CN112210564A - 一种短双歧杆菌纤维寡糖转运蛋白基因 - Google Patents

一种短双歧杆菌纤维寡糖转运蛋白基因 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种短双歧杆菌纤维寡糖转运蛋白基因，属于生物技术领域。本发明通过将短双歧杆菌纤维寡糖转运蛋白基因连接到pET‑28a载体上后转入感受态目的菌株并进行诱导表达培养，成功构建了高效表达短双歧杆菌纤维寡糖转运蛋白的工程菌株，并通过热力学实验证明了其能够高效结合纤维寡糖，尤其是纤维四糖，为产业上进一步利用纤维素提供了工具。

Description

一种短双歧杆菌纤维寡糖转运蛋白基因
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种短双歧杆菌纤维寡糖转运蛋白基因。
背景技术
随着化石能源的日趋枯竭以及人们对环境污染、能源危机等问题关注度的提高，寻找清洁的可再生能源成为当前研究热点。木质纤维素是由多种有机高分子化合物组成的具有高结晶度和聚合度的复合体，主要由纤维素、半纤维素和木质素通过共价键和非共价键相互连接形成，因其储量丰富、成本低廉、清洁环保而受到各国科学家的青睐。
纤维素酶，包含外切-1,4-β-D-葡聚糖酶(exo-β-glucanases,CBH)、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶(endo-β-glucanases,EG)、β-葡萄糖苷酶(endo-β-glucosidases,GE)，可以将纤维素、半纤维素水解为单糖，其中外切-1,4-β-D-葡聚糖酶从纤维素的两端水解结晶纤维素，释放纤维二糖；内切-1,4-β-D-葡聚糖酶作用于纤维素内部的β-1,4糖苷键，随机水解无定形纤维素，释放各种纤维寡糖；β-葡萄糖苷酶也称纤维二糖酶，主要水解纤维二糖、纤维寡糖，释放葡萄糖。纤维二糖对外切-1,4-β-D-葡聚糖酶和内切-1,4-β-D-葡聚糖酶有抑制作用，而葡萄糖对β-葡萄糖苷酶有抑制作用，当水解液中的葡萄糖浓度升高时，纤维素的水解效率下降。因此，较低的木质纤维素酶解效率，较高的纤维素酶使用成本是制约木质纤维素这一可再生能源开发利用的瓶颈。
直接利用木质纤维素预处理液中的纤维寡糖是有效降低纤维素酶解和发酵成本，实现木质纤维素高效发酵转化的途径之一。但是纤维寡糖是大分子物质，不能以自由扩散等简单的扩散方式通过细胞膜，必需转运蛋白的协助。在目前的工业发酵微生物菌株中，没有纤维寡糖转运蛋白，不具有直接利用纤维寡糖进行发酵的能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种短双歧杆菌纤维寡糖转运蛋白基因及蛋白，以解决上述现有技术存在的问题，通过将短双歧杆菌纤维寡糖转运蛋白转入目的菌株中获得能够高效利用纤维素，尤其是纤维四糖的工程菌，为实现产业上利用纤维素奠定了基础。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种短双歧杆菌纤维寡糖转运蛋白基因，所述寡糖转运蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种所述短双歧杆菌纤维寡糖转运蛋白基因表达的寡糖转运蛋白，所述寡糖转运蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种纤维素发酵工程菌的构建方法，所述构建方法包括构建所述短双歧杆菌纤维寡糖转运蛋白基因的表达载体，利用所述载体转化感受态目的菌株，再诱导转化后目的菌株中短双歧杆菌纤维寡糖蛋白表达。
本发明还提供一种由所述构建方法构建的工程菌。
本发明还提供一种所述的工程菌在纤维素发酵中的应用。
进一步的，所述的纤维素为纤维寡糖。
进一步的，所述的纤维寡糖包括纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖中的一种或多种。
进一步的，所述的纤维寡糖为纤维四糖。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过将短双歧杆菌纤维寡糖转运蛋白基因转入感受态目的菌株并进行诱导表达培养，成功构建了高效表达短双歧杆菌纤维寡糖转运蛋白的工程菌株，并通过热力学实验证明了其能够高效结合纤维寡糖，尤其是纤维二糖，为产业上进一步利用纤维素提供了工具。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为牛血清蛋白标准曲线；
