CN106699872B - 一种提高胰岛素前体产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高胰岛素前体产量的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过分子生物学手段将人工合成的胰岛素前体通过双酶切和毕赤酵母表达载体pPIC9K相连接，构建重组菌株，通过G418抗性筛选获得高拷贝重组的含胰岛素前体的工程菌P.pastoris GS115‑PI(CL012)，并在该重组菌种共表达SNC2和Sso2基因，通过高密度发酵使得菌株的胰岛素前体产量达到78mg/L，比菌株CL012的产量提高47％。

Description

一种提高胰岛素前体产量的方法
技术领域
本发明涉及一种提高胰岛素前体产量的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
近年来，随着世界各国社会经济的发展和居民生活水平的提高，糖尿病的发病率及患病率逐年升高，成为威胁人民健康的重大社会问题。胰岛素类药物是治疗糖尿病的特效必需药，但是有限的生产和巨大的需求之间的矛盾，迫切需要我们尽快找到有效策略，提高胰岛素的产量。
目前人们更多地采用大肠杆菌和酵母表达系统发酵生产重组人胰岛素前体，然后加工成有活性的重组人胰岛素。如：礼来公司利用大肠杆菌，采用16步发酵技术生产重组人胰岛素；诺和诺德公司，使用的是酿酒酵母生产中效胰岛素。大肠杆菌和酿酒酵母作为生产人胰岛素的表达系统存在着一些问题如大肠杆菌表达系统存在的问题：(1)由于大肠杆菌会产生较多自身蛋白酶，特别容易降解人胰岛素前体类似的小蛋白；(2)过表达产物会以包涵体形式在细胞质中产生，需要复杂的变性、复性加工过程，才能转变成有活性的胰岛素，增加后来处理的难度和复杂程度。酿酒酵母表达系统存在的问题：(1)酿酒酵母表达载体传代不稳定；(2)分泌表达的产物常常过度糖基化，且糖蛋白的核心寡聚糖链含α-1,3聚糖连接头，会增加产物的抗原性，不利于治疗。(3)酿酒酵母大规模发酵过程中会产生乙醇，很难进行高密度发酵培养。由于毕赤酵母表达外源蛋白时具有以下优点：(1)表达载体能在基因组特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合；(2)毕赤酵母具有目前最强，调控最严格启动子之一的AOX1；(3)对表达的蛋白进行翻译后加工和修饰，不会出现过度糖基化的现象；(4)可以利用简单的基础盐培养基进行高密度发酵，利于工业上的扩大生产。
毕赤酵母(Pichia pastoris)由于具有表达异源蛋白的较多优点，有望实现人胰岛素前体的高效表达。然而，由于毕赤酵母表达异源蛋白的过程中，有许多限速步骤限制异源蛋白的分泌。因此，一种调控限速过程，提高毕赤酵母中异源表达胰岛素前体(PI)的分泌能力的方法对于提高胰岛素产量具有重要意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种胰岛素前体，其氨基酸序列如SEQ ID NO,2所示。
本发明的第二个目的是提供编码所述胰岛素前体的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第三个目的是提供一种产胰岛素前体的重组菌，是以毕赤酵母为宿主，以pPIC9K为载体，表达SEQ ID NO.1所示基因。
在本发明的一种实施方式中，还表达SNC2基因或Sso2基因。
在本发明的一种实施方式中，所述SNC2基因序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述SNC2基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述Sso2基因序列如SEQ ID NO.5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述Sso2基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。
本发明的第四个目的是提供一种生产胰岛素前体重组菌的构建方法，所述方法是以pPIC9K为载体，将SEQ ID NO.1所示的编码胰岛素前体的基因与载体连接，在毕赤酵母中重组表达。
在本发明的一种实施方式中，所述载体为pPIC9K，所述毕赤酵母为P.pastorisGS115。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌还表达SEQ ID NO.3所示的SNC2基因。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌还表达SEQ ID NO.5所示的Sso2基因。
在本发明的一种实施方式中，所述SNC2基因以pPICZα为载体进行表达。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：(1)以pPIC9K为载体，将SEQ ID NO.1所示基因与载体连接，在毕赤酵母P.pastoris GS115中进行表达；(2)以pPICZα为载体，将SEQ ID NO.3所示基因与载体连接，在步骤(1)的毕赤酵母中重组表达SEQID NO.3所示SNC2基因。
