CN112143662B - 一种重组毕赤酵母工程菌及在制备嘌呤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组毕赤酵母及在制备嘌呤中的应用，所述重组毕赤酵母工程菌是将SEQ ID NO.1所示基因Rihc‑2、SEQ ID NO.2所示基因Hac1和SEQ ID NO.3所示基因PDI导入宿主菌构建获得的。本发明首次将腺苷水解酶在毕赤酵母中以分泌表达方式高效表达，并且组合应用了基因高拷贝、抗性可循环使用表达载体、HAC1和PDI基因导入等强化蛋白表达的策略，提高了重组酶的生产效率；本发明得到的菌株WC‑5在5L发酵罐中采用补料分批高密度发酵方法，腺苷水解酶蛋白表达量为500mg/L。发酵液上清粗酶液可应用于腺苷及鸟苷的水解反应。

Description

一种重组毕赤酵母工程菌及在制备嘌呤中的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种重组毕赤酵母工程菌及在制备嘌呤中的应用。

(二)背景技术

腺嘌呤和鸟嘌呤在医药工业上具有重要应用价值。腺嘌呤是核酸的组成成分，参与遗传物质的合成，能促进白细胞增生，使白细胞数目增加，用于防治各种原因引起的白细胞减少症，特别是用于肿瘤化学治疗时引起的白细胞减少症，也用于急性粒细胞减少症，是生物体内不可或缺的一种化合物。另外，腺嘌呤也是很多药物的中间体，可用于生产植物激素6-BA、维生素B4、阿德福韦醋等。鸟嘌呤是抗病毒药阿昔洛韦和更昔洛韦合成的重要中间体，同时还可应用于临床治疗由免疫功能低下而引发的盲性巨细胞病毒性视网膜炎，此外还应用于器官移植、艾滋病以及恶性肿瘤的辅助治疗。

由于腺嘌呤和鸟嘌呤具有如此广泛的用途，近年来全世界的用量也正在不断地扩大，因此开发一种绿色环保，经济适用的腺嘌呤和鸟嘌呤工业化方法受到了广大化学生物工作者的关注。

目前，生产腺嘌呤和鸟嘌呤的方法主要有天然产物提取和化学法合成。由于天然产物提取存在效率低下、成本高等缺点，因此，工业化生产主要是采用化学法，但是，化学法一般都存在步骤比较长、反应条件苛刻、对环境不友好等缺点。以腺嘌呤为例，中国专利CN102321086A公开的制备方法，以乙酰次黄嘌呤为初始原料，先与三氯氧膦在N，N一二甲基苯胺催化下发生氯代反应，再通过高温高压氨化、精制等步骤得到腺嘌呤。此方法的缺陷在于，需要使用能耐受高温高压的特殊反应设备，对设备要求比较高，并且有安全隐患。另外，此方法产生的三废的量比较大，处理麻烦，对环境不友好。中国专利CN10288'7899A中公开的制备方法，以丙二酸二乙醋为初始原料与甲酰胺合成4，6一二羟基嘧啶，再通过硝化、氯代、氨化、还原、环合等步骤得到腺嘌呤。此方法的缺陷在于，反应步骤较多，原子经济性比较差，工业化价值较低。中国专利CN101125854A中公开的制备方法，利用高温液态水水解腺苷制备腺嘌呤，此方法的缺陷在于，水解腺苷需要在高温下进行，生成的副产物D一核糖在高温下容易变性而无法利用，非常不经济。中国专利CN103923083A中公开的制备方法，以腺苷为底物通过醋醉乙酰化后得到乙酰腺嘌呤和四乙酰核糖，再通过碱解、中和得到腺嘌呤。虽然此方法主产物腺嘌呤和副产物四乙酰核糖都能以较高的收率得到，但是此工艺复杂并且产生的三废较多。

鉴于此，目前函待提出一种反应步骤简单、产量高、成本低、环保的制备腺嘌呤和鸟嘌呤的方法。酶法水解制备腺嘌呤和鸟嘌呤的工艺就具有这样的优势。

大肠杆菌表达系统是目前应用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，它最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低,因而广泛用在工业酶的表达生产上。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白加工修饰能力，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程，其产物往往形成没有活性的包涵体。例如，中国专利CN105802938A中公开的制备方法，用重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中表达腺苷水解酶，将腺苷溶于水中，加入腺苷水解酶进行反应，得到腺嘌呤。腺苷水解酶在大肠杆菌中进行表达，虽然方法简单，但是大肠杆菌表达的是胞内酶，细胞破碎成本高，且酶液中含有大量杂质，甚至含内毒素，不利于腺嘌呤、特别是食品和医药级腺嘌呤的分离纯化。

与大肠杆菌相比，以酵母作为工程菌分泌表达外源蛋白日益引起重视。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是第二代酵母表达系统，被美国FDA认定为GRAS(generallyrecognized as safe)微生物，为其在食品和医药上的应用铺平了道路。除了具有一般酵母所具有的特点外，具有以下几个优点：

