JP3140206B2 - 細菌レトロンによる真核生物中での安定した一本鎖ｃＤＮＡの合成法並びにその生産物および利用 - Google Patents

細菌レトロンによる真核生物中での安定した一本鎖ｃＤＮＡの合成法並びにその生産物および利用

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は組み換えＤＮＡの分野に
関するものである。特に本発明は，レトロンと呼ばれる
細菌レトロ因子を用いた、真核細胞内の安定した一本鎖
ｃＤＮＡのインビボでの合成法に関するものである。本
発明は、また、一本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド構造
を作り出すために必要な因子を持つ新しい真核生物のベ
クターに関するものである。さらに、本発明は、感染さ
せた真核生物、例えば、酵母、植物細胞およびホ乳類細
胞に関するものである。これらの新規な生産物の用途が
記載されている。
【０００２】
【従来の技術】ミホコッカス ハンサス（Myxococcus
xanthus ）、スティグマテラ オーランティアカ（Stig
matella aurantiaca）およびエセリシア コリ（Esch
erichia coli）のようなグラム陰性菌がレトロンと呼ば
れるレトロ因子を有するということが見出されている。
TIBS, 16, 17-21 (1991a) においてその著者らは、サテ
ライトＤＮＡの特殊な種、すなわちマルチコピー一本鎖
ＤＮＡ（ｍｓＤＮＡ）について報告している。これらの
分子は、独特な２′，５′‐ホスホジエステル結合によ
って、一本鎖ＤＮＡ分子の内部のグアノシン残基から枝
分かれしている一本鎖ＤＮＡを含む構造を特徴としてい
る。従って、これらの分子は、一本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハ
イブリッドである。逆転写酵素は、これらのｍｓＤＮＡ
の合成を必要とする。Ann. Rev. Microbiol., 45, 163-
186 (1991b) において、この著者らは、ｍｓＤＮＡにつ
ての総説を述べている。また、細菌におけるｍｓＤＮＡ
については、Lampson et al., Progress in Nucleic Ac
id Research and MolecularBiology, 60, 1-24を参照
するとよい。
【０００３】鋳型としての逆転写酵素による一本鎖ｃＤ
ＮＡの生産は、レトロ因子の逆転写酵素（ＲＴ）を介し
た転写に必須の工程である（レトロ因子を参照）。総説
として、Weiner et al.,Ann. Rev. Biochem., 55, 631-
661 (1986)を参照するとよい。これは、ホ乳類ゲノムへ
のレトロウイルスの組み込み、ゲノムに組み込まれたプ
ロウイルスからの感染性レトロウイルスの生産、レトロ
因子のレトロトランス転位および真核細胞における偽遺
伝子の形成を含んでいる。
【０００４】しかしながら、ＲＴによってインビボで生
産された一本鎖ｃＤＮＡは、恐らく不安定であるために
直接検出されることはなかった。
【０００５】細菌におけるｍｓＤＮＡの生産は大変重要
な進歩であったが、真核細胞、例えば酵母または植物お
よびホ乳類細胞のような高等な真核細胞、における一本
鎖ＤＮＡのインビボでの生産がより大きな重要性をもっ
ている。真核生物は、目標とする分子を生産するとい
う、原核生物に対する周知の利点を有する。研究上およ
び産業上における多大な実践的利用に対し、安定した一
本鎖ＤＮＡを十分な量生産することが非常な必要性であ
る。本発明は、検出でき、安定で、有用である一本鎖Ｒ
ＮＡ−ＤＮＡ構造を生産する点で重要な貢献をした。
【０００６】発明の概要 本発明によって、基本的な発見がなされた。安定な一本
鎖ＤＮＡが真核細胞中インビボで生産できることが発見
された。
【０００７】簡単に述べると、本発明は、酵母もしくは
植物細胞またはホ乳類細胞のような真核細胞において、
インビボで安定な一本鎖ＤＮＡを生産する方法（または
工程）を提供する。本発明の方法は、レトロンと呼ばれ
るレトロ因子によって一本鎖ｃＤＮＡを生産する。一本
鎖ＤＮＡは、分鎖状のＲＮＡが結合したマルチコピー一
本鎖ＤＮＡ（ｍｓＤＮＡ）構造の一体的部分として生産
される。これらの構造は、それらが両方が一本鎖である
ＲＮＡおよびＤＮＡから構成されるにもかかわらず、生
産および単離の後において安定であり、すなわち検出で
きるものである。本発明の方法は、また、外来ＤＮＡお
よびＲＮＡフラグメントをＲＮＡ−ＤＮＡ構造のＤＮＡ
およびＲＮＡの部分にそれぞれ含むようなｍｓＤＮＡを
提供する。公知の細菌のｍｓＤＮＡとは異なるが、これ
らの分子はｍｓＤＮＡまたは修飾されたｍｓＤＮＡとし
て設計され、というのはそれらが前記したｍｓＤＮＡの
特徴および特異的な性質を有するからである。
【０００８】本発明は、また、レトロンを提供するもの
である。レトロンは、ｍｓＲＮＡに対応するｍｓｒおよ
びｍｓＤＮＡ分子のｍｓｄＤＮＡに対応するｍｓｄのそ
れぞれのコード領域並びに逆転写酵素（ＲＴ）の遺伝子
を含んでなる、遺伝因子である。
【０００９】本発明による新しいレトロンは、非コード
領域が特に選択されたプロモーターの転写開始部位およ
びＲＴ遺伝子の開始コドンの間の領域で短かい、という
点で公知の細菌レトロンとは異なる配列を有する。
【００１０】本発明は、また、公知の細菌レトロンとは
違って細菌レトロンにおける遺伝子の逆方向に関係して
ＲＴ遺伝子がｍｓｒ−ｍｓｄ領域の上流に位置する、と
いう新規なレトロンを提供する。これらの新規なレトロ
ンは、より多量のｍｓＤＮＡを生産する。
【００１１】本発明は、さらに、新規なレトロンによっ
て生産された新しい種類のｍｓＤＮＡを提供する。これ
らのｍｓＤＮＡは、それらのＤＮＡ部分において外来Ｄ
ＮＡフラグメント、例えば、特定の目標遺伝子のｍＲＮ
Ａに相補的な一本鎖フラグメント（アンチセンスＤＮ
Ａ）、を含み、従って望まざるタンパク質の発現を阻害
しまたは変化させる貴重な手法であるかもしれない。同
様にｍｓＤＮＡは、また、外来ＲＮＡフラグメントを含
む。
【００１２】本発明のさらに新規な態様は、細菌を起源
として同定されたレトロンで真核生物の宿主を形質転換
することである。上記の新しいベクターが感染した真核
細胞の宿主も、また、新規なものである。
【００１３】新規な一本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡ構造の種々の
利用を以下に説明する。
【００１４】遺伝物質の寄託 プラスミドＹＥｐ５２１−Ｍ１は、American Type Cult
ure Collection(ATCC)に寄託番号７４０９２で寄託され
ている。
【００１５】プラスミドＹＥｐ５２１−Ｍ４は、ＡＴＣ
Ｃに寄託番号７４０９３で寄託されている。
【００１６】プラスミドＹＥｐ５２１−Ｍ５は、ＡＴＣ
Ｃに寄託番号７４０９４で寄託されている。
【００１７】図面の詳細な説明 （図１）ｍｓＤＮＡ合成の生合成経路 ｍｓｒ −ｍｓｄ領域および逆転写酵素（ＲＴ）の遺伝子
からなるレトロン領域を図の最上段に表した。白ぬきで
ない矢印は、逆方向の反復の２つの組み合わせ（ａ１お
よびａ２，ｂ１およびｂ２）の位置を示している。白ぬ
き矢印は、ｍｓｄＲＮＡ（ｍｓｒ）、ｍｓＤＮＡ（ｍｓ
ｄ）およびＲＴ遺伝子を示していてる。一次転写産物
は、ＲＴ遺伝子を通りｍｓｒの上流領域まで含むと考え
られ、これは工程１の細い線で表わされている。ＲＮＡ
転写産物中の太線は、最終のｍｓｄＲＮＡに相当する。
分岐したＧ残基は環状になり、ＲＴの開始コドンがまた
現れる。折りたたまれたＲＮＡ上の三角印は、不一致の
塩基での５′末端伸長部位を示す。工程３および４の点
線はＤＮＡ鎖を表す。
【００１８】（図２）ハイブリッドＤＮＡ−ＲＮＡｍｓ
ＤＮＡの構造がＭｘ１６２、Ｍｘ６５、Ｓａ１６３、Ｅ
ｃ１０７、Ｅｃ６７、Ｅｃ８６およびＥｃ７３の順に示
されている（Ann. Rev. Microbiol., 45, 163-186 (199
1b) ）。
【００１９】（図３）ハイブリッドＤＮＡ−ＲＮＡｍｓ
ＤＮＡ−Ｙｅ１１７の構造を表したものである。
【００２０】（図４）ｍｓＤＮＡの生産に必要なレトロ
因子中の遺伝子転位 細菌染色体上の単一コピーのレトロ因子はｍｓＤＮＡの
生産に必要とされる領域を含む。すべての公知のｍｓＤ
ＮＡのコード領域は、Ａに示すように同様の方法で組織
された３つの遺伝子を持つ。
【００２１】Ａ： 遺伝子ｍｓｄはｍｓＤＮＡのＤＮＡ
鎖をコードする。第２の遺伝子ｍｓｒはｍｓｄの反対向
きに、５′から３′方向に位置し、ｍｓＤＮＡのＲＮＡ
鎖をコードしている。近くに位置するＯＲＦはＲＴをコ
ードする。この領域の転写はｍｓｒの５′末端からまた
はその近くから始まり、ｍｓｄを越えてＯＲＦを含むと
ころまで及ぶ。一連の逆方向反復配列、ａ１およびａ２
は、ｍｓＤＮＡコード領域中にまた保存される（短い矢
印）。丸で囲んだＧは、ｍｓＤＮＡ中に２′５′分枝結
合を有するＲＮＡ中の残基に相当する（図１０も参
照）。
【００２２】Ｂ： 大腸菌レトロンＥｃ６７に対しｍｓ
ＤＮＡをコードする領域は、染色体（白ぬき部分）上に
見い出される大きな因子のうち小さな部分のみである。
宿主染色体とのＥｃ６７レトロンの接合点には、矢印で
示すように２６塩基の同じ方向に反復した染色体配列を
両側に有している。図は、大きさに比例して描かれてい
ない。
【００２３】（図５）種々の細菌ＲＴの領域の構造 黒ぬり部分はＲＴ領域を、点で表わされた部分はＲＮａ
ｓｅ Ｈ領域をそれぞれ表す。
【００２４】（図６）酵母発現ベクターＹＥｐ５１
（７．３ｋｂ）およびＹＥｐ５２（６．６ｋｂ） ２つの酵母発現ベクターの構造を図示したものである。
両方とも、ＲＥＰ３（斜線部分）および複製起点（黒ぬ
り部分）を有する酵母２μｍ環状プラスミド（細線）、
ＣｏｌＥ１複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を有
する細菌プラスミドｐＢＲ３２２（ギザギザ線）、ＬＥ
Ｕ２遺伝子（点の部分）を有する酵母ゲノム、および、
転写開始部位から−４９５のＳａｕ３Ａ部位からプラス
ミドｐＮＮ７８−Δ４の＋１３に存在するＳａｌＩ部位
まで至るＡＬ１０遺伝子（白ぬき部分）の５′末端領域
のそれぞれ由来の配列から構成される。ＳａｌＩ、Ｓａ
ｌＩからＢａｍＨＩ、ＳａｌＩからＨｉｎｄ IIIまたは
ＳａｌＩからＢｃｌＩ部位においてＹＥｐ５１に挿入さ
れたクローン遺伝子は、図中Ｉで表わされ、止められた
矢印によって示された２μｍ環状配列中の部位（Ｔ）で
終結する。同様の転写は、ＹＥｐ５２のＨｉｎｄ III部
位またはＨｉｎｄ IIIからＢｃｌＩ部位に遺伝子を挿入
することによって得られる。略号は次の制限酵素を示
す：Ｒ→ＥｃｏＲＩ、Ｈ→Ｈｉｎｄ III、Ｂ→ＢａｍＨ
Ｉ、Ｓ→Ｓａｌ、Ｐ→ＰｓｔＩ、Ｂｃ→ＢｃｌＩ(Broac
h et al., Experimental Manipulation of Gene Expres
sion, Academic Press Inc., New York, 1983 参照）。
【００２５】（図７）１１．６ｋｂＥｃｏＲＩフラグメ
ントの制限地図 Ｃｌ−１Ｅ地図において、左側半分（ＥｃｏＲＩからＨ
ｉｎｄ III）については図示しなかった。Ｃｌ１ＥＰ５
地図において、ｍｓＤＮＡおよびｍｓｄＲＮＡの位置お
よび方向は、それぞれ小さな矢印および白ぬき矢印で示
している。大きな黒ぬり矢印はＯＲＦおよびその方向を
表している（Lampson et al., Science,243, 1033-1038
(1989)を参照）。
【００２６】（図８）プラスミドＰＣ１−１ＢＰｖ４、
ＹＥｐ５２１−Ｍ１、−Ｍ２、−Ｍ３、−Ｍ４および−
Ｍ５の概略図 図は酵母ベクターＹＥｐ５２１に挿入された領域（斜線
部）のみを表している。これらの領域はレトロン−Ｅｃ
６７を含み、図に示す制限部位はプラスミドの構成に用
いるもののみを表している。ｍｓｒおよびｍｓｄの短い
矢印は、ｍｓｄＲＮＡおよびｍｓＤＮＡの位置および方
向である。ＲＴの長い矢印は、ＲＴおよびその方向を表
している。太い矢印はＧＡＬ１０プロモーターおよびそ
の転写の方向を表している。図の上の文字は次の制限酵
素部位を示す：Ｈ→Ｈｉｎｄ III、Ｂａ→ＢａＩＩ、Ｐ
ｖ→ＰｖｕII、Ｂ→ＢａｍＨＩ、Ｓ→ＳｍａＩ。
【００２７】（図９）サッカロミセス セレビシエ（S.