图2为表达产物的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，其中泳道1为Standardprotein Marker(Low)；泳道2为纯化的Bbr-CLDE；
图3为底物结合蛋白Bbr-CLDE与各种纤维寡糖相互作用的微量热差示扫描量结果，其中A为Bbr-CLDE及其与葡萄糖的DSC分析；B为Bbr-CLDE及其与纤维二糖的DSC分析；C为Bbr-CLDE及其与纤维三糖的DSC分析；D为Bbr-CLDE及其与纤维四糖的DSC分析；E为Bbr-CLDE及其与纤维五糖的DSC分析；
图4为底物结合蛋白Bbr-CLDE的质量作用效应；
图5为纤维寡糖和底物结合蛋白Bbr-CLDE在30℃等温滴定的曲线，其中A为纤维二糖滴定Bbr-CLDE；B为纤维三糖滴定Bbr-CLDE；C为纤维四糖滴定Bbr-CLDE；D为纤维五糖滴定Bbr-CLDE。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均能够从商业途径获得。
实施例1Bbr-cldE基因转化大肠杆菌
1.密码子优化和重组质粒构建
根据文献报道(The CebE/MsiK Transporter is a Doorway to the Cello-oligosaccharide-mediated Induction of Streptomyces scabies Pathogenicity，Jourdan S等,2016和Several Archaeal Homologs of Putative Oligopeptide-BindingProteins Encoded by Thermotoga maritima Bind Sugars，Nanavati D M等，2006和Cellobiose Uptake in the Hyperthermophilic Archaeon Pyrococcus furiosus IsMediated by an Inducible,Konings S M等，2001和Cellodextrin UtilizationbyBifidobacterium breveUCC2003，Pokusaeva K等，2011和HyperthermophilicThermotoga Species Differ with Respect to Specific Carbohydrate Transportersand Glycoside Hydrolases，Frock AD等，2012和Tracking the Subtle MutationsDriving Host Sensing by the Plant Pathogen Streptomyces scabies，SamuelJourdan A I M F等，2017)，对来自短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)的基因序列进行BlastX比对分析，并对其编码的氨基酸序列进行蛋白质结构域预测和信号肽分析，将其命名为Bbr-cldE。根据对基因序列的分析，由科雷生物科技有限责任公司构建到pET-28a表达载体上，获得DNA分子溶液。
2.从E.coli中小量制备质粒
(1)取1.5mL过夜培养的菌液加入容积为2mL的EP管，12000rpm离心1min，弃去上清。
(2)向EP管中加入250μL预冷的P1溶液(使用前加入RNase A)，使用涡旋振荡器重悬菌体。
(3)向EP管中加入250μL预冷的P2溶液，温和地上下翻转6-8次，使菌体充分裂解。
(4)向EP管中加入350μL预冷的P3溶液，立刻温和地上下翻转6-8次，充分混匀，12000rpm离心10min。
(5)将上清转移到吸附柱CP3中，12000rpm离心1min，弃去收集管中的废液，将吸附柱CP3放回收集管中。
(6)向吸附柱CP3中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm离心1min，弃去收集管中的废液，将吸附柱CP3放回收集管中。
(7)向吸附柱CP3中加入600μL去漂洗液PW，12000rpm离心1min，弃去收集管中的废液，将吸附柱CP3放回收集管中。
(8)重复步骤7。
(9)将吸附柱CP3放回收集管中，12000rpm离心2min，将吸附柱CP3转移到一个干净的EP管，向吸附膜中间部位加入50μL无菌水，室温静置2min，12000rpm离心2min，将质粒溶液收集到EP管，放-20℃存储备用。
3.氯化钙-氯化镁法制备大肠杆菌感受态细胞(E.coli Rosetta(DE3))
(1)从-40℃取出甘油保藏的E.coli菌种，在超净工作台里用接种环蘸取菌液，在无抗生素的LA平板上划线，放37℃培养过夜。
