CN101143216A - 大肠杆菌TolC抗体靶向作用提高耐药菌对抗生素敏感性的技术 - Google Patents

Abstract

本发明公开了大肠杆菌TolC抗体靶向作用提高耐药菌对抗生素敏感性的技术方法。本发明通过大肠杆菌耐氯霉素菌株其TolC上调，TolC基因缺失株对氯霉素敏感，抗TolC抗体可以强烈抑制包括耐药菌在内细菌的生长等研究，提供了一种采用抗体提高耐药菌对抗生素敏感性的技术方法。

Description

大肠杆菌TolC抗体靶向作用提高耐药菌对抗生素敏感性的技术

技术领域

本发明涉及大肠杆菌(E.coli)TolC抗体靶向作用提高耐药菌对抗生素敏感性的技术方法。

背景技术

近年来细菌耐药日趋严峻，成为医药界倍受关注的问题。由于抗生素滥用造成细菌耐药性问题尤为突出。我国临床分离的一些细菌对某些药物的耐药性已居世界首位。除耐青霉素的肺炎链球菌、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、肠球菌、真菌等多种耐药菌外，进入我国仅20多年的喹诺酮类抗生素的耐药率已经达60％-70％。据报道，包括广州在内的国内一些大城市人群感染的金黄色葡萄球菌中。80％已经产生了对青霉素G的耐药性。凯福隆、失孢三嗪等第三代的头孢类茵抗生素的应用已日趋普遍，抗生素品种的选用明显超前。抗生素的滥用主要是由于抗生素生产和销售管理薄弱、临床的误用和滥用、以及将抗生素作为生长促进剂在动物养殖中广泛使用所导致。由于在抗生素使用与病原菌耐药水平之间存在着一种宏观的量化关系，即一定范围内的抗生素使用可以导致病原菌整体耐药水平以及耐药菌感染率的变化。由此，人和动物的肠道正常菌群暴露于抗生素而普遍产生耐药性，并通过粪便直接污染环境、水、食品，导致耐药菌不断增加，也使人体接触耐药菌的机会不断增加。因此耐药菌的种类非常广泛。这样一来，人体如果再获得耐药菌的感染治疗起来就比较困难。因此.控制目前已经广泛存在的耐药菌己成为一个重要的社会和科学问题。

耐药菌的防制尚不能完全寄托在新抗生素的发现和发明，因为抗生素的生产与发展伴随着细菌耐药性的不断发展，一种新的抗生素投入使用后，很快就发现有相应的抗性菌株出现。在细菌中普遍存在的抗药性是对抗菌药物的生产开发及对细菌性疾病防治的一个巨大挑战，直接危害食品安全和人类健康。对细菌耐药机理的深入研究，发现其作用靶点是解决这一难题的关键。虽然不同的细菌对相同的抗生素以及同一细菌对不同的抗生素的均各有其特点，但在外膜的耐药机制中可能具有明显共性，即通过影响膜通透性以及抗生素排出系统起作用。这些作用不是单个蛋白而是一个蛋白质组在起作用。因此，通过对细菌外膜耐药蛋白质组的研究，可望筛选获得针对细菌耐药的共性蛋白作为药物作用靶点。

在肿瘤治疗方面，针对活性作用靶位可以采用抗体靶向疗法，即通过抗体与该靶位结合以负调其功能，达到抑制肿瘤细胞生长的目的。迄今为止，虽然已有采用杀菌性抗体抑制细菌的文献，但无采用抗体负调与耐药相关活性蛋白的功能达到抑制耐药菌生长的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供大肠杆菌TolC基因编码蛋白(TolC)作为一种抗体靶向作用的靶点，达到抑制耐药菌的目的的技术方法。

本发明通过比较亚蛋白质组学和免疫印迹(Westem blotting)技术，证明氯霉素耐药大肠杆菌外膜蛋白TolC、OmpC、OmpW、OmpT、FadL、Lamb发生明显变化，其中前4种出现上调，提示TolC、OmpC、OmpW、OmpT可以作为抗体靶向负调的作用靶标。

本发明为进一步证明上述结论，对上述蛋白的基因缺失株进行最小抑菌浓度测定和在含有抗生素培养基中生存能力的评价，发现其缺失株的最小抑菌浓度发生变化、细菌存活率明显下降，其中TolC缺失株的存活率最低。这些结果证明TolC是抗体靶向负调的良好作用靶标。

本发明采用抗体靶向疗法，证明抗TolC抗血清(抗体)能够在含氯霉素和链霉素的培养基中强烈抑制包括耐药大肠杆菌在内的该种细菌的生长。经抗TolC抗血清处理后的细菌，其生长被抑制的程度与同条件培养下TolC缺失株的生长情况一致。这些结果说明抗TolC抗体靶向作用可以明显负调TolC的功能，达到抑制耐药菌生长的目的。

