CN106198979B - 细粒棘球绦虫二氢叶酸还原酶的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了细粒棘球绦虫二氢叶酸还原酶在制备检测细粒棘球蚴病的免疫抗原和/或试剂盒中的应用，其作为免疫抗原能够被自然感染细粒棘球蚴病的绵羊阳性血清识别，应用于间接ELISA检测时，具备较高的特异性和灵敏度，临床检测符合率高达97.9％。以细粒棘球绦虫二氢叶酸还原酶为免疫抗原建立的检测方法具有良好的诊断效果，可以用于疫区绵羊细粒棘球蚴病的初步筛选。

Description

细粒棘球绦虫二氢叶酸还原酶的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及细粒棘球绦虫二氢叶酸还原酶的应用。

背景技术

细粒棘球蚴病又称囊性包虫病，是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)的中绦期幼虫引起的一种人兽共患病，主要寄生在人和家畜等多种哺乳动物体内。90％以上的细粒棘球蚴包囊生长于宿主的肝脏、肺脏或者同时生长于肝肺。细粒棘球蚴病呈世界性分布，引起一系列的经济和公共卫生问题。在一些流行地区，其感染率可高达5-10％，死亡率高达2-4％。据估计，全球人囊性棘球蚴病每年至少损失1-3.6百万伤残调整生命年(DALYs)，而动物囊性棘球蚴病每年造成的经济损失至少为20亿美元。因此，世界卫生组织已经把棘球蚴病列为《被忽视的热带疾病》，作为其2008-2015年重点防治计划。

缺乏标准有效的特异性重组抗原是细粒棘球蚴病免疫诊断中的一个尚未解决的难题。目前，细粒棘球蚴病免疫诊断的研究主要集中在粗囊液抗原上，但是其成分复杂，具有难以大量提纯、抗原来源不稳定、成本高、诊断特异性低等缺陷。与囊液抗原相比，重组抗原具有特异性好以及来源稳定等优点。目前，动物细粒棘球蚴病的重组诊断抗原的报道还很少，刘红霞等用细粒棘球蚴CE18重组蛋白检测绵羊细粒棘球蚴病，发现其他带科绦虫病阳性血清如羊脑多头蚴病血清和羊细颈囊尾蚴病血清均存在交叉反应，特别是和羊细颈囊尾蚴病血清的交叉反应概率较高，不能准确诊断绵羊细粒棘球蚴病。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供细粒棘球绦虫二氢叶酸还原酶的应用，使其能够能被自然感染细粒棘球蚴病的绵羊阳性血清识别，具有良好的免疫原性，并具有较高的特异性和灵敏度，减少与其他带科绦虫病阳性血清的交叉反应。

二氢叶酸还原酶(DHFR)能催化二氢叶酸生成四氢叶酸，进而合成四氢叶酸类辅酶，参与体内核酸和氨基酸的合成，在生物体中发挥重要作用。二氢叶酸还原酶抑制剂能选择性的与二氢叶酸还原酶结合，抑制其催化还原活性，使二氢叶酸不能顺利转变为四氢叶酸，阻碍叶酸代谢，干扰DNA和蛋白质的合成，最终导致细胞死亡，所以二氢叶酸还原酶抑制剂具有抗癌以及抗寄生虫的作用。

DHFR在原虫上研究的比较广泛，如疟原虫、利什曼原虫、锥虫、弓形虫等，但在蠕虫上并未见相关研究，因此，本发明对细粒棘球绦虫二氢叶酸还原酶(Eg-DHFR)进行了生物信息学分析，并通过反转录表达出rEg-DHFR蛋白，制备出抗rEg-DHFR的多克隆抗体，对该蛋白进行免疫印迹分析表明其可被自然感染细粒棘球蚴病的绵羊阳性血清识别，具有良好的免疫原性，利用rEg-DHFR蛋白建立细粒棘球蚴病间接ELISA诊断方法，为细粒棘球蚴病的防控提供监测手段。