在本发明的一种实施方式中，所述Sso2基因以pPICZα为载体进行表达。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：(1)以pPIC9K为载体，将SEQ ID NO.1所示基因与载体连接，在毕赤酵母P.pastoris GS115中进行表达；(2)以pPICZα为载体，将来源于面包酵母的编码Sso2的基因与所述载体连接，在毕赤酵母中重组表达。
本发明的第五个目的是提供应用所述重组菌生产胰岛素前体的方法，所述方法是将所述重组菌培养至OD600＝2.0-6.0，加入甲醇诱导胰岛素前体的表达。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述重组菌培养至OD600为2.0-6.0，加入终浓度为1mL/L的甲醇后，在30℃下进行诱导24-96h。
在本发明的一种实施方式中，所述菌株生长培养条件是：pH 5.5，温度为30℃，培养时间24h。
在本发明的一种实施方式中，所述菌株诱导条件是：pH 5.5，温度为30℃，诱导时间96h。
在本发明的一种实施方式中，所述菌株生长及诱导都在摇床中进行，摇床转速为200～250r/min。
在本发明的一种实施方式中，所述菌株使用的诱导剂是浓度为1mL/L的甲醇。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是进行高密度发酵，以提高胰岛素前体产量的方法，所述方法是将所述重组菌的菌液接种于YPD培养基，200～250r/min，30℃培养20-24h；然后以按体积10％的接种量转接到装液量30～60％的发酵罐中进行发酵，控制pH为5.2～5.8，当甘油耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加甘油(控制溶氧大于10％)，，以16～20mL/(L·h)的速率流加甘油，4-6h后停止，待甘油再次耗尽并饥饿菌体1.5～3h后，开始流加甲醇，并通过调节其流速维持培养基中的甲醇浓度在2g/L。
在本发明的一种实施方式中，甘油流加速度为18.15mL/(L·h)，4-6h后流加停止，待甘油再次耗尽并饥饿菌体2h后，开始流加甲醇，并通过调节其流速维持培养基中的甲醇浓度在2g/L。
在本发明的一种实施方式中，用浓度为30％的氨水控制pH为5.5。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌株的种子培养条件是：温度30℃，转速200r/min，培养时间是24h。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌株的甘油生长阶段的培养条件是：pH5.5，温度30℃，转速400-600r/min，培养时间是18-24h。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌株的甘油流加阶段的培养条件是：pH5.5，温度30℃，转速700r/min，培养时间是4-6h。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌株的甲醇诱导阶段的培养条件是：pH5.5，温度25℃，转速800r/min，培养时间是96h。
本发明还提供所述重组菌在食品、医药、化工领域中制备含胰岛素前体的产品中的应用。
有益效果：
1、本发明是使用人工合成的胰岛素前体基因构建重组菌株，将来源于面包酵母的SNC2和Sso2基因共表达于含胰岛素前体基因的重组菌株，通过SNC2和Sso2基因所表达的蛋白具有将异源蛋白从高尔基体运输到质膜的作用，来提高毕赤酵母中胰岛素前体从高尔基体到质膜的运输，增加胰岛素前体的表达，为工业化应用奠定基础。
2、利用高密度发酵使胰岛素前体的产量达到53mg/L，含SNC2的重组菌株CL0121的产量达到78mg/L，比出发菌株CL001的产量提高47％；含Sso2的重组菌株CL0122的产量达到64mg/L，比出发菌株CL001的产量提高21％。
附图说明
图1为蛋白表达的SDS-PAGE电泳图；M：marker；1：未导入表达质粒的菌株；2：诱导96h的菌株CL012；3：诱导96h的菌株CL0122；4：诱导96h的菌株CL0121；
图2为蛋白表达的SDS-PAGE电泳图；M：marker；1：未导入表达质粒的菌株；2：诱导96h的菌株CL001；3：诱导96h的菌株CL002；4：诱导96h的菌株CL003；5：诱导96h的菌株CL006；6：诱导96h的菌株CL007；7：诱导96h的菌株CL012；
图3为摇瓶水平检测拷贝数对胰岛素前体产量的影响；
图4为摇瓶水平检测SNAREs对胰岛素前体产量的影响；
图5为高密度发酵水平检测SNAREs对胰岛素前体产量的影响。
具体实施方式
MD培养基(g/L)：葡萄糖20,YNB 13.4,生物素4×10-4
YPD培养基(g/L)：胰蛋白胨20,酵母粉10,葡萄糖20