综上所述，大肠杆菌TolC抗体靶向疗法能够明显抑制耐药菌的生长，为耐药菌的治疗提供了一种崭新的技术方法。

附图说明

图1为用肉汤稀释法测定的氯霉素耐药菌(CAP-R)及其来源菌株(CAP-R-O)的最小抑菌浓度。

图2为CAP-R和CAP-R-O外膜蛋白表达的双向电泳图谱

图3为差异蛋白局部放大图

图4为免疫印迹技术鉴定的CAP-R和CAP-R-O中TolC差异表达

图5为CAP-R和CAP-R-O在不同氯霉素浓度时的生长曲线

图6为缺失菌株对氯霉素的最低抑菌浓度

图7为氯霉素对缺失株的生存的影响

图8为TolC抗体对细菌生长的抑制作用。A，免疫前血清和TolC血清分别处理对CAP-R，CAP-R-O和△tolC在加和不加氯霉素培养基中生长的影响。B，A的抑制率比较(*表示有显著性差异(P<0.01))

图9为TolC抗体对细菌生长的抑制作用的确证。A，免疫前血清和TolC血清分别处理对BW25113和△tolC在加和不加链霉素培养基中生长的影响。B，A的抑制率比较(*表示有显著性差异(P<0.01))

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(2001 by ColdSpring Harbor Laboratory Press)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

氯霉素(CAP)耐药大肠杆菌菌株及其来源株外膜差异表达蛋白的分离鉴定

1.细菌菌株来源：大肠杆菌BW25113(本试验起始株)和除tolC以外的基因缺失株均来源于Nara Institute of Science and Technology，Japan。氯霉素耐药菌株(CAP-R)为本实验室筛选获得，大肠杆菌tolC基因缺失株为本实验室构建。

2.氯霉素耐药大肠杆菌菌株的筛选

用两倍稀释法检测大肠杆菌起始株(CAP-R-O)对氯霉素的最小抑菌浓度。将CAP-R-O以10⁵菌落形成单位/mL的数量在含1/2最小抑菌浓度氯霉素的培养基中连续培养10代，重新测定其最小抑菌浓度。如果重新测定的最小抑菌浓度/起始最小抑菌浓度>4，则认为该菌株对该抗生素表现出耐药性。结果发现，选择出的菌株的最小抑菌浓度为27.2μg/mL，是起始株CAP-R-O(6.8 μg/mL)的4倍(图1)，说明选择获得氯霉素耐药大肠杆菌菌株(CAP-R)。

3.外膜蛋白的提取

用月桂酰肌氨酸钠二步法提取CAP-R和CAP-R-O的外膜蛋白。具体过程如下：挑取CAP-R单菌落于LB培养基培养过夜后，再按1∶100接种于LB培养基，培养至OD1.0，离心获得细菌。同时以CAP-R-O为对照菌株。菌体收集后，称菌体湿重，按1∶3(w/v)的比例加入超声波破碎缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH7.5；5mmol/L MgCl₂；1mmol/L PMSF)悬浮菌体，冰浴下进行超声破碎，输出功率50％，15s每次，间隔30s，超声3次。超声破碎后的菌液，5000g4℃离心15分钟，收集上清。上清液超速离心100,000g，4℃离心40分钟。弃上清，沉淀用2％月桂酰肌氨酸钠(配于50mmol/l Tris-HCl，pH7.5)悬浮，室温放置40分钟。再超速离心100,000g，4℃离心40分钟。沉淀溶于适当体积超声缓冲液中；用Bradford法测定样品中蛋白质浓度。分装，-20℃保存。

4.外膜蛋白的分离及差异蛋白鉴定

外膜蛋白样品经过第一向等电聚焦，第二向SDS-PAGE后，获得CAP-R和CAP-R-O的外膜蛋白双向电泳图谱(图2)。具体操作程序如下：

(1)将浸泡在洗液中的第一向等电聚焦管取出，用蒸馏水清洗干净，置5mol/LNaCl 1小时，用蒸馏水清洗干净烘干，置2mol/LHCl 1小时，用蒸馏水清洗干净，烘干。按等电聚焦凝胶的配方制备等电聚焦管状凝胶；

(2)预电泳：加入10μL裂解缓冲液和10μL覆盖缓冲液，上槽加入200mL20mmol/L NaOH阴极电泳液，下槽加入200mL10mmol/L H₃PO₄阴极液，预电泳，条件：200V，15分钟；300V，30分钟；400V，60分钟或更长时间；

