CN107746816B

CN107746816B - 一种改造蛋白折叠分泌途径增强葡萄糖氧化酶分泌的方法

Info

Publication number: CN107746816B
Application number: CN201710975230.3A
Authority: CN
Inventors: 张娟; 陈坚; 顾磊; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2014-10-22
Filing date: 2014-10-22
Publication date: 2020-06-09
Anticipated expiration: 2034-10-22
Also published as: CN107746816A; CN104357416A

Abstract

本发明公开了一种改造蛋白折叠分泌途径增强葡萄糖氧化酶分泌的方法，属于基因工程技术领域。本发明采用基因重组技术将毕赤酵母中KAR2、CNE1、ERO1、SSA4、SSO2、SEC53、BMH2、HRD1、UBC1、GCN4等基因分别克隆连接到毕赤酵母表达载体pGAPZ等系列衍生质粒连接，并与GOD共表达转化入Pichia pastoris GS115菌株中，考察其效果，并通过模块化组合优化，经筛选鉴定得到一株较原有菌株增强分泌表达葡萄糖氧化酶的菌株。该菌株表达的葡萄糖氧化酶在3L发酵罐上酶活1972.9U/mL。这为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。

Description

一种改造蛋白折叠分泌途径增强葡萄糖氧化酶分泌的方法

技术领域

本发明涉及一种改造蛋白折叠分泌途径增强葡萄糖氧化酶分泌的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

葡萄糖氧化酶是生物领域中最主要的工具酶之一。自1967年Updike和Hicks将GOD固定在Clark氧电极表面，将其应用于血糖测定以来，GOD被广泛应用于食品、饲料、医药等许多相关领域。

在食品工业中，由于氧的存在，引起许多不利于产品质量的化学反应，并为许多微生物生长创造了条件。目前，许多国家已将GOD作为工人的安全抗氧剂而广泛应用于各种食品和食品加工工艺中。虽然用途多样，GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成过氧化氢、形成葡萄糖酸四个方面。利用其专一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析仪，能快速准确简易地测定各种食品中的葡萄糖含量，指导生产。

在医药工业中，GOD作为试剂盒、酶电极等用于血清(浆)、尿液及脑脊液中葡萄糖的体外定量分析；GOD制成的酶制剂还可用于除去或缓解牙斑、牙垢和龋齿的形成防止口腔疾病和牙病的发生。此外，由于可以催化生成H202，还可用于对H2O2敏感的淋巴瘤的导向目标的治疗。

GOD还是一种新型的酶饲料添加剂，能够改善动物肠道环境，调节饲粮消化，促进动物生长。含葡萄糖氧化酶、乳酸过氧化物和乳铁蛋白的混合饲料添加剂，可用于预防牲畜胃肠道感染、腹泻，并有促进动物生长作用。

从动植物组织中提取GOD有一定的局限，酶量亦不丰富；细菌GOD产酶量少；一般采用黑曲霉(具有GRAS资格)和青霉属菌株作为GOD生产菌。我国及美国均采用点青霉及产黄青霉生产GOD，日本常用尼崎青霉，俄罗斯用生机青霉，近年报道胶霉属(Clioctadium)、拟青霉属(Paecilomyces)和帚霉属(Scopulariopsis)也能生产GOD。

产量低、酶活低、检测方法复杂是GOD产业化的限制性因素，国内外为此做了大量工作并取得了明显进展。目前国外生产的GOD厂家主要是德国的Boehringer和日本的TOYOBO。规模化生产高活性的GOD还有困难。发酵生产GOD的同时产生大量杂蛋白，分离提取复杂，成本高。

