CN106810602A - 弓形虫感染小鼠脑组织差异表达蛋白质、与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质及其应用 - Google Patents

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CN106810602A CN201710169788.2A CN201710169788A CN106810602A CN 106810602 A CN106810602 A CN 106810602A CN 201710169788 A CN201710169788 A CN 201710169788A CN 106810602 A CN106810602 A CN 106810602A
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Abstract

本发明提供了一种应用iTRAQ技术研究弓形虫慢性感染小鼠脑组织差异表达蛋白质组的方法，本发明还提供了一种与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质或多肽、及其应用，本发明通过CoIP和Pulldown实验发现与大脑发育调节蛋白相互作用6个弓形虫蛋白，并进一步针对TgRPS14、TgH4基因进行基因敲除实验和神经行为学验证。本发明提供了的弓形虫慢性感染小鼠脑组织差异表达蛋白质组的方法能快速有效地进行蛋白质组学研究，有利于快速定位到具有研究价值或商业应用价值的检测靶标、防治药物靶点。

Description

弓形虫感染小鼠脑组织差异表达蛋白质、与大脑发育调节蛋 白相互作用的蛋白质及其应用
本申请要求了2017年03月17日提交中国专利局的，申请号201710162190.0，发明名称为“弓形虫感染小鼠脑组织差异表达蛋白质、与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及寄生虫学领域，涉及一种弓形虫感染小鼠脑组织差异表达蛋白质、与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质及其应用；具体涉及一种应用iTRAQ技术研究弓形虫慢性感染小鼠脑组织差异表达蛋白质组的方法、还涉及一种与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质或多肽、及其应用。
背景技术
弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种机会致病性原虫，可以引起世界性的人兽共患寄生虫病。据调查，约30％的世界人口有潜在的弓形虫感染，其中90％发生弓形虫脑炎的病人死亡，继发性瘫痪的比例更高。近年来，弓形虫慢性感染导致的中枢神经系统(centralnervous system,CNS)损伤越发受到广泛关注，这类病患表现为局部或弥散性的神经损伤，常伴随精神症状和行为失常，如产生类似阿兹海默症的症状表现。
蛋白质组学技术已被广泛应用到包括寄生虫在内的许多生物体研究中，但目前寄生虫的基因图谱极不完善，因此给蛋白质组的研究带来了一定困难。
同位素标记相对和绝对定量(Isobaric Tags For Relative And AbsoluteQuantitation，iTRAQ)技术是美国应用生物系统公司2004年推出的一种体外同位素标记技术。作为一种新型蛋白质组学定量研究技术，iTRAQ技术可以在同一实验中对4种或8种不同样本进行蛋白质定量比较，对一个基因组表达的全部蛋白质或者一个复杂混合体系中的所有蛋白质进行精确定量和分析鉴定。
目前还未有报道应用iTRAQ技术研究弓形虫慢性感染小鼠脑组织差异表达蛋白质组的方法。
此外，获得弓形虫慢性感染小鼠脑组织差异表达蛋白质组之后，需要对差异表达蛋白质进行功能分析以及功能验证，才能挖掘出检测靶标、防治药物靶点；目前，由于有效获取弓形虫慢性感染小鼠脑组织差异表达蛋白质组的方法较为缺乏，导致关于弓形虫慢性感染小鼠脑组织差异表达蛋白质相互作用蛋白的研究也难以推进，不利于检测靶标、防治药物靶点的发现和应用。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种应用iTRAQ技术研究弓形虫慢性感染小鼠脑组织差异表达蛋白质组的方法、与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质或多肽、及其应用。
第一方面，本发明提供了一种应用iTRAQ技术研究弓形虫慢性感染小鼠脑组织差异表达蛋白质组的方法，包含以下步骤：
(1)小鼠脑蛋白的提取；
(2)对步骤(1)所得的蛋白质样品进行FASP酶解、肽段标记；
(3)对步骤(2)标记的蛋白质样品进行HPLC分离肽段混合物及LC-MS质谱分析；
(3)对上步所得的质谱鉴定结果进行生物信息学分析、定量分析，获取弓形虫慢性感染小鼠脑组织过程中的差异表达蛋白质。
优选地，步骤(1)中，小鼠包括昆明鼠、Balb/c鼠、沙鼠中的一种或多种。
优选地，步骤(1)中所述小鼠脑蛋白的提取，具体步骤为：分别取感染弓形虫的小鼠脑及健康SPF小鼠脑，进行RIPA裂解、超声、离心处理，收集上清液。
进一步优选地，所述超声处理的条件为：20W，工作0.8s，停0.8s，超声10次后放于冰上冷却，并重复6次。
进一步优选地，所述离心处理的条件为：4℃，12000rpm，离心20min，收集上清液。
优选地，步骤(2)中FASP酶切具体包括：
a)在对步骤(1)所得的蛋白质样品定量后，每个样本取200μg蛋白溶液置于离心管中，加入TCEP还原试剂，60℃反应1h；然后加入MMTS半胱氨酸封闭试剂，室温反应30分钟；获得还原烷基化后的蛋白溶液；
b)将还原烷基化后的蛋白溶液加入超滤管中，离心，弃掉收集管底部溶液；加入8M尿素(pH 8.5)，离心，弃掉收集管底部溶液；加入0.25M TEAB(pH 8.5)，离心，弃掉收集管底部溶液；更换新的收集管，在超滤管中加入0.5M TEAB，加入胰蛋白酶(胰蛋白酶与蛋白质量比优选为1:50)，37℃反应过夜；次日加入胰蛋白酶(胰蛋白酶与蛋白质量比优选为1:100)，37℃反应4h，离心获得酶解消化后的肽段溶液。
优选地，步骤(2)肽段标记具体包括：参照AB公司试剂盒iTRAQ Reagent-8plexMultiplex Kit(AB SCIEX)说明书进行FASP酶切后所得肽段的标记。
进一步优选地，步骤(2)肽段标记包括：
a)取8标iTRAQ试剂盒，平衡至室温；向每管iTRAQ试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底，获得异丙醇处理后的iTRAQ试剂；
b)取50μl样品(约100μg酶解产物)转移到新的离心管中，加入步骤a)异丙醇处理后的的iTRAQ试剂到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2h；加入水终止反应，获得标记肽段。
优选地，步骤(3)具体包括：
a)先(用95％的A相5％B相)平衡柱子，然后将步骤(2)标记后多肽用A相复溶，进样后以0.2ml/min的速率进行梯度洗脱：B相从5％到37％，最后在5min内使B相的比例上升至95％并保持5min，共85min；收取肽段溶液，真空干燥后，进行第二维LC-MS分析；其中，A相：水(NH3 in H2O，pH 10)；B相：80％乙腈(NH3 in H2O，pH 10)；；
b)步骤(a)真空干燥后的肽段用样品溶解液溶解，充分振荡涡旋、离心，上清转移到上样管中，进行质谱鉴定；
色谱柱信息：75um i.d.x 150mm,装填Acclaim PepMap RSLC C18,2μm,nanoViper；流动相A：0.1％甲酸；流动相B：0.1％甲酸，80％CAN(硝酸铈铵)；流速：300nL/min；每个组分分析时间：65min；有效梯度：B相从5％上升至35％，40min。
