ES2900861T3 - Digestión enzimática de biomasa de microalgas para la recuperación de lípidos, glúcidos y proteínas - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de hidrólisis enzimática para convertir carbohidratos de algas en glúcidos monoméricos que comprende: digerir microalgas con una mezcla de enzimas para producir biomasa tratada enzimáticamente, en el que la mezcla de enzimas comprende una mezcla de al menos una proteasa y al menos una glucoamilasa; en el que está presente una carga de proteasa de al menos 0,25 kU de proteasa por gramo de biomasa y 1 unidad de proteasa se define como la cantidad de enzima que hidroliza 1 mmol de L-leucina-p- nitroanilida por min; en el que las microalgas se digieren a un pH de 3,0 a 5,5; y separar la biomasa tratada enzimáticamente en una fase sólida y un sobrenadante, en el que la fase sólida contiene lípidos y el sobrenadante contiene carbohidratos y nutrientes.

Description

DESCRIPCIÓN

Digestión enzimática de biomasa de microalgas para la recuperación de lípidos, glúcidos y proteínas Antecedentes de la invención

El aumento de los precios de los productos petroquímicos y el interés en reducir las emisiones de CO² han impulsado el desarrollo de la producción de productos químicos bioderivados. Como ejemplo, el succinato es una plataforma química importante para la producción de diversos derivados de alto valor añadido, tales como el 1,4-butanodiol, el disuccinato de etilendiamina y el ácido adípico. Actualmente, el succinato se puede producir a partir de síntesis petroquímica o bien fermentación microbiana, teniendo un coste este último proceso que podría competir favorablemente con la producción petroquímica en el futuro. Para la producción de ácido succínico bioderivado, la búsqueda de materias primas económicas y la optimización del procedimiento de pretratamiento son dificultades importantes en la reducción del coste de la producción de ácido succínico. Los procedimientos de pretratamiento biológico, tales como la hidrólisis enzimática, han reemplazado a la hidrólisis ácida tradicional debido a las condiciones suaves, la menor cantidad de subproductos y la ausencia de problemas de corrosión. Sin embargo, quedan muchas dificultades y una necesidad insatisfecha en la técnica de procedimientos de hidrólisis enzimática más eficaces y rentables.

El documento WO 2012/089843 A divulga un procedimiento de hidrólisis enzimática de microalgas y separación de una fase orgánica que comprende lípidos, en el que la proteasa usada puede ser una proteasa ácida fúngica y pueden estar presentes otras enzimas tales como una amilasa.

Seung Phill Choi et al.: "Enzymatic pretreatment of Chlamydomonas reinhardtii biomass for ethanol production" Bioresource Technology, vol. 101, n.° 14, 9 de marzo de 2010, páginas 5330-5336 divulga un pretratamiento enzimático de dos etapas de microalgas, que implica licuefacción por alfa-amilasa y sacarificación por amiloglucosidasa.

Mitsufumi Matsumoto et al.: "Saccharification of marine microalgae using marine bacteria for ethanol production", Applied Biochemistry and Biotechnology, vol. 105, n.° 1 -3, 1 de enero de 2003, páginas 247-254 divulga la hidrólisis enzimática de microalgas verdes con amilasa y glucoamiloglasa y la posterior conversión de los glúcidos obtenidos en etanol.

El documento US 2012/238732 A1 divulga un procedimiento para recuperar lípidos de microalgas que comprende un tratamiento enzimático doble de microalgas con una proteasa y extracción de lípidos con un disolvente.

El documento US 2011/086386 A1 divulga un procedimiento de tratamiento enzimático de microalgas con proteasa y posiblemente otras enzimas, la separación de una fase orgánica que comprende lípidos y una fase acuosa que comprende carbohidratos.

El documento US 2009/203101 A1 divulga composiciones enzimáticas que comprenden glucoamilasa, amilasa y proteasa ácida fúngica.

Sumario de la invención

En el presente documento se proporciona un procedimiento como se reivindica de hidrólisis enzimática para convertir carbohidratos de algas en glúcidos monoméricos que comprende:

digerir microalgas con una mezcla de enzimas para producir biomasa tratada enzimáticamente,

en el que la mezcla de enzimas comprende una mezcla de al menos una proteasa y al menos una glucoamilasa; en el que está presente una carga de proteasa de al menos 0,25 kU de proteasa por gramo de biomasa, en el que 1 unidad de proteasa se define como la cantidad de enzima que hidroliza 1 pmol de L-leucina-p-nitroanilida por min;

en el que las microalgas se digieren a un pH de 3,0 a 5,5; y

separar la biomasa tratada enzimáticamente en una fase sólida y un sobrenadante, en el que la fase sólida contiene lípidos y el sobrenadante contiene carbohidratos y nutrientes.

El sobrenadante se puede someter a fermentación microbiana para obtener un producto bioderivado. En determinados modos de realización, el producto bioderivado comprende ácido succínico.

En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además extraer lípidos de los sólidos con un disolvente orgánico. En determinados modos de realización, las microalgas son microalgas húmedas ricas en lípidos.

En el presente documento se proporciona un procedimiento como se reivindica de hidrólisis enzimática que comprende las etapas de tratar microalgas con una o más proteasas y al menos una glucoamilasa, en el que está presente una carga de proteasa de al menos 0,25 kU, en el que las microalgas se digieren a un pH de 3 a 5,5, para obtener biomasa digerida; separar la biomasa tratada enzimáticamente en una fase sólida y un sobrenadante, en el que la fase sólida contiene lípidos y el sobrenadante contiene carbohidratos y nutrientes. El procedimiento puede comprender además el tratamiento con una mezcla de enzimas que comprende adicionalmente al menos una a-amilasa.

Se proporciona además un procedimiento como se reivindica de hidrólisis enzimática que comprende tratar microalgas con una mezcla de enzimas que comprende una mezcla de al menos una proteasa y al menos una glucoamilasa, en el que está presente una carga de proteasa de al menos 0,25 kU, en el que las microalgas se digieren en una pH de 3 a 5,5, en el que la proteasa comprende una proteasa ácida fúngica, y separar la biomasa tratada enzimáticamente en una fase sólida y un sobrenadante, en el que la fase sólida contiene lípidos y el sobrenadante contiene carbohidratos y nutrientes; y someter el sobrenadante a fermentación microbiana para obtener un producto bioderivado.

Se proporciona además un procedimiento como se reivindica de hidrólisis enzimática que comprende las etapas de tratar microalgas deficientes en lípidos con una mezcla de al menos una proteasa y al menos una glucoamilasa, en el que está presente una carga de proteasa de al menos 0,25 kU, en el que las microalgas se digieren a un pH de 3 a 5,5, para obtener biomasa digerida; y separar además la biomasa tratada enzimáticamente en una fase sólida y un sobrenadante, y opcionalmente procesar de forma fermentativa el sobrenadante para obtener un producto bioderivado. La separación comprende separar los sólidos del líquido para obtener sólidos y un sobrenadante, conteniendo el sobrenadante carbohidratos y nutrientes. El sobrenadante se puede someter a fermentación microbiana para obtener un producto bioderivado.

El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones implica una etapa única en la que la liberación de lípidos y la descomposición de polisacáridos en monosacáridos fermentables se produce simultáneamente. El procedimiento utiliza una mezcla de enzimas que comprende al menos una proteasa y al menos una glucoamilasa. En determinados modos de realización, el procedimiento no requiere pretratamiento (térmico o mecánico) antes de la hidrólisis enzimática y se puede llevar a cabo a bajas temperaturas usando un equipo relativamente sencillo.

