CN101962651B

CN101962651B - 一种来自深海宏基因组的l-蛋氨酸裂解酶基因及其表达产物

Info

Publication number: CN101962651B
Application number: CN2010101090280A
Authority: CN
Inventors: 周世宁; 李慧贤; 黄雅丽; 陆勇军
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Guangzhou Institute Of Microbiology Group Co ltd
Priority date: 2010-02-05
Filing date: 2010-02-05
Publication date: 2012-06-13
Anticipated expiration: 2030-02-05
Also published as: CN101962651A

Abstract

本发明涉及一种来自深海环境的新基因，尤其是一种来自深海宏基因组的能产生L-蛋氨酸γ-裂解酶活性的新基因，获得了新基因的克隆，构建了工程大肠杆菌并获得表达产物。本发明所述的一种来自深海宏基因组的L-蛋氨酸裂解酶基因，该基因大小为1281bp，序列如SEQ ID NO.1所示，编码426个氨基酸，序列如SEQ ID NO.2所示；蛋白分子量为46.024kDa，等电点为5.28。本发明首次克隆得到了深海L-蛋氨酸γ-裂解酶基因，并首次分析了其产物及摸索出重组基因工程大量制备该酶蛋白的方法，能获得足够用于产业应用的酶蛋白。

Description

一种来自深海宏基因组的L-蛋氨酸裂解酶基因及其表达产物

技术领域

本发明属于微生物技术领域和基因工程领域，涉及了一种来自深海环境的新基因，尤其是一种来自深海宏基因组的能产生L-蛋氨酸γ-裂解酶活性的新基因，获得了新基因的克隆，构建了工程大肠杆菌并获得表达产物。

背景技术

L-蛋氨酸γ-裂解酶(L-methionine γ-lyase，简称MGL或METase)，是一种5’-磷酸吡哆醛(PLP)依赖型的多功能酶。它主要催化L-蛋氨酸的γ-消去反应，生成甲硫醇、氨和α-丁酮酸，该酶还能催化L-半胱氨酸和硫代L-半胱氨酸的β-消去反应以及L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸及它们的衍生物的γ，β-取代反应。MGL催化L-蛋氨酸γ-消去的反应方程式(参见Ilya V.Manukhov et.al.Journal of Bacteriology.2005，187：3889-3893)。

MGL主要在微生物中发现，包括细菌和某些原生动物。1951年首次在Escherichia coli中首次发现能够代谢L-蛋氨酸的酶，最初并命名为“蛋氨酸酶”(methionase)，随后几十年间又陆续报道了从Pseudomonas putida(＝ovalis)、Clostridium sporogenes、Aeromonas sp、Citrobacter intermedius、Brevibacteriumlinens、Trichomonas vaginalis、Porphyromonas gingivalis等细菌和原核动物Entamoeba histolytica和Trichomonas vaginalis中发现了MGL，其中的一些已经进行了酶的纯化和性质的测定(Tomoaki Takakura et.al.AnalyticalBiochemistry 327：233-240，2004；夏立亮等，生物技术通报，10：70-74，2009)。近年来，在癌症治疗的新方法研究中发现，多种癌细胞生长需要大量的L-蛋氨酸，即具有L-蛋氨酸依赖性(Hoffman RM & Erbe RW.，Proc Natl Acad Sci USA，73：1523-1527，1976)。通过输入外源MGL来消耗肿瘤组织的L-蛋氨酸，使癌细胞不能分裂并停滞于细胞分裂期的S/G2后期，因此达到治疗的目的(HoffmanRM & Jacobsen SJ.Proc Natl Acad Sci USA 77：7306-7310，1980；Kokkinakis DM.et.al.Br J Cancer 75：779-788，1997)。研究还表明利用带有MGL基因的腺病毒载体转导癌细胞，导致selenomethionine生成methylselenol，后者产生的氧化压力使细胞色素C释放而激活细胞凋亡(K.Miki et al.Cancer Research 61：6805-6810，2001)。

此外，MGL作为一个多功能酶，能够对多种底物起催化作用，并且因此作为一种检测试剂在临床检测中具有重要意义；应用MGL检测各种环境中蛋氨酸和/或同型半胱氨酸含量的方法已经在美国授予专利(US Patent 5885767(1999，3)-Methods and compositions for quantitating L-homocysteine and/orl-methionine in a solution)。在食品工业中MGL可以使蛋氨酸等成分直接产生甲硫醇类物质因而用于改进食品风味(Fdlix Amarita.et.al.，Applied andEnvironmental Microbiology，70：7348-7354，2004)。MGL还可以用于重要生化药物α-氨基丁酸的生物合成。