因此，本发明提出了细粒棘球绦虫二氢叶酸还原酶在制备检测细粒棘球蚴病的免疫抗原和/或试剂盒中的应用。

其中，作为优选，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒或免疫印迹检测试剂盒。

同时，本发明还提供了一种检测细粒棘球蚴病的ELISA检测试剂盒，包括细粒棘球绦虫二氢叶酸还原酶(作为抗原进行包被)和ELISA检测试剂盒常规组分。所述试剂盒依据间接ELISA检测原理。

作为优选，所述ELISA检测试剂盒常规组分包括抗原包被液、酶标板、封闭液、HRP标记的二抗和TMB底物。

进一步优选地，所述封闭液为5％脱脂奶粉；所述HRP标记的二抗为HRP标记的山羊或绵羊抗兔二抗。

在具体的ELISA检测过程中，抗原包被的最佳条件是4℃过夜，抗原最佳浓度为0.6μg/每孔，血清最佳稀释浓度为1:320，最佳封闭液和封闭条件是5％脱脂奶粉37℃封闭1h，血清孵育最佳时间是37℃ 1.5h，二抗孵育最佳时间是37℃ 1h，二抗最佳稀释浓度为1:3000时，底物显色的最佳条件是37℃15min。在以上条件下，测得阴阳性血清的P/N值为3.86。

作为优选，所述ELISA检测试剂盒常规组分还包括显色反应终止液H₂SO₄、洗涤液PBST和稀释液PBS。

本发明先提取细粒棘球绦虫总RNA，而后进行反转录获得cDNA，根据GeneDB(http://www.genedb.org/Homepage/Egranulosus)中公布的Eg-DHFR(EgrG_000572400)的基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计引物扩增目的片段，然后进行测序验证，其与GeneDB中Eg-DHFR(EgrG_000572400)的序列同源性达到100％。最后连接至表达载体中，转入大肠杆菌中表达，获得细粒棘球绦虫二氢叶酸还原酶的反转录重组蛋白rEg-DHFR。

免疫印迹显示rEg-DHFR能被自然感染细粒棘球蚴病的绵羊阳性血清识别，具有良好的免疫原性。间接ELISA结果显示，该方法的cut-off值为0.4014，特异性和灵敏度分别为85.7％(12/14)和1:6400，并且与绵羊脑包虫血清无交叉反应。

由以上技术方案可知，本发明提供了细粒棘球绦虫二氢叶酸还原酶在制备检测细粒棘球蚴病的免疫抗原和/或试剂盒中的应用，其作为免疫抗原能够被自然感染细粒棘球蚴病的绵羊阳性血清识别，应用于间接ELISA检测时，具备较高的特异性和灵敏度，临床检测符合率高达97.9％。以细粒棘球绦虫二氢叶酸还原酶为免疫抗原建立的检测方法具有良好的诊断效果，可以用于疫区绵羊细粒棘球蚴病的初步筛选。

附图说明

图1所示为Eg-DHFR PCR扩增凝胶图；其中，M为DNA分子质量标准DL2000；1为空白对照；2为Eg-DHFR cDNA PCR产物；

图2所示为rEg-DHFR的western blot凝胶图；其中，M为蛋白质标准品；1为重组菌中rEg-DHFR的表达；2为纯化后的rEg-DHFR；3为兔抗rEg-DHFR-IgG识别rEg-DHFR；4为健康兔血清识别rEg-DHFR；5为自然感染细粒棘球蚴病的绵羊阳性血清识别rEg-DHFR；6为健康绵羊血清识别rEg-DHFR；7为兔抗rEg-DHFR-IgG识别原头蚴粗提蛋白；8为健康兔血清识别原头蚴粗提蛋白；

图3所示为间接ELISA对rEg-DHFR的特异性分析图；其中，横坐标从左至右依次为山羊抗细颈囊尾蚴阳性血清、绵羊抗脑多头蚴阳性血清、绵羊抗细粒棘球蚴阳性血清；Cuto-off value表示临界值；