Cerevisiae ）におけるｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の生産を
示したシークエンスポリアクリルアミドゲル 対数増殖期後期の培地０．９mlから調製した全ＲＮＡ
は、以下に示すように、ｍｓＤＮＡをＡＭＶ−ＲＴで検
出するのに用いた。ＲＴ反応混合物を６％シークエンス
ウレアゲルで電気泳動にかけた。反応混合物の一部を電
気泳動の前にＲＮａｓｅＡで処理した。lane１およびla
ne２（それぞれＧおよびＣ lane ）は、大きさを示すた
めチェインターミネーター法（ Sanger et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977)）によっ
て並べられたｐＵＣ１９のＤＮＡ配列のはしご状のもの
である。lane３はＹＥｐ５２１−Ｍ１を有する酵母細胞
由来の全ＲＮＡのＡＭＶ−ＲＴによる生産物であり、la
ne４は電気泳動前にＲＮａｓｅＡで処理した以外はlane
３と同じサンプルであり、lane５はＹＥｐ５２１を有す
る酵母細胞由来の全ＲＮＡのＡＭＶ−ＲＴによる生産物
である。サンプルはＲＮａｓｅ Ａで処理された。lane
６は、〔γ−32Ｐ〕ｄＣＴＰで標識したｐＢＲ３２２を
ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントでＭｓｐ
Ｉ消化したものである。右側の数字は塩基対におけるフ
ラグメントの大きさを示し、文字つき矢印はｍｓＤＮＡ
の位置を示す。
【００２８】（図１０）ＡＭＶ−ＲＴおよびＲＮａｓｅ
Ａ処理によるｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の３′末端の伸長を
図示したものである。
【００２９】（図１１）サッカロミセス セレビシエ
（S. cerevisiae）中に生産されたｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６
７のサザンブロットハイブリダイゼーション Ａ： ＹＥｐ５２１−Ｍ１（lane１）およびＹＥｐ５２
１−Ｍ２（lane２）を有する酵母細胞の２．５ml培地並
びにｐＣＬ−１ＥＰ５ｃ（lane３）を有する大腸菌（E.
coli）ＣＬ８３から調製した全ＲＮＡフラクションを
用いた。ナイロン膜フィルターにブロットしたあと、ｍ
ｓＤＮＡ−Ｅｃ６７は、ニックトランスレーションされ
た１４０塩基対ｍｓｒ−ｍｓｄＤＮＡフラグメントをプ
ローブとして用いることによって検出された。矢印の頭
はｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の位置を示す。
【００３０】Ｂ： ＹＥｐ５２１−Ｍ１、−Ｍ３、−Ｍ
４を有するサッカロミセス セレビシエ（S. cerevisi
ae）中のｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の生産を示したものであ
る。ＹＥｐ５２１−Ｍ１（lane３）、−Ｍ３（lane
２）、−Ｍ４（lane１）を有する酵母細胞の２．５ml培
地から調製した全ＲＮＡフラクションがＡに示されたと
同様のサザンブロットハイブリダイゼーションに用いら
れた。矢印の頭はｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の位置を示して
いる。
【００３１】（図１２）ＹＥｐ５２１−Ｍ５は、Ｘｈｏ
Ｉ部位をｍｓｄ領域に加え、その部位にｃｄｃ２８のｍ
ＲＮＡに相補的な５０塩基対の外来ｄｓＤＮＡフラグメ
ントをクローン化することによって、ＹＥｐ５２１−Ｍ
４から構成された。ＸｈｏＩ部位を、ＰＣＲ法によって
ＹＥｐ５２１−Ｍ４のｍｓｄ領域に加えた。この構成物
を次いでＸｈｏＩによって消化し、さらにアンチセンス
ＤＮＡをレトロンＥｃ６７のｍｓｄ領域に結合させた。
このプラスミドは酵母（ＳＰ−１）に導入され、その後
発現されたｍｓＤＮＡを、ここではｍｓＤＮＡ−Ｙｅ１
１７と呼ぶ。これは新規な構造である。
【００３２】発明の具体的説明 この発明によると、感染した酵母、サッカロミセス セ
レビシエ（Saccharomyces cervisiae ）が、合成され
た分岐状ＲＮＡ結合マルチコピー一本鎖ＤＮＡ（ｍｓＤ
ＮＡ）として記述される遺伝子構造を生産するというこ
とが発見された。生産されたｍｓＤＮＡのような遺伝子
構造のひとつは、ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７であった、ｍｓ
ＤＮＡ−Ｅｃ６７はレトロン−Ｅｃ６７から合成され
た。
【００３３】他の代表的なｍｓＤＮＡの製造は、以下に
説明される通りである。
【００３４】いくつかのｍｓＤＮＡは文献に記載されて
いる。これらのうちいくつかを次に示す：Ｍｘ１６２
( Dhundale et al., Cell, 51, 1105-1112, 1987); Ｍ
ｘ６５（ Dhundale et al., J. Biol. Chem., 263, 905
5-9058, 1988b); Ｓａ１６３（Furuichi et al., Cell,
48, 47-52, 1987aおよび Furuichi et al., Cell, 48,
55-62, 1987b); Ｅｃ６７ (Lampson et al., Scienc
e, 243, 1033-1038, 1989b); Ｅｃ８６ (Lim and Maa
s, Cell, 56, 891-904, 1989); Ｅｃ７３ (Sun etal.,
J. Bacteriol., 173, 4171-4181, 1991); Ｅｃ１０７(H
erzer et al., Mol. Microbiol.,１９９１年８月に寄
稿）; 大腸菌Ｂ由来のｍｓＤＮＡ（Lim andMaas, Cell,
56, 891-904, 1989)。
【００３５】ここで引用した参考文献２、３、９および
１４は、この特許出願に付随し、同時に出願され、そし
て参照事項として本明細書の開示の一部とされる。
【００３６】ｍｓＤＮＡ ｍｓＤＮＡは、数字の前に宿主の源を示す接尾辞を付け
たものによって、文献中でしばしば言い表わされてい
る。例えば、“Ｍｘ”はミホコッカス ハンサス（Myxo
coccus xanthus ）を、“Ｅｃ”はエセリシア コリ
（E. coli）を、“Ｓａ”はスティグマテラ オーラン
ティアカ（Stigmatella aurantiaca）をそれぞれ表
す。
【００３７】ｍｓＤＮＡは、幅広い多様性を有するにも
かかわらず類似した構造的性質を持つ特異的な分子であ
る。一般的に、ｍｓＤＮＡは、内部のｒＧ残基の２′−
ＯＨ基とＤＮＡ分子の５′−リン酸の間の２′，５′−
ホスホジエステル結合によって一本鎖ＤＮＡに共有結合
し、ＲＮＡおよびＤＮＡ分子の相補的な３′末端間の塩
基対合によってＤＮＡに非共有結合し、そのＤＮＡおよ
びＲＮＡが安定したステムループの２次構造を形成す
る、分岐状ＲＮＡを含んでなる分子であると表わせるか
もしれない。ｍｓＤＮＡ分子は、レトロウイルスＲＴと
同様の配列およびＲＴに共通の高く保存された配列を有
するポリペプチドをコードするｍｓｒ遺伝子座の下流の
読み取り枠（ＯＲＦ）を含むＲＮＡ一次転写産物、すな
わちｐｒｅ−ｍｓＤＮＡによってコードされている。
【００３８】ｐｒｅ−ｍｓＤＮＡは、もう１つの態様と
して、レトロンが同様に構成されるようｍｓｒ遺伝子座
の上流の読み取り枠を含んでもよい。
【００３９】特徴的なｍｓＤＮＡを示す図２において、
この分子のＲＮＡの部分を線で囲んで示す。残りの構造
はｓｓＤＮＡ部分である。
【００４０】この分子はすべて、分岐したｒＧ残基、ｍ
ｓＤＮＡおよびｍｓｄＲＮＡの３′末端でのステムルー
プＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド並びにＲＮＡおよびＤＮ
Ａ鎖におけるステムループ構造を示すことがわかるであ
ろう。分岐するリボヌクレオチド、すなわちＧは環状に
なり、最初のデオキシヌクレオチドへの２′，５′−ホ
スホジエステル結合が示されている。
【００４１】レトロン レトロンは、逆転写酵素（ＲＴ）をコードする遺伝子に
よって構成される１．３〜２．５ｋｂの長さのｍｓｒ−
ｍｓｄ領域の構造であることが今日までに明らかにされ
た小さな遺伝因子である。ｍｓＤＮＡのコード領域は、
“ｍｓｄ”によって示され、ｍｓｄＲＮＡのコード領域
は“ｍｓｒ”によって示される。
【００４２】公知のすべてのｍｓＤＮＡコード領域の比
較は、この遺伝子座が同様の方法で構成された３つの遺
伝子を含むことを明らかにする（図４参照）。ｍｓｄと
呼ばれる遺伝子はｍｓＤＮＡのＤＮＡ部分をコードして
いる。第２の遺伝子、ｍｓｒは５′から３′に、すなわ
ちｍｓｄの反対向きに位置し、ＲＮＡ鎖をコードしてい
る。従って、遺伝子ｍｓｄおよびｍｓｒは、その各々の
３′末端が数塩基重複するようにゆるやかに重なるよう
配向する。
【００４３】この重複は、ｍｓＤＮＡ分子におけるＲＮ
ＡおよびＤＮＡ鎖の重複した３′末端によって形成され
た、水素結合ＤＮＡ−ＲＮＡ構造と等価である。Ｍｘ１
６２では、それらが作り出すｍｓＤＮＡのハイブリッド
構造のような重複したｍｓｄ−ｍｓｒ遺伝子が８塩基対
からなる。種々のｍｓＤＮＡの特徴的な重複した長さ
は、表１を参照するとよい。
【００４４】ｍｓｄ−ｍｓｒ遺伝子が近接したヌクレオ
チド配列の決定は、近くに結合した読みとり枠（ＯＲ
Ｆ）を明らかにした。このＯＲＦは、ｍｓｄからすぐ上
流に位置するが、ｍｓｒと同じ方向に転写される（図８
参照）。ＯＲＦの開始コドンは、大腸菌Ｂ（E. Coli
B）のＥｃ８６レトロンのｍｓｄ遺伝子の開始からは１
９塩基対の近さであるが、ミホコッカス ハンサス（My
xococcus xanthus ）のＭｘ１６２レトロンでは７７塩
基対も離れて位置している。
【００４５】ｍｓＤＮＡをコードする染色体遺伝子座の
もう一つの保存された性質はａ１およびａ２を表わす一
組の逆方向反復配列である。配列ａ１は、ｍｓｄ遺伝子
の開始位置からちょうど上流に位置し、一方で、配列ａ
２は、ｍｓＤＮＡ分子において２′５′分岐結合を形成
するｍｓｒ遺伝子におけるＧ残基に対し、ちょうど５′
側に位置している（図４）。逆方向の反復は、大きさに
おける違いだけでなく、ｍｓＤＮＡをコードする公知の
異なった遺伝子座における幅広いヌクレオチド配列の多
様性を示す。例えば、Ｍｘ１６２をコードするレトロン
遺伝子座において発見された逆方向の反復（ａ１および
ａ２）は３４ヌクレオチドである一方で、大腸菌Ｂ（E.