(1)具有醇氧化酶AOXl基因启动子，这是目前最强，调控机制最严格的启动子之一。严格调控外源基因的表达，使外源基因只在甲醇培养基中有效表达；

(2)表达质粒能在基因组特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合，由于外源基因以同源重组整合到酵母细胞染色体上，所以遗传稳定；

(3)毕赤酵母自分泌蛋白很少，外源蛋白是培养液中的优势蛋白；

(4)菌株易于进行高密度发酵，发酵培养基成本低廉，外源蛋白表达量高。表达水平是细菌、昆虫或哺乳动物的10-100倍。如表皮生长因子(Epidemal Growth Factor，EGF)在酿酒酵母(Saccharomyces.Cerevisiae)中的产量为7.4mg/L，而在巴斯德毕赤酵母(PichiaPastoris)中为450mg/L，提高60倍；

(5)表达方式灵活，既可胞内表达，也可胞外表达，能将目的蛋白分泌到胞外并进行翻译后加工；

(6)毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存于其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用；

(7)糖基化程度低。与酿酒酵母相比，毕赤酵母加到蛋白上的糖链长度平均每条侧链为8-14个甘露糖残基，比酿酒酵母每条侧链50-150个甘露糖残基短得多。

因此，本发明以毕赤酵母为表达宿主，通过组合应用多种强化重组蛋白表达的分子策略，分泌表达腺苷水解酶，并将该酶应用于腺嘌呤和鸟嘌呤的酶法制备中。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种重组毕赤酵母工程菌及其在制备嘌呤中的应用，所述重组毕赤酵母，能够高效发酵产腺苷水解酶，解决目前腺嘌呤和鸟嘌呤生产方法落后，不能满足工业生产上环保、节能、食品与医药安全需求的问题。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种重组毕赤酵母工程菌，所述重组毕赤酵母工程菌是将SEQ IDNO.1所示基因Rihc-2、SEQ ID NO.2所示基因Hac1和SEQ ID NO.3所示基因PDI导入宿主菌构建获得的。

本发明所述宿主菌优选为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115(购自Invitrogen)。

本发明所述基因Rihc-2源自大肠杆菌(Escherichia coli str.K-12substr.MG1655)的腺苷水解酶基因，经密码子优化后连接到酵母表达质粒pPIC9K上，构建表达载体pPIC9K-Rihc-2，导入宿主菌，筛选阳性克隆子。

本发明所述基因Hac1编码的Hac1p蛋白是酵母内质网中未折叠蛋白响应机制的激活因子。以酿酒酵母by4741(购自Invitrogen)为模板，利用引物Hac1-F和Hac1-R扩增Hac1基因片段，连接到载体pPICZC中，构建表达载体pPICZC-Hac1。

本发明所述基因PDI为二硫键异构酶基因，以酿酒酵母by4741为模板，利用引物PDI-F和PDI-R扩增PDI基因片段，连接到载体pPICZC中，构建表达载体pPICZC-PDI。

所述载体pPICZC按如下方法构建：以F7质粒为模板，利用引物Cre-F和Cre-R扩增Tcre基因片段；以pPICZα质粒为模板，利用引物Ori-Paox-F和Paox-R扩增Pox基因片段，利用引物Cre-Taox-F和Taox-R扩增Taox基因片段，利用引物Taox反向-R和Zeo反向-F扩增基因片段pP，利用引物ori-F和ori-R扩增基因片段Ori；以pPIC9K质粒为模板，利用引物Zeo-His4-F和引物His4-R扩增HIS4基因片段；将上述Tcre基因片段、Pox基因片段、Taox基因片段、基因片段pP、基因片段Ori和HIS4基因片段共6个片段连接，获得载体pPICZC；

本发明所述重组毕赤酵母工程菌按如下方法构建：将表达载体pPIC9K-Rihc-2电转入宿主菌中，筛选得到单拷贝腺苷水解酶基因的工程菌，利用转化后载体扩增方法获得多拷贝腺苷水解酶基因的工程菌；再利用抗性可循环表达载体技术将Hac1基因和PDI基因整合进基因组，得到重组毕赤酵母工程菌。更优选为：将表达载体pPIC9K-Rihc-2电转入毕赤酵母GS115中，筛选得到单拷贝腺苷水解酶基因的重组毕赤酵母WC-1；然后利用转化后载体扩增方法(PTVA法)获得多拷贝腺苷水解酶基因的重组毕赤酵母菌株WC-2；进一步利用抗性可循环表达载体技术将Hac1基因和PDI基因整合进重组毕赤酵母菌株基因组，得到腺苷水解酶表达产量与WC-1相比提高10倍以上的重组毕赤酵母WC-5。

本发明所述重组毕赤酵母工程菌的构建具体为：

(1)选用毕赤酵母GS115作为出发菌株；

(2)构建表达载体

将腺苷水解酶基因Rihc-1按照毕赤酵母偏好密码子优化后人工合成，得到基因Rihc-2(SEQ ID NO.1)，将基因Rihc-2连接在毕赤酵母表达载体pPIC9K中，构建得到表达载体pPIC9K-Rihc-2；