Además, se proporciona un procedimiento de hidrólisis enzimática de dos fases para extraer lípidos e hidrolizar glúcidos. En la primera fase, se usa un primer conjunto de enzimas de acuerdo con la reivindicación 1 para alterar la pared celular, extraer lípidos y al menos hidrolizar parcialmente los carbohidratos. En la segunda fase, se usa un segundo conjunto de enzimas para completar la hidrólisis de los carbohidratos. Se puede extraer más de un 85 % de los lípidos y se puede liberar un 99 % de los glúcidos monómeros.

Se proporciona además un procedimiento de hidrólisis enzimática de una fase para extraer lípidos e hidrolizar carbohidratos simultáneamente. El procedimiento implica usar una mezcla de enzimas de acuerdo con la reivindicación 1.

Se describe además un procedimiento de fermentación, comprendiendo el procedimiento usar una mezcla de enzimas para hidrolizar proteínas en la biomasa de microalgas y liberar nutrientes en el hidrolizado, en el que los nutrientes y aminoácidos liberados se usan como fuente de nitrógeno en la fermentación sin ninguna adición adicional. Se pueden recoger residuos sólidos y se pueden realizar etapas opcionales para extraer productos valiosos de los mismos. La fase líquida del hidrolizado de microalgas se puede usar en la fermentación del ácido succínico sin ninguna adición adicional.

Se proporciona además un procedimiento para llevar a cabo la fermentación de ácido succínico de acuerdo con las reivindicaciones, comprendiendo el procedimiento alterar simultáneamente la pared celular, liberando carbohidratos e hidrolizando los carbohidratos liberados en glúcidos monómeros, todo mientras se usa una mezcla de enzimas de microalgas sin lípidos. En determinados modos de realización, el procedimiento no requiere ningún pretratamiento antes de la hidrólisis enzimática y se puede llevar a cabo a bajas temperaturas usando un equipo relativamente sencillo. Esto reduce significativamente el coste de funcionamiento. En algunos modos de realización, más de un 99 % del glúcido monómero se puede liberar en condiciones optimizadas.

El tratamiento hidrotérmico se puede usar para incrementar la accesibilidad de las enzimas a los sitios de unión de los polisacáridos, lo que mejora significativamente la actividad enzimática y reduce la carga enzimática.

La mezcla de enzimas hidroliza parte del contenido de proteínas en la biomasa de microalgas y libera otros nutrientes en el hidrolizado. El hidrolizado con nutrientes y aminoácidos liberados (una fuente de nitrógeno) se usa durante el proceso de fermentación de productos bioderivados sin adición adicional. El residuo sólido se recoge y opcionalmente se pueden realizar otras etapas para extraer un producto valioso en el residuo sólido. Mientras se usa la fase líquida del hidrolizado de microalgas en la fermentación con ácido succínico de determinados modos de realización, se logra un rendimiento (-72 %, p/p) y actividad similar entre la fermentación con o sin extracto de levadura complementario.

Los sólidos no digeridos se pueden usar como piensos o fertilizante. Los carbohidratos y proteínas hidrolizados se pueden fermentar para producir productos bioderivados. El procedimiento puede comprender además separar los sólidos de los carbohidratos y proteínas hidrolizados, en el que los sólidos separados se pueden usar para piensos o fertilizante.

Se proporciona además un procedimiento como se reivindica de hidrólisis enzimática que comprende tratar microalgas húmedas ricas en lípidos con un combinado enzimático que comprende proteasas y al menos una glucoamilasa, en el que está presente una carga de proteasa de al menos 0,25 kU, en el que las microalgas se digieren a un pH de 3 a 5,5, para producir biomasa digerida; y separar la biomasa tratada enzimáticamente en una fase sólida y un sobrenadante, en el que la fase sólida contiene lípidos y el sobrenadante contiene carbohidratos y nutrientes. Los lípidos se pueden usar para producir combustibles y otros productos.

En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además fermentar de forma microbiana la fase sobrenadante para producir productos bioderivados. Los sólidos se pueden usar para piensos o fertilizante. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además fermentar de forma microbiana el sobrenadante para producir productos bioderivados.

Se proporciona además un procedimiento de hidrólisis enzimática como se reivindica, que comprende tratar algas húmedas deficientes en lípidos con una de proteasas y al menos una glucoamilasa, en el que está presente una carga de proteasa de al menos 0,25 kU, en el que las microalgas se digieren a un pH de 3 a 5,5, para producir biomasa digerida, y separar la biomasa tratada enzimáticamente en una fase sólida y un sobrenadante, en el que la fase sólida contiene lípidos y el sobrenadante contiene carbohidratos y nutrientes. En determinados modos de realización, las algas húmedas deficientes en lípidos se tratan térmicamente antes de tratarse con enzimas. El procedimiento comprende además llevar a cabo una etapa de separación en la biomasa digerida para producir sólidos y un sobrenadante, en el que los sólidos se pueden usar para piensos o fertilizante, y el sobrenadante comprende carbohidratos y nutrientes. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además fermentar de forma microbiana el sobrenadante para producir productos bioderivados.

Los productos producidos por el procedimiento reivindicado pueden comprender ácido succínico.

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1: Ejemplo de una hidrólisis enzimática en dos fases de microalgas ricas en lípidos usando proteasas y amilasas, no de acuerdo con la presente divulgación. El diagrama de flujo de bloques muestra el procedimiento para la producción de hidrolizado rico en glúcidos y lípidos a partir de biomasa de microalgas que contienen lípidos con dos fases de hidrólisis enzimática. Los lípidos recuperados se pueden usar para la producción de combustibles y otros productos oleoquímicos, mientras que los glúcidos liberados se pueden fermentar (con o sin separación de sólidos) en bioproductos tales como alcoholes, ácidos orgánicos o metano.

FIG. 2: Una hidrólisis enzimática en una fase de microalgas ricas en lípidos usando una mezcla de proteasas y amilasas, no de acuerdo con las reivindicaciones. El diagrama de flujo de bloques muestra el procedimiento para la producción de hidrolizado rico en glúcidos y lípidos a partir de biomasa de microalgas que contienen lípidos con hidrólisis enzimática en una fase. Los lípidos recuperados se pueden usar para la producción de combustibles y otros productos oleoquímicos, mientras que los glúcidos liberados se pueden fermentar (con o sin separación de sólidos) en bioproductos tales como alcoholes, ácidos orgánicos o metano.

FIG. 3: Ejemplo de hidrólisis enzimática de microalgas ricas en lípidos usando cualquiera de una mezcla de proteasa y al menos una glucoamilasa y, opcionalmente, otras amilasas. Después del tratamiento enzimático, el hidrolizado se separa en primer lugar en sólidos residuales y sobrenadante. Los sólidos residuales se someten a extracción con disolvente para recuperar los lípidos, mientras que el sobrenadante que contiene glúcidos y proteína hidrolizados se fermenta en bioproductos tales como alcoholes, ácidos orgánicos o metano.

FIG. 4: Ejemplo de hidrólisis enzimática de microalgas deficientes en lípidos usando proteasa y al menos una glucoamilasa, y opcionalmente otras amilasas. Después del tratamiento enzimático, el hidrolizado se puede fermentar (con o sin separación anterior de sólidos insolubles) a bioproductos tales como alcoholes, ácidos orgánicos o metano.

