CN104140977A - Cdt-2的新用途以及利用其促进微生物细胞转运木寡糖的方法及其应用 - Google Patents
Cdt-2的新用途以及利用其促进微生物细胞转运木寡糖的方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种促进微生物细胞转运和/或水解木寡糖的方法及其应用。实验证明纤维寡糖转运蛋白CDT-2还具有木寡糖转运能力，β-木糖苷酶GH43-2对木寡糖具有水解作用，因此本发明将cdt-2基因和/或gh43-2基因导入微生物菌株中，得到的重组微生物菌株与出发菌株相比，获得或提高了木寡糖由胞外转运至胞内的能力和/或水解为木糖的能力。本发明木寡糖转运蛋白CDT-2的发现以及β-木糖苷酶GH43-2的应用，为改造酵母直接利用来源于半纤维素降解得到的木寡糖生产生物化学品提供了思路，也可以将cdt-2和gh43-2与cdt-1和gh1-1共同在含有木糖代谢途径的酿酒酵母中表达来实现葡萄糖、木糖、纤维寡糖和木寡糖混合糖的共发酵来生产生物化学品，从而大大节约生产成本。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及基因cdt-2在影响细胞对木寡糖转运上的新用途，即通过表达cdt-2基因可使微生物菌株获得或提高转运木寡糖的能力，以及利用该基因和β-木糖苷酶编码基因gh43-2共同导入微生物菌株后，微生物菌株可获得或提高木寡糖转运和水解木寡糖的能力。
背景技术
生物质降解主要是通过一些木质纤维素降解菌株，例如粗糙脉孢菌等所分泌的木质纤维素降解酶来将生物质分解为不同的单糖和多糖以供菌体利用。产生的生物质糖包括葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等单糖以及纤维寡糖和木寡糖等寡糖。之后这些生物质糖在不同的糖转运蛋白的作用下转运进入胞内以供菌体利用。此外，由于寡糖同时也是很多木质纤维素酶的诱导物，寡糖不仅仅作为营养物质被糖转运蛋白转运，同时作为诱导物也被转运。因此，糖转运蛋白在真菌的生长中起着至关重要的作用。同时糖转运蛋白的发现，在改造酵母菌株用于利用生物质糖生产生物能源及生物化学品中具有重大的潜力。
尽管大家对于糖转运蛋白的研究越来越多，但是关于寡糖转运蛋白的信息很少，尤其是木寡糖转运蛋白。目前的木寡糖转运体系多是在细菌中发现的，而且它们都是ABC型木寡糖转运蛋白，例如热紫链霉菌（Streptomyces thermoviolaceus）中的xleE（详见参考文献:Tsujibo,H.,et al.,2004.Molecular characterization of ahigh-affinity xylobiose transporter of Streptomyces thermoviolaceus OPC-520and its transcriptional regulation.J.Bacteriol.186,1029-37.）、嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）中的xynEFG（详见参考文献:Shulami,S.,et al.,2007.A two-component system regulates the expressionof an ABC transporter for xylo-oligosaccharides in Geobacillusstearothermophilus.Appl.Environ.Microbiol.73,874-84.）以及微生物（Caldanaerobius polysaccharolyticus，无中文名称）中的xyn10A（详见参考文献:Han,Y.,et al.,2012.Biochemical and structural insights into xylanutilization by the thermophilic bacterium Caldanaerobius polysaccharolyticus.J.Biol.Chem.287,34946-60.）。到目前为止，在真核生物中有两个木寡糖转运蛋白被发现，一个是来自浅白隐球酵母（Cryptococcus albidus）CCY17-4-1，另一个是来自茁芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）。
不同于细菌木寡糖转运蛋白，丝状真菌的糖转运蛋白根据转运能量的来源可以将转运蛋白分为初级主动转运蛋白(primary active transporters)和次级转运蛋白(secondary transporters)。初级主动转运蛋白通过利用ATP水解、光子吸收、电子流、底物脱羧或甲基转移反应等释放的能量实现转运过程，典型代表是ATP结合盒(ATPbinding cassette，ABC)超家族；而次级转运蛋白则是利用由于物质在膜内外浓度不同造成的电化学渗透势能来转运底物，典型代表是主要协助转运蛋白超家族(majorfacilitator superfamily，MFS)（详见参考文献：孙林峰，王佳伟，颜宁，MFS超家族转运蛋白结构与分子机制的研究.生命科学,第23卷第11期,1052-1056.）。
CDT-1和CDT-2是两个来自粗糙脉孢菌（一种丝状真菌）的纤维寡糖转运蛋白，它们同属于MFS型转运蛋白，同时它们也是首次被发现的丝状真菌纤维寡糖转运蛋白（详见参考文献：Galazka,J.M.,et al.,2010.Cellodextrin transport in yeast forimproved biofuel production.Science.330,84-86.）。随着CDT-1的发现，很快它就被应用到了酿酒酵母改造中来，最有突破性的是在酿酒酵母中引入CDT-1纤维寡糖转运蛋白基因以及一个同样来自粗糙脉孢菌的β-葡萄糖苷酶基因，使酿酒酵母可以直接转运纤维寡糖至胞内并在胞内进行水解（存在于生物质纤维素酶降解后的混合糖中），还可利用它生产乙醇及木糖醇等其它化合物。作为纤维寡糖转运蛋白，CDT-1和CDT-2已申请专利，公开号为CN 102625844A。尽管CDT-2同时也被鉴定为纤维寡糖转运蛋白，但与CDT-1相比，对于它在粗糙脉孢菌中的功能及调控则知之甚少，并且由于在酵母中CDT-2对于纤维寡糖的转运能力不如CDT-1的效果好，CDT-2较弱的纤维寡糖转运能力并没有像CDT-1那样被用于改造酵母菌株用于生产生物乙醇等生物化学品。
由于越来越严重的石油能源危机以及石油燃料造成的环境污染，寻求新的、更加安全的新能源已经势在必行，而利用大量廉价的生物质（例如玉米秸秆，稻草，麦秆等）进行生物能源的生产为人类可持续发展提供了希望。
生物质来源的混合糖的共发酵一直是利用大量廉价生物质生产生物产品和生物能源的重要制约因素。生物质来源糖包括单糖，同时也有大量的寡糖产生。就如纤维素水解之后会产生大量的葡萄糖的同时也会产生很多纤维寡糖一样，半纤维素水解后伴随着木糖的产生同样也会有木寡糖的产生，而为了实现生物质糖（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、纤维寡糖、木寡糖等）的全利用，木寡糖转运蛋白也会同纤维寡糖转运蛋白和木糖转运蛋白一样发挥重要的作用。但是作为生物产品及生物乙醇的理想生产菌株，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）只能利用葡萄糖。为了使酿酒酵母可以利用纤维寡糖、木寡糖和木糖，需要对菌株进行改造，除了胞内代谢途径的改造（例如木糖代谢途径的改造，使酿酒酵母可以代谢木糖）之外，还包括各种糖转运途径的改造（例如纤维寡糖转运蛋白和木糖转运蛋白的改造），其中木寡糖转运蛋白就为木寡糖转运至胞内的改造提供了条件。