在毕赤酵母表达载体pPICZα的基础上，加入Cre/Loxp基因序列，得到抗性可循环使用的表达载体pPICZC；将基因Hac1(SEQ ID NO:2所示)连接到载体pPICZC中，构建得到表达载体pPICZC-Hac1；将基因PDI(序列如SEQ ID NO:3)连接到载体pPICZC中，构建得到表达载体pPICZC-PDI；

(3)将表达载体pPIC9K-Rihc-2转入毕赤酵母菌株GS115中，同源重组整合至其基因组，构建出重组毕赤酵母菌株WC-1；

(4)对重组毕赤酵母菌株WC-1进行转化后载体扩增(posttransformationalvector amplification(PTVA))，以荧光定量PCR方法检测基因拷贝数，得到腺苷水解酶基因Rihc-2拷贝数为1～8的不同毕赤酵母菌株；经过摇瓶发酵筛选，获得一株腺苷水解酶表达量最高的重组毕赤酵母菌株WC-2；

(5)将表达载体pPICZC-Hac1转入重组毕赤酵母菌株WC-2中，筛选得到整合有Hac1基因的重组毕赤酵母WC-3；

(6)对菌株WC-3进行抗性基因去除实验，得到无Zeocin抗性的重组毕赤酵母菌株WC-4；

(7)将表达载体pPICZC-PDI转入重组毕赤酵母菌株WC-4中构建得到重组毕赤酵母WC-5。

本发明还提供一种所述重组毕赤酵母在制备嘌呤中的应用，所述应用方法为：以重组毕赤酵母经发酵培养获得的上清液浓缩后为催化剂，加入底物，以pH6.0-7.0的缓冲液为反应介质构成水解体系，在20-50℃(30℃)下反应4～24h，反应液分离纯化，获得相应嘌呤；所述底物为腺苷或鸟苷，对应的产物分别为腺嘌呤或鸟嘌呤；所述底物加入量以水解体系总体积计为100-900g/L，优选200g/L。

进一步，所述反应介质为50mM、pH 7.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液。

进一步，所述催化剂是将发酵液于4℃下10000rpm离心10分钟去除菌体沉淀，上清液通过10KDa的超滤膜浓缩，再过0.45μm-0.22μm的水系滤膜，得到浓缩5～10倍的粗酶液，即为催化剂。

进一步，所述发酵液按如下方法制备：

将重组毕赤酵母接种至含3L BSM培养基的5L发酵罐中，调pH至5.0，温度为30℃，初始转速设置为500r/min，通气量控制溶氧在20％以上；当培养基中甘油消耗完后，溶氧快速上升(DO﹥60％)，随即开始以10-50ml/h/L发酵液(优选16.7ml/h/L)的速度流加含PTM112mL/L的体积浓度50％的甘油水溶液，培养至菌体含量为150g/L；流加结束后，反应条件不变，饥饿30min后，第1-2h以3.6ml/h/L发酵液，第2-4h以7.3ml/h/L发酵液，接着以10.9ml/h/L发酵液的速度流加含PTM1 12mL/L的无水甲醇进行诱导，通过控制无水甲醇的流加速率，使生长速率在0.001-0.1h^-1(优选0.015h^-1)，调节转速与通气量控制溶氧大于20％，诱导后每12h取一次发酵液，发酵培养96h(至菌体湿度达到400g/L结束)，获得含腺苷水解酶的发酵液。所述甘油水溶液体积加入量以BSM培养基体积计为200mL/3L。

所述BSM培养基：H₃PO₄ 31.4mL/L，KOH 4.13g/L，K₂SO₄ 18.2g/L，CaSO₄ 0.93g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9g/L，甘油(Glycerol)40.0g/L，溶剂为水，接种前用氨水调pH到5.0-5.5，并加4.35mL/L的PTM1。

PTM1配方：H₃BO₃ 0.02g/L，CuSO₄·5H₂O 6.0g/L，MnSO₄·H₂O 3.0g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2g/L，CoCl₂ 0.5g/L，NaI 0.08g/L，ZnCl₂ 20.0g/L，FeSO₄·7 H₂O 65.0g/L，生物素0.2g/L，5.0mL/L的H₂SO₄，ddH₂O定容至1L。

进一步，本发明所述重组毕赤酵母在发酵前，先进行扩大培养，再以体积浓度10％接种量接种至BSM培养基，所述扩大培养是将重组毕赤酵母接种至YPD液体培养基，30℃培养24h；YPD液体培养基：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，溶剂为水，pH自然即可。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

本发明首次将腺苷水解酶在毕赤酵母中以分泌表达方式高效表达，并且组合应用了基因高拷贝、抗性可循环使用表达载体、HAC1和PDI基因导入等强化蛋白表达的策略，提高了重组酶的生产效率；

本发明得到的菌株WC-5在5L发酵罐中采用补料分批高密度发酵方法，本发明首次进行腺苷水解酶分泌表达，腺苷水解酶蛋白表达量为500mg/L，发酵液上清粗酶液可应用于腺苷及鸟苷的水解反应。