BMMY培养基(g/L)：酵母粉10,胰蛋白胨20,硫酸铵10,YNB13.4,1moL/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH6.0)100mL/L，生物素4×10-4
BMGY培养基(g/L)：酵母粉10,胰蛋白胨20,甘油20,硫酸铵10,YNB13.4,1moL/LKH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH6.0)100mL/L，生物素4×10-4
分批发酵培养基(每L)：85％磷酸26.7mL，硫酸钙0.93g，硫酸钾18.2g，七水硫酸镁14.9g，氢氧化钾4.13g，甘油40.0g；
PMT1微量元素液(/每L)：五水硫酸铜6.0g，碘化钠0.08g，一水硫酸锰3.0g，二水钼酸钠0.2g，硼酸0.02g，氯化钴0.5g，氯化锌20.0g，七水硫酸亚铁65.0g，生物素0.2g，硫酸5.0mL；
补料生长培养基：50％(w/v)甘油(含12mL/LPTM1)；
发酵诱导培养基：100％甲醇(含12mL/LPTM1)。
待测样品预处理：发酵液于12000r/min离心10min，保留上清液，取10μL进行Tricine-SDS-PAGE。
待测样品预处理：发酵液于12000r/min离心10min，保留上清液，取上清用0.45μm的微孔滤膜过滤后，利用高效液相色谱法测定胰岛素前体的含量。
胰岛素前体含量的测定：采用高效液相色谱法，液相：Dionex UltiMate 3000system；色谱柱：Vydac Grace C18(4.6×250mm)；流动相：A为0.1％TFA水，B为0.1％TFA乙腈；用0.45μm滤膜过滤；柱温：30℃；检测波长：214nm；进样量：20μL；流速：1mL/min；采用梯度洗脱进行分析，梯度为20-35％B(0-30min)，35-70％B(30-50min)，70-20％B(35-36min)，20-20％B(36-46min)。
实施例1：含胰岛素前体(PI)基因工程菌的构建
(1)将合成的PI和毕赤酵母表达载体pPIC9K分别使用EcoRI和NotI双酶切，37℃酶切2h；
(2)将双酶切后的PI片段和pPIC9K片段分别胶回收，将胶回收后的PI和pPIC9K相连，16℃连接过夜；
(3)将过夜连接产物转化JM109感受态，加入1mL液体LB培养基后，37℃，200rpm孵育2h，然后涂布氨苄抗性平板，37℃培养箱倒置培养8h；
(4)将上一步中长出的单菌落重新划线于氨苄平板，37℃培养箱倒置培养8h，进行菌落PCR验证；
(5)挑取菌落PCR验证正确的菌株于25mL/250mL的含有氨苄的液体LB培养基中，37℃，200r/min过夜培养；
(6)将过夜培养的菌株提取质粒后使用BglII单酶切，37℃酶切2h后胶回收；
(7)将胶回收后的产物转化毕赤酵母GS115感受态，电击后加入1mol/L的山梨醇静置孵育1h，取200μL液体涂布于MD固体培养基平板，30℃培养箱倒置培养2天；
(8)从MD平板上挑取单菌落接种于50mL/500mL含有液体YPD的三角瓶中，30℃,200r/min培养至对数期，根据天根酵母基因组提取试剂盒说明书提取酵母基因组；
(9)以酵母基因组为模板，5’AOX1和3’AOX1为引物，检测PCR扩增出的条带大小，选取目的基因导入酵母基因组的重组菌株，即为表达胰岛素前体基因工程菌P.pastorisGS115-PI，命名为CL001。
实施例2：含不同拷贝数胰岛素前体基因重组菌株的构建
(1)将验证正确的重组菌株CL001，挑取单菌落于25mL/250mL的液体YPD培养基中，30℃，200r/min培养20h，将0.5mL上述菌液转接到25mL YPD液体培养基中，30℃，200r/min培养8h(大约OD600＝1.3-1.5)，制备毕赤酵母(CL001)感受态；
(2)将含有表达载体pPIC9K-PI的菌株接种于25mL/250mL的含有氨苄的液体LB培养基，37℃，200r/min过夜培养,将过夜培养的菌株提取质粒后使用SacI单酶切，37℃酶切2h后使用PCR产物纯化柱进行柱回收；
(3)将SacI酶切后的质粒pPIC9K-PI转化的毕赤酵母(CL001)感受态，电击后加入1mL、1mol/L的山梨醇静置孵育1h，取200μL液体涂布于含不同浓度的G418+YPD固体培养基平板，30℃培养箱倒置培养2-5天，G418浓度梯度为1.0、1.5、2.0、3.0和4.0mg/mL；
(4)将1.0、1.5、2.0、3.0和4.0mg/mL G418平板上长出的单菌落划线此浓度平板后进行菌落PCR验证；
(5)提取X-33菌株基因组，从X-33基因组中扩增出GAP基因片段，将扩增出的GAP片段连接T载，送测序；
(6)挑选测序正确的GAP-T菌株，接种于25mL/250mL的含氨苄抗生素的LB培养基中，37℃，220r/min过夜培养后提取质粒；
(7)将上步中提取的质粒按照公式将其做梯度稀释，公式如下：
按照此公式计算出提取的质粒的初始拷贝数，然后做10倍的系列梯度稀释，取1×103-1×109拷贝数的质粒作为模板进行荧光定量PCR，制作内参标准曲线；