(3)样品的处理：取出样品，按5∶1加入裂解液，充分溶解样品；

(4)上样：预电泳结束后，将凝胶管内液体也移去，后用蒸馏水洗净。样品经10000转离心10分钟后，取上清加入加样孔，然后加入10μL覆盖液，加上槽液进行电泳；

(5)IEF电泳：400V，12小时；600V，3小时；800V，2小时；

(6)平衡：电泳结束后，取下管状等电聚焦凝胶置于平衡液中平衡15分钟；

(7)SDS-PAGE：配制第二向凝胶，分离胶12％，浓缩胶4％，在浓缩胶表面加入一层1％琼脂糖，待平衡结束后，将管状胶条置于浓缩胶上，滴上几滴溴酚兰做指示剂，然后再用1％琼脂糖封好，加入电泳缓冲液，进行电泳，条件与SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS/PAGE)一样，即：浓缩胶，80V；分离胶，120V。电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色，用2mol/LNaCl溶液脱色至背景干净。

(8)采用GDS8000pc凝胶成像分析系统扫描，Melanie4.0双向电泳图谱分析软件分析图谱。

5.质谱样品的处理和分析

5.1样品处理

(1)取点：从胶上切下目的蛋白质点，，把胶切成1mm³大小，放入0.5mL离心管中；

(2)洗脱：用溶于100mmol/L碳酸氢铵的50％乙腈洗胶块(2或3次，每次15分钟)，直至胶块变为白色；

(3)脱水：加入100％乙腈处理15分钟，弃所有溶液后在真空离子机上干燥胶块1.5小时；

(4)还原和烷基化：把胶块浸入10mmol/L DTT/0.1 mol/L NH₄HCO₃，56℃孵育60分钟；将管子冷至室温，弃多余的液体，迅速加入大约等体积新鲜的55mmol/L碘乙酰胺，0.1mol/L NH₄HCO₃溶液室温暗处，孵育60分钟，吸出碘乙酰胺溶液；

(5)洗涤：经0.1mol/L NH₄HCO₃，100％乙氰洗胶块(重复两次)，吸净所有液体；

(6)真空干燥：1小时以上，彻底干燥；

(7)胶内消化：在4℃加入消化液使胶块泡胀，加入足够消化液覆盖胶块，冰上孵育45分钟；37℃过夜消化(10小时以上即可)；

(8)萃取：酶解结束后，加入5％TFA 60μL，室温放置1小时，吸出上清；加入2.5％TFA，50％ACN溶液60μL，室温1小时，吸出上清；合并所有上清，离心干燥；

(9)溶解：在干燥的离心管中加入适量0.5％TFA进行充分的溶解；取0.5μL与等量的HCCA溶液混合，点至样品靶上，干燥后进行肽质量指纹图谱分析。

5.2质谱分析

MALDI-TOF分析使用德国BRUKER公司的ReFlex^TM III MALDI-TOF质谱仪进行分析，反射模式，离子源加速电压1为20kv，加速电压2为23kv，N₂激光波长337nm，脉冲宽度为3ns，离子延迟提取2000ns，真空度1.4×10-7Torr，质谱信号单次扫描累加50次，并用标准Maker峰作为外标校正质谱峰，正离子谱测定，获得肽质量指纹图谱。

从图2可见，双向电泳图谱上蛋白质点大约50个，其中20个为差异蛋白点。通过MALDI-TOF-MS质谱鉴定，这20个蛋白分别归属于10种蛋白：点1、2、4是TolC，点3是AtpB，点5是AceA，点6是FadL，点7是Lamb，点8-ll是OmpT，点13是OmpC，点14-16是OmpW，点12、17-19是Dps，点20是PspA。根据SWISS-PROT database，TolC、OmpC、OmpW、OmpT、Lamb和FadL属于外膜蛋白，and AceA属于细胞质蛋白，AtpB和PspA属于内膜蛋白，Dps的定位尚不清楚(表1)。图像分析结果表明在CAP-R中，TolC表达上调。图3为局部放大比较图谱。

实施例2

TolC基因的克隆、原核表达、纯化及兔抗血清的制备

在该实施例中，将全长的大肠杆菌TolC编码序列或片段构建入大肠杆菌蛋白质原核表达载体之中，以达到表达和提纯目的蛋白。

TolC基因编码序列如下：

1    atgaagaaat tgctccccat tcttatcggc ctgagccttt ctgggttcag ttcgttgagc

61   caggccgaga acctgatgca agtttatcag caagcacgcc ttagtaaccc ggaattgcgt

121  aagtctgccg ccgatcgtga tgctgccttt gaaaaaatta atgaagcgcg cagtccatta

181  ctgccacagc taggtttagg tgcagattac acctatagca acggctaccg cgacgcgaac

241  ggcatcaact ctaacgcgac cagtgcgtcc ttgcagttaa ctcaatccat ttttgatatg

301  tcgaaatggc gtgcgttaac gctgcaggaa aaagcagcag ggattcagga cgtcacgtat

361  cagaccgatc agcaaacctt gatcctcaac accgcgaccg cttatttcaa cgtgttgaat

421  gctattgacg ttctttccta tacacaggca caaaaagaag cgatctaccg tcaattagat

481  caaaccaccc aacgttttaa cgtgggcctg gtagcgatca ccgacgtgca gaacgcccgc

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601  gtagagcagc tgcgccagat caccggtaac tactatccgg aactggctgc gctgaatgtc

