CN101875925B - 一种单双酰脂肪酶、其编码基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一个新的单双酰脂肪酶Mdl₍₉₎以及编码该酶的基因mdl₍₉₎，该酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码该酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。实验表明，单双酰脂肪酶Mdl₍₉₎具有较高的水解单酰甘油酯和二酰甘油酯的活力。本发明还提供其在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的分泌表达载体和高效表达该酶的方法。采用该方法，表达的单双酰脂肪酶能有效地分泌到胞外，不仅降低了分离纯化成本，而且表达效率提高。在摇瓶培养的条件下，以甲醇为诱导物进行诱导培养时，胞外分泌量可达660mg/L，以单硬脂酸甘油酯为底物，酶活达到2700U/ml。本发明为该酶的工业化应用奠定了基础。

Description

一种单双酰脂肪酶、其编码基因及应用

技术领域

本发明涉生物技术领域，具体地涉及一种脂肪酶，编码该脂肪酶的基因以及该酶的应用。本发明还涉及一种异源表达该单双酰脂肪酶的方法。

背景技术

目前，酶法催化化学反应因为其反应条件温和，副产物少而逐渐替代繁琐、昂贵的化学法。

脂肪酶(E C3.1.1.3)是一类具有多种催化能力的酶，因为其可以催化水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应等多种化学反应，而成为一种重要的工业用酶，应用在生产、生活中的很多方面。

脂肪酶的应用主要包括，在面粉行业：是满足于各种面粉改良剂功能需求的首选酶制剂之一；食品增香：通过对原料中的脂肪酸的分解，转化成具有特殊香气的物质，增加产品风味；鱼片加工：用碱性脂肪酶脱去了鱼片中大量的油脂，使鱼片的保鲜、口味及色泽都有显著的提高，彻底解决碱法脱脂影响鱼片质量的难题；在洗衣粉中的应用：在洗衣粉配方中加入适量的碱性脂肪酶，并与碱性蛋白酶配伍成复合酶，不仅可以明显提高洗衣粉的去污力，而且对洗涤织物的保养，抗再污染等方面有显著效果；在皮革脱脂方面：碱性脂肪酶的专一性确保了脱脂后的皮革质量在诸多方面有明显的提高，是生产高档皮革的首选脱脂剂，而且有助于提高皮革的等级率及解决环境污染问题；在造纸行业：克服马尾松磨木浆的树脂障碍、漂白助剂、废纸张浆的油墨脱除、造纸网毯的清洗及纸厂废水处理等方面都有显著功效。目前有越来越多的微生物来源的脂肪酶被开发出来，因为其性质的不同而在不同领域中发挥着重大的作用。

单双酰脂肪酶是脂肪酶的一种，它主要以二酰甘油和单酰甘油为底物，在工业上也有十分广泛的应用，另外由于其在性质上与三酰甘油脂肪酶的互补性，还将它和三酰脂肪酶组合起来使用，可以大大提高三酰甘油的水解及转酯化效率。

目前，已知的单双酰脂肪酶数量极少，酶活普遍不高，限制了其应用。因此寻找新的具有高活性的单双酰脂肪酶，建立其高效表达体系是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种单双酰脂肪酶；

本发明的第二个目的在于提供编码上述单双酰脂肪酶的基因；

本发明的第三个目的在于提供一种可在巴斯德毕赤酵母中分泌表达单双酰脂肪酶的表达载体；

本发明的第四个目的在于提供上述单双酰脂肪酶的用途。

本发明从圆弧青霉(Penicillium cyclopium)菌株中克隆到一个新的单双酰脂肪酶(mono-and diacylglycerol lipase，MDL)基因mdl₍₉₎，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该基因全长为840bp，分析表明，GC含量为56.1％，编码279个氨基酸组成的蛋白。由该基因编码的单双酰脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。该蛋白大小约39kD，活性中心是145位Ser，199位Asp和259位His。实验表明由该基因编码的单双酰脂肪酶具有较高的酶活。通过酶学性质测定，该酶的最适反应温度为45℃，最适反应pH值为6.0，在中性偏碱性条件下稳定。为便于表述，将该单双酰脂肪酶命名为Mdl₍₉₎。

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的单双酰脂肪酶的氨基酸序列(SEQ ID No.2)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第25位的Asp替换为Ala。因此，本发明单双酰脂肪酶还包括SEQ ID No.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与Mdl₍₉₎同等活性的由Mdl₍₉₎衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。

此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。因而，本发明单双酰脂肪酶基因还包括由SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到编码Mdl₍₉₎的核苷酸序列。