FIGS. 5A-5B: Una fracción de lípido extraíble después del tratamiento enzimático de SLA-04 (FIG. 5A) y SR-21 (FIG. 5B) después de la digestión enzimática con proteasa (barras blancas) o una mezcla de proteasa y amilasa y glucoamilasa (barras rellenas). La línea discontinua horizontal indica el contenido total de éster metílico del ácido graso (FAME) de las muestras de biomasa: 35 % (p/p) para SLA-04 y 44 % (p/p) para SR21.

FIG. 6: Fotografía que muestra gotículas de lípidos formadas en la superficie de la fase acuosa en SLA-04 digerido enzimáticamente.

FIGS. 7A-7B: Un cromatograma de CG de ejemplo no limitante de extractos de disolventes obtenidos después de la digestión y recuperación de lípidos de SLA-04 (FIG. 7A) y SR-21 (FIG. 7B). Esto muestra que la mayoría de los lípidos recuperados eran triglicéridos (tiempo de retención >30 min).

FIG. 8: Gráfico que muestra que una parte de los lípidos puede permanecer adherida a los sólidos residuales después de la digestión enzimática y se puede extraer por separado. El eje y muestra la masa de lípidos recuperados de los sólidos residuales en relación con la masa inicial (alimentación) de la biomasa de algas.

FIGS. 9A-9B: Concentraciones de glúcidos solubilizados liberados de SLA-04 (FIG. 9A) y SR-21 (FIG. 9B) después de la digestión enzimática con proteasa (barras blancas) o una mezcla de proteasa, glucoamilasa y amilasas (barras rellenas).

FIG. 10: Imagen de un gel de electroforesis PAGE para preparaciones enzimáticas de proteasa, a-amilasa y glucoamilasa comerciales. La imagen muestra que parte de la actividad a-amilasa podría estar presente en la preparación de protasa (véase banda superpuesta en ~50 kD en los carriles 1 y 2).

FIG. 11: Efecto de la composición del combinado enzimático sobre la liberación de glúcido. Los experimentos se realizaron usando una solución de biomasa de microalgas al 16 % (p/v) durante 2 h con diferentes combinaciones de a-amilasa, glucoamilasa y proteasa. El eje y muestra la liberación de glúcidos monoméricos en relación con el carbohidrato total inicialmente presente en la biomasa.

FIG. 12: Liberación de glúcido durante la digestión de la biomasa de algas con cargas variables de a-amilasa (0,5-15 kU) y cargas de glucoamilasa fijas (150 U). Los experimentos se realizaron usando una solución de biomasa de microalgas al 16 % (p/v) a un pH de 4,5 y 55 °C. El eje y muestra la liberación de glúcidos monoméricos en relación con el carbohidrato total inicialmente presente en la biomasa.

FIG. 13: Liberación de glúcido en función del pH durante la digestión de la biomasa de algas con a-amilasa (1 kU) y cargas de glucoamilasa (150 U). Los experimentos se realizaron usando una solución de biomasa de microalgas al 16 % (p/v) a 55 °C. El eje y muestra la liberación de glúcidos monoméricos en relación con el carbohidrato total inicialmente presente en la biomasa.

FIG. 14: Liberación de glúcido durante la digestión de la biomasa de algas con cargas variables de proteasa (0-3 kU) y cargas de glucoamilasa fijas (150 U). Los experimentos se realizaron usando una solución de biomasa de microalgas al 16 % (p/v) a un pH de 4,5 y 55 °C. El eje y muestra la liberación de glúcidos monoméricos en relación con el carbohidrato total inicialmente presente en la biomasa.

FIG. 15: Liberación de glúcido durante la digestión de la biomasa de algas con cargas variables de proteasa (0-3 kU) y cargas de glucoamilasa fijas (150 U). Los experimentos se realizaron usando una solución de biomasa de microalgas al 16 % (p/v) a un pH de 4,5 y 55 °C. El eje y muestra la liberación de glúcidos monoméricos en relación con el carbohidrato total inicialmente presente en la biomasa.

FIGS. 16A-16B: Fermentación de biomasa de microalgas digeridas (FIG. 16A) y glucosa en ácido succínico (FIG. 16B).

Descripción detallada de la invención

Las microalgas pueden servir como materias primas para biocombustibles económicamente viables y ambientalmente sostenibles debido a su alta productividad, incluso cuando se usan tierras, agua y nutrientes de baja calidad. A diferencia de las plantas terrestres, las microalgas tienen una estructura unicelular sin lignina, lo que posibilita la rotura de la pared celular y la liberación de carbohidratos con procedimientos de pretratamiento mucho más suaves. Como resultado, las microalgas no generan cantidades significativas de inhibidores que provocan la degradación de los carbohidratos durante el proceso. Previamente, las microalgas se han sometido a procedimientos de alteración mecánica, termólisis, microondas y ultrasonido para alterar la pared celular. Sin embargo, todos estos procedimientos requieren un gran consumo de energía o un mayor coste de equipo. La presente divulgación describe el desarrollo de un procedimiento rentable con un bajo requisito de energía y una fácil configuración del equipo que, en determinados modos de realización, simultáneamente (1) altera las paredes celulares, (2) extrae los lípidos, (3) libera e hidroliza los polisacáridos a glúcidos monómeros y (4) libera e hidroliza las proteínas para obtener una fuente de nitrógeno para la fermentación.

Previamente, las algas marinas se usaban principalmente en la producción de lípidos para biodiésel. Ahora, de acuerdo con la presente divulgación, las algas marinas se convierten en diversos tipos de productos químicos bioderivados como el ácido succínico. Existen muchas ventajas en el uso de microalgas, en comparación con las plantas terrestres, como materia prima para la producción de ácido succínico. Estas incluyen ningún requisito para la fertilidad del suelo y ninguna necesidad de recurrir a suministros valiosos, y a menudo escasos, de agua dulce. Además, la fijación y el almacenamiento de CO² en la biomasa mientras proliferan las microalgas reduce la preocupación por la liberación de gases de efecto invernadero. Las microalgas se pueden usar como biomasa en la fermentación del ácido láctico después de la extracción de lípidos. La biomasa de algas también se puede usar como materia prima de energía renovable como el bioetanol o el biohidrógeno.

La biomasa de microalgas está formada convencionalmente por cuatro clases bioquímicas principales de moléculas: carbohidratos, proteínas, ácidos nucleicos y lípidos. Para los carbohidratos, diferentes clases de microalgas producen tipos particulares de polisacáridos. Normalmente, el almidón que consiste principalmente en amilosa es el carbohidrato que almacena energía que se encuentra en la mayoría de las algas. Por ejemplo, el alga verde Tetraselmis suecica acumula un 11 % y un 47 % de su peso seco como almidón en condiciones de repleción y agotamiento de nutrientes, respectivamente. Las algas rojas sintetizan un polímero de carbohidratos conocido como almidón florideano, que consiste en su mayor parte en amilosa. Un polisacárido que se encuentra comúnmente en una gran cantidad de especies de algas es la crisolaminarina, un polímero lineal de p-1,3 y p-1,6 unidades de glucosa enlazadas. A diferencia de la biomasa lignocelulósica, las células de microalgas son organismos unicelulares que flotan, evitando la necesidad de biopolímeros estructurales tales como la hemicelulosa y la lignina que, de otro modo, son importantes para soportar el tejido en las plantas terrestres.