利用基因工程或发酵工程来研究GOD的过量表达。其酶学性质、分子改造最终实现葡萄糖氧化酶的工业化生产奠定了一定的理论基础和策略导向。

发明内容

本发明提供了一种改造蛋白折叠分泌通路增强葡萄糖氧化酶分泌的方法，是在Pichia pastoris GS115中表达葡萄糖氧化酶基因GOD的基础上，进一步将毕赤酵母中KAR2、CNE1、ERO1、SSA4、SSO2、SEC53、BMH2、HRD1、UBC1、GCN4等基因分别克隆连接到毕赤酵母表达载体pGAPZ等系列衍生质粒进行共表达，或者对上述基因进行模块化组合表达，获得葡萄糖氧化酶分泌表达增强的菌株。

所述改造蛋白折叠分泌通路增强葡萄糖氧化酶分泌的方法中，蛋白折叠分泌通路包括三个模块，其中，模块一包括囊泡运输基因SSA4、SSO2、SEC53、BMH2，ERAD基因HRD1、UBC1；模块二包括内质网中折叠基因KAR2、CNE1、ERO1；模块三是胁迫应激反应基因GCN4；所述改造，是表达三个模块中的任意一个基因，或同时表达模块一中的任意一个基因及模块二中任意一个基因，或同时表达模块一至三中的各一个基因。

在本发明的一种实施方式中，SSA4基因的核苷酸序列如Gene ID:8199979所示，SSO2基因的核苷酸序列如Gene ID:8197744所示，SEC53基因的核苷酸序列如Gene ID:8199158，BMH2基因的核苷酸序列如Gene ID:8198501所示，HRD1基因的核苷酸序列如GeneID:8201066，UBC1基因的核苷酸序列如Gene ID:8200711所示，KAR2基因的核苷酸序列如Gene ID:8198455所示，CNE1基因的核苷酸序列如Gene ID:8198102所示，GCN4基因的核苷酸序列如Gene ID:8197788所示。

本发明还提供一种葡萄糖氧化酶分泌表达增强的重组毕赤酵母，是在表达葡萄糖氧化酶基因的基础上，改造了蛋白折叠分泌通路。所述蛋白折叠分泌通路包括三个模块，其中，模块一包括囊泡运输基因SSA4、SSO2、SEC53、BMH2，ERAD基因HRD1、UBC1；模块二包括基因内质网中折叠基因KAR2、CNE1、ERO1；模块三是胁迫应激反应基因GCN4；所述改造，是表达三个模块中的任意一个基因，或同时表达模块一、二中各一个基因，或同时表达模块一至三中的各一个基因。

所述重组毕赤酵母，以毕赤酵母表达载体pGAPZαA衍生质粒为表达载体表达蛋白折叠分泌通路基因；以去除HIS4和kan^R的pPIC9k表达葡萄糖氧化酶基因。

所述pGAPZ衍生质粒包括去除pGAPZαA的α-mating信号肽得到的pGAPZ，去除pGAPZαA的α-mating信号肽，并将Shble替换成HIS4得到的pGAPH，去除pGAPZαA的α-mating信号肽，并将Shble替换成kan^R得到的pGAPK。

在本发明的一种实施方式中，以衍生质粒pGAPZ表达模块一的基因，以衍生质粒pGAPH表达模块二的基因，以衍生质粒pGAPK表达模块三的基因。

在本发明的一种实施方式中，在P.pastoris GS115中表达葡萄糖氧化酶基因GOD，并共表达内质网基因CNE1或囊泡运输基因SEC53或ERAD基因HRD1或胁迫应激反应基因GCN4。

在本发明的另一种实施方式中，在P.pastoris GS115中表达葡萄糖氧化酶基因GOD，并共表达模块一SEC53基因及模块二KAR2基因。

在本发明的另一种实施方式中，在P.pastoris GS115中表达葡萄糖氧化酶基因GOD，并共表达模块一SSA4基因及模块二CNE1基因。

在本发明的另一种实施方式中，在P.pastoris GS115中表达葡萄糖氧化酶基因GOD，并共表达模块一SEC53基因及模块二CNE1基因。

在本发明的另一种实施方式中，在P.pastoris GS115中表达葡萄糖氧化酶基因GOD，并共表达模块一SEC53基因、模块二CNE1基因及模块三GCN4基因。