图4所示为间接ELISA的临床试验结果图；其中，横坐标从左至右依次为阳性血清和阴性血清；Cuto-off value表示临界值。

具体实施方式

本发明公开了细粒棘球绦虫二氢叶酸还原酶的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明具体实施方式中，各试验所涉及的材料和试剂如下：

1、主要试剂

动物组织总RNA抽提试剂盒(TRIzol.R.Total RNA Isolation.Reagent)和反转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)，购自GIBCOBRL公司；DNAMarker、Protein Marker、限制性内切酶(BamH I、Hind III、EcoRI、Xho I)、T4DNA连接酶，购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、Ni-NTA Agarose，购自Qiagen公司；TaqPCRMasterMix、质粒小量抽提试剂盒、HRP-DAB底物显色试剂盒，购自北京天根生化科技有限公司；HRP标记的羊抗兔IgG抗体，HRP标记的兔抗山羊IgG抗体，HRP标记的兔抗绵羊IgG抗体，FITC标记的羊抗兔IgG抗体购自武汉博士德生物有限公司；IPTG，弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，购自Sigma公司；HiTrap Protein A HP，购自Bio-Rad公司，PCR引物合成和测序由上海英俊生物工程有限公司完成；其它试剂均为国产分析纯。

2、菌株和质粒载体

宿主菌大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)、pMD19-T Vector购自TaKaRa公司；pET32a(+)载体由四川农业大学动物寄生虫病实验室提供。

3、常用缓冲溶液和培养基的配制

PBS Buffer①：分别称取下列试剂于烧杯中：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄1.42g，KH₂PO₄ 0.27g。加入约500mL灭菌双蒸水混匀溶解，加入浓HCl使pH达到7.4，定容到1L。高压灭菌后室温保存。

电泳缓冲液(50×TAE Buffer)：称取242g Tris和37.2g Na₂EDTA·2H₂O于烧杯中，加入500mL灭菌双蒸水并混匀溶解，加58mL的CH₃COOH再次充分搅拌，定容到1L并室温保存。

EB：将0.1gEB加入100mL的灭菌双蒸水中，分装后常温保存。

LB培养基：液态培养基：分别称取Triptone 10g，5g Yeast Extract,10g NaCl加入烧杯中溶于500mL灭菌H₂O中并用烧碱调节pH至7.0，定容到1L后高压灭菌，4℃保存。LB平板：每1L溶液中加15g琼脂粉，高压灭菌，4℃保存。

IPTG溶液：电子天平称取2g的异丙基硫代半乳糖苷溶于8mL超纯水中，充分搅拌溶解后加水到10mL，用0.45μm滤膜过滤后用EP管分装贮存于-20℃。

30％聚丙烯酰胺溶液：称取0.8g的Bis-acrylamide和29.2g的Acrylamide，加入50mL去离子水混匀溶解，加水到100mL，用0.22μm滤膜过滤。

1M Tris-HCl(pH 6.8)：称取12.11g的Tris于烧杯中，加80mL双蒸水充分搅拌溶解，加浓盐酸并使用酸度计调整pH到6.8后加水到100mL，用0.22μm滤膜过滤。

1.5M Tris-HCl(pH 8.8)：取19g的Tris于烧杯中，加50mL双蒸水充分搅拌溶解，加浓盐酸并使用酸度计调整pH到8.8后加水到100mL，4℃保存。

10％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液：称取10g的SDS于烧杯中，加入80mL双蒸水充分搅拌溶解后定容至100mL，用0.45μm滤膜过滤后常温保存。

10％过硫酸铵溶液：称取0.1g的APS，加水定容到1mL，常温保存。

考马斯亮蓝染色液：用电子天平称取0.1g考马斯亮蓝粉末于20mL酒精中，取100mL浓磷酸到200mL，用0.45μm滤膜过滤后常温保存。

氨苄西林钠溶液(AMP)：使用电子天平称取1gAmpicilin粉末，吸取9mL超纯水充分搅拌溶解后定容至10mL，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装EP管-20℃保存。

