CN107083373B

CN107083373B - 一株异源高效表达脂肪酶的重组毕赤酵母及其应用

Info

Publication number: CN107083373B
Application number: CN201710402904.0A
Authority: CN
Inventors: 黄金金; 王一洲; 孙梦雪; 郑维发; 赵艳霞
Original assignee: Jiangsu Normal University
Current assignee: Jiangsu Normal University
Priority date: 2017-06-01
Filing date: 2017-06-01
Publication date: 2020-07-07
Anticipated expiration: 2037-06-01
Also published as: CN107083373A

Abstract

本发明公开了一株异源高效表达脂肪酶的重组毕赤酵母及其应用。重组毕赤酵母通过向含4拷贝数pro‑rml基因的能够表达Pro‑RML的重组巴斯德毕赤酵母X‑33中转化过表达HAC1基因的质粒HAC1‑pPIC3.5K得到。该菌株摇瓶发酵96h时，胞外酶活最高达到1078U/mL，酶活分泌效率达到47U/OD₆₀₀。而专利CN103361327A涉及的2个米黑根毛霉脂肪酶拷贝数的毕赤酵母达到最高胞外酶活及酶的分泌效率需要发酵120h，胞外酶活最高为1038U/mL，酶活分泌效率仅为25U/OD₆₀₀。本发明有效的促进了米黑根毛霉脂肪酶的表达，在不影响胞外最高酶活的情况下，使米黑根毛霉脂肪酶的分泌效率提高了1.9倍，且发酵时间缩短了24h。

Description

一株异源高效表达脂肪酶的重组毕赤酵母及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一株异源高效表达脂肪酶的重组毕赤酵母及其应用。

背景技术

脂肪酶(E C3.1.1.3)是可以水解三酰甘油的一类酶，可催化多种化学反应如：水解、酯化、转酯化、氨解等，且具有反应条件温和、专一性强、无污染等优点被广泛的应用于食品、医药、化妆品、石油等行业，被称之为第三大工业用酶。

脂肪酶虽然用途广，但出发菌株产量低，限制其应用，因此异源蛋白表达是当前蛋白工业化生产的主要策略。但异源蛋白表达时的影响因素很多，如宿主的选择、基因密码子的偏爱性、基因拷贝数、载体的性能、培养条件、宿主自身蛋白合成分泌途径的承受能力等等。多种限制因素的存在使多数酶的表达量仍旧很低，单一因素的改造也不能有效地提高酶的表达水平。如何提高宿主分泌异源脂肪酶的能力是脂肪酶工业化应用需解决的问题。

异源蛋白过表达过程中，为保证蛋白被正确折叠并分泌到胞外，会采取一系列质量控制措施。如当大量的新生肽或未折叠的蛋白在内质网中积累时，会激发解折叠蛋白反应(UPR反应)，UPR反应可增强蛋白折叠及降解途径的相关基因的表达，使未折叠蛋白折叠且错误折叠蛋白降解，从而缓解内质网的压力。转录调控因子HAC1可以与UPR顺式作用元件结合，从而上调UPR反应相关基因的表达。

米黑根毛霉脂肪酶是一种1,3-位置专一性的脂肪酶，可被用于生物柴油制备的多个方面。申请人前期申请的CN103361327A公开了一种异源高效分泌表达米黑根毛霉脂肪酶的重组毕赤酵母，上述重组毕赤酵母是通过采用分子生物学技术，引入2个拷贝的米黑根毛霉脂肪酶基因(带自身前导肽)，构建能在巴斯德毕赤酵母表达的载体来获得的。该重组毕赤酵母虽然实现了米黑根毛霉脂肪酶的异源分泌，分泌的重组酶酶活较高，但其分泌效率终是影响其推广应用的软肋。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一株高分泌效率的米黑根毛霉脂肪酶的重组毕赤酵母菌株。