本发明的重组毕赤酵母工程菌分别水解腺苷和鸟苷制备腺嘌呤和鸟嘌呤工艺，无需对菌体进行破壁，也无需对酶进行提纯，只需对发酵上清进行超滤浓缩后即可用于反应。反应步骤简单、产量高，大幅降低了生产成本，并且制备过程中产生的三废的量很少。分离所得的毕赤酵母菌体可作为单细胞蛋白饲料；

本发明的腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤，生物转化的底物浓度最高可达900克/升，反应的转化率>99％。同时该酶也可应用于鸟苷水解制备鸟嘌呤，具有一酶两用的功能。

(四)附图说明

图1、pPIC9K-Rihc-2质粒图谱图。

图2、pPICZC-PDI质粒图谱。

图3、pPICZC-Hac1质粒图谱。

图4腺嘌呤和腺苷标准品图谱，1腺嘌呤，2腺苷。

图5鸟嘌呤和腺苷标准品图谱，1鸟嘌呤，2鸟苷。

图6实施例2腺苷水解反应液的液相色谱图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：表达腺苷水解酶的毕赤酵母菌株WC-5的构建

1.采用毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115作为出发菌株(购自Invitrogen)

2.构建表达载体

2.1将源自于大肠杆菌(Escherichia coli str.K-12substr.MG1655)的腺苷水解酶原始基因序列Rihc-1的密码子进行毕赤酵母偏好性优化，获得如SEQ ID NO:1所示的Rihc-2基因。

2.2将目的基因序列Rihc-2交由杭州擎科生物技术有限公司合成，并插入标准毕赤酵母表达质粒pPIC9K表达框中，获得表达载体pPIC9K-Rihc-2。

2.3以F7质粒(购自Invitrogen)为模板，利用引物Cre-F和Cre-R扩增Tcre基因片段；以pPICZα质粒(购自Invitrogen)为模板，利用引物Ori-Paox-F和Paox-R扩增Pox基因片段，利用引物Cre-Taox-F和Taox-R扩增Taox基因片段，利用引物Taox反向-R和Zeo反向-F扩增基因片段pP，利用引物ori-F和ori-R扩增基因片段Ori；以pPIC9K质粒(购自Invitrogen)为模板，利用引物Zeo-His4-F和引物His4-R扩增HIS4基因片段。使用南京诺唯赞生物科技有限公司多片段一步快速克隆试剂盒将上述6个片段连接获得抗性可循环使用载体pPICZC。再以pPICZC质粒为模板，利用引物Hac1反向-F和Hac1反向-R扩增载体片段pPHac1；以酿酒酵母by4741(购自Invitrogen)为模板，利用引物Hac1-F和Hac1-R扩增Hac1基因片段(核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示)，用一步克隆试剂盒将片段pPHac1和片段Hac1连接获得表达载体pPICZC-Hac1；以酿酒酵母by4741为模板，利用引物PDI-F和PDI-R扩增PDI基因片段(核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示)，用一步克隆试剂盒将片段pPHac1和片段PDI连接获得表达载体pPICZC-PDI。

2.4利用电穿孔法将表达载体pPIC9K-Rihc-2导入毕赤酵母菌株GS115，利用含350μg/mL的G418抗性的MD平板，30℃培养筛选阳性转化子，即为腺苷水解酶表达菌株，记为毕赤酵母菌株WC-1。本步骤中的MD平板组成：20g/L葡萄糖、13.4g/L酵母氮源基础(YeastNitrogen Base)和20g/L琼脂，溶剂为水，pH自然即可。

2.5利用PTVA(posttransformational vector amplification)法筛选高拷贝数菌株。将菌株WC-1划线接种于含350μg/mL的遗传霉素(G418)抗性的YPD平板。然后将单菌落接种于350μg/mL的G418抗性的5mL液体YPD培养基，30℃，200rpm培养24h后，3500rpm离心去上清，加入含500μg/mL的G418抗性的5mL液体YPD培养基，30℃，200rpm培养24h后，3500rpm离心去上清，按此方法依次加入逐步递增G418浓度(1000μg/mL、1500g/mLμ、2000μg/mL、2500μg/mL、3000μg/mL)的5mL液体YPD培养基在30℃、200rpm，培养24h。最后将菌液稀释10^-5后涂布含3000μg/mL的G418抗性YPD平板培养3-5天。最后采用qPCR检测菌株的目的基因拷贝数，筛选得到腺苷水解酶产量最高的重组菌株，记为菌株WC-2，其腺苷水解酶基因拷贝数为6。

YPD平板：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH自然即可。

YPD液体培养基：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，溶剂为水，pH自然即可。

2.6利用电穿孔法将表达载体pPICZC-Hac1导入毕赤酵母菌株WC-2，利用含100μg/mL的博来霉素(zeocin)抗性的YPD平板筛选阳性转化子，将得到的阳性转化子记为毕赤酵母菌株WC-3。