Además de los carbohidratos, las microalgas también contienen proteínas que son enzimas importantes en la regulación del metabolismo celular o glucoproteínas reticuladas ricas en hidroxil-prolina como pared celular estructural. Como con los carbohidratos, los lípidos sirven tanto como reservas de energía como componentes estructurales (membranas) de la célula. Los triglicéridos de ácidos grasos simples son importantes reservas de energía. Las membranas se construyen principalmente a partir de fosfolípidos y glucolípidos, donde los restos de glúcido o fosfato polar hidrófilo y el nivel de saturación de las cadenas de acilo graso determinan la fluidez de las membranas. Para algunos microorganismos, los cultivos ricos en almidón se pueden usar directamente como materia prima en la fermentación, aunque podría ser aconsejable el pretratamiento y/o la digestión enzimática para mejorar la productividad. Adicionalmente, los residuos de microalgas ricas en carbohidratos que quedan después de la extracción de lípidos pueden ser materia prima para la producción de ácido succínico.

Algunas cepas de microalgas acumulan lípidos, tales como los triglicéridos, que se pueden convertir en biodiésel, diésel verde o productos oleoquímicos de alto valor. Además de los procedimientos rentables y de bajo consumo energético para la recuperación de lípidos, un procedimiento de conversión desarrollado para microalgas debe poder conservar los otros componentes principales, carbohidratos y proteína, para usos rentables. Dichos procedimientos de conversión también deben poder utilizar directamente biomasa húmeda porque los procedimientos de secado son de alto consumo energético. En determinados modos de realización, los procedimientos descritos en el presente documento conservan de forma ventajosa los carbohidratos y las proteínas, y pueden utilizar biomasa húmeda. Para recuperar triglicéridos y otros lípidos del material húmedo, la alteración celular es importante. La alteración mecánica se aplica comúnmente en forma de esfuerzos cortantes intensos, ondas ultrasónicas o bien campos electromagnéticos. Puesto que estas fuerzas son más eficaces sobre intervalos cortos, las suspensiones pasan a través de zonas estrechas y restringidas donde se aplican fuerzas intensas para alterar las resistentes paredes celulares de microalgas. Como resultado, los procedimientos basados en alteración mecánica pueden ser de alto consumo energético y de capital, así como difíciles de aumentar a escala.

Otros han intentado previamente usar enzimas para la digestión de células de algas con la intención de recuperar lípidos y/o carbohidratos. Por ejemplo, se han intentado combinados de enzimas termoestables que contienen hasta 14 enzimas diferentes, incluyendo varias endo- y exogluconasas. Si bien estos combinados produjeron cierta recuperación de lípidos, la actividad proteasa estuvo ausente en los combinados y la amilasa estuvo presente solo en cantidades insignificantes. Un combinado que contenía mayores cantidades de amilasa fue relativamente ineficaz para facilitar la liberación de lípidos. No obstante, la liberación de lípidos se midió por procedimientos gravimétricos que normalmente sobreestiman el contenido de lípidos, y las enzimas usadas en estos intentos no estaban disponibles comercialmente.

Las enzimas se han usado previamente para degradar las paredes celulares, pero no se ha demostrado previamente que posibiliten la recuperación de lípidos o bien la descomposición de carbohidratos en glúcidos monoméricos. Los intentos previos han demostrado que las amilasas no tenían ningún impacto en la degradación de la pared celular, dando como resultado la creencia de que la lisis de enzimas de Aspergillus sp. era ineficaz frente a las células de algas. En marcado contraste con los intentos previos de otros, la presente divulgación revela que la proteasa sola es eficaz en la digestión de la biomasa de algas y la liberación de lípidos que se separan en fases o se pueden recuperar usando procedimientos de extracción con disolvente. Los lípidos se pueden recuperar a través de extracción con disolvente con disolventes orgánicos no polares, una mezcla de disolventes orgánicos polares y no polares o disolventes de polaridad conmutable, y los lípidos se pueden convertir posteriormente en combustibles o productos oleoquímicos. El tratamiento con proteasa sola también hidroliza parcialmente los polisacáridos de algas en glúcidos monoméricos. La complementación de la proteasa con a-amilasa y glucoamilasa permite la hidrólisis casi completa de los carbohidratos en glúcidos, además de liberar simultáneamente lípidos. La acción sinérgica de la proteasa y la glucoamilasa conjuntamente reduce drásticamente la cantidad de glucoamilasa requerida para la hidrólisis de los carbohidratos de algas. Además, después de retirar los lípidos, la fase acuosa rica en glúcidos es fácilmente fermentable por microorganismos, y la proteína residual y otro material celular pueden servir como fuente de nutrientes (nitrógeno, fósforo y otros micronutrientes) para apoyar la proliferación microbiana. Como resultado, se describen varias opciones de procedimiento, variando los procedimientos varios por la composición bioquímica de la biomasa de algas.

En el presente documento se proporcionan procedimientos de hidrólisis enzimática que implican una única etapa en la que la liberación de lípidos y la descomposición de polisacáridos en monosacáridos fermentables se producen simultáneamente. Los procedimientos proporcionan un procedimiento rentable para la recuperación de lípidos, glúcidos y proteínas de la biomasa microbiana por digestiones enzimáticas. Estos procedimientos eliminan los costes asociados con el secado de algas y una extracción separada de lípidos, dando como resultado una ventaja de costes apreciable sobre los procedimientos conocidos en la técnica. Por el contrario, en los procedimientos de múltiples etapas, la extracción de lípidos de las algas secas se lleva a cabo antes de que el residuo restante se someta a hidrólisis enzimática o digestión ácida, lo que produce un resultado económicamente desventajoso. Los procedimientos de la presente divulgación utilizan un combinado enzimático específico que comprende al menos una proteasa y al menos una glucoamilasa, a diferencia de las enzimas de las lignocelulasas. Esto reduce además los costes implicados. En determinados modos de realización, la despolimerización de todos los principales biopolímeros de algas se produce en una única etapa a través del uso de un combinado enzimático abundante y de bajo coste que contiene una mezcla de proteasas y glucoamilasas.

Los procedimientos descritos en el presente documento no implican ninguna etapa de digestión ácida. Esto proporciona una ventaja sobre otros procedimientos que usan la digestión ácida para hidrolizar los carbohidratos. La digestión ácida típicamente produce inhibidores de la degradación de glúcidos que inhiben el proceso de fermentación, lo que dificulta, de este modo, la conversión de glúcidos en productos de valor añadido. Los procedimientos en el presente documento tampoco requieren la presencia de cisteína libre, un aminoácido que contiene azufre, para activar las enzimas. Las enzimas usadas en el presente documento son activas sin tener que añadir cisteína exógena al medio de digestión. Sin quedar vinculado a ninguna teoría, se cree que esto se debe a la acción de las proteasas particulares usadas. En un ejemplo no limitante, las proteasas digieren las microalgas mientras que simultáneamente hidrolizan al menos un 10 % de proteína y carbohidratos.