在本发明的另一种实施方式中，在P.pastoris GS115中表达葡萄糖氧化酶基因GOD，并共表达模块一SEC53基因、模块二KAR2基因及模块三GCN4基因。

本发明还提供一种应用所述重组毕赤酵母生产葡萄糖氧化酶的方法，将重组菌30℃、200rpm下培养到OD₆₀₀在1.6～1.7之间的种子以2％的接种量转入基本发酵培养基(BMGY)，于30℃、200rpm条件下培养；在基本发酵培养基中培养至OD₆₀₀值为1.2-1.5时，将酵母细胞转入诱导培养基(BMMY)中诱导蛋白的产生。

在本发明的一种实施方式中，在3L发酵罐中应用所述重组菌生产葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步骤：将活化好的重组菌菌液以接种量为10％无菌操作接入3L全自动发酵罐(LiFlus GM BioTRON,Korea)中；初始条件为：装液量800-1000mL，初始搅拌转速为500r/min，通气量2.5vvm，以30％的磷酸溶液和25％的浓氨水控制pH为5.5，生长期的培养温度为30℃，采用搅拌关联的DO-stat控制，维持DO在30％，搅拌转速最高值设置为950r/min；当甘油耗尽(DO迅速上升)时，DO>60％时，开始指数流加添加50％的甘油培养基；待甘油再次耗尽，DO再次反弹，当DO>60％，开始诱导，将诱导温度降低至22℃，开始流加诱导培养基，使培养基甲醇浓度迅速达到1.8％(w/w)，通过FC2002型甲醇检测流加控制器控制甲醇残留浓度为1.8％(w/w)。

所示基本发酵培养基为BMGY培养基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB 13.4g，100mM磷酸缓冲液(pH 6.0)；诱导培养基为BMMY培养基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL，YNB 13.4g，100mM磷酸缓冲液(pH 6.0)。

本发明采用基因重组技术将毕赤酵母中KAR2、CNE1、ERO1、SSA4、SSO2、SEC53、BMH2、HRD1、UBC1、GCN4等基因分别克隆连接到毕赤酵母表达载体pGAPZ等系列衍生质粒连接，并与GOD共表达转化入Pichia pastoris GS115菌株中，获得一系列葡萄糖氧化酶分泌增强的重组菌；并通过模块化组合优化，获得一株较原有菌株增强分泌表达葡萄糖氧化酶的菌株，在3L发酵罐上酶活1972.9U/mL。本发明为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。

附图说明

图1功能模块1和模块2基因组合优化对外源表达GOD的影响；(A)GOD胞外蛋白含量；(B)GOD胞外活性；(C)细胞干重DCW。

图2功能模块1和模块2基因组合对产GOD生产效率的影响。

图3功能模块3基因组合对产GOD生产效率的影响。

图4发酵过程中不同菌株胞内ROS水平及细胞存活率；A，细胞存活率，■GS115，□PP-GOD，●S17；B，高ROS水平细胞量；C，高ROS水平死亡细胞量；

GS115；

PP-GOD；

S17。

具体实施方式

表1本发明构建菌株与质粒

表2本发明构建质粒所用引物

¹⁾设计引物序列中下划线字母代表设计加入的酶切位点。

葡萄糖氧化酶酶活测定方法：GOD活性测定一般采用邻-联(二)茴香胺分光光度法。在有氧条件下，GOD催化葡萄糖脱氢产生H₂O₂，在过氧化物酶(POD)作用下，氧供体邻-联(二)茴香胺(DH₂)被氧化成棕色产物。测540nm处吸光度的变化，根据标准曲线的结果，计算葡萄糖氧化酶活力单位。

种子和斜面培养基为YPD培养基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g；斜面培养基添加琼脂20g。

基本发酵培养基为BMGY培养基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB13.4g，100mM磷酸缓冲液(pH 6.0)。

诱导培养基为BMMY培养基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL，YNB13.4g，100mM磷酸缓冲液(pH 6.0)。