(8)同上一步，提取表达载体pPIC9K-PI质粒，将其做10倍系列梯度稀释，取1×103-1×109拷贝数的质粒作为模板进行荧光定量PCR，制作目的基因的内参标准曲线；
(9)提取从1.0、1.5、2.0、3.0、4.0mg/mL G418浓度平板上筛选出的菌株的基因组；
(10)使用SYBR Green I染料定量PCR方法，以20μL的体系进行反应，20μL的体系包括：10μL 2×SYBR Premix Ex Taq，1μL 10moL/L正向和反向引物，2μL质粒(制作标准曲线)或待测重组毕赤酵母基因组为模板，6μL的水；反应条件：95℃，2min，40个循环(95℃ 5s，55℃ 30s，72℃ 30s)，荧光信号在每个循环结束时采集，扩增后，融解曲线按仪器默认程序进行，即65℃-95℃，0.5℃/s，融解曲线用来检测是否有非特异性扩增；所使用的荧光定量PCR引物如表1所示；
(11)1.0、1.5、2.0、3.0、4.0mg/mL G418浓度平板上筛选出的菌株的的拷贝数分别为2、3、6、7、12，分别命名为CL002、CL003、CL006、CL007、CL012。
表1实施例2所使用的引物
实施例3：含有SNAREs重组菌株的构建
(1)提取面包酵母基因组，接种面包酵母单菌落于50mL/500mLYPD三角瓶中，30℃培养至对数期，按照天根酵母基因组提取试剂盒进行基因组的提取；
(2)以酵母基因组为模板，扩增出SNAREs中的组分SNC2和Sso2；
(3)将扩增出的目的片段经过琼脂糖凝胶电泳验证正确后，连接pMD19-T载，16℃连接过夜；
(4)将连接产物转化JM109感受态，加入1mL液体LB培养基后，37℃，200r/min孵育2h，然后涂于氨苄抗性平板，37℃培养箱倒置培养8h；
(5)将长出的单菌落重新划线于氨苄抗性平板，37℃培养箱倒置培养8h后进行菌落PCR验证；
(6)将验证正确的菌株送测序；
(7)将测序正确的菌株接种于25mL/250mL的LB液体培养基中，37℃，200r/min培养8h，根据质粒提取试剂盒提取质粒；
(8)将表达载体pPICZα和连接T载的pMD19-T-SNC2、pMD19-T-Sso2使用酶AsuII和XbaI于37℃分别双酶切2h后进行胶回收，使用T4连接酶将胶回收后的目的基因SNC2、Sso2分别和表达载体pPICZα于16℃过夜连接；
(9)将上步的连接液转化JM109感受态，加入1mL液体LB培养基后，37℃，200r/min孵育2h，然后涂于氨苄抗性平板，37℃培养箱倒置培养8h；
(10)将长出的单菌落进行菌落PCR验证；
(11)将验证正确的菌株进行质粒的提取，提取的质粒双酶切验证正确后用酶SacI线性化后转化CL012感受态，电击后加入1mL、1mol/L的山梨醇静置孵育1h，取200μL液体涂布于含博莱霉素Zeocin的YPD固体培养基平板，30℃培养箱倒置培养2-5天，将长出的单菌落提取基因组后使用引物5’AOX1和3’AOX1进行验证，将验证正确的菌株P.pastorisGS115-PI-SNC2和P.pastoris GS115-PI-Sso2命名为CL0121和CL0122。所使用的引物如表2所示：
表2实施例3所使用的引物
实施例4：基因工程菌的诱导表达
(1)将选定的重组毕赤酵母CL012、CL0121和CL0122单菌落接种于50mL生长培养基BMGY/500mL三角瓶中，30℃，200r/min培养20h，未导入表达载体的菌株作为对照；
(2)将上述BMGY生长培养基中的菌液，室温静置1h，弃掉上清液，用30mLBMMY培养基重新悬浮菌体，加入100％甲醇至终浓度为1％(v/v)，30℃，200r/min培养，每隔24h补加100％甲醇至终浓度为1％(v/v)进行诱导；
(3)甲醇诱导96h后，12000r/min离心5min，保留上清液，进行Tricine-SDS-PAGE蛋白凝胶电泳，电泳分析结果如图1所示，三条带中最上面的一条带为目的条带，大小为6.7kDa，与理论值相符合，下面的两条带为目的蛋白降解的条带；
(4)取离心后的上清用0.45μm的微孔滤膜过滤后，利用高效液相进行分析，分析结果如图4所示，菌株CL012、CL0121和CL0122的摇瓶产量分别为1.53mg/L、1.89mg/L和1.64mg/L。
(5)菌株CL002、CL003、CL006、CL007、CL012也以上述同样的方法进行甲醇诱导表达，电泳分析结果如图2所示，其中菌株CL012的条带最亮。高效液相结果如图3所示，CL002、CL003、CL006、CL007、CL012的摇瓶产量分别为0.78mg/L、0.8mg/L、1.25mg/L、1.34mg/L、1.53mg/L。其中菌株CL012的产量最高。
实施例5：基因工程菌的高密度发酵
(1)接1mL重组毕赤酵母CL012、CL0121和CL0122甘油管菌液于100mLYPD/500mL三角瓶中，200r/min，30℃培养24h；然后以10％接种量接入到2L分批发酵培养基/5L罐中进行发酵，用30％的氨水维持pH 5.5，当甘油耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加甘油(控制溶氧大于10％)，4-6h后停止，待甘油再次耗尽并饥饿菌体2h后，开始流加甲醇，并通过调节其流速维持培养基中的甲醇浓度在2g/L。甲醇诱导开始后每12h取样一次并检测其OD600；