Coli B）のＥｃ８６レトロンの逆方向の反復は、１２
塩基の大きさしかない。それらの多様性にもかかわら
ず、これらの反復配列は、ｍｓＤＮＡをコードするすべ
ての公知の遺伝子座の同じ部位に位置する（図４に示
す）。以下詳細に議論するが、これらの逆方向反復配列
の位置はｍｓＤＮＡの合成に重要である。
【００４６】ｍｓｒ−ｍｓｄコード領域に関するＲＴ遺
伝子の構成（逆方向の位置）においておよび転写開始部
位とＲＴ遺伝子の開始コドンＡＵＧとの間の非コード領
域を短かくする議論において、逆方向を与える本発明の
一側面が議論される場合、上記の議論に言及することが
手助けになるであろう。
【００４７】ｍｓｒ−ｍｓｄ領域のプロモーターは、ｍ
ｓｒの上流にある。転写は左から右へ行われ、ＲＴ遺伝
子に関する全領域を包含する。以下さらに詳細に説明す
るように、真核生物の宿主をトラスフェクトする複製媒
体は、ｍｓｒ−ｍｓｄおよびＲＴに対応する１つのプロ
モーターを含むか、または、ｍｓｒ−ｍｓｄ領域に対応
するものとＲＴに対応するものの２つのプロモーターを
含むかである。
【００４８】前記したｍｓＤＮＡの一般的で、保存され
たそして特徴的な性質以外の性質が典型的なｍｓＤＮＡ
とは異なるｍｓＤＮＡをが得られるようにレトロンが構
成されることは、本発明の範囲内である。例えば、レト
ロンにおけるＩＲ（逆方向の繰り返し）、すなわち一組
のａ１およびａ２の長さおよび／または位置が変化し、
すでに議論した位置と同じ位置に維持されることは排除
されない。従って、ｍｓＤＮＡのステムにおけるループ
の大きさおよび／または位置は変化させることができ
る。
【００４９】さらに、ｍｓＤＮＡにおけるＤＮＡおよび
ＲＮＡの３′末端の塩基対の大きさまたは重複が、適当
な操作によって影響をうけることは排除されない。その
ような多様性が望ましいものかどうかは、これらのｍｓ
ＤＮＡに提案される最終的な有用性に依存するであろ
う。
【００５０】ｍｓＤＮＡの一般的性質 表１は代表的なレトロンの構造をまとめたものである。
【００５１】
【表１】 逆転写酵素（ＲＴ） 細菌の代表的レトロンのＲＴの領域構造を図５に示す。
【００５２】ＲＴ遺伝子は、一般的にｍｓｒ−ｍｓｄ領
域から下流に位置する。それらの相対的位置が逆転する
細菌レトロンと異なる新しいレトロンにおいては、ｍｓ
ｒ−ｍｓｄ領域がＲＴ遺伝子の下流に位置する。
【００５３】ｍｓＤＮＡの生合成は、Inouye & Inouye,
Ann. Rev. Microbiol., 45, 163-186 (1991b) および
１９９１年８月に寄稿した Herzer et al., Mol. Micro
biol. に記述されている。合成の概要は、図１に示され
る通りである。一次転写産物（ｐｒｅ−ｍｓｄＲＮＡ）
は、図１の工程（１）の細い線で表わす部分によって示
されるように、ＲＴ遺伝子を通じｍｓｒの上流領域を含
むと考えられる。ＲＮＡ転写産物における太い領域は最
終的なｍｓｄＲＮＡに相当する。分岐したＧ残基は環状
化し、ＲＴの開始コドンが、また、現れる。折りたたま
れたＲＮＡ上の三角形は、不対塩基での５′末端プロセ
シング部位を示す。工程（３）および（４）の点線はＤ
ＮＡ鎖を表わす。
【００５４】要約すると、ｍｓｒ−ｍｓｄ領域由来の一
次転写産物は、鋳型としてだけでなく、ｍｓＤＮＡを生
産するプライマーとしても使用できると考えられる。ｍ
ｓＤＮＡの合成は、その２′−ＯＨ基を用いるＲＮＡ転
写産物の内部のｒＧ残基から開始する。従って、ｍｓＤ
ＮＡは、２′，５′−ホスホジエステル結合によって、
このｒＧ残基から分岐している。
【００５５】酵母細胞の形質転換 希望するｍｓＤＮＡを発現する（ＲＴ遺伝子を含む）レ
トロンを含んでなるプラスミドを有する酵母細胞の形質
転換が以下に記載される。この説明は、現在ｍｓＤＮＡ
−Ｅｃ６７をそのレトロン（Ｅｃ６７）から発現する最
良の形態である。
【００５６】１．ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の合成 ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の発現のためにプラスミドＹＥｐ
５２を用いた。プラスミドＹＥｐ５２１は、ｐＵＣ１９
（Yanisch-Perron et al. Gene, 33, 103-119,1985 ）
の多重クローニング部位をＹＥｐ５２に、すなわち酵母
におけるＧＡＬ１０プロモーターの下でクローン化され
た遺伝子の発現が高レベルで誘導されるよう設計された
ベクター、に導入することによって構成された。ＹＥｐ
５２は、ＣｏｌＥ１の複製起点、ＧＡＬ１０遺伝子のプ
ロモーター、ＬＥＵ２、２μ−環状複製起点および２μ
−環状ＲＥＰ３遺伝子座を有する（図６参照）。Broach
et al., Experimental Manipulation of Gene Express
ion, Academic Press Inc., New York, 1983を参照する
とよい。
【００５７】レトロン−Ｅｃ６７は、４ｋｂ ＢａｌＩ
−ＰｖｕIIフラグメント（図５に示す地図の左端のＢａ
ｌＩから２番目のＰｖｕII部位までのフラグメント由来
のＤＮＡ）がｐＵＣ９のＨｉｎｃII部位にクローン化さ
れたプラスミドｐＣＬ１ＢＰｖ４から調製された。この
プラスミドを有する大腸菌（E. Coli）はｍｓＤＮＡ−
Ｅｃ６７（Lampson et al., Science, 243, 1033-103
8, 1989）を生産する。
【００５８】全ＲＮＡフラクションはｐＣ１−１ＥＰ５
ｃを感染させた細胞から調製した。ここで、ｐＣ１−１
ＥＰ５ｃは、ＰＣ１−１ＢＰｖ４における４ｋｂ Ｂａ
ｌＩ−ＰｖｕII全配列を含む５ｋｂ ＰｓｔＩ（ａ）−
ＥｃｏＲＩフラグメントを有する（図８参照）。
【００５９】プラスミドＹＥｐ５２１の構築は以下のよ
うに行なった。ｐＵＣ１９多重クローニング部位を有す
るＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲＩでｐＵＣ１９を消化
することによって分離し、開裂末端はＤＮＡポリメラー
ゼＩのクレノウフラグメントで満たされ、次いでＨｉｎ
ｄ IIIで消化された。その結果生じた５４ｂｐフラグメ
ントは、（クレノウフラグメントで満たした）Ｂｃ１Ｉ
およびＨｉｎｄ III部位の間のフラグメントと交換する
ことによってＹＥｐ５２へとクローン化され、ＹＥｐ５
２１を得た。
【００６０】従って構築されたＹＥｐ５２１は、ＧＡＬ
１０プロモーターの下流に、ＥｃｏＲＩを除いて、ｐＵ
Ｃ１９由来の多重クローニング部位を有する。
【００６１】ｐＣ１−１ＢＰｖ４由来の４ｋｂ Ｈｉｎ
ｄ III−ＢａｍＨＩフラグメント（図８参照）は、ＹＥ
ｐ５２１のＨｉｎｄ IIIおよびＢａｍＨＩ部位にクロー
ン化された。
【００６２】結果として、ｍｓｒ−ｍｓｄ領域およびレ
トロン−Ｅｃ６７のＲＴ遺伝子は、ＧＡＬ１０プロモー
ターの下流に位置していた。このプラスミドをＹＥｐ５
２１−Ｍ１と呼ぶ。
【００６３】プラスミドＹＥｐ５２１−Ｍ１は図８に表
わされる通りである。斜線部分は、酵母ベクターＹＥｐ
５２１に挿入された部分である。
【００６４】レトロン−Ｅｃ６７遺伝子のＲＴはｍｓｒ
−ｍｓｄ領域の後ろに（下流に）位置していることが認
識されるであろう。
【００６５】 ２．形質転換酵母におけるｍｓＤＮＡの産生 酵母株（ＳＰＩ，a vra3 leu2 trpl his3 ade8 can gal
2 ）が用いられた。酵母細胞の形質転換は、酢酸リウチ
ム法（ Ito et al. J. Bacteriol., 153, 163-168, 198
3 ）によって行われた。酵母の培養は以下に記載する方
法で行った。ｍｓＤＮＡが生産され、それはトリ骨髄芽
球腫ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）によってｍｓ
ＤＮＡの３′末端を延長することによって検出された。
これは１１７ヌクレオチドの主要な生産物を生みだし
た。リボヌクレアーゼＡでこの生産物を処理すると、１
０５ヌクレオチドのＤＮＡを生じた。これらの結果はｍ
ｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の構造とよく一致する（Lampson et
al., Science, 243, 1033-1038, 1989を参照）。ｍｓ
ＤＮＡ−Ｅｃ６７の産生は、サザンブロットハイブリダ
イゼーションによってさらに確かめられた。
【００６６】ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の生産がレトロンＥ
ｃ６７由来のＲＴ遺伝子なしに酵母内で生じうるかどう
か決定するために、次の試験が行われた。
【００６７】ＹＥｐ５２１−Ｍ２を有する細胞から調製
したＲＮＡは、ＧＡＬ１０プロモーターのもとでｍｓｒ
−ｍｓｄ領域のみを含み、上記されるものは（図８参
照）サザンブロットハイブリダイゼーションによって検
出された。図１１のlane２に示されるように、ｍｓＤＮ
Ａ−Ｅｃ６７に相当するバンドは検出されず、レトロン
−Ｅｃ６７由来のＲＴ遺伝子が酵母細胞におけるｍｓＤ
ＮＡ合成に必須であることが示された。
【００６８】同様の方法で、ＣＨＯ細胞は公知の手順お
よび技術を用いて形質転換することができる。同様のこ
とが、ヒーラ細胞または他の脊髄ホ乳類細胞で行うこと
ができるであろう。
【００６９】レトロン中の遺伝子転位 本発明と結びつく重要な発見は、感染した酵母細胞中の
ｍｓＤＮＡの生産が、ＲＴの生産の増加をもたらす（と
信じられている）方法によって大きく改良がされる、と
いうことである。そのような戦略の１つは、ＧＡＬ１０
プロモーター（もしくはこの目的に用いられるどのよう
なプロモーターでも）の転写開始部位およびＲＴ遺伝子
の開始コドンの間のＡＵＧコドンの数をできるだけ減少
させることである。最良の結果は、翻訳開始コドンＡＵ
Ｇを含む５′末端の非コード領域の部分が５′末端に最
も近い最初のＡＵＧコドンを除き削除された場合に得ら
れた。
【００７０】従って、非コード領域の５′末端の多くの
部分は、酵母細胞におけるｍｓＤＮＡの生産に必須では
なかった。ＡＵＧコドンを含むヌクレオチド配列の部分
の欠失がｍｓＤＮＡの生産の重大な改善をした。
【００７１】特にＹＥｐ５２１−Ｍ１において（図８参
照）、５′末端Ｈｉｎｄ III部位からＲＴに対する開始
コドンＧＡＡまでは４１７ｂｐある（図８参照：Lampso
n etal., Science, 243, 1033-1038, 1989）。最も左
側のＨｉｎｄ III部位からＹＥｐ５２１−Ｍ１のｍｓｒ
のすぐ上流までのｍｓｒ遺伝子の上流にある２４０塩基
対の配列の削除が行われた。
【００７２】この目的のために、１４０塩基対のｍｓｒ
−ｍｓｄフラグメント（ｍｓｄの上流の外側の５塩基お
よびｍｓｄの上流のｍｓｒ−ｍｓｄ領域の３′末端での
他の１８塩基を含む）（ＰＣＲによる増幅後）および
１．８ｋｂ ＲＴ遺伝子（ＲＴ遺伝子の開始コドンの上
流の８塩基および終結コドンの下流の４塩基を含む）
（ＰＣＲによる増幅後）が、ＹＥｐ５２１−Ｍ３を生ず
るＹＥｐ５２１−Ｍ１のＨｉｎｄ IIIおよびＢａｍＨＩ
部位にクローン化された（図８参照）。ＹＥｐ５２１−
Ｍ３に感染した酵母におけるｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の生
産は、以下で議論するように、大きな増加を示した。
【００７３】酵母におけるｍｓＤＮＡの生産を実質的増