661  gaaaacttta aaaccgaeaa accacagccg gttaacgcgc tgctgaaaga agccgaaaaa

721  cgcaacctgt cgctgttaca ggcacgcttg agccaggacc tggcgcgcga gcaaattcgc

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841  acctcttata gcggttcgaa aacccgtggt gccgctggta cccagtatga cgatagcaat

901  atgggccaga acaaagttgg cctgagcttc tcgctgccga tttatcaggg cggaatggtt

961  aactcgcagg tgaaacaggc acagtacaac tttgtcggtg ccagcgagca actggaaagt

1021 gcccatcgta gcgtcgtgca gaccgtgcgt tcctccttca acaacattaa tgcatctatc

108l agtagcatta acgcctacaa acaagccgta gtttccgctc aaagctcatt agacgcgatg

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1201 ttgtacaacg ccaagcaaga gctggcgaat gcgcgttata actacctgat taatcagctg

1261 aatattaagt cagctctggg tacgttgaac gagcaggatc tgctggcact gaacaatgcg

1321 ctgagcaaac cggtttccac taatccggaa aacgttgcac cgcaaacgcc ggaacagaat

1381 gctattgctg atggttatgc gcctgatagc ccggcaccag tcgttcagca aacatccgca

1441 cgcactacca ccagtaacgg tcataaccct ttccgtaact ga

TolC氨基酸序列如下：

1    mkkllpilig lslsgfssls qaen1mqvyq qarlsnpelr ksaadrdaaf ekinearsp1

61   lpqlglgady tysngyrdan ginsnatsas lqltqsifdm skwraltlqe kaagiqdvty

121  qtdqqtliln tatayfnvln aidvlsytqa qkeaiyrqld qttqrfnvgl vaitdvqnar

181  aqydtvlane vtarnnldna veqlrqitgn yypelaalnv enfktdkpqp vnallkeaek

241  rnlsllqarl sqdlareqir qaqdghlptl dltastgisd tsysgsktrg aagtqyddsn

301  mgqnkvglsf slpiyqggmv nsqvkqaqyn fvgaseqles ahrsvvqtvr ssfnninasi

361  ssinaykqav vsaqssldam eagysvgtrt ivdvldattt lynakqelan arynyl inql

421  niksalgtln eqdllalnna lskpvstnpe nvapqtpeqn aiadgyapds papvvqqtsa

481  rtttsnghnp frn

1.TolC基因的克隆

根据NCBI公布的大肠杆菌K12的基因序列，设计一对引物。引物序列如下：Sense primer：5’-CGA GAA TTC ATG CAA ATG AAG AAA-3’，antisense primer：5’-GGT AAG CTT TCA GTT ACG GAA AGG G-3’。为便于克隆和表达载体的构建，在引物上分别引入限制性内酶位点EcoRI和HindIII。引物由大连宝生物工程公司合成。以热变性法获得的大肠杆菌K12全基因组为模板，通过PCR反应获得目的条带。用限制性内酶EcoRI和HindIll分别酶切回收的DNA片断和PET-HIS(Novagen)表达载体，参照Takara公司的使用说明书进行连接反应，连接产物转化丑coli DH5α感受态，通过双酶切和序列测定重组子的正确性，结果证明与数据库公布序列完全一致。

2.TolC基因的表达

将正确的重组质粒以热激法转化大肠杆菌BL21表达菌，37℃培养12～16小时。接种单菌落于含Amp的LB液体培养基中，同时接种含有PET-HIS质粒的BL21作为对照，于30℃培养至OD(600nm)值0.6，加入IPTG 100μg/ml 35℃诱导2个小时，离心收集菌体，用SDS-PAGE检测插入片段是否表达蛋白，以及表达蛋白的分子量大小。接着，进行蛋白表达产物为可溶组分抑或是不溶组分(包涵体)的鉴定。具体过程如下：将离心后沉淀重悬于1/10体积的PBS或50mmol/L Tris缓冲液(pH8.0)中；加入溶菌酶至100μg/mL，保温30分钟；反复冻融数次以破坏细胞壁，用超声波处理剪切DNA(超声波的强度以不能产生气泡为适宜；裂解的时间根据实际情况掌握，一般将云雾状的细菌悬浮物裂解至比较清朗即可)；离心(12,000rpm)15分钟后将培养物分为可溶部分和不溶部分；将15μL上清与4μL4×SDS样品缓冲液混合，将沉淀物重悬于1×SDS样品缓冲液；将表达样品(上清及沉淀)和非表达对照物进行SDS-PAGE电泳并以考马斯亮蓝染色以便在预计分子量范围内观察表达蛋白带。经鉴定表达产物为可溶蛋白。