实施例1各不同模块基因对分泌葡萄糖氧化酶的影响

1.1改造内质网中折叠模块基因对外源表达GOD的影响

内质网(ER)中的蛋白折叠速率和胞质内的分泌速率是影响酵母细胞中外源蛋白分泌的重要因素。ER中参与蛋白折叠机制的驻留蛋白Kar2p，Cne1p和Ero1p能够帮助新生未折叠肽链折叠成正确构象。为了研究ER折叠模块对分泌外源GOD的影响，将P.pastoris中的ER驻留蛋白编码基因KAR2，CNE1和ERO1分别在P.pastoris工程菌PP-GOD过量共表达，以增强改造工程菌株细胞内的对应功能蛋白的表达水平，结果如表3所示。在改造工程菌PP-G-CNE1内共表达GOD和CNE1后，GOD活性达到779.3U·mL^-1，同时平均外源蛋白生产率qp和GOD生产率Qp达到0.528mg·g_DCW ^-1·h^-1和35.48U·g_DCW ^-1·h^-1。相比对照菌株PP-GOD明显提高。这是第一次发现在P.pastoris中共表达CNE1基因能够提高外源GOD的分泌。CNE1基因在酵母细胞中对于糖化蛋白在ER中的折叠起着重要的作用，其能够加强新生肽链的折叠，从而提高产量。

然而并不是所有的模块基因对于增强分泌外源GOD的效果都很显著。在改造工程菌PP-G-KAR2中，在统计学显著性差异上较小，相对于对照菌株PP-GOD，GOD活性从322.9U·mL^-1提高到378.1U·mL^-1。同时GOD的比生产率(GOD蛋白量/DCW)稍有降低，从0.046g·g_DCW ^-1降低至0.039g·g_DCW ^-1。同样在改造工程菌PP-G-ERO1中，共表达ERO1，对分泌外源GOD的影响不显著，相较于对照菌株PP-GOD，GOD活性和平均蛋白生产率qp达到347.2U·mL^-1和0.486mg·g_DCW ^-1·h^-1，提升显著性差异较小。

表3毕赤酵母中折叠模块基因对外源表达GOD的影响

1.2改造囊泡运输模块基因对外源表达GOD的影响

在外源蛋白分泌途径中，不同细胞器之间蛋白的转运由可溶的SNARE突触膜蛋白受体(N ethylmaleimide sensitive factor receptor)催化和调控。外源蛋白在酵母宿主细胞分泌过程中尽管已经形成了正确的构象，但由于囊泡运输效率不高造成其积累在胞内。造成分泌效果不显著的运输步骤，包含了胞质到ER、ER到高尔基体、胞质到细胞膜等不同的阶段。为了研究囊泡运输模块对于分泌外源GOD的影响，将毕赤酵母中的编码基因SSA4，SSO2，SEC53和BMH2在毕赤酵母工程菌PP-GOD过量共表达，结果如表4所示。在改造菌株PP-G-SSA4中过表达胞质至ER中转运定位基因SSA4后，GOD活性达到412.7U·mL^-1，平均GOD生产率Qp达到22.46U·g_DCW ^-1·h^-1，同时平均蛋白生产率qp相较于对照菌株PP-GOD有小幅度提升，从0.431mg·g_DCW ^-1·h^-1提高到0.459mg·g_DCW ^-1·h^-1。在共表达BMH2基因的PP-G-BMH2中，对于分泌外源GOD的增强效果一般，平均qp和Qp分别达到0.462mg·g_DCW ^-1·h^-1和20.39U·g_DCW ^-1·h^-1。共表达SSO2相比SSA4和BMH2的效果较好，平均qp和Qp提高到0.510mg·g_DCW ^-1·h^-1和26.41U·g_DCW ^-1·h^-1，相较于对照菌株PP-GOD分别提高了18％和52％，这说明突触融合蛋白受体Sso2p对于P.pastoris内囊泡转运外源GOD的作用，相比于胞质进入ER和从ER离开进入胞质和细胞膜的转运步骤对分泌外源GOD的影响更大。