(2)发酵液于12000r/min离心10min，保留上清液，将上清进行Tricine-SDS-PAGE，然后取上清用0.45μm的微孔滤膜过滤后，利用液相进行分析。结果如图5所示，利用高密度发酵使胰岛素前体的产量达到53mg/L，含SNC2的重组菌株CL0121的产量达到78mg/L，比出发菌株CL001的产量提高47％；含Sso2的重组菌株CL0122的产量达到64mg/L，比出发菌株CL001的产量提高21％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种提高胰岛素前体产量的方法
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Glu Glu Gly Glu Pro Lys Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His
1 5 10 15
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
20 25 30
Thr Asp Lys Glu Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile
35 40 45
Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
50 55
<210> 2
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaagaaggtg aaccaaagtt cgtcaagcag cacttgtgtg gttcccattt ggttgaggct 60
ctgtacttgg tctgtggaga aagaggtttc ttttacaccg ataaggaaaa aagaggtatc 120
gttgagcaat gttgcacctc tatttgttcc ctgtatcagt tggaaaacta ctgcggttaa 180
<210> 3
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgtcgtcat cagtgccata cgatccatat gtgcctccag aggagagtaa ctcaggcgca 60
aacccaaatt cccaaaacaa gactgctgct ttgagacaag agattgatga cacggtggga 120
ataatgagag ataatatcaa caaggttgct gaacgtggtg aaaggctaac atccattgag 180
gacaaagctg ataacttggc tatctccgca caaggattca agagaggcgc caacagggtc 240
agaaagcaaa tgtggtggaa agatctaaaa atgagaatgt gtttattctt agttgttatt 300
attttactag tggtaattat cgttcctatc gtcgtccatt tcagctaa 348
<210> 4
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Ser Ser Ser Val Pro Tyr Asp Pro Tyr Val Pro Pro Glu Glu Ser
1 5 10 15
Asn Ser Gly Ala Asn Pro Asn Ser Gln Asn Lys Thr Ala Ala Leu Arg
20 25 30
Gln Glu Ile Asp Asp Thr Val Gly Ile Met Arg Asp Asn Ile Asn Lys
35 40 45
Val Ala Glu Arg Gly Glu Arg Leu Thr Ser Ile Glu Asp Lys Ala Asp
50 55 60
Asn Leu Ala Ile Ser Ala Gln Gly Phe Lys Arg Gly Ala Asn Arg Val
65 70 75 80
Arg Lys Gln Met Trp Trp Lys Asp Leu Lys Met Arg Met Cys Leu Phe
85 90 95
Leu Val Val Ile Ile Leu Leu Val Val Ile Ile Val Pro Ile Val Val
100 105 110
His Phe Ser
115
<210> 5
<211> 888
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgagcaacg ctaatcctta tgagaataac aatccgtacg ctgaaaacta tgaaatgcaa 60
gaggacttga acaatgctcc tactggtcac tcagatggta gcgacgattt cgtagctttt 120