发明内容
本发明的一个目的在于提供蛋白CDT-2的一种新应用，即将其作为木寡糖转运蛋白的应用。
一方面，本发明提供CDT-2蛋白的一种新用途，即作为木寡糖转运蛋白，可将木寡糖由微生物的胞外转运至胞内，进而加以利用。
所述CDT-2蛋白的氨基酸残基序列如序列表中序列1所示，编码CDT-2蛋白的基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
具体来讲，所述CDT-2蛋白为：
1）来源于粗糙脉孢菌氨基酸残基序列如序列表中序列1所示的蛋白；
2）以序列表中序列2所示cdt-2基因编码的蛋白；
3）与序列表中序列1氨基酸残基序列全长或局部结构域同源度在75％以上的蛋白；该同源度在75％以上的蛋白来自于但不限于以下菌：嗜热毁丝菌（Myceliophthorathermophila）、球毛壳菌（Chaetomium globosum）、柄孢霉（Podospora anserina）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、玉米赤霉（Gibberella zeae）、尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）、土曲霉（Aspergillus terreus）、鞭毛藻丛赤壳菌（Nectria haematococca）、斯梭孢壳霉（Thielavia terrestris）、绿色木霉（Trichoderma virens）、肉原毛平革菌（Phanerochaete carnosa）、黑曲霉（Aspergillus niger）、里氏木霉（Trichoderma reesei）、树干毕赤酵母（Scheffersomyces stipitis）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）等。
所述微生物包括但不限于以下菌：酵母属（Saccharomyces sp.）的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、摩纳酵母（Saccharomyces monacensis）、贝酵母（Saccharomyces bayanus）、巴氏酵母（Saccharomyces pastorianus）、卡氏酵母（Saccharomyces carlsbergensis）、裂殖酵母（Saccharomyces pombe），克鲁维酵母菌属（Kluyveromyces sp.）的马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxiamus）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、脆壁克鲁维酵母（Kluyveromycesfragilis），树干毕赤酵母（Pichia stipites）、嗜热侧孢霉（Sporotrichumthermophile）、休哈塔假丝酵母（Candida shehatae）、热带假丝酵母（Candidatropicalis）、粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）、运动发酵单孢菌（Zymomonasmobilis）、梭状芽孢杆菌（Clostridium sp.）、（Clostridium phytofermentans）、梭热杆菌（Clostridium thermocellum）、拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）、丙酮丁醇梭杆菌（Clostridium acetobutylicum）、热乙酸菌（Moorellathermoacetica）、大肠杆菌（Escherichia coli）、产酸克雷伯氏菌（Klebsiellaoxytoca）、厌氧杆菌（Thermoanaerobacterium saccharolyticu）和枯草杆菌（Bacillussubtilis）。
所述木寡糖是由2-10个木糖通过-1，4-糖苷键结合而成的低度聚合糖类，包括木二糖、木三糖、木四糖、木五糖等低聚木糖。
本发明利用CDT-2蛋白获得及促进微生物转运木寡糖的方法，是将CDT-2蛋白的编码基因导入上述微生物菌株中，可将木寡糖转运至微生物胞内，得到的重组微生物菌株与出发菌株相比，重组菌株获得或提高木寡糖转运能力。
本发明另一目的在于提供GH43-2蛋白作为木糖苷酶的应用。GH43-2蛋白的应用可以进一步配合CDT-2蛋白转运木寡糖的应用而使微生物获得或提高木寡糖转运和/或水解木寡糖的能力。
因此，本发明还提供GH43-2蛋白作为木糖苷酶的应用，其可将木寡糖水解为木糖。
具体来讲，所述GH43-2蛋白为：
1）来源于粗糙脉孢菌氨基酸残基序列如序列表中序列3所示的蛋白；
2）以序列表中序列4所示gh43-2基因的核苷酸序列编码的蛋白；
3）与序列表中序列3氨基酸残基序列全长或局部结构域同源度在75％以上的蛋白；该同源度在75％以上的蛋白来自于但不限于以下菌：嗜热毁丝菌（Myceliophthorathermophila）、球毛壳菌（Chaetomium globosum）、柄孢霉（Podospora anserina）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、玉米赤霉（Gibberella zeae）、尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）、土曲霉（Aspergillus terreus）、鞭毛藻丛赤壳菌（Nectria haematococca）、斯梭孢壳霉（Thielavia terrestris）、绿色木霉（Trichoderma virens）、肉原毛平革菌（Phanerochaete carnosa）、黑曲霉（Aspergillus niger）、里氏木霉（Trichoderma reesei）、树干毕赤酵母（Scheffersomyces stipitis）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）等。
所述木寡糖是由2-10个木糖通过-1,4-糖苷键结合而成的低度聚合糖类，包括木二糖、木三糖、木四糖、木五糖等低聚木糖。
本发明利用GH43-2蛋白获得及促进微生物水解木寡糖的方法，是将GH43-2蛋白的编码基因导入微生物（如上述所列）中，可将木寡糖水解为木糖，得到的重组微生物菌株与出发菌株相比，重组菌株获得或提高木寡糖水解能力。
本发明还一目的是提供一种使微生物获得或提高木寡糖转运和/或水解木寡糖的方法。该方法是将cdt-2和gh43-2导入微生物（如上述所列）中，所得微生物菌株可以将木寡糖从微生物胞外转运至胞内，并在胞内被水解为木糖，从而使微生物获得或提高木寡糖转运和/或水解木寡糖的能力。
本发明还进一步提供一种使微生物获得或提高木寡糖转运和/或水解木寡糖的重组菌，是将所述CDT-2蛋白的编码基因cdt-2和所述GH43-2蛋白的编码基因gh43-2导入所述微生物中之一得到的微生物菌株。具体的，将所述cdt-2和gh43-2基因导入酿酒酵母菌得到的cdt-2和gh43-2双基因共表达重组酿酒酵母菌株命名为E（1900+8114G）。
