酵液：将发酵液4℃，5000rpm，离心10min，取上清40mL，调节pH至8.0，之后放于-20℃内，直至表面出现结冰。

(2)向(1)中发酵液加入8mL丙酮(提前在-20℃预冷)，边加边缓慢搅拌，-20℃静置10min；

(3)向(2)中再缓慢加入72mL丙酮(-20℃预冷)，边加边缓慢搅拌，-20℃静置2-3h；

(4)将(3)中的混合液，8000rpm、4℃、离心10min，弃上清，收集沉淀；

(5)向(4)中的沉淀中加入2倍沉淀物体积的预冷丙酮，搅拌混匀，4℃，8000rpm离心10min；

(6)重复(5)一次；

(7)沉淀于通风橱中风干，并获得酶粉。

如表2所示，以40mL发酵液为研究对象，丙酮和发酵液的体积比为2:1，获得酶粉的重量为1.5029g，酶粉的比活为13227.5U/g，酶粉的回收率为93.9％。

表2 40mL发酵液在不同pH时获得酶粉的性质

序列表

<110> 江苏师范大学

<120> 一种生产米黑根毛霉脂肪酶pRML酶粉的方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1017

<212> DNA

<213> 米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)

<400> 1

gtgccaatca agagacaatc aaacagcacg gtggatagtc tgccacccct catcccctct 60

cgaacctcgg caccttcatc atcaccaagc acaaccgacc ctgaagctcc agccatgagt 120

cgcaatggac cgctgccctc ggatgtagag actaaatatg gcatggcttt gaatgctact 180

tcctatccgg attctgtggt ccaagcaatg agcattgatg gtggtatccg cgctgcgacc 240

tcgcaagaaa tcaatgaatt gacttattac actacactat ctgccaactc gtactgccgc 300

actgtcattc ctggagctac ctgggactgt atccactgtg atgcaacgga ggatctcaag 360

attatcaaga cttggagcac gctcatctat gatacaaatg caatggttgc acgtggtgac 420

agcgaaaaaa ctatctatat cgttttccga ggttcgagct ctatccgcaa ctggattgct 480

gatctcacct ttgtgccagt ttcatatcct ccggtcagtg gtacaaaagt acacaaggga 540

ttcctggaca gttacgggga agttcaaaac gagcttgttg ctactgttct tgatcaattc 600

aagcaatatc caagctacaa ggttgctgtt acaggtcact cactcggtgg tgctactgcg 660

ttgctttgcg ccctgggtct ctatcaacga gaagaaggac tctcatccag caacttgttc 720

ctttacactc aaggtcaacc acgggtaggc gaccctgcct ttgccaacta cgttgttagc 780

accggcattc cttacaggcg cacggtcaat gaacgagata tcgttcctca tcttccacct 840

gctgcttttg gttttctcca cgctggcgag gagtattgga ttactgacaa tagcccagag 900

actgttcagg tctgcacaag cgatctggaa acctctgatt gctctaacag cattgttccc 960

ttcacaagtg ttcttgacca tctctcgtac tttggtatca acacaggcct ctgtact 1017

<210> 2

<211> 339

<212> PRT

<213> 米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)

<400> 2

Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro Pro

1 5 10 15

Leu Ile Pro Ser Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr Thr

20 25 30

Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser Asp

35 40 45

Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala Thr Ser Tyr Pro Asp

50 55 60

Ser Val Val Gln Ala Met Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala Thr

65 70 75 80

Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn

85 90 95

Ser Tyr Cys Arg Thr Val Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His

100 105 110

Cys Asp Ala Thr Glu Asp Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu

115 120 125

Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr

130 135 140

Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile Ala

145 150 155 160

Asp Leu Thr Phe Val Pro Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys

165 170 175

Val His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu

180 185 190

Val Ala Thr Val Leu Asp Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val

195 200 205

Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala

210 215 220

Leu Gly Leu Tyr Gln Arg Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu Phe

225 230 235 240

Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn

245 250 255

Tyr Val Val Ser Thr Gly Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg

260 265 270

Asp Ile Val Pro His Leu Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala

275 280 285

Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr Asp Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln Val

290 295 300

Cys Thr Ser Asp Leu Glu Thr Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro

305 310 315 320

Phe Thr Ser Val Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly

325 330 335

Leu Cys Thr

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cggaattcgt gccaatcaag ag 22

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tagtctagag tacagaggcc tgtg 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gactggttcc aattgacaag c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcaaatggca ttctgacatc c 21

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgggatccac catgcccgta gattcttctc ataag 35

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ataagaatgc ggccgctcac ctgatcgcta tgcatg 36

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgcccgtag attcttctca taagacagct agcccacttc cacct 45

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcaaatggca ttctgacatc c 21

Claims (1)

1.一种生产米黑根毛霉脂肪酶pRML酶粉的方法，其特征在于，包括步骤：

S1：构建含4拷贝数脂肪酶基因pro-rml的能够表达Pro-RML的工程菌株，所述脂肪酶基因pro-rml的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述工程菌株为巴斯德毕赤酵母；

S2：培养工程菌株；

S3：经诱导表达获得含米黑根毛霉脂肪酶pRML的发酵液，所述诱导条件为每24小时补充一次诱导物甲醇，至甲醇终浓度为1.0％v/v；

S4：将发酵液于4℃，5000rpm条件下离心10min，之后取发酵液上清40体积份置于容器中，调节pH至8.0，将容器放置在-20℃的环境内，直至容器内的液体表面出现结冰；

S5：向容器中加入8体积份-20℃预冷的丙酮，边加边缓慢搅拌，之后-20℃静置10min，再向容器中缓慢加入72体积份-20℃预冷的丙酮，边加边缓慢搅拌，之后-20℃静置2-3h，于8000rpm、4℃条件下离心10min，弃上清，收集沉淀；

S6：向步骤S5得到的沉淀中加入2倍沉淀物体积的预冷丙酮，搅拌混匀，于8000rpm、4℃条件下离心10min；重复操作一次；

S7：风干沉淀，得米黑根毛霉脂肪酶pRML酶粉。

Images