CN103361321B - 一种ssDNA-蛋白质酶法交联方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种ssDNA-蛋白质酶法交联方法，包括以下步骤：（1）制备proA*与目标蛋白的融合蛋白，proA*来源于噬菌体ΦX174；（2）融合蛋白与ssDNA交联，ssDNA含有识别和结合序列。利用proA*可以识别、切割并催化特定序列的ssDNA与自身酪氨酸残基通过形成酯键相偶联的特性，以LDH为模式蛋白建立蛋白质与ssDNA高效交联的通用方法。本发明交联时引入的蛋白proA*不但不会影响其活力，而且对保持酶的活力有一定的辅助作用。本发明所实施的交联反应是在反应缓冲液中通过融合蛋白对于底物DNA序列的识别实现的，本发明所提供的方法高效、快速、简单、经济，具有巨大的实用性与通用性。

Description

一种ssDNA-蛋白质酶法交联方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地讲，属于ssDNA与蛋白质酶法交联的生物技术领域。

背景技术

DNA-蛋白质交联物是一种用途广泛的分子工具，当ssDNA与蛋白质交联后，可以利用序列互补的一条ssDNA，指导这些ssDNA-蛋白质交联物在空间的有序排布，因而具有广泛的用途。ssDNA-蛋白质交联物主要被应用于以下方面：（1）检测核酸或蛋白质；（2）制备生物芯；（3）制备具有定量关系的链亲和素网络；（4）构建多酶体系。

尽管ssDNA-蛋白质交联物有着非常广泛的应用，但是ssDNA-蛋白交联物的合成却较为困难。目前，制备ssDNA-蛋白质交联物的方法主要包括以下几种：（1）目标蛋白与链亲和素融合，ssDNA进行生物素化修饰，通过链亲和素与生物素的特异性相互作用而达到交联的目的；（2）目标蛋白表达出组氨酸标签（His），ssDNA进行适当修饰，借助Ni²⁺使彼此结合在一起，形成Ni-NTA-His6的形式；（3）借助辅因子作用重构不含辅基的蛋白（酶）为全酶（functional holoenzyme）实现交联；（4）完全采用化学交联，利用双功能试剂的交联作用；（5）利用特定的转移酶实现蛋白质的交联。以上已经报道的用于ssDNA与蛋白质交联的方法中，一般存在如下问题：（1）步骤繁琐。多涉及多次的纯化过程，步骤十分繁琐。多步的纯化会严重影响ssDNA-蛋白质交联物的产量。此外，繁琐的操作，也会使不稳定的酶不断失活，而最终失去应用的价值。（2）效率较低。基于化学偶联反应的交联方法，只有基团特异性（对应于特定氨基酸残基种类），无法保证特异性。因此，很难保证交联物的一致性，无法实现对特定位点的标记。（3）无法实现对多亚基蛋白的单亚基特异性偶联。许多蛋白是同型亚基组成的多聚体，传统的标记方法在通常情况下标记的结果是每个亚基都被标记，这在一定程度上增加了其活性受到标记影响的可能性。

来自噬菌体的蛋白质A*（proA*），是基因A内部包含的一个较小的阅读框编码的产物。生物化学研究表明，该蛋白质可以结合ssDNA，针对特定序列进行切割，并将切割后的ssDNA链通过与该蛋白中的酪氨酸残基通过形成酯键的方式连接起来。因此提供了一种借助酶、特异性标记蛋白质进行交联的可能。

鉴于现存的ssDNA-蛋白质交联反应存在的不足以及ssDNA-蛋白质交联物在各个方面有着广泛的应用，开发一种通用、简便、高效的ssDNA-蛋白质交联技术显得尤其必要。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种通用、简便、高效的ssDNA-蛋白质酶法交联方法。

本发明的第二个目的在于提供来源于噬菌体ΦX174的蛋白proA*（proteinID:NP_040704）在ssDNA-蛋白质酶法交联方法中的应用。

本发明的第三个目的在于提供ssDNA-蛋白质酶法交联方法在制备蛋白质和/或酶-ssDNA交联物中的应用。

为实现以上第一个目的，本发明公开以下技术方案：一种ssDNA-蛋白质酶法交联方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备proA*与目标蛋白的融合蛋白，所述proA*（protein ID:NP_040704）来源于噬菌体ΦX174；