2.7挑选阳性转化子到含2mL BMGY培养基的EP管里，30℃，200rpm培养36h后，于4摄氏度下，3500rpm离心1分钟去上清，用1mL BMMY培养基重悬，30℃，200rpm培养24h，每12h添加甲醇至体积终浓度为0.5％。将此诱导后培养物划线到无zeocin抗性YPD平板，30℃培养至菌落明显可见，然后转移单菌落分别在YPD和加入100μg/mL的zeocin的YPDZ平板30℃过夜。将能在YPD平板上生长，而不能在YPDZ平板上生长的菌株筛选保存，记为毕赤酵母菌株WC-4。

BMGY培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，甘油10g/L，K₂HPO₄ 3g/L，KH₂PO₄11.8g/L，3.4g/L的YNB(Yeast nitrogen base，without Amino Acids&Ammonium Sulfate)，硫酸铵10g/L，115℃灭菌30min，质量浓度0.2％的500×生物素(一种水溶性维生素(B7)，也叫做维生素H)，溶剂为水，pH自然即可。

BMMY培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，K₂HPO₄ 3g/L，KH₂PO₄ 11.8g/L，3.4g/L的YNB(Yeast nitrogen base，without Amino Acids&Ammonium Sulfate)，硫酸铵10g/L，115℃灭菌30min，质量浓度0.2％500×生物素，溶剂为水，pH自然即可。

YPDZ平板：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，溶剂为水，pH自然即可，115℃灭菌30min后，冷却加入100μg/mL的zeocin。

2.8利用电穿孔法将表达载体pPICZC-PDI导入毕赤酵母菌株WC-4，利用含100μg/mL的zeocin抗性的YPD平板筛选阳性转化子，将得到的阳性转化子记为毕赤酵母菌株WC-5，即得到本发明所述重组毕赤酵母工程菌。

表1引物序列

实施例2、菌株WC-5的发酵情况以及酶活情况测定

1.发酵评价

菌株WC-5接种至50mL液体YPD，30℃培养24h后，按照体积浓度10％的接种量接到含3L BSM培养基的5L发酵罐中。调pH至5.0，温度为30℃，初始转速设置为500r/min，通气量控制溶氧在20％以上。当培养基中甘油消耗完后，溶氧快速上升(DO﹥60％)，随即开始以16.7ml/h/L发酵液的速度流加含PTM1 12mL/L的体积浓度50％的甘油水溶液，培养至菌体含量为150g/L。流加结束后，反应条件不变，饥饿30min后，第1-2h以3.6ml/h/L发酵液，第2-4h以7.3ml/h/L发酵液，接着以10.9ml/h/L发酵液的速度流加含PTM1 12mL/L的无水甲醇进行诱导，通过控制无水甲醇的流加速率，使生长速率在0.015h^-1左右，调节转速与通气量控制溶氧大于20％，诱导后每12h取一次发酵液，发酵培养96h(至菌体湿重达到400g/L时结束)，获得含腺苷水解酶的发酵液，测定腺苷水解酶含量与菌体湿重。

BSM培养基：H₃PO₄ 31.4mL/L，KOH 4.13g/L，K₂SO₄ 18.2g/L，CaSO₄ 0.93g/L，MgSO₄ ^.7 H₂O 14.9g/L，甘油(Glycerol)40.0g/L，溶剂为水，接种前用氨水调pH到5.0-5.5，并加4.35mL/L的PTM1。

PTM1配方：H₃BO₃ 0.02g/L，CuSO₄·5H₂O 6.0g/L，MnSO₄·H₂O 3.0g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2g/L，CoCl₂ 0.5g/L，NaI 0.08g/L，ZnCl₂ 20.0g/L，FeSO₄·7 H₂O 65.0g/L，生物素0.2g/L，5.0mL/L的H₂SO₄，ddH₂O定容至1L。

2.水解反应及酶活测定

(1)菌体湿重测定

取2mL发酵液置于预称重的2mL离心管内，5000rpm离心5min弃上清，用超纯水洗两遍，进行同样的离心操作后，再用超纯水重悬菌体并转入已经称重的离心管内离心，弃上清，称重重量减去离心管重量为细胞湿重。每次测定测3个平行组取平均值作为此次取样所得菌体湿重。

(2)腺苷水解酶含量测定：

发酵液中腺苷水解酶蛋白含量是Elisa试剂盒定量，发酵上清液中目的蛋白的测定方法及注意事项参考南京金斯瑞生物科技有限公司的His Tag ELISA Detection Kit的使用方法。

(3)酶活测定：

HPLC测定腺苷水解酶活性：

步骤1发酵液于4℃下10000rpm离心10分钟去除菌体沉淀，上清液通过10KDa的超滤膜，再过0.22μm的水系滤膜，取截留液，得到浓缩10倍的粗酶液样品。

30℃下的50mM Tris pH 7.0中，添加1mM腺苷，500μL粗酶液，反应混合物的总体积为1mL，30℃反应24h，取出20μL等分试样，沸水煮沸5min终止反应，腺苷和腺嘌呤的相对量通过HPLC确定，等量灭活的酶液作为空白对照。酶活力单位(U)定义为在30℃下，每分钟催化产生1μmol腺嘌呤所需的酶量。