4、试验动物

2只健康新西兰兔，1.4～2.2kg，购自四川农业大学试验动物中心。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：细粒棘球蚴总RNA的提取

细粒棘球蚴包囊来自于自然感染的绵羊肝脏，样本采自青海西宁或四川甘孜，保存于液氮中。

取出液氮保存的细粒棘球蚴，用研钵将其磨碎，随后参照天根的动物组织RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。

(1)每10-20mg原头蚴加300μL裂解液，使用研磨棒研磨；

(2)向匀浆液中加入Proteinase K(10μL)和RNase-Free ddH2O(590μL)，混匀后反应15min(56℃)。

(3)离心5min(12,000rpm)，将上清转移到干净的管子中；在管子中加入0.5倍上清体积的无水乙醇，混匀后转入吸附柱中，离心1min(12,000rpm)后弃废液。

(4)在吸附柱中加去蛋白质液RW1(350μL)，离心1min(12,000rpm)后，弃废液。

(5)将DNase I工作液(80μL)加入吸附柱，室温放置反应15min；随后加去蛋白质液RW1(350μL)，离心1min(12,000rpm)后弃废液。

(6)500μL漂洗液RW加入吸附柱中，放置2min(室温)，离心1min(12,000rpm)后弃废液。

(7)重复(6)。

(8)空离，弃废液，晾干残余漂洗液。

(9)把吸附柱放入一个新的离心管中，用RNase-Free ddH2O(30-100μL)洗脱，静置2min(室温)，离心2min(12,000rpm)后得到细粒棘球蚴总RNA提取液。

实施例2：第一链cDNA的合成

以抽提的细粒棘球蚴总RNA为模板，以Oligo dT(18)为反转录引物，参照Thermo公司反转录试剂盒说明书进行操作：

(1)冰上制备反应混合物

Oligo dT₁₈ 1μL

模板RNA 1μL

DEPC ddH₂O 1μL

(2)在70℃(5min)孵育后转到冰上冷却

(3)在冰上按照顺序加入以下反应物：

5reaction buffer 4μL

核糖核酸酶抑制剂 1μL

10dNTP混合物 2μL

(4)37℃(5min)孵育后加RevertAid^TM反转录酶1μL。

(5)PCR程序：42℃，1h；70℃，10min。

(6)得到的cDNA于-80℃保存。

实施例3：Eg-DHFR基因的扩增

根据GeneDB(http://www.genedb.org/Homepage/Egranulosus)中公布的Eg-DHFR(EgrG_000572400)的基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计引物：

上游：5’-CGCGGATCCATGGGGCTGAAGCGTCT-3’下划线为BamH I

下游：5’-CCGCTCGAGATGATCATTAAGGGGATGCG-3’下划线Xho I

扩增体系(25μL)：DNA模板各1μL，上下游引物各1μL，PCR Mixture12.5μL，灭菌双蒸水9.5μL。

扩增条件：预变性：95℃5min；38个循环(变性：95℃，40s；退火：54℃，45s；延伸：72℃，45s)；最后延伸：72℃，10min。

以细粒棘球绦虫原头蚴的cDNA为模板扩增出一条576bp左右的条带(图1)。

实施例4：PCR产物的回收

将含有目的条带的凝胶切下，放入EP管中，称重。采用凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段。每100mg凝胶加入400μLPC Buffer后，55℃水浴溶胶。待凝胶完全溶解后，移入吸附柱中，离心60 sec(12000rpm)，随后加入Washing Buffer洗涤离心2次后，空离心2min(12000rpm)。晾干吸附柱内乙醇气味，向吸附柱中加入30μL Elution Buffer，离心2min(12000rpm)，得到目的DNA片段。

实施例5：Eg-DHFR基因克隆测序和比对

(1)将下列试剂混合：4μL的Solution 1，3.5μL的模板DNA，0.5μL的pMD19-Tvector，放入离心机瞬离后放于16℃恒温水连接过夜。

(2)从-70℃出感受态细胞，室温融化后取30μL放入空EP管中，将连接过夜的8μL产物加入EP管并用微量加样枪轻轻吹打混匀，立刻放入冰水混合物冰浴30min。42℃水浴90s立即冰浴5min。每个EP管中加入600μL的LB溶液，37℃中180r/min培养1.5h。将混匀的溶液倒在到LB平板上，37℃冷却1h使表面干燥，反倒平板过夜。