（2）融合蛋白与ssDNA交联，所述ssDNA含有识别和结合序列。

作为一个优选方案，步骤（1）中目标蛋白为乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)，制备LDH-A*融合蛋白包括以下步骤：

（1）构建含有LDH-A*融合蛋白基因的重组质粒pET28a-LDH-A*；

（2）将（1）构建的重组质粒转入宿主菌株得到重组菌；

（3）使用2×YT培养基进行发酵，使用终浓度为0.5mM IPTG进行诱导，在30℃的诱导温度下培养8小时；

（4）对发酵后的菌体超声破碎；

（5）使用Ni-NTA亲和柱进行融合蛋白的纯化，洗脱缓冲液：20mMTris-HCl，0.5M NaCl，400mM咪唑，pH7.4；

（6）收集洗脱峰样品进行透析处理，即制得LDH-A*融合蛋白。

为了获得理想的表达量，对培养基、表达条件等进行了初步的探索和优化，筛选出了最优培养基、表达条件等。采用SDS-PAGE电泳检测发现，在实验中，E.coli BL21(DE3)/pET28a-LDH-A*的表达产物融合蛋白LDH-A*，其中，可溶表达量达到25-35%。通过Ni-NTA亲和柱进行蛋白的纯化，最终制备LDH-A*融合蛋白。

作为一个优选方案，构建pET28a-LDH-A*设计的引物如下：

为构建重组质粒pET28a-LDH设计如下引物：

LDH上游引物LF1:CTAGCTAGCATGGCAAGTATTACGGATAAGGATCACC；（SEQ ID NO.1）

LDH下游引物LF2:CCGCTCGAGTTACTGACGGGTTTCGATGTCG；（SEQ ID NO.2）

为构建重组质粒pET28a-LDH-A*设计如下引物：

LDH上游引物LAF1:CTAGCTAGCATGGCAAGTATTACGGATAAGG；（SEQ ID NO.3）

LDH下游引物LAF2:CCAGAGCCGCCGCCGCCAGAGCCGCCGCCGCCCTGACGGGTTTCGATGTCATTCTTAG；（SEQ ID NO.4）

proA*上游引物LAF3:TCTGGCGGCGGCGGCTCTGGCGGCGGCGGCTCTATGAAGAGCCGCCGTGGTTTTACGAT；（SEQ ID NO.5）

proA*下游引物LAF4:GCCCTCGAGTCATTTACCGCCCGCCGTCCACTTG。（SEQ ID NO.6）

作为又一个优选方案，步骤（2）交联反应缓冲液的成分如下：4×：Tris-HCl200mM，NaCl600mM，DTT20mM，MgCl₂20mM，pH7.5。

作为又一个优选方案，步骤（2）融合蛋白与ssDNA摩尔质量比为1：2。

作为又一个优选方案，步骤（2）交联反应温度为37℃，时间为5-30min，优选10min。

为了实现本发明第二个目的，本发明公开来源于噬菌体ΦX174的蛋白proA*在ssDNA-蛋白质酶法交联方法中的应用，其特征在于，所述ssDNA含有识别和结合序列，蛋白proA*在二价金属离子的作用下在体外识别、切割并催化特定序列的ssDNA与自身酪氨酸残基Tyr通过形成酯键相偶联。

为了实现本发明第三个目的，本发明公开ssDNA-蛋白质酶法交联方法在制备蛋白质和/或酶-ssDNA交联物中的应用。

通过对底物ssDNA进行荧光标记，在对交联反应产物进行透析处理后，检测荧光激发峰与发射峰信号来判断是否已经交联成功。融合蛋白与底物ssDNA发生交联反应后，交联物与未交联蛋白相比分子量增加，这可以通过SDS-PAGE电泳判断，通过分析不同时间点反应产物的SDS-PAGE电泳图来定量判断反应的产率，定性分析反应的速度。