由于蛋氨酸裂解酶具有重要应用前景，需要对该酶进行规模化制备。利用自然分离的菌株或其突变株进行酶的制备，酶的产量极低，难以实现有效益的规模生产；目前主要倾向应用基因工程的菌株进行酶的制备。Y.Tan等将来自Pseudomonas putida的L-methionine α-deamino-γ-mercaptomethane-lyase(即METase或MGL)基因连接到含有T7RNA聚合酶启动子的表达载体pT7-7上，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，表达产物中重组MGL约占可溶性总蛋白的10％(Yuying Tan et.al.Protein Expression and Purification 9：233-245，1997)。Tomoaki Takakura等将自Pseudomonas putida的METase(即MGL)基因用含有trc启动子的载体构建成表达质粒pMGLTrc03，在大肠杆菌JM109中表达，表达产物中重组METase占可溶性总蛋白的比例高达43％(TomoakiTakakura et.al.，Appl Microbiol Biotechnol，70：183-192，2006)。这些工作为该酶的研究和应用提供酶的来源。在国内，马百坤、王红兵报道了将阴道毛滴虫蛋氨酸裂解酶基因克隆到大肠杆菌的研究(马百坤，王红兵：医学研究生学报，2008，21(4)：353-359)，李朝辉和田长富通过化学合成手段获得一个假单胞菌(Pseudomonas putida)的MGL酶基因，并初步试验其在大肠杆菌表达(李朝辉，田长富：昆明医学院学报，NO 6，157，2009)。阴道毛滴虫的MGL酶和假单胞菌的MGL酶基因在国外也已经被克隆研究。

本发明涉及的是一个来自深海宏基因组文库的基因，该基因最大的可能是来自Idiomarina属的海洋细菌，该属细菌在2000年才由Ivanova等人发现并提出建立新属(Ivanova，E.P.et al.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.50(Pt2)：901-907，2000)，分子分类表明该属微生物代表了明显不同的进化路线，2004年该属一个种I.loihiensis的基因组被测定(Hou，S.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101：18036-18041，2004)，从基因组信息发现该微生物的能量主要来源是氨基酸代谢而非一般微生物能量来源的糖代谢，这样该属微生物具有明显特殊性。我们已经从深海宏基因组一个大片段克隆子中发现一个36Kb长的深海DNA片段，测序表明所含35个阅读框(基因)的序列与已知的海洋细菌Idiomarina相应基因有最高的相似性。该片段含有多个重要的氨基酸代谢有关基因，很多基因与已知基因的相似性都较低，本申请涉及的基因mgl就是来自该克隆片段；海洋基因尤其来自深海的基因往往与陆生生物的基因有较大差别。

发明内容

本发明的目的是提供了一种新的海洋L-蛋氨酸γ-裂解酶基因及其产物。

本发明所述的一种来自深海宏基因组的L-蛋氨酸裂解酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因的大小为1281bp。

进一步，本发明提供了包含本发明所述的L-蛋氨酸裂解酶基因的重组表达载体。

进一步，本发明提供了用所述的重组表达载体转化宿主细胞所得的转化体。

优选地，所述的转化体为重组工程菌菌株E.coli Pmet，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 209255。

本发明还提供了由根据本发明所述的转化体表达的L-蛋氨酸裂解酶，其分子量为46～46.5kDa，序列推导的理论等电点为5.28，催化L-蛋氨酸裂解的最适反应温度为60℃，最适反应pH为9.5。

本发明所述的L-蛋氨酸裂解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共426个氨基酸。

本发明所述的L-蛋氨酸γ-裂解酶基因与已有报道的L-蛋氨酸γ-裂解酶基因相比，区别在于：本基因是从约2000米深海沉积物宏基因组fosmid文库中筛选得到的，该基因序列经搜索比对国际数据库(NCBI)的结果显示与已知的海洋细菌Idiomarina loihiensis L2TR的相应基因有最高的一致性【Identities＝786/1183(66％)】，但核苷酸序列的差异达34％；由该基因核苷酸序列翻译的氨基酸序列也与Idiomarina loihiensis L2TR或Idiomarina baltica的MGL有最高一致性【Identities＝264/391(67％)】，但氨基酸序列差异达33％。因此，本发明提供了新的L-蛋氨酸γ-裂解酶基因以及相应的L-蛋氨酸γ-裂解酶蛋白。

本发明首先从南海约2000米深海沉积物提取制备总DNA，然后用该DNA以及fosmid载体和大肠杆菌构建了宏基因组文库，从文库数万个克隆子中挑选一个约含36kb外源DNA片段的克隆子进行测序研究，应用GeneMark hmm2.4程序在线对其序列进行分析预测，该克隆子含35个完整的ORF(开放阅读框)和2个不完整的ORF。在该克隆子序列分析中发现了一个与L-蛋氨酸γ-裂解酶基因最相似的基因(称mgl)，将该基因连接到原核表达载体pET 32a并转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，获得了转化体，所得转化体能产生过量的重组蛋白，该蛋白产物能分解L-蛋氨酸，产生丁酮酸等产物，即具有L-蛋氨酸γ-裂解酶活性。本发明所得的含mgl基因的转化体菌株命名为E coli Pmet(保藏号为CCTCC NO：M 209255)。经用NCBI网站的BLASTX工具比对，所克隆的mgl基因与海洋细菌Idiomarina loihiensis L2TR的L-蛋氨酸γ-裂解酶(Methioninegamma-lyase)的基因序列有最高的一致性(66％)。鉴于原始克隆的36kb片段中的绝大部分基因序列(88％)也都与Idiomarina属基因具有最高相似性，因此推断本发明所克隆的基因mgl最有可能来源于Idiomarina属海洋细菌，或者来自未被报道相关基因的其它与Idiomarina属相近的微生物。