本发明的一个贡献，是发现并通过鉴定，确证纤维寡糖转运蛋白CDT-2（CDT-2之前被鉴定为是一个纤维寡糖转运蛋白，拥有纤维寡糖转运能力）还具有木寡糖转运能力，是一个木寡糖转运蛋白，且CDT-2是第一个被鉴定的丝状真菌（粗糙脉孢菌是丝状真菌）木寡糖转运蛋白。实验证明：在粗糙脉孢菌中，cdt-2的缺失导致菌株在木聚糖条件下存在严重的生长缺陷，说明cdt-2在粗糙脉孢菌降解和利用木聚糖中起着非常重要的作用；在粗糙脉孢菌cdt-2突变体的木寡糖转运实验以及表达有cdt-2和gh43-2（β-木糖苷酶基因）酿酒酵母的木寡糖转运实验，都共同验证了CDT-2具有木寡糖转运能力，因此CDT-2同时也是一个木寡糖转运蛋白。本发明还提供了cdt-2缺失菌株在纤维素和半纤维素条件下的转录组分析，表明CDT-2的木寡糖转运作用对于菌株在半纤维降解和利用中起着关键作用。木寡糖是粗糙脉孢菌的营养物质，同时也是粗糙脉孢菌生产半纤维素酶的诱导分子，因此在丝状真菌中，木寡糖转运蛋白的作用不仅仅是营养物质运输的作用，同时还与信号转导息息相关。因此，木寡糖转运蛋白的发现为丝状真菌半纤维素降解机理提供了更多的信息。
本发明另一贡献是通过实验确证了GH43-2为β-木糖苷酶，实验证明其对木寡糖具有水解作用，可促进转运至微生物胞内的木寡糖的利用。
本发明对于生物质特别是木寡糖通过微生物发酵转化为生物基化学品有重要用途，将cdt-2和gh43-2基因整合入拥有木糖代谢途径的酿酒酵母中，为酿酒酵母直接对于木寡糖的利用及生产生物化学品提供了思路。此外，还可以与纤维寡糖转运蛋白cdt-1基因和β-葡萄糖苷酶gh1-1基因在拥有木糖代谢途径的酿酒酵母中共表达，来实现生物质来源的大多数糖，包括葡萄糖、木糖、纤维寡糖和木寡糖的共利用生产生物能源等。本发明木寡糖转运蛋白CDT-2的发现以及β-木糖苷酶GH43-2的作用，为改造酵母直接利用来源于半纤维素降解得到的木寡糖生产生物化学品提供了思路，最终实现对生物质混合糖的共发酵，从而大大节约成本。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1A为野生型粗糙脉孢菌菌株WT在不同碳源培养条件下cdt-1和cdt-2的基因表达情况（数据来源于WT在不同碳源条件下的转录组数据）
图1B为野生型粗糙脉孢菌菌株WT在不同碳源培养条件下cdt-1和cdt-2的基因表达情况（实时荧光定量PCR的验证结果）
图1C为cdt-2基因敲除的粗糙脉孢菌在不同碳源培养条件下的生物量测定结果
图2A为cdt-2基因敲除的粗糙脉胞菌的木寡糖（木二糖）转运实验结果
图2B为cdt-2基因敲除的粗糙脉胞菌的木寡糖（木三糖）转运实验结果
图3为携带gh 43-2基因的重组表达质粒pRS423-PGK-1900的酶切鉴定结果
图4为携带gh 43-2基因的重组表达质粒pRS423-PGK-1900的物理图谱
图5A为表达并经纯化的GH43-2蛋白的SDS-PAGE电泳图谱
图5B为GH43-2蛋白水解木寡糖能力的测定结果
图6为携带cdt-2基因的重组表达质粒pRS424-PGK-8114G的物理图谱
图7为cdt-2和gh43-2酿酒酵母共表达菌株的木寡糖转运能力测定结果
图8为CDT-2转运木寡糖和GH43-2水解木寡糖的示意图
图9为cdt-2敲除的粗糙脉孢菌分别在纤维素和木聚糖（半纤维素）条件下的转录组分析结果
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor）。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度(g/100mL)或体积/体积(V/V)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
所用引物均由金唯智生物科技有限公司合成。
本发明中，木聚糖、木糖购自sigma试剂公司，木寡糖购自日本和光纯药工业株式会社，木二糖和木三糖购自爱尔兰Megazyme公司。
木寡糖是由2-10个木糖通过-1,4-糖苷键结合而成的低度聚合糖类。它包括木二糖、木三糖、木四糖、木五糖等，即木寡糖是一个不同聚合度木糖的混合物。而木二糖、木三糖则单纯是聚合度为2和3的低聚木糖，它们属于木寡糖。对于后面实施例1中的生长实验，使用的是购自日本的木寡糖，因为是作为碳源，用于生长，所以使用混合糖的木寡糖。而之后实施例2以及实施例3中的木寡糖转运实验以及木寡糖水解实验过程中选择木二糖和木三糖作为木寡糖的代表（因为它们都属于木寡糖）进行实验，目的是为了好做检测，对于木二糖、木三糖使用HPLC可以检测到单纯的一个峰，因为它们是纯糖，而木寡糖因为是一个混合糖，使用HPLC无法检测。
木聚糖是植物细胞中主要的半纤维素成分，占植物细胞干重的35％，是一种丰富的生物质资源，是自然界中除纤维素之外含量最丰富的多糖。木聚糖的结构是一种多聚五碳糖，由β-D-1,4木糖苷键连接起来，并带有多种取代基。木聚糖经木聚糖酶部分降解可形成低聚木糖（即木寡糖），木二糖和木三糖都属于木寡糖（低聚木糖），区别在于木二糖是由两个木糖由β-D-1,4木糖苷键连接而成，而木三糖则是由三个木糖经β-D-1,4木糖苷键连接而成。木寡糖在β-木糖苷酶的作用下可以完全降解为木糖，木糖为五碳糖，是构成低聚木糖和木聚糖的单糖。木聚糖彻底降解得到五碳单糖：木糖、阿魏糖、阿拉伯糖等（木聚糖和纤维素不同，纤维素是六碳糖葡萄糖的多聚物，木聚糖的骨架是木糖，但其带有多种取代基。因此，木聚糖降解后能得到阿拉伯糖，但量很少，还是以木糖为主），其中以木糖为主。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、不同碳源条件下野生型菌株中cdt-2和cdt-1基因的表达情况测定及cdt-2基因敲除的粗糙脉孢菌在各种碳源上的生长情况测定
一、cdt-2和cdt-1双基因敲除菌株
1、cdt-1和cdt-2单基因敲除菌株的来源
cdt-1和cdt-2单基因敲除的粗糙脉孢菌菌株购自美国真菌遗传资源中心FungalGenetics Stock Center(FGSC)真菌菌种保存库，为商业渠道获得。FGSC编号分别为FGSC16575（Δcdt-1），FGSC17868（Δcdt-2）。
本发明中，所用FGSC17868（Δcdt-2）菌株中cdt-2基因序列如序列表中序列2所示，其编码的CDT-2蛋白的氨基酸残基序列如序列表中序列1所示。
2、构建cdt-2和cdt-1双基因敲除菌株
cdt-2和cdt-1双基因敲除菌株是通过cdt-1和cdt-2单基因敲除菌株Δcdt-1和Δcdt-2杂交获得，其中，粗糙脉孢菌杂交方法详见参考文献（Davis,R.H.,DeSerres,F.J.,1970.Genetic and microbiological research techniques forNeurospora crassa.Methods Enzymol.17A,79-142.），将得到的cdt-2和cdt-1双基因敲除菌株命名为Δcdt-1Δcdt-2。
二、不同碳源条件下野生型菌株中cdt-2和cdt-1基因的表达情况测定和cdt-2基因敲除的粗糙脉孢菌在各种碳源上的生长情况测定
1、转录组数据中不同碳源条件下野生型菌株中cdt-2和cdt-1基因的表达情况测定
所有菌株（野生型粗糙脉孢菌：WT，cdt-2基因敲除菌株：Δcdt-2，cdt-1基因敲除菌株：Δcdt-1，cdt-2和cdt-1双基因敲除菌株：Δcdt-1Δcdt-2）接种（接种量为106个孢子/mL）于100mL分别以2％葡萄糖、2％纤维二糖、2％木聚糖、2％木糖、2％纤维素（Avicel）为碳源的Vogel盐培养基（配方详见参考文献：Vogel,H.J.,1956.A convenient growth medium for Neurospora.Microbiol.Genet.Bull.13,42-46.）中，在25℃下分别培养16h（其中WT在2％木糖条件下培养22h，在2％纤维素条件下培养30h），抽滤获得菌丝后，提取菌丝RNA，送至华大基因进行RNAseq测序获得WT在不同碳源条件下的转录组数据（RNAseq数据）。