本发明的优点在于：本发明利用proA*可以识别、切割并催化特定序列的ssDNA与自身酪氨酸残基（Tyr）通过形成酯键相偶联的特性，以乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)为模式蛋白建立蛋白质与ssDNA高效交联的通用方法，可以应用于不同蛋白质与ssDNA的交联，相对于现在已报道的方法，更具通用性，过程更加简单，效率更高，具有普遍适用性。反应所需温度条件较为温和(37℃)，在二价金属离子作用下即可进行，反应容易实施，也更加简便、经济。通过对比LDH-A*融合蛋白与原LDH酶活性表明，本发明交联时引入的蛋白proA*不但不会影响其活力，而且对保持酶的活力有一定的辅助作用。

附图说明

图1重组质粒pET18a-LDH质粒图谱。

图2重组质粒pET28a-LDH-A*质粒图谱。

图3表达LDH的重组E.coli在2×YT培养基中诱导表达产物及蛋白纯化电泳图，1：Marker，2：重组菌BL21(DE3)全菌体，3：菌体破碎上清，4：菌体破碎沉淀，5：20mM咪唑洗脱液，6：400mM咪唑洗脱液，7：纯化后目的蛋白。

图4表达LDH-A*的重组E.coli在2×YT培养基中诱导表达产物及蛋白纯化电泳图，1：Marker，2：重组菌BL21(DE3)全菌体，3：菌体破碎上清，4：菌体破碎沉淀，5：流穿液，6：20mM咪唑洗脱液，7：50mM咪唑洗脱液，8：400mM咪唑洗脱液。

图5交联物及交联产物透析液荧光激发光谱，左为交联物荧光激发光谱，右为交联产物透析液荧光激发光谱。

图6交联物及交联产物透析液荧光发射光谱，左为交联物荧光发射光谱，右为交联产物透析液荧光发射光谱。

图7交联反应随时间变化所得产物SDS-PAGE电泳图，1：Marker，2：0min反应产物，3：2min反应产物，4：5min反应产物，5：10min反应产物，6：30min反应产物。

图8交联反应随时间变化产率图

图9为ssDNA-蛋白质酶法交联反应优选获得的流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.ssDNA-蛋白质酶法交联方法

在本发明的实施方式中，首先进行材料选择：

质粒与菌株，质粒pET-28a(+)(Novagen,USA)，重组质粒pET28a-LDH和pET28a-LDH-A*为本发明构建，大肠杆菌DH5α(Novagen,USA,实验室保存)作为质粒扩增菌株，E.coli BL21(DE3)(Novagen,USA,实验室保存)作为质粒表达菌株。

试剂与培养基，异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside,IPTG)、硫酸卡那霉素购自Sigma-Aldrich公司，Ni-NTA亲和柱购自Biorad公司，限制酶(Nhe I,Xho I)、PCR酶、T₄DNA连接酶购自宝生物工程公司，质粒快速抽提试剂盒、Agarose Gel DNA纯化试剂盒购自生工生物工程公司，LB培养基：酵母提取物(5g/L)、胰化蛋白胨(10g/L)、氯化钠(10g/L)，2×YT培养基：酵母提取物(10g/L)、胰化蛋白胨(16g/L)、氯化钠(5g/L)。其他的生化试剂属于常规的分析纯试剂。

DNA电泳缓冲液(TAE)储存液（每升）：50×：242g Tris，57.1ml冰醋酸，100ml0.5M EDTA(pH8.0)。

DNA电泳胶（每100ml1%琼脂糖电泳胶）：1g琼脂糖加入100ml TAE，加热溶解，待冷却50-60℃左右，加入100×Gel Red，插好梳子，倒胶。

蛋白电泳缓冲液（Tris-甘氨酸）储存液（每升）：5×：15.1g Tris，94g甘氨酸（电泳级，pH8.3），50ml10%SDS（电泳级）。

12%蛋白电泳分离胶：ddH₂O3.3ml，1.5M Tris-HCl（pH8.8）2.5ml，10%SDS100μL，30%丙烯酰胺4.0ml，10%APS100μL，TEMED4μL。