本发明的第二个目的在于提供提高上述脂肪酶分泌效率的方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种高效异源分泌表达米黑根毛霉脂肪酶的基因工程菌，所述的基因工程菌通过向含4拷贝数pro-rml基因的能够表达Pro-RML的重组巴斯德毕赤酵母X-33中转化过表达HAC1基因(SEQ ID NO.10)的质粒HAC1-pPIC3.5K得到。

所述的含4拷贝数的pro-rml基因的重组巴斯德毕赤酵母X-33是通过将含前导肽的脂肪酶基因pro-rml插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZα A上构建得到含2拷贝pro-rml基因的表达载体pPICZα A-2prorml；其质粒构建过程如附图2所示。将pPICZα A-2prorml转化到巴斯德毕赤酵母X-33中通过qPCR法筛选获得含4拷贝数pro-rml基因的能够表达Pro-RML的重组巴斯德毕赤酵母X-33。

本发明从米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)菌株中克隆到包含前导肽的1,3-位置专一性的脂肪酶(Pro-RML)基因pro-rml，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该基因全长为(1017)bp，分析表明，GC含量为(48.9)％，编码(339)个氨基酸组成的蛋白。

本发明发现在4拷贝数目的基因的能够表达Pro-RML的基因工程菌中产生UPR压力，将UPR反应相关的HAC1连接到pPIC3.5K载体上(图3)，转化到4拷贝数目的基因的能够表达Pro-RML的基因工程菌中，获得了过表达HAC1的4拷贝数目的基因的能够表达Pro-RML的基因工程菌株。

本发明所述的基因工程菌在异源分泌表达米黑根毛霉脂肪酶中的应用。

一种高效异源分泌表达米黑根毛霉脂肪酶的方法，其是通过培养上述过表达HAC1的4拷贝数Pro-RML基因的基因工程菌，经诱导表达获得脂肪酶Pro-RML。所述培养条件为28℃，初始pH为7，200rpm培养96h。所述诱导条件为每24h补充一次诱导物甲醇，至甲醇终浓度为1.0％。采用该方法，摇瓶培养96h，以橄榄油为底物，酶活为1078U/mL。并发现该菌株的分泌效率得到明显提高47U/OD₆₀₀，高于专利CN103361327A所涉及的2拷贝菌株(96h时分泌效率为17U/OD₆₀₀)。

有益效果：

本发明通过将该脂肪酶在毕赤酵母中表达，优化其基因拷贝数，获得一株含有4个米黑根毛霉脂肪酶基因拷贝数的毕赤酵母重组菌株，摇瓶发酵120h时，胞外酶活最高为748U/mL，酶活分泌效率为25U/OD₆₀₀。另外发现该菌株mRNA转录水平高，但不能有效的转化为有活性的目的蛋白，且在该菌株内部产生了UPR反应。通过在该菌株中过表达转录调控因子HAC1，有效的促进了米黑根毛霉脂肪酶的表达，提高了该酶的分泌效率，摇瓶发酵96h时，酶活达到1078U/mL，菌株酶活分泌效率达到47U/OD₆₀₀，该分泌效率高于专利CN103361327A中涉及的2个米黑根毛霉脂肪酶拷贝数的毕赤酵母重组菌株在96h的分泌效率17U/OD₆₀₀，且在不影响最高酶活的情况下，发酵时间缩短了24h。本发明为该酶的工业化应用奠定了基础。

附图说明

图1目的基因DNA酶切回收电泳图，泳道1为DNA标准分子量(kb):4.5,3.0,2.0,1.2,0.8,0.5 0.2；泳道2:目的基因DNA酶切回收1017bp片段(箭头所指)；

图2 2拷贝表达质粒构建流程图；

图3过表达HAC1载体的构建过程；

图4过表达HAC1的菌株摇瓶发酵结果比较；

A：发酵过程中各菌株的细胞生长情况；B：发酵过程中各菌株的胞外酶活；C：发酵过程中各菌株的酶活分泌效率比较；

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液100ml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。所涉及的酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。引物合成及测序由英骏(Invitrogen)生物公司完成。