加させたもう１つの重要な発見は、ｍｓｒ−ｍｓｄ領域
に関しＲＴ遺伝子の位置を転位させることである。細菌
のレトロンにおいて、ｍｓｒ−ｍｓｄ領域は、ＲＴ遺伝
子の前にある。そのＲＴ遺伝子がｍｓｒ−ｍｓｄ領域の
上流に移動した場合、ｍｓＤＮＡ生産のさらなる増加が
観察された。このことは次のように行われた。
【００７４】ＹＥｐ５２１−Ｍ３のｍｓｒ−ｍｓｄ領域
は３つのＡＵＧコドンを依然として有しているので、Ｙ
Ｅｐ５２１−Ｍ４（図８参照）は、その中でＲＴ遺伝子
およびｍｓｒ−ｍｓｄ領域の順序が逆になるよう、すな
わちｍｓｒ−ｍｓｄ領域がＲＴ遺伝子の後に位置するよ
うに構成された。ＹＥｐ５２１−Ｍ４において、最も左
側のＨｉｎｄ III部位とＢａｍＨＩ部位の間（図８参
照）にはＡＵＧコドンが１つしかなく、これはＰＵＣ１
９の多重クローニング部位に存在する（Yabisch-Peron
et al., Gene, 33, 103-119, 1985 ）。このＡＵＧコド
ンは５コドン後の終始コドンＵＡＧによって終始する。
ＲＴ遺伝子の開始コドンＧＡＡは、同じ読み取り枠にお
ける終始コドンの６コドン後ろに位置していた。
【００７５】ＹＥｐ−Ｍ５は、次いで、ｃｄｃ２８の５
０塩基対のアンチセンスＤＮＡを、ｍｓｄをコードする
領域に加えることによって、ＹＥｐ５２１−Ｍ４から構
成された（以下さらに詳細に記載する）。従って、ＲＴ
遺伝子およびｍｓｒ−ｍｓｄ領域の順序が逆転するよう
な２つのプラスミドが構成された。
【００７６】ＹＥｐ５２１−Ｍ４に感染した酵母細胞に
おけるｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の生産は、ＹＥｐ５２１−
Ｍ４とＹＥｐ５２１−Ｍ３の間で比較された。この遺伝
子の転位は、ＹＥｐ５２１−Ｍ３以上の生産のさらなる
増加をもたらした。ｍｓＤＮＡ生産物は、ＹＥｐ５２１
−Ｍ１よりもＹＥｐ５２１−Ｍ３およびＹＥｐ５２１−
Ｍ４でそれぞれ約１．２倍および９．４倍それぞれ増加
した。
【００７７】リボソームサブユニット（Ｍｅｔ−ｔｒＮ
Ａmet および種々の開始因子を有する）が最初にｍＲＮ
Ａの５′末端に結合し、次いでｍＲＮＡストップピング
を調べ、そして好ましい状況で最初のＡＵＧコドンで転
写を開始する(Kozak, J. Cell Biology, 108, 229-24
1, 1989）。６９９の脊髄動物のｍＲＮＡの最近の検索
から、ＧＣＣＧＣＣａＣＣＡＵＧは、高等な真核生物に
おける翻訳開始の共通配列として浮び上ってきた（Boek
e et al., Cell, 40, 491-500, 1985 ）。検索は、６９
９の脊髄動物ｍＲＮＡの５′非コード配列の研究につい
て報告している（文献中でアクセスが可能であったすべ
ての配列）。脊髄動物のｍＲＮＡの起源は、ヒト（筋
肉、骨格、肝臓、腸など）、ウシ、ラットおよびその他
を含む。また酵母においても、ＡＵＧは翻訳開始の共通
配列であることが報告された(Hamilton et al., Hucl.
Acids Res., 15, 3581-3583, 1987 ）。Kozak, J. Cell
Biology, 108,229-241, 1989 が、また、上記したもの
より一般的な規則に対する多様性および例外を報告し
た、ということが注目される。例えば、開始が最初のＡ
ＵＧコドンに制限されない場合が報告されており、従っ
てそれはもっぱら用いられるものではないが、５′末端
の近傍に他のＡＵＧコドンを有する。さらに、５′末端
に最も近い最初のＡＵＧコドンを不活性化することは、
リボソームがもう１つのコドン（ＵＵＧ）で翻訳を開始
することを許した。
【００７８】上記したように、種々のｍｓＤＮＡの読み
取り枠の開始コドンの位置は変化しうる（例えば、Ｅｃ
８６レトロンのｍｓｄ遺伝子の開始点から１９塩基対お
よびＭｘ１６２レトロンでは７７塩基対）。従って、当
業者は、上記の戦略を続ける場合、レトロンの削りとら
れた非コード領域の長さを調整することができる。
【００７９】従って、上記の本発明と結びつく発見、す
なわちｍｓＤＮＡの生産における大きな改善が、保存さ
れた５′末端に最も近い１つのＡＵＧコドンがなかった
ならば、ＧＡＬ１０プロモーターの転写部位とおよびＲ
Ｔ遺伝子の開始コドンとの間のＡＵＧコドンが欠失する
場合に起こるという発見は、すでに議論した文献の報告
と一致する。従って、ｍｓＤＮＡの生産という点で本発
明と一致してなされたこの発見は、酵母に限定されるこ
とを意図していないが、ホ乳類細胞、例えばヒーラ細
胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ−１細胞およびその他の細胞のよう
な特に高等な真核生物において、ｍｓＤＮＡを生産する
感染した他の真核生物に適応することを合理的に予想で
きる。
【００８０】同様のことが、ｍｓｒ−ｍｓｄ領域の上流
のＲＴ遺伝子の位置に注目することによって観察されう
る。この発見は、また、上記のような真核生物中におけ
るｍｓＤＮＡの生産に一般的に応用できると考えられ
る。これらの記載した方法は、ＲＴを、最終的にはｍｓ
ＤＮＡの生産を、増加させることに寄与すると考えられ
る。
【００８１】上記した２つの方法（ＡＵＧコドンの欠失
並びにＲＴ遺伝子およびｍｓｒ−ｍｓｄ領域のそれぞれ
の位置の逆転）が、現在の最良の形態として、一緒に行
われる（ＹＥｐ５２１−Ｍ４に関し示した）必要はな
い、ということは当業者に明らかであろう。例えば、こ
の方法は、欠失の方法なしに行われてもよく、その逆で
もよい。さらに上記したように、ＲＴの生産を増加する
ことに寄与するどの方法も、本発明の範囲内のものであ
ると考えられる。
【００８２】これらの新しいレトロンから合成されたｍ
ｓＤＮＡは、また、新規なものである。
【００８３】ここで示したように、ＲＴ遺伝子およびｍ
ｓｒ−ｍｓｄ領域に対する１つのプロモーターが用いら
れることは必要ではない。１以上のプロモーターを用い
ることができ、１つはＲＴに対するもの、１つはｍｓｒ
−ｍｓｄ領域に対するものである。２つのプロモーター
を用いることが希望される場合、ＲＴの生産を増加させ
る方法、すなわち逆転および／または欠失させる方法の
いずれか一方または両方を用いることができ、これは、
当業者に明らかである。
【００８４】これらの特異的なレトロン（欠失および／
または位置の逆転による）を有し、新しいｍｓＤＮＡを
コードするＤＮＡ配列は、公知の細菌レトロンと比較す
ると新規なものである、ということは注目すべきことで
ある。すなわち、これらのレトロンを有する複製した媒
体およびこれらの媒体を有する感染された真核生物がそ
のようなものである。それらは、生産能を改善して真核
生物中で新規な一本鎖ＤＮＡを生産する効果的な方法を
提供する。
【００８５】真核生物に関し議論された上記の２つの方
法は、原核生物において修飾されたレトロンから生産さ
れたｍｓＤＮＡに応用できる、ということに、また、注
目するべきである。
【００８６】本発明を、例としてのレトロンＥｃ６７と
ともに説明した。しかしながら、同様の工程により、酵
母は他のｍｓＤＮＡを生産するように作成することがで
きる。例えば、類似の方法によって、レトロンＥｃ７３
をｍｓＤＮＡ−Ｅｃ７３を生産するように酵母株ＳＰ１
を形質転換するように用いることができる。
【００８７】同じように、必要なレトロン因子から酵母
内でｍｓＤＮＡ−Ｍｘ６５を形質転換し生産するよう
に、同様の工程が続けられる（Dhundale et al., JBC,
263, 9055-9058, 1988を参照）。そのＯＲＦは４２７の
アミノ酸残基をコードする。
【００８８】もし、酵母におけるｍｓＤＮＡ−Ｍｘ１６
２の生産が望まれるならば、レトロンＭｘ１６２を含む
適当なＤＮＡフラグメントを、Yee et al., Cell, 38,
203-209, 1984 に開示される１７．５ｋｂ Ｓａｌ１フ
ラグメントから調製することができる。そのＯＲＦは、
４８５のアミノ酸残基をコードする。
【００８９】ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ１０７の発現のために、
同様の方法が続けられてもよい。このレトロンは、その
うちのｐｙｒＥおよびｔｔｋの間の（図５）３４塩基対
の遺伝子間配列が欠失した、１．３ｋｂのＤＮＡフラグ
メントである。レトロンは３１９のアミノ酸残基（図２
中の３９６から１３５２塩基）をコードするＯＲＦを含
む。上記した図の例は、Dhundale et al.,Cell, 51, 11
05, 1987による。このレトロンは、細菌においてかって
発見された最も小さいものである。
【００９０】Ｓａ１６３のレトロンは、ｍｓｄおよびｍ
ｓｒ領域を含む４８０塩基対のＤＮＡフラグメント中に
含まれると決定された（Furuichiらによる）。
【００９１】Ｅｃ７３のレトロンは、３．５ｋｂ Ｓａ
ｌＩ（ｂ）−ＥｃｏＲＩ（ｃ）フラグメント中に含まれ
ると決定された（Sun らの図１Ａを参照）。Ｅｃ７３の
詳細については以下参照。
【００９２】Ｅｃ８６のレトロンは、３．５ｋｂ Ｐｓ
ｔＩフラグメント中に含まれると決定された（Lim and
Maas, Cell, 56, 891-904, 1989 ）。
【００９３】同様にして、レトロンＳａ１６３，Ｅｃ８
６およびＥｃ７３から、これに相当するｍｓＤＮＡであ
るｍｓＤＮＡ−Ｓａ１６３、ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ８６およ
びｍｓＤＮＡ−Ｅｃ７３が感染した酵母細胞において生
産されるであろう。もし植物またはホ乳類脊髄動物細胞
が用いられるならば、適当な操作および方法が続けられ
るであろう。
【００９４】同様の技術が、他の公知のｍｓＤＮＡを発
現するようまたはそれらの各々のレトロンから発見され
もしくは合成されるよう、続けられてもよい。これらの
レトロンのすべては、ここで記載するように、特異的な
ｍｓＤＮＡの性質を合成するために必要な因子を有する
ことが期待される。
【００９５】従って、一般的にここで記載した本質的な
性質を有するレトロンは、保存されたそして特徴的な性
質を有する安定した（性質を弱めずに）ｍｓＤＮＡを真
核生物中インビボで生産する上で有用である。
【００９６】ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ７３は、Sun et al., Jo
urnal of Bacteriology, 173, 4171-4181, 1991におい
て記載されたレトロンＥｃ７３から合成される。この文
献は本明細書の開示の一部とされる。図２は、ｍｓＤＮ
Ａ−Ｅｃ７３を合成することかできるヌクレオチド配
列、すなわち３．５ｋｂ Ｓ（ｂ）−Ｅ（ｃ）フラグメ
ントを示している。１１，５４４番目の部位の最初のＡ
ＴＧコドンが必要なＲＴ遺伝子の開始点であり、ＲＴの
ＯＲＦが３１６残基であることが決定された。
【００９７】今日までに知られるすべてのレトロンにお
いて、ＲＴ遺伝子がｍｓｄ遺伝子の上流（ｍｓｄ遺伝子
の下流）２０から７７番目の塩基対に位置することに留
意すべきである。
【００９８】今日までに研究されたすべてのレトロンに
おいて、プロモーター因子はｍｓｄＲＮＡの合成および
ＯＲＦの両方のプロモーターとしてはたらくと考えられ
る。例えば、ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７に対して、−１０領
域ＴＴＧＡＣＡおよび−３５領域ＴＧＡＡＴにおけるプ
ロモーター因子がこの機能を果たすと考えられる（Lamp