可将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进一步将该重组表达载体导入恰当的宿主细胞中，获得表达本发明Mdl₍₉₎的基因工程菌。

在本发明实例中，通过将单双酰脂肪酶基因mdl₍₉₎插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K上构建得到在巴斯德毕赤酵母中的表达载体pPIC9K-mdl₍₉₎，其质粒图谱如附图2所示。进一步，将该表达载体导入到巴斯德毕赤酵母中获得表达Mdl₍₉₎的基因工程菌。

本发明还提供一种制备上述Mdl₍₉₎的方法，其是通过培养上述基因工程菌，经诱导表达获得单双酰脂肪酶Mdl₍₉₎。所述培养条件为28℃，初始pH为7，200rpm培养120-170小时。所述诱导条件为每24小时补充一次诱导物甲醇，至甲醇终浓度为1.0％。采用该方法，摇瓶培养148小时，分泌到胞外的酶量可达660mg/L，以单硬脂酸甘油酯为底物，酶活为2700U/ml。

本发明提供的单双酰脂肪酶，具有较高的酶活性，增加了单双酰脂肪酶的成员。本发明通过构建恰当的表达载体，使所述单双酰脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中分泌表达，表达的单双酰脂肪酶大部分分泌到细胞外，降低了分离纯化成本，而且表达效率较高，在摇瓶培养的条件下，以甲醇诱导培养时，胞外分泌酶量可达660mg/L，以单硬脂酸甘油酯为底物，检测酶活可达2700U/ml。本发明为该酶的工业化应用奠定了基础。

附图说明

图1目的基因DNA酶切回收电泳图，泳道1为DNA标准分子量(kb)：4.5，3.0，2.0，1.2，0.8，0.50.2；泳道2：目的基因DNA酶切回收840bp片段(箭头所指)；

图2表达质粒pPIC9K-mdl₍₉₎构建流程图；

图3表达质粒pPIC9K-mdl₍₉₎的酶切电泳图，其中，泳道1为DNA标准分子量(kb)：4.5，3.0，2.0，1.2，0.8，0.50.2；2为质粒pPIC9K-mdl₍₉₎经SnaBI和Not I双酶切后的结果，箭头所指为目的基因。

图4毕赤酵母GS115-pPIC9K-mdl₍₉₎摇瓶培养细胞密度及胞外酶活检测图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液100ml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。所涉及的酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。引物合成及测序由英骏(Invitrogen)生物公司完成。

实施例1圆弧青霉cDNA的制备

1.1圆弧青霉总RNA的提取

(1)取适量的圆弧青霉菌丝，滤纸吸干水分，液氮研磨，加入1mlTrizol试剂(Invitrogen)，振荡器振荡5min，室温静置1min；

(2)加入0.2ml氯仿，振荡15秒，静置2min；

(3)4℃，12000rpm，15min；

(4)吸取上清，加入等体积异丙醇，-20℃沉淀30min；

(5)4℃，12000rpm，15min；

(6)倒掉上清，用1ml75％乙醇洗涤沉淀，7500rpm，4℃，5min；

(7)重复(6)步骤一次；

(8)倒掉上清，干燥10min；

(9)加入适量的DEPC水溶解，得到总RNA；

1.2圆弧青霉cDNA第一链的制备

反转录采用TIANGEN生物公司的TIANScript cDNA第一链合成试剂盒，具体操作如下：

20μl反应体系可用于1-5μg总RNA，将以下成分加到一个无核酸酶的离心管中：

2μl随机引物(10μM)，

1-5μg总RNA，

2μl(10mM)dNTP混合物(中性pH)，

补灭菌蒸馏水至14μl；

70℃加热5min后迅速在冰上冷却2min。简短离心后收集反应液，加入4μl 5×First-Strand Buffer，1μl 0.1M DTT，0.2μl Rasin(RNase抑制剂)；

加入1μl(200U)TIANScript M-MLV，轻轻混匀，将离心管置于25℃温浴10min；42℃温浴50min；95℃加热5min终止反应，冷冻保存。

实施例2圆弧青霉单双酰脂肪酶基因mdl₍₉₎的引物设计

2.1引物设计

根据GenBank中mdl基因的序列(GenBank登录号为AF288219)，设计合成了以下一对引物：

FW(P1)：5’-GACCGATGTTTCGACCAGCGAACT-3’

REV(P2)：5’-ATTTTTAAACCCTCTTGAATGGCA-3’

