CN104152484B - 一种提高毕赤酵母分泌型外源蛋白表达量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供一种能提高毕赤酵母分泌型外源蛋白表达量的方法。通过将HAC1、ERO1双基因或HAC1、ERO1、BIP三基因在毕赤酵母胞内共表达，有效提高毕赤酵母分泌型外源蛋白的表达量。本发明将HAC1、ERO1双基因或HAC1、ERO1、BIP三基因转化入分泌表达外源木聚糖酶的巴斯德毕赤酵母中获得重组毕赤酵母菌株，进而显著提高了外源木聚糖酶的表达量。当毕赤酵母胞内共表达HAC1、ERO1双基因时，外源木聚糖酶的分泌表达量比初始水平普遍提高了15％‑25％；而当共表达HAC1、ERO1、BIP三基因时，木聚糖酶的分泌表达量比初始水平提高了45％‑57％。

Description

一种提高毕赤酵母分泌型外源蛋白表达量的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种提高毕赤酵母分泌型外源蛋白表达量的方法。

技术背景

毕赤酵母作为目前广泛用于表达外源蛋白的重要宿主，拥有诸多优点：培养方式简便、菌株遗传稳定、蛋白表达量高、表达蛋白能够经过正确折叠和翻译后修饰。然而随着大量不同外源蛋白在毕赤酵母中的表达，发现毕赤酵母对不同外源蛋白的表达量差异较大。已有的研究主要关注于外源蛋白的分泌表达与基因拷贝数、信使RNA含量等因素之间的关系，然而最近的研究发现，外源蛋白的分泌表达量低往往是其在内质网中的聚集造成的。通过采用不同启动子或增加基因拷贝数的策略来增强毕赤酵母表达外源蛋白，相当含量的外源蛋白仍然滞留在胞内而未被分泌表达。

内质网是将分泌表达蛋白折叠成天然构象，并对不正确折叠构象蛋白进行严格筛选的主要场所。内质网驻留蛋白包括3类：折叠酶、分子伴侣和凝集素伴侣。表达分泌性外源蛋白常常使细胞内积累大量未正确折叠的蛋白，大量未折叠蛋白在内质网的滞留会对内质网造成胁迫。作为一种自我防御机制，受到未折叠蛋白胁迫的细胞会产生未折叠蛋白响应(URP)。因此，如何通过激活URP来增强细胞分泌表达外源蛋白的能力，是近些年本领域的研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种能提高毕赤酵母分泌型外源蛋白表达量的方法。通过将HAC1、ERO1双基因或HAC1、ERO1、BIP三基因在毕赤酵母胞内共表达，有效提高毕赤酵母分泌型外源蛋白的表达量，从而弥补现有技术的不足。

本发明的提高毕赤酵母分泌型外源蛋白表达量的方法；是通过增加HAC1、ERO1基因在毕赤酵母胞内的表达量来提高的；

更进一步的，在毕赤酵母胞内还可以同时增加BIP基因的表达量；

作为实施例的优选，上述增加HAC1、ERO1基因在毕赤酵母胞内的表达量，是通过将共表达HAC1、ERO1双基因的重组质粒转化/转染入毕赤酵母中实现的；

作为实施例的优选，增加HAC1、ERO1、BIP基因在毕赤酵母胞内的表达量，是将共表达HAC1、ERO1、BIP三基因的重组质粒转化/转染入毕赤酵母中来实现的；

其中共表达HAC1、ERO1双基因的重组质粒、共表达HAC1、ERO1、BIP三基因的重组质粒的制备方法如下：

1)对质粒pGAPZαA进行改造，去掉信号肽，构建新的质粒pGAPZA；

2)在质粒pGAPZA的基础上，将酶切位点AvrII突变掉，构建新的质粒pGAPZB；

3)将HAC1基因片段连接pGAPZA质粒，构建得到重组质粒pGAPZA-HAC1；

ERO1基因片段连接pGAPZB质粒，构建得到重组质粒pGAPZB-ERO1；

BIP基因片段连接pGAPZB质粒，构建得到重组质粒pGAPZB-BIP；

4)将pGAPZB-ERO1质粒和pGAPZA-HAC1质粒分别进行酶切，连接，构建得到共表达HAC1、ERO1两个基因的重组质粒pGAPHE；

5)将pGAPZB-BIP质粒和pGAPHE质粒分别进行酶切，连接，构建得到共表达HAC1、ERO1、BIP三个基因的重组质粒pGAPHEB。

其中上述HAC1基因的核苷酸序列优选为SEQ ID NO:1。

上述ERO1基因的核苷酸序列优选为SEQ ID NO:2。

上述BIP基因的核苷酸序列优选为SEQ ID NO:3。

本发明另一方面还提供了一种重组毕赤酵母菌株，为转化/转染了共表达HAC1、ERO1双基因的重组质粒和/或共表达HAC1、ERO1、BIP三基因的重组质粒的毕赤酵母。