本发明对底物腺苷、产物腺嘌呤的高效液相色谱(HPLC)检测方法建立如下：

仪器:Waters 1525e2695高效液相色谱仪、Waters 2489紫外检测器

1)产物腺嘌呤得率检测方法

①色谱柱：

C18柱；

②流动相：A液为磷酸盐缓冲液(pH＝4.8)，B液为乙腈；梯度洗脱(0～5min，100％A；5～15min，97％A；15～30min，90％A；30～40min，100％A；流速：1.0mL·min^-1；

③检测波长：254nm；

④进样量：10μL；

⑤柱温：40℃；

2)样品处理

反应液离心除去可见的沉淀，稀释相应倍数后过膜，之后进行HPLC检测。

形成的腺嘌呤的量是通过对产生的腺嘌呤的峰进行积分，然后通过标准曲线将其转换为腺嘌呤的量来确定的。

标准曲线绘制:

将底物腺苷配置成终浓度为0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM的标准样品以及将产物腺嘌呤配置成终浓度为2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM的标准样品，按照上述液相色谱方法进行测定，以样品浓度为x轴、物质峰面积为y轴，绘制样品的标准曲线。

计算的腺嘌呤对应方程：Y＝53.33X+3.992，R²:0.9998；对应线性范围：0.4747～15.19μg/mL。

(4)腺苷水解反应：

步骤1发酵液于4℃下10000rpm离心10分钟去除菌体沉淀，上清液通过10KDa的超滤膜浓缩，再过0.22μm的水系滤膜，取截留液，得到浓缩10倍的粗酶液样品。配制100mL酶反应体系：由50mL 50mM、pH 7.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液、20g腺苷、50mL粗酶液构成。在30℃下反应24h。用高效液相色谱测定产物腺嘌呤的生成浓度，测定条件同上。根据图6，腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤，反应的转化率>99％。

实施例3：

将实施例2酶活测定及腺苷水解反应中腺苷改为鸟苷，菌体湿重测定方法相同，腺苷水解酶含量测定、酶活和水解反应具体为：

腺苷水解酶含量测定：实施例2步骤1发酵液在12000rpm高速离心20min，取上清液通过10KDa的超滤膜浓缩，再过0.22μm的水系滤膜，取截留液，得到浓缩10倍的粗酶液样品。测定蛋白的总浓度，具体方法同实施例2。

与实施例2不同的是，腺苷水解酶酶活(U/mL)定义为单位时间内每产生1μmol鸟嘌呤所需的酶量。

水解反应：配制100mL酶反应体系：由50mL 50mM、pH 6.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液、10g鸟苷、50mL粗酶液构成。在30℃下反应24h。用高效液相色谱测定产物鸟嘌呤的生成浓度。

与实施例2不同的HPLC条件：

仪器:与实施例2相同

①色谱柱：

XB-C18(250mm×4.6mm，5μm)；

②流动相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱(0～10min，4％A→4.8％A；10～10.01min，4.8％A→5.5％A；10.01～15min，5.5％A→7％A；15～20min，7％A→12％A；20～27min，12％A→4％A；27～40min，4％A→4％A)；流速：1.0mL·min-1；

③检测波长：260nm；

④柱温：30℃；

⑤进样量：10μL

将底物鸟苷配置成终浓度为0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM的标准样品以及将产物鸟嘌呤配置成终浓度为2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM的标准样品，按照上述液相色谱方法进行测定，以样品浓度为x轴、物质峰面积为y轴，绘制样品的标准曲线。计算的鸟嘌呤对应方程：Y＝28.96X+0.9 672，R²:0.9997，对应线性范围：0.120 0～3.840μg/mL。

表2、菌株WC-5的发酵情况

表2中的实验结果均为三次重复试验平均值±SD。

通过上述实验数据可知：采用补料分批的发酵方式对菌株WC-5进行5L发酵罐放大培养，全程通过控制甘油流加速度、甲醇流加速度以及转速来控制溶氧，每隔一定时间取样检测菌体湿重与酶活力，直到发酵结束后放罐。经甲醇诱导85h(发酵120h)后，菌体湿重达到345g/L，目的蛋白表达量最高为500mg/L，发酵液酶活力实施例2最高为41.11U/mL，实施例3最高为38.56U/mL。

本发明为毕赤酵母生产腺苷水解酶提供了参考价值，对将来腺苷水解酶的工业化生产具有重要意义。

上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明保护范围的限制，但凡采用本发明的设计原理，以及在此基础上进行非创造性劳动而作出的变化，均应属于本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种重组毕赤酵母工程菌及在制备嘌呤中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 915