进一步优选地，步骤(3)具体包括：
a)先用95％的A相5％B相平衡柱子(Phenomenex columns；Gemini-NX 3u C18110A；150*2.00mm)30min，然后将标记后抽干的混合多肽用200μl的A相复溶，取100μl进样后以0.2ml/min的速率进行梯度洗脱：B相从5％到37％，最后在5min内使B相的比例上升至95％并保持5min，共85min；整个洗脱过程在214nm吸光度下进行监测，从线性梯度开始根据峰型收取24个组分，每1管每50秒钟接1次，梯度为85min，反复循环接样；根据峰型和时间共收取24个组分(肽段)，真空干燥后，进行第二维LC-MS分析；其中，A相：水(NH3 in H2O pH10)；B相：80％乙腈(NH3 in H2O pH 10)
b)肽段用样品溶解液(0.1％甲酸、5％乙腈)溶解，充分振荡涡旋，13500rpm，4℃离心20min，上清转移到上样管中，进行质谱鉴定；色谱柱信息：75um i.d.x 150mm,装填Acclaim PepMap RSLC C18,2μm,nanoViper；流动相A：0.1％甲酸；流动相B：0.1％甲酸，80％CAN(硝酸铈铵)；流速：300nL/min；每个组分分析时间：65min；有效梯度：B相从5％上升至35％，40min；
c)分离后的肽段直接进入质谱仪Thermo Scientific Q Exactive进行在线检测，具体参数如下：一级质谱参数：Resolution：70,000；AGC target：3e6；Maximum IT：100ms；Scan range：350 to 1800m/z；二级质谱参数：Resolution：17,500；AGC target：5e4；Maximum IT：120ms；TopN：20；NCE/stepped NCE：30。
优选地，步骤(4)生物信息学分析具体包括：用Proteome Discoverer 1.4(ThermoFisher Scientific)的默认设置进行蛋白质组分析；用Protein Pilot 5.0(AppliedBiosystems Sciex)进行蛋白质组学分析和蛋白定量分析；差异表达倍数>2倍和<0.5倍(两个标准“P≤0.05和|FC|≥2”)，分别选出作为蛋白表达量上调和下调的研究对象。
本发明所述的P值为Protein Pilot 5.0软件分析时进行的假设检验，FC为Foldchange的缩写。
优选地，步骤(4)生物信息学分析进一步具体包括：通过QuickGO，从生物学进程、分子功能以及细胞组分，对差异表达蛋白进行分析。
优选地，步骤(4)生物信息学分析进一步具体包括：通过KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)进行生物学通路分析，在Uniprot上可找到该蛋白的序列和功能信息。
优选地，如第一方面提供的方法，获取弓形虫慢性感染小鼠脑组织过程中的差异表达蛋白质不低于4983个蛋白。
优选地，如第一方面提供的方法，通过用两个标准“P≤0.05和|FC|≥2”进行显著性差异分析，被弓形虫感染的昆明鼠脑部与对照组相比，可获得上调蛋白有不低于215个。
进一步优选地，可获得不低于215个的上调蛋白优选包括表2中所例高表达蛋白。
优选地，如第一方面提供的方法，通过用两个标准“P≤0.05和|FC|≥2”进行显著性差异分析，被弓形虫感染的昆明鼠脑部与对照组相比，可获得下调蛋白有不低于246个。
进一步优选地，可获得不低于246个的下调蛋白优选包括表2中所例低表达蛋白。
优选地，如第一方面提供的方法，通过用两个标准“P≤0.05和|FC|≥2”进行显著性差异分析，被弓形虫感染的Balb/c鼠脑部与对照组相比，可获得上调蛋白有不低于159个。
优选地，如第一方面提供的方法，通过用两个标准“P≤0.05和|FC|≥2”进行显著性差异分析，被弓形虫感染的Balb/c鼠脑部与对照组相比，可获得下调蛋白有不低于353个。
进一步优选地，可获得不低于246个的下调蛋白优选包括表2中所例低表达蛋白。
优选地，如第一方面提供的方法，通过用两个标准“P≤0.05和|FC|≥2”进行显著性差异分析，被弓形虫感染的沙鼠脑部与对照组相比，可获得上调蛋白有不低于48个(优选包括表3中所例48种高表达蛋白)。
优选地，如第一方面提供的方法，通过用两个标准“P≤0.05和|FC|≥2”进行显著性差异分析，被弓形虫感染的沙鼠脑脑部与对照组相比，可获得下调蛋白有不低于63个(优选包括表3中所例63种低表达蛋白)。
优选地，如第一方面提供的方法获得的差异表达蛋白质涉及的通路包括代谢信号通路、氧化磷酸化信号通路、谷氨酸能突触信号通路、钙信号信号通路、cGMP-PKG信号通路、突触囊泡循环信号通路，以及Mdh2、Pdhx、Pvalb、Atp5a1、Cox4i1、Me1、Dbn1、Impdh2、Syt7、Hadha、Actb蛋白相关信号通路中的一种或多种。
优选地，如第一方面提供的方法中，步骤(4)获取弓形虫慢性感染小鼠脑组织过程中的差异表达蛋白质包括大脑发育调节蛋白。
进一步优选地，所述与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质或多肽的氨基酸序列包括：
1)表12所示蛋白质中的任一种，或
2)氨基酸编码序列与表12所示蛋白质同源性不低于80％、85％、90％、95％、98％或
99.9％的蛋白质或多肽中的任一种。
第三方面，本发明提供了一种与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质或多肽，所述与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质或多肽的氨基酸序列包括：
1)表12所示蛋白质中的任一种，或
2)氨基酸编码序列与表12所示蛋白质同源性不低于80％、85％、90％、95％、98％或99.9％的蛋白质或多肽中的任一种。
第四方面，本发明提供了一种核酸序列，所述核酸序列编码第三方面所述的与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质或多肽的氨基酸序列中的任一种。
第五方面，本发明提供了一种如第一方面提供的方法、与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质或多肽、如第三方面提供的与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质或多肽、如第四方面提供的核酸序列在制备弓形虫慢性感染关联信号通路生物标志物或诊断试剂中的应用，其中，所述信号通路包括代谢信号通路、氧化磷酸化信号通路、谷氨酸能突触信号通路、钙信号信号通路、cGMP-PKG信号通路、突触囊泡循环信号通路，以及Mdh2、Pdhx、Pvalb、Atp5a1、Cox4i1、Me1、Dbn1、Impdh2、Syt7、Hadha、Actb蛋白相关信号通路中的一种或多种。
第六方面，本发明提供了一种如第一方面提供的方法、与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质或多肽、如第三方面提供的与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质或多肽、如第四方面提供的核酸序列在制备弓形虫慢性感染关联疾病生物标志物、诊断试剂或靶向药物中的应用，其中，所述弓形虫慢性感染关联疾病包括亨廷氏舞蹈症、阿兹海默症、帕金森氏症中的一种或多种。
本发明通过比较弓形虫慢性感染小鼠与健康小鼠的脑组织，筛选差异表达的鼠脑蛋白质，以期从蛋白质组学角度挖掘其导致中枢神经系统(central nervous system,CNS)损伤的机制，并为寻找生物标志物提供靶标。本发明提供的iTRAQ结合LCMS/MS技术能快速有效地进行蛋白质组学研究，为研究弓形虫慢性感染致宿主CNS损伤机制以及发现新的生物标志物提供参考。