3.TolC基因产物的纯化

大量培育菌体，离心后超声处理，离心收集上清用Ni-NTA His亲和柱纯化。采用pH5.9(buffer F)和pH4.5(buffer G)两个不同pH值的缓冲液纯化蛋白。用冲洗缓冲液buffer E(8mol/L尿素，0.1mol/L NaH₂PO₄，10mmol/LTris-Hcl，pH 6.3)洗涤5次，每次1mL；用洗脱缓冲液buffer F(8 mol/L尿素，0.1mol/L NaH₂PO₄，10mmol/LTris-HCl，pH 5.9)洗脱目的蛋白4次，每次1mL，收集洗脱液；用洗脱缓冲液bufferG(8M尿素，0.1mol/LNaH₂PO₄，10mmol/LTris-HCl，pH 4.5)洗脱蛋白4次，每次1mL，收集洗脱液。取收集液进行SDS-PAGE分析。纯化蛋白进行紫外检测，测定蛋白含量。

4.兔抗血清的制备

将纯化蛋白溶液与福氏完全佐剂1∶1(v/v)混合均匀形成油包水，采用背部多点注射免疫家兔，注射量为500μg/只；其后采用福氏不完全佐剂，每次间隔2周，第3次免疫后的第10天，心脏取血，将得到的血摆成最大斜面后在4℃冰箱中静置过夜，使血清自然析出。通过Dot-ELISA测定效价为1∶4000。分装，-80℃保存。

实施例3

免疫印迹技术验证外膜差异蛋白

将制备好的TolC兔抗血清作为一抗，酶标羊抗兔为二抗，采用双向电泳免疫印迹技术对经双向电泳发现的差异蛋白结果进行验证。结果与双向图谱分析一致(图4)。具体操作程序如下：

双向电泳结束后，进行电转，恒压70V电转1小时；电转结束后，用丽春红染色检测电转的效果；洗去丽春红，加封闭液封闭，室温孵育1小时；TNT洗膜，3次(每次5分钟)；加入一抗(用封闭液配制)，室温孵育1小时：取出膜，TNT洗膜3次(每次10分钟；加入酶标二抗(用封闭液配制)，室温孵育1小时；取出膜，TNT洗膜3次(每次10分钟)；DAB显色；终止反应，扫描，封好膜，保存。

实施例4大肠杆菌tolC基因缺失菌株的构建过程

首先制作含有pKD46质粒(由美国Purdue University的Barry L Wanner教授提供)的BW25113菌株的感受态。接种含有pKD46质粒的BW25113菌株于5毫升LB培养基中，30℃培养过夜，次日1∶50接种至100毫升含70mg/ml氨苄青霉素的LB培养基，30℃培养至0.25(OD600)时，加入L-阿拉伯糖至30mmol/L，诱导1小时(OD600不能超过0.6)，使pKD46质粒上的Red重组酶(Exo、Bet和Gam蛋白)充分表达。冰上预冷10分钟后，4℃离心收集沉淀，用预冷10％甘油洗涤3次，浓缩100倍成1ml的感受态细胞，储于-80℃冰箱备用。

根据TolC基因序列和pKD4质粒中卡那霉素抗性基因序列，设计一对扩增卡那霉素基因的引物。引物序列为：sense：5`-ATGCAAATGAAGAAATTGCTCCCCATTCTTATCGGCCTGAGCCTTTCTGGTTGAGCGATTGTGTAG-3`，Antisense：5`-TCAGTTACGGAAAGGGTTATGACCGTTACTGGTGGTAGTGCGTGCGGATGATGGTCCATATGAATATCCT-3`。其5’端为TolC基因序列，3`端为卡那霉素基因序列。以pKD4质粒为模板，用常规PCR方法扩增出卡那霉素抗性基因，经琼脂糖凝胶电泳后用试剂盒回收目的片段。

将适量的卡那霉素抗性基因(约200ng)加入含有pKD46质粒的BW25113感受态细胞中，混匀，加入0.2cm电击杯中，用BioRad电击仪进行电转化。电击条件：200 Ω，25μF，电击电压213kV，电击时间为4-5毫秒，电击后迅速加入1毫升的LB液体培养液，7℃培养1小时，涂布于含50ug/ml的卡那霉素平板上，12小时后用链式聚合酶反应鉴定出正确的克隆。