atgaacaaga tcaactcaat aaatgctaac ttgtccaggt acgaaaacat tatcaaccaa 180
attgatgcgc aacacaaaga cctacttact caagtgagtg aggaacagga gatggaattg 240
agacgttctt tggacgatta catctctcag gccacagatt tgcagtatca attgaaagcg 300
gatatcaaag atgcccagag agacggattg cacgactcta ataaacaggc acaagctgaa 360
aattgcagac agaaattctt aaaattaatt caagactaca gaattatcga ttctaactac 420
aaagaagaaa gcaaagagca ggcgaagaga cagtacacaa ttatccaacc ggaagccact 480
gacgaagaag tggaagccgc catcaacgat gtcaatggcc agcagatctt ttcccaagcg 540
ttgctaaacg ccaatagacg tggtgaggcc aagacagcat tggccgaagt acaggctaga 600
catcaagagt tgttgaagtt ggaaaaaaca atggctgaac ttacccaatt gttcaatgac 660
atggaagagt tggtcatcga acaacaagaa aatgtggatg tcattgacaa aaacgtcgaa 720
gacgctcagc aagatgtaga gcaaggtgtg ggtcacacca acaaggccgt taagagtgcc 780
agaaaagcaa gaaaaaacaa aataagatgt ttgatcatct gctttattat ctttgctatt 840
gttgttgtcg ttgtggttgt tccatccgtt gtggaaacaa gaaagtaa 888
<210> 6
<211> 295
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Met Ser Asn Ala Asn Pro Tyr Glu Asn Asn Asn Pro Tyr Ala Glu Asn
1 5 10 15
Tyr Glu Met Gln Glu Asp Leu Asn Asn Ala Pro Thr Gly His Ser Asp
20 25 30
Gly Ser Asp Asp Phe Val Ala Phe Met Asn Lys Ile Asn Ser Ile Asn
35 40 45
Ala Asn Leu Ser Arg Tyr Glu Asn Ile Ile Asn Gln Ile Asp Ala Gln
50 55 60
His Lys Asp Leu Leu Thr Gln Val Ser Glu Glu Gln Glu Met Glu Leu
65 70 75 80
Arg Arg Ser Leu Asp Asp Tyr Ile Ser Gln Ala Thr Asp Leu Gln Tyr
85 90 95
Gln Leu Lys Ala Asp Ile Lys Asp Ala Gln Arg Asp Gly Leu His Asp
100 105 110
Ser Asn Lys Gln Ala Gln Ala Glu Asn Cys Arg Gln Lys Phe Leu Lys
115 120 125
Leu Ile Gln Asp Tyr Arg Ile Ile Asp Ser Asn Tyr Lys Glu Glu Ser
130 135 140
Lys Glu Gln Ala Lys Arg Gln Tyr Thr Ile Ile Gln Pro Glu Ala Thr
145 150 155 160
Asp Glu Glu Val Glu Ala Ala Ile Asn Asp Val Asn Gly Gln Gln Ile
165 170 175
Phe Ser Gln Ala Leu Leu Asn Ala Asn Arg Arg Gly Glu Ala Lys Thr
180 185 190
Ala Leu Ala Glu Val Gln Ala Arg His Gln Glu Leu Leu Lys Leu Glu
195 200 205
Lys Thr Met Ala Glu Leu Thr Gln Leu Phe Asn Asp Met Glu Glu Leu
210 215 220
Val Ile Glu Gln Gln Glu Asn Val Asp Val Ile Asp Lys Asn Val Glu
225 230 235 240
Asp Ala Gln Gln Asp Val Glu Gln Gly Val Gly His Thr Asn Lys Ala
245 250 255