P1、P2两端分别设计有SnaBI和NotI酶切位点(见上述序列中斜体并有下划线的部分)

2.2圆弧青霉单双酰脂肪酶基因mdl₍₉₎的PCR扩增

采用P1、P2引物，以圆弧青霉(购自中科院微生物所，编号为3.4515)cDNA为模板，PCR反应体系为：

模板DNA(10μg/μl)          1μl

10×Buffer                  2μl

dNTP(2.5mmol/μl)           0.5μl

primer(P1)(10pmol/μl)      0.8μl

primer(P2)(10pmol/μl)      0.8μl

Taq酶                       0.1μl

ddH₂O                       14.8μl

总体积                      20μl

反应条件为：95℃5min；95℃30s，58℃1min，72℃1min，循环30次；72℃10min。

2.3从PCR反应产物中回收目的片段

从PCR产物中纯化回收目的基因片段采用切胶过柱的方法，PCR反应产物经过琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯的照射下切下目的基因DNA(目的基因长度为840bp(图1)，按照DNA回收试剂盒说明书(购自天根公司，产品编号为DP209-02)的方法进行回收。

2.4TA克隆

将PCR回收产物连接到载体pMD18-T-Simple上(购自TaKaRa公司)，连接反应按照TaKaRa公司所提供的试剂盒(Code No.D104A)说明书操作。

2.5目的基因连接到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K(Invitrogen公司)

用限制性内切酶SnaBI和Not I分别对pMD18-T-mdl₍₉₎和pKIC9K进行双酶切，然后对目的片段进行回收，用T4连接酶将其连接，得到表达质粒pPIC9K-mdl₍₉₎，构建流程图见附图2。

表达质粒pPIC9K-mdl₍₉₎的检测结果见附图3，结果表明外源片段(840bp)和载体(9.3kb)大小均正确。将连接产物转化大肠杆菌DH5α(购自上海生工生物工程有限公司)。

实施例3单双酰脂肪酶基因mdl₍₉₎在巴斯德毕赤酵母GS115中的分泌表达

3.1巴斯德毕赤酵母GS115(Invitrogen公司)电转化感受态细胞的制备及其电击转化

(1)挑取新鲜的单菌落于5mlYPD液体培养基中，于30℃，250rpm培养12-14小时；

(2)以0.1％的接种量接种到含500ml YPD培养基的2升三角瓶中，于30℃，250rpm培养12-14小时，使其OD600＝1.3-1.5；

(3)在4℃下1500rpm离心5分钟，收集细胞；

(4)用500-250ml冰预冷的无菌水洗涤细胞两次；

(5)用20ml冰预冷的1M山梨醇溶液洗涤细胞一次；

(6)用1ml冰预冷的1M山梨醇溶液重悬细胞，至终体积为1.5ml左右，以80μl分装于小离心管；

3.2巴斯德毕赤酵母酵母细胞的电击转化

(1)将准备好的约1μg/μl的线性化质粒pPIC9K-mdl₍₉₎约10μl，与80μl酵母感受态细胞混匀，在冰上放置约5分钟；

(2)把混合了DNA的感受态细胞转入冰预冷的0.2cm的电转杯；在1.5千伏的电压下转化；

(3)然后马上加入1ml冰预冷的1M山梨醇溶液于经转化的细胞中，把细胞混匀，转入1.5ml小离心管；

(4)马上涂布于MD平板(YNB 1.34％，葡萄糖2％，生物素4×10^-5％)，于30℃培养2至3天观察结果。

3.3.巴斯德毕赤酵母高拷贝转化子及单双酰脂肪酶高产菌株的筛选

3.3.1采用G418浓度梯度筛选巴斯德毕赤酵母高拷贝转化子

取2ml无菌水将在MD平板上生长的转化子洗脱并悬浮，轻微的振荡后稀释，以10⁵/ml的细胞浓度分别在含G418浓度为0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0mg/ml的YPD平板(1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂)上涂布，挑选在含3.0mg/ml G418的平板上生长的菌落，作为巴斯德毕赤酵母高拷贝转化子，并做PCR鉴定。