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

atgagattgc caattttttt ggatactgat ccaggtattg atgatgctgt tgctattgct 60

gctgctattt ttgctccaga attggatttg caattgatga ctactgttgc tggtaacgtt 120

tctgttgaaa agactactag aaacgctttg caattgttgc atttttggaa cgctgaaatt 180

ccattggctc aaggtgctgc tgttccattg gttagagctc caagagatgc tgcttctgtt 240

catggtgaat ctggtatggc tggttacgat tttgttgaac ataacagaaa gccattgggt 300

attccagctt ttttggctat tagagatgct ttgatgagag ctccagaacc agttactttg 360

gttgctattg gtccattgac taacattgct ttgttgttgt ctcaatgtcc agaatgtaag 420

ccatacatta gaagattggt tattatgggt ggttctgctg gtagaggtaa ctgtactcca 480

aacgctgaat ttaacattgc tgctgatcca gaagctgctg cttgtgtttt tagatctggt 540

attgaaattg ttatgtgtgg tttggatgtt actaaccaag ctattttgac tccagattac 600

ttgtctactt tgccacaatt gaacagaact ggtaagatgt tgcatgcttt gttttctcat 660

tacagatctg gttctatgca atctggtttg agaatgcatg atttgtgtgc tattgcttgg 720

ttggttagac cagatttgtt tactttgaag ccatgttttg ttgctgttga aactcaaggt 780

gaatttactt ctggtactac tgttgttgat attgatggtt gtttgggtaa gccagctaac 840

gttcaagttg ctttggattt ggatgttaag ggttttcaac aatgggttgc tgaagttttg 900

gctttggctt cttaa 915

<210> 2

<211> 915

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

atgcccgtag attcttctca taagacagct agcccacttc cacctcgtaa aagagcaaag 60

acggaagaag aaaaggagca gcgtcgagtg gaacgtatcc tacgtaatag gagagcggcc 120

catgcttcca gagagaagaa acgaagacac gttgaatttc tggaaaacca cgtcgtcgac 180

ctggaatctg cacttcaaga atcagccaaa gccactaaca agttgaaaga aatacaagat 240

atcattgttt caaggttgga agccttaggt ggtaccgtct cagatttgga tttaacagtt 300

ccggaagtcg attttcccaa atcttctgat ttggaaccca tgtctgatct ctcaacttct 360

tcgaaatcgg agaaagcatc tacatccact cgcagatctt tgactgagga tctggacgaa 420

gatgacgtcg ctgaatatga cgacgaagaa gaggacgaag agttacccag gaaaatgaaa 480

gtcttaaacg acaaaaacaa gagcacatct atcaagcagg agaagttgaa tgaacttcca 540

tctcctttgt catccgattt ttcagacgta gatgaagaaa agtcaactct cacacattta 600

aagttgcaac agcaacaaca acaaccagta gacaattatg tttctactcc tttgagtctt 660

ccggaggatt cagttgattt tattaaccca ggtaacttaa aaatagagtc cgatgagaac 720

ttcttgttga gttcaaatac tttacaaata aaacacgaaa atgacaccga ctacattact 780

acagctccat caggttccat caatgatttt tttaattctt atgacattag cgagtcgaat 840

cggttgcatc atccagcagc accatttacc gctaatgcat ttgatttaaa tgactttgta 900

ttcttccagg aatag 915

<210> 3

<211> 1569

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

atgaagtttt ctgctggtgc cgtcctgtca tggtcctccc tgctgctcgc ctcctctgtt 60

ttcgcccaac aagaggctgt ggcccctgaa gactccgctg tcgttaagtt ggccaccgac 120

tccttcaatg agtacattca gtcgcacgac ttggtgcttg cggagttttt tgctccatgg 180

tgtggccact gtaagaacat ggctcctgaa tacgttaaag ccgccgagac tttagttgag 240

aaaaacatta ccttggccca gatcgactgt actgaaaacc aggatctgtg tatggaacac 300

aacattccag ggttcccaag cttgaagatt ttcaaaaaca gcgatgttaa caactcgatc 360

gattacgagg gacctagaac tgccgaggcc attgtccaat tcatgatcaa gcaaagccaa 420

ccggctgtcg ccgttgttgc tgatctacca gcttaccttg ctaacgagac ttttgtcact 480

ccagttatcg tccaatccgg taagattgac gccgacttca acgccacctt ttactccatg 540

gccaacaaac acttcaacga ctacgacttt gtctccgctg aaaacgcaga cgatgatttc 600

aagctttcta tttacttgcc ctccgccatg gacgagcctg tagtatacaa cggtaagaaa 660

gccgatatcg ctgacgctga tgtttttgaa aaatggttgc aagtggaagc cttgccctac 720

tttggtgaaa tcgacggttc cgttttcgcc caatacgtcg aaagcggttt gcctttgggt 780

tacttattct acaatgacga ggaagaattg gaagaataca agcctctctt taccgagttg 840

gccaaaaaga acagaggtct aatgaacttt gttagcatcg atgccagaaa attcggcaga 900

cacgccggca acttgaacat gaaggaacaa ttccctctat ttgccatcca cgacatgact 960

gaagacttga agtacggttt gcctcaactc tctgaagagg cgtttgacga attgagcgac 1020

aagatcgtgt tggagtctaa ggctattgaa tctttggtta aggacttctt gaaaggtgat 1080

gcctccccaa tcgtgaagtc ccaagagatc ttcgagaacc aagattcctc tgtcttccaa 1140

ttggtcggta agaaccatga cgaaatcgtc aacgacccaa agaaggacgt tcttgttttg 1200

tactatgccc catggtgtgg tcactgtaag agattggccc caacttacca agaactagct 1260

gatacctacg ccaacgccac atccgacgtt ttgattgcta aactagacca cactgaaaac 1320

gatgtcagag gcgtcgtaat tgaaggttac ccaacaatcg tcttataccc aggtggtaag 1380

aagtccgaat ctgttgtgta ccaaggttca agatccttgg actctttatt cgacttcatc 1440

aaggaaaacg gtcacttcga cgtcgacggt aaggccttgt acgaagaagc ccaggaaaaa 1500

gctgctgagg aagccgatgc tgacgctgaa ttggctgacg aagaagatgc cattcacgat 1560

gaattgtaa 1569

Claims (9)