本发明还提供了所述的L-蛋氨酸裂解酶的制备方法，包括以下步骤：培养用包含如权利要求3所述的转化体，诱导表达并回收所表达的具有催化L-蛋氨酸裂解活性的蛋白产物。

优选地，所述的制备方法中，诱导表达时，诱导温度为20℃；诱导剂为IPTG，其终浓度为0.1mM；诱导时间为14小时。

本发明获得的具有催化L-蛋氨酸裂解活性的蛋白产物，其特征是：分子量(单体)为46kDa，催化蛋氨酸裂解反应的最适温度为60℃，最适反应pH为9.5。综合各种特征，该蛋白与已报道的L-蛋氨酸-γ-裂解酶有明显不同(表1)。

表1.不同来源蛋氨酸-γ-裂解酶的比较^*

^*参考：夏立亮等，生物技术通报，10：70-74，2009

本发明克隆的基因mgl虽然与Idiomarina loihiensis L2TR的L-蛋氨酸γ-裂解酶基因序列有最高的相似性，但Idiomarina的L-蛋氨酸γ-裂解酶基因及其产物至今尚未有人研究，仅仅是数据库中登录的全基因组测序数据，而本发明首次克隆得到了深海L-蛋氨酸γ-裂解酶基因，并首次分析了其产物及摸索出重组基因工程菌大量制备该酶蛋白的方法，能获得足够用于产业应用的酶蛋白。如前所述，已报道的L-蛋氨酸裂解酶可应用的范围，本发明所述的L-蛋氨酸裂解酶也可应用于这些范围，因此，本发明还提供了所述的L-蛋氨酸裂解酶的用途，包括但不限于：用于制备治疗癌症的药物的应用；用于制备检测各种环境中蛋氨酸和/或同型半胱氨酸含量的检测试剂的应用；用于制备改进食品风味的制试剂的应用；以及用于合成α-氨基丁酸的应用。

附图说明

图1为fosmid重组子酶切分析部分结果，图中，M1为DL15000marker，M2为λDNA/HindIII marker；载体本身的大小为8.1kb。

图2为重组L-蛋氨酸γ-裂解酶(rMGL)诱导表达的SDS-PAGE图谱，图中，1：宿主菌E.coli BL21(DE3)的细胞破碎上清液；2：带有pET 32a质粒的E.coliBL21(DE3)的细胞破碎上清液；3：不加IPTG诱导的重组子的细胞破碎上清液；4：加入IPTG诱导的重组子的细胞破碎上清液；5：加入IPTG诱导的重组子的细胞碎片沉淀；6：不加IPTG诱导的重组子的细胞碎片沉淀；7：带有pET 32a质粒的E.coli BL21(DE3)的细胞碎片沉淀；8：宿主菌E.coli BL21(DE3)的细胞碎片沉淀；M：蛋白marker。

图3为rMGL酶促反应产物的HPLC分析；图3A显示：标准α-丁酮酸的HPLC图谱，在9.728min处(箭头处)有一个特征峰；图3B显示：空白对照的HPLC图谱；图3C：酶反应液的HPLC图谱，在9.451min处(箭头处)有一个特征峰，与α-丁酮酸标准品的HPLC图谱吻合。

图4为不同IPTG浓度诱导下产生可溶性酶蛋白的SDS-PAGE分析图谱；图中，M：蛋白marker；0：不加IPTG诱导的细胞破碎上清液(空白对照)；1-7：终浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.8、1.0mmol/L的IPTG诱导的粗酶液(上清)。

图5为诱导时间梯度的粗酶上清SDS-PAGE图谱；图中，1-6：诱导时间分别为8、10、12、14、16、18h的粗酶液；M：蛋白marker。

图6为粗酶液用Ni²⁺-Chelating Sepharose Fast Flow纯化的纯化流程图。

图7为测定重组L-蛋氨酸γ-裂解酶的最适反应温度的曲线图。

图8为测定重组L-蛋氨酸γ-裂解酶的最适反应pH的曲线图。

具体实施方式

实施例一：基因mgl的获得

1、海洋沉积物宏基因组文库构建

分别从来自南海四个位点(水深1256～2893米)的海洋沉积物提取DNA，合并四个来源的DNA。经脉冲场电泳分离、0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，所得DNA片段与质粒fosmid连接并转染宿主菌E.coli EPI300，涂布于含12.5μg/mL氯霉素的LB平板上，37℃培养过夜，获得39,600个转化子，此克隆文库保存于4℃和-80℃。

2、文库克隆的鉴定

从上述深海宏基因库中随机挑取70个fosmid克隆接于含抗生素的LB培养液中，37℃振荡培养过夜，按20％的接种量，取过夜培养物接于新鲜的含氯霉素的培养集中，加入质粒扩增诱导剂，37℃剧烈振荡5h，离心收集细胞用于质粒提取。所得质粒DNA经酶切电泳表明所检测的克隆子中所含的外源片段最长约为45kb，最短约为24kb，统计得到插入片段平均长度为33kb(见图1)。