实施例1米黑根毛霉cDNA的制备

1.1米黑根毛霉总RNA的提取

(1)取适量的米黑根毛霉菌丝，滤纸吸干水分，液氮研磨，加入1ml Trizol试剂(Invitrogen)，振荡器振荡5min,室温静置1min；

(2)加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min；

(3)4℃，12000rpm，15min；

(4)吸取上清，加入等体积异丙醇，-20℃沉淀30min；

(5)4℃，12000rpm，15min；

(6)倒掉上清，用1ml 75％乙醇洗涤沉淀，7500rpm，4℃，5min；

(7)重复(6)步骤一次；

(8)倒掉上清，干燥10min；

(9)加入适量的DEPC水溶解,得到总RNA；

1.2米黑根毛霉cDNA第一链的制备

反转录采用由Promega公司生产的反转录酶(MMLV)具体操作如下：

25μl反应体系将以下成分加到一个无核酸酶的离心管中：

95℃加热5min终止反应，冷冻保存。

实施例2 2拷贝pPICZα A-2prorml质粒的构建

2.1引物设计

根据GenBank中rml基因的序列(GenBank登录号为A02536.1)，设计合成了以下一对引物：

FW(P1)：5’—CGGAATTCGTGCCAATCAAGAG—3’(SEQ ID NO.2)

REV(P2)：5’—TAGTCTAGAGTACAGAGGCCTGTG—3’(SEQ ID NO.3)

P1、P2两端分别设计有EcoR I和Not I酶切位点(见上述序列中斜体并有下划线的部分)

2.2含前导肽的米黑根毛霉脂肪酶pro-rml的PCR扩增

采用P1、P2引物，以米黑根毛霉(Boel E,Huge-Jensen B,Christensen M,Thim L,Fiil N:Rhizomucor miehei triglyceride lipase is synthesized as aprecursor.Lipids 1988,23(7):701-706.)cDNA为模板，PCR反应体系为：

反应条件为：95℃5min，5℃40s，60℃40s，72℃1min，循环30次，72℃10min,4℃2min。

2.3从PCR反应产物中回收目的片段

从PCR产物中纯化回收目的基因片段采用切胶过柱的方法，PCR反应产物经过琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯的照射下切下目的基因DNA，目的基因长度为1017bp(图1)，按照DNA回收试剂盒说明书(购自天根公司，产品编号为DP209-02)的方法进行回收。

2.4 TA克隆

将PCR回收产物连接到载体pMD18-T-Simple上(购自TaKaRa公司)，连接反应按照TaKaRa公司所提供的试剂盒(Code No.D104A)说明书操作。

2.5目的基因连接到巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZα A。

用限制性内切酶EcoR I和Not I分别对pMD18-T-prorml和pPICZα A进行双酶切，然后对目的片段进行回收，用T4连接酶将其连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α(购自上海生工生物工程有限公司)。得到单拷贝表达质粒pPICZα A-prorml。将带有单拷贝pPICZα A-prorml进行BamH I和Bgl II双酶切，得到含有prorml片段的表达框；将pPICZα A-prorml进行BamH I单酶切得到含有单拷贝prorml的pPICZα A载体片段；将上述表达框和载体片段连接即得到2拷贝的pPICZα A-2prorml载体。表达质粒pPICZα A-2prorml转入大肠杆菌DH5α中进行扩增并PCR检测，送invitrogn公司测序。构建流程图见图2。