本发明将构建得到的共表达质粒pGAPHE、pGAPHEB分别转化入分泌表达外源木聚糖酶的巴斯德毕赤酵母中获得重组毕赤酵母菌株。重组毕赤酵母菌株能在胞内共表达HAC1、ERO1基因或HAC1、ERO1、BIP基因，进而显著提高了外源木聚糖酶的表达量。当共表达HAC1、ERO1基因时，木聚糖酶的分泌表达量比初始水平普遍提高了15％-25％；而当共表达HAC1、ERO1、BIP时，木聚糖酶的分泌表达量比初始水平提高了45％-57％。本发明提供的方法能有效提高外源蛋白在内质网中的正确折叠，进而提高毕赤酵母分泌型外源蛋白的表达量，有利于促进毕赤酵母作为酶制剂生产菌株的广泛应用。

附图说明

图1：pGAPZαA质粒图谱。

图2：pGAPZA、pGAPZB质粒图谱。

图3：pGAPZA-HAC1、pGAPZB-ERO1、pGAPZB-BIP质粒图谱。

图4：pGAPHE、pGAPHEB质粒图谱。

具体实施方式

为了有效提高外源蛋白在内质网中的正确折叠，进而提高外源蛋白的表达量，申请人对调控因子HAC1、折叠酶PDI、ERO1、分子伴侣BIP、KAR2、SEC63等进行了大量的筛选和组合，通过在毕赤酵母中表达来验证其效果，结果发现HAC1和PDI、ERO1和SEC63、PDI和KAR2三种组合在胞内的共表达对外源蛋白表达量的提高均没有效果，但HAC1、ERO1或HAC1、ERO1、BIP的共表达能显著提高毕赤酵母中分泌型外源蛋白的表达量，从而促成了本发明。

下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述

实施例1pGAPZA和pGAPZB质粒构建

质粒pGAPZαA(购于invitrogen公司)(图1)带有α-factor信号肽，适合分泌表达外源蛋白，转化毕赤酵母宿主时先通过AvrII酶切位点用AvrII酶切后进行线性化，线性化的片段能更好的整合到宿主基因组上。调控因子HAC1、ERO1、BIP需要在胞内进行表达，因而需要对质粒pGAPZαA进行改造，去掉信号肽，构建新的质粒pGAPZA(图2)，同时在质粒pGAPZA的基础上，将酶切位点AvrII突变掉，构建新的质粒pGAPZB。

具体的构建过程如下：

采用PCR反应克隆启动子pGAP和终止子AOX1TT的基因片段，然后通过重叠PCR反应将两个片段融合到一起，从而将中间的α-factor信号肽片段去掉。引物和反应条件如下：

引物1(pGAP-F)：GCGCAGATCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGT

引物2(pGAP-R)：GCCGCGGCTCGAGGTACCCGTTTCGAAATAGTTGTT

引物3(TT-F)：AACAACTATTTCGAAACGGGTACCTCGAGCCGCGGC

引物4(TT-R)：TAAAGGATCCGCACAAACGAAGGTCTCACT

反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃保温10min。引物1、引物2扩增获得pGAP片段，大小510bp，引物3、引物4扩增获得AOX1TT片段，大小459bp。以这两个片段为模板，引物1、引物4扩增，获得融合片段，大小933bp。将该片段与载体pGAPZαA通过Bgl II和BamH I位点双酶切后连接，构建新的质粒pGAPZA。

采用PCR反应克隆pGAPZA质粒中片段，将AvrII位点CCTAGG突变为CCTAG，构建新的质粒pGAPZB。引物和反应条件如下：

引物5(AvrII-F)：CGTTACCGTCCCTAGAAATTTTACTCTGCTGGA

引物6(BamHI-R)：TGTGTGGGGGATCCGCACAAACGAAGGTCTCA

反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸45s，30个循环后，72℃保温10min。以质粒pGAPZA为模板，引物5、引物6扩增获得片段，大小770bp。将该片段与载体pGAPZA通过Avr II和BamH I位点双酶切后连接，构建新的质粒pGAPZB。

实施例2HAC1、ERO1、BIP基因扩增

从KEGG数据库中获得HAC1、ERO1、BIP基因的核苷酸序列，分别为SEQID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3。利用下述引物，扩增这三个基因。

引物7(HAC1-F)：ATGCCCGTAGATTCTTCTC

引物8(HAC1-R)：TCACCTGATCGCTATGCAT

引物9(ERO1-F)：ATGAGGATAGTAAGGAGCG

引物10(ERO1-R)：TTACAAGTCTACTCTATAT

引物11(BIP-F)：ATGCTGTCGTTAAAACCAT

引物12(BIP-R)：CTACAACTCATCATGATCA

以毕赤酵母GS115基因组为模板，引物7、引物8扩增获得HAC1基因，大小996bp；引物9、引物10扩增获得ERO1基因，大小1584bp；引物11、引物12扩增获得BIP基因，大小2037bp；将3个片段分别连接T载体后测序，序列与基因库中报道的序列一致。