(3)挑取菌落到空EP管中，加入1mL LB溶液和1μLAMP溶液，160r/min震荡培养6h至其浑浊。吸取1μL菌液扩增并将产物跑电泳后观察。选取电泳观察阳性的菌液送至英潍捷基公司进行测序。

把测序得到的目的片段序列放入GeneDB数据库中比对，经测序得到的序列与GeneDB中Eg-DHFR(EgrG_000572400)的序列同源性达到100％。

实施例6：Eg-DHFR基因克隆、鉴定及转化

1、质粒提取

测序结果比对正确后，将菌株扩大培养，参照天根生化有限公司的质粒小提试剂盒操作说明进行：

(1)取3-5mL菌液，离心收集沉淀；

(2)加入悬浮液P1悬浮菌体，并加入裂解液P2对菌液进行裂解；

(3)加入P3产生沉淀，翻转混合，静置10min后离心15min(12,000rpm)；

(4)取上清至收集管中，加600μL漂洗溶液PW，静置2min，离心1min(12,000rpm)，弃废液；

(5)重复(4)；

(6)晾干漂洗液后用90μL洗脱液回收质粒。

2、质粒酶切回收

将提取的pMD19-T-Eg-DHFR用Takara BamH I和Xho I快切酶双酶切，37℃酶切12min，体系总体积为10μL：T克隆质粒8μL，10X QuickCut Green Buffer 1μL，QuickBamH I和Xho I 0.5μL。用微量加样枪混匀后瞬离，37℃恒温水浴15min后迅速取出点样进行1％的琼脂糖凝胶电泳并胶回收。

3、目的片段连接表达载体

将双酶切的Eg-DHFR目的片段和pET28a(+)载体22℃连接1.5h，随后连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，并涂于氨苄青霉素抗性的LB培养基平板上，37℃培养12h。挑取单个菌落，进行PCR鉴定。

4、pET28a-Eg-DHFR重组质粒双酶切鉴定

对重组质粒进行双酶切鉴定，方法参照“2、质粒酶切回收”。

实施例7：重组Eg-DHFR在大肠杆菌中的表达

1、重组蛋白的表达

(1)将测序正确的重组质粒pET28a(+)-DHFR转入BL21(DE3)表达菌。

(2)将表达菌接种于两瓶含100mL的新鲜的LB(含AMP 100μg/mL)培养液中，37℃摇床培养3h(160r/min)，至菌液OD590为0.6后加入诱导剂IPTG(1mmol/L)，37℃诱导5h(160r/min)，另一瓶不加IPTG做对照培养。

(3)分别取有到过后的菌液1.5mL于两个新EP管中，4℃离心1min(12,000r/min)收集菌体，分别加入10μL 5×SDS上样Buffer和40μL PBS溶液，充分混匀。

(4)沸水煮10min，以使菌体充分破裂，4℃离心10min(12,000r/min)，取上清进行SDS-PAGE。

(5)用考马斯亮蓝染色1h，脱色后观察表达情况。

2、重组蛋白的可溶性分析

将含有重组质粒Pet28a-Eg-DHFR的表达菌接种于500mL含氨苄的液体培养基中，37℃培养(170rpm)至OD600＝0.6左右，加入最佳IPTG浓度，诱导6h。把菌液离心10min(8000rpm)，弃上清，沉淀用裂解液(20mM Tris-Cl,pH8.0)悬浮，超声破碎菌体。将破碎后的菌体裂解液在4℃条件下离心10min(12,000rpm)，分离沉淀与上清；沉淀加入适量的8M尿素溶解。上清和沉淀各取40μL，分别加10μL 5×SDS凝胶上样缓冲液，煮沸10min，离心10min(12,000rpm)，进行SDS-PAGE电泳，分析rEg-DHFR是否为可溶性表达。