野生菌株WT在不同碳源条件下的转录组数据结果如图1A所示（横坐标表示野生菌株WT在不同碳源条件下的cdt-1和cdt-2，纵坐标表示cdt-1和cdt-2基因在RNA-seq数据中的RPKM值，即基因表达水平；cdt-1表示编码CDT-1蛋白的基因，cdt-2表示编码CDT-2蛋白的基因；G：葡萄糖，CB：纤维二糖，AV：纤维素，X：木糖，XN：木聚糖）。可以看出，野生菌株WT中cdt-2和cdt-1在葡萄糖（G）条件下没有RPKM值，在纤维二糖（CB）条件下有较高的且相似的RPKM值，在结构更加复杂的纤维素（AV）条件下，cdt-1和cdt-2的RPKM值更高，且cdt-2的高于cdt-1的，在木糖（X）条件下，cdt-1有非常低的可以忽略的RPKM值，cdt-2有较低的RPKM值，在木聚糖（XN）条件下cdt-1有非常低的可以忽略的RPKM值，与cdt-1相比，cdt-2则有很显著的RPKM值。转录组数据中的基因的RPKM值的大小表征着相应基因的表达情况。因此图1A结果表明cdt-1和cdt-2在葡萄糖条件下是没有表达的，在纤维二糖条件下有相似的表达，在结构更加复杂的纤维素条件下cdt-1和cdt-2的表达更高，且cdt-2的表达高于cdt-1。同时cdt-2在其它碳源如木糖、木聚糖上也有表达，尤其是木聚糖条件下，cdt-2有非常显著的表达。表明cdt-1和cdt-2在粗糙脉孢菌利用纤维二糖和纤维素中起作用，cdt-2和cdt-1的不同之处在于cdt-2除了在纤维二糖和纤维素的利用中起作用，同时cdt-2在半纤维素（生物质主要由纤维素和半纤维素以及少量的木质素构成，纤维素部分降解之后会生成纤维二糖。）—木聚糖的降解和利用中也起着非常重要的作用。图1A尤其显示了cdt-2在木聚糖上有很好的性状。
2、实时荧光定量PCR验证转录组数据（RNAseq数据）中不同碳源条件下野生型菌株中cdt-2和cdt-1基因的表达
所有菌株（野生型粗糙脉孢菌：WT，cdt-2基因敲除菌株：Δcdt-2，cdt-1基因敲除菌株：Δcdt-1，cdt-2和cdt-1双基因敲除菌株：Δcdt-1Δcdt-2）接种（接种量为106个孢子/mL）于100mL2％蔗糖为碳源的Vogel盐培养基中，在25℃下分别培养16h后，洗涤菌丝，将洗涤后的菌丝转接到分别以0.5％葡萄糖、0.5％纤维二糖、0.5％木寡糖、0.5％木糖、0.5％的木聚糖和0.5％纤维素（Avicel）为碳源的Vogel盐培养基中，在25℃下继续培养4h，培养结束后，抽滤获得菌丝后，提取菌丝RNA，反转录为cDNA，进行实时荧光定量PCR，测定野生型菌株WT在不同碳源诱导条件下cdt-1和cdt-2基因的表达情况。
结果如图1B所示（横坐标表示野生菌株WT在不同碳源条件下的cdt-1和cdt-2，纵坐标表示cdt-1和cdt-2基因在qRT-PCR（实时荧光定量PCR）实验中的基因表达水平；cdt-1表示编码CDT-1蛋白的基因，cdt-2表示编码CDT-2蛋白的基因；G：葡萄糖，CB：纤维二糖，AV：纤维素，X：木糖，XO：木寡糖，XN：木聚糖）。cdt-2和cdt-1在纤维二糖和纤维素上都有表达，在纤维素上的相对表达水平高于在纤维二糖上的表达，且cdt-2的相对表达水平高于cdt-1。cdt-2除在纤维二糖和纤维素上表达之外，还在木糖、木寡糖、木聚糖上有高的相对表达量。所以实时荧光定量PCR验证结果与二（1）中转录组数据保持一致。表明cdt-2除了在降解和利用纤维素中有重要作用，同时在木聚糖（半纤维素）相关降解和利用中起重要作用。此验证试验增加了木寡糖碳源的诱导，在木寡糖诱导条件下cdt-2的表达情况与木聚糖条件下保持一致，都有很高的表达水平。
3、cdt-2基因敲除的粗糙脉孢菌在各种碳源上的生长情况测定
所有菌株（野生型粗糙脉孢菌：WT，cdt-2基因敲除菌株：Δcdt-2，cdt-1基因敲除菌株：Δcdt-1，cdt-2和cdt-1双基因敲除菌株：Δcdt-1Δcdt-2）接种（接种量为106个孢子/mL）于100mL分别以2％葡萄糖、2％木糖、2％纤维二糖、2％木寡糖、2％木聚糖为碳源的Vogel盐培养基（配方详见参考文献：Vogel,H.J.,1956.Aconvenient growth medium for Neurospora.Microbiol.Genet.Bull.13,42-46.）中，在25℃下培养3天，抽滤获得菌丝后，烘箱中烘干，称量干重。
结果如图1C（横坐标表示不同碳源条件下不同突变体，纵坐标表示相对于野生型生物量的百分比；G：葡萄糖，CB：纤维二糖，X：木糖，XO：木寡糖，XN：木聚糖）所示，Δcdt-2以及Δcdt-1Δcdt-2在以木寡糖和木聚糖为碳源的培养基中生物量较低，表现出明显的生长缺陷，表明cdt-2基因的缺失会影响菌体在木寡糖和木聚糖上的生长，特别是在木聚糖培养基条件下，生物量最低，表明CDT-2在粗糙脉孢菌对于木聚糖-半纤维素的降解和利用中起重要作用。
讨论：综合上述1、2和3的实验结果，由于cdt-2是糖转运蛋白，推测cdt-2在半纤维素的降解和利用中是以转运木寡糖的形式来起重要作用的。因为生物质主要由纤维素和半纤维素以及少量的木质素构成，纤维素部分降解之后会生成纤维二糖。半纤维素在本底的半纤维素酶的作用下水解生成木寡糖，而木寡糖转运蛋白的作用是运输木寡糖进入胞内，木寡糖不仅是细胞的营养物质被细胞利用，同时还是半纤维素酶的诱导物，而木寡糖是由半纤维素酶降解木聚糖得到。经半纤维素酶水解得到的木寡糖通过木寡糖转运蛋白进入胞内，一部分被细胞降解利用，另一部分诱导细胞生成更多的半纤维素酶，而半纤维素酶分泌到胞外之后进一步降解木聚糖生成木寡糖，而木寡糖再次被木寡糖转运蛋白运输到胞内，如此循环。表明cdt-2在半纤维素的降解和利用中是以转运木寡糖的形式来起重要作用的。
实施例2、cdt-2基因敲除的粗糙脉孢菌的木寡糖（木二糖或木三糖）转运实验
菌丝培养：所有菌株（野生型粗糙脉孢菌：WT，cdt-2敲除菌株：Δcdt-2，cdt-2回补菌株：Pc-cdt-2，即将cdt-2基因重新转入粗糙脉孢菌cdt-2突变体菌株Δcdt-2中去看其是否恢复了cdt-2敲除后所缺失的性状）分别接种（接种量为106个孢子/mL）于100mL加有2％蔗糖的Vogel盐培养基中，在25℃下培养16h。培养结束后，离心收集菌丝，用1×Vogel盐洗涤3次。
转运蛋白的诱导表达：将菌丝分成2份，分别转移到加有0.5％木聚糖或0.5％蔗糖（作为对照）的Vogel盐培养基中在25℃下培养4h，诱导转运蛋白的表达。培养结束后，得到蛋白表达培养液。
木寡糖转运测定：离心收集10mL培养液，用Vogel盐洗涤3次，重悬在加有环己酰亚胺（放线菌酮，100mg/mL）和含90mM木二糖或木三糖的1mL双蒸水中，15分钟后从中取出100μL离心，通过HPLC测定去除菌丝的上清中剩余的木二糖或木三糖残留量。
粗糙脉孢菌突变体木寡糖转运的测定原理：野生型WT菌株以及cdt-2回补菌株的蛋白表达培养液中存在木寡糖转运蛋白CDT-2，它们可以转运胞外的木寡糖即木二糖或木三糖进入胞内，而测定到的胞外的木二糖或木三糖的剩余量就会很低。而对于cdt-2突变体Δcdt-2菌株，由于缺失了cdt-2基因，因此就不会在木聚糖条件下诱导产生CDT-2木寡糖转运蛋白，也就不具有木寡糖转运能力，因此在cdt-2突变体Δcdt-2菌株木寡糖转运实验后的胞外可以检测到相较于WT和cdt-2回补菌株Pc-cdt-2更多的木二糖或木三糖残留在胞外而不能转运进入胞内。