3、基因mgl的获得

在LB平板上发现一个菌落表形有变化的克隆子f，从该克隆子提取质粒，酶切分析表明该克隆子包含有大约36kb的外源片段，将其外源片段进行测序。根据测序的结果，该插入片段全长36801bp，应用GeneMark hmm2.4程序在线分析预测，其含有35个完整的ORF(开放阅读框)和2个不完整的ORF。经用NCBI网站的BLASTX工具比对分析发现，其中30个(占88.2％)与来自Idiomarina loihiensis L2TR或Idiomarina baltica OS145的基因序列有着最高的相似性，暗示该插入片段可能来源于Idiomarina属细菌，或者未见报道相关序列的其它微生物。

在35个完整的ORF中，有一个ORF(mgl)其由1281个碱基组成，核苷酸序列与序列数据库中来自Idiomarina loihiensis L2TR的L-蛋氨酸γ-裂解酶(MGL)基因有最高相似性(66％)，mgl推译的蛋白产物与来自Idiomarinaloihiensis L2TR或Idiomarina baltica OS145的核苷酸序列推译的L-蛋氨酸γ-裂解酶(MGL)的氨基酸序列均有最高的一致性(67％)。

实施例二：基因mgl的蛋白序列分析

运用瑞士生物信息学研究所(Swiss Institute of Bioinformatics，SIB)的ExPASy-ProtParam tool对MGL蛋白序列的一些基本性质，如分子量、等电点及氨基酸组成等进行在线分析(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)。在线分析结果(见表2)显示，MGL蛋白由426个氨基酸组成，分子量为46.024kDa，理论等电点(pI)为5.28，是一个酸性蛋白质，该蛋白质很稳定，预测在哺乳动物网状细胞内的半衰期达30小时，在大肠杆菌细胞内的半衰期大于10小时。表2中把本案衍生的MGL氨基酸序列与具最高相似性的其他来源MGL氨基酸序列作了比较，结果表明了该2蛋白的明显差异。氨基酸组成分析显示(见表3)，该蛋白的Ala、Leu含量较高，其次是Thr、Gly、Val和Asp，含量最低的是Cys和Trp，不含Pyl和Sec；带负电荷的残基(Asp+Glu)总数为51，带正电荷的残基(Arg+Lys)总数为34。

表2MGL蛋白的的计算机预测分析

^*消光系数是在280nm水溶液中测定的，单位是M^-1cm^-1

^**前者是假定所有半胱氨酸残基形成胱氨酸进行测定，后者是假定所有半胱氨酸残基均被还原进行测定。

^***该等级说明蛋白质是稳定的。

表3MGL的氨基酸组成

^*Pyl(O)：吡咯赖氨酸

^**Sec(U)：硒氨酸；硒代半胱氨酸

实施例三：基因mgl的功能鉴定

1、基因mgl的克隆

根据已知的mgl序列设计扩增mgl全长基因的引物：

mgl F：5’-TCAGCGTCCATGGAATCTGATGCG-3’(下划线为Nco I酶切位点)

mgl R：5’-CATGAAGTTGTGGAATTCTGTCATG-3’(下划线为EcoR I酶切位点)

接种克隆子f于LB(含12.5μg/mL氯霉素)，按照实施例一之第2项制备重组质粒fosmid DNA作为模板，以上述引物进行PCR扩增，扩增产物纯化后用Nco I和EcoR I进行双酶切。同时制备pET 32a质粒，同样用Nco I和EcoRI进行双酶切。两者的酶切产物进行连接，构建成携带mgl的重组质粒pET-mgl。

重组质粒pET-mgl转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得携带mgl的重组子，命名为E.coli Pmet。

本实施例采用的原核表达载体为pET 32a载体(LaVallie，E.R.et al.Bio/Technology.11：187-193)，除在多克隆位点两侧具有His-Tag外，还有Trx-Tag和S-Tag，因此表达的蛋白为融合蛋白。His-Tag和S-Tag便于所表达的融合蛋白的纯化。采用融合表达方法，产物分子量增加约18kDa。融合蛋白可经肠激酶(enterokinase)切割成为非融合蛋白。

2、重组L-蛋氨酸γ-裂解酶(rMGL)的诱导表达

本发明优选的工程菌E coli Pmet的基本培养条件是：培养基包括富含蛋白和大肠杆菌生长因子的原料如蛋白胨、酵母提取物等，另添加一定浓度抗生素，37℃培养至OD600约为0.6时，加入诱导剂IPTG启动诱导培养，即可表达过量具有L-蛋氨酸裂解酶活性的蛋白产物(MGL)。

本发明用工程菌株生产的MGL主要以胞内可溶性蛋白的形式存在，其提取与纯化步骤包括：细胞裂解，离心去除细胞碎片；上清液经Ni²⁺-Chelating Sepharose Fast Flow纯化，用咪唑浓度梯度缓冲液洗脱，洗脱液经过透析，或经超滤脱盐浓缩，获得初步纯化的具有裂解L-蛋氨酸活性的蛋白产物。

以下是一个诱导表达的实际例子：

挑取一个重组子单菌落于含有100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB培养基(含1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％NaCl)中，37℃振荡培养过夜，培养物作为种子液。

在新鲜的含有100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB培养基中按100∶1的比例接入种子液，37℃振荡至培养物OD₆₀₀约为0.6，在培养物中加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃继续振荡培养16小时。