本发明还提供了弓形虫慢性感染小鼠脑组织差异表达蛋白质组、与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质或多肽，并进行了生物功能分析和生物功能验证。
附图说明
图1为差异表达蛋白的通路富集分析结果；
图2为部分差异表达蛋白的互作网络分析结果；
图3为部分差异表达蛋白mRNA表达水平的荧光定量PCR验证结果。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
在本发明第一实施例中，本发明提供了一种应用iTRAQ技术研究弓形虫慢性感染小鼠脑组织差异表达蛋白质组的方法。
本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。
6～8周龄的SPF级昆明小鼠，购于广东省实验动物中心；
弓形虫PRU株，由华南农业大学兽医学院寄生虫实验室保存。
1材料与方法
1.1 样品制备
弓形虫慢性感染小鼠模型建立
实验动物昆明小鼠40只，体重约22g，随机均分为实验组和对照组。
将一只弓形虫慢性感染小鼠用颈椎脱白法处死，取小鼠的脑组织，加入适量PBS，用研钵充分研磨至不见任何组织，取脑匀浆平铺在玻片上，于显微镜下计数包囊个数，重复3次，根据计数结果将脑组织匀浆用PBS稀释成20个包囊/mL。釆取经口感染的方式，实验组接种10个包囊/只，即0.5mL脑匀浆液。对照组每只灌胃0.5mL PBS。分别分笼饲养，每笼5只，正常取食及饮水。
感染弓形虫30天的成年昆明小鼠18只，雌雄各半，随机均分为3组。无菌环境下解剖取脑，每组鼠脑混合后将其分为2等份，一半用于蛋白质组学研究，另一半用于做荧光定量PCR和Western blot验证。另取相同年龄、相同性别的18只健康SPF小鼠脑，相同处理，作为空白对照。
1.2 主要仪器及试剂
冷冻离心机(湘仪H2050R)；超声仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；PMSF(-20℃保存，使用前需摇匀使结晶溶解)(上海生工)；旋涡混合器VORTEX-5；RIPA裂解液(50mMTris-Hcl，AMRESCO)；BCA定量试剂盒(Sigma)；分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；8-plex iTRAQ试剂盒(AB Sciex)；胰酶(Promega)；10K超滤管(Pall)；三乙基碳酸氢铵缓冲液TEAB(Sigma)；液相色谱Shimadzu HPLC(Thermo Dionex Ultimate 3000 RSLCnano)；质谱仪(Thermo Scientific Q Exactive)。
PBS(pH7.4)：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.42g，KH2PO4 0.27g，加入约800mL蒸馏水充分溶解，将pH调至7.4后再加蒸馏水定容至1L，高压灭菌后使用。
RIPA裂解液(使用前加入1×的PMSF)：50mM Tris-Hcl，150mM Nacl，1％SDS，0.1％Trionx-100，1％SDC pH 8.0。
1.3 蛋白质的提取及纯化
在EP管中加入100μl RIPA，充分溶解组织后超声处理(20W，工作0.8s，停0.8s，超声10下后放于冰上冷却，重复6次)，破碎核酸，4℃，12000rpm，离心20min，收集上清液。
BCA法进行蛋白质定量，取1、2、4、6、8、10、12、14μg的BSA制作标准曲线，样品取2μL，双复管测定。每支管加入100μL去离子水，100μL BCA染液，涡旋振荡20s，60℃反应1h，575nm处测定吸光值。
1.4 蛋白酶解及iTRAQ试剂标记
使用FASP方法酶解样品，蛋白定量后每个样本取200μg蛋白溶液置于离心管中；加入4μL TCEP Reducing Reagent，60℃反应1h；加入2μl MMTS Cysteine-BlockingReagent，室温30分钟；
将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12,000rpm离心20min，弃掉收集管底部溶液；加入8M尿素(pH 8.5)100μl，12000rpm离心20分钟，弃掉收集管底部溶液，重复2次；加入0.25M TEAB(pH 8.5)100μl，12000rpm离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次；
更换新的收集管，在超滤管中加入0.5M TEAB使终体积为50μl，加入胰蛋白酶(胰蛋白酶与蛋白质量比1:50)，37℃反应过夜；次日加入胰蛋白酶(胰蛋白酶与蛋白质量比1:100)，37℃反应4h，反应后12000rpm离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；
在超滤管中加入50μl 0.5M TEAB，12000rpm再次离心20min，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品；
iTRAQ试剂标记，从冰箱中取出8标的iTRAQ试剂盒，平衡到室温，将iTRAQ试剂离心至管底；向每管iTRAQ试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底；取50μl样品(100μg酶解产物)转移到新的离心管中；将iTRAQ试剂添加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2h；加入100μl水终止反应；混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底；真空冷冻离心干燥；抽干后的样品冷冻保存待用。
1.5 HPLC分离肽段混合物以及质谱检测
第一维高pH-RP液相分离
先用95％的A相5％B相平衡柱子(柱子信息：Phenomenex columns；Gemini-NX 3uC18 110A；150*2.00mm)30min，然后将标记后抽干的混合多肽用200μl的A相(H2O)复溶，取100μl进样后以0.2ml/min的速率进行梯度洗脱：B相(80％ACN)从5％到37％，最后在5min内使B相的比例上升至95％并保持5min，共85min。整个洗脱过程在214nm吸光度下进行监测，从线性梯度开始根据峰型收取24个组分，每1管每50秒钟接1次，梯度为85min，反复循环接样；根据峰型和时间共收取24个组分，真空干燥后，进行第二维LC-MS分析。
A相：水(NH3in H2O pH 10)；B相：80％乙腈(NH3in H2O pH 10)。
具体梯度洗脱程序如表1所示。
表1 梯度洗脱程序
第二维反相液质联用RPLC-MS
肽段用样品溶解液(0.1％甲酸、5％乙腈)溶解，充分振荡涡旋，13500rpm，4℃离心20min，上清转移到上样管中，进行质谱鉴定；色谱柱信息：75um i.d.x 150mm,packed withAcclaim PepMap RSLC C18,2μm,nanoViper；流动相A：0.1％甲酸；流动相B：0.1％甲酸，80％CAN；流速：300nL/min；每个组分分析时间：65min；有效梯度：B相从5％上升至35％，40min。
具体梯度洗脱程序如表2所示。
表2 梯度洗脱程序
分离后的肽段直接进入质谱仪Thermo Scientific Q Exactive进行在线检测，具体参数如下：一级质谱参数：Resolution：70,000；AGC target：3e6；Maximum IT：100ms；Scan range：350to 1800m/z。二级质谱参数：Resolution：17,500；AGC target：5e4；Maximum IT：120ms；TopN：20；NCE/stepped NCE：30。