Un procedimiento alternativo para liberar lípidos en condiciones de funcionamiento más suaves que los procedimientos mecánicos es a través del uso de enzimas para digerir las células. Sin embargo, la viabilidad económica global de los procedimientos basados en enzimas depende del coste y la facilidad de producción enzimática. Por tanto, las enzimas de bajo coste disponibles comercialmente son las más deseables. Cierta aamilasa comercial presenta la capacidad de degradar las glucoproteínas dentro de las paredes celulares. Además, la alfa-amilasa puede licuar el almidón intracelular en dextrinas, que se pueden además sacarificar en los monómeros de glúcido por la glucoamilasa. El pretratamiento enzimático de la biomasa de microalgas para la producción de etanol por S. cerevisiae S288C necesita dos etapas de hidrólisis enzimática: licuefacción por aamilasa termoestable a 90 °C en primer lugar a pH 6,0, a continuación sacarificación a 55 °C a pH 4,5. La proteasa de los hongos puede hidrolizar la glucoproteína, la estructura principal en la pared celular de las microalgas, y también hay cierta a-amilasa y glucoamilasa combinadas en la proteasa puesto que son los subproductos de la proteasa en la producción por esos hongos. De acuerdo con la presente divulgación, estas enzimas mixtas pueden trabajar conjuntamente para romper la pared celular y los carbohidratos al mismo tiempo. Este proceso se puede realizar a bajas temperaturas de 30 °C a 50 °C, y pH de 3 a 5. Además, la mayoría del glúcido se libera en menos de 1 hora. Puesto que la proteasa pierde la actividad rápidamente (en su mayor parte en menos de 2 horas), no obstaculiza la proliferación del microorganismo en la fermentación adicional.

Además de la fuente de carbono, el nitrógeno es un nutriente indispensable para la proliferación y metabolismo de las células de microorganismos. Cualquier tipo de alimentación con fuente de nitrógeno (amonio, aminoácidos libres, urea o extracto de levadura) puede incrementar la tasa de fermentación y mejorar la proliferación de las células. Una falta de nutrición con nitrógeno dará lugar a la reducción de la tasa de formación de ácido succínico y del rendimiento, y dicho efecto negativo no se puede ignorar en particular cuando se requiere la concentración de ácido succínico en el medio a niveles mayores. En los procedimientos industriales, es necesaria una alimentación con fuente de nitrógeno adicional y cuesta una parte considerable del coste de ácido succínico total. Cierta biomasa de microalgas contiene un nivel considerablemente alto de proteína (más de un 20 % en peso seco), que se puede derivar al aminoácido libre durante el procedimiento de pretratamiento con proteasa. Por lo tanto, las microalgas ricas en nitrógeno pueden servir como fuente de nitrógeno de bajo coste alternativa en la fermentación de ácido succínico.

En ejemplos no limitantes, Actinobacillus succinogenes se describe como el microorganismo en la fermentación, que es flexible en su capacidad para fermentar eficazmente diferentes fuentes de carbono que se encuentran comúnmente en el hidrolizado, incluyendo L-arabinosa, celobiosa, fructosa, galactosa, glucosa, lactosa, maltosa, manitol, xilosa y otras. Las vías metabólicas de ambos glúcidos hexosa y pentosa muestran que estos glúcidos se pueden convertir completamente en su mayor parte en succinato, con acetato, formiato y alcohol como los principales subproductos. Se ha de entender, sin embargo, que es posible el uso de microorganismos distintos de Actinobacillus succinogenes. Otros microorganismos adecuados incluyen, pero no se limitan a: microorganismos del género Lactobacillus; microorganismos del género Pseudomonas; microorganismos del género Bacillus; o microorganismos del género Clostridia, tales como Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljundahlii o Clostridium ragsdalei.

A diferencia de la biomasa lignocelulósica terrestre, la mayoría de las microalgas son unicelulares y no contienen lignina. Algunas especies de algas incluso carecen de paredes celulares. Esta estructura permite condiciones mucho más suaves y un procedimiento de pretratamiento más sencillo, lo que reduce el coste provocado por temperaturas mayores y corrosión en el procedimiento de alto consumo energético. En primer lugar, se altera la pared celular de las microalgas por la proteasa ácida, una enzima de bajo coste producida a partir de hongos. Además, la mayoría de sus carbohidratos reservados en la célula son polisacáridos similares al almidón, que se pueden hidrolizar por enzimas de bajo coste tales como a-amilasa y amiloglucosidasa a monómeros de glúcido como glucosa, galactosa, xilosa o manosa. Todos estos glúcidos liberados se pueden utilizar directamente por la mayoría de las cepas, tales como la levadura para producir etanol, o Actinobacillus succinogenes para producir ácido succínico.

En un aspecto, en el presente documento se describe un procedimiento en el que se usa un proceso de hidrólisis enzimática optimizado para sustituir el pretratamiento de alto consumo energético convencional para la biomasa de microalgas. Para las microalgas, el principal obstáculo de la hidrólisis enzimática es que los gránulos de almidón intercelulares están unidos dentro de las paredes celulares rígidas, lo que requiere una etapa de pretratamiento de la biomasa para descomponer la pared celular y liberar los polisacáridos tales como almidón, carbohidratos estructurales y otros nutrientes, antes de la hidrólisis enzimática y las etapas de fermentación. La pared celular de las microalgas contiene glucoproteínas como constituyentes predominantes en su matriz extracelular. Por lo tanto, degradar esas proteínas es una etapa importante para alterar toda la pared celular. Algunas presentan la actividad proteasa particular para la degradación de glucoproteínas dentro de las paredes celulares. Sin embargo, usando a-amilasa solo para romper la pared celular no es suficientemente eficaz como para recuperar un alto rendimiento de glúcido. Para resolver este problema, la a-amilasa se puede reemplazar con proteasa de la misma cepa de hongos (Aspergillus oryzae), que en realidad también contiene una pequeña cantidad de a-amilasa y glucoamilasa. Esta mezcla de enzimas permite que la alteración completa de la pared celular se produzca simultáneamente a la hidrólisis de los polisacáridos a glúcidos monómeros. Mientras las microalgas proliferan hasta una determinada concentración, la biomasa de microalgas se puede recoger y concentrar por sedimentación o centrifugación. En determinados modos de realización, a continuación, se puede ajustar el pH de la suspensión a aproximadamente 4,5 añadiendo tampón de sal citrato (50 mM). A continuación, se añaden a-amilasa (EC 3.2.1.1) y proteasa (EC 232.752.2) de Aspergillus oryzae y amiloglucosidasa (EC 3.2.1.3) de Aspergillus niger al caldo para iniciar el proceso de hidrólisis. Estas dos enzimas se pueden añadir simultáneamente porque comparten un intervalo similar de temperatura (30-55 °C) y pH (3,0-5,5) optimizados.

El uso del pretratamiento hidrotérmico reduce la carga enzimática incrementando la accesibilidad de las enzimas a los sitios de unión de los polisacáridos, lo que a su vez hace que todo el procedimiento sea más rentable. Similar a la biomasa lignocelulósica, la aplicación del pretratamiento hidrotérmico recristaliza la celulosa de modo que las enzimas hidrolíticas puedan acceder fácilmente a los biopolímeros. Se puede aplicar el equipo de autoclave al pretratamiento hidrotérmico hasta 120 °C, que es lo suficientemente alto como para descomponer parcialmente la pared celular y la matriz extracelular de las microalgas. Después de este tratamiento, la enzima tiene una mayor probabilidad de unirse a los sitios de reacción en los polisacáridos intracelulares debido a la ruptura de la pared celular. Como resultado, se requieren menos enzimas para alcanzar la misma actividad. A modo de ejemplo no limitante, la esterilización en autoclave a 120 °C durante 30 minutos puede reducir más de un 60 % de la carga de a-amilasa para lograr el mismo rendimiento de glúcido.