测定结果如图2A和图2B所示（横坐标表示不同菌株，纵坐标表示转运后上清中残留的糖含量；0.5％蔗糖表示菌丝在0.5％蔗糖为碳源的培养基中诱导4h，0.5％木聚糖表示菌丝在0.5％木聚糖为碳源的培养基中诱导4h；WT表示粗糙脉孢菌野生型菌株，Δcdt-2表示cdt-2敲除菌株，PC-cdt-2表示cdt-2回补菌株），在0.5％蔗糖诱导条件下，所有菌株的上清中木二糖和木三糖的残留量都一致，都很高，即都没有被转运至胞内。表明cdt-2在蔗糖条件下不被诱导，而在0.5％木聚糖诱导条件下，WT的上清中木二糖和木三糖的残留量低，说明CDT-2被诱导产生，木寡糖被转入WT野生菌胞内，从而在WT的上清中只检测到少量的木寡糖。与野生型相比，Δcdt-2菌株在0.5％木聚糖诱导条件下的上清中残留大量的木二糖或木三糖，说明由于敲除了cdt-2基因，即使在0.5％木聚糖诱导条件下，也没有cdt-2基因的表达，继而导致Δcdt-2转运能力的缺陷，因此可以检测到上清中残留大量的木寡糖（木二糖或木三糖）未被转入菌中；与Δcdt-2菌株相比，cdt-2回补菌株PC-cdt-2在木聚糖诱导条件下的上清中木二糖或木三糖的残留量明显减少，接近于WT上清中木寡糖的残留量，表明cdt-2在PC-cdt-2菌株中的回补成功。
上述实验结果表明：由于cdt-2基因的缺失，突变体菌株的木寡糖转运能力明显下降，而cdt-2回补菌株部分回补了菌株的木寡糖转运能力。
实施例3、gh43-2基因的克隆、在酿酒酵母中的表达及水解木寡糖能力的测定
gh43-2基因是被预测为木糖苷酶或阿拉伯糖苷酶基因，本实施例的目的是通过gh43-2基因的克隆和在酿酒酵母中的表达来确定gh43-2编码蛋白GH43-2的功能。
一、构建携带gh43-2基因的重组酿酒酵母菌株
使用引物1900-F（序列：5’-GCATACTAGTAAAAATGTACACCGCCGACCCCTCCGC-3’）和1900-R（序列：5’-ATGAATTCTTAATGATGATGATGATGATGCTTCCCAGCCGGCTGCTTTTCC-3’，附带一个His标签）从粗糙脉孢菌的cDNA中PCR扩增gh43-2基因的编码阅读框，PCR反应体系为：5×phusion HF buffer10μl，10mM dNTPs1μl，1900-F2.5μl，1900-R2.5μl，cDNA1μl，Phusion DNA polymerase0.5μl，水32.5μl。PCR反应条件为：先98℃30s；然后98℃10s，55℃30s，72℃1min,29个循环；最后72℃10min，4℃10min。PCR反应结束后，使用限制性内切酶Spe I和EcoR I将PCR产物和质粒pRS423-PGK[该质粒构建根据参考文献（Galazka,J.M.,et al.,2010.Cellodextrintransport in yeast for improved biofuel production.Science.330,84-86.）略有改动，质粒选用pRS423（Mumberg,D.，et al.,1995.Yeast vectors for thecontrolled expression of heterologous proteins in different geneticbackgrounds.Gene.156,119-122.）]进行双酶切，并将两种双酶切产物进行连接，将连接产物用限制性内切酶进行酶切鉴定，鉴定结果如图3所示（泳道M表示：DNAMarker，泳道1表示：EcoR I和Sac I酶切结果，泳道2表示：Spe I和Cla I酶切结果，泳道3表示：Cla I和EcoR I酶切结果，泳道4表示：Sac I和Spe I酶切结果，泳道5表示：Cla I酶切结果），酶切所得片段与预期结果相符，再进行测序，测序结果表明gh43-2基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示，其编码蛋白的氨基酸残基序列如序列表中序列3所示，表明获得了序列及插入位置正确的携带gh43-2基因的重组表达质粒，命名为pRS423-PGK-1900，其物理图谱如图4所示。然后，将质粒pRS423-PGK-1900转入酿酒酵母EBY.VW4000（Wieczorke,R.,et al.,1999.Concurrent knock-out of at least20transporter genes is required to blockuptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae.FEBS Lett.464,123-128.）中，得到携带gh43-2基因的重组酿酒酵母菌株，命名为E1900。
二、gh43-2基因在酿酒酵母中的表达及纯化
挑取E1900单克隆，将其接种在50mL以2％麦芽糖为碳源的SC-His培养基（配方：无氨基酵母氮源6.7g/L，酵母合成缺失培养基补充物1.4g/L，麦芽糖20g/L，亮氨酸,尿嘧啶和色氨酸各20mg/L）中30℃培养过夜（10-12小时），之后转入1000mL同样的培养基中培养4-6小时。培养结束后，低温离心收集菌体，重悬在适量的PEB缓冲液（50mM Tris·HCl，pH8.0，2mM EDTA1×PMSF）中，加入玻璃珠，漩涡振荡破壁，低温15000rpm离心10min，收集上清过Ni柱（购自GE HealthcareBio-Sciences AB，型号HisTrapTM HP1×5mL），将纯化蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶(PAGE凝胶为购自Invitrogen的Novex4-12％Bis-Tris Gel1.0mm,10Well)电泳检测其纯度，检测结果如图5A所示（泳道M为标准分子量蛋白，泳道1为纯化蛋白），显示经表达获得了约45KD的蛋白，与预期结果GH43-2蛋白相符，将该纯化蛋白-80℃保存。
三、GH43-2蛋白水解木寡糖能力的测定
将5μg步骤二表达纯化的GH43-2蛋白与200μl木二糖或木三糖水溶液（10mM）混合，于30℃反应40min后终止，得到酶解液。通过超滤膜去除酶解液中的蛋白，通过HPLC测定去除蛋白后酶解液中的木糖含量。
测定结果如图5B所示（横坐标表示木二糖或木三糖水解反应条件下的gh43-2基因表达菌株和对照菌株，纵坐标表示木二糖水解产生的木糖量，木三糖水解产生的木糖和木二糖量；Xylose表示木糖，Xylobiose表示木二糖；XB表示木二糖，XT表示木三糖，hydrolysis表示水解，NA表示未检测到），可以看出，木二糖经GH43-2水解之后生成了木糖，而木三糖经GH43-2水解后生成了木二糖和木糖，表明GH43-2可以水解木寡糖，具有β-木糖苷酶（β-木糖苷酶可以将木二糖，木三糖等低聚木糖即木寡糖水解为木糖）水解活力。
实施例4、构建cdt-2和gh43-2酿酒酵母共表达菌株及其木寡糖转运和水解能力测定
本实施例利用实施例2中CDT-2木寡糖转运能力和实施例3中GH43-2木寡糖水解能力的结果，构建cdt-2和gh43-2酿酒酵母共表达菌株。
一、构建cdt-2和gh43-2酿酒酵母共表达菌株
1、构建携带cdt-2基因的重组表达质粒pRS424-PGK-8114G
根据参考文献（Galazka,J.M.,et al.,2010.Cellodextrin transport in yeastfor improved biofuel production.Science.330,84-86.）构建质粒pRS424-PGK-8114G，改动之处为出发载体选用pRS424（Mumberg,D.，et al.,1995.Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins indifferent genetic backgrounds.Gene.156,119-122.），质粒pRS424-PGK-8114G的物理图谱如图6所示（质粒名称和图中8114即为cdt-2）。
需要说明的是，本实例中cdt-2基因采用序列表中序列2所示的碱基序列（来源于粗糙脉孢菌），其编码序列表中序列1所示的CDT-2蛋白。本领域技术人员可以推知，来源于其它菌种（如发明内容中所列举的）所产生的类似CDT-2蛋白（其氨基酸残基序列全长或局部结构域与序列1同源度在75％以上）的编码基因也可同样加以利用。本发明不再一一赘述。