5%蛋白电泳浓缩胶：ddH₂O3.15ml，1.0M Tris-HCl（pH6.8）0.57ml，10%SDS45μL，30%丙烯酰胺0.75ml，10%APS45μL，TEMED4.5μL。

考马斯亮蓝染色液（每升）：400ml乙醇，500ml去离子水，100ml冰醋酸，2g考马斯亮蓝R-250，过滤。

脱色液（每升）：400ml乙醇，500ml去离子水，100ml冰醋酸。

组氨酸标签蛋白纯化缓冲液：

结合缓冲液：20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH7.4。

洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，400mM咪唑，pH7.4。

重组质粒pET28a-LDH与pET28a-LDH-A*的构建

通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）扩增乳酸脱氢酶基因片段及蛋白proA*基因片段，并连接两段基因。

为构建重组质粒pET28a-LDH设计如下引物：

LDH上游引物LF1:CTAGCTAGCATGGCAAGTATTACGGATAAGGATCACC（SEQ ID NO.1）；

LDH下游引物LF2:CCGCTCGAGTTACTGACGGGTTTCGATGTCG（SEQID NO.2）；

为构建重组质粒pET28a-LDH-A*设计如下引物：

LDH上游引物LAF1:CTAGCTAGCATGGCAAGTATTACGGATAAGG（SEQ ID NO.3）；

LDH下游引物LAF2:CCAGAGCCGCCGCCGCCAGAGCCGCCGCCGCCCTGACGGGTTTCGATGTCATTCTTAG（SEQ ID NO.4）；

proA*上游引物LAF3:TCTGGCGGCGGCGGCTCTGGCGGCGGCGGCTCTATGAAGAGCCGCCGTGGTTTTACGAT（SEQ ID NO.5）；

proA*下游引物LAF4:GCCCTCGAGTCATTTACCGCCCGCCGTCCACTTG（SEQ ID NO.6）；

构建重组质粒pET28a-LDH

PCR体系（50μL）如下：

模板：1μL，引物：2×2μL，dNTP（2.5mM）：4μL，10×buffer for pfuDNA polymerase5μL，pfu DNA polymerase：1μL，ddH₂O35μL。

LDH基因片段PCR反应条件：

预变性：95℃3min，变性：95℃30sec，复性：55℃20sec，延伸：72℃110sec，30次循环，终延伸：72℃7min。

分别对PCR扩增产物LDH基因片段和载体pET28a(+)进行双酶切(Nhe I,Xho I)，酶切体系如下：

Nhe I1μL，Xho I1μL，10×M buffer3μL，DNA7μL，ddH₂O18μL。

酶切时间：8h，酶切温度：37℃。

胶回收，连接。

连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落通过PCR验证，PCR验证后进行基因测序；结果正确，重组质粒pET28a-LDH构建成功。

构建重组质粒pET28a-LDH-A*

LDH基因片段PCR反应条件：

预变性：95℃3min，变性：95℃30sec，复性：55℃20sec，延伸：72℃110sec，30次循环，终延伸：72℃7min。

proA*基因片段PCR反应条件：

预变性：95℃3min，变性：95℃30sec，复性：50℃20sec，延伸：72℃120sec，30次循环，终延伸：72℃7min。

LDH与proA*基因片段的连接：

第一步，以扩增的LDH和proA*基因片段为模板进行PCR扩增，以获得LDH-A*作为扩增的模板。

PCR体系（20μL）如下：

LDH基因片段：8μL，proA*基因片段：4μL，dNTP（2.5mM）：2μL，10×buffer for pfu DNA polymerase2μL，pfu DNA polymerase：1μL，ddH₂O3μL。

PCR反应条件：

预变性：95℃3min，变性：95℃30sec，复性：64℃20sec，延伸：72℃120sec，6次循环，终延伸：72℃7min。

第二步，以LDH-A*为模板，以LAF1和LAF4为引物，通过PCR扩增获取大量LDH-A*基因片段。

PCR体系（50μL）如下：

模板：1μL，引物：2×2μL，dNTP（2.5mM）：4μL，10×buffer for pfuDNA polymerase5μL，pfu DNA polymerase：1μL，ddH₂O35μL。