(2)从LA平板上挑取生长良好的单菌落，接种到内含5mL LB培养基的直形瓶，37℃，200rpm培养过夜。
(3)按1％的接种量(v/v)转接到内含100mL LB培养基的锥形瓶里，37℃，200rpm培养2-3h，菌液OD600至0.4-0.6。
(4)将培养好的菌液使用冰浴进行冷却，冰浴时间约为30min，中间偶有混匀。
(5)在超净台里将充分冷却的菌液分装到预冷的、无菌的容积为50mL的聚丙烯管，在4℃下，5000rpm离心10min，弃去上清。
(6)向聚丙管中加入35mL预冷的氯化钙-氯化镁溶液，轻轻敲打重悬菌体，在4℃下，5000rpm离心5min，弃去上清。
(7)重复步骤6两次。
(8)向聚丙管中加入4mL预冷的甘油-氯化钙溶液，轻轻敲打重悬菌体，在冰上将感受态细胞分装到无菌的、预冷的EP管，每管100μL，放-80℃冷藏。
4.DNA分子转化大肠杆菌感受态细胞
(1)从-80℃取出大肠杆菌感受态细胞，迅速插入冰里，让大肠杆菌感受态细胞在冰里自然融化。
(2)用微量移液器吸取适量步骤1中制备的DNA分子溶液加入内含100μL大肠杆菌感受态细胞的EP管中，混匀后冰浴静置30min。
(3)将EP管快速地放入42℃水浴，在静置的条件下，热激90s。
(4)热激结束后立即取出EP管，冰浴静置3min。
(5)向EP管内加入200μL SOC培养基，37℃，200rpm培养1h,。
(6)取适量体积的培养物涂布到含有相应抗生素的LA平板上，放37℃恒温培养箱倒置培养12-16h。
实施例2重组底物结合蛋白的诱导表达
(1)分别从转化平板上挑取生长良好的单菌落到内含5mL的LB培养基(含50μg/mL卡那霉素，25μg/mL氯霉素)的直形瓶中，37℃、200rpm培养10h。
(2)按1％(v/v)的接种量分别转接到内含65mL LB培养基(含50μg/mL卡那霉素，25μg/mL氯霉素)的锥形瓶中，37℃、200rpm培养过夜。
(3)按1％(v/v)的接种量分别转接到内含1L LB培养基(含50μg/mL卡那霉素，25μg/mL氯霉素)的锥形瓶中，37℃、200rpm培养2-3h，菌液OD600至0.4-0.6时加入终浓度为1mmol/L的IPTG。
(4)重组菌株E.coli Rosetta(DE3)/pET-Bbr-cldE放16℃、180rpm培养20h进行目的蛋白的诱导表达。
实施例3重组底物结合蛋白质的纯化
1.重组底物结合蛋白质的纯化
(1)诱导6L菌液表达后，8000rpm离心10min，收集菌体。
(2)用300mL Lysis buffer(pH 8.0，咪唑10mmol/L，氯化钠300mmol/L，磷酸二氢钠50mmol/L)重悬菌体，加入3mL 25mg/mL的溶菌酶，混匀后冰上静置20min。
(3)在冰水混合物中使用超声波细胞破碎仪进行破胞，破胞总时间20min，工作时间5s，间歇时间5s，破胞功率30％。
(4)破胞结束后,重组菌株E.coli Rosetta(DE3)/pET-Bbr-cldE破胞结束后，破胞液于4℃，12000rpm离心30min，离心后的上清液为粗蛋白液。
(5)分别吸取2mL Ni-NTA填料至层析柱中，用Lysis buffer(pH 8.0，咪唑10mmol/L，氯化钠300mmol/L，磷酸二氢钠50mmol/L)充分平衡层析柱中的Ni-NTA填料。
(6)分别将粗蛋白液与用Lysis buffer平衡的Ni-NTA填料混合，放10℃，150rpm作用1h，使含有组氨酸标签的重组底物结合蛋白与Ni-NTA填料充分结合。
(7)分别将混合液转移到层析柱中并排空液体，向层析柱中加入10mL预冷的Washbuffer(pH 8.0，氯化钠300mmol/L，磷酸二氢钠50mmol/L，纯化Bbr-CLDE和Ssc-SCAB时咪唑浓度为20mmol/L，纯化Pfu-CBTA和Tma-CBTA时咪唑浓度为40mmol/L)，轻轻重悬Ni-NTA，排空层析柱内的液体，重复4次。
(8)充分洗涤以后向层析柱中加入10mL预冷的Elution buffe(pH 8.0，咪唑250mmol/L，氯化钠300mmol/L，磷酸二氢钠50mmol/L)洗脱底物结合蛋白，收集洗脱液，重复3次，4℃保存含有底物结合蛋白的洗脱液。
(9)底物结合蛋白洗脱结束以后，使用Elution buffe多次冲洗Ni-NTA填料，冲洗结束后用20％的乙醇溶液保存。纯化同一种底物结合蛋白时，Ni-NTA填料可重复使用3-5次，结合率下降以后可对Ni-NTA填料进行再生。
2.底物结合蛋白的脱盐
(1)将含有底物结合蛋白的洗脱液转移到30kDa的超滤管，洗脱液较多时可分多次转移，在4℃条件下，5000rpm离心30min，弃去收集管中的废液。