使用引物8114-F（序列：5’-TATTAAACTAGTATGGGCATCTTCAACAAGAAGC-3’）和8114-R（序列：5’-TTATAAGAATTCAGCAACAGACTTGCCCTCATG-3’）从粗糙脉孢菌的cDNA中PCR扩增cdt-2基因(序列2)的编码阅读框，PCR反应体系为：5×phusion HFbuffer10μl，10mM dNTPs1μl，8114-F2.5μl，8114-R2.5μl，cDNA1μl，PhusionDNA polymerase0.5μl，水32.5μl。PCR反应条件为：先98℃30s；然后98℃10s，55℃30s，72℃1min,29个循环；最后72℃10min，4℃10min。PCR反应结束后，使用限制性内切酶Spe I和EcoR I将PCR产物和质粒pRS424-PGK[该质粒构建根据参考文献（Galazka,J.M.,et al.,2010.Cellodextrin transport in yeast for improvedbiofuel production.Science.330,84-86.）略有改动，质粒选用pRS424（Mumberg,D.，et al.,1995.Yeast vectors for the controlled expression of heterologousproteins in different genetic backgrounds.Gene.156,119-122.）]进行双酶切，并将两种双酶切产物进行连接，将连接产物限制性内切酶进行酶切鉴定及测序，序列正确，携带cdt-2基因的重组表达质粒构建成功，命名为pRS424-PGK-8114G。
2、构建cdt-2和gh43-2酿酒酵母共表达菌株
将质粒pRS424-PGK-8114G和pRS423-PGK-1900（参见实施例3）共同转化（使用酵母醋酸锂转化方法）酿酒酵母EBY.VW4000，并在以2％麦芽糖为碳源的SC-His-Trp平板（配方：无氨基酵母氮源6.7g/L，酵母合成缺失培养基补充物1.4g/L，麦芽糖20g/L，亮氨酸，和尿嘧啶20mg/L琼脂：20g/L）上筛选转化子，将最终得到的cdt-2和gh43-2双基因共表达重组酿酒酵母菌株命名为E（1900+8114G）。
E（1900+8114G）的鉴定：从以2％麦芽糖为碳源的SC-His-Trp的筛选平板上挑单克隆在筛选平板上划线，可以生长，表明转化成功。
二、cdt-2和gh43-2酿酒酵母共表达菌株E（1900+8114G）的木寡糖转运及水解能力测定
测定重组菌株E(1900+8114G)和对照菌株（将pRS424-PGK和pRS423-PGK两个空质粒转化进入EBY.VW4000中的菌株）对木二糖或木三糖的转运能力。方法如下。
菌体获得：将菌株接种到3mL以2％（质量百分浓度）麦芽糖为碳源的SC-His-Trp培养基中，培养过夜（10-12h），然后转接入100mL同样的培养基中，30℃、250rpm培养24h，培养结束后，低温离心收集和洗涤菌体，此步除了获得菌体之外，同时菌体也表达了CDT-2和胞内的GH43-2蛋白。
重组酵母菌株E(1900+8114G)木二糖或木三糖的转运：将获得的菌体重悬在含1％（质量百分浓度）的木二糖或木三糖为碳源的SC-His-Trp培养基中，使菌体终浓度OD600为20，培养4h后，收集1mL菌体，此时重组酵母菌株E(1900+8114G)菌体胞内已经在其所表达的CDT-2的作用下转入了木二糖或木三糖并且在胞内GH43-2的水解作用下将木二糖或木三糖水解生成木糖，部分木糖还在胞内内源的醛糖还原酶的作用下部分转化为木糖醇；
木糖和木糖醇的测定：上步获得的菌体离心洗涤之后将胞内含有木糖和木糖醇的E(1900+8114G)菌体重悬在0.6mL的去离子水中，继续在37℃、250rpm条件下培养48h，培养结束后离心弃除菌体取上清，由于E(1900+8114G)没有木糖代谢途径，因此无法利用胞内木糖和木糖醇，经过培养后通过渗透作用木糖和木糖醇会从胞内进入水中，通过HPLC测定上清中的木糖及木糖醇含量（酵母中存在内源的醛糖还原酶，可以将胞内的部分木糖还原为木糖醇，详见参考文献：K.L.Traff,R.R.O.Cordero,W.H.van Zyl and B.Hahn-Hagerdal,Appl.Environ.Microbiol.,2001,67,5668–5674.在计算胞内木糖含量的时候要将还原为木糖醇的木糖量折算加入）。
测定结果如图7所示（横坐标表示木二糖或木三糖转运条件下的重组菌株和对照菌株，纵坐标表示木糖浓度；Xylose表示木糖；XB表示木二糖，XT表示木三糖，ND表示未检测；Control表示对照菌株，E(1900+8114G)表示E(1900+8114G)重组菌株），与对照菌株相比，E(1900+8114G)重组菌株在木二糖或木三糖中培养均产生了明显的木糖；而对照菌株上清中检测不到木糖。
分析：酿酒酵母在没有整合木糖代谢相关基因的条件下是不能利用木糖来生长和发酵的。当木寡糖在改造菌株E(1900+8114G)中的木寡糖转运蛋白CDT-2的作用下被转运到胞内，在胞内再经E(1900+8114G)中的β-木糖苷酶（GH43-2）的作用水解为木糖，由于酿酒酵母菌株胞内没有木糖代谢途径，木糖是不被E(1900+8114G)所利用的，通过渗透作用木糖可以排至胞外（如图8所示），因此当2天后在水的上清中会检测到木糖和木糖醇（木糖一部分还会在酵母胞内内源的醛糖还原酶的作用下部分转化为木糖醇）。CDT-2转运木寡糖和GH43-2水解木寡糖的示意图如图8所示。
该实施例提示，当cdt-2和gh43-2整合入含有木糖代谢途径的重组酵母中，可以将来自半纤维素水解得到的木寡糖转运进入胞内，在胞内水解为木糖，供菌体利用发酵生产生物化学品。
本实施例以酿酒酵母为例进行说明，本领域普通技术人员可知，其它类似的微生物（如发明内容中所列）与其具有类似的属性，将cdt-2和gh43-2整合入类似微生物中，CDT-2蛋白转运木寡糖和GH43-2蛋白水解木寡糖的功能也是类似的。特此说明并不一一赘述。
实施例5、cdt-2基因缺失菌株分别在纤维素和半纤维素条件下的转录组分析
设立此实施例，是为进一步证明cdt-2在半纤维素的降解和利用上起着非常重要的作用。
转录组广义上指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA；狭义上指所有mRNA的集合。本发明中定义为mRNA的集合。简单的说就是cdt-2基因的敲除对整个菌株中的其它基因表达的影响。因为cdt-2基因的敲除致使突变体在半纤维素条件下，大量的基因表达受到影响，表明cdt-2基因是半纤维素降解和利用中非常重要的基因。CDT-2作为转运蛋白，它的缺失对在纤维素和半纤维素条件下基因的表达会产生不同的影响。
cdt-2基因敲除的粗糙脉孢菌（Δcdt-2）与野生型粗糙脉孢菌（WT）分别在2％蔗糖为碳源的Vogel盐培养基中培养16h后，洗涤菌丝；将菌丝分别转入含0.5％纤维素（Avicel）和0.5％木聚糖（Xylan，半纤维素）为碳源的Vogel盐培养基中继续诱导培养4h，培养结束后抽滤收集该步培养菌丝，提取RNA，进行RNAseq测序。