实施例5  氯霉素对外膜差异蛋白缺失菌株生长的影响

1.氯霉素耐药菌株和初始菌株生长曲线的测定

为检测CAP-R和CAP-R-O在不同浓度CAP时的生长情况，分别将这2种细菌接种于含有CAP-R-O的1/2和1/8最低抑菌浓度的培养基中，测定其生长曲线。结果发现，2种浓度氯霉素条件下均为CAP-R的生长较CAP-R-O好，其中在1/2最低抑菌浓度时更为明显(图5)。

2.氯霉素对相关缺失菌株生长的影响

根据双向电泳中发现的差异蛋白，利用其缺失菌株进行了耐药菌对氯霉素抗性研究。首先以CAP-R-O和CAP-R为对照，测定了缺失菌株△tolC， △ompC，△ompT，△ompW，△fadL，△lamB，△dps的最低抑菌浓度，每个样品重复3次，实验重复3次。最低抑菌浓度结果表明，共有4个缺失株发生了变化，其中△tolC为最低，说明缺失该蛋白后细菌对氯霉素最为敏感(图6)。同时，以CAP-R-O、CAP-R和无关缺失菌株△purA，△udp，△frdB和△tsx为对照，将这些缺失菌株分别接种于含有CAP-R-O的1/2最低抑菌浓度的氯霉素和无任何抗生素的培养基中，37℃培养8小时后，测定其OD(600nm)，计算存活率。存活率研究表明2-DE中的7个差异蛋白与氯霉素抗性都有关系，其中△tolC的生长最慢(图7)，进一步说明缺失该蛋白后细菌对氯霉素最为敏感。这两项实验都表明，在这些差异蛋白中，TolC对细菌耐受氯霉素最为重要。

3.TolC靶向疗法对细菌生长的抑制作用

鉴于TolC在所有差异外膜蛋白中对氯霉素的抗性最为重要，进一步探讨了TolC特异性抗体对细菌生长的抑制作用。以△tolC菌株为材料，同时以CAP-R和CAP-R-O作为对照，将培养至OD(光密度)0.5的细菌分别用免疫前血清和TolC抗血清处理，稀释1000倍后，加上1/8最低抑菌浓度的氯霉素，同时以不加氯霉素为对照，37℃培养9小时，测定其OD值(600nm)。结果发现，采用免疫前血清处理后，CAP-R-O的OD值从不加氯霉素的1.97下降为加入氯霉素的1.13，抑制率为42.64％；CAP-R从1.93降至1.14，抑制率为40.09％；△tolC从1.83降至0.01，抑制率为99.45％。而用TolC抗血清处理后，CAP-R-O的OD值从1.63降为0.03，抑制率为98.16％；CAP-R从1.62降至0.02，抑制率为98.77％；△tolC从1.59降至0.01，抑制率为99.37％(图8A，B)。重要的是，当用免疫前血清处理时，△tolC的抑制率明显高于CAP-R-O和CAP-R，而用TolC抗体处理后，三者的抑制率无明显差别。这些结果表明，当TolC抗体靶向至细菌外膜的TolC后，可以使该蛋白的功能发生明显负调，致使CAP-R-O和CAP-R对氯霉素的敏感性明显提高，与缺失该蛋白的表现结果相似。

实施例6 TolC靶向疗法对细菌生长抑制作用的进一步证明

为进一步确证TolC靶向疗法对细菌生长的抑制作用，任意选取另一抗生素一链霉素(streptomycin，STR)进行试验。以△tolC菌株为材料，同时以其出发菌株BW25113作为对照，将培养至OD(光密度)0.5的细菌分别用免疫前血清和TolC抗血清处理，稀释1000倍后，加上1/4最低抑菌浓度的链霉素，同时以不加链霉素为对照，37℃培养10小时，测定其OD值(600nm)。结果发现，采用免疫前血清处理后，BW25113的OD值从不加链霉素的1.758下降为加入链霉素的1.294，抑制率为26.394％；△tolC从1.702降至0.075，抑制率为95.59％。而用TolC抗血清处理后，BW25113的OD值从1.718降为0.076，抑制率为95055％；△tolC从1.541降至0.067，抑制率为95.65％(图9A，B)。当用免疫前血清处理时，△tolC的抑制率明显高于BW25113，而用TolC抗体处理后，二者的抑制率无明显差别。结果表明，当TolC抗体靶向至细菌外膜的TolC后，可以使该蛋白的功能发生明显负调，同样致使BW25113对链霉素的敏感性明显提高，与缺失该蛋白的表现结果相似。