实施例3pGAPHE、pGAPHEB质粒构建

通过PCR在HAC1、ERO1、BIP基因片段两端分别引入EcoR I、Not I酶切位点，双酶切后HAC1连接pGAPZA质粒，ERO1、BIP连接pGAPZB质粒，分别构建出pGAPZA-HAC1、pGAPZB-ERO1、pGAPZB-BIP质粒(图3)。

将pGAPZB-ERO1质粒用Bgl II、BamH I双酶切后，胶回收含有启动子、目的基因、终止子的表达盒，大小为2486bp。pGAPZA-HAC1质粒用BamH I酶切后，与表达盒连接，转化DH5α菌株，挑取阳性转化子。由于Bgl II与BamHI酶切位点是同尾酶，有相同的粘性末端，在连接的时候会形成正、反向两种质粒，可以通过提取质粒，用Avr II、BamH I双酶切来验证，正向连接的质粒，通过Avr II、BamH I双酶切会得到4195bp、2100bp两个片段；反向连接的质粒，通过Avr II、BamH I双酶切会得到4595bp、1700bp两个片段。将正向连接的正确质粒命名为pGAPHE(图4)，其含有两个表达盒，含有HAC1、ERO1两个基因。

将pGAPZB-BIP质粒用Bgl II、BamH I双酶切后，胶回收含有启动子、目的基因、终止子的表达盒，大小为2939bp。上述pGAPHE质粒用BamH I酶切后，与该表达盒连接，转化DH5α菌株，挑取阳性转化子。提取质粒，用Avr II、BamH I双酶切来验证，正向连接的质粒，通过Avr II、BamH I双酶切会得到7135bp、2100bp两个片段；反向连接的质粒，通过Avr II、BamHI双酶切会得到4195bp、5040bp两个片段。将正向连接的正确质粒命名为pGAPHEB(图4)，其含有三个表达盒，同时含有HAC1、ERO1、BIP三个基因。

实施例4转化巴斯德毕赤酵母

将从烟曲霉(Aspergillus fumigatus)筛选的木聚糖酶基因转化入毕赤酵母(Pichia pastoris)中，构建得到巴斯德毕赤酵母H43(Pichia pastoris H43)。该菌株能高效表达木聚糖酶，且生产的木聚糖酶在酸性条件下具有较高的活性，同时具有很强的耐热性和胃蛋白酶、胰蛋白酶耐受性。

上述巴斯德毕赤酵母H43已于2013年6月6日，保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M2013252。具体的构建过程记载于2013年6月8日申请的中国专利(申请号：2013102292527，专利名称：一种木聚糖酶重组表达工程菌)中。

将实施例3构建得到的pGAPHE质粒用Avr II进行线性化，质粒线性化片段通过电穿孔法转化巴斯德毕赤酵母H43，在含有100μg/ml Zeocin的YPD平板上进行筛选，得到阳性转化子，统一命名为巴斯德毕赤酵母PHE(Pichiapastoris PHE)。提取PHE酵母的基因组，利用载体的测序通用引物13、14扩增，能得到大小为1000bp、1600bp的两条带，说明HAC1、ERO1基因成功的整合到酵母的基因组中。

引物13：GACTGGTTCCAATTGACAAGC

引物14：GGCAAATGGCATTCTGACATCCT

将实施例3构建得到的pGAPHEB质粒用Avr II进行线性化，质粒线性化片段通过电穿孔法转化巴斯德毕赤酵母H43，在含有100ug/ml Zeocin的YPD平板上进行筛选，得到阳性转化子，统一命名为巴斯德毕赤酵母PHEB(Pichiapastoris PHEB)。提取PHEB酵母的基因组，利用载体的测序通用引物13、14扩增，能得到大小为1000bp、1600bp、2100bp的三条带，说明HAC1、ERO1、BIP基因成功的整合到酵母的基因组中。

实施例5酶活测定与比较

木聚糖酶酶活力检测方法

取2ml浓度为1％的木聚糖底物(pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制)，加入到比色管中，37℃平衡10min，再加入2ml经pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液适当稀释并经37℃平衡好的酸性木聚糖酶酶液，混匀于37℃精确保温反应30min。反应结束后，加入5ml DNS试剂，混匀以终止反应。然后沸水浴煮沸5min，用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25ml，混匀后，以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光值AE。

酶活单位定义：在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中释放1μmol还原糖所需要的酶量即为一个酶活力单位U。