实施例3 4拷贝pro-rml基因的毕赤酵母重组菌株筛选

3.1巴斯德毕赤酵母X-33(Invitrogen公司购买)电转化感受态细胞的制备

(1)挑取新鲜的单菌落于5ml YPD液体培养基中，于30℃，250rpm培养12-14h；

(2)以0.1％的接种量接种到含500ml YPD培养基的2L三角瓶中，于30℃，250rpm培养12-14h，使其OD₆₀₀＝1.3-1.5；

(3)在4℃下1500rpm离心5分钟，收集细胞；

(4)用500-250ml冰预冷的无菌水洗涤细胞两次；

(5)用20ml冰预冷的1M山梨醇溶液洗涤细胞一次；

(6)用1ml冰预冷的1M山梨醇溶液重悬细胞，至终体积为1.5ml左右，以80μl分装于小离心管；

3.2巴斯德毕赤酵母酵母细胞的电击转化

(1)将准备好的约100μg/μl的非线性化2个拷贝目的基因的表达质粒pPICZα A-2prorml约10μl，与80μl酵母感受态细胞混匀，在冰上放置约5分钟；

(2)把混合了DNA的感受态细胞转入冰预冷的0.2cm的电转杯；

在1.5千伏的电压下转化；

(3)然后马上加入1ml冰预冷的1M山梨醇溶液于经转化的细胞中，把细胞混匀，转入1.5ml小离心管,30℃静止1-2h。

(4)取50-200ul涂布于含有100ug/ml YPDS平板(yeast extract 1％,peptone2％,dextrose 2％,Sorbitol 1M,agar 2％,)，于30℃培养2至3天观察结果。

3.3含4拷贝数的pro-rml基因的重组菌株的筛选

3.3.1酵母菌落PCR法鉴定正确整合的转化子

在平板上选到阳性菌落，以5’AOX1、3’AOX1为引物，利用酵母菌落PCR的方法进一步验证得到正确整合的转化子。

引物序列为： 5’AOX1：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′(SEQ ID NO.4)

3’AOX1：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′(SEQ ID NO.5)

模板的处理方法：

(1)用无菌的吸头挑取菌落少许，溶解到50μl的D2-Buffer(1L：异硫氰酸胍472.64g,1mol/L pH8.0Tris·HCl缓冲液50ml,β-巯基乙醇7ml)中混匀；

(2)将混合液于100℃沸水浴5min；

(3)12000rpm，离心30s，弃上清；

(4)用无菌水洗涤沉淀2次；

(5)将沉淀溶于20μl的ddH₂O，95℃作用5min；

(6)离心后得到上清液即为模板。

PCR反应体系：

反应条件：95℃5min；95℃40s，60℃40s，72℃1min 30s，30cycles；72℃10min。

3.3.2采用qPCR法确定4拷贝菌株

用TIANGEN酵母基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Yeast DNA Kit,货号：DP307-02)提取筛选得到的毕赤酵母重组子的的基因组，用只含有一个拷贝pro-rml的重组子的基因组为模板，选取甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(gap)为内参基因，将模板进行不同浓度的稀释,Q-PCR检测，分别得到目的基因pro-rml和内参基因gap的模板量的log值与Ct值之间的标准曲线。将未知样品的目的基因的Ct(pro-rml)和内参基因Ct(gap)代入公式得到目的基因和内参基因的模板量pro-rml(copy quantity)和gap(copy quantity)。拷贝数计算公式为：

结果见表1：

表1确定重组菌株的拷贝数

实施例4将HAC1基因在4拷贝的上述菌中进行过表达

4.1 HAC1基因片段的获得

以P_HAC1-F(CGGGATCCACCATGCCCGTAGATTCTTCTCATAAG(SEQ ID NO.6))和P_HAC1-R(ATAAGAATGCGGCCGCTCACCTGATCGCTATGCATG(SEQ ID NO.7))为引物，毕赤酵母X-33的基因组为模板(TIANGEN酵母基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Yeast DN A Kit,货号：DP307-02)提取)，以下面的PCR体系及扩增条件获得HAC1基因的片段。