离心收集菌体，用裂解缓冲液(100mmol/L KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液，pH7.2，含1mmol/L EDTA，0.01％DTT，0.02mmol/L PLP)悬浮菌体，超声破碎细胞，离心后分别收集细胞碎片沉淀和上清液。将上清液和细胞碎片沉淀进行SDS-PAGE观察，结果见图2，在IPTG诱导下，64kDa附近目的蛋白得到大量表达(泳道4和5)。

3、上清液总蛋白质含量的测定

蛋白质定量用TIANGEN Bradford蛋白质定量试剂盒进行浓度测定。操作方法如下：

将0、10、20、30、40、50、60μL牛血清白蛋白(BSA)标准溶液(1mg/mL)分别加入到试管中，加入PBS缓冲液(NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L，KH2PO4 1.76mmol/L，pH 7.2～7.4)补足到150μL；将适当体积的样品加入到试管中，用PBS缓冲液补足到150μL；向各试管中加入2.85mL考马斯亮蓝染液，混合均匀，室温放置5-10分钟；用预热好的分光光度计测定各管溶液595nm处的吸光值，记录读数，以不含BSA的样品的吸光值作为空白对照；绘制标准曲线，根据标准曲线方程计算样品的蛋白质浓度。此方法用于酶的比活计算(见下文)。

4、重组蛋白的L-蛋氨酸γ-裂解酶(rMGL)活性检测

酶活测定原理：L-蛋氨酸在MGL的催化下，生成甲硫醇、氨和α-丁酮酸，其中的α-丁酮酸能与BMTH反应生成吖嗪衍生物，后者在315-325nm处有吸收峰，可用分光光度计测定其含量。MGL酶活测定原理如下：

α-丁酮酸+MBTH——→吖嗪衍生物

取2.0mL底物溶液(含100mmol/L KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液，pH8.0；25mmol/L L-蛋氨酸；0.01mmol/L PLP)于37℃预热，加入20μL稀释到适当浓度的酶溶液(含100mmol/L KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液，pH7.2；1mmol/L EDTA；0.02mmol/L PLP；0.01％(m/v)DTT；酶适量)，37℃反应10分钟，加入0.25mL三氯乙酸溶液终止反应。离心后取1.0mL上清，加入2.0mL乙酸钠溶液(pH5.0)和0.8mL 0.1％(m/v)BMTH溶液，50℃反应30分钟后25℃温育30分钟，测定320nm的吸光度。用酶稀释液(含100mmol/L KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液，pH7.2；1mmol/L EDTA；0.02mmol/L PLP；0.01％(m/v)DTT)代替酶溶液作为空白对照。

37℃，pH8.0的条件下，每分钟催化L-蛋氨酸裂解生产1.0μmol α-丁酮酸的酶量定义为一个酶活单位。

每毫克蛋白含有酶的活性单位数定义为酶的比活(specific activity，SA)。

根据上述方法测定的数据及公式，计算出重组蛋白具有L-蛋氨酸γ-裂解酶活性，其表达量为每mL培养物0.312U，比活为0.915U/mg蛋白。

rMGL酶促反应的产物丁酮酸经HPLC分析确定(见图3)。

实施例四：重组L-蛋氨酸γ-裂解酶(rMGL)的可溶性表达

1、诱导温度的优化

实施例三之第2项的诱导表达温度为37℃，在该温度下重组蛋白易形成不可溶的包涵体(见图2的第5泳道)。为提高可溶性rMGL的产量，进行了诱导温度的优化。

挑取一个重组子单菌落于含有100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，培养物作为种子液。

在新鲜的含有100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB培养基中按100∶1的比例接入种子液，37℃振荡至培养物OD600约为0.6～1.0，在培养物中加入终浓度为1mmol/L的IPTG，分别在37℃、30℃、25℃和20℃继续振荡培养16h。

离心收集菌体，用裂解缓冲液悬浮菌体，超声破碎细胞，离心后分别收集细胞碎片沉淀和上清液，所得上清即为含rMGL的粗酶液。

按实施例三之第3、4项的方法测定粗酶液的可溶性蛋白含量、酶活和比活，结果如表4。

表4不同诱导温度下rMGL的表达

表4的数据显示，在20℃-37℃温度范围内，随着诱导温度的降低，细胞裂解物中的含量、酶活及比活均有所增加。上清液中可溶性蛋白含量的增加说明，较低的诱导温度能降低表达过程中形成包涵体的量，提高可溶性重组蛋白的含量。

2、诱导剂浓度的优化

实施例三之第2项的诱导剂IPTG的终浓度为1mmol/L，过大的诱导剂浓度会使重组蛋白形成不可溶的包涵体，而且诱导剂浓度过大会增加生产成本。为提高可溶性rMGL的产量，降低生产成本，进行了诱导剂浓度的优化实验。

在新鲜的含有100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB培养基中按100∶1的比例接入种子液，37℃振荡至培养物OD600约为0.6，在培养物中分别加入终浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.8、1.0mmol/L的IPTG，20℃继续振荡培养16h。

离心收集菌体，用裂解缓冲液悬浮菌体，超声破碎细胞，离心后分别收集细胞碎片沉淀和上清液，所得上清即为含rMGL的粗酶液。将粗酶液进行SDS-PAGE观察，结果见图4。