son et al., Science, 243, 1033-1038, 1989参照）。
しかしながら、本発明によると、両方の要素に１つのプ
ロモーター因子があるというよりむしろ２つのプロモー
ター因子、すなわちＲＴ遺伝子のＲＮＡポリメラーゼに
よる転写を開始する因子とｍｓｒ−ｍｓｄ領域に対する
もう一つの因子、があるということが本質的である。従
って、ｍｓｒ−ｍｓｄ領域およびＲＴ遺伝子は、２つの
独立したプロモーター、すなわちお互い相補的なプロモ
ーターのもとで発現させることができる。しかしなが
ら、現時点では、少なくともここに示したｍｓＤＮＡの
２つ（ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７およびｍｓＤＮＡ−Ｅｃ７
３）に対して、ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の生産がＲＴ−Ｅ
ｃ６７によってだけ補われ、その逆にＲＴ−Ｅｃ７３に
よっては補われていないと思われる。
【００９９】さらに、生来あるプロモーターよりむしろ
強いプロモーターを用いることがしばしば望まれる。
【０１００】本発明のもう１つの重要な態様は、ｍｓＤ
ＮＡ構造に対し非ネガティブまたは外来のものであるい
ずれかのＤＮＡフラグメントを真核生物中インビボで生
産することに関するものである。同様に、そのような外
来ＤＮＡフラグメントを有するベクターおよび感染され
た真核生物宿主は本発明に包含される。従って本発明
は、ＤＮＡ部分中に外来ＤＮＡフラグメントを、または
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリット構造のＤＮＡ部分に外来Ｒ
ＮＡフラグメントを含む、安定したｍｓＤＮＡを真核細
胞中インビボで合成することを可能にするものである。
特に興味深いのは、ｍｓＤＮＡがその特異的な標的遺伝
子（またはフラグメント）のｍＲＮＡと相補的な一本鎖
またはＤＮＡもしくはＲＮＡフラグメントを有する（ア
ンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）ということである。
【０１０１】この態様の１つの例に、構成されたフラグ
メントＹＥｐ５２１−Ｍ５があり、このプラスミドへは
ｍｓｄ領域（すなわちＹＥｐ５２１−Ｍ４の２９９−４
２６ヌクレオチド（Lampson et al., Science, 243, 1
033-1038, 1989の図７の最下段の線で囲まれた領域））
のＸｈｏＩ制限認識部位（Ｔ↓ＣＴＡＧ）に挿入がされ
た。すなわち、５０塩基対の外来ＤＮＡフラグメントが
このＸｈｏＩ部位に挿入された。ＹＥｐ５２１−Ｍ５は
酵母（ＳＰ−１）に導入され、その後発現されたｍｓＤ
ＮＡをｍｓＤＮＡ−Ｙｅ１１７と呼ぶ（図３参照）。
【０１０２】同じような方法で、ＹＥｐ５２１−Ｍ４の
ｍｓｒ領域へ制限認識部位が挿入され、ＤＮＡフラグメ
ントにも同様にしてされた。このレトロンは、酵母（Ｓ
Ｐ−１）に導入され、その後発現されたｍｓＤＮＡは、
新規なものである。それは、新しい外来フラグメントが
ｍｓＤＮＡのＲＮＡ部分にあること以外は、ここでｍｓ
ＤＮＡ−Ｙｅ１１７と呼ばれた構造に相当する。
【０１０３】本発明は、遺伝子の生産を調節することに
用いられる系の構成を可能にする。本発明の修飾された
ｍｓＤＮＡは、ＤＮＡ部分中に、アンチセンスＤＮＡま
たはＲＮＡの生産を促進する方向をもつプロモーターの
下流の遺伝子由来のクローンＤＮＡフラグメント（ｍｉ
ｃＲＮＡ）を含む。“ｍｉｃＲＮＡ”技術は、ｍＲＮＡ
阻害相補ＲＮＡ（ｍＲＮＡ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ−
ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＲＮＡ）であるＲＮＡ転
写産物に応用された（Coleman et al., Cell,37, 429-4
36, 1984 およびこの文献で引用された参考文献）。
“ｍｉｃＲＮＡ”は、あるタンパク質（例えばＯｍｐ
Ｆ）の生産を阻害することが報告されている。同様の調
節が、Ｔｎ１０トランスポザーゼ遺伝子に対するｍｉｃ
ＲＮＡおよびその遺伝子に対して報告されている。ｍｉ
ｃＲＮＡおよびトランスポザーゼに対する遺伝子は、そ
の転写物の５′末端が相補的なハイブリッドを形成でき
るような同じＤＮＡセグメントから、反対方向で転写さ
れると報告される。ハイブリッドは、トランスポザーゼ
ｍＲＮＡの翻訳を阻害すると考えられる。Colman et a
l., supra. は、大腸菌中のいずれかの特定の遺伝子の
発現を調節するよう設計された人工的な“ｍｉｃ”系の
構成を報告している。
【０１０４】種々の細胞分裂周期（ｃｄｃ）遺伝子が知
られており、今日までに５０種のｃｄｃ遺伝子が細胞分
子の複製中に起こる特徴的な出来事（例えば糖に関する
もの）から同定された。種々のｃｄｃ遺伝子およびその
機能は、Watson et al., Molecular Biology of the Ge
ne, 1987（第４版、１８章）に記載されている。これら
のうちｃｄｃ４は、有糸細胞分裂周期中におけるＤＮＡ
合成の開始および他の機能に要求され、ｃｄｃ７はｃｄ
ｃ４と同様の機能をもつが減数分裂前のＤＮＡ合成に要
求され、紛錘体の複製に必要なｃｄｃ２８はホ乳類タン
パクキナーゼと同じものでありタンパクキナーゼ活性を
有し、ｃｄｃ８、ｃｄｃ９およびその他のものも同様で
ある。
【０１０５】そのＤＮＡ部分に外来のｄｓＤＮＡフラグ
メントを有するようなｍｓＤＮＡを生産する方法を、図
１２に示す。ＤＮＡフラグメントは黒ぬりの部分で表わ
されている。５０塩基対のヌクレオチドフラグメントは
下記の配列で示される。
【０１０６】
【化２】 ＹＥｐ５２１−Ｍ５で感染された酵母（ＳＰ−１）は、
図３に示すように新規なｍｓＤＮＡ様構造、すなわちｍ
ｓＤＮＡ−Ｙｅ１１７を生産した（ポリアクリルアミド
−尿素ゲル電気泳動で分析した）。この新しいｍｓＤＮ
Ａ構成物は５０塩基対ＤＮＡフラグメントを含む。新し
いｍｓＤＮＡはアンチセンスＤＮＡの有用なベクターで
あると考えられる。この新しい構成物は、特定のｍＲＮ
Ａ（この場合はｃｄｃ２８のｍＲＮＡ）に相補的な一本
鎖ＤＮＡを生産し、そのｍＲＮＡおよびその遺伝子の発
現を阻害することが期待される。
【０１０７】リボソームに作用することが知られている
ｍＲＮＡの領域に相補的なアンチセンスＤＮＡ（ｍｉｃ
ＤＮＡ）およびｍｉｃＲＮＡは、特に興味深い。それゆ
えそのようなＤＮＡ−ｍｉｃＤＮＡを生ずる領域を有す
るｍｓＤＮＡは種々の応用面において特に興味深い。し
たがって、プロモーターの後に、例えばＸｈｏＩ部位
に、適当なＤＮＡフラグメントを挿入することによっ
て、いずれかの遺伝子の発現を特異的に調節する系を、
本明細書において開示されたｍｓＤＮＡで構成すること
ができる。
【０１０８】これは、そのようなアンチセンス系が真核
生物で生産された分子から提供された最初の例である。
【０１０９】ここで開示されたプラスミドおよび同様の
機能、例えばその遺伝子を阻害するｍＲＮＡに相補的な
ｍｉｃＤＮＡまたはｍｉｃＲＮＡを生み出す機能、を有
するこれに相当する合成された新しいｍｓＤＮＡのｍｓ
ｄ領域および／またはｍｓｒ領域に他のＤＮＡフラグメ
ントが挿入される、ということが考えられる。
【０１１０】同じように、ＹＥｐ５２１−Ｍ１を、広く
新しいｍｓＤＮＡの構造を生産するように修飾すること
ができる（ｍｓＤＮＡのＤＮＡ部分の５′末端）。
【０１１１】あるタンパク質（ポリペプチド）をコード
するＤＮＡ配列（例えば遺伝子の２つのコピー）を挿入
することが望まれる場合、そのＤＮＡ配列は、ＹＥｐ５
２１−Ｍ４のような選択できるもののｍｓＤＮＡのｍｓ
ｄ配列に選ばれた制限部位でもう１つに対し反対向きに
挿入される。新規なｍｓＤＮＡ−ＲＮＡ構造が真核生物
の宿主で生産されることが期待される。ｌａｃＺ遺伝子
が選ばれた構成物のｍｓｄ領域の適当な位置に挿入され
る場合、β−ガラクトシダーゼ活性が検出されることが
期待される。
【０１１２】
【実施例】以下の実施例は例示であって、本発明はこれ
らに限定されるものではない。これらの実施例中、すべ
てのパーセンテージ（％）は、固体では重量で、液体で
は体積であらわされ、すべての温度は他に指摘がない限
りセ氏温度（℃）をあらわすものとする。
【０１１３】利便と簡略化のために、実施例は図の詳細
な説明にも関連し、これを提供する。
【０１１４】実施例１ 酵母株、培地および培養条件 酵母ＳＰ１株（ｕｒａ３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｈｉｓ
３ ａｄｅ８ ｃａｎ r ｇａｌ２）を用いた。細胞は
ＹＰＤ培地（１％酵母抽出液、２％バクトペプトンおよ
び２％グルコース）で培養した。ＹＥｐ５２およびその
継代されたものの形質転換体をスクリーニングするため
に、最小培地を用い(Rose et al., Methods in Yeast G
enetics: A Laboratory Course Manual, Cold Spring H
arber Lab., Cold Spring, NY, 1990 ）、ロイシン以外
の要求されるすべての栄養を補った。ガラクトースの導
入には、グルコースのかわりに２％ガラクトースを含む
最小培地中に前培養した０．１５mlの細胞を用いた。こ
の細胞を、対数増殖期の後期まで３０℃で培養した。酵
母の形質転換は酢酸リチウム法によって行った(Broach
et al., Experimental Manipulation of Gene Expressi
on, Academic PressInc., New York, 1983 ）。酵母細
胞の形質転換は以下のように行なわれた。酵母の形質転
換体から調製したプラスミドを大腸菌（E. coli）ＤＨ
−５（Ｆ- ｅｎｄＡ１、ｒｅｃＡ１、ｈｓｄＲ１７（ｒ
ｋ- ，ｋ+ ）、ｓｕｐＥ４４、ｔｈｉ−１、ｇｙｒＡ９
６、ｒｅｌＡ１）に導入し、ＤＨ−５細胞から調製した
プラスミドは続いて特徴付けしなかった。酵母細胞由来
のプラスミドＤＮＡは、Hoffman Winston, Gene, 57, 2
68-272, 1987に記載される方法に従って調製した。
【０１１５】プラスミド ＹＥｐ５２(Broach et al., Experimental Manipulatio
n of Gene Expression, Academic Press Inc., New Yor
k, 1983 ）は、酵母中でｍｓＤＮＡを発現するプラスミ
ドを構成することに用いた。このプラスミドは、Ｃｏｌ
Ｅ１複製起点、ＧＡＬ１０遺伝子のプロモーター、ＬＥ
Ｕ２、２μ環状複製起点および２μ環状ＲＥＰ３遺伝子
座を有する。レトロン−Ｅｃ６７は、４ｋｂ ＢａｌＩ
−ＰｖｕIIフラグメント（Lampson et al., Science, 2
43, 1033-1038, 1989 の図５に表された地図の左端から
２番目のＰｖｕII部位からＢａｌＩまでのＤＮＡフラグ
メント）をｐＵＣ９のＨｉｎｃII部位にクローン化され
たプラスミドｐＣ１−１ＢＰｖ４から調製された。この
プラスミドを有する大腸菌（E. coli）はｍｓＤＮＡ−
Ｅｃ６７を産生する。全ＲＮＡフラクションは、ｐＣ１
−１ＥＰ５ｃで形質転換した細胞から調製された。ｐＣ
Ｌ−１ＥＰ５ｃは、ｐＵＣ９中のｐＣ１−１ＢＰｖ４に
おいて完全な４ｋｂ Ｂａｌ１−Ｉ−ＰｖｕII配列（La