3.3.2酵母菌落PCR法鉴定正确整合的转化子

在平板上选到阳性菌落，以P1、P2为引物，利用酵母菌落PCR的方法进一步验证得到正确整合的转化子。

模板的处理方法：

(1)用无菌的吸头挑取菌落少许，溶解到50μl的D2-Buffer(1L)：异硫

氰酸胍472.64g，1mol/L pH8.0Tris·HCl缓冲液50ml，β-巯基乙醇7ml，混匀；

(2)将混合液于100℃沸水浴5分钟；

(3)12000rpm，离心30秒，弃上清；

(4)用无菌水洗涤沉淀2次；

(5)将沉淀溶于20μl的ddH₂O，95℃作用5分钟；

(6)离心后得到上清液即为模板。

PCR反应体系：

模板                 2μl

P1                   2μl

P2                   2μl

dNTP(2.5mM)          0.5μl

10×Buffer           2μl

Taq酶                0.2μl

ddH₂O                11.3μl

总体积               20μl

反应条件：95℃5分钟；95℃30秒，58℃30秒，72℃2分钟，循环30次；72℃10分钟。

分别挑取10个转化子进行摇瓶诱导培养，发现外源蛋白表达分泌量基本相同，选择其中酶活相对较高的一株进行后续的实验。

3.4.巴斯德毕赤酵母重组单双酰脂肪酶的表达

NaOH滴定法测定单双酰脂肪酶酶活

(1)0.05M NaOH的配置：先用无CO₂水配置5M的NaOH储液；再准确稀释50倍后，称取100℃烘至恒重的邻苯二甲酸氢钾0.38g，溶于80ml无CO₂水中，标定出其准确浓度，再推算出储液浓度；0.05M的NaOH溶液以无CO₂水用储液现用现配；

(2)PVA-单硬脂酸甘油酯乳化液底物的配置：将硬脂酸甘油酯12g，100ml 2％PVA1750(聚乙烯醇)混合，加热溶化，用超声波乳化，功率300W，超声3s，间歇4s，30次，循环2次；

(3)取5ml乳化液底物，4ml 0.1M pH6.0的磷酸钠缓冲液加入到150ml三角瓶中，置于恒温水浴摇床45℃，130rpm温育5min；

(4)取1ml适当稀释的酶液加入到底物和缓冲液中，45℃130rpm反应10min后加入15ml无水乙醇终止反应；

(5)滴加4滴酚酞作指示剂，用0.05M NaOH滴定酶解产生的脂肪酸，至反应液变粉红色停止；

空白操作与上述一致，只是将发酵液与无水乙醇混合反应10min后加入到底物和缓冲液中。

酶活定义为在该测定条件下，1min释放1μmol脂肪酸的酶量为一个酶活单位。

挑取具有高拷贝数巴斯德毕赤酵母阳性转化子单菌落，接种于5mlBMGY培养基(1％酵母粉，2％蛋白胨，1％甘油)，于28℃，200rpm摇床培养至OD600为6.0左右，离心收集菌体，转接到装有50mlBMMY培养基(1％酵母粉，2％蛋白胨，1.0％甲醇，100mmol/l磷酸缓冲液，pH 7.0)的500ml三角瓶中，相同培养条件继续培养，每24小时补加100％甲醇于培养基至终浓度为1.0％，诱导表达7天。每隔一定的时间取样，测量其细胞密度(OD600)和胞外的单双酰脂肪酶的酶活。

检测结果如附图4所示，在BMMY培养基(初始pH为7，培养温度为28℃)摇瓶培养的条件下148小时酶活达到最高2700U/ml，而细胞也不再生长，OD600达到36.8。

实施例4单双酰脂肪酶的应用

以0.2g单硬脂酸甘油酯为底物，与5ml2％PVA混合经乳化后，加入1ml 600U/ml的单双酰脂肪酶毕赤酵母工程菌发酵液，在45℃水浴，130转/分振荡下，反应10分钟，单硬脂酸甘油酯的水解率可达51.9％。以1，3-二硬脂酸甘油酯为底物，按照类似的方法处理，结果获得了与水解单硬脂酸甘油酯相近的水解率。

Claims (10)

1.单双酰脂肪酶Mdl₍₉₎，其氨基酸序列为：SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述单双酰脂肪酶Mdl₍₉₎的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。

5.如权利要求4所述的重组载体，其为pPIC9K-mdl₍₉₎。

6.权利要求4或5所述重组载体转化的宿主细胞。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其为巴斯德毕赤酵母。

8.一种制备单双酰脂肪酶Mdl₍₉₎的方法，其通过培养权利要求6或7所述的宿主细胞，诱导单双酰脂肪酶表达获得单双酰脂肪酶。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养条件为28℃，初始pH为7，200rpm培养120-170小时；诱导条件为每24小时补充一次诱导物甲醇，至甲醇终浓度为1.0％。

10.权利要求1所述单双酰脂肪酶Mdl₍₉₎在水解单酰甘油和/或二酰甘油中的应用。

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