3、SDS-PAGE电泳检测

按蛋白质电泳仪(Bio-Rad)说明书，组装电泳槽。配制12％的分离胶和5％的浓缩胶；把凝胶垂直置于电泳缓冲液中，将样本和蛋白质Marker加入样品孔中；调节恒压为80V，20min；随后调整电压为200V。电泳完毕后取出凝胶，用考马斯亮蓝染色1h，沸水浴脱色15min，最后在凝胶成像系统中照相观察。

4、重组蛋白的纯化

根据上述步骤对重组菌诱导表达，获得大量重组蛋白菌液。

(1)取1,000mL菌液，离心10min(8,000rpm)，弃上清，收集菌体。

(2)在菌体中加入裂解液。

(3)超声波破碎，直到菌液澄清。

(4)离心10min(12,000rpm)，留上清。

(5)取镍离子亲和层析柱，用Banding Buffer平衡5-10个床体积；

(6)将样品于0.22μm滤膜过滤后上样；

(7)用Banding Buffer洗5-10个床体积；

(8)用含不同梯度的咪唑洗脱液进行洗脱，并收集各洗脱峰；

(9)用400mM咪唑洗脱液清洗后，用20％的乙醇洗涤至离子浓度为0，将柱子于4℃保存。

(10)将蛋白用超滤管进行超滤和浓缩，多次加入PBS进行溶液的置换，以除去原有的咪唑；

(11)蛋白浓缩后，进行SDS-PAGE检查，并以BCA蛋白质定量试剂盒测定蛋白质浓度。

5、结果

Eg-DHFR片段成功连接在pET-28a载体上，转化进入BL21大肠杆菌中诱导表达。在37℃条件下，用1mM IPTG诱导5h时表达量最大。表达的重组蛋白大小为27kDa左右，符合预期大小。可溶性分析结果显示，rEg-DHFR表达为可溶性蛋白。纯化后的重组蛋白为单一条带(图2)。

实施例8：免疫原性分析

1、兔抗rEg-DHFR-IgG的制备

将纯化后的rEg-DHFR蛋白分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按照1:1比例混合制备乳剂苗。对两只新西兰兔进行皮下四次注射免疫，每次间隔两个周免疫一次，第一次用弗氏完全佐剂和200μg重组蛋白皮下注射免疫，后三次均用弗氏不完全佐剂和200μg重组蛋白皮下注射免疫。

免疫结束后，使用HiTrap ProteinA 1mL预装柱和HPLC纯化系统(Bio-Rad)纯化血清，将流速调为1.0mL/min，使用A2Buffer洗柱子10min。将0.45μm NC膜过滤过的血清放入柱子中，0.5mL/min。用10-20ml的B Buffer洗脱，收集洗脱下来的IgG，并用50mM的Tris调节洗脱下来的IgG溶液的PH。平衡后用20％的酒精洗涤柱子，直到离子浓度降为0。通过SDS-PAGE鉴定抗体纯化情况。