mpson et al., Science, 243, 1033-1038, 1989の図５
を参照）を含む５ｋｂ ＰｓｔＩ（ａ）−ＥｃｏＲＩフ
ラグメントを有する。
【０１１６】プラスミドの構築 プラスミドＹＥｐ５２１は、ｐＵＣ１９の多重クローニ
ング部位(Yanisch-Perron et al., Gene, 33, 103-119,
1985 ）をＹＥｐ５２(Broach et al., Experimental M
anipulation of Gene Expression, Academic Press In
c., New York, 1983 ）、すなわち酵母においてＧＡＬ
１０プロモーターのもとでクローン化した遺伝子の高レ
ベルで誘導される発現を得るために設計されたベクタ
ー、に導入することによって構成された。ｐＵＣ１９多
重クローニング部位を含むＤＮＡフラグメントは、Ｅｃ
ｏＲＩでｐＵＣ１９を消化することによって単離され、
開裂末端はＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメン
トで満たされ、次いでＨｉｎｄIIIで消化された。この
結果生じた５４塩基対フラグメント、Ｂｃ１Ｉ（クレノ
ウフラグメントで満たされたもの）およびＨｉｎｄ III
部位の間のフラグメントを置きかえることによってＹＥ
ｐ５２にクローン化され、ＹＥｐ５２１を得た。このよ
うに構成されたＹＥｐ５２１は、ＥｃｏＲＩを除き、ｐ
ＵＣ１９由来の多重クローニング部位をＧＡＬ１０プロ
モーターの下流に含む。ｐＣ１−１ＢＰｖ４由来の４ｋ
ｂ Ｈｉｎｄ III−ＢａｍＨＩフラグメントは、ＹＥｐ
５２１のＨｉｎｄ IIIおよびＢａｍＨｉ部位にクローン
化された。その結果、ｍｓｒ−ｍｓｄ領域およびレトロ
ン−Ｅｃ６７のＲＴ遺伝子がＧＡＬ１０プロモーターの
下流に置かれた。このプラスミドは、図８に示されるよ
うにＹＥｐ５２１−Ｍ１と呼ぶ。
【０１１７】いくつかのＡＴＧコドンを含むｍｓｒの上
流の２４２塩基のフラグメントを除くために、ＰＣＲ法
が、プライマーとしての２つの合成したオリゴヌクレオ
チド、すなわちＭ２−ａ（5'ＧＣＡＡＧＣＴＴＣＡＴＡ
ＡＡＣＡＣＧＣＡＴＧＴ3'）およびＭ２−ｂ（5'ＣＴＧ
ＧＡＴＣＣＡＧＡＡＡＣＧＣＡＴＧＣＡＧＧ3'）と、鋳
型としてのＹＥｐ５２１−Ｍ１を用いて行われた。これ
らの配列は、Ｍ２−ａのレトロンＥｃ６７の２４３から
２５８番目およびＭ２−ｂの３８４から３６９番目の塩
基配列に相当し（参考文献２２の図７参照）、ｍｓｒ−
ｍｓｄ領域の両側に存在する。１４０塩基対のＰＣＲ製
成物は、ゲルによって精製され、Ｈｉｎｄ IIIおよびＢ
ａｍＨＩで消化した。生じたフラグメントは、ＹＥｐ５
２１のＨｉｎｄ IIIおよびＢａｍＨＩ部位にクローン化
され、ＹＥｐ５２１−Ｍ２を生じた。ＹＥｐ５２１−Ｍ
２は、ＧＡＬ１０プロモーターのもとでｍｓｒ−ｍｓｄ
領域だけを有する。
【０１１８】ＹＥｐ５２１−Ｍ２のＢａｍＨＩ部位にＲ
Ｔ遺伝子を挿入するために、ＲＴ遺伝子を含む１．８ｋ
ｂ ＢａｍＨＩフラグメントが、鋳型としてのＹＥｐ５
２１−Ｍ１と、プライマーとしての２つのオリゴヌクレ
オチド、すなわちＭ３−ａ（5'ＣＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧ
ＡＡＡＴＧＡＣＡＡＡＡＡＣＡ3'）およびＭ３−ｂ（5'
ＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＣＡＴＴＡＧＣＴＡＴＴＴＡＡＣ
ＡＴ3'）（これらの配列はそれぞれレトロンＥｃ６７の
４０９から４２９番目および２１８２から２１６３番目
の塩基に相当する（Lampson et al., Science, 243, 1
033-1038 (1989) の図７参照））を用いて、ＰＣＲ法に
よって増幅された。１．８ｋｂフラグメントをゲルによ
って精製し、ＢａｍＨＩで消化し、そしてＹＥｐ５２１
−Ｍ２のＢａｍＨＩ部位に結合させた。この結果生じた
プラスミドを、ＹＥｐ５２１−Ｍ３と呼ぶ。
【０１１９】ＹＥｐ５２１−Ｍ４は、ｍｓｒ−ｍｓｄ領
域およびＲＴ遺伝子の順序を変えて構成した。ｍｓｒ−
ｍｓｄ領域は、ＳｍａＩ部位を５′末端に加えた以外は
Ｍ２−ａおよびＭ２−ｂ（上記参照）を用いてＰＣＲ法
によって増幅した。ＲＴ遺伝子を含む１．８ｋｂ Ｂａ
ｍＨＩは、ＹＥｐ５２１のＢａｍＨＩ部位にクローン化
された。次いで、ｍｓｒ−ｍｓｄ領域を含む１４０塩基
対ＳｍａＩフラグメントは上記のプラスミドのＳｍａＩ
部位にクローン化され、この結果生じたプラスミドをＹ
Ｅｐ５２１−Ｍ４と呼ぶ。
【０１２０】ＹＥｐ５２１−Ｍ５は、ＹＥｐ５２１−Ｍ
４のｍｓｄ領域にｃｄｃ２８に対する５０塩基対のアン
チセンスＤＮＡを加えて構成した。ＸｈｏＩ部位をＰＣ
Ｒ法によってＹＥｐ５２１−Ｍ４のｍｓｄ領域に加え
た。この構成物を、次いで、ＸｈｏＩによって消化し、
さらにアンチセンスＤＮＡをレトロンＥｃ６７のｍｓｄ
領域に結合させた。このプラスミドは酵母（ＳＰ−１）
に導入され、その後発現されたｍｓＤＮＡをここではｍ
ｓＤＮＡ−Ｙｅ１１７と呼ぶ。
【０１２１】ｍｓＤＮＡの検出 酵母細胞由来の全ＲＮＡフラクションはElder et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 2432-2436, 1983 の
記載に従って調製し、大腸菌（E. coli）由来の全ＲＮ
Ａフラクションは、 Chomzynski et al., Anal. Bioche
m., 162, 156-159, 1987に記載の方法によってｐＣ１−
１ＥＰ５ｃを有する大腸菌（E. coli）から調製した。
【０１２２】ｍｓＤＮＡを逆転写酵素で標識するため
に、対数増殖期後期の培地の０．９mlから調製した全Ｒ
ＮＡフラクションを、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．２）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、ｄＴＴｐ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ
をそれぞれ０．２ｍＭ、５μＣｉ〔γ−32Ｐ〕ｄＡＴＰ
およびトリ血腫ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ：Mo
lecular Genetic Resource社）に加えた。反応混合物を
３０℃で１時間インキュベートし、その反応混合物の一
部を６％ポリアクリルアミド８Ｍ尿素ゲルで電気泳動に
かけた。もう一方の一部を３７℃で１０分間ＲＮａｓｅ
Ａ（１０μｇ／ml）で処理し、電気泳動にかけた。
【０１２３】ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７は、また、サザンブ
ロット法によって検出された（Southern, Mol. Biol.,
98, 503-517, 1975 ）。対数増殖期後期の培地２．５ml
由来の全ＲＮＡはＥバッファー（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、２ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）中１．５％アガロースゲルに適応した。
電気泳動後、そのゲルを毛管移動法（capillary transf
er method ）によってナイロン膜フィルター（PALL BLO
DYNE A TRANSFER MEMBRANE : INC）にブロットした。ハ
イブリダイズは、５０％（v/v ）ホルムアミド、５ｘＳ
ＳＰＥ（１ｘＳＳＰＥ：１８０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）、０．３％ドデシル硫酸ナトリウムおよび５ｘデン
ハート溶液（Denhardt, Biochem. Biophys. Res. Commu
n., 23, 641-646 (1966)）中で、プローブとしてニック
トランスレーションされた１４０塩基対ｍｓｒ−ｍｓｄ
領域を用いて（Rigby et al., J. Mol. Biol., 113, 23
7-251, 1977 ）行われた。
【０１２４】上記のように、本発明は、一般的な真核生
物からの望ましいｍｓＤＮＡの発現を提供する。本発明
を、サッカロミセス（Saccharomyces ）属の酵母によっ
て説明したが、他のものも本発明を実施するのに直ちに
用いることができる。
【０１２５】適切な酵母の好都合な源泉はATCC Catalog
ue of Yeasts, 18th Ed., 1990に見い出される。実践的
で経済的な重要性のために、本発明は、パン、ビール、
ワインおよび他の産業に広く用いられるサッカロミセス
（Saccharomyces ）属に特に向けられる。伝統的にこれ
らの酵母は、パン用、醸造用およびワイン用酵母とされ
ている。
【０１２６】これらのうち特に関係のあるものは、サッ
カロミセス セレビシエ（S. cerevisiae）株、すなわ
ちサッカロミセス バヤナス（S. bayanus ）、サッカ
ロミセス カールスバージェネンシス（S. carlsberge
nensis）、サッカロミセスディアタチカス（S. diatat
icus）およびサッカロミセス ウバラム（S. uvarum）
であり、これらは本発明のベクターを導入するために提
供される。さらにｍｓＤＮＡを発現させるために、ＣＯ
Ｓ−１、ＣＨＯ、ヒーラ細胞のような脊髄動物宿主細胞
を、または脊髄動物細胞もしくは植物細胞中で用いても
よい。
【０１２７】用いてもよい植物は、単子葉植物および双
子葉植物を含む。形質転換される植物の実例としては、
アルファルファ、大豆、とうもろこしおよび小麦が挙げ
られる（Genetic Engineering of Plants, An Agricult
ural Perspective, Edited by Kosuge et al., Plenum
Press (1983) ）。
【０１２８】本発明を実施するために、種々のクローニ
ングベクターが、ベクターの複製用の適合性のある真核
宿主細胞に感染させるために用いられる。その後形質転
換体が同定され、それからプラスミドＤＮＡが調製さ
れ、そしてｍｓＤＮＡが抽出され精製される。
【０１２９】酵母中のクローン化された遺伝子の発現用
ベクターはMethods in Enzymology,Vol. 194, "Guide t
o Yeast Genetics and Molecular Biology", page 373
(Guthrie and Fink, Eds., Academic Press Inc., 1991
）に記載されている。フラグメントＧＡＬファミリ
ー、例えば、ＧＡＬ４、ＧＡＬ８０、ＧＡＬ１、ＧＡＬ
２、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ１１、ＭＥＬ１；Ａ
ＤＨ１およびＰＧＫ(Broach et al., Experimental Man
ipulation of Gene Expression, Academic PressInc.,
New York, 1983 参照）の調節プロモーターまたは非調
節強力プロモーター由来のような外来ＤＮＡを用いてま
たは用いずに、酵母内でｍｓＤＮＡを発現させるために
適当なプロモーターを選択することは、当業者にとって
自明のことである。
【０１３０】オリゴヌクレオチドの合成は、U.S. Pat.