从图4可见，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG即可以获得明显的诱导效果，重组子表达出大量的rMGL，随着IPTG的浓度的增大，rMGL的表达量没有明显的变化，而且当IPTG的终浓度达到1.0mmol/L时，表达量已明显看出有所下降。

按实施例三之第3、4项的方法测定粗酶液中可溶性蛋白含量、酶活和比活，结果如表5。

表5不同IPTG浓度诱导下产生可溶性酶的活性分析

表5的数据显示，在IPTG的终浓度在0～1.0mmol/L的范围内，粗酶液中总可溶性蛋白含量随着IPTG终浓度的增大而增加，在终浓度为0.5-0.8mmol/L时达到最大，然后在终浓度为1.0mmol/L时又有所下降；酶活单位在IPTG的终浓度为0.1mmol/L时达到最大值的97.3％(11.853U/mL)，在终浓度为0.2mmol/L时达到最大值12.178U/mL，然后随着终浓度的增大而呈下降趋势；比活则在IPTG的终浓度为0.1mmol/L时达到最大值4.875U/mg蛋白，随着终浓度的增大而呈下降趋势(比活是指酶活单位与蛋白质含量的比，比活越高，说明蛋白质中酶蛋白的比例越大)。

综合考虑生产成本和诱导效果，确定终浓度0.1mmol/L的IPTG为最佳诱导剂浓度。

3、诱导时间的优化

挑取一个重组子单菌落接种于含有100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，培养物作为种子液。

在新鲜的含有100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB培养基中接入种子液，37℃振荡至培养物OD600约为0.6，在培养物中分别加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，20℃分别振荡培养8h、10h、12h、14h、16h和18h。

离心收集菌体，用裂解缓冲液(100mmol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液，pH7.2，含1mmol/L EDTA，0.01％DTT，0.02mmol/L PLP)悬浮菌体，超声破碎细胞，离心后分别收集细胞碎片沉淀和上清液，所得上清即为含rMGL的粗酶液。将粗酶液和细胞碎片沉淀进行SDS-PAGE观察，结果见图5。

从粗酶上清的SDS-PAGE来看，在8-16h的诱导时间内，重组蛋白的含量随诱导时间的增加而增大，到16h达到最大值，18h时略有下降。

按实施例三之第3、4项的方法测定粗酶液中可溶性蛋白含量、酶活和比活，结果如表6。

表6不同诱导时间对可溶rMGL的酶活性影响

表6的数据显示，在8-16h的诱导时间内粗酶液中可溶性蛋白的含量随诱导时间的增加而增大，到16h达到最大，18h时略有下降，这与SDS-PAGE观察到的结果相吻合。酶活单位则随诱导时间增加而增大，在14h时达到最大值，然后又随时间增加而有所下降。比活的值在8-14h的诱导时间内保持在一个较稳定的水平，16h和18h略有降低。

根据实验数据，确定最佳诱导时间为14小时。

1、海洋沉积物宏基因组文库构建

总结：利用工程菌株E.coli Pmet产重组L-蛋氨酸γ-裂解酶(rMGL)的最适诱导表达条件为：诱导温度20℃，诱导剂IPTG终浓度0.1mM，诱导时间14h。实施例五重组L-蛋氨酸Y-裂解酶(rMGL)的生产与纯化

在新鲜的含有100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的500mL LB培养基中按100：1的比例接入种子液，37℃振荡至培养物OD₆₀₀约为0.6，在培养物中分别加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，20℃分别振荡培养14h。

离心收集菌体，用裂解缓冲液悬浮菌体，超声破碎细胞，离心后5分别收集细胞碎片沉淀和上清液，所得上清即为含rMGL的粗酶液。

获得的粗酶液用Ni²⁺-Chelating Sepharose Fast Flow纯化，纯化流程如图6所示。

含有重组L-蛋氨酸Y-裂解酶(rMGL)的咪唑洗脱液相对稀释液透析24h，期间换透析液3-4次。

纯化前的粗酶液和纯化后的酶液进行SDS-PAGE观察，结果见图6。根据凝胶成像系统的扫描分析，重组L-蛋氨酸γ-裂解酶(rMGL)在粗酶液和纯化后的酶液中分别约占总蛋白的40％和85％。表达水平与迄今报道的最高水平(占总蛋白43％)相当(Tomoaki Takakura et.al.，Appl Microbiol Biotechnol，70：183-192，2006)。

按实施例三之3、4的方法测定粗酶液和纯化后的酶液中可溶性蛋白含量、酶活和比活，结果如表7。

表7重组L-蛋氨酸γ-裂解酶(rMGL)纯化前后比较

实施例六表达产物重组L-蛋氨酸γ-裂解酶(rMGL)的特征分析

1、重组L-蛋氨酸γ-裂解酶(rMGL)的最适反应温度

取2.0mL底物溶液(含100mmol/L KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液，pH8.0；25mmol/L L-蛋氨酸；0.01mmol/L PLP)分别于10℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃预热，加入20μL稀释到适当浓度的酶溶液(含100mmol/L KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液，pH7.2；1mmol/L EDTA；0.02mmol/L PLP；0.01％(m/v)DTT；酶适量)，分别于10℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃反应10min，加入0.25mL三氯乙酸溶液终止反应。离心后取1.0mL上清，加入2.0mL乙酸钠溶液(pH5.0)和0.8mL 0.1％(m/v)BMTH溶液，50℃反应30min后25℃温育30min，测定320nm的吸光度。用酶稀释液(含100mmol/LKH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液，pH7.2；1mmol/L EDTA；0.02mmol/L PLP；0.01％(m/v) DTT)代替酶溶液作为空白对照。