Val Lys Ser Ala Arg Lys Ala Arg Lys Asn Lys Ile Arg Cys Leu Ile
260 265 270
Ile Cys Phe Ile Ile Phe Ala Ile Val Val Val Val Val Val Val Pro
275 280 285
Ser Val Val Glu Thr Arg Lys
290 295
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
agccgaagca gttattggtt ac 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
acaacagacc gttattagtg ga 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atgaccgcca ctcaaaagac 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gcaccagtgg aagatggaat 20
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gggttcgaaa cgatgtcgtc atcagtgcca tac 33
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gctctagatt agctgaaatg gacgacgata g 31
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gggttcgaaa cgatgagcaa cgctaatcct tatg 34
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gctctagatt actttcttgt ttccacaac 29
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
atgagatttc cttctatttt cactg 25
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ttagttgcag tagttttcca actg 24
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gcaaatggca ttctgacatc c 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gactggttcc aattgacaag c 21

Claims (7)

1.一种胰岛素前体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述胰岛素前体的基因。
3.一种产胰岛素前体的重组菌，其特征在于，以毕赤酵母为宿主，以pPIC9K为载体，表达SEQ ID NO.1所示基因；还表达SNC2基因或Sso2基因；所述SNC2基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；所述Sso2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.一种生产胰岛素前体的重组菌的构建方法，其特征在于，以pPIC9K为载体，在毕赤酵母中表达SEQ ID NO.1所示的编码胰岛素前体的基因；还以pPICZα为载体，表达SEQ IDNO.3所示的SNC2基因或SEQ ID NO.5所示的Sso2基因。
5.一种生产胰岛素前体的方法，其特征在于，所述方法是将权利要求3所述的重组菌培养至OD600＝2.0-6.0，加入甲醇诱导胰岛素前体的表达。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将所述的重组菌以按体积10％的接种量接种至发酵培养基中，控制pH为5.2～5.8，当甘油耗尽时，以16～20mL/(L·h)的速率流加甘油，4-6h后停止，待甘油再次耗尽并饥饿菌体1.5～3h后，开始流加甲醇，并维持培养基中的甲醇浓度在1.8～2.2g/L。
7.权利要求3所述重组菌在食品、化工、医药领域制备含胰岛素的产品中的应用。
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GenBank登录号：NP_014972.3;GenBank;《GenBank》;20161028;全文 *
Membrane fusion: SNAREs and regulation;J. Malsam等;《Cellular and Molecular Life Sciences》;20081018;第2814页左栏第1段、第2814页右栏第1段 *
一种增加重组毕赤酵母拷贝数提高胰岛素前体产量的策略;龚香艺等;《微生物学报》;20130604;第53卷(第6期);第546页右栏第1段 *

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