No.4,415,734、 Matteuci et al.,J. Am. Chem. Soc.,
103 (11):3185-3191(1981) 、Adams et al., J. Am. Ch
em.Soc., 105 (3):661-663 (1983) 、Bemcage et al.,
Tetrahedron Letters, 22(20):1859-1867 (1981)に開
示される方法を含む多くの方法によって行われてよい。
【０１３１】選択したＤＮＡフラグメントを用いてまた
は用いずに、高等真核生物中でｍｓＤＮＡを発現させる
には、当業者は公知技術を参照し、これを用いてもよ
い。真核生物中で特定の真核生物タンパク質を合成する
利点は周知である。意図的に生産されるｍｓＤＮＡに依
存して、適当な真核生物宿主細胞が選択される（Molecu
lar Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition,
§3,§16.3および後編(Sambrook et al., Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1989 ）参照）。真核生物発
現媒体は、周知のように、プロモーターおよびエンハン
サー因子、認識配列、ＴＡＴＡボックス並びに上流のプ
ロモーター因子を含む。複製および選択のための転写開
始部位の上流に位置する他の伝統的な因子は、標準的な
実験手引書に知られ記載されている。ベクターは、例え
ばファルマシア社から有用なものが市販されている（ｐ
ＭＳＧ、ｐＳＶＴ１７、ｐＭＴ２）。ホ乳類細胞への組
み換えベクターを導入する方法は、Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Second Edition, §16.30-16.5
5,(Sambrook et al., Cold Spring Harbor Loboratory
Press, 1989 ）を参照するとよい。ホ乳類細胞のトラン
スフェクション用のコスミドベクターは、Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual, Second Edition, §23.1
8 および後編(Sambrook et al., Cold Spring Harbor L
oboratory Press, 1989 ）を参照するとよい。
【０１３２】さらに当業者は、Current Protocols In M
olecular Biology, Volume 1, §16.12-16.13.7(Ausube
l et al., Eds., Greene Publishing Associates and W
iley-Interscience, 1989)を参照してもよく、この中で
は特に、３つのベクター系またはＣＯＳ細胞、ＣＨＣお
よびワクシニアウイルスベクターを用いてホ乳類細胞に
外来遺伝子を導入する方法が議論されている。当業者
は、選択したレトロンからｍｓＤＮＡを生産するため
に、最も適当な系を選択するであろう。さらに、ホ乳類
細胞にＤＮＡを導入するためにも、同様である（Curren
t Protocols In Molecular Biology, Volume 1, §9.01
-9.93(Ausubel et al., Eds., Greene Publishing Asso
ciates and Wiley-Interscience, 1989 ）参照。
【０１３３】ｍｓＤＮＡはいくつかの重要な有用性を有
する。
【０１３４】考られる魅力的な用途は、本発明のｍｓＤ
ＮＡがトリプルヘリックスＤＮＡまたは染色体上に特定
のダブルヘリックスをもつトリプレックスＤＮＡの形成
を演じるという役割である。Science, 252, 1374-1375
(June 27, 1991), "TriplexDNA Finally Comes of Ag
e"における最近の報告は本発明が時を得ていることを示
している。トリプレックスＤＮＡは、３本目の鎖が染色
体ＤＮＡ上の特定の認識部位に結合することによって形
成される。好ましいことに、塩基の完全な相補性（１１
−１５およびそれ以上高いもの）を有する大きさの合成
鎖が議論されている。長い３′（または５′）末端（お
よび非ダプレックス塩基）を有する本発明のｍｓＤＮＡ
は、有力な候補であることがわかる。これらの領域はト
リプレックス形成に必要な一本鎖ＤＮＡを提供する。こ
の結果生じたトリプレックスＤＮＡが、安定性と有用性
を増加させたことが予想される。トリプルヘリツクス形
成に基づく新しい治療、すなわちエイズ治療および選択
遺伝子の阻害およびその他の治療に含まれる治療が、本
発明により提案される。
【０１３５】人工的に合成されたｍｓＤＮＡは、ｍｓＤ
ＮＡの一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ領域を用いて、アンチ
センスＤＮＡおよび／またはＲＮＡおよび／またはリボ
ザイムとして設計することが出来、用いられる。アンチ
センス系として用いるようなｍｓＤＮＡ（外来のｓｓＤ
ＮＡまたはｓｓＲＮＡフラグメントを有する）は、上記
した通りである。その遺伝子（またはその一部）と相補
的なｍｓＤＮＡが生産されると、その特定のタンパク質
の合成が阻害される。ある遺伝子のｍＲＮＡの希望する
相補的なＤＮＡを生み出すために、真核細胞において作
り出されたｍｓＤＮＡ系は、真核細胞中で実効を有し、
薬物耐性、ガン遺伝子およびファージまたはウイルスの
ような種々の有害または毒性遺伝子の発現を阻害するこ
とが明らかである。この系は、エイズ治療に適応性を有
するであろう。特に重要なものとしては、ヒーラ細胞に
よって生産され、アンチセンスとして使用のために選択
されたＤＮＡフラグメントを有するｍｓＤＮＡが挙げら
れる。
【０１３６】上記のように、遺伝子は例えばｍｓＤＮＡ
のステム領域に挿入されることが考えられる。従ってｍ
ｓＤＮＡは選択された遺伝子の増幅に用いられてもよ
い。
【０１３７】ＰＣＲ法は、特定のＤＮＡフラグメントを
インビトロで酵素的に増幅する、周知の迅速な方法であ
る。標準的ＰＣＲ法は、２本鎖ＤＮＡのセグメントが増
幅されること、並びにそのセグメントの隣りの２本の一
本鎖オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラー
ゼ、適当なデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴ
Ｐ）、バッファーおよび塩が要求される（Current Prot
ocols, Section 15 ）。
【０１３８】従って、特異的構造（および安定性）によ
るｍｓＤＮＡは、生化学、医学、薬学および他の生物科
学において多大な適応価値を有すると予想される。
【０１３９】本発明は技術および科学に重要な貢献をし
たと思われる。
【０１４０】本発明は、この選ばれた技術分野の当業者
に対し記載されたものである。均等の原則は本発明のす
べての態様および側面に適応される。参考文献 １． TIBS,16,18-21(1991a) ２． Ann.Rev.Microbiol,45,163-186(1991b) ３． Lampson et al.,Progress In Nucleic Acid R
esearch and Molecular Biology,60,1-24 ４． Retroelements ５． Weiner et al.,Ann.Rev.Biochem.,55,631-661
(1986) ６． Broach et al.,Experimental Manipulation of
Gene Expressiom,Academic Press Inc.,New York,1983 ７． Lampson et al.,Science,243,1033-1038(1989) ８． Sanger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,54
63-5467(1977) ９． Dhundale et al.,Cell,51,1105-1112,1987 １０． Dhundale et al.,J ．Biol.Chem.,263,9055-90
58,1988b １１． Furuichi et al.,Cell,48,47-52,1987a and Fu
ruichi et al.,Cell,48,55-62,1987b １２． Lim and Maas,Cell,56,891-904,1989 １３． Sun et al.,J.Bacrobiol.,173,4171-4181,1991 １４． Herzer et al.,Mol.Microbiol.,submitted,Aug
ust 1991 １５． Yanisch-Perron et al.,Gene,33,103-119,1985 １６． Ito et al.,J.Bacteriol.153,163-168,1983 １７． Kozak,J.Cell Biology,108,229-241,1989 １８． Boeke et al.,Cell,40,491-500,1985 １９． Hamilton et al.,Nucl.Acids Res.,15,3581-35
83,1987 ２０． Yee et al.,Cell,38,203-209,1984 ２１． Coleman et al.,Cell,37,429-436(1984) ２２． Watson et al.,Molecular Biology of the Gen
e,Fourth Ed.(1987),Chapter 18 ２３． Rose et al.,Methods in Yeast Genetics:A La
boratory Course Manual,Cold Spring Harbor Lab.,Col
d Spring Harbor,NY,1990 ２４． Hoffman and Winston,Gene,57,268-272,1987 ２５． Elder et al.,Proc.Natl.Sci.USA,80,2432-243
6,1983 ２６． Chomzynski et al.,Anal.Biochem,162,156-15
9,1987 ２７． Southern,Mol.Biol.,98,503-517,1975 ２８． Denhardt,Biochem.Biophys.Res.Commun.,23,64
1-646(1966) ２９． Rigby et al.,J.Mol.biol.,113,237-251,1977 ３０． ATCC Catalogue of Yeasts,18th Ed.,1990 ３１． Genetic Engineering of Plants,An Agricultu
ral Perspective,Editedby Kosuge et al.,Plenum Pres
s(1983) ３２． Methods in Enzymology,Vol.194 “Guide to Y
east Genetics and Molecular Biology ”,page 373(Gu
thrie and Fink,Eds.,Academic PressInc.,1991) ３３． U.S.Pat.No.4,415,734 ３４． Matteuci et al.,J.Am.Chem.Soc., 103(11):31
85-3191(1981) ３５． Adams et al .,J.Am.Chem.Soc.,105(3):661-66
3(1983) ３６． Bemcage et al., Tetrahedron Letters,22(2
0):1859-1867(1981) ３７． Molecular Cloning:A Labotatory Manual,Seco
nd Edition, §3,§16.3and seq.(Sambrook et al.,Col
d Spring harbor Laboratory Press,1989) ３８． Current Protocols In Molecular Biology,Vol
ume 1,§16.12-16.13.7(Ausubel et al.,Eds.,Greene P
ublishing Associates and Wiley-Intetrscience,1989) ３９． Current Protocols In Molecular Biology,Vol
ume 1,§9.01-9.93(Ausubel et al.,Eds.,Greene Publi
shing Associates and Wiley-Interscience,1989) ４０． Science ,252,1374-1375(June 27,1991),“Tr
iplex DNA Finally Comes of Age” ４１． Current Protocols,Section 15 ４２． Science , 252,1643-1650(June 21,1991)
【図面の簡単な説明】
【図１】ｍｓＤＮＡの合成の生合成経路を表したもので
ある。
【図２】典型的な細菌のｍｓＤＮＡの構造を表したもの
である。
【図３】ｍｓＤＮＡ−Ｙｅ１１７の構造を表したもので
ある。
【図４】ｍｓＤＮＡ生産に必要なレトロ因子中の遺伝子
の転位を表したものである。
【図５】種々の細菌ＲＴの主要構造を比較したものであ
る。
【図６】プラスミドＹＥｐ５１およびＹＥｐ５２を表し
たものである。
【図７】１１．６ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントの制限
地図を表したものである。
【図８】プラスミドＰＣ１−１ＢＰｖ４、ＹＥｐ５２１
−Ｍ１、ＹＥｐ５２１−Ｍ２、ＹＥｐ５２１−Ｍ３、Ｙ
Ｅｐ５２１−Ｍ４およびＹＥｐ５２１−Ｍ５を図式で表
したものである。
【図９】ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の生産を示す、シークエ
ンスポリアクリルアミドゲルのバンドａおよびｂを表し
た電気泳動写真である。
【図１０】ＡＭＶ−ＲＴおよびＲＮａｓｅ Ａの処理に
よってｍｓＤＮＡの３′末端が伸長したことを図によっ
て表したものである。
【図１１】サッカロミセス セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）で生産されたｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の
サザンブロットハイブリダイゼーションを表した写真で
ある。
【図１２】プラスミドＹＥｐ５２１−Ｍ５を図式で表し
たものである。レトロン中の黒ぬりの領域は、レトロン
Ｅｃ６７のｍｓｄ領域に挿入されたｃｄｃ２８に対する
５０塩基対のアンチセンスＤＮＡ（ＸｈｏＩ部位にクロ
ーン化された）を表す。ｃｄｃ２８に対する５０塩基対