1.6 蛋白质鉴定与数据分析
将原文件转换为MASCOT软件的通用格式(.mgf)，用Proteome Discoverer 1.4(Thermo Fisher Scientific)的默认设置进行蛋白质组分析。输入.mgf格式文件，用Protein Pilot 5.0(Applied Biosystems Sciex)进行蛋白质组学分析和蛋白定量分析。Protein Pilot 5.0中的Paragon Algorithm用于数据库检索，利用该软件，iTRAQ系统得到的肽段数据得以转换成蛋白水平上的差异分析数据。参数设置如下：Cys alkylation:MMTS；ID focus:biological modifications；Digestion:typsin；Database:Uniprot_MOUSE；Search effort:thorough ID。差异表达倍数>2倍和<0.5倍，分别选出作为蛋白表达量上调和下调的研究对象。
为了找到生物学功能显著变化的蛋白，我们通过QuickGO，利用生物信息研究最权威的数据库，从生物学进程、分子功能以及细胞组分，对差异表达蛋白进行分析。QuickGO是通过BLAST和Uniprot找到差异表达蛋白的ID并对其进行注释。选取的蛋白通过KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)进行生物学通路分析，在Uniprot上可找到该蛋白的序列和功能信息。另外，可以借助STRING 10.0(http://string-db.org)探索互作关系网中的功能与蛋白质差异表达的关系。统计分析数据以均数标准差为标准，并对数据进行t检验用来评估组间的显著性差异。应用SPSS 18进行统计分析。P＜0.05时表明差异显著。
1.7 实时荧光定量PCR分析验证mRNA的表达水平
qRT-PCR分析是用于验证iTRAQ结果得到的验证基因表达差异。根据操作说明书通过RNAiso Plus方法(Takara,大连,中国)对感染鼠脑进行总RNA的提取，最后用无酶水重悬所得RNA。提取的RNA浓度以及纯度由紫外分光光度计(Thermo Scientific Nanodrop2000,Waltham,MA,USA)测量所得。通过反转录试剂盒SYBR PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa,大连,中国)转录成cDNA。参照UniGene上的基因序列用Premier 5.0软件(Premier Biosoft International,Palo Alto,CA,USA)设计特异性qPCR引物。引物序列见表3。qPCR使用仪器Rotor-Gene Q(Qiagen)的实时系统，采用SYBRGreen master mix(SYBR Premix Ex Tag TMII；TaKaRa Bio；http://www.TaKaRa-bio.com),qRT-PCR反应条件是95℃5min；95℃30s，60℃1min，40个循环。每个样品三次生物学重复，mRNA的表达水平通过公式2–△△Ct得出。为了标准化，我们采用β-actin基因的表达作为内参，空白对照作为一个参照样品设为1。
表3 荧光定量PCR引物设计
1.8 Western blot实验
分别选取实验组中差异表达下调蛋白Dbn1和上调蛋白Pvalb进行免疫印迹实验来验证实验结果。处理好的样品进行SDS-PAGE，120V。然后转移到尼龙膜(Roche,Indianapolis,USA)上，45min，120mA。然后把膜放在含有0.1％的吐温20以及5％的脱脂牛奶的PBS中过夜孵育鼠抗β-actin单抗(NEOBIOSCIENCE,中国.1:500稀释)，特异性兔抗Syt7(1:250,Abcam，ab106618)和兔抗Pvalbalb(1:300,Abcam，ab11427)抗体。孵育抗体之后洗膜三次再分别用羊抗兔的二抗1：2500稀释。膜是用二氨基联苯胺(DAB)底物溶液(天根生化科技(北京)有限公司，中国)显像，图像是由ECL-plus Western blotting检测分析系统进行成像分析(Tiannon，上海，中国)。
2结果
2.1 原始数据分析及差异表达蛋白的检测
通过Protein Pilot 5.0搜索软件进行蛋白质组学定量分析，检测到4983个蛋白，通过用两个标准“P≤0.05和|FC|≥2”进行显著性差异分析，发现被弓形虫包囊感染的小鼠脑部与对照组相比有215个蛋白上调(46.63％)和246个下调蛋白(53.37％)。部分上调和下调蛋白已分别列出(表4)。
表4 部分差异表达蛋白信息
2.2 差异表达蛋白的生物信息学分析
通过GO分析鉴定各个功能相关的差异表达蛋白，主要涉及生物学进程(BP)有解剖结构的发展、信号传导、运输、细胞分化、应激反应等。分子功能(MF)分类揭示差异蛋白主要与体内分子的结合与捆绑相关。细胞组分(CC)分析发现差异表达蛋白主要参与细胞质、细胞器、胞外结构和质膜形成。
同时，KEGG PATHWAY分析可见差异表达蛋白一共涉及了227个通路，图1为差异表达蛋白的通路富集分析结果，包含差异蛋白最多的前10个通路，包括代谢通路、氧化磷酸化、谷氨酸能突触、钙信号通路、cGMP PKG信号通路、亨廷氏舞蹈症、突触囊泡循环、和阿兹海默症、多巴胺能神经突触、帕金森氏症等。
根据STRING 10.0数据库(http://string-db.org)探索差异表达蛋白质互作网络发现，这些差异表达蛋白至少与其中另一个蛋白存在相互作用，结果如图2所示，图2为部分差异表达蛋白的互作网络分析结果。不同颜色的线表明蛋白质不同种类的互作证据(由于专利申请文件为灰度图，显示不出色彩效果，若需要，申请人可提供带颜色的原图)。Mdh2、Pdhx、Pvalb、Atp5a1、Cox4i1、Me1、Dbn1、Impdh2、Syt7、Hadha、Actb等是处在关系互作网的重要节点，散在的蛋白目前尚未见相关报道。
具体地，差异表达鼠脑蛋白质大脑发育调节蛋白(Drebrin)在调节树突棘与神经突触的形态结构上有重要作用。在大脑的学习和记忆机制中，树突棘是一个关键角色，并且影响神经突触的生长发育。阿兹海默症早期的认知功能障碍就与突触退化有关，树突棘形态退化、数量和密度同时下降，Drebrin的表达水平在大脑颞叶也发生显著下调。Kojima等在实验中发现Drebrin A在成年鼠脑中对突触的可塑性和海马依赖性的恐惧记忆是至关重要的。慢性感染弓形虫的小鼠精神沉郁很可能与鼠脑中Drebrin表达水平显著下调有关。树突棘和突触的病变与通路富集分析结果一致。
为了进一步说明本发明的有益效果，本发明第二实施例还采用沙鼠替换本发明上述第一实施例中的昆明鼠，其他步骤不变，获得部分差异表达蛋白信息如表5所示：
表5 部分差异表达蛋白信息在Uniprot数据库登录号
为了进一步说明本发明的有益效果，本发明第三实施例还采用Balb/c鼠替换本发明上述第一实施例中的昆明鼠，其他步骤不变，获得差异表达蛋白情况为：上调蛋白159种；下调蛋白有353种，部分差异表达蛋白情信息如表6所示：
表6 部分差异表达蛋白信息在Uniprot数据库登录号
为了进一步说明本发明的有益效果，本发明第四实施例选用表4中差异表达鼠脑蛋白质大脑发育调节蛋白(Drebrin)为研究对象，提供了一种筛选与小鼠Drebrin蛋白互作的弓形虫蛋白的方法。
3.1 实验材料与仪器
3.1.1 虫株、菌株与细胞
弓形虫PRU株，由华南农业大学兽医学院寄生虫实验室保存；Trans5α、Trans BL21(DE3)化学感受态细胞，购于北京全式金生物科技有限公司；人包皮成纤维细胞(HFF)，由暨南大学馈赠，保存于本实验室液氮中；小鼠神经瘤母细胞(N2a)，保存于本实验室液氮中。
3.1.2 载体和引物