(2)超滤管中的洗脱液约为500μL时，向超滤管中加入buffer A溶液(pH 7.0，50mMTris-HCl，100mM NaCl)在4℃条件下，5000rpm离心30min，弃去收集管中的废液。
(3)重复步骤2两次。
(4)分别将超滤管中含有底物结合蛋白的溶液和收集管中的超滤液转移到干净的EP管和直形瓶，放4℃保存。
3.蛋白质标准曲线的绘制和定量分析
吸取100μL牛血清蛋白BSA标准品(2mg/mL)，加入1900μL ddH20后充分混匀，按照表2-4在1.5mL的EP管内用稀释液(ddH2O、0.9％NaCl或者PBS)稀释BSA标准品，每个浓度三个平行。
表1牛血清蛋白标准曲线测定
Figure BDA0002732952410000101
分别吸取20μL稀释后的BSA标准品溶液加入1.5mL的EP管，每个浓度做三个平行，分别向每管加入1mL复温的Broadford Dye Reagent，混匀后室温反应5min，各取200μL加入96孔板，使用酶标仪测定600nm处的吸光度值，计算各浓度的平均值后减去Blank的平均值，以蛋白质含量为横坐标，OD600的读数为纵坐标，绘制BSA标准品溶液的标准曲线(图1)。
纯化的底物结合蛋白定量：分别取20μL不同稀释倍数的目的蛋白溶液加入1mL复温的Broadford Dye Reagent，混匀后室温反应5min，各取200μL加到酶标板，读取OD600的吸光度值，代入标准曲线计算目的蛋白的质量浓度，质量浓度为9.537092mg/ml。
实施例4底物结合蛋白的SDS-PAGE分析
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)用于分析底物结合蛋白的表达情况与纯化的底物结合蛋白的分子量和纯化程度，实验步骤如下：
(1)将制胶器、胶梳、玻璃板和Spacer洗干净，并组装好，用水检测严密性，若严密性好，弃去玻璃夹板层里的水，用滤纸吸干。
(2)按照表2-5配制分离胶和浓缩胶溶液，混匀以后向玻璃板夹层灌注分离胶溶液，灌至合适高度后加入1mL无水乙醇，室温静置30min。
(3)待分离胶凝固后弃去玻璃夹层里的无水乙醇，用滤纸吸干，快速灌入浓缩胶溶液，灌满玻璃板夹层以后插入胶梳，室温静置30min。
(4)待浓缩胶凝固后将凝胶放入电泳槽，用电极缓冲液冲洗胶孔，用10mA恒定电流进行预电泳15min。
表2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶配方
Figure BDA0002732952410000111
Figure BDA0002732952410000121
(5)取30μL的底物结合蛋白溶液与10μL 4×protein loading buffer混匀，沸水浴30 min，12000 rpm离心10 min。
(6)分别各取4-10μL上清加入聚丙烯酰胺凝胶胶孔，上样结束后用120 V恒定电压进行电泳，至溴酚兰条带到达聚丙烯酰胺凝胶底部止。
(7)电泳结束后，将玻璃板撬开，小心取出聚丙烯酰胺凝胶，放入考马斯亮蓝R-250染色液进行染色，25℃，60 rpm染色30 min。
(8)染色结束后，弃去考马斯亮蓝R-250染色液，清水冲洗，加入适量脱色液进行脱色，25℃，60 rpm脱色，至聚丙烯酰胺凝胶无明显背景颜色止，中间需多次换脱色液。
(9)待聚丙烯酰胺凝胶充分脱色以后，使用成像仪Gel DocTM XR+获得理想的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
如图2所示，对诱导后的重组菌株分别进行超声破胞纯化，在相应分子量大小处出现了明显的蛋白质特征性条带，Bbr-CLDE(Lane 2)在46.6kDa处出现特征性蛋白质条带，说明我们已经成功表达了这个底物结合蛋白，并且纯化后的Bbr-CLDE蛋白质溶液纯度较高。
实施例5等温滴定量热法(ITC)测定底物结合蛋白与纤维寡糖之间的亲和力
1.各种纤维寡糖滴定底物结合蛋白
(1)分别用最后一次收集管中的超滤液将底物结合蛋白溶液稀释至0.1—0.2mmol/L并配制浓度为底物结合蛋白浓度10倍左右的各种纤维寡糖溶液。
(2)于4℃真空脱气10—20min，设置等温滴定的各个参数。
底物结合蛋白Bbr-CLDE的滴定条件：
底物结合蛋白的滴定浓度为0.1mmol/L，纤维二糖的滴定浓度为6mmol/L，其余各种纤维寡糖的滴定浓度为4mM，进样针体积为40μL，进样针抽滤时间5s，每次滴定持续时间6s，第1滴0.2μL，第2-20滴2.0μL，共30滴，每两滴的间隔时间120s，样品池温度30℃，参考能量值10μcal/sec，起始延长时间1min，进样针搅拌速度500rpm，反馈模式low。