转录组分析结果如图9所示，图9C中深色表示上调表达基因，浅色表示下调表达基因，WT-AV表示野生型在纤维素条件下转录组，Δcdt-2-AV表示突变体Δcdt-2在纤维素条件下的转录组，WT-XN表示野生型在木聚糖条件下转录组，Δcdt-2-XN表示突变体Δcdt-2在木聚糖条件下的转录组。在纤维素（AV）条件下，WT与Δcdt-2相比较，上调和下调表达基因有差异，但差异较小。而在半纤维素（XN）条件下，WT与Δcdt-2相比较，上调和下调表达基因差异巨大。可以看出CDT-2作为转运蛋白，它的缺失对在纤维素和半纤维素（木聚糖）条件下基因的表达影响是不同的。对于粗糙脉孢菌利用半纤维素起着非常重要的作用。图9A中Δcdt-2/WT-AV表示在纤维素（AV）条件下，由于cdt-2的缺失，有147个基因下调表达，其中44个是只在纤维素条件下下调表达的基因。Δcdt-2/WT-XN表示在木聚糖（XN）条件下，由于cdt-2的缺失，有671个基因下调表达，其中568个是只在木聚糖条件下下调表达的基因。图9B中Δcdt-2/WT-AV表示在纤维素（AV）条件下，由于cdt-2的缺失，有131个基因上调表达，其中29个是只在纤维素条件下上调表达的基因。Δcdt-2/WT-XN表示在木聚糖（XN）条件下，由于cdt-2的缺失，有708个基因上调表达，其中606个是只在木聚糖条件下上调表达的基因。由图9中A和B可以看出，与纤维素条件下相比，在木聚糖条件下，由于cdt-2基因的缺失导致粗糙脉孢菌中更大量的基因上调表达和下调表达，表明cdt-2对于木聚糖的降解和利用起着非常重要的作用。
CDT-2作为糖转运蛋白，它不仅可以转运纤维寡糖，同时本实验验证其还可以转运木寡糖。可以根据CDT-2的这一转运特性，对酿酒酵母进行改造来利用生物质生产例如生物乙醇等的生物化学品，如实施例4所述。此外，本实验也证实了由于CDT-2转运的木寡糖是很多半纤维素酶的诱导物，因此通过转录组学的分析，可以挖掘出更多的半纤维素酶。对于那些由于cdt-2的敲除造成的半纤维素酶的下调表达，表明这些半纤维素酶在半纤维素的降解中起着主要的作用，可以对这些半纤维素酶进行进一步的研究，例如在体外表达产酶，或者构建及优化半纤维素酶系，来提高生物质半纤维素的降解效率，减少酶制剂的使用，从而减少生物质利用生产生物化学品的成本有重要的应用价值。
利用本发明有以下方向的应用：
应用1：用于构建酿酒酵母木寡糖利用重组菌株并利用木寡糖生产生物乙醇
1.1菌株构建：将含有cdt-2和gh43-2两个基因的表达质粒（例如但不限于实施例4提到的）转化进入含有木糖代谢途径的酿酒酵母菌（木糖代谢途径基因包括木糖还原酶基因，木糖醇脱氢酶基因以及木酮糖激酶基因）中从而获得木寡糖利用重组菌株1（其中还含有木糖代谢基因）。酿酒酵母本身可以利用葡萄糖发酵生产乙醇。此外由于该菌株中还有木糖代谢途径，该菌株也可以利用木糖。因此，该重组菌株可以利用葡萄糖、木糖和木寡糖来发酵生产乙醇。
1.2木寡糖发酵产乙醇：将构建的含有cdt-2和gh43-2两个基因以及木糖代谢基因的重组菌株1接种到以木寡糖为碳源的发酵培养基中，发酵一定时间，得到生物乙醇。
应用2：用于构建酿酒酵母重组菌株利用混合糖发酵生产生物乙醇
2.1菌株构建：将含有cdt-1和gh1-1两个基因的表达质粒转化进入1.1构建的可以利用木寡糖的重组菌种1中获得一种新的重组菌株2，由于cdt-1（纤维素寡糖转运蛋白）和gh1-1（ 葡萄糖苷酶，可以水解纤维寡糖为葡萄糖）两个基因的作用，使重组菌株2除了可以利用葡萄糖，木糖和木寡糖之外，还可以利用纤维寡糖。
2.2混合糖发酵：将2.1构建的重组菌株接种到以葡萄糖、木糖、木寡糖和纤维寡糖的混合糖培养基中，发酵一定时间，生产生物乙醇。
应用3：用于构建酿酒酵母重组菌株利用生物质发酵生产生物乙醇
在应用2构建的菌株基础上再整合半纤维素酶以及纤维素酶基因，则可以直接利用生物质生产化学品，减少半纤维素酶和纤维素酶的添加量，或者不添加半纤维素酶和纤维素酶，为利用生物质生产生物化学品节省大量的成本。在此不一一赘述。
Claims (10)
1.CDT-2蛋白作为木寡糖转运蛋白的应用，可将木寡糖由微生物的胞外转运至胞内，进而对木寡糖加以利用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述CDT-2蛋白为：
1）来源于粗糙脉孢菌氨基酸残基序列如序列表中序列1所示的蛋白；
2）以序列表中序列2所示cdt-2基因编码的蛋白；
3）与序列表中序列1氨基酸残基序列全长或局部结构域同源度在75％以上的蛋白；该同源度在75％以上的蛋白来自于但不限于以下菌：嗜热毁丝菌（Myceliophthorathermophila）、球毛壳菌（Chaetomium globosum）、柄孢霉（Podospora anserina）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、玉米赤霉（Gibberella zeae）、尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）、土曲霉（Aspergillus terreus）、鞭毛藻丛赤壳菌（Nectria haematococca）、斯梭孢壳霉（Thielavia terrestris）、绿色木霉（Trichoderma virens）、肉原毛平革菌（Phanerochaete carnosa）、黑曲霉（Aspergillus niger）、里氏木霉（Trichoderma reesei）、树干毕赤酵母（Scheffersomyces stipitis）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）等。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述微生物包括但不限于以下菌：酵母属（Saccharomyces sp.）的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、摩纳酵母（Saccharomyces monacensis）、贝酵母（Saccharomyces bayanus）、巴氏酵母（Saccharomyces pastorianus）、卡氏酵母（Saccharomyces carlsbergensis）、裂殖酵母（Saccharomyces pombe），克鲁维酵母菌属（Kluyveromyces sp.）的马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxiamus）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）、脆壁克鲁维酵母（Kluyveromyces fragilis），树干毕赤酵母（Pichiastipites）、嗜热侧孢霉（Sporotrichum thermophile）、休哈塔假丝酵母（Candidashehatae）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）、粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）、运动发酵单孢菌（Zymomonas mobilis）、梭状芽孢杆菌（Clostridium sp.）、微生物（Clostridium phytofermentans）、梭热杆菌（Clostridium thermocellum）、拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）、丙酮丁醇梭杆菌（Clostridiumacetobutylicum）、热乙酸菌（Moorella thermoacetica）、大肠杆菌（Escherichiacoli）、产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）、厌氧杆菌（Thermoanaerobacteriumsaccharolyticu）和枯草杆菌（Bacillus subtilis）。
4.根据权利要求1或2或3所述的应用，其特征在于：所述木寡糖是由2-10个木糖通过-1,4-糖苷键结合而成的低度聚合糖类，包括木二糖、木三糖、木四糖、木五糖在内的低聚木糖。