2、免疫印迹

(1)按照上述方法制备蛋白质电泳凝胶，对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳。

(2)蛋白质电泳结束后，取蛋白质所在的相应凝胶部位，放入转膜缓冲液中进行平衡，共3次，每次4min。

(3)将硝酸纤维素滤膜(NC膜)和24层滤纸置于转移缓冲液中浸泡5min。

(4)按顺序将阴极电极板、24层滤纸、凝胶、NC膜、24层滤纸置于Bio-Rad半干式转印槽内，盖上阳极电极板。

(5)将电转移装置接到电转仪上，并加入转移缓冲液35mA转移30min。

(6)转移结束后，取出NC膜，浸泡在3％BSA的TBST中，4℃封闭过夜。

(7)封闭结束后，剪开NC膜，阴性和阳性分开放置，加入1：1000稀释的一抗，室温孵育2h后，倒掉一抗，用TBST快速洗膜3次，5min/次。

(8)将HRP标记的Goat-anti-sheep IgG按1:1000稀释后，加入NC膜，室温孵育2h后，倒掉二抗，用TBST快速洗膜3次，5min/次。

(9)将NC膜置于平皿中，以新鲜底物显色液冲洗直至显色。

(10)显色后，用双蒸水冲洗NC膜终止显色，并对结果进行拍照记录。

3、结果

免疫印迹显示，rEg-DHFR能被细粒棘球蚴病阳性绵羊血清识别，且为单一条带(图2)，说明rEg-DHFR具有较好的免疫原性。以兔抗rEg-DHFR-IgG识别原头蚴粗蛋白提取液，显示只有单一条带，大小与天然Eg-DHFR一致(21.9kDa)，说明表达的重组蛋白确实为rEg-DHFR。

实施例9：间接ELISA方法的建立

1、间接ELISA操作步骤

(1)以抗原包被液按比列稀释rEg-DHFR蛋白，每孔100μL加入96酶标板中进行包被；

(2)倒掉包被液，拍干孔内液体，用PBST洗涤，重复四次；

(3)加入封闭液(5％的脱脂奶粉)封闭后，洗涤四次；

(4)用PBS按比例稀释血清后，加入酶标孔孵育，倒掉液体，洗涤四次；

(5)加入稀释好的HRP标记的山羊或绵羊抗兔二抗，孵育，洗涤四次；

(6)在避光条件下向孔中加入可溶性单组分底物TMB进行显色反应；

(7)在孔中加入100μL 2M H₂SO₄终止反应，在紫外吸光度为450nm时测定其OD值。

(8)倒掉液体，拍干后，按(2)所示洗涤四次，每次3min；

(9)倒掉液体，拍干后，在避光条件下进行颜色反应，向孔中加入可溶性单组分底物TMB，每孔100μL，室温孵育10～20min；

(10)再向孔中加入100μL 2M H₂SO₄终止反应，立即将96孔板置于酶标仪上，在紫外吸光度为450nm时测定其OD值。

2、确定最佳条件

(1)用棋盘滴定法确定最佳抗原和血清稀释浓度^[100]，设置6个抗原浓度梯度，分别为：0.075μg,0.15μg,0.3μg,0.6μg,1.2μg和2.4μg/每孔，血清从1:20到1:2560作倍比稀释，以阳性血清OD₄₅₀接近1，P/N最大的条件作为最佳。

(2)二抗作用的最佳浓度和时间，分别设1:1000，1:2000，1:3000，1:4000，1:5000五个稀释浓度进行摸索。二抗作用时间设置为37℃0.5小时、1小时、1.5小时、2小时四个组，以阳性血清OD₄₅₀接近1，P/N最大的条件作为最佳。

(3)抗原包被时间确定，用包被液稀释重组抗原，用最佳稀释浓度进行包被，包被时间分别为37℃1h、37℃2h及4℃过夜3个组，以阳性血清OD₄₅₀接近1，P/N最大的条件作为最佳。

(4)封闭液以及封闭时间的确定，分别用1％BSA，3％BSA，5％BSA，1％脱脂牛奶，3％脱脂牛奶，5％脱脂牛奶封闭。用最佳的封闭液分别封闭37℃1小时、2小时、3小时及4℃过夜4个，以阳性血清OD₄₅₀接近1，P/N最大的条件作为最佳。

(5)阴、阳性血清反应时间的确定，按照确定的条件来筛选阴、阳性血清的最佳孵育时间，设为37℃0.5小时、1小时、1.5小时、2小时4个组，以阳性血清OD₄₅₀接近1，P/N最大的浓度作为最佳。

(6)底物显色时间的确定，37℃条件下设5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟和30分钟显色时间，测定OD₄₅₀值，以阳性血清OD₄₅₀接近1，P/N最大时间作为最佳。