2.底物结合蛋白的热力学参数
使用Origin ITC 200软件进行数据分析和曲线拟合，在一次等温滴定实验中，ITC可以测定亲和力常数Kb，化学计量数n，结合的焓变△H和熵变△S，根据实验测得的热力学参数和吉布斯—亥姆霍兹方程可以计算出吉布斯自由能△G。
3.结果
使用等温滴定量热法(ITC)测定底物结合蛋白在buffer A中与纤维寡糖的结合特性，在30℃或者50℃等温滴定时，等体积地把纤维寡糖分别滴入充满底物结合蛋白的样品池内(第一滴体积较小，)。若底物结合蛋白与纤维寡糖结合，则释放热量并被记录下来形成能量峰，最开始的几滴产生能量较多，峰值较高，随着纤维寡糖不断地滴入样品池，底物结合蛋白趋于饱和，产生的能量越来越少，峰值越来越低，当样品池中的底物结合蛋白完全饱和时，记录到的峰值为纤维寡糖的稀释所产生的热量，化学计量数n也不会再改变；若底物结合蛋白与纤维寡糖不结合，则只有微小的因稀释放热形成的峰。在相同的滴定条件下，测定各种纤维寡糖滴定buffer A时产生的稀释热，作为空白，数据分析时点对点扣除背景。
等温滴定量热法可以直接测定底物结合蛋白和纤维寡糖结合时产生的结合焓变化量(△H)、熵变化量(△S)、结合常数(Kb)和化学计量数(n)，同时，根据实验测得的热力学参数可以计算出结合反应的吉布斯自由能变化量(△G)和转变温度(T转)。使用纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖分别滴定底物结合蛋白Bbr-CLDE，滴定结果使用一个结合位点模式进行曲线拟合运算分析，根据得到的解离常数Kd，提示所有的底物结合蛋白对各自的底物均有不同程度的亲和力，有些底物结合蛋白在等温滴定饱和以后尚有微弱的热容变化量，可能是由于纤维寡糖与底物结合蛋白的非特异性相互作用和(或)纤维寡糖的稀释引起。
使用终浓度为0.022mmol/L的底物结合蛋白Bbr-CLDE进行DSC热力学分析，结果图3所示。底物结合蛋白Bbr-CLDE与纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖结合以后，Tm值比未结合纤维寡糖的Bbr-CLDE要高，说明纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖与Bbr-CLDE结合以后，诱导了Bbr-CLDE内部构象改变。应用非二态模式对Bbr-CLDE及其与各种纤维寡糖形成复合物以后的微量热差示扫描结果进行分析，热力学参数：溶解温度Tm、量热焓变△H、范特霍夫焓变△HV(具体见表3)。
表3 Bbr-CLDE的DSC热力学参数
Figure BDA0002732952410000141
Figure BDA0002732952410000151
从表3可知底物结合蛋白Bbr-CLDE的△H﹥△Hv且△H/△Hv的比值等于2.03，说明Bbr-CLDE为单体蛋白质且内部含有两个结构域，结合图3可知，Bbr-CLDE及其与各种纤维寡糖的复合物在变性过程中只有一个热容扫描峰，说明Bbr-CLDE内部的两个结构域在变性过程中具有相同或相近的溶解温度Tm和焓变△H，并且两个结构域的变性过程相互独立，互不干扰。底物结合蛋白Bbr-CLDE及其与各种纤维寡糖形成的复合物均有△HV﹤△H的关系，所以，底物结合蛋白Bbr-CLDE的变性过程是非二态转变模式。
结合表3和图3可知，纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖结合天然状态的底物结合蛋白Bbr-CLDE，所以，纤维二糖(图3-B)、纤维三糖(图3-C)、纤维四糖(图3-D)与Bbr-CLDE形成的复合物热稳定性提高，各自的Tm值较未结合纤维寡糖的天然状态的底物结合蛋白Bbr-CLDE升高。Bbr-CLDE加入葡萄糖(图3-A)以后，其Tm值为53.69℃，与未结合纤维寡糖的天然状态的底物结合蛋白Bbr-CLDE的Tm值53.01℃相比，几乎无变化，说明底物结合蛋白Bbr-CLDE不结合葡萄糖。底物结合蛋白Bbr-CLDE与纤维五糖的Tm值为54.59℃，总量热焓变为2.45×105cal/mol与未结合纤维寡糖的天然状态的底物结合蛋白Bbr-CLDE的Tm值53.01℃，总量热焓变2.19×105cal/mol相比，变化不大，说明底物结合蛋白Bbr-CLDE不与纤维五糖结合(图3-E)，其Tm值和总量热焓变的微弱变化可能是由于纤维五糖的分子量较大，将两者混合以后，非特异性作用加强质量作用效应的缘故。