此结果与氯霉素表现出一致性，进一步证明TolC靶向疗法对细菌生长的抑制。

    表1质谱鉴定耐药菌改变的外膜蛋白

SpotNo	Accessionnumber	Variation	Character description	Subcellularlocation	MW/PI	Peptidesmatched	MoscowScore
								1234567891011121314151617181920	TOLC_ECOLITOLC_ECOLIATPB_ECOLITOLC_ECOLIACEA_ECOLIFADL_ECOLILamB_ECOLIOmpT_ECOLIOmpT_ECOLIOmpT_ECOLIOmpT_ECOLIDpS_ECOLIOmpC_ECOLIOmpW_ECOLIOmpW_ECOLIOmpW_ECOLIDpS_ECOLIDpS_ECOLIDpS_ECOLIPSPA_ECOLI	↑↑↓↑↓↓↓↑↓↓↓↓↑↑↑↑↓↓↓↑	multidrug efflux and proteinexportmultidnug efflux and proteinexportATP synthase subunit betamultidrug efflux and proteinexportSocitrate lyaselong-chain fatty acidtransport proteinMaltose-inducible porinProteaseProteaseProteaseProteaseDNA protection duringstarvation proteinpassive diffuse smallmolecular weighthydrophilic material crossingthe outer membranea receptor for colicin S4a receptor for colicin S4a receptor for colicin S4DNA protection duringstarvation proteinDNA protection duringstarvation proteinDNA protection duringstarvation proteinPhage shock protein A	OMOMIMOMCytoplasmOMOMOMOMOMOMunknownOMOMOMOMunknownunknownunknownIM	53967/5.4653967/5.4650194/4.9053967/5.4647200/5.4448742/5.0949941/4.8535540/5.7635540/5.7635540/5.7635540/5.7618564/5.7240368/4.5922928/6.0322928/6.0322928/6.0318564/5.7218564/5.7218564/5.7225362/5.4	88158108713131313766877989	86862008610962701761761761761027665706595928080