Además, se liberan el contenido de proteína y otros nutrientes en las microalgas y son solubles después de la hidrólisis enzimática, que se pueden usar como fuente de nitrógeno y fosfato en un proceso de fermentación. El residuo sólido de la biomasa de microalgas después de la hidrólisis enzimática se puede retirar por centrifugación y usarse para producir productos de valor añadido en otras etapas.

La figura 1 describe un procedimiento para una hidrólisis enzimática en dos fases de microalgas ricas en lípidos usando proteasas y amilasas, no de acuerdo con las reivindicaciones. El diagrama de flujo de bloques de la FIG.

1 muestra un procedimiento de dos fases donde se usa proteasa sola en la primera fase para la alteración celular y la recuperación de lípidos. Después del tratamiento con disolventes de extracción, la fase acuosa se trata con amilasas adicionales, si es necesario, para descomponer polisacáridos adicionales en glúcidos monoméricos. El tratamiento con amilasas hidroliza los carbohidratos en sacáridos monoméricos u oligoméricos. Los lípidos se recuperan de la fase orgánica a través de evaporación. La fase acuosa se puede filtrar para recuperar los residuos ricos en proteínas mientras se dejan atrás los glúcidos, la proteína y otro material celular solubles para su fermentación en productos tales como, pero sin limitarse a, alcoholes, ácidos orgánicos o metano. De forma alternativa, se puede fermentar toda la suspensión.

La figura 2 describe un procedimiento para una hidrólisis enzimática en una fase de microalgas ricas en lípidos usando una mezcla de proteasas y amilasas, no de acuerdo con las reivindicaciones. El diagrama de flujo de bloques de la FIG. 2 muestra un procedimiento de una fase que incorpora un tratamiento simultáneo con una mezcla de proteasa y amilasa, y produce hidrolizado rico en glúcidos y lípidos. En este procedimiento, la digestión celular y la hidrólisis de polisacáridos se completan en una única etapa. Las vías de recuperación y conversión posteriores son similares a las mostradas para el procedimiento de dos fases. Los lípidos recuperados se pueden usar en la producción de combustibles y otros productos oleoquímicos, mientras que los glúcidos se pueden fermentar en bioproductos tales como, pero sin limitarse a, alcoholes, ácidos orgánicos o metano.

La figura 3 describe un procedimiento alternativo de hidrólisis enzimática de microalgas ricas en lípidos usando cualquiera de una mezcla de proteasa y glucoamilasa y, opcionalmente, otras amilasas. Después del tratamiento enzimático, el hidrolizado se separa en primer lugar en sólidos residuales y sobrenadante. Los sólidos residuales se someten a extracción con disolvente para recuperar los lípidos, mientras que el sobrenadante que contiene glúcidos y proteína hidrolizados se fermenta en bioproductos tales como, pero sin limitarse a, alcoholes, ácidos orgánicos o metano.

La figura 4 describe un procedimiento de hidrólisis enzimática de microalgas deficientes en lípidos. Estas microalgas son ricas en carbohidratos, pero no contienen cantidades apreciables de lípidos. Para dichas microalgas, el uso de proteasas y glucoamilasa y, opcionalmente, otras amilasas logra la liberación de polisacáridos celulares como glúcidos monoméricos. Después del tratamiento enzimático, el hidrolizado se puede fermentar, con o sin separación anterior de sólidos insolubles, en bioproductos tales como, pero sin limitarse a, alcoholes, ácidos orgánicos o metano. La FIG.4 muestra un diagrama de flujo de bloques para este procedimiento de una fase. También se pueden usar tratamientos térmicos para reducir la carga enzimática.

Se ha de entender que se puede realizar cualquier extracción con disolvente adecuada para lograr las separaciones. Una extracción con disolvente es un procedimiento para separar una sustancia de una o más de otras sustancias usando un disolvente, basándose el procedimiento en variaciones de las solubilidades de diferentes compuestos en las diferentes sustancias. La sustancia que se va a extraer se disuelve típicamente en un líquido y se usa un disolvente líquido para la extracción. Se elige un disolvente que no se mezcla con el compuesto en el que se disuelve la sustancia de interés, de modo que cuando se deja sin distribuir, se forman dos capas separadas. Una vez que se añade el disolvente, se pueden agitar los dos líquidos conjuntamente durante un tiempo y a continuación se deja reposar durante un tiempo hasta que se separen. El experto en la técnica reconocerá que la elección del disolvente dependerá de las propiedades químicas y físicas de todas las sustancias en la mezcla. En determinados procedimientos, la extracción con disolvente se lleva a cabo en varias etapas usando diferentes disolventes. En un ejemplo no limitante, el disolvente es una mezcla de hexano e isopropanol, pero se pueden usar muchos otros disolventes polares o no polares, o mezclas de disolventes polares o no polares. Otros posibles disolventes de extracción incluyen, pero no se limitan a: cloroformo, metanol, heptano, hexano, isopropanol y mezclas de los mismos. En algunos ejemplos no limitantes, se usa una mezcla 2:1 (v/v) de cloroformo y metanol. En otros ejemplos no limitantes, se usa una mezcla de hexano e isopropanol.

Los procedimientos descritos en el presente documento pueden lograr simultáneamente la liberación de lípidos y la descomposición de carbohidratos en monosacáridos, además de la hidrólisis parcial de la proteína de las algas.

Aunque se describen las especies de Chlorella y Schizochitrium limacium con propósitos ejemplares, se ha de entender que los procedimientos descritos en el presente documento se pueden realizar con cualquier microalga adecuada. Existen más de 50.000 especies conocidas de microalgas. Las especies adecuadas de microalgas incluyen, pero de ninguna manera se limitan a: las especies del género Chlorella; las especies del género Spirulina; Schizochitrium limacium; Botryococcus braunii; las especies del género Isochrysis, tales como Isochrysis galbana; Neochloris oleoabundans; Phaeodactylum tricornutum; Pleurochrysis carterae; Prymnesium parvum; Scenedesmus dimorphus; Tetraselmis chui; y Tetraselmis suecica. En general, se puede usar cualquier especie de alga verde en los procedimientos descritos en el presente documento.

El tratamiento enzimático descrito en el presente documento permite la liberación simultánea de lípidos y la descomposición de polisacáridos en monosacáridos. Al menos un 5 % de los lípidos no polares se pueden separar espontáneamente de la fase acuosa, lo que permite la recuperación de los lípidos sin necesidad de una etapa de extracción. Por ejemplo, se puede extraer al menos un 85 % de los lípidos y se puede liberar al menos un 99 % de los glúcidos monómeros. En otro ejemplo, se hidroliza al menos un 20 % de la proteína y los carbohidratos. Por ejemplo, se liberan los lípidos celulares mientras que al menos se hidroliza simultáneamente un 20 % de otros componentes celulares.

Los procedimientos son rentables por muchos motivos, tales como que se pueden llevar a cabo a bajas temperaturas. Los procedimientos se llevan a cabo por debajo de la temperatura de gelatinización del sustrato. La temperatura puede ser de aproximadamente 50 °C y el pH de aproximadamente 4,5. En un ejemplo de un procedimiento con un tratamiento hidrotérmico, se usa una autoclave a 120 °C durante 30 minutos, y el pretratamiento da como resultado la reducción de la carga enzimática a 1/3 mientras todavía se alcanza el mismo rendimiento de glúcido. En un ejemplo, se recupera más de un 99 % de los glúcidos monómeros en menos de 2 horas y se libera más de un 99 % de los lípidos.