のアンチセンスＤＮＡもまた示されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 オオシマ、アツシ アメリカ合衆国ニュージャージー州、ハ イランド、パーク、シーダー、レイン、 200‐エイ、アパートメント、48エイ (72)発明者 イノウエ、スミコ アメリカ合衆国ニュージャージー州、ブ リッジウォーター、リンベイル、レイ ン、３ (72)発明者 イノウエ、マサヨリ アメリカ合衆国ニュージャージー州、ブ リッジウォーター、リンベイル、レイ ン、３ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】真核生物細胞において、安定なマルチコピ
    ー一本鎖ＤＮＡ（ｍｓＤＮＡ）を生産する方法であっ
    て、 ＤＮＡ発現ベクターにより形質導入された前記細胞にお
    いて前記ｍｓＤＮＡを発現させることを含んでなり、 ここで前記発現ベクターは、前記細胞において複製可能
    であり、かつ前記細胞において前記ｍｓＤＮＡを発現可
    能なレトロンを含んでなり、該レトロンは前記ｍｓＤＮ
    ＡのＲＮＡ部分をコードする領域ｍｓｒおよびＤＮＡ部
    分をコードする領域ｍｓｄ（ｍｓｒ−ｍｓｄ）と、逆転
    写酵素（ＲＴ）をコードする遺伝子とを含んでなるもの
    である、方法。
  2. 【請求項２】前記真核生物細胞が、酵母、植物、または
    哺乳類細胞である、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】前記ｍｓＤＮＡのレトロンがｍｓｒ−ｍｓ
    ｄ領域およびＲＴをコードする遺伝子を含んでなり、該
    ＲＴをコードする遺伝子がｍｓｒ−ｍｓｄ領域の上流ま
    たは下流にある、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】前記発現ベクターがｍｓｒ−ｍｓｄ領域お
    よびＲＴをコードする遺伝子からなるレトロンのプロモ
    ーターを含んでなり、そのプロモーターがｍｓｒの上流
    に位置するものであり、かつ外来の強力なプロモーター
    または内在性のプロモーターのいずれかである、請求項
    １記載の方法。
  5. 【請求項５】前記外来ＤＮＡフラグメントが、ｍｓＤＮ
    ＡのＤＮＡをコードするレトロンのｍｓｄ領域に含まれ
    てなる、請求項３記載の方法。
  6. 【請求項６】前記レトロンがベクターＹＥｐ５２１−Ｍ
    １またはＹＥｐ５２１−Ｍ３中にある、請求項１記載の
    方法。
  7. 【請求項７】前記レトロンがベクターＹＥｐ５２１−Ｍ
    ５中にある、請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】前記ｍｓＤＮＡ分子が、内部のｒＧ残基の
    ２’−ＯＨ基とＤＮＡ分子の５’−リン酸との間の
    ２’，５’ホスホジエステル結合によって一本鎖ＤＮＡ
    に共有結合している分岐した一本鎖ＲＮＡを含んでな
    り、前記ＲＮＡはＲＮＡとＤＮＡ分子の間の相補的な
    ３’末端の塩基対合によってＤＮＡに非共有結合し、前
    記ＲＮＡ- ＤＮＡは安定したステムループ二次構造を形
    成し、前記ｍｓＤＮＡはＲＮＡ一次転写産物、ｍｓｒ遺
    伝子座の下流の読みとり枠（ＯＲＦ）を含むｐｒｅ−ｍ
    ｓＤＮＡ、レトロウイルスＲＴと類似の配列を有するポ
    リペプチドをコードするＯＲＦおよびすべてのＲＴに共
    通の高度に保存された配列によってコードされるもので
    ある、請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】生産された安定したｍｓＤＮＡが、ｍｓＤ
    ＮＡ- Ｍｘ１６２、ｍｓＤＮＡ- Ｍｘ６５、ｍｓＤＮＡ
    - Ｅｃ１０７、ｍｓＤＮＡ- Ｍｘ８６、およびＳａ１６
    ３およびｍｓＤＮＡ- Ｅｃ６７からなる群から選択され
    る、請求項１記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記ＯＲＦがｍｓｒ遺伝子座の上流に位
    置している、請求項１記載の方法。
  11. 【請求項１１】安定したハイブリッド一本鎖ＲＮＡ- Ｄ
    ＮＡ（ｍｓＤＮＡ）構造をコードでき、逆転写酵素（Ｒ
    Ｔ）並びにｍｓＤＮＡのＲＮＡおよびＤＮＡ部分をそれ
    ぞれコードするｍｓｒおよびｍｓｄのふたつのコード配
    列を含む一つのコード領域を有するレトロンを含んでな
    る、真核生物宿主で複製可能な、ＤＮＡ発現ベクター。
  12. 【請求項１２】レトロンにおいてＲＴ遺伝子がｍｓｒ−
    ｍｓｄ領域の上流または下流にある、請求項１１記載の
    遺伝子発現ベクター。
  13. 【請求項１３】プロモーターが内在性のプロモーターま
    たは外来の強力なプロモーターである、請求項１１記載
    のベクター。
  14. 【請求項１４】一本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＤＮＡの部分
    から構成される新規なｍｓＤＮＡ分子であって、前記分
    子は内部のｒＧ残基の２’−ＯＨ基とＤＮＡ分子の５’
    −リン酸との間の２’，５’ホスホジエステル結合によ
    って一本鎖ＤＮＡに共有結合している分岐した一本鎖Ｒ
    ＮＡを含んでなり、前記ＲＮＡはＲＮＡとＤＮＡ分子の
    間の相補的な３’末端の塩基対合によってＤＮＡに非共
    有結合し、前記ＲＮＡ-ＤＮＡは安定したステムループ
    二次構造を形成し、前記ｍｓＤＮＡはＲＮＡ一次転写産
    物、ｍｓｒ遺伝子座の上流の読みとり枠（ＯＲＦ）を含
    むｐｒｅ−ｍｓＤＮＡ、レトロウイルスＲＴと類似の配
    列を有するポリペプチドをコードするＯＲＦおよびすべ
    てのＲＴに共通の高度に保存された配列によってコード
    されるものであり、前記ｍｓＤＮＡはｍｓｒ−ｍｓｄ領
    域によってコードされるものであり、前記ｍｓＤＮＡは
    ｍｓＤＮＡのＤＮＡをコードしたレトロンのｍｓｄ領域
    によってコードされた領域中のＤＮＡの５’末端鎖にお
    いて外来のＤＮＡフラグメントを含んでなるものであ
    る、ｍｓＤＮＡ分子。
  15. 【請求項１５】ｍｓＤＮＡがプラスミドＹＥｐ５２１−
    Ｍ４またはＹＥｐ５２１−Ｍ５によってコードされる、
    請求項１４記載のｍｓＤＮＡ。
  16. 【請求項１６】標的遺伝子の特定のｍＲＮＡまたはその
    フラグメントに相補的なＲＮＡ転写産物を生ずることが
    できる外来ＤＮＡフラグメントを、５’末端によって終
    結するＤＮＡ部分に含んでなる、請求項１４記載のｍｓ
    ＤＮＡ。
  17. 【請求項１７】相補配列が下記式で表される、請求項１
    ６記載のｍｓＤＮＡ。 【化１】
  18. 【請求項１８】生じたＲＮＡがｃｄｃ２８に相補的であ
    る、請求項１７記載のｍｓＤＮＡ。
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Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5780269A (en) * 1989-02-24 1998-07-14 The University Of Medicine And Denistry Of New Jersey Hybrid molecules
US5849563A (en) * 1989-02-24 1998-12-15 The University Of Medecine And Dentistry Of New Jersey Eukaryotes expressing single stranded hybrid molecules
US6017737A (en) * 1989-02-24 2000-01-25 The University Of Medicine And Denistry Of New Jersey E. coli msDNA synthesizing system, products and uses
FR2675803B1 (fr) * 1991-04-25 1996-09-06 Genset Sa Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications.
JPH08506011A (ja) 1992-12-09 1996-07-02 イー． ミラー，ジェフリー ｃＤＮＡ合成のための方法及び組成物
US5366690A (en) * 1993-06-18 1994-11-22 Combustion Engineering, Inc. Zirconium alloy with tin, nitrogen, and niobium additions
WO2000022114A1 (en) * 1998-10-09 2000-04-20 Ingene, Inc. PRODUCTION OF ssDNA $i(IN VIVO)
US20070160581A1 (en) * 1994-04-29 2007-07-12 Cytogenix, Inc. Production of ssDNA in vivo
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
CZ295108B6 (cs) 1998-03-20 2005-05-18 Benitec Australia Ltd Syntetický gen obsahující dispergovanou nebo cizorodou deoxyribonukleovou molekulu a genový konstrukt obsahující tento syntetický gen
DE69933382T2 (de) * 1998-10-09 2007-08-30 Cytogenix, Inc., Houston Herstellung von ssdna innerhalb der zelle
IL142490A0 (en) * 1998-10-09 2002-03-10 Ingene Inc ENZYMATIC SYNTHESIS OF ssDNA
AU2004205192B2 (en) * 1998-10-09 2007-09-20 Cytogenix, Inc. Production of ssDNA in vivo
US20030082800A1 (en) * 1998-10-09 2003-05-01 Cytogenix, Inc. In vivo ssDNA expression vectors for altering gene expression
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
US7419964B2 (en) * 1999-09-16 2008-09-02 Cytogenix, Inc. Treatment of HSV-related pathologies using ssDNA
AUPR621501A0 (en) 2001-07-06 2001-08-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Delivery of ds rna
AU2011253686C1 (en) * 2001-09-28 2014-04-03 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. Micro-RNA molecules
CA2462144C (en) 2001-09-28 2016-09-20 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Micro-rna molecules
WO2003093424A2 (en) * 2002-05-01 2003-11-13 Cytogenix, Inc. In vivo ssdna expression vectors for altering gene expression
US20050260588A1 (en) * 2002-05-01 2005-11-24 Conrad Charles A In vivo ssdna expression vectors for altering gene expression
US20050250207A1 (en) * 2002-06-05 2005-11-10 Rozwadowski Kevin L Retrons for gene targeting
US20040248101A1 (en) * 2003-06-03 2004-12-09 Cytogenix, Inc. Identification of novel antibacteria agents by screening the single-stranded DNA expression library
US20050020526A1 (en) * 2003-06-03 2005-01-27 Cytogenix, Inc. Oligodeoxynucleotide intervention for prevention and treatment of sepsis
US11866728B2 (en) 2022-01-21 2024-01-09 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2023183588A1 (en) * 2022-03-25 2023-09-28 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Methods of assessing engineered retron activity, and uses thereof
WO2024044723A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0132309A3 (en) * 1983-06-27 1985-12-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Novel regulatable eukaryotic promoter element
US5079151A (en) * 1989-02-24 1992-01-07 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Production of branched RNA-linked multi-copy single-stranded DNA using permeabilized cells

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