PCR反应体系：

反应条件：95℃5min；95℃40s，60℃40s，72℃2min，30cycles；72℃10min。

4.2过表达质粒HAC1-pPIC3.5K的构建

将HAC1基因的PCR回收产物连接到载体pMD18-T-Simple上(购自TaKaRa公司)，连接反应按照TaKaRa公司所提供的试剂盒(Code No.D104A)说明书操作。经测序获得正确的HAC1-pMD18T质粒。用限制性内切酶BamH I和Not I双酶切HAC1-pMD18T和pPIC3.5K，分别割胶回收HAC1片段和pPIC3.5K载体。用T4连接酶将其连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α。经质粒提取、PCR、BamHI和Not I双酶切验证筛选获得过表达质粒HAC1-pPIC3.5K。构建过程见图3。

4.3过表达质粒HAC1-pPIC3.5K电转化到含有4拷贝脂肪酶基因的毕赤酵母及阳性菌株筛选。

HAC1-pPIC3.5K提取、线性化及电转化方法同3.2，阳性菌株的筛选过程同3.3.，所用引物为D-HAC1-F(ATGCCCGTAGATTCTTCTCATAAGACAGCTAGCCCACTTCCACCT(SEQ ID NO.8))和D-HAC1-R(GCAAATGGCATTCTGACATCC(SEQ ID NO.9))。PCR反应体系及扩增条件同3.3。筛选获得过表达HAC1的4拷贝pro-rml基因的阳性菌株。

4.4巴斯德毕赤酵母中目的脂肪酶的表达

(1)0.05M NaOH的配制：先用无CO₂水配置5M的NaOH储液；再准确稀释50倍后，称取100℃烘至恒重的邻苯二甲酸氢钾0.38g，溶于80ml无CO₂水中，标定出其准确浓度，再推算出储液浓度；0.05M的NaOH溶液以无CO₂水用储液现用现配；

(2)PVA－橄榄油乳化液底物的配制：将橄榄油100ml,300ml 2％PVA1750(聚乙烯醇)混合，加热溶化，用超声波乳化，功率300W，超声3s，间歇4s，99次，循环2次；

(3)取5ml乳化液底物，4ml 0.1M pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液加入到150ml三角瓶中，置于恒温水浴摇床35℃，150rpm温育5min；

(4)取1ml适当稀释的酶液加入到底物和缓冲液中，35℃150rpm反应10min后加入15ml无水乙醇终止反应；

(5)滴加4滴酚酞作指示剂，用0.05M NaOH滴定酶解产生的脂肪酸，至反应液变粉红色停止；

空白操作与上述一致，只是将发酵液与无水乙醇混合反应10min后加入到底物和缓冲液中。

酶活定义为在该测定条件下，1min释放1μmol脂肪酸的酶量为一个酶活单位。

挑取过表达HAC1的4拷贝pro-rml基因菌株(mα-4pRML-X33H)、未过表达HAC1的4拷贝pro-rml基因菌株(mα-4pRML-X33)和专利CN103361327A所涉及的2拷贝pro-rml基因菌株(mα-2pRML-X33)的单菌落，接种于25ml BMGY培养基(1％酵母粉,2％蛋白胨,1％甘油)，于28℃，200rpm摇床培养至OD₆₀₀为4.0-8.0左右，转接到装有50ml BMMY培养基(1％酵母粉,2％蛋白胨,1.0％甲醇，100mmol/l磷酸缓冲液，pH 7.0)的500ml三角瓶中，相同培养条件继续培养，每24小时补加100％甲醇于培养基至终浓度为1.0％(v/v)，诱导表达5天。每隔一定的时间取样，测量其细胞密度(OD₆₀₀)和胞外的米黑根毛霉脂肪酶的酶活,并计算各个菌株的胞外酶活分泌效率，结果见图4。

从各菌株细胞生长看(图4A)，摇瓶发酵120h，mα-2pRML-X33(OD₆₀₀＝40.65)的细胞生长状况优于mα-4pRML-X33H(OD₆₀₀＝24.5)和mα-4pRML-X33(OD₆₀₀＝24.25)。说明过表达HAC1的4拷贝pro-rml基因的重组毕赤酵母生长状况略低于2拷贝pro-rml基因的重组毕赤酵母，但与4拷贝pro-rml基因的重组毕赤酵母相比变化不大。