克隆载体pMD18-T(全式金)；原核表达载体pGEX-6P-1，由本实验室保存；Drebrin(Uniprot Accession：Q9QXS6)扩增引物通过Primer Premier 5.0设计，由上海生工合成，序列如下：Drebrin-F：5'-ggatccATGGCCGGCGTCAGCTTCAGC-3'，划线酶切位点为BamH I，Drebrin-R：5'-ctcgagCTAATCACCACCCTCGAAGCCCTC-3'，划线酶切位点为Xho I。使用前，先将引物12000rpm离心1～3min，加入相应量的灭菌去离子水进行稀释，终浓度为50pmol/μL，分装后于-20℃保存备用。
3.1.3 主要试剂及溶液配制
Pierce经典磁珠式免疫共沉淀试剂盒，反转录试剂盒RevertAid First StrandcDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific)；RIPA裂解液；Milli-Q water；乙腈、甲醇(Fisher)；硫代硫酸钠、碘乙酰胺、铁氰化钾、碳酸氢铵、FA甲酸、溴化乙锭(EB)、琼脂糖(Sigma)；二硫苏糖醇(PlusOne)；胰酶、胰酶重溶液、十二烷基硫酸钠SDS(Promega)；NC膜(Life Science Pure Nitrocellulose Blotting Membrane)；T4DNA连接酶，Ex-Taq DNA聚合酶(5U/μL)，dNTPs(2.5mM each)，10×PCR buffer，6×Loading Buffer，10×LoadingBuffer，pMD18-T Vector Kit，RNA提取试剂RNAiso Plus，TaKaRa MiniBEST Agarose GelDNA Extraction Kit(TAKARA)；TIANprep Mini Plasmid Kit质粒小提试剂盒(TIANGEN)；兔抗Drebrin多抗(proteintech)；ANTI-GST(TRANS)；HRP标记山羊抗兔IgG(碧云天，A0208)；HRP标记山羊抗鼠IgG(康为世纪cw0102A)；5×TBE贮存液(pH8.3)：Tris 54g，硼酸27.5g，EDTA(0.5mol/L)20mL，加去离子水至1L；1.0％琼脂糖凝胶：琼脂糖2g，0.5×TBE电泳缓冲液200mL，将以上组分溶于三角烧瓶中，然后放入微波炉中加热3min是琼脂糖完全融化，加入10μLE.B.(10mg/mL)备用；银染脱色液配制：K3Fe(CN)6 25mg，NaS2O3 40mg，溶于5mL超纯水。
3.1.4 主要仪器
蛋白电泳仪、电泳槽(Bio-RAD)；旋转仪(TR-02U(HYQ-2231)，CrystalTechnology&Industries)；质谱仪Q Exactive mass spectrometer(Thermo fisher)；真空干燥仪；旋转混合仪；爱普生扫描仪；PCR扩增仪(TaKaRa)；Thermo精密pH计；Bio-RAD核酸电泳系统
3.2 实验方法
3.2.1 免疫共沉淀CoIP
1、弓形虫速殖子感染N2a细胞全蛋白提取：
(1)加入850μL RIPA裂解液，在冰上孵育5min；
(2)漩涡振荡5s，12,000g，4℃离心5min；
(3)将上清液转入预冷的离心管中，置于冰上备用，或-80℃保存；
(4)分别取40μL蛋白裂解液用于input组，400μL蛋白用于NC组，400μL蛋白用于IP组。
2、蛋白免疫复合物制备：
取1μg抗体原液(分别为Drebrin抗体和IgG蛋白)、400μL细胞裂解液上清混合，在4℃缓慢颠倒混匀过夜，使目的蛋白从细胞裂解液中被特异性抗体免疫沉淀下来。
3、protein A/G琼脂糖珠准备
按总需量，取100μl protein A/G琼脂糖珠，加200μL裂解缓冲液洗涤3次，4℃，3000g离心30s留琼脂糖珠，加100μL裂解缓冲液重悬。
4、捕获免疫复合物：
(1)在EP管中分别加入50μL Protein A/G Agarose，低速1000g离心1min除去储存液，并用100μL PBS洗涤两次，低速离心弃洗涤液；
(2)加入第2步中免疫复合物，体系用裂解缓冲液补齐至1mL，4℃混合室温孵育2h；
(3)1000g离心1min，加入200μL IP wash buffer，洗涤2-3次；
(4)再用100μL 1×Conditoning buffer洗涤1次。
5、洗脱免疫复合物：
加入50μl Elution Buffer，室温下孵育10min，沸水煮10min，3000g离心30s，取上清存于-80℃，或直接用于SDS-PAGE电泳分析。
6、SDS-PAGE检测
电泳操作同3.2.5，电泳结束后断开电源，取下凝胶，将凝胶边缘多余部分切掉，放在有考马斯亮蓝染色液的染色池中染色40min。然后将胶从染色液中取出，用清水将多余的染液冲掉，放入脱色液中脱色。期间，及时更换脱色液，待条带清楚时，停止脱色，观察拍照。
3.2.2 GST-Pulldown
3.2.2.1 Drebrin基因克隆和带GST标签的原核表达
1、从鼠脑组织中扩增Drebrin
鼠脑Total RNA提取及反转录操作同3.2.4描述。
以鼠脑cDNA为模板，利用Drebrin特异引物进行PCR扩增,扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析后，与DL2000、DL5000DNA Marker进行比较。PCR扩增体系见表7。
表7 鼠脑Drebrin基因的PCR扩增反应体系
特异PCR扩增的条件为：94℃预变性4min；94℃变性1min、65℃退火1min、72℃延伸2min，共进行30个循环；72℃延伸7min。
2、PCR扩增产物的回收和纯化
采用切胶纯化法进行纯化，按照宝生物工程(大连)有限公司的DNA凝胶回收试剂盒操作说明进行。
3、Drebrin基因片段与pMD18-T载体连接
将回收的Drebrin片段DNA与pMD18-T于4℃连接过夜。连接体系见表8：
表8 连接反应体系
根据pMD18-T Vector Kit说明书，将上述各组分加入到一个新鲜干净的0.2mL离心管中，整个操作过程在冰浴上进行。
4、将所得pMD18-Drebrin重组质粒的转化感受态细胞(DH5α)，培养12-14h。
5、提取pMD18-Drebrin重组质粒，-20℃保存。
6、pMD18-Drebrin重组质粒的酶切及测序鉴定
提取的质粒用BamH I和Xho I进行双酶切鉴定，将酶切鉴定正确的阳性质粒送到上海生工公司测序，测序结果与Genebank中的序列进行比对，核苷酸序列正确的阳性质粒命名为PMD18-Drebrin。
7、表达载体pGEX-6p-1的线性化
提取pGEX-6p-1载体质粒，并用BamH I和Xho I对pGEX-6p-1载体进行双酶切；用1％琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带后用胶回收试剂盒进行回收线性化的pGEX-6p-1载体。
8、带粘性末端Drebrin基因片段的制备
提取质粒pMD18-Drebrin，将阳性重组质粒pMD18-Drebrin用BamH I和Xho I双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带后用胶回收试剂盒说回收带粘性末端的Drebrin目的片段。
9、Drebrin与线性化表达载体pGEX-6p-1的连接及转化
将带有粘性末端的Drebrin基因片段连接至线性化的pGEX-6p-1载体，连接体系如下：
表9 目的基因与线性化表达载体pGEX-6p-1的连接体系
混匀后短暂离心，于4℃连接过夜。连接产物重组质粒转化DH5α感受态细胞，培养12～14h。
10、重组质粒的双酶切鉴定
提取重组质粒，用BamH I和Xho I双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。将鉴定为阳性的重组表达质粒送往送到上海生工公司测序，测序结果与Genebank中的序列进行比较分析，核苷酸序列正确的阳性质粒命名为pGEX-6p-1-Drebrin。