1.一种重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述重组毕赤酵母工程菌是将SEQ ID NO.1所示基因Rihc-2、SEQ ID NO.2所示基因Hac1和SEQ ID NO.3所示基因PDI导入宿主菌构建获得的；所述宿主菌为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。

2.如权利要求1所述重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述基因Rihc-2连接到质粒pPIC9K上，构建表达载体pPIC9K-Rihc-2，导入宿主菌。

3.如权利要求1所述重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述基因Hac1连接到载体pPICZC中，构建表达载体pPICZC-Hac1，导入宿主菌；所述基因PDI连接到载体pPICZC中，构建表达载体pPICZC-PDI，导入宿主菌；

所述载体pPICZC按如下方法构建：以F7质粒为模板，利用引物Cre-F和Cre-R扩增Tcre基因片段；以pPICZα质粒为模板，利用引物Ori-Paox-F和Paox-R扩增Pox基因片段，利用引物Cre-Taox-F和Taox-R扩增Taox基因片段，利用引物Taox反向-R和Zeo反向-F扩增基因片段pP，利用引物ori-F和ori-R扩增基因片段Ori；以pPIC9K质粒为模板，利用引物Zeo-His4-F和引物His4-R扩增HIS4基因片段；将上述Tcre基因片段、Pox基因片段、Taox基因片段、基因片段pP、基因片段Ori和HIS4基因片段共6个片段连接，获得载体pPICZC；

4.如权利要求1所述重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述重组毕赤酵母工程菌按如下方法构建：将表达载体pPIC9K-Rihc-2电转入宿主菌中，筛选得到单拷贝腺苷水解酶基因的工程菌，利用转化后载体扩增方法获得多拷贝腺苷水解酶基因的工程菌；再利用抗性可循环表达载体技术将Hac1基因和PDI基因整合进基因组，得到重组毕赤酵母工程菌。

5.一种权利要求1所述重组毕赤酵母在制备嘌呤中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用方法为：以重组毕赤酵母经发酵培养获得的上清液浓缩后为催化剂，加入底物，以pH6.0-7.0的缓冲液为反应介质构成水解体系，在20-50℃下反应4～24h，反应液分离纯化，获得相应嘌呤；所述底物为腺苷或鸟苷。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述底物加入量以水解体系总体积计为100-500g/L。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于发酵液按如下方法制备：将重组毕赤酵母接种至含BSM培养基的发酵罐中，调pH至5.0，温度为30℃，初始转速设置为500r/min，通气量控制溶氧在20％以上；当培养基中甘油消耗完后，溶氧快速上升，随即开始以10-50ml/h/L发酵液的速度流加含PTM1 12mL/L的体积浓度50％的甘油水溶液，培养至菌体含量为150g/L；流加结束后，反应条件不变，饥饿30min后，第1-2h以3.6ml/h/L发酵液，第2-4h以7.3ml/h/L发酵液，接着以10.9ml/h/L发酵液的速度流加含PTM1 12mL/L的无水甲醇进行诱导，使生长速率在0.001-0.1h^-1，调节转速与通气量控制溶氧大于20％，发酵培养至菌体湿重达到400g/L时结束，获得含腺苷水解酶的发酵液；所述甘油水溶液体积加入量以BSM培养基体积计为200mL/3L；

所述BSM培养基：H₃PO₄ 31.4mL/L，KOH 4.13g/L，K₂SO₄ 18.2g/L，CaSO₄ 0.93g/L，MgSO₄7H₂O 14.9g/L，甘油40.0g/L，接种前用氨水调pH到5.0-5.5，并加4.35mL/L的PTM1；

PTM1配方：H₃BO₃ 0.02g/L，CuSO₄·5H₂O 6.0g/L，MnSO₄·H₂O 3.0g/L，Na₂MoO₄·2 H₂O0.2g/L，CoCl₂ 0.5g/L，NaI 0.08g/L，ZnCl₂ 20.0g/L，FeSO₄·7 H₂O 65.0g/L，生物素0.2g/L，5.0mL/L的H₂SO₄，ddH₂O定容至1L。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述重组毕赤酵母在发酵前，先进行扩大培养，再以体积浓度10％接种量接种至BSM培养基，所述扩大培养是将重组毕赤酵母接种至YPD液体培养基，30℃培养24h；YPD液体培养基：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，溶剂为水，pH自然即可。

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