纤维寡糖与底物结合蛋白的相互作用是分子内部和分子间共同作用的结果，这些相互作用表现在焓变化量△H、熵变化量△S、吉布斯自由能变化量△G。在底物只和自然状态的蛋白质以非共价键紧密结合，而与已经变性的蛋白质不结合的情况下，当温度升高致蛋白质变性时，底物与蛋白质形成的复合物解离，底物重新被释放到溶液中，增加了溶液中底物的浓度，进而影响自然状态的蛋白质向变性蛋白质转变的平衡点，Tm值也会发生变化，称之为质量作用效应(the mass action effect)。纤维二糖与底物结合蛋白Bbr-CLDE的质量作用效应如图3所示。随着纤维二糖浓度的逐渐增加，Bbr-CLDE与纤维二糖形成的复合物Tm值随着增大。分别测定了底物结合蛋白Bbr-CLDE的Tm值及其与2mM、4mM、8mM纤维二糖的Tm值，分别为52.72±0.08℃、55.35±0.05℃、56.62±0.02℃、57.92±0.10℃，随着纤维二糖浓度的增加，Tm值会轻微升高，说明纤维二糖只与自然状态的底物结合蛋白Bbr-CLDE以非共价键紧密结合，而与已经变性的底物结合蛋白Bbr-CLDE不结合，基于微量热差示扫描量热仪的工作原理，说明使用微量热差示扫描量热仪研究底物结合蛋白Bbr-CLDE与各种纤维寡糖的实验结果是可信的。
使用终浓度为4-6mmol/L的纤维寡糖溶液分别滴定底物结合蛋白Bbr-CLDE，测定Bbr-CLDE的结合热力学特性，结果如图5所示。Bbr-CLDE可与纤维二糖(图5-A)、纤维三糖(图5-B)、纤维四糖(图5-C)结合，等温滴定量热法的结果与微量热差示扫描量热法结果一致。使用一个结合位点模式对滴定结果进行拟合分析，各结合热力学参数见表4。
表4底物结合蛋白Bbr-CLDE与纤维寡糖相互作用的热力学参数
Figure BDA0002732952410000171
从表4可知，Bbr-CLDE与纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖均有结合，对纤维四糖亲和力最强，结合常数Kb为(1.12±0.18)×104M-1，对对纤维二糖亲和力最弱，结合常数Kb为(0.55±0.02)×104M-1，对与DSC结果相一致。
从表3和表4可知，对纤维四糖的亲和力最强，在30℃测得其解离常数Kd为91μM，纤维三糖次之，解离常数为94μM，对纤维二糖的亲和力最弱，解离常数为184μM。吉布斯自由能变化量(△G)除了能判断反应的方向性以外，还能判断反应生成物的相对稳定性，从表3可知，各个复合物的相对稳定性由大到小依次为：G4-Bbr-CLDE(-5.6kcal/mol)﹥G3-Bbr-CLDE(-5.58kcal/mol)﹥G2-Tfu-CBTA(-5.18kcal/mol)，解离常数Kd和吉布斯自由能变化量△G表明：复合物的亲和力越强，稳定性越高。由表5可知，Bbr-CLDE与各种纤维寡糖(纤维五糖(图5-D)除外)的结合熵变化量(△S)均小于0，说明Bbr-CLDE和各种纤维寡糖(纤维五糖除外)的结合反应在本实验条件下为自发的正向不可逆过程。结合焓变化量(△H)均小于0，说明Bbr-CLDE和各种纤维寡糖(纤维五糖除外)的结合反应在本实验条件下为放热反应；△S、△H、△G均小于0，由此可以判断，在本实验条件下，底物结合蛋白Bbr-CLDE与各种纤维寡糖(纤维五糖除外)的结合反应是由焓驱动的正向自发进行的不可逆反应，温度T起能动作用。纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖与底物结合蛋白的转变温度依次为963.37(K)、762.02(K)、553.91(K)，均比滴定温度T(323.15K)大，从表3-8可知，△H﹤0、△S﹤0均小于0，所以反应正向自发进行。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 广西科学院
<120> 一种短双歧杆菌纤维寡糖转运蛋白基因
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1308
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atgaagaggt caaaggcgat gttttcagct gtgttagctg ttgctaccgt ggtgagcctc 60
gcagcttgcg gtactgctaa taatagtgga aacgctacca ctaaagatgg aaaaacgatt 120
atcaagattc aaacctttaa taattttggc tatggtaagc ccaccaatga gcgcccaagt 180
gctgacttgt ggagcaagta cgaaaagctg catccgaaca tcaaaatcga agagactatc 240