鉴定为阳性的重组质粒放在-20℃保存，对应的阳性菌液可于4℃短暂保存，长期保存需加入甘油置于-80℃保存。
11、GST融合蛋白的表达及纯化
(1)将重组质粒pGEX-6p-1-Drebrin转入BL21大肠杆菌感受态细胞中，挑单克隆于5mL LB培养基中(含100μg/mL Amp+)，37℃180rpm过夜，第二天吸取1mL加入100mL培养基中扩培至OD值为0.6左右；
(2)加IPTG至终浓度0.4mmoL/L诱导，20℃培养3h收菌，离心8500rpm弃上清后，用PBS洗涤沉淀3次；
(3)加入细胞裂解液，超声破碎后4℃12000rpm离心10min，取上清；
(4)取50μL上清加10μL 6×Loading buffer，沸水中煮10min，-20℃放置5min后10000rpm离心5min，取上清做WB检测表达情况；
(5)取150ul GST琼脂糖均分为3管，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤一次，备用；
(6)WB验证正确的阳性菌株制备新鲜细菌裂解液，上清加入GST琼脂糖中(留一部分细菌裂解液作为Input)，混合仪上4℃孵育1h，离心弃上清，用细胞裂解液洗涤琼脂糖3次。
12、弓形虫全蛋白提取
(1)用HFF细胞扩大培养PRU株速殖子，待细胞破裂释放出大量虫体时进行收集，用细胞刮刀将贴壁细胞刮下，然后用27g针头的注射器反复吹吸破碎全部细胞，让虫体释放更加完全，混合液转入15mL离心管，先低速离心(800rpm，5min)去除大的细胞碎片，取上清继续4000rpm离心10min收集虫体，计数约为109个；
(2)将虫体置于预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末；
(3)加入900μL裂解液，将裂解的蛋白移入1.5mL Ep管中超声破碎10min，4℃12000rpm离心10min取上清，即为弓形虫全蛋白。
13、体外蛋白质结合分析
(1)将弓形虫蛋白平均分成两份，一份加入上一步的GST空载-琼脂糖中，另一份加入GST-Drebrin-琼脂糖中，加入等量的裂解液于另一份GST-Drebrin-琼脂糖中，混合仪上4℃孵育过夜；
(2)离心将琼脂糖与蛋白裂解液分离，弃裂解液，用细胞裂解液洗磁洗涤3次，再用PBS洗涤1次，用20mM还原型谷胱甘肽洗脱10min；
(4)再次离心将琼脂糖与蛋白裂解液分离，将还原型谷胱甘肽吸入新的1.5mlEp管中，加入Loading buffer混匀后沸水煮10min，离心后吸取上清进行SDS-PAGE电泳、银染和WB；
(5)WB：一抗稀释比例为兔抗Drebrin多抗1:1000，GST抗体1:6000；二抗稀释比例为1:8000；
(6)银染：SDS-PAGE电泳结束后将凝胶取下，放入干净的银染盒中，加入固定液(40％乙醇，10％乙酸，50％去离子水)室温水平摇床上固定30min；小心倒掉固定液，加入敏化液(乙酸钠10.2g,硫代硫酸钠0.471g，乙醇45mL，去离子水补足到150mL)室温水平摇床上敏化30min；倒掉敏化液，用去离子水漂洗4次，每次5min；倒掉漂洗液，加入染色液(硝酸银0.375g溶解于150ml去离子水中)室温水平摇床上染色30min；倒掉染色液，用去离子水漂洗2次，每次40s；倒入显色液(碳酸钠4.5g，甲醛72μL，溶解于180mL去离子水中)，水平摇床上染色25s，倒掉显色液，再加入显色液显色直至条带清晰；倒掉显色液，加入终止液(Na2EDTA2.19g溶解于150mL去离子水中)终止显色反应；爱普生扫描仪扫描成像，并保存。
3.2.3 质谱鉴定
银染条带酶解：
1、切胶：将需要进行质谱鉴定的蛋白条带切出后放入EP管中。
2、水洗：每管加入120-150μL Milli-Q水，置于震荡器震荡1min，吸出液体。每管再加入120-150μL Milli-Q水，置于震荡器震荡1min，吸出液体的同时用枪头把胶粒切成1mm3大小。
3、脱色：加脱色液50μL于EP管中，置于白色滤纸上观察，颜色完全脱去后马上吸出液体，然后加150μL ddH2O冲洗停止反应，吹打洗涤胶粒，吸出液体后再加入150μL ddH2O洗胶粒两次。
4、脱水：每管加入150μL 100％ACN，震荡30s等胶粒变白后吸出液体。
5、还原：往干燥胶粒中加入120μL 25mM DTT，放55℃孵育50min。
6、水洗：吸出DTT，加入150μL ddH2O吹打洗涤胶粒3次。
7、脱水：加入150μL 100％CAN脱水至胶粒变白。
8、烷基化：每管加入100μL 55mM IAA，室温暗处孵育40min。
9、水洗：将IAA吸出，加入150μL ddH2O吹打水洗胶粒3次。
10、脱水：加入150μL 100％ACN脱水至胶粒变白。
11、酶解：用覆盖液(25mM NH4HCO3，10％ACN)稀释胰酶至10ng/μL；每管胶粒加入胰酶10μL，冰浴30min后吸掉多余的胰酶；再加入15μL左右25mM NH4HCO3至覆盖胶粒，小心将EP管倒转，将整个EP管架放入塑料盒中，放入37℃恒温箱酶切12-16h。
12、肽段提取：将EP管盒直接放入超声仪中超声破碎15-20min，吸出肽段，真空抽干，用6μL 30％ACN重溶。
蛋白产物溶液酶解
由于CoIP电泳结果条带不明显，所以对获得的蛋白溶液进行质谱检测，Pulldown实验的蛋白溶液也进行质谱检测，作为对条带质谱的补充，蛋白溶液酶解操作如下：
1、向蛋白溶液中加入0.05M TCEP溶液充分混匀，60℃反应1h；加入55mM MMTS溶液，室温避光孵育45min。
2、处理10KD超滤管：加入70％乙醇润洗，12000g离心20min，弃掉滤液；加入纯水润洗，12000g离心20min，弃掉滤液。
3、将蛋白液加入10KD超滤管，12000g离心20min，弃掉滤液；加入100μL UA溶液(8M尿素，0.1M Tris/HCL，pH 8.5)，12000g离心20min，离心2次。
4、加入100μL 0.25M TEAB，12000g离心20min，重复3次。
5、加入50μL 0.5M TEAB，加入胰酶(胰酶储存于50mM乙酸中，储存浓度为1μg/μL)，胰酶与蛋白质量比为1:50，37℃过夜。第二天早上补加胰酶，胰酶与蛋白质量比为1:100，继续反应4h。
6、更换新的收集管，离心收集滤液，再向超滤管中加入50μL 0.5M TEAB，离心并和之前的滤液合并，低温真空抽干，用6μL 30％ACN重溶。
质谱检测：
1、肽段用样品溶解液(0.1％甲酸、2％乙腈)溶解，充分振荡涡旋，13200rpm，4℃离心10min，上清转移到上样管中，进行质谱鉴定；
2、样品通过Finnigan Surveyor高效液相系统让多肽经过C18反向柱(300μmi.d.x 5mm,packed with Acclaim PepMap RSLC C18,5μm,nanoViper)进行分离；
分离参数：流动相A：0.1％甲酸；流动相B：0.1％甲酸，80％ACN；流速：300nL/min；
分析时间：65min；有效梯度：B相从5％上升至90％，5％5min，50％45min，90％50min，90％55min，5％65min。
3、质谱参数：
分离后的肽段直接进入质谱仪Thermo Scientific Q Exactive进行在线检测，具体参数如下：
表10 质谱参数设置
4、数据库检索：
质谱原始文件经过MM File Conversion软件处理转换，得到MGF格式文件，然后用Proteinpilot(5.0.1版本)检索Uniprot数据库，检索参数如下：
表11 蛋白质检索参数设置
实验结果及讨论
Q9QXS6的CoIP和Pulldown两个实验的交集是6个弓形虫蛋白，分别如表12所示：
表12 6个弓形虫蛋白在Uniprot数据库的登录号
为了进一步说明本发明的有益效果，本发明第四实施例针对TgRPS14、TgH4基因进行基因敲除实验和神经行为学验证。具体地，包括：
4.1 基于CRISPR/Cas9基因敲除技术构建TgRPS14、TgH4基因缺失的虫株
4.1.1 用CRISPR/CAS9敲除弓形虫的基因
4.1.1.1 特定基因的CRISPR质粒构建
在web-server E-CRISP(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)上获取靶定GOI的gRNA序列，长度为20bp，其后紧挨着PAM序列(NGG)。
选择好gRNA序列之后，通过PCR突变用所选基因特异的gRNA去置换CRISPR原始质粒(pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT)上的UPRT，使用Q5突变试剂盒，模板为pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT质粒，引物是GOI-gRNA-Fw/GOI-gRNA-Rv，根据试剂盒说明书设置反应体系，反应条件如下：
PCR扩增后，取出5μL产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定是否扩增成功(片段大小9674bp)。若鉴定PCR反应有效，将剩余的PCR产物按照Q5试剂盒操作进行KLD反应和转化。
可选步骤(推荐)：在KLD反应前用DpnI消化PCR产物可以提高突变的效率。每12.5μLPCR产物中加入1μL DpnI酶，37℃孵育15-30min后用DpnI消化产物(不要求纯化时)，然后继续KLD反应和其他步骤。
挑选正确的目的基因靶定gRNA克隆。从平板上挑选4-6个单克隆，接种到5ml LB培养基(Amp 100μg/ml)，37℃摇床培养12-16h。提取质粒并用0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定。要确定已经成功用目的基因靶定的gRNA置换的原本的UPRT gRNA，需要用M13-rev(5'-CAGGAA ACA GCT ATG AC)或M13R(-48)(5'-AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA)作为引物对质粒进行测序。鉴定正确的克隆保留待用。
4.1.1.2 同源模板质粒构建
以下步骤是如何构建一个包含目的基因序列同源片段的质粒并用其敲除部分或全部的目的基因。同源模板质粒可以通过商品化的试剂盒(如Gibson assembly kit或NEBuilder HiFi DNA assembly kit)一步克隆组装多个片段。以下步骤是根据Gibson试剂盒列出，说明书内有更详尽的步骤。
设计引物扩增克隆载体(如PUC19)，同源臂(左臂和右臂)，以及选择性标签。因为同源臂的位置决定了基因编辑的位置，设计时必须与实验目的一致。引物的设计还需保证PCR产物末端能够进行后面的重组(参照说明书)。
用高保真酶扩增克隆载体、同源臂和选择性标签，基因组DNA作为扩增同源臂的模板。如果使用质粒DNA作为模板，则在PCR扩增后，克隆载体和选择性标签的PCR产物需要用DpnI进行消化。每10μLPCR产物中加入1μL DpnI，37℃孵育30min。
为了提高成功率，PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳后需要进行切胶回收纯化，以去除非特异性条带和引物二聚体，纯化后用分光光度计测定产物浓度。
重组反应体系为10μL，包含0.01-0.05pmol等摩尔比值的目的片段和Gibsonassembly master mix(2×)。在PCR仪中50℃反应60min后，将产物转化进大肠杆菌感受态细胞，或直接-20℃冻存待用。需要设置阴性对照。
重组产物转化进大肠杆菌感受态细胞(如DH5α)。2-3μL重组产物或阴性对照加入50μL感受态细胞，按照试剂盒说明书进行操作和培养筛选。
鉴定阳性克隆。从平板上挑选4–6个菌落，分别用5mL LB肉汤培养基(加入对应抗生素)培养12–16h。小提质粒后用酶切和测序鉴定。
阳性克隆鉴定正确后，用酶切的方式或PCR扩增来大量获取同源模板，以进行接下来的虫体转染。这一步的目的是排除载体序列的干扰，提高转染时同源重组的效率。
4.1.2 虫体转染
1.培养HFF细胞(T25培养瓶)：略
2.准备虫体：用适宜剂量的虫体感染HFF细胞，待感染后细胞裂解并自然释放虫体达到50-80％时，刮取细胞并用22G注射器反复抽吸3–5次，使宿主细胞破碎释放虫体。用3μm滤膜过滤除去细胞碎片，400g 18℃离心10min，弃上清，沉淀用10mL Hank’s平衡盐缓冲液洗涤并重悬，相同条件再次离心后用适量cytomix buffer重悬(虫体密度4×107/ml)。
3.在电转杯中配制转染体系(300μL)
虫体悬液 250μl
同源模板(PCR产物或酶切产物) 1.5μg
目的基因CRISPR质粒 7.5μg
ATP(0.2M，100×) 3μl
谷胱甘肽(0.5M，100×) 3μl
Cytomix 加至300μl
阴性对照不加同源模板和目的基因的CRISPR质粒。
4.在电转杯中混合以上组分后进行电穿孔。对于BTX ECM-830电转仪(4mm间隙电转杯)，我们使用1700V，脉冲持续时间176μsec，2次脉冲间隔100msec。阴性对照也要进行电转。电转后立即将虫体转入HFF细胞(T25培养瓶)，放入CO2培养箱37℃培养。
4.1.3 药物筛选和虫体增殖
1.电转后的虫体从HFF细胞中自然释放后，将1/5-1/3的培养基转移至包含筛选药物的培养基中，重复此过程直至孔中耐药虫株稳定，即阴性对照组的虫体全部死亡，而实验组则能耐受每2–4天的药物筛选。
2.提取耐药组一个孔的基因组，按照Fig 1(PCR 1和PCR 2)进行PCR鉴定是否包含阳性克隆(基因敲除)。
3.如果PCR 1和PCR 2鉴定为阳性，则将对应的孔用有限稀释法进行克隆。宿主细胞自然释放出虫体后，刮取细胞并用22G注射器破碎细胞，用3μm滤膜过滤除去细胞碎片后用血球计数板计数虫体，以估算培养基中总的虫体密度。将培养基用新鲜的D10培养基(不含药物)稀释至每150μl 2–3个虫体(Ⅰ型虫株)，或每150μl 3–5个虫体(其他虫株)。按150μl/孔将稀释好的培养基加入已有HFF细胞的96孔板，培养7–10天，过程中不可移动，以形成HFF单层细胞噬斑。
4.1.4 阳性克隆鉴定
1. 噬斑形成后，在倒置显微镜下检查96孔板的每个孔，并找到只有一个噬斑的孔。将此孔中的虫体转移至已有单层HFF细胞的24孔板中培养，直至宿主细胞自然释放出虫体。
2. 24孔板每一孔中释放出的虫体取一小份转入新的板中，剩余用来进行PCR鉴定(Fig 1中的PCR 1，PCR 2和PCR 3)。PCR 1和PCR 2检测阳性，PCR 3检测阴性的即为成功敲除目的基因的克隆，可以进行进一步的检测(如WB)。
3. 鉴定出的阳性克隆要转入T25培养瓶中培养，并及时冻存保种。
4.2 建立弓形虫PRU株野生型与TgRPS14、TgH4基因缺失型小鼠感染模型与神经行为测验
120只KM小鼠(18-22g，雌性)随机均分为4组，其中3组分别感染PRU株野生型、TgRPS14基因缺失株、TgH4基因缺失株，另一组作为正常对照。每只小鼠腹腔注射100个弓形虫速殖子记录动物存活时间、发病情况，出现死亡者，生理盐水腹腔灌洗法、解剖头部，取脑组织直接涂片，查找弓形虫，若未发现弓形虫，将脑组织用0.25％胰酶消化1小时，涂片，吉姆萨染色，查找弓形虫，或将脑组织捣碎，直接盲传小白鼠。
感染后60d进行小鼠神经行为测验，内容包括对猫气味的反应、游泳试验、迷宫试验等，并用Lab-maze动物行为学分析软件进行数据分析。
A.一般行为学与震颤麻痹评分观察：给药后立即观察行为变化，无任何症状0分；间断性细小震颤，但活动自如1分；频繁性震颤，后肢僵直，颤尾，活动逐渐受限2分；连续性震颤，四肢僵硬，吞咽活动频繁，活动受限3分；全身麻痹而死亡4分。