Se puede usar la fase acuosa de cualquiera de los procedimientos como fuente de nitrógeno en un proceso de fermentación para producir productos tales como alcoholes, ácidos orgánicos (como ácido succínico) o metano. Se puede usar el residuo de microalgas después de la hidrólisis enzimática como fuente de nitrógeno y fosfato en la fermentación de ácido succínico sin un nutriente externo. Los sólidos separados recuperados de los procedimientos son útiles para la fermentación microbiana o como piensos o fertilizante. Después de la digestión enzimática se pueden atascar los lípidos en los sólidos. Cuando esto se produce, se pueden tratar los sólidos digeridos con un disolvente orgánico para recuperar los lípidos.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Recuperación de lípidos y glúcidos monoméricos de biomasa de algas húmedas usando procedimientos de tratamiento enzimático

En estos experimentos se usaron dos cepas de algas: a) Chlorella sp. SLA-04, y b) Schizochitrium limacium SR21, obtenidas de ATCC (MYA 1381).

Se realizaron las digestiones de biomasa a una concentración de sólidos de un 10 % (p/v) en tampón de citrato 50 mM ajustado a un pH de 4,5. Se añadieron proteasa sola o una mezcla de proteasa con a-amilasa y amiloglucosidasa (todas adquiridas de Sigma) a las suspensiones de biomasa. Las cargas enzimáticas (por g de biomasa) usadas fueron como sigue: (a) 312 U/g de proteasa; (b) 1875 U/g de a-amilasa; y (c) 18,75 U/g de glucoamilasa. 1 unidad de a-amilasa se define como la cantidad de enzima que libera 1 pmol de maltosa por minuto a pH 6,0 y 25 °C; 1 unidad de glucoamilasa se define como la cantidad de enzima que escinde 1 pmol de maltosa por minuto a pH 4,3 y 25 °C; y 1 unidad de proteasa se define como la cantidad de enzima que hidroliza 1 pmol de L-leucina-p-nitroanilida por min.

La mezcla de algas-enzimas se incubó a 50 °C durante 6 h en un agitador mantenido a 200 rpm. También se realizaron experimentos de control sin biomasa. Se tomaron muestras a intervalos regulares durante los experimentos para medir los lípidos y glúcidos liberados.

Para la recuperación y el análisis de lípidos, se usó una mezcla de hexano/isopropanol 3:2 (v/v). Se añadieron 0,5 ml de la mezcla de disolventes a 300 pl de las muestras digeridas y se llevó a cabo la extracción a 90 °C durante 30 min. Se analizaron y cuantificaron los lípidos en el disolvente de extracción utilizando un cromatógrafo de gases (CG) conectado con un detector de ionización de llama (FID). Para el análisis de carbohidratos solubles, se centrifugaron y filtraron las muestras digeridas a través de una membrana de 0,22 pm y se analizó el sobrenadante para detectar los glúcidos por medio de HPLC usando una columna de intercambio iónico Shodex SH1011 con detector de índice de refracción (IR).

En otro conjunto de experimentos, después de la digestión enzimática de SLA-04, se centrifugó la suspensión digerida y se extrajeron los sólidos residuales con hexano/isopropanol.

De las FIGS. 5A-5B, se puede observar que la tasa y el grado de lípidos liberados de ambos materiales de algas (SLA-04 y SR-21) es similar en los tratamientos con proteasa sola, así como en los tratamientos con una mezcla de proteasa y amilasas. Para SLA-04, se liberó (y se extrajo) >85 % del lípido (medido como éster metílico del ácido graso - FAME) contenido en la biomasa como resultado de los tratamientos enzimáticos. Para SR-21, se liberó >72 % del lípido celular. Los tratamientos de control sin enzimas no liberaron ningún lípido extraíble.

La FIG. 6 muestra que al menos una parte de los lípidos liberados durante la digestión se separó en una fase oleosa y se pudieron separar sin necesidad de extracción con disolvente. Las FIGS. 7A-7B muestran que la mayoría de los lípidos recuperados después de la extracción eran triglicéridos. La FIG. 8 muestra que al menos una parte de los lípidos permaneció asociada con los sólidos residuales y se pudieron extraer por separado. El eje y en la FIG. 8 muestra la masa de lípidos recuperados de sólidos residuales en relación con la masa inicial (alimentación) de biomasa de algas.

Después del tratamiento enzimático, se midieron las concentraciones de glúcido monomérico solubilizado en las suspensiones digeridas para determinar si también se producía hidrólisis de carbohidratos durante los tratamientos. Las FIGS. 9A-9B muestran que los tratamientos con proteasa sola, así como los tratamientos con una mezcla de proteasa y amilasas dieron como resultado la liberación de glúcidos monoméricos de ambas muestras de biomasa de algas (SLA-04 y SR-21). Sin embargo, el grado de liberación de glúcido fue mayor en los tratamientos que contenían amilasas. La glucosa fue el principal glúcido recuperado junto con cantidades más pequeñas de xilosa. La electroforesis en gel de las tres preparaciones enzimáticas (FIG. 10) muestra que puede haber cierta actividad amilasa presente en la preparación comercial de proteasa que puede haber dado como resultado cierta hidrólisis de carbohidratos incluso en ausencia de amilasas.

Ejemplo 2 - Recuperación de glúcido de biomasa de microalgas por digestión enzimática

Se llevaron a cabo experimentos de hidrólisis enzimática usando proteasa, a-amilasa y glucoamilasa, y sus combinaciones. Se obtuvo un cultivo mixto de biomasa de algas deficiente en lípidos (contenido de lípidos <5 % (p/p)) de una instalación comercial de tratamiento de aguas residuales. La biomasa tenía un contenido de carbohidratos de un 24,5 % (p/p). Se realizaron los experimentos de digestión con una carga de sólidos de un 16 % (p/v) a un pH de 4,5. Se fijó la cantidad de cada enzima como sigue: 2,5 kU de proteasa, 5 kU de a-amilasa y 150 U de glucoamilasa. Se realizaron las reacciones de hidrólisis enzimática en viales de suero sellados agitados a 200 rpm durante 2 h a 55 °C. Se recogieron las muestras al final del período de incubación y se analizaron por HPLC usando una columna de intercambio iónico Shodex SH1011 con detector de índice de refracción (IR).

Los resultados (FIG. 11) muestran que los tratamientos con proteasa sola dieron como resultado la liberación de una cantidad apreciable de glúcidos monoméricos. Sin quedar vinculado a ninguna teoría, se cree que esto posiblemente se deba a la presencia de pequeñas cantidades de a-amilasa y glucoamilasa en esta preparación enzimática, como se analiza previamente en el ejemplo 1 (FIG. 10). La complementación de proteasa con aamilasa adicional no incrementó el rendimiento de glúcido, lo que indica que la actividad a-amilasa no fue limitante en este sistema. Sin embargo, la adición de glucoamilasa a la proteasa o a una mezcla de proteasa y a-amilasa dio como resultado una descomposición casi completa de los polisacáridos disponibles a glúcidos monoméricos, lo que indica que la actividad glucoamilasa insuficiente estaba disponible tanto en las preparaciones de proteasa comercial como de a-amilasa. Los experimentos de digestión realizados con una mezcla de a-amilasa y glucoamilasa mostraron mejores rendimientos que las digestiones realizadas con las enzimas individuales. Sin embargo, se observaron rendimientos menores que en los tratamientos que contenían proteasa, lo que indica que la actividad proteasa era necesaria para acceder a los carbohidratos intracelulares o bien que las concentraciones de a-amilasa usadas en estos experimentos fueron insuficientes para descomponer todos los polisacáridos disponibles.