gcctcgggtt ccgatgaggc gcgttcggct ttcaacacgg ccatctcttc cggttctgac 300
gcctacgaca tctatgctgc cgacattgcc tggatgccat cagtgcttgc gatctctgat 360
tccttcatgg atctgagcag ctacctcaaa aagaacgatt ggcttgactg gaaggtcgaa 420
ggtggcaagg ccaatggcaa gataattggc gcaggtaacg atatcggtcc gactgccgtg 480
tgctaccgtt ccgatttgtt ccagaaggct ggtctaccca ccgatcgtac cgaagtcgcc 540
aagatgctcg gtggagattc tgcgacctgg gatcagtact tcaaggtagg ccgtgaatat 600
acccagaaga ctggcttgcc gtggtatgac gccatgggcg ggctatgggg caccatgaaa 660
tcccaaatga aggaatccta cgtcaagaag gacggcacca tcgttgccac cactgacaaa 720
atgaagaaga acttcgaaac gctgactgcc accaccgata tgtccgccca tctgactcag 780
tggagcgatg attggaacgc gcaattcaag tctgataagg gctttgccac catcatgtgt 840
cccgcatggc tggtcaacaa catcaaaggc aatgcaggct ccgatttcaa gggatgggac 900
atcgctgatg tcactcctgg tggcggttcc aaccaaggtg gttcctggct tgtagtgccg 960
gagagctcca aggtaaagga ggaggccgcc aaactggtgg catggcttac cgcccctgag 1020
cagcaggtag ctaccttcaa ggccgcttcg aactatccaa gctcgccgac tgcaatggcc 1080
aatgataccg tttcaaacaa agtggatacc ttcctcaaca atgctccgac cggcaagatc 1140
ttcgcagacc gagcgaaggc tgtgaaggtt gttccatata tgggtgccca gtatttcgat 1200
atcgattcga agttcggcaa cgcattggat cgtgtggatg tcaataagga gcagacaccg 1260
tcccaggcgt ggaagcaata cgtcgacgac gtgaagtccc tgtcctga 1308
<210> 2
<211> 435
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Met Lys Arg Ser Lys Ala Met Phe Ser Ala Val Leu Ala Val Ala Thr
1 5 10 15
Val Val Ser Leu Ala Ala Cys Gly Thr Ala Asn Asn Ser Gly Asn Ala
20 25 30
Thr Thr Lys Asp Gly Lys Thr Ile Ile Lys Ile Gln Thr Phe Asn Asn
35 40 45
Phe Gly Tyr Gly Lys Pro Thr Asn Glu Arg Pro Ser Ala Asp Leu Trp
50 55 60
Ser Lys Tyr Glu Lys Leu His Pro Asn Ile Lys Ile Glu Glu Thr Ile
65 70 75 80
Ala Ser Gly Ser Asp Glu Ala Arg Ser Ala Phe Asn Thr Ala Ile Ser
85 90 95
Ser Gly Ser Asp Ala Tyr Asp Ile Tyr Ala Ala Asp Ile Ala Trp Met
100 105 110
Pro Ser Val Leu Ala Ile Ser Asp Ser Phe Met Asp Leu Ser Ser Tyr
115 120 125
Leu Lys Lys Asn Asp Trp Leu Asp Trp Lys Val Glu Gly Gly Lys Ala
130 135 140
Asn Gly Lys Ile Ile Gly Ala Gly Asn Asp Ile Gly Pro Thr Ala Val