酶活计算公式：

式中：XD为稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/ml；AE为酶反应液的吸光度；AB为酶空白液的吸光度；K为标准曲线的斜率；C0为标准曲线的截距；M为木糖的摩尔质量，150.2g/mol；t为酶解反应时间，min；N为酶液稀释倍数；1000为转化因子，1mmol＝1000μmol。

5.1巴斯德毕赤酵母PHE发酵酶活测定

将pGAPHE质粒转化到巴斯德毕赤酵母H43后，共挑取了41个阳性转化子(分别为巴斯德毕赤酵母PHE-1，PHE-2，直至PHE-41)。

将上述阳性转化子分别转接于BMGY培养基中，30℃250rpm振荡培养1d后，再转入BMM培养基中30℃250rpm振荡培养，每天添加0.5％的甲醇。诱导表达4d后，离心去除菌体，得到含酸性木聚糖酶的粗酶液，按照上述方法分别测定酸性木聚糖酶的活力，并以原宿主巴斯德毕赤酵母H43做为对照组，计算酶活增长率，具体结果下表所示。

从表中的数据可以看出，在相同发酵条件下，本发明构建的巴斯德毕赤酵母PHE(Pichia pastoris PHE)，其发酵液中木聚糖酶的酶活比对照组巴斯德毕赤酵母H43普遍提高了15％-25％，从而说明巴斯德毕赤酵母PHE通过胞内共表达HAC1、ERO1基因能有效提高分泌型外源蛋白的表达量。

5.2巴斯德毕赤酵母PHEB发酵酶活测定

将pGAPHEB转化到巴斯德毕赤酵母H43后，共挑取了29个阳性转化子(分别为巴斯德毕赤酵母PHEB-1，PHEB-2，……，PHEB-29)。

上述阳性转化子分别转接于BMGY培养基中，30℃250rpm振荡培养1d后，再转入BMM培养基中30℃250rpm振荡培养，每天添加0.5％的甲醇。诱导表达4d后，离心去除菌体，得到含酸性木聚糖酶的粗酶液，按照上述方法分别测定酸性木聚糖酶的活力，并以原宿主巴斯德毕赤酵母H43做为对照组，计算酶活增长率，具体结果下表所示。

从表中的数据可以看出，在相同发酵条件下，本发明构建的巴斯德毕赤酵母PHEB(Pichia pastoris PHEB)，其发酵液中木聚糖酶的酶活比对照组巴斯德毕赤酵母H43普遍提高了45％-57％，比巴斯德毕赤酵母PHE也有明显提高，从而说明巴斯德毕赤酵母PHEB通过胞内共表达HAC1、ERO1、BIP基因能显著提高该菌株分泌型外源蛋白的表达量，且HAC1、ERO1、BIP三基因共表达对于提高毕赤酵母分泌型外源蛋白表达量的效果要明显高于HAC1、ERO1双基因共表达的效果。

同时，申请人还利用毕赤酵母分别构建了表达脂肪酶、植酸酶、淀粉酶等外源基因的毕赤酵母重组菌株，按照本发明所述的方法都能明显的提高目的外源基因的表达量，从而表明本发明所述的方法对于不同外源基因都适用，具有通用性。

Claims (7)

1.一种提高毕赤酵母分泌型外源蛋白表达量的方法，其特征在于，所述的方法是通过增加HAC1、ERO1、BIP基因在毕赤酵母胞内的表达量来提高分泌型外源蛋白的表达量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的增加HAC1、ERO1、BIP基因在毕赤酵母胞内的表达量，是将共表达HAC1、ERO1、BIP三基因的重组质粒转化/转染入毕赤酵母中。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的共表达HAC1、ERO1、BIP三基因的重组质粒的制备方法如下：

1)对质粒pGAPZαA进行改造，去掉信号肽，构建新的质粒pGAPZA；

2)在质粒pGAPZA的基础上，将酶切位点AvrII突变掉，构建新的质粒pGAPZB；

3)将HAC1基因片段连接pGAPZA质粒，构建得到重组质粒pGAPZA-HAC1；

ERO1基因片段连接pGAPZB质粒，构建得到重组质粒pGAPZB-ERO1；

BIP基因片段连接pGAPZB质粒，构建得到重组质粒pGAPZB-BIP；

4)将pGAPZB-ERO1质粒和pGAPZA-HAC1质粒分别进行酶切，连接，构建得到共表达HAC1、ERO1两个基因的重组质粒pGAPHE；

5)将pGAPZB-BIP质粒和pGAPHE质粒分别进行酶切，连接，构建得到共表达HAC1、ERO1、BIP三个基因的重组质粒pGAPHEB。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的HAC1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的ERO1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的BIP基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

7.一种重组毕赤酵母菌株，其特征在于，所述的重组毕赤酵母菌株为转化/转染了共表达HAC1、ERO1、BIP三基因的重组质粒的毕赤酵母。