间接ELISA结果显示，P/N值达到最高的抗原包被的最佳条件是4℃过夜，抗原最佳浓度为0.6μg/每孔，血清最佳稀释浓度为1:320，最佳封闭液和封闭条件是5％脱脂奶粉37℃封闭1h，血清孵育最佳时间是37℃ 1.5h，二抗孵育最佳时间是37℃ 1h，二抗最佳稀释浓度为1:3000时，底物显色的最佳条件是37℃ 15min，在以上条件下，测得阴阳性血清的P/N值为3.86。

3、临界值的确定

在最佳条件下，测定24份绵羊细粒棘球蚴病阴性血清的OD₄₅₀。设置三个重复。按照临界值＝平均值+3倍标准差计算。

用24份绵羊阴性血清样品的OD₄₅₀值确定临界值，通过统计学分析，计算出24份绵羊阴性血清样品OD₄₅₀值的平均值为0.255，标准差为0.0488。根据计算公式：临界值＝阴性样本OD₄₅₀平均值+3倍标准差，得出临界值为0.4014，即OD₄₅₀>0.4014时，理论上可判定为阳性，OD₄₅₀<0.4014可判定为阴性。

4、批内重复性试验

取同一批次包被的板子，检测5份已知为细粒棘球蚴病阳性的绵羊血清，每份设置3个重复孔，按照已经建立的ELISA方法，进行批内重复试验，计算变异系数，检测该方法的批内重复性。

批内重复性试验结果显示，板内的变异系数在0.332％-0.944％之间，平均值为0.661％。

5、批间重复性试验

取3个批次包被的板子，在最佳条件下，检测3份细粒棘球蚴病阳性的绵羊血清，每份设置3个重复孔，按照已经建立的ELISA方法，进行批间重复试验，计算变异系数，检测该方法的批间重复性。

批间重复性试验结果显示，板间变异系数在0.584％-1.21％之间，平均值为0.830％。

6、特异性试验

用建立的间接ELISA分别对山羊抗细颈囊尾蚴阳性血清、绵羊抗脑多头蚴血清进行检测，检测其特异性。

用建立的间接ELISA分别对绵羊抗脑多头蚴血清和山羊抗细颈囊尾蚴阳性血清进行检测，结果显示与绵羊脑包虫血清无交叉反应，与细颈囊尾蚴有2个血清有交叉反应(图3)，因此，其特异性为85.7％(12/14)。

7、灵敏度试验

将3份阳性血清作倍比稀释，从1:100到1:201800，根据判定标准，确定其灵敏度。

将3份阳性血清作倍比稀释，结果显示在稀释6400倍时，OD₄₅₀平均值为0.527，仍属于阳性，而在在稀释12800倍时，OD₄₅₀平均值为0.334，小于临界值，因此，确定其灵敏度为1:6400。

8、临床试验

用建立的间接ELISA方法分别对24份细粒棘球蚴病阴性绵羊血清和24分细粒棘球蚴病阳性绵羊血清进行检测，根据临界值判断该方法的可靠性。

用24份绵羊细粒棘球蚴病阳性血清和24份阴性血清对建立的间接ELISA方法进行临床检测(见表1和图4)，结果显示23份绵羊细粒棘球蚴病阳性血清的OD₄₅₀均大于临界值，24份阴性血清OD₄₅₀均小于临界值，检测的符合率高达97.9％。

表1临床血清样本OD₄₅₀

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.细粒棘球绦虫二氢叶酸还原酶在制备检测细粒棘球蚴病的免疫抗原和/或试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒或免疫印迹检测试剂盒。

3.一种检测细粒棘球蚴病的ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括细粒棘球绦虫二氢叶酸还原酶和ELISA检测试剂盒常规组分，所述ELISA检测试剂盒常规组分包括抗原包被液、酶标板、封闭液、HRP标记的二抗和TMB底物。

4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述封闭液为5％脱脂奶粉。

5.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述HRP标记的二抗为HRP标记的山羊或绵羊抗兔二抗。

6.根据权利要求3-5任意一项所述试剂盒，其特征在于，所述ELISA检测试剂盒常规组分还包括显色反应终止液H₂SO₄、洗涤液PBST和稀释液PBS。