此外，共表达SEC53基因的改造菌株PP-G-SEC53对分泌外源GOD的效果显著。相较于对照菌株PP-GOD，平均Qp和qp均有大幅度提高，分别从17.43U·g_DCW ^-1·h^-1提高至31.58U·g_DCW ^-1·h^-1，0.431mg·g_DCW ^-1·h^-1提高至0.545mg·g_DCW ^-1·h^-1，同时最终胞外GOD活性也从322.9U·mL^-1提高至960.4U·mL^-1，提高了近1.9倍。这说明共表达SEC53基因能够通过提高外源糖蛋白在ER中糖基化控制的效率来降低ER内部的折叠压力，从而提高外源GOD的分泌。

表4毕赤酵母中囊泡运输模块基因对外源表达GOD的影响

1.3改造ERAD模块基因对外源表达GOD的影响

过量表达外源GOD会加重ER的负载压力。当保留在ER中的未折叠肽链和折叠错误的外源蛋白大量积累，会使得形成正确构象的时间增长，从而形成对ER的胁迫。ERAD机制将过载和错误构象的蛋白转入胞质中，并进一步引导进入蛋白酶体(Proteasome)进行降解，能够有效的减缓ER的胁迫压力。HRD1基因编码ERAD机制中的泛素连接酶，是降解通路的重要参与因子。见表5，当共表达HRD1基因的改造菌株PP-G-HRD1，大幅度提高了GOD产量，达到837.7U·mL^-1。同时平均Qp和qp也明显提升，分别提高到32.86U·g_DCW ^-1·h^-1和0.524mg·g_DCW ^-1·h^-1，相较于对照菌株分别提高了88％和21％。宿主细胞的最终生长情况也明显好转，最终DCW提高至271.7g·L^-1。

表5毕赤酵母中ERAD模块基因对外源表达GOD的影响

相比共表达HRD1基因，作为ERAD机制中参与筛选被降解的非正常蛋白的泛素共轭酶编码基因UBC1，在共表达改造菌株PP-G-UBC1中，统计学显著性差异上略小，平均Qp和qp提升不显著，较对照菌株分别只提高了17％和16％。ER中异常蛋白的长期滞留会造成ERAD机制的代谢负担，会对宿主引起严重的影响，直接导致的就是菌体生长能力的减弱。结果显示共表达ERAD模块的主要功能基因能够为分泌外源GOD提供正向的帮助，同时能够通过减缓ERAD代谢压力提高细胞的生长能力。

1.4改造胁迫应激反应模块基因对外源表达GOD的影响

基于上述的结果，发现共表达ERAD模块重要基因可以提高外源GOD的分泌生产，同时也能改善宿主细胞在过量表达外源蛋白时的生长能力。这些结果也证实了细胞生长的功能障碍和反作用，对于分泌外源GOD的分泌生产有严重的影响。在过量分泌外源蛋白的情况下，细胞生长的功能障碍主要由于ER中的胁迫压力造成。当ER中胁迫压力发生时，作为胞内抵御机制存在的应激反应调控因子会被激活，其中Gcn4p为UPR应激反应激活因子，而Gcn4p区别于HAC1基因编码调控因子，主要参与维持细胞功能抵御生长功能障碍。

表6毕赤酵母中胁迫应激模块基因对外源表达GOD的影响

为了验证胁迫应激模块基因GCN4基因对分泌外源GOD的影响，将GCN4基因在改造菌株PP-G-GCN4中进行共表达。结果见表6，细胞生长情况较对照菌株PP-GOD有明显改善，最终DCW从134.4g·L^-1提高至288.8g·L^-1，提高了1.1倍。同时GOD活性大幅度提升，达到1239.6U·mL^-1，平均Qp和qp提升也显著提升。