各菌株的胞外酶活分泌情况见图4B，当发酵时间为96h时，mα-4pRML-X33H的酶活最高为1078U/ml，高于mα-2pRML-X33(638U/mL)和mα-4pRML-X33(448U/mL)的酶活。当发酵120h时，mα-2pRML-X33和mα-4pRML-X33的最高酶活为1056U/mL和748U/mL。说明过表达HAC1的4拷贝pro-rml基因的重组毕赤酵母胞外最高酶活与mα-2pRML-X33相当，但达到最高酶活的时间比mα-2pRML-X33缩短了24h。

根据酶活和细胞生长状况计算重组菌株的分泌效率，结果见图4C。mα-4pRML-X33H的胞外酶活分泌效率高于mα-2pRML-X33和mα-4pRML-X33，发酵96h时，mα-4pRML-X33H、mα-2pRML-X33和mα-4pRML-X33的胞外酶活分泌效率分别为47U/OD₆₀₀、17U/OD₆₀₀和24U/OD₆₀₀。该结果说明过表达HAC1提高了4拷贝pro-rml基因的重组毕赤酵母的胞外酶活分泌效率。

综上所述根据图4的检测结果：在BMMY培养基(初始pH为7，培养温度为28℃)摇瓶培养的条件下96h，过表达HAC1的含4个拷贝pro-rml基因的巴斯德毕赤酵母重组子的胞外酶活达到最高1078U/ml，胞外酶活分泌效率可达47U/OD₆₀₀，超过了专利CN103361327A所涉及的2拷贝菌株的17U/OD₆₀₀，且达到最高酶活时的发酵时间缩短了24h。

<110> 江苏师范大学

<120> 一株异源高效表达脂肪酶的重组毕赤酵母及其应用

<160> 10

<210> 1

<211> 1017

<212>

<213> 米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）

<220>

<223> pro-rml基因

<400> 1

gtgccaatca agagacaatc aaacagcacg gtggatagtc tgccacccct catcccctct 60

cgaacctcgg caccttcatc atcaccaagc acaaccgacc ctgaagctcc agccatgagt 120

cgcaatggac cgctgccctc ggatgtagag actaaatatg gcatggcttt gaatgctact 180

tcctatccgg attctgtggt ccaagcaatg agcattgatg gtggtatccg cgctgcgacc 240

tcgcaagaaa tcaatgaatt gacttattac actacactat ctgccaactc gtactgccgc 300

actgtcattc ctggagctac ctgggactgt atccactgtg atgcaacgga ggatctcaag 360

attatcaaga cttggagcac gctcatctat gatacaaatg caatggttgc acgtggtgac 420

agcgaaaaaa ctatctatat cgttttccga ggttcgagct ctatccgcaa ctggattgct 480

gatctcacct ttgtgccagt ttcatatcct ccggtcagtg gtacaaaagt acacaaggga 540

ttcctggaca gttacgggga agttcaaaac gagcttgttg ctactgttct tgatcaattc 600

aagcaatatc caagctacaa ggttgctgtt acaggtcact cactcggtgg tgctactgcg 660

ttgctttgcg ccctgggtct ctatcaacga gaagaaggac tctcatccag caacttgttc 720

ctttacactc aaggtcaacc acgggtaggc gaccctgcct ttgccaacta cgttgttagc 780

accggcattc cttacaggcg cacggtcaat gaacgagata tcgttcctca tcttccacct 840

gctgcttttg gttttctcca cgctggcgag gagtattgga ttactgacaa tagcccagag 900

actgttcagg tctgcacaag cgatctggaa acctctgatt gctctaacag cattgttccc 960

ttcacaagtg ttcttgacca tctctcgtac tttggtatca acacaggcct ctgtact 1017

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物P1

<400> 2

cggaattcgt gccaatcaag ag 22

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物P2

<400> 3

tagtctagag tacagaggcc tgtg 24

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物5’AOX1

<400> 4

gactggttcc aattgacaag c 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物3’AOX1

