CN104805025A - 一株表达植酸酶的酿酒酵母工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株表达植酸酶的酿酒酵母工程菌及应用，属于发酵工程领域。本发明所提供的酿酒酵母工程菌，是将植酸酶的编码基因与α-凝集素的编码基因融合后转化酿酒酵母CICIMY0086中，重组质粒整合到宿主的染色体DNA上，得到在细胞表面锚定表达植酸酶的菌株，植酸酶酶活达到6.4U/g(菌体湿重)。所述菌株用于玉米和木薯等原料的酒精发酵生产，不仅能够提高酒精发酵效率，而且能明显降低酒糟中的植酸含量，与宿主酿酒酵母CICIMY0086相比植酸含量降低了90％以上。本发明对于提高酒糟的利用价值，减少磷排放，以及燃料酒精的环境友好生产具有重要意义。

Description

一株表达植酸酶的酿酒酵母工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株酿酒酵母工程菌及其应用，特别是一株在细胞表面锚定表达植酸酶的酿酒酵母菌株及其应用。
背景技术
燃料酒精是一种可再生的清洁能源，国内外生产燃料酒精的原料有玉米、甘薯、木薯、甘蔗、甜菜、高粱秸秆等，目前应用于工业生产的主要是玉米类淀粉质原料。酒精糟液的处理是燃料酒精生产中的一个关键工序，糟液中含有糖分，蛋白质，纤维素，氨，磷，钾等营养成分，经浓缩处理后可用于生产动物饲料。酒精糟液中的磷主要以植酸磷的形式存在，植酸磷是一种抗营养因子，不能被动物直接吸收利用，还会影响其他矿物元素的吸收，同时，植酸磷随动物粪便排出体外后，会对环境造成污染。
植酸酶能够催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸(盐)，同时释放出与植酸(盐)结合的其它营养物质。在酒精发酵生产中，有通过外源添加植酸酶以提高酒精生产效率，降低酒糟中的植酸磷含量的研究，但是要从根本上解决植酸磷酒精发酵及酒糟利用的不利影响，还是需要利用基因工程的手段构建能够分泌表达植酸酶的酿酒酵母菌株。
发明内容
本发明提供了一株表达植酸酶的酿酒酵母工程菌Saccharomyces cerevisiae/pMGK-AG-phy，已于2015年4月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内（武汉大学第一附小对面）武汉大学保藏中心，保藏编号CCTCC M 2015190。
本发明提供的酿酒酵母工程菌，是将植酸酶的编码基因phy和α-凝集素的编码基因AGα1融合后导入酿酒酵母CICIMY0086(江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心保藏)中，得到的在细胞表面锚定表达植酸酶的菌株。
所述植酸酶的氨基酸序列的GenBank号为NP_415500；所述α-凝集素的GenBank号为AAA34417。
所述植酸酶的编码基因的核苷酸序列的GenBank号为946206；所述α-凝集素的编码基因的核苷酸序列的GenBank号为M28164。
所述植酸酶的编码基因phy通过表达载体pMGK-AG导入酿酒酵母；所述表达载体pMGK-AG包含有α-凝集素编码基因的核苷酸序列。
所述酿酒酵母工程菌Saccharomyces cerevisiae/pMGK-AG-phy优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)PHY。
酿酒酵母PHY由以下步骤获得：
(1)构建重组质粒pMGK-AG-phy，流程如图4所示。以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，PCR扩增得到植酸酶基因phy片段；将扩增得到的phy基因与质粒pPIC9k连接，得到重组质粒pPIC9k-phy，以此为模板PCR扩增得到含信号肽的sphy基因，与表面展示载体pMGK-AG(江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心保藏)连接，得到重组载体pMGK-AG-phy。
(2)将重组载体pMGK-AG-phy转化酿酒酵母CICIMY0086，获得重组酵母PHY
酿酒酵母PHY的细胞为椭圆形，菌落形态特征是菌落凸起、光滑、乳白色、边缘整齐； 最适生长温度30℃，最适生长pH为5.5。