实施例2蛋白分泌途径模块优化对外源表达葡萄糖氧化酶的影响

实施例1分别共表达各模块基因，能够改善重组P.pastoris中GOD的产量，这预示着各个模块改造P.pastoris分泌外源GOD均有作用。为了进一步提高重组P.pastoris产外源GOD的能力，研究各个模块基因的优化组合对产外源GOD能力的影响。由于各个功能区块之间的相互联系，简单的叠加一个功能区块中的功能模块基因，并不能使结果呈现叠加式的增加。因此，本实施例通过模块化优化改造的方式，将不同功能模块的基因进行相互组合，以进一步提高重组P.pastoris产外源GOD。将实施例1中的功能基因分为三类，进行接下来的组合优化，分别为：(1)模块1：包含了HRD1，SEC53，SSO2和SSA4基因，模块1中的基因包含了ERAD功能模块和胞内囊泡运输模块的基因，能够减缓蛋白在胞内内质网等细胞器中的积累压力，加强运输能力；(2)模块2：包含KAR2，CNE1和ERO1，模块2中的基因均为内质网中折叠模块基因，直接影响蛋白在内质网中的折叠速率；(3)模块3：包含了GCN4基因，模块3基因编码因子属于胞内抵御机制存在的应激反应调控因子，能够影响P.pastoris对胞内胁迫条件的抗胁迫能力。

2.1功能模块1和模块2的组合优化对外源表达GOD的影响

为了考察内质网ER中折叠速率和胞内运输能力对于产外源GOD的影响，对模块1和模块2的典型编码基因进行组合共表达，如图1所示。

当模块2的基因为KAR2，模块1分别为HRD1，SEC53，SSO2和SSA4基因与KAR2进行搭配共表达。当模块1中的SEC53和模块2中的KAR2搭配共表达时，该重组菌的外源GOD产量最高，GOD胞外含量最高达到16.09g·L^-1，GOD胞外活性达到1305.7U·mL^-1，同时细胞干重达到361.8g·L^-1。

当模块2的基因为CNE1，模块1中HRD1，SEC53，SSO2和SSA4基因分别与之进行搭配共表达。第二轮中不同重组菌的外源GOD产量同第一轮的优化呈现了相同的趋势，SEC53基因同折叠模块1中基因进行搭配共表达能够达到最好的效果，这说明参与糖蛋白在内质网中糖基化修饰控制转运的SEC53基因，对于糖蛋白GOD在内质网中折叠速率的增强具有特殊的效果。此外，这一轮的结果显示出共表达CNE1基因较KAR2基因的优势，该重组菌的GOD胞外含量最高达到17.43g·L^-1，GOD胞外活性达到1559.4U·mL^-1。

当模块2的基因为ERO1时，发现效果较前两轮优化效果明显。

如图2所示，结果显示共表达SEC53或SSA4的重组P.pastoris菌株(S2，S4，S6，S8，S10和S12)中GOD的平均Qp和qp较其他没有共表达这两个基因的重组菌株要更高。说明了内质网中参与糖基化控制的功能和转运定位功能，对提高外源GOD在宿主细胞中的分泌有重要的作用。同时，重组菌株(S2，S4，S6和S8)的平均Qp和qp在共表达KAR2和CNE1基因的条件下，较其他未表达它们的条件下要高。重组菌株S2，在同时共表达SEC53和KAR2时平均Qp和qp提升最明显，Qp达到54.10U·g_DCW ^-1·h^-1，同时qp最高达到0.735mg·g_DCW ^-1·h^-1。2.2功能模块3的组合优化对外源表达GOD的影响

功能模块1和功能模块2的组合优化，发现HRD1，SEC53，SSA4，KAR2和CNE1基因间的搭配对外源表达GOD有较为明显的作用。因此在这基础上，对功能模块3进行组合优化的考察。在这一轮组合优化中，模块1和模块2的共表达组合方式在菌株S1，S2，S4，S5，S6和S8的组合基础上，叠加模块3的优化，如图3所示。图中结果显示，共表达模块3基因GCN4后，能够有效地提高胞外GOD的积聚。其中改造重组菌株S17的GOD产量提高最为显著，当同时共表达SEC53，CNE1和GCN4基因时，GOD活性最高达到1972.9U·mL^-1，平均qp最高达到0.971mg·g_DCW ^-1·h^-1。