Para determinar si a-amilasa adicional (en combinación con glucoamilasa) da como resultado una mayor recuperación de glúcidos monoméricos, se realizaron los experimentos con cargas de a-amilasa entre 0,5 y 15 kU. También se añadieron a la solución 150 U de glucoamilasa. Los resultados de estos experimentos (FIG. 13) muestran que con una carga de a-amilasa por debajo de 5 kU, menos de un 60 % de los carbohidratos de la biomasa se convirtieron en glúcidos monoméricos. Sin embargo, con una carga de a-amilasa de 15 kU, casi un 90 % de los polisacáridos se hidrolizaron a glúcidos. Estos resultados muestran que al ajustar apropiadamente los niveles de a-amilasa y glucoamilasa, es posible la hidrólisis casi completa de los polisacáridos de algas. Para determinar el pH óptimo de esta combinación de enzimas, se realizaron experimentos usando una mezcla de 1 kU de a-amilasa y 150 U de glucoamilasa a valores de pH del medio entre 3 y 6. Los resultados de estos experimentos (FIG. 13) muestran que la actividad más alta se obtiene entre un pH de 4 y 5.

Como se analiza anteriormente, de los resultados presentados en la FIG. 11, también se puede lograr la hidrólisis de los carbohidratos de algas usando mezclas de proteasa y glucoamilasa. Para determinar el efecto de la proteasa sobre la recuperación de glúcido, se realizaron experimentos con cargas de proteasa que variaban de 0 a 3 kU y con una carga fija de glucoamilasa de 150 U. Los resultados muestran que se puede convertir más de un 90 % de los carbohidratos de algas en glúcidos monoméricos con cargas de proteasa de más de 1,25 kU (FIG. 14).

Ejemplo 3: Recuperación de glúcido de biomasa de microalgas por pretratamiento hidrotérmico seguido de digestión enzimática

Se usó un pretratamiento hidrotérmico en combinación con la digestión enzimática para evaluar el potencial de reducir los requisitos de enzimas para la recuperación de glúcido. Para el tratamiento hidrotérmico, se cargaron suspensiones de algas (16 % p/p) en frascos de suero sellados y se esterilizaron en autoclave a 120 °C durante 30 minutos. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, se digirieron las suspensiones pretratadas a 55 °C durante 6 h usando una mezcla de a-amilasa y glucoamilasa (pH = 4,5). Se realizaron una serie de digestiones con cargas de a-amilasa entre 0,5 y 15 kU mientras se mantenía una carga de glucoamilasa de 150 U. Se midió la liberación de glúcido monomérico al final de los experimentos. Como se observa en la FIG. 15, el pretratamiento mejoró la digestibilidad enzimática en relación con los controles que no se pretrataron térmicamente. Como resultado, se pudo lograr hasta un 90 % de recuperación de glúcido con cargas de a-amilasa tan bajas como 5 kU.

Ejemplo 4: Fermentación de biomasa de microalgas digerida a ácido succínico

Se llevaron a cabo experimentos de fermentación de ácido succínico para una biomasa de algas hidrolizada enzimáticamente en 4 condiciones con 3 soluciones de glúcido modelo como controles. En primer lugar, se digirieron suspensiones de biomasa de algas al 16 % (p/v) a 50 °C durante 2 h usando una mezcla de proteasa y glucoamilasa como se describe en el ejemplo 2. Se centrifugó una parte de la suspensión digerida (5000 rpm, 10 min) para separar los sólidos. Se realizaron las fermentaciones con todo el digestato, así como con el sobrenadante tanto con como sin extracto de levadura (2 g/l) como fuente de nutrientes adicional. Como controles, también se fermentaron soluciones de glúcido modelo con la misma concentración de glúcido que el digestato junto con 2 g/l, 5 g/l o 10 g/l de extracto de levadura.

Se usó la cepa de tipo Actinobacillus succinogenes 130Z (ATCC 55618) como organismo fermentador. La cepa se cultivó en caldo de soja tripsínico y se usó como inóculo un cultivo líquido de segunda generación. Se añadió MgCO3 (-40 g/l) al medio de fermentación como tampón de pH. Se usó un inóculo al 4 % (v/v) y se realizaron las fermentaciones a 37 °C en frascos de suero de 50 ml que contenían dióxido de carbono estéril. Se analizó el nitrógeno soluble usando un procedimiento de reducción de cadmio, que convirtió el nitrato en nitrito, como se determina por espectrofotómetro. Se analizaron los glúcidos y los ácidos orgánicos de las muestras por medio de HPLC.

La complementación externa del hidrolizado con extracto de levadura no mostró ninguna diferencia apreciable en la fermentación de ácido succínico (FIGS. 16A-16B). La producción de ácido succínico del hidrolizado de microalgas fue similar a la fermentación de control de glúcido modelo que contenía 10 g/l de extracto de levadura como fuente de nitrógeno. Por tanto, el nitrógeno y los micronutrientes disponibles en el propio hidrolizado fueron comparables a los proporcionados por el extracto de levadura. Por ende, para la fermentación de ácido succínico del hidrolizado de biomasa de algas, no se requiere ninguna fuente de nitrógeno externa u otro nutriente.

Tabla 1 Cambio del contenido de nitrógeno en la fermentación

Como se muestra en la tabla 1, el contenido de nitrógeno soluble que queda después de la fermentación del hidrolizado de microalgas con el residuo sólido fue mayor que el del hidrolizado clarificado. Esto indica que se libera nitrógeno soluble del residuo sólido durante la fermentación.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de hidrólisis enzimática para convertir carbohidratos de algas en glúcidos monoméricos que comprende:

digerir microalgas con una mezcla de enzimas para producir biomasa tratada enzimáticamente, en el que la mezcla de enzimas comprende una mezcla de al menos una proteasa y al menos una glucoamilasa;

en el que está presente una carga de proteasa de al menos 0,25 kU de proteasa por gramo de biomasa y 1 unidad de proteasa se define como la cantidad de enzima que hidroliza 1 pmol de L-leucina-pnitroanilida por min;

en el que las microalgas se digieren a un pH de 3,0 a 5,5; y

separar la biomasa tratada enzimáticamente en una fase sólida y un sobrenadante, en el que la fase sólida contiene lípidos y el sobrenadante contiene carbohidratos y nutrientes.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además someter el sobrenadante a fermentación microbiana para obtener un producto.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el producto es ácido succínico.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además extraer lípidos de la fase sólida con un disolvente orgánico.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la mezcla comprende glucoamilasa en una cantidad de 150 U de glucoamilasa por gramo de biomasa.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la mezcla comprende proteasa en una cantidad de al menos 1,25 kU de proteasa por gramo de biomasa.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la mezcla comprende además al menos una a-amilasa.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las microalgas son microalgas húmedas ricas en lípidos.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la enzima proteasa comprende una proteasa ácida fúngica.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las microalgas tratadas enzimáticamente tienen un contenido de lípidos inferior a un 5 % p/p.