根据测定的数据及公式，计算出相对酶活(以最高酶活为1)。

重组L-蛋氨酸γ-裂解酶(rMGL)在10-60℃范围内，活性随温度上升而增高，到60℃时达到最高，然后随温度的上升急剧下降。(图7)

2、重组L-蛋氨酸γ-裂解酶(rMGL)的最适反应pH值

由于测定rMGL的最适反应pH涉及的pH范围较大，需要采用不同的缓冲体系进行，底物溶液的配制如下：含25mmol/L L-蛋氨酸和0.01mmol/L PLP的100mmol/L KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液，pH分别为6.5、7.0、7.5、8.0；含25mmol/LL-蛋氨酸和0.01mmol/L PLP的100mmol/L Tris-HCL缓冲液，pH分别为7.5、8.0、8.5、9.0；含25mmol/L L-蛋氨酸和0.01mmol/L PLP的100mmol/L甘氨酸-NaOH缓冲液，pH分别为9.0、9.5、10.0、10.5。各取2.0mL上述底物溶液于37℃预热，加入20μL稀释到适当浓度的酶溶液(含100mmol/L KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液，pH7.2；1mmol/L EDTA；0.02mmol/L PLP；0.01％(m/v)DTT；酶适量)，分别于37℃反应10min，加入0.25mL三氯乙酸溶液终止反应。离心后取1.0mL上清，加入2.0mL乙酸钠溶液(pH5.0)和0.8mL 0.1％(m/v)BMTH溶液，50℃反应30min后25℃温育30min，测定320nm的吸光度。用酶稀释液(含100mmol/LKH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液，pH7.2；1mmol/L EDTA；0.02mmol/L PLP；0.01％(m/v)DTT)代替酶溶液作为空白对照。

根据测定的数据及公式(参考上文)，计算出出相对酶活(以最高酶活为1)。

由于采用不同的缓冲体系的影响，酶的活性在不同缓冲体系表现出差异，但从图10的曲线可以看出，在pH6.5-9.5范围内，rMGL的活性随pH增大而增大，到pH9.5时达到顶峰，然后酶活随pH增大而有所下降。(图8)

总结：工程菌株E.coli Pmet所产重组L-蛋氨酸γ-裂解酶分子量为46kDa，等电点5.25，最适反应温度60℃，最适反应pH为9.5。

SEQUENCE LISTING(序列表)