5.一种利用CDT-2蛋白获得及促进微生物转运木寡糖的方法，是将权利要求1或2所述CDT-2蛋白的编码基因导入权利要求3所述的微生物菌株中，可将木寡糖转运至微生物胞内，得到的重组微生物菌株与出发菌株相比，重组菌株获得或提高木寡糖转运能力。
6.GH43-2蛋白作为木糖苷酶的应用，可将木寡糖水解为木糖；所述木寡糖是由2-10个木糖通过-1,4-糖苷键结合而成的低度聚合糖类，包括木二糖、木三糖、木四糖、木五糖在内的低聚木糖。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述GH43-2蛋白为：
1）来源于粗糙脉孢菌氨基酸残基序列如序列表中序列3所示的蛋白，gh43-2基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示；
2）与序列表中序列3氨基酸残基序列全长或局部结构域同源度在75％以上的蛋白；该同源度在75％以上的蛋白来自于但不限于以下菌：嗜热毁丝菌（Myceliophthorathermophila）、球毛壳菌（Chaetomium globosum）、柄孢霉（Podospora anserina）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、玉米赤霉（Gibberella zeae）、尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）、土曲霉（Aspergillus terreus）、鞭毛藻丛赤壳菌（Nectria haematococca）、斯梭孢壳霉（Thielavia terrestris）、绿色木霉（Trichoderma virens）、肉原毛平革菌（Phanerochaete carnosa）、黑曲霉（Aspergillus niger）、里氏木霉（Trichoderma reesei）、树干毕赤酵母（Scheffersomyces stipitis）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）等。
8.一种利用GH43-2蛋白获得及促进微生物水解木寡糖的方法，是将权利要求6或7所述GH43-2蛋白的编码基因导入权利要求3所述的微生物菌株中，可将木寡糖水解为木糖，得到的重组微生物菌株与出发菌株相比，重组菌株获得或提高木寡糖水解能力。
9.使微生物获得或提高木寡糖转运和/或水解木寡糖的重组菌，是将权利要求1或2所述CDT-2蛋白的编码基因cdt-2和权利要求6或7所述GH43-2蛋白的编码基因gh43-2导入权利要求3所述微生物中之一得到的微生物菌株；将所述cdt-2和gh43-2基因导入酿酒酵母菌得到的cdt-2和gh43-2双基因共表达重组酿酒酵母菌株命名为E（1900+8114G）。
10.一种使微生物获得或提高木寡糖转运和/或水解木寡糖的方法，是将权利要求1或2所述CDT-2蛋白的编码基因cdt-2和权利要求6或7所述GH43-2蛋白的编码基因gh43-2导入权利要求3所述微生物中之一得到重组菌，可以将木寡糖从微生物胞外转运至胞内，并在胞内被水解为木糖，从而使微生物获得或提高木寡糖转运和/或水解木寡糖的能力。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112142832A (zh) * | 2020-10-20 | 2020-12-29 | 广西科学院 | 一种链霉菌纤维寡糖转运蛋白基因 |
| CN112210564A (zh) * | 2020-10-20 | 2021-01-12 | 广西科学院 | 一种短双歧杆菌纤维寡糖转运蛋白基因 |
| CN112322563A (zh) * | 2020-10-20 | 2021-02-05 | 广西科学院 | 一种纤维素发酵工程菌及其构建方法和应用 |
| CN113237807A (zh) * | 2021-03-22 | 2021-08-10 | 南京中医药大学 | 生物体内液各组分调控蛋白纳米颗粒跨膜渗透压的量化分析技术 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101166830A (zh) * | 2005-04-26 | 2008-04-23 | 诺维信公司 | 阿拉伯木聚糖的水解 |
| WO2011011796A2 (en) * | 2009-07-24 | 2011-01-27 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for improving sugar transport, mixed sugar fermentation, and production of biofuels |
| CN103562216A (zh) * | 2011-01-21 | 2014-02-05 | 伊利诺伊大学董事会 | 纤维糊精和β-D-葡萄糖的增强型发酵 |
-
2013
- 2013-05-07 CN CN201310165380.XA patent/CN104140977B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101166830A (zh) * | 2005-04-26 | 2008-04-23 | 诺维信公司 | 阿拉伯木聚糖的水解 |
| WO2011011796A2 (en) * | 2009-07-24 | 2011-01-27 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for improving sugar transport, mixed sugar fermentation, and production of biofuels |
| CN103562216A (zh) * | 2011-01-21 | 2014-02-05 | 伊利诺伊大学董事会 | 纤维糊精和β-D-葡萄糖的增强型发酵 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| GALAGAN,J.E.: "XP_963873.1", 《GENBANK》 * |
| GALAGAN,J.E.: "XP_965531.2", 《GENBANK》 * |
| GALAZKA JM: "Cellodextrin transport in yeast for improved biofuel production.", 《SCIENCE》 * |
| PLESCH,G: "HC890263.1", 《GENBANK》 * |
| 顾芮萌: "粗糙脉孢菌糖转运蛋白功能及产酶条件优化研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112142832A (zh) * | 2020-10-20 | 2020-12-29 | 广西科学院 | 一种链霉菌纤维寡糖转运蛋白基因 |
| CN112210564A (zh) * | 2020-10-20 | 2021-01-12 | 广西科学院 | 一种短双歧杆菌纤维寡糖转运蛋白基因 |
| CN112322563A (zh) * | 2020-10-20 | 2021-02-05 | 广西科学院 | 一种纤维素发酵工程菌及其构建方法和应用 |
| CN113237807A (zh) * | 2021-03-22 | 2021-08-10 | 南京中医药大学 | 生物体内液各组分调控蛋白纳米颗粒跨膜渗透压的量化分析技术 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |