CN109239351A - 一种莲藕潜隐病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒及制备与检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种莲藕潜隐病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒及制备与检测方法，其包括ELISA用微孔板，酶标抗体，缓冲液，显色液，终止液，其中微孔板上包被有LLV特异的多克隆抗体，酶标抗体为辣根过氧化酶标记得LLV特异性多克隆抗体。本发明采用的免疫原为基因工程表达的LLV外壳蛋白抗原。本发明还公开了一种莲藕潜隐病毒的检测方法。本发明在血清学水平上为莲藕潜隐病毒的检测提供了一种快速、灵敏、简便的方法，并且经济实用，也为莲藕生产中莲藕潜隐的防治及其脱毒苗的制备提供了有效的检测方法。

Description

一种莲藕潜隐病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒及制备与 检测方法

技术领域

本发明涉及植物病毒检测的生物技术产品领域，具体涉及一种可用于对莲藕潜隐病毒进行快速检测的双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒(DAS-ELISA)，本发明还涉及该试剂盒的制备方法及检测方法。

背景技术

“僵藕”是一类广泛发生在世界各大莲藕产区的重要的莲藕病害，主要症状表现为藕身表面有棕褐色斑点，随着病害的加重，棕褐色斑点逐渐发展成棕褐色或黑褐色条斑，且深入表皮以下，该病害在江苏区莲藕栽培区广泛发生，严重地制约了莲藕产业的持续稳定发展。

莲藕潜隐病毒(Lotus latent virus，LLV)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。该病毒基因组约为10kb，编码一个多聚蛋白，经蛋白酶水解切割后可产生10个成熟的蛋白质，在P3蛋白氨基端有一个PIPO蛋白。LLV首先在莲藕花叶病株上发现，自然条件下能够侵染莲藕。2016年，我们在江苏省莲藕产区首次发现LLV，后续调查发现，LLV在江苏省莲藕主产区发生越来越普遍，部分地区呈现流行爆发趋势。因此，发展LLV的快速检测鉴定技术迫在眉睫，目前，LLV主要通过RT-PCR法进行检测，由于目前尚无LLV特异性抗血清，无法利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明内容提供一种用于莲藕潜隐病毒检测的准确高效、易于推广、经济实用的双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒，以及该试剂盒的制备方法及检测方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种莲藕潜隐病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括LLV特异性多克隆抗体，LLV特异性多克隆抗体包被于多克隆抗体包被板上。

所述LLV特异性多克隆抗体的氨基酸序列为：

AADDELDAGKMNVKKQQGTGEAGQPSATPPQSNAKDKGKEVVSAQGSGIINKPELDRDINTGTIGTFQVPRLRAIPTKIRPPIIKSGAALNLDHLLVYKPSQLDITNAKSTRDQFSQWYEGVKNAYEVDDQQMSILMNGLVVWCIENGTSPNINGDWVMMDGDTQISYPIKPLIDFAAPTFRQIMKHFSDVAEAYIQMRNAEQPYMPRYGLQRNLTDMSLARYAFDFYEVTSRTPIRAKEAHFQMKAAALTNTHHRLFGLDGNVSTNQENTERHTATDVDRNIHTLLGMRGIH(SEQID No.3)。

所述试剂盒还包括辣根过氧化酶标记多克隆抗体、基因工程重组LLV外壳蛋白标准品、质控品。还包括辅助试剂：提取反应液、洗涤缓冲液、酶缓冲液、显色剂及反应终止液。

上述检测试剂盒的制备方法，包括基因工程重组LLV外壳蛋白标准品的制备步骤、LLV特异多克隆抗体的制备步骤、多克隆抗体包被板的制备步骤、辣根过氧化酶标多克隆抗体的制备步骤、质控品的制备以及辅助试剂的制备步骤。

所述LLV外壳蛋白标准品的制备步骤中，以感染LLV的莲藕叶片的总RNA为模版，使用引物LLVCPF和LLVCPR扩增获得LLV的CP基因，克隆入pET-28a载体得到重组质粒pET28a-LLVCP，经原核表达纯化获得33kDa的外壳蛋白。

所述多克隆抗体包被板，用纯化的LLV外壳蛋白获得的LLV特异性多克隆抗体包被酶标板制作而成。

所述辣根过氧化物酶标多克隆抗体，用纯化的LLV外壳蛋白获得的LLV特异性多克隆抗体标记辣根过氧化物酶制作而成。

一种莲藕潜隐病毒的检测方法，使用前述的试剂盒实现莲藕潜隐病毒的检测。

具体地，一种莲藕潜隐病毒检测的双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒包括包被有LLV特异性多克隆抗体的微孔板(即多克隆抗体包被板)、辣根过氧化酶标记多克隆基因工程重组LLV外壳蛋白标准品、质控品以及底物反应液、洗涤缓冲液、酶缓冲液、显色剂及反应终止液等辅助试剂。

本发明中，莲藕潜隐病毒外壳蛋白标准品的制备，以感染LLV的莲藕叶片的总RNA为模版，使用引物LLVCPF和LLVCPR扩增获得LLV的CP基因，经酶切连接，克隆入pET-28a载体得到重组质粒pET28a-LLVCP，将该重组质粒转化至大肠杆菌Rossta菌株，37℃培养过夜，IPTG诱导表达，而后经镍柱亲和层析纯化得到大小为33kDa的外壳蛋白。

所述外壳蛋白LLVCP的引物设计为：

LLVCPF：5’-CATGCCATGGCACACAGCCCAAAAGTTTTG-3’；酶切位点Nco I

LLVCPR：5’-CGAGCTCGTACCCACAACATAGAATTTCATCT-3’；酶切位点Sac I。

本发明中的多克隆抗体包被板，可用原核表达纯化的LLV外壳蛋白(即莲藕潜隐病毒外壳蛋白标准品的制备步骤得到的外壳蛋白)免疫新西兰大白兔获得的多克隆抗体包被酶标板制作。该试剂盒采用的酶标板为一种进口酶标板。制备步骤如下：

(1)选择体重2.5Kg左右青壮年新西兰大白兔，做好标记。用浓度为1mg/mL LLV外壳蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔。首次免疫中，先将抗原完全混匀，而后与弗氏完全佐剂按照1:1体积比充分混匀，乳化完全后，进行多点皮下注射，每点0.2mL。第二-四次免疫采用弗氏不完全佐剂，仍按照1:1体积比与抗原充分混匀。首免后第14天进行二免，二免到三免间隔时间为7天。兔子三免后第7天耳中动脉采小样血清检测，检测合格，7天后加免，加免完7天后可采集全血。采血后，加入质量百分比浓度为0.02％的叠氮化钠，-20℃保存。所得抗血清通过DE52阴离子交换柱层析法纯化。

(2)将纯化的兔抗多克隆抗体用pH 9.6、50mM磷酸盐缓冲液稀释为终浓度1μg/mL，而后加入酶标板各个孔中，每孔100μL，37℃孵育2h。用洗涤缓冲液冲洗酶标板，而后用封闭液封闭。封闭液为含有2％明胶，0.5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。封闭后，经甩干晾干，即得到多克隆抗体包被板。

本发明提供了辣根过氧化物酶标多克隆抗体的制备方法。将辣根过氧化物酶与纯化的LLV外壳蛋白免疫新西兰大白兔获得的多克隆抗体按照1:1摩尔分子比标记。制备步骤如下：

(1)将辣根过氧化物酶溶于蒸馏水，加入新配制的NaIO₄水溶液，混匀后，4℃避光静置30min；

(2)加入0.5mL乙二醇水溶液，25℃避光静置30min；

(3)加入含纯化抗体的水溶液(与辣根过氧化物酶等摩尔比)，混匀后装入透析袋，经0.05M，pH 9.6的碳酸盐缓冲液透析6h；

(4)加入NaBH4水溶液，混匀后，4℃避光静置2h；

(5)在上述溶液中，缓慢加入等体积饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃静置30min，离心，去上清，加入20μL，0.02M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)溶解沉淀，，4℃透析除盐过夜；

(6)离心取上清，即为酶-抗体结合物，加入等体积甘油，分装后-20℃保存。

本发明试剂盒中的辅助试剂包括洗涤缓冲液、酶缓冲液、提取缓冲液、显色剂及反应终止液。辅助试剂的制备方法如下：

(1)提取缓冲液：0.87％硫酸钾、0.5％聚乙烯吡络烷酮、0.05％吐温-20、0.1％巯基乙醇、0.58％氯化钠、0.2％牛血清白蛋白、以及含有0.02％叠氮化钠的Tris盐酸缓冲液(pH 7.4)；

(2)酶缓冲液，用蒸馏水配置，其中含有1％聚乙二醇、0.5％牛血清白蛋白、0.01％硫柳汞钠、含有0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)；

(3)洗涤缓冲液：含0.05％吐温-20，pH 7.2的磷酸盐缓冲液；

(4)显色剂A，含有终浓度为1.46％磷酸二氢钠、0.93％柠檬酸、0.045％过氧化氢水溶液；

(5)显色剂B，含有终浓度为0.03％四甲基联苯胺、0.96％柠檬酸、0.019％乙二胺四乙二酸钠盐、2％DMSO和4％甘油的水溶液；

(6)终止液为2M H₂SO₄溶液，蒸馏水配制。

本发明试剂盒中的阳性质控品的制备，将RT-PCR检测阳性(指莲藕潜隐病毒呈阳性)的莲藕叶片，用上述提取缓冲液研磨后离心，取上清即为阳性质控品。阴性质控品的制备，将莲藕潜隐病毒RT-PCR检测阴性的莲藕叶片，用提取缓冲液研磨后离心，取上清即为阴性质控品。

在另一个方面中，本发明还提供了一种检测莲藕潜隐病毒双抗体夹心酶联免疫检测方法，包括以下步骤：

(1)将待测莲藕样品，用提取缓冲液研磨后离心后，吸取上清；

(2)将上清按照100μL/孔加入多克隆抗体包被板中，37℃温育30min：

(3)加入1μg/mL的酶标抗体，37℃温育2h；

(4)将显色液A、B等体积混匀，按照100μL/孔加入，37℃温育15min；

(5)按照50μL/孔加入终止液，10min内在酶标仪上450nm测定各孔OD值；若待测样品与阴性质控品的A₄₅₀nm的比值大于2.1，则判定为阳性。

采用上述方案后，本发明组成了包含盒体、酶标板、各种试剂的双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒。本发明还提供了一种检测莲藕潜隐病毒双抗体夹心酶联免疫检测方法，应用该方法可以检测到莲藕潜隐病毒的外壳蛋白，以诊断莲藕等作物中是否感染莲藕潜隐病毒，待测样品提取自叶片组织。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明提供了一种检测莲藕潜隐病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒及检测方法，试剂盒采用基因工程表达的高纯度的外壳蛋白作为免疫原，灵敏度高，特异性好，并且操作简单，经济适用，适合生产中大批量检测，利于大规模商业推广，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是LLV外壳蛋白表达与纯化电泳图。

图2为田间12个莲藕样品的检测结果和显著性分析示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

(1)LLV外壳蛋白的原核表达与纯化

①总RNA提取(多糖多酚植物组织裂解法)

②引物设计

根据已获得莲藕潜隐病毒LLV-S2-2分离物序列，设计并合成在扩增LLV外壳蛋白核苷酸序列的特异性引物：LLVCPF(SEQ ID No.1)和LLVCPR(SEQ ID No.2)；分别引入酶切位点Nco I和Sac I，以连接原核表达重组载体pET-28a。引物采用PAGE的纯化方式，送上海生工生物工程股份公司进行合成。

③RT-PCR

以莲藕叶片总RNA为模板，以LLVCPR引物，通过反转录酶M-MLV，合成cDNA，反转录体系见表1。

表1反转录体系

轻弹管壁混匀，稍离心后，42℃保温60min，然后置冰上待用；

PCR反应体系见表2。

表2 PCR反应体系

PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，共进行20个循环，72℃延伸7min，4℃保存；

吸取RT-PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，切胶，回收。

④构建重组质粒

回收产物利用Nco I和Sac I进行双酶切，酶切回收产物并连接到相应酶切的pET-28a载体上，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过菌液PCR、酶切和测序鉴定阳性重组菌。

酶切体系见表3。

表3酶切体系

⑤蛋白的原核表达

通过AxyPrep^TM DNA Gel Extraction kit提取阳性重组质粒，转化到大肠杆菌Rossta菌株感受态细胞，经菌液PCR、酶切鉴定获得阳性克隆。

挑取阳性菌株接种于2mL LB液体培养基，37℃活化过夜。活化菌液按1:100加入新鲜LB中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6。分别在28℃和37℃下进行诱导，每个温度取2管，一管加IPTG至终浓度为1mM,另一管不加IPTG作为对照，培养4-6h。取2mL诱导培养物，12000rpm离心30s收集菌体。加入200μLSDS-PAGE Loading Buffer，沸水煮10min，12000rpm离心10min。取8mL上清进行SDS-PAGE电泳检测。

通过预实验确定蛋白表达后，在1L液体LB中按1:100加入10mL活化菌液，37℃培养至OD₆₀₀为0.6，用1mM IPTG于18℃诱导18h。然后离心收集菌体，用40mL含20mM Tri-HCl(pH6.8)、500mM NaCl、10％甘油的蛋白buffer重悬，加蛋白酶抑制剂至终浓度为1mM，超声波破碎，离心收集上清和沉淀。上清用GenScript公司的High Affinity Ni-NTA Resin纯化。5mLHigh Affinity Ni-NTA Resin过5倍柱体积蛋白buffer，上清过柱子5遍，分别用10mL含60mM、80mM、100mM、200mM、300mM、400mM咪唑的蛋白buffer洗脱，洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测(图1)。将含目的蛋白的洗脱液用蛋白浓缩柱浓缩，分装后液氮速冻，-80℃保存。

(2)LLV外壳蛋白多克隆抗体的制备

①选择体重2.5Kg左右青壮年新西兰大白兔，做好标记。用浓度为1mg/mLLLV外壳蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔。首次免疫中，先将抗原完全混匀，而后与弗氏完全佐剂(石蜡油：羊膜脂＝7:1，另外加1mg/mL灭活的结核分枝杆菌成分)按照1:1体积比充分混匀，乳化完全后，进行多点皮下注射，每点0.2mL，每只新西兰大白兔免疫剂量1mg。

②第二-四次免采用弗氏不完全佐剂(石蜡油：羊膜脂＝7:1)，仍按照1:1体积比与抗原充分混匀。首免后第14d进行二免，二免到三免间隔时间为7d，免疫剂量同第一次。

③兔子三免后第7天耳中动脉采小样血清检测：自免疫新西兰大白兔耳缘静脉采血200μL至无菌离心管中，37℃温育2h，而后4℃过夜。次日，12000rpm离心2min，分离血清。使用间接ELISA法检测抗体效价至1:20000以上，即可采血。

④7天后加免，加免完7天后，将免疫新西兰大白兔禁食一天，可采集全血。

⑤采血后，放置到血清分离瓶中，37℃温育2h，而后4℃过夜。次日，用灭菌毛细管收集析出的血清，剩余样品3000rpm离心3min，继续收集分离出的血清，将收集到的血清加入质量百分比浓度为0.02％的叠氮化钠，-20℃保存。

⑥多克隆抗体IgG的粗纯

称取DEAE-纤维素(DE32或DE52)50g，置于1000mL烧杯中，先以蒸馏水漂浮除去细颗粒，再经酸碱处理后，用0.01～0.05mol/L，pH 8.0左右的磷酸盐缓冲液平衡。将水分抽干，或用布氏滤斗(内放两层滤纸)过滤，收集湿纤维素，以降低离子强度。按1mL血清加湿重5g DEAE纤维素，经过充分搅拌，置4℃吸附1h。上清液可再如此处理一次，即获得较纯的IgG。

(3)多克隆抗体的辣根过氧化物酶标记

①将辣根过氧化物酶溶于蒸馏水，加入新配制的NaIO₄水溶液，混匀后，4℃避光静置30min；

②加入0.5mL乙二醇水溶液，25℃避光静置30min；

③加入含纯化抗体的水溶液(与辣根过氧化物酶等摩尔比)，混匀后装入透析袋，经0.05M，pH 9.6的碳酸盐缓冲液透析6h；

④加入NaBH4水溶液，混匀后，4℃避光静置2h；

⑤在上述溶液中，缓慢加入等体积饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃静置30min，离心，去上清，加入20μL，0.02M PBS液(pH 7.4)溶解沉淀，，4℃透析除盐过夜；

⑥离心取上清，即为酶-抗体结合物，加入等体积甘油，分装后-20℃保存。

(4)莲藕潜隐病毒的双抗体夹心酶联免疫检测方法：

①试剂配置：

a提取缓冲液：0.87％硫酸钾、0.5％聚乙烯吡络烷酮、0.05％吐温-20、0.1％巯基乙醇、0.58％氯化钠、0.2％牛血清白蛋白、以及含有0.02％叠氮化钠的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)；

b酶缓冲液，用蒸馏水配置，其中含有1％聚乙二醇、0.5％牛血清白蛋白、0.01％硫柳汞钠、含有0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)；

c洗涤缓冲液：含0.05％吐温-20，pH 7.2的磷酸盐缓冲液；

d显色剂A，含有终浓度为1.46％磷酸二氢钠、0.93％柠檬酸、0.045％过氧化氢水溶液；

e显色剂B，含有终浓度为0.03％四甲基联苯胺、0.96％柠檬酸、0.019％乙二胺四乙二酸钠盐、2％DMSO和4％甘油的水溶液；

f终止液为2M H₂SO₄溶液，蒸馏水配制。将待测莲藕样品，用提取缓冲液研磨后离心后，吸取上清；

g包被液为pH 9.6，50mM的碳酸盐缓冲液；

h封闭液，包含2％明胶，0.5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；

I阳性质控品，为莲藕潜隐病毒RT-PCR检测阳性的莲藕叶片，用提取缓冲液研磨后离心，取上清得到；

J阴性质控品的制备，将莲藕潜隐病毒RT-PCR检测阴性的莲藕叶片，用提取缓冲液研磨后离心，取上清得到。

②样品处理：取待测样品叶片0.1g于离心管中，依次加入钢珠，液氮速冻后用研磨仪研磨成粉末，分别加入提取缓冲液，4℃，12000rpm离心10min，取上清；包被：用包被液将兔抗多克隆抗体稀释成终浓度1μg/mL，100μL/孔加入微孔板中，37℃温育2h，而后4℃过夜。次日，经洗涤液冲洗三次，甩干。封闭：用封闭液200μL/孔封闭，37℃温育2h。加样：甩去封闭液，按照100μL/孔加待测样品，同时设置空白对照(样品提取液)，阴性对照，阳性对照，剂量皆为100μL/孔，37℃温育30min，洗涤液冲洗5次，甩干。加酶标抗体：用酶缓冲液将酶标抗体稀释至0.5μg/mL，100μL/孔，37℃温育30min，洗涤液冲洗5次，甩干。显色：每孔先后加入显色剂A、B各10μL，37℃避光温育30min。终止：每孔加入终止液10μL。检测：10min内在酶标仪上450nm测定各孔OD值。

为了验证该试剂盒精度、准确度，我们首先通过RT-PCR对田间12个莲藕样品进行检测，结果如图2所示，同时用本发明的试剂盒对田间12个莲藕样品进行检测，在12个样品中，5个样品阴性，7个样品阳性。而该试剂盒检测结果与RT-PCR结果一致(图2)，显著性分析显示，阳性样品与阴性样品间存在极显著差异，结果对比明显、真实可靠，证明该试剂盒具有较高的准确度和灵敏度。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，本领域技术人员对之可作一些修改或改进。但是，在不偏离本发明内涵的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种莲藕潜隐病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒及制备与检测方法

<130> xhx2018081001

<141> 2018-08-10

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Lotus latent virus

<400> 1

catgccatgg cacacagccc aaaagttttg 30

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> Lotus latent virus

<400> 2

cgagctcgta cccacaacat agaatttcat ct 32

<210> 3

<211> 293

<212> PRT

<213> Lotus latent virus

<400> 3

Ala Ala Asp Asp Glu Leu Asp Ala Gly Lys Met Asn Val Lys Lys Gln

1 5 10 15

Gln Gly Thr Gly Glu Ala Gly Gln Pro Ser Ala Thr Pro Pro Gln Ser

20 25 30

Asn Ala Lys Asp Lys Gly Lys Glu Val Val Ser Ala Gln Gly Ser Gly

35 40 45

Ile Ile Asn Lys Pro Glu Leu Asp Arg Asp Ile Asn Thr Gly Thr Ile

50 55 60

Gly Thr Phe Gln Val Pro Arg Leu Arg Ala Ile Pro Thr Lys Ile Arg

65 70 75 80

Pro Pro Ile Ile Lys Ser Gly Ala Ala Leu Asn Leu Asp His Leu Leu

85 90 95

Val Tyr Lys Pro Ser Gln Leu Asp Ile Thr Asn Ala Lys Ser Thr Arg

100 105 110

Asp Gln Phe Ser Gln Trp Tyr Glu Gly Val Lys Asn Ala Tyr Glu Val

115 120 125

Asp Asp Gln Gln Met Ser Ile Leu Met Asn Gly Leu Val Val Trp Cys

130 135 140

Ile Glu Asn Gly Thr Ser Pro Asn Ile Asn Gly Asp Trp Val Met Met

145 150 155 160

Asp Gly Asp Thr Gln Ile Ser Tyr Pro Ile Lys Pro Leu Ile Asp Phe

165 170 175

Ala Ala Pro Thr Phe Arg Gln Ile Met Lys His Phe Ser Asp Val Ala

180 185 190

Glu Ala Tyr Ile Gln Met Arg Asn Ala Glu Gln Pro Tyr Met Pro Arg

195 200 205

Tyr Gly Leu Gln Arg Asn Leu Thr Asp Met Ser Leu Ala Arg Tyr Ala

210 215 220

Phe Asp Phe Tyr Glu Val Thr Ser Arg Thr Pro Ile Arg Ala Lys Glu

225 230 235 240

Ala His Phe Gln Met Lys Ala Ala Ala Leu Thr Asn Thr His His Arg

245 250 255

Leu Phe Gly Leu Asp Gly Asn Val Ser Thr Asn Gln Glu Asn Thr Glu

260 265 270

Arg His Thr Ala Thr Asp Val Asp Arg Asn Ile His Thr Leu Leu Gly

275 280 285

Met Arg Gly Ile His

290

Claims (9)

1.一种莲藕潜隐病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括LLV特异性多克隆抗体，LLV特异性多克隆抗体包被于多克隆抗体包被板上。

2.根据权利要求1所述的一种莲藕潜隐病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述LLV特异性多克隆抗体的氨基酸序列为：AADDELDAGKMNVKKQQGTGEAGQPSATPPQSNAKDKGKEVVSAQGSGIINKPELDRDINTGTIGTFQVPRLRAIPTKIRPPIIKSGAALNLDHLLVYKPSQLDITNAKSTRDQFSQWYEGVKNAYEVDDQQMSILMNGLVVWCIENGTSPNINGDWVMMDGDTQISYPIKPLIDFAAPTFRQIMKHFSDVAEAYIQMRNAEQPYMPRYGLQRNLTDMSLARYAFDFYEVTSRTPIRAKEAHFQMKAAALTNTHHRLFGLDGNVSTNQENTERHTATDVDRNIHTLLGMRGIH。

3.根据权利要求1所述的一种莲藕潜隐病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括辣根过氧化酶标记多克隆抗体、基因工程重组LLV外壳蛋白标准品、质控品。

4.根据权利要求1或3所述的试剂盒，其特征在于，还包括辅助试剂：提取反应液、洗涤缓冲液、酶缓冲液、显色剂及反应终止液。

5.一种权利要求1至4任意一项所述检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括基因工程重组LLV外壳蛋白标准品的制备步骤、LLV特异多克隆抗体的制备步骤、多克隆抗体包被板的制备步骤、辣根过氧化酶标多克隆抗体的制备步骤、质控品的制备以及辅助试剂的制备步骤。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述LLV外壳蛋白标准品的制备步骤中，以感染LLV的莲藕叶片的总RNA为模版，使用引物：SEQ ID No.1的LLVCPF和SEQ ID No.2的LLVCPR扩增获得LLV的CP基因，克隆入pET-28a载体得到重组质粒pET28a-LLVCP，经原核表达纯化获得33 kDa的外壳蛋白。

7.根据权利要求5所述检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述多克隆抗体包被板，用纯化的LLV外壳蛋白免疫动物获得的LLV特异性多克隆抗体包被酶标板制作而成。

8.根据权利要求5所述检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述辣根过氧化物酶标多克隆抗体，用纯化的LLV外壳蛋白免疫动物获得的LLV特异性多克隆抗体标记辣根过氧化物酶制作而成。

9.一种莲藕潜隐病毒的检测方法，其特征在于，使用权利要求1-4任意一项所述的试剂盒实现莲藕潜隐病毒的检测。