B.自主活动计数(open field)：开场实验同样可以检测动物的焦虑程度和自主活动能力。实验装置主要为一60cm×60cm×40cm大小的顶部开口的箱体。在安静、光线较暗的环境中检测。小鼠适应环境10min后,计数5min内小鼠移动(ambulation)的格子数和站立(rearing)的次数,连续测5次取平均值。
C.游泳实验(swim test)：将受试小鼠放入一个20cm×30cm×20cm规格的有机玻璃水箱中,水深10cm,水温为22℃-25℃。评分标准如下：在1min内能连续不断游泳者记310分；大部分时间游泳仅偶尔漂浮者记215分；漂浮时间占整个受试时间50％以上者记210分；偶尔游泳者记115分；偶尔用后肢游动并漂浮在水箱一边者记110分。每次检测间隔1min,共检测5次取平均值。
D.爬杆实验(pole test)：直径018cm,高60cm的直木杆顶部有一小木球,外面覆盖纱布以防止小鼠打滑。小鼠被头向上放于杆顶端,计录两个时间：动物从开始运动到完全转为头向下的时间和它们下到杆底的时间。每次检测间隔1min,共检测5次取平均值。
E.悬挂实验(grid test)：有机玻璃悬挂实验箱,水平放置的金属杆直径115mm,距地面30cm,金属杆上方1cm加盖,以避免小鼠翻坐于金属上,实验中小鼠悬挂于金属杆上,记录落地前的时间,按下述标准评分：0～4s评0分,5～9s评1分,10～14s评2分,15～19s评3分,20～24s评4分,25～29s评5分,超过30s评6分。每次检测间隔1min,共检测5次取平均值。
变异系数(co-efficient of variation,CV)：几种行为学检测方法采用单位不同,因此通过计算每只小鼠5次检测结果的变异系数,求出每种检测方法10只小鼠所得变异系数的x和s,进行行为学检测方法间的比较,对比不同方法测得结果的稳定性。在每种检测方法中按顺序计算10只小鼠从第1到第5次检测结果的x和s,求出每次结果的CV，反映从第1到第5次检测结果的变化趋势。
F.Y型迷宫实验：基本原理是利用老鼠喜阴暗的天性，给予电击刺激，使其逃离阴暗区，即此处是伤害源(电击)，从而避开，趋向一个安全的正性刺激(光亮区)。Y型迷宫的电击程度和时间是可控的，但对于老鼠来说电击毕竟是一种伤害管，使动物产生应激反应，进而影响学习记忆活动。在笔者近期做的相关实验中曾出现有小鼠低电压下没反应，而电压稍高就疼痛呻吟的情况。在目前Y迷宫多用于药物筛选。
G.八臂迷宫：一种用于研究动物空间记忆的迷宫模型。它由一个中心区和其周围连接的八条臂组成，在其中一些臂的末端放入食饵或将一些臂施以电击，根据动物的取食或逃避策略(进入每个臂的次数、时间、错误次数、路线等)，可反应其空间记忆能力；强大、灵活的GSN软件系统具备八臂迷宫所有的功能(如动物活动路径、各种时间、次数及参数)，还能通过声、光、电等刺激-应答模块建立完整的各种条件、非条件刺激环境，具有超强的运行学习记忆实验的能力。对于八臂迷宫，它所记录的数据资料，如时间、动物位置、进入某个区域的次数等，根据不同的模型其意义都不一样，不同的模型也要在软件系统中设计不同的实验方案，选择不同的参数，可记录的指标是灵活多变的。
为了进一步说明本发明的有益效果，本发明第五实施例针对TgRPS14、TgH4基因分别克隆到慢病毒载体，并进行小鼠神经行为学功能验证实验。具体地，包括：
根据Rab2和HSP60基因编码区序列设计引物，通过PCR以虫体cDNA为模板扩增克隆至pCDH-CMV-EF1-GFP-Puro慢病毒载体中。制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超速离心浓缩病毒。检测病毒滴度后，根据待感染细胞的MOI值，取适量病毒液侵染N2a细胞或感染小鼠，观察细胞形态状态和小鼠症状，进行小鼠神经行为学实验。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种应用iTRAQ技术研究弓形虫慢性感染小鼠脑组织差异表达蛋白质组的方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)小鼠脑蛋白的提取；
(2)对步骤(1)所得的蛋白质样品进行FASP酶解、肽段标记；
(3)对步骤(2)标记的蛋白质样品进行HPLC分离肽段混合物及LC-MS质谱分析；
(4)对上步所得的质谱鉴定结果进行生物信息学分析、定量分析，获取弓形虫慢性感染小鼠脑组织过程中的差异表达蛋白质。
2.如权利要求1所述的应用iTRAQ技术研究弓形虫慢性感染小鼠脑组织差异表达蛋白质组的方法，其特征在于，步骤(1)中，小鼠包括昆明鼠、Balb/c鼠、沙鼠中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的应用iTRAQ技术研究弓形虫慢性感染小鼠脑组织差异表达蛋白质组的方法，其特征在于，步骤(4)获取弓形虫慢性感染小鼠脑组织过程中的差异表达蛋白质包括大脑发育调节蛋白。
4.一种与权利要求3所述大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质或多肽，其特征在于，所述与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质或多肽包括：
1)表12所示蛋白质中的任一种，或
2)氨基酸编码序列与表12所示蛋白质同源性不低于80％、85％、90％、95％、98％或99.9％的蛋白质或多肽中的任一种。
5.一种核酸序列，其特征在于，所述核酸序列编码权利要求4所述与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质或多肽的氨基酸序列中的任一种。
6.一种与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质或多肽，其特征在于，所述与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质或多肽的氨基酸序列包括：
1)表12所示蛋白质中的任一种，或
2)氨基酸编码序列与表12所示蛋白质同源性不低于80％、85％、90％、95％、98％或99.9％的蛋白质或多肽中的任一种。
7.一种核酸序列，其特征在于，所述核酸序列编码权利要求6所述与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质或多肽的氨基酸序列中的任一种。
8.一种如权利要求1所述的方法、如权利要求4所述的与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质或多肽、如权利要求5所述的核酸序列、如权利要求6所述的与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质或多肽、如权利要求7所述的核酸序列在制备弓形虫慢性感染关联信号通路生物标志物或诊断试剂中的应用，其中，所述信号通路包括代谢信号通路、氧化磷酸化信号通路、谷氨酸能突触信号通路、钙信号信号通路、cGMP-PKG信号通路、突触囊泡循环信号通路，以及Mdh2、Pdhx、Pvalb、Atp5a1、Cox4i1、Me1、Dbn1、Impdh2、Syt7、Hadha、Actb蛋白相关信号通路中的一种或多种。
9.一种如权利要求1所述的方法、如权利要求4所述的与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质或多肽、如权利要求5所述的核酸序列、如权利要求6所述的与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质或多肽、如权利要求7所述的核酸序列在制备弓形虫慢性感染关联疾病生物标志物、诊断试剂或靶向药物中的应用，其中，所述弓形虫慢性感染关联疾病包括亨廷氏舞蹈症、阿兹海默症、帕金森氏症中的一种或多种。
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