序列表

<110>中山大学

<120>大肠杆菌TolC抗体靶向作用提高耐药菌对抗生素敏感性的技术方法

<160>2

<210>1

<211>1482

<212>DNA

<213>大肠杆菌TolC基因

<400>1

atgaagaaat tgctccccat tcttatcggc ctgagccttt ctgggttcag ttcgttgagc 60

caggccgaga acctgatgca agtttatcag caagcacgcc ttagtaaccc ggaattgcgt 120

aagtctgccg ccgatcgtga tgctgccttt gaaaaaatta atgaagcgcg cagtccatta 180

ctgccacagc taggtttagg tgcagattac acctatagca acggctaccg cgacgcgaac 240

ggcatcaact ctaacgcgac cagtgcgtcc ttgcagttaa ctcaatccat ttttgatatg 300

tcgaaatggc gtgcgttaac gctgcaggaa aaagcagcag ggattcagga cgtcacgtat 360

cagaccgatc agcaaacctt gatcctcaac accgcgaccg cttatttcaa cgtgttgaat 420

gctattgacg ttctttccta tacacaggca caaaaagaag cgatctaccg tcaattagat 480

caaaccaccc aacgttttaa cgtgggcctg gtagcgatca ccgacgtgca gaacgcccgc 540

gcacagtacg ataccgtgct ggcgaacgaa gtgaccgcac gtaataacct tgataacgcg 600

gtagagcagc tgcgccagat caccggtaac tactatccgg aactggctgc gctgaatgtc 660

gaaaacttta aaaccgacaa accacagccg gttaacgcgc tgctgaaaga agccgaaaaa 720

cgcaacctgt cgctgttaca ggcacgcttg agccaggacc tggcgcgcga gcaaattcgc 780

caggcgcagg atggtcactt accgactctg gatttaacgg cttctaccgg gatttctgac 840

acctcttata gcggttcgaa aacccgtggt gccgctggta cccagtatga cgatagcaat 900

atgggccaga acaaagttgg cctgagcttc tcgctgccga tttatcaggg cggaatggtt 960

aactcgcagg tgaaacaggc acagtacaac tttgtcggtg ccagcgagca actggaaagt 1020

gcccatcgta gcgtcgtgca gaccgtgcgt tcctccttca acaacattaa tgcatctatc 1080

agtagcatta acgcctacaa acaagccgta gtttccgctc aaagctcatt agacgcgatg 1140

gaagcgggct actcggtcgg tacgcgtacc attgttgatg tgttggatgc gaccaccacg 1200

ttgtacaacg ccaagcaaga gctggcgaat gcgcgttata actacctgat taatcagctg 1260

aatattaagt cagctctggg tacgttgaac gagcaggatc tgctggcact gaacaatgcg 1320

ctgagcaaac cggtttccac taatccggaa aacgttgcac cgcaaacgcc ggaacagaat 1380

gctattgctg atggttatgc gcctgatagc ccggcaccag tcgttcagca aacatccgca 1440

cgcactacca ccagtaacgg tcataaccct ttccgtaact ga                    1482

<210>2

<211>493

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>2

Met Lys Lys Leu Leu ProIle Leu Ile Gly Leu Ser Leu Ser Gly Phe

1                5                 10                   15

Ser Ser Leu Ser Gln Ala Glu Asn Leu Met Gln Val Tyr Gln Gln Ala

             20                  25                   30

Arg Leu Ser Asn Pro Glu Leu Arg Lys Ser Ala Ala Asp Arg Asp Ala

         35                  40                  45

Ala Phe Glu Lys Ile Asn Glu Ala Arg Ser Pro Leu Leu Pro Gln Leu

     50                  55                  60

Gly Leu Gly Ala Asp Tyr Thr Tyr Ser Asn Gly Tyr Arg Asp Ala Asn

65                   70                  75                 80

Gly Ile Asn Ser Asn Ala Thr Ser Ala Ser Leu Gln Leu Thr Gln Ser

                 85                  90                 95

Ile Phe Asp Met Ser Lys Trp Arg Ala Leu Thr Leu Gln Glu Lys Ala

             100                  105                110

Ala Gly Ile Gln Asp Val Thr Tyr Gln Thr Asp Gln Gln Thr LeuIle

         115                120               125

Leu Asn Thr Ala Thr Ala Tyr Phe Asn Val Leu Asn Ala Ile Asp Val

     130                 135                 140

Leu Ser Tyr Thr Gln Ala Gln Lys Glu Ala Ile Tyr Arg Gln Leu Asp

145                 150                  155                160

Gln Thr Thr Gln Arg Phe Asn Val Gly Leu Val Ala Ile Thr Asp Val

                 165                  170                 175

Gln Asn Ala Arg Ala Gln Tyr Asp Thr Val Leu Ala Asn Glu Val Thr

            180                  185                  190

Ala Arg Asn Asn Leu Asp Asn Ala Val Glu Gln Leu Arg Gln Ile Thr

         195                  200                205

Gly Asn Tyr Tyr Pro Glu Leu Ala Ala Leu Asn Val Glu Asn Phe Lys

     210                 215                 220

Thr Asp Lys Pro Gln Pro Val Asn Ala Leu Leu Lys Glu Ala Glu Lys

225                  230                 235                240

Arg Asn Leu Ser Leu Leu Gln Ala Arg Leu Ser Gln Asp Leu Ala Arg

                 245                 250                255

Glu Gln Ile Arg Gln Ala Gln Asp Gly His Leu Pro Thr Leu Asp Leu

            260                  265                270

Thr Ala Ser Thr Gly Ile Ser Asp Thr Ser Tyr Ser Gly Ser Lys Thr

        275                  280                 285

Arg Gly Ala Ala Gly Thr Gln Tyr Asp Asp Ser Asn Met Gly Gln Asn

     290                295                  300

Lys Val Gly Leu Ser Phe Ser Leu Pro Ile Tyr Gln Gly Gly Met Val

305                 310                  315                320

Asn Ser Gln Val Lys Gln Ala Gln Tyr Asn Phe Val Gly Ala Ser Glu

                325                  330                335

Gln Leu Glu Ser Ala His Arg Ser Val Val Gln Thr Val Arg Ser Ser

            340                  345                350

Phe Asn Asn Ile Asn Ala Ser Ile Ser Ser Ile Asn Ala Tyr Lys Gln

        355                 360                  365

Ala Val Val Ser Ala Gln Ser Ser Leu Asp Ala Met Glu Ala Gly Tyr

     370                 375                  380

Ser Val Gly Thr Arg Thr Ile Val Asp Val Leu Asp Ala Thr Thr Thr

385                 390                 395                 400

 Leu Tyr Asn Ala Lys Gln Glu Leu Ala Asn Ala Arg Tyr Asn Tyr Leu

                 405                  410                415

Ile Asn Gln Leu Asn Ile Lys Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn Glu Gln

            420                 425                 430

Asp Leu Leu Ala Leu Asn Asn Ala Leu Ser Lys Pro Val Ser Thr Asn

        435                  440                 445

Pro Glu Asn Val Ala Pro Gln Thr Pro Glu Gln Asn Ala Ile Ala Asp

    450                 455                  460

Gly Tyr Ala Pro Asp Ser Pro Ala Pro Val Val Gln Gln Thr Ser Ala

465                 470                 475                 480

Arg Thr Thr Thr Ser Asn Gly His Asn Pro Phe Arg Asn

                485                  490

Claims (2)

1.大肠杆菌TolC作为抗体抑制耐药和非耐药菌的作用靶点的应用。

2.抗TolC抗体作为提高细菌对抗生素敏感性的药物的应用。

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