<400> 5

gcaaatggca ttctgacatc c 21

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PHAC1-F

<400> 6

cgggatccac catgcccgta gattcttctc ataag 35

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PHAC1-R

<400> 7

ataagaatgc ggccgctcac ctgatcgcta tgcatg 36

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物D-HAC1-F

<400> 8

atgcccgtag attcttctca taagacagct agcccacttc cacct 45

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物D-HAC1-R

<400> 9

gcaaatggca ttctgacatc c 21

<210> 10

<211> 996

<212> DNA

<213> 毕赤酵母X-33

<220>

<223> HAC1基因

<400> 10

atgcccgtag attcttctca taagacagct agcccacttc cacctcgtaa aagagcaaag 60

acggaagaag aaaaggagca gcgtcgagtg gaacgtatcc tacgtaatag gagagcggcc 120

catgcttcca gagagaagaa acgaagacac gttgaatttc tggaaaacca cgtcgtcgac 180

ctggaatctg cacttcaaga atcagccaaa gccactaaca agttgaaaga aatacaagat 240

atcattgttt caaggttgga agccttaggt ggtaccgtct cagatttgga tttaacagtt 300

ccggaagtcg attttcccaa atcttctgat ttggaaccca tgtctgatct ctcaacttct 360

tcgaaatcgg agaaagcatc tacatccact cgcagatctt tgactgagga tctggacgaa 420

gatgacgtcg ctgaatatga cgacgaagaa gaggacgaag agttacccag gaaaatgaaa 480

gtcttaaacg acaaaaacaa gagcacatct atcaagcagg agaagttgaa tgaacttcca 540

tctcctttgt catccgattt ttcagacgta gatgaagaaa agtcaactct cacacattta 600

aagttgcaac agcaacaaca acaaccagta gacaattatg tttctactcc tttgagtctt 660

ccggaggatt cagttgattt tattaaccca ggtaacttaa aaatagagtc cgatgagaac 720

ttcttgttga gttcaaatac tttacaaata aaacacgaaa atgacaccga ctacattact 780

acagctccat caggttccat caatgatttt tttaattctt atgacattag cgagtcgaat 840

cggttgcatc atccagcagt gatgacggat tcatctttac acattacagc aggctccatc 900

ggctttttct ctttgattgg ggggggggaa agttctgtag cagggaggcg cagttcagtt 960

ggcacatatc agttgacatg catagcgatc aggtag 996

Claims

1.一种高效异源分泌表达米黑根毛霉脂肪酶的基因工程菌，其特征在于所述的基因工程菌通过向含4拷贝数pro-rml基因的能够表达Pro-RML的重组巴斯德毕赤酵母X-33中转化过表达HAC1基因的质粒HAC1-pPIC3.5K得到；所述的含4拷贝数的pro-rml基因的重组巴斯德毕赤酵母X-33是通过将含前导肽的脂肪酶基因pro-rml插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαA上构建得到含2拷贝pro-rml基因的表达载体pPICZαA-2prorml；将pPICZαA-2prorml转化到巴斯德毕赤酵母X-33中通过qPCR法筛选获得含4拷贝数pro-rml基因的能够表达Pro-RML的重组巴斯德毕赤酵母X-33；其中，所述的pro-rml基因核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述的过表达质粒HAC1-pPIC3.5K是将HAC1基因插入pPIC3.5K载体BamH I和Not I酶切位点之间所得。

3.权利要求1-2中任一项所述的基因工程菌在异源分泌表达米黑根毛霉脂肪酶中的应用。

4.一种高效异源分泌表达米黑根毛霉脂肪酶的方法，其特征在于通过培养权利要求1-3中任一项所述的基因工程菌，经诱导表达获得脂肪酶Pro-RML。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述培养的条件为28℃，初始pH为7，200rpm培养96小时。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述诱导的条件为每24小时补充一次诱导物甲醇，至甲醇终体积浓度为1.0％(v/v)。