145 150 155 160
Cys Tyr Arg Ser Asp Leu Phe Gln Lys Ala Gly Leu Pro Thr Asp Arg
165 170 175
Thr Glu Val Ala Lys Met Leu Gly Gly Asp Ser Ala Thr Trp Asp Gln
180 185 190
Tyr Phe Lys Val Gly Arg Glu Tyr Thr Gln Lys Thr Gly Leu Pro Trp
195 200 205
Tyr Asp Ala Met Gly Gly Leu Trp Gly Thr Met Lys Ser Gln Met Lys
210 215 220
Glu Ser Tyr Val Lys Lys Asp Gly Thr Ile Val Ala Thr Thr Asp Lys
225 230 235 240
Met Lys Lys Asn Phe Glu Thr Leu Thr Ala Thr Thr Asp Met Ser Ala
245 250 255
His Leu Thr Gln Trp Ser Asp Asp Trp Asn Ala Gln Phe Lys Ser Asp
260 265 270
Lys Gly Phe Ala Thr Ile Met Cys Pro Ala Trp Leu Val Asn Asn Ile
275 280 285
Lys Gly Asn Ala Gly Ser Asp Phe Lys Gly Trp Asp Ile Ala Asp Val
290 295 300
Thr Pro Gly Gly Gly Ser Asn Gln Gly Gly Ser Trp Leu Val Val Pro
305 310 315 320
Glu Ser Ser Lys Val Lys Glu Glu Ala Ala Lys Leu Val Ala Trp Leu
325 330 335
Thr Ala Pro Glu Gln Gln Val Ala Thr Phe Lys Ala Ala Ser Asn Tyr
340 345 350
Pro Ser Ser Pro Thr Ala Met Ala Asn Asp Thr Val Ser Asn Lys Val
355 360 365
Asp Thr Phe Leu Asn Asn Ala Pro Thr Gly Lys Ile Phe Ala Asp Arg
370 375 380
Ala Lys Ala Val Lys Val Val Pro Tyr Met Gly Ala Gln Tyr Phe Asp
385 390 395 400
Ile Asp Ser Lys Phe Gly Asn Ala Leu Asp Arg Val Asp Val Asn Lys
405 410 415
Glu Gln Thr Pro Ser Gln Ala Trp Lys Gln Tyr Val Asp Asp Val Lys
420 425 430
Ser Leu Ser
435

Claims (8)

1.一种短双歧杆菌纤维寡糖转运蛋白基因，其特征在于，所述寡糖转运蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的短双歧杆菌纤维寡糖转运蛋白基因编码的寡糖转运蛋白，其特征在于，所述寡糖转运蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种纤维素发酵工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括构建权利要求1所述短双歧杆菌纤维寡糖转运蛋白基因的表达载体，利用所述载体转化感受态目的菌株，再诱导转化后目的菌株中短双歧杆菌纤维寡糖蛋白表达。
4.一种如权利要求3所述的构建方法构建的工程菌。
5.一种权利要求4所述的工程菌在纤维素发酵中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的纤维素为纤维寡糖。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的纤维寡糖包括纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖中的一种或多种。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的纤维寡糖为纤维四糖。
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