酿酒酵母PHY的植酸酶酶活为6.4U/g(菌体湿重)，酶活测定采用钼蓝法，具体操作：将800μL 6.25mmol/L的植酸钠溶液37℃预热10min，加入200μL上清液或全细胞催化剂，37℃反应30min，立即加入1mL 5％的三氯乙酸终止反应，加入1mL显色液(1.5％钼酸铵溶液，2.7％硫酸亚铁，4:1比例混合，现用现配)，室温下静置10min，8000r/min离心5min，测定其在700nm处的吸光值。酶活定义为：在37℃、pH 5.0条件下，每分钟从5.0mmol/L植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷所需的酶量定义为1个酶活力单位。
本发明还提供了一种利用上述酿酒酵母工程菌生产酒精的应用。
本发明提供的生产酒精的应用是以玉米粉/木薯培养基为发酵培养基，配制方法为：按1:3(w/v)的比例将玉米粉/木薯粉与去离子水混合，调pH至6.0，加入耐高温α淀粉酶(10U/g)，加热料液至95℃，维持2h，降至室温后调pH至4.5，添加去离子水以弥补水分损失，高压蒸汽灭菌，降温后加入糖化酶(130U/g)和尿素(终浓度0.05％)。
本发明所提供的酿酒酵母工程菌，在以玉米粉/木薯粉为原料的同步糖化发酵实验表明，生长速度高于出发菌株，同时酒精产量相较出发菌株提高了5.6％。更为重要的是发酵后酒糟中植酸磷含量与对照相比降低了91％。构建的表面展示表达植酸酶的重组工业酿酒酵母能够有效降低植酸含量，提高了酒糟的利用价值，减少磷排放，对燃料酒精的环境友好生产具有重要的意义。
附图说明：
图1为植酸酶基因PCR产物和重组质粒pPIC9k-phy酶切产物电泳图
图2为带信号肽的植酸酶基因PCR产物和重组质粒pMGK-AG-phy酶切产物电泳图
图3为酿酒酵母转化子的染色体DNA的PCR产物电泳图
图4为重组质粒pMGK-AG-phy的构建流程图
图5为酿酒酵母工程菌PHY发酵过程中的葡萄糖和酒精变化图
图6为酿酒酵母工程菌PHY发酵的过程中，培养基干物质中的植酸磷含量变化曲线
具体实施方式：
下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施1、构建酿酒酵母工程菌(Saccharomyces cerevisiae)PHY。
一、含有植酸酶编码基因的重组质粒pPIC9K-phy的构建
根据已报道的大肠杆菌植酸酶的编码基因phy的核苷酸序列(phy基因序列的GenBank号为946206)，设计如下引物，在下游引物中引入EcoR I酶切位点(用下划线标出)。
上游引物Phy1：ATGAAAGCGATCTTAATCCCAT
下游引物Phy2：CCGGAATTCTTACAAACTGCACGCCGGTA
以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，以Phy1、Phy2为引物，进行PCR扩增。将得到的PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示，得到一条约1300bp的特异性条带，其大小与GenBank已公布的基因长度一致，经进一步DNA测序表明扩增得到植酸酶基因。将扩增得到的phy基因用Pfu补平后与SnaB I酶切后的质粒pPIC9k(江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心保藏)连接，构建了重组质粒pPIC9k-phy。利用限制性内切酶SalⅠ进行酶切验 证，结果见图1，酶切得到大小约3000bp和7500bp的带，与预期相当，酶切验证结果证明pPIC9k-phy的结构正确。图1中，泳道M为DL 15000DNA Marker，泳道1为phy的PCR产物，泳道2为SnaB I酶切后的质粒pPIC9k，泳道3为Sal I酶切后的重组质粒pPIC9k-phy。
二、含有植酸酶编码基因的重组质粒pMGK-AG-phy的构建
根据pPIC9K中的alpha因子信号肽的核苷酸序列设计上游引物p1，引入EcoR I酶切位点，p1核苷酸序列如下
上游引物p1：CCGGAATTCCGATGAGATTTCCTTCAA
以重组质粒pPIC9k-phy为模板，以p1和Phy2为上下游引物，进行PCR扩增。将得到的PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示，得到一条约1500bp的特异性条带，其大小与预期相同，表明扩增得到含信号肽植酸酶基因sphy。将PCR产物用EcoR I酶切后用核酸酶S1处理得到平末端片段，同样方法处理表面展示载体pMGK-AG(江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心保藏)，T4连接酶16℃过夜连接，构建表达载体pMGK-AG-phy。利用限制性内切酶HindⅢ进行酶切验证，结果见图2，酶切得到大小约1000bp、4000bp和6000bp的带，与预期相当，酶切验证结果证明pMGK-AG-phy的结构正确。图2中，泳道M为DL 15000DNA Marker，泳道1为sphy的PCR产物，泳道2为EcoR I酶切后用核酸酶S1处理的质粒pMGK-AG，泳道3为HindⅢ酶切后的重组质粒pMGK-AG-phy。
重组质粒pMGK-AG-phy的构建流程如图4所示。
三、重组质粒pMGK-AG-phy转化酿酒酵母CICIMY0086
将重组质粒pMGK-AG-phy用SacⅡ酶切线性化后转化工业酿酒酵母，转化液涂布添加了300μg/mL G418的YPD固体平板，随机挑取转化子提取染色体DNA，以Phy1和Phy2为引物进行PCR扩增。将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图3所示，得到一条约1300bp的特异性条带，与植酸酶基因的大小相同，该PCR产物经进一步测序表明植酸酶基因成功整合到酵母染色体上。图2中，泳道M为DL 5000DNA Marker，泳道1-3为以酵母转化子的染色体DNA为模板的PCR产物，泳道4为以出发菌染色体DNA为模板的PCR产物
挑取阳性转化子与出发菌株分别接种于YPD培养基，培养16h后，收集细胞，进行植酸酶酶活力测定。酶活测定采用钼蓝法，具体操作：将800μL 6.25mmol/L的植酸钠溶液37℃预热10min，加入200μL上清液或全细胞催化剂，37℃反应30min，立即加入1mL 5％的三氯乙酸终止反应，加入1mL显色液(1.5％钼酸铵溶液，2.7％硫酸亚铁，4:1比例混合，现用现配)，室温下静置10min，8000r/min离心5min，测定其在700nm处的吸光值。酶活定义为：在37℃、pH 5.0条件下，每分钟从5.0mmol/L植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷所需的酶量定义为1个酶活力单位。
植酸酶酶活最高的转化子即为酿酒酵母工程菌PHY，酶活为6.4U/g(菌体湿重)。出发菌株中未测得任何酶活，说明植酸酶基因整合在酵母染色体上并成功表达；7#转化子细胞重悬液经超声波破碎后酶活为5.8U/g，且转化子上清液中没有检测到酶活，说明植酸酶在酵母细胞表面锚定表达。
实施例2、利用酿酒酵母工程菌PHY发酵玉米粉生产酒精的应用
将酿酒酵母工程菌PHY和出发菌株分别接种于20mL种子培养基，30℃200r/min培养12 h，以1％的接种量转接新的种子培养基，30℃200r/min培养18h，作为发酵实验的种子液。发酵培养基装液量为135mL，接种量为10％，30℃静止发酵。为保证数据可靠性，每组实验做三个平行，每隔8h取样，发酵56h。
为进一步验证植酸酶在酒精发酵中的作用，进行了外源添加植酸酶的工业酿酒酵母发酵实验，发酵方法同上。
所述种子培养基配方如下：2％葡萄糖，0.85％酵母粉，0.13％氯化铵，0.01％硫酸镁，0.006％氯化钙，115℃高压蒸汽灭菌。
所述发酵培养基配制方法如下：按1:3(w/v)的比例将玉米粉与去离子水混合，调pH至6.0，加入耐高温α淀粉酶(10U/g)，加热料液至95℃，维持2h，降至室温后调pH至4.5，添加去离子水以弥补水分损失，121℃高压蒸汽灭菌，降温后加入糖化酶(130U/g)和尿素(终浓度0.05％)。
用高效液相色谱分析发酵过程中葡萄糖的消耗和酒精的产生，色谱柱为Aminex HPX-87H离子交换柱，流动相为10mmol/L H2SO4，流速0.8mL/min，柱温65℃；发酵初始的总糖采用酸水解法测定，DNS法测还原糖，以公式：发酵效率＝实测发酵酒精浓度/(初始总糖浓度*0.511)*100％计算发酵效率。
植酸磷含量测定采用沉淀消解法，取1g烘干后的发酵混合物，加入1.2％的盐酸50mL，200r/min振荡1h，定性滤纸过滤，取10mL滤液，加入1％的三氯化铁4mL，沸水浴30min，冷却后离心去上清，向沉淀物中加入5mL浓硝酸、2mL浓硫酸，加热消解至沉淀全部溶解，定容至100mL；取定容后的消解液10mL，加入0.8mol/L浓硫酸4mL、10％钼酸铵0.4mL、去离子水30mL，摇匀后加入2％抗坏血酸0.5mL，定容至50mL，显色20min，波长660nm处测定吸光值。
酿酒酵母工程菌PHY在玉米粉培养基中的发酵情况如图5所示。重组酵母PHY酒精生产速率与出发菌株相当，发酵48h，酒精产量最高为113g/L，相比于对照出发菌株酒精产量(107g/L)，提高了5.6％；发酵初始的总糖浓度为245g/L，重组酵母PHY及出发菌株的发酵效率分别为90.25％和85.5％；发酵前8h，葡萄糖浓度有明显上升，这是由于糖化酶持续水解淀粉糊精，生产葡萄糖，重组酵母PHY发酵过程中的葡萄糖消耗速率略快于出发菌株。外源添加植酸酶的出发菌株发酵情况与植酸酶重组酵母表现相似，酒精产量和葡萄糖消耗速率耗糖略快于出发菌株。
酿酒酵母工程菌PHY发酵的过程中，培养基干物质中的植酸磷含量变化情况如图6所示。发酵前期，出发菌株发酵液固形物中植酸磷含量有所升高，这是由于随发酵进行，发酵液中固形物比例减少，植酸磷得到浓缩。重组酵母PHY及外源添加植酸酶的出发菌株发酵液固形物中的植酸磷含量明显降低。出发菌株发酵结束后的干酒糟中植酸磷含量为0.68％，而重组酵母PHY中的植酸磷含量仅0.06％，降低了91％，外源添加植酸酶的出发菌株中的植酸磷含量也明显减少。植酸磷含量的降低提高了酒糟的饲用价值，有利于减少磷的排放。
该酿酒酵母工程菌在以玉米粉为原料的同步糖化发酵中，表现出优于出发菌株的发酵性能，生长速率和酒精产量都有所提高，发酵后酒糟中植酸磷含量与对照相比降低了91％。目前，我国年产玉米酒糟350万吨左右，其中大部分用作畜禽饲料，研究构建的酿酒酵母工程菌 能有效水解植酸磷，提高了全价干酒糟的饲用价值，有利于环境的保护。

Claims (7)

1.一株用于酒精发酵的酿酒酵母工程菌，是将植酸酶的编码基因phy和α-凝集素的编码基因AGα1基因融合后导入酿酒酵母CICIMY0086中，得到的在细胞表面锚定表达植酸酶的菌株，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015190。
2.一种酿酒酵母CCTCC M 2015190的构建方法，其特征是运用基因工程手段，以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，PCR扩增得到植酸酶基因phy片段，目的基因定向克隆于质粒pPIC9k的SnaB I位点，得到重组质粒pPIC9k-phy；PCR扩增包含α-因子分泌信号肽和植酸酶的基因片段，定向插入于pMGK-AG载体中，获得重组酵母表达质粒pMGK-AG-phy；将重组酵母表达质粒用SacⅡ酶切线性化，电转化法转化酿酒酵母CICIMY0086，在含有G418抗生素的培养基中筛选，得到表面展示表达植酸酶的重组菌CCTCC M 2015190。
3.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于所述植酸酶的氨基酸序列的GenBank号为NP_415500；所述α-凝集素的GenBank号为AAA34417。
4.根据权利要求2所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于所述植酸酶的编码基因的核苷酸序列的GenBank号为946206；所述α-凝集素的编码基因的核苷酸序列的GenBank号为M28164。
5.根据权利要求1-3所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于所述植酸酶的编码基因phy和α-凝集素的编码基因AG基因融合后插入到α-因子分泌信号肽序列下游。
6.根据权利要求1-5任一项所述的酿酒酵母工程菌应用于以玉米或木薯为原料的酒精生产，种子培养基：2％葡萄糖，0.85％酵母粉，0.13％氯化铵，0.01％硫酸镁，0.006％氯化钙，30℃用于酿酒酵母发酵前的种子培养。
发酵培养基：按1:3(w/v)的比例将玉米粉或木薯粉与去离子水混合，调pH至6.0，加入高温α淀粉酶(10U/g)，加热料液至95℃，维持2h，降至室温后调pH至4.5，添加去离子水以弥补水分损失，高压蒸汽灭菌，降温后加入糖化酶(130U/g)和尿素(终浓度0.05％)。
7.根据权利要求6所述的应用，酒精发酵效率和原料利用效率都能得到提高，酒糟中的植酸含量降低90％以上。
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