<110>中山大学

<120>一种来自深海宏基因组的L-蛋氨酸裂解酶基因及其表达产物

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>1302

<212>DNA

<213>深海生物宏基因组

<400>1

<210>1

<211>1281

<212>DNA

<213>深海生物宏基因组

<400>1

atgcaatctg atgcgcaaca acgaggagat attctgccaa tgcgcaccaa caataaagat 60

aaatcgcaat ggcagccggc gacagtgaca attcatggcg gtaaacgtcg tgatgaacat 120

ggcgctttgg ttgcaccact gtatcaaacg gcgacgtttt catttacgaa tacggcgcaa 180

gggtcagctc gttttgctgg cgaagaagaa ggttatattt atagtcgctt gggtaaccca 240

acggtcaccg aactagaaga acgtgttgct gcgctggaag ggttttctgc tgctgcggcc 300

gccgctacgg gtatgggcgc ggtgtcagcc agtatgctcg catttgttga acaaggcgac 360

catgtcttgg tatcagacgc gatttatggt tgtagctttg ccttgttctc acatttgttc 420

acgaagtttg gcattactgt cgactttgtc gacatggcgg atttagcgaa aacgcgtgcc 480

gcaatgcgtt caaatacgaa actggtattt cttgagtcac cggttaaccc gcatttgaaa 540

gtgattgata ttcaagcgat tgccgatatt gctcacgaag tgaatgcgcg cttggttgtt 600

gataatacgt ttatgacgcc actattgcag caaccgcgga agcaaggtgc cgatttagta 660

cttcacagtg cgactaaata tctcaatggt cacggcgacg tcgtagctgg cattgtttgt 720

ggtagcgaag aagatattga attgattaaa ttaaccacat taaaagatat gggcgctacc 780

atgagcccac acgatgcttg gttaatattg cgtggtctaa agaccctcga tgtccgtatg 840

gaacgtcatt gtgcaaacgc agtcaaagta gctgagtatt tacgcgataa agatctggtt 900

aaaactattt atttcccggg ctttgcggac catccagcgc aggctttgat ggatacgcag 960

atgcatgggg caggtgcagt cattgccttt gaattacacg gtgacatcaa tactgcacgg 1020

caattattag atagcttaca gttaattacg attgcagtga gtttaggcga tgcagaaaca 1080

ttaattcagc atccgacttc gatgacgcac tcaccctata cgccagaagc gcgagctgct 1140

gcgggtatca gtgatacgct gattcgtatt tcagtggggc ttgaggccgt cgaagatatt 1200

attgctgatt tggaacaagc gtttgctgct tgcgccaaca gccaaataac aacaacaggg 1260

gaacaagtac gctatgggta a 1281

<210>2

<211>426

<212>PRT

<213>深海生物宏基因组

<400>2

Met Gln Ser Asp Ala Gln Gln Arg Gly Asp Ile Leu Pro Met Arg Thr

1 5 10 15

Asn Asn Lys Asp Lys Ser Gln Trp Gln Pro Ala Thr Val Thr Ile His

20 25 30

Gly Gly Lys Arg Arg Asp Glu His Gly Ala Leu Val Ala Pro Leu Tyr

35 40 45

Gln Thr Ala Thr Phe Ser Phe Thr Asn Thr Ala Gln Gly Ser Ala Arg

50 55 60

Phe Ala Gly Glu Glu Glu Gly Tyr Ile Tyr Ser Arg Leu Gly Asn Pro

65 70 75 80

Thr Val Thr Glu Leu Glu Glu Arg Val Ala Ala Leu Glu Gly Phe Ser

85 90 95

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gly Met Gly Ala Val Ser Ala Ser Met

100 105 110

Leu Ala Phe Val Glu Gln Gly Asp His Val Leu Val Ser Asp Ala Ile

115 120 125

Tyr Gly Cys Ser Phe Ala Leu Phe Ser His Leu Phe Thr Lys Phe Gly

130 135 140

Ile Thr Val Asp Phe Val Asp Met Ala Asp Leu Ala Lys Thr Arg Ala

145 150 155 160

Ala Met Arg Ser Asn Thr Lys Leu Val Phe Leu Glu Ser Pro Val Asn

165 170 175

Pro His Leu Lys Val Ile Asp Ile Gln Ala Ile Ala Asp Ile Ala His

180 185 190

Glu Val Asn Ala Arg Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Thr Pro Leu

195 200 205

Leu Gln Gln Pro Arg Lys Gln Gly Ala Asp Leu Val Leu His Ser Ala

210 215 220

Thr Lys Tyr Leu Asn Gly His Gly Asp Val Val Ala Gly Ile Val Cys

225 230 235 240

Gly Ser Glu Glu Asp Ile Glu Leu Ile Lys Leu Thr Thr Leu Lys Asp

245 250 255

Met Gly Ala Thr Met Ser Pro His Asp Ala Trp Leu Ile Leu Arg Gly

260 265 270

Leu Lys Thr Leu Asp Val Arg Met Glu Arg His Cys Ala Asn Ala Val

275 280 285

Lys Val Ala Glu Tyr Leu Arg Asp Lys Asp Leu Val Lys Thr Ile Tyr

290 295 300

Phe Pro Gly Phe Ala Asp His Pro Ala Gln Ala Leu Met Asp Thr Gln

305 310 315 320

Met His Gly Ala Gly Ala Val Ile Ala Phe Glu Leu His Gly Asp Ile

325 330 335

Asn Thr Ala Arg Gln Leu Leu Asp Ser Leu Gln Leu Ile Thr Ile Ala

340 345 350

Val Ser Leu Gly Asp Ala Glu Thr Leu Ile Gln His Pro Thr Ser Met

355 360 365

Thr His Ser Pro Tyr Thr Pro Glu Ala Arg Ala Ala Ala Gly Ile Ser

370 375 380

Asp Thr Leu Ile Arg Ile Ser Val Gly Leu Glu Ala Val Glu Asp Ile

385 390 395 400

Ile Ala Asp Leu Glu Gln Ala Phe Ala Ala Cys Ala Asn Ser Gln Ile

405 410 415

Thr Thr Thr Gly Glu Gln Val Arg Tyr Gly

420 425

Claims

1.一种来自深海宏基因组的L-蛋氨酸裂解酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2. 包含如权利要求1所述的基因的重组表达载体。

3. 用如权利要求2所述的重组表达载体转化宿主细胞所得的转化体。

4. 根据权利要求3所述的转化体，为重组工程菌菌株E.coli Pmet，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: M 209255。

5. 一种L-蛋氨酸裂解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6. 如权利要求5所述的L-蛋氨酸裂解酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：构建包含来自深海宏基因组的L-蛋氨酸裂解酶基因的重组表达载体，所述L-蛋氨酸裂解酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；用所述重组表达载体转化宿主细胞，获得转化体；培养所述的转化体，诱导表达并回收所表达的具有催化L-蛋氨酸裂解活性的蛋白产物。

7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：诱导表达时，诱导温度为20℃；诱导剂为IPTG，其终浓度为0.1mM；诱导时间为14小时。

8. 根据权利要求5所述的L-蛋氨酸裂解酶的用途，包括：

用于制备治疗癌症的药物的应用；

用于制备检测环境中蛋氨酸和/或同型半胱氨酸含量的检测试剂的应用；

用于制备改进食品风味的制试剂的应用；以及

用于合成α-氨基丁酸的应用。