实施例3模块化改造对毕赤酵母胞内活性氧水平的影响

通过流式细胞仪考察了重组改造菌S17胞内ROS与细胞生长的变化情况。由于利用甲醇也会对胞内ROS的积累产生影响，因此同时将野生型GS115菌株作为对照菌株一起进行了比较。如图4所示，经过改造，S17菌株的细胞存活率显著提升，发酵144h细胞存活率达到77.4％，同原始菌株PP-GOD相比存活率提升了16.6％。通过对胞内ROS水平的检测，发现由于采用甲醇诱导，菌体在利用甲醇的同时也会产生ROS提高ROS在胞内的水平，如图4B所示，对照菌株GS115随着诱导时间的延长，高ROS水平的细胞数也在增加，当诱导96h后高ROS水平的细胞数占总细胞数的76％；然而发现在过量表达GOD的菌株PP-GOD与S17中，由于过量表达异源蛋白GOD会使ER中折叠功能进入满负荷状态，也会生产ROS从而引起氧化胁迫，其高ROS水平细胞数比例明显要高于对照菌株，上升趋势也更为明显，诱导48h就接近70％。说明过量表达GOD对细胞造成了额外的ROS负担。这证明了ROS的积累的确会影响酵母菌的生长，同时过量表达外源蛋白会造成额外的ROS积累。如图4C所示，对各菌株中高ROS水平死亡细胞比例的比较，发现原始重组菌PP-GOD中高ROS水平死亡细胞比例较高，而改造菌S17的死亡细胞比例明显下降，说明S17菌株中的改造策略在更高效生产GOD的同时，抗ROS的能力也显著增强，使得细胞存活率提高，从而进一步提高了生产能力。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种改造蛋白折叠分泌途径增强葡萄糖氧化酶分泌的方法

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<170> PatentIn version 3.3

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<213> 人工序列

<400> 15

gggttcgaaa tgtcgttttc taataaagaa gat 33

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ttgcggccgc ttacagggaa aagagctcct 30

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gggttcgaaa tgggtaaatc aattggaatt g 31

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ttgcggccgc ttaatcgact tcttccacgg ttg 33

<210> 19

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gggttcgaaa tgagtaacca gtataatccg tatg 34

<210> 20

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ttgcggccgc ctatcttccc cagtttccga caccg 35

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gggttcgaaa tgactagcat taaacgaatc 30

<210> 22

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ttgcggccgc tcatctcaaa agctcttcta aaat 34

Claims

1.一种葡萄糖氧化酶分泌表达增强的重组毕赤酵母，是在表达葡萄糖氧化酶基因的基础上，改造了蛋白折叠分泌途径，所述改造，是将GCN4基因与CNE1、SEC53同时表达；

所述SEC53基因的核苷酸序列如Gene ID:8199158，CNE1基因的核苷酸序列如Gene ID:8198102所示，GCN4基因的核苷酸序列如Gene ID:8197788所示；以pGAPZαA衍生质粒为表达载体表达蛋白折叠分泌途径基因；以去除HIS4和kan ^R的pPIC9k表达葡萄糖氧化酶基因；所述pGAPZαA衍生质粒包括去除pGAPZαA的α-mating信号肽得到的pGAPZ，去除pGAPZαA的α-mating信号肽并将Shble替换成HIS4得到的pGAPH，去除pGAPZαA的α-mating信号肽并将Shble替换成kan ^R得到的pGAPK。

2.根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于，以衍生质粒pGAPZ表达SEC53基因，以衍生质粒pGAPH表达CNE1基因，以衍生质粒pGAPK表达GCN4基因。

3.权利要求1所述的重组毕赤酵母在葡萄糖氧化酶生产中的应用。