PCR反应条件：

预变性：95℃3min，变性：95℃30sec，复性：65℃20sec，延伸：72℃220sec，30次循环，终延伸：72℃7min。

分别对PCR扩增产物LDH-A*基因片段和载体pET28a(+)进行双酶切（NheI,Xho I），酶切体系如下。

Nhe I1μL，Xho I1μL，10×M buffer3μL，DNA7μL，ddH₂O18μL。

酶切时间：8h，酶切温度：37℃。

胶回收，连接。

连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落通过PCR验证，PCR验证后进行基因测序，结果正确，重组质粒pET28a-LDH-A*构建成功。

同时，本发明平行构建了重组质粒pET28a-LDH，并在接下来的表达纯化过程中平行操作，以考察融合蛋白proA*前后对于酶活性的影响。

融合蛋白的表达及表达条件优化

本发明将已构建好且测序正确的重组质粒pET28a-LDH和pET28a-LDH-A*分别转化BL21（DE3）感受态细胞中，挑取转化子转入5ml LB培养基中（50μg/ml卡那霉素），200rpm，37℃过夜培养。将过夜的新鲜菌液1:100转入100ml LB培养基中，200rpm、37℃，待OD600达到0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mM，37℃诱导培养8小时，停止培养，4℃离心5min，转速8000rpm，弃去上清，向菌体中加入超声裂解液（Lysis buffer）充分重悬菌体后超声破碎菌体，超声条件：100w，超3s停5s，99次循环，冰浴。超声结束后，液体为澄清状。

超声结束后12000rpm，4℃，12min离心，收集沉淀和上清，SDS-PAGE电泳鉴定，在超声上清液中存在目的蛋白，蛋白以可溶性形式表达，但通过对电泳图灰度分析结果显示目的蛋白所占比例较低，因此本发明接下来可以通过对表达条件进行优化，以提高可溶蛋白的含量。

优化工程菌表达条件，为提高表达量本发明选取2×YT培养基进行发酵，从诱导温度、IPTG浓度、诱导时间等进行优化，以优选出最佳的表达条件。

不同温度诱导条件下相对比，37℃条件下诱导，细胞的生长密度及融合蛋白的表达水平都是最高，但可溶蛋白所占比例较低。30℃条件下诱导，细胞的生长相对于37℃没受很大影响，且融合蛋白的表达水平也仅有少量下降，但可溶的目标蛋白所占的比例却有明显升高。20℃条件下诱导，细胞的生长密度及融合蛋白的表达水平均有显著下降，可溶目标蛋白的比例也有增加。可能的原因是降低温度可以增加折叠中间体的稳定性，使折叠中间体在热力学上处于更利于折叠的构象。结合细胞生长速度、融合蛋白的表达水平、可溶目标蛋白所占比例等因素，本发明选用30℃作为可溶表达诱导温度。

融合蛋白的纯化和酶活性检测及对比

纯化6×His-LDH和6×His-LDH-A*融合蛋白

组氨酸标签纯化的原理：多聚组氨酸亲和标签(6×His)纯化蛋白的原理是组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨酸含有一个咪唑基团，这一化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，能够与多种金属离子如Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Co²⁺等发生亲和作用，亲和层析就是利用这一原理进行吸附的，然后利用不同浓度的咪唑进行洗脱，从而实现蛋白质的分离纯化。

本发明按照以下步骤进行纯化

Ni-NTA亲和柱的准备，使用1ml体积的Ni-NTA亲和柱进行纯化，用5个柱体积ddH₂O进行冲洗，目的是洗去柱子中含有的乙醇，而后用5个柱体积的结合缓冲液平衡柱子。

样品的制备，根据融合蛋白的表达及表达条件优化的结果及过程操作，进行融合蛋白的诱导、表达、菌体超声破碎、离心获取上清液。

上样于Ni-NTA亲和层析柱，待上样完成用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰样，对收集的样品进行透析处理，透析液为50mM Tris-HCl，pH7.4。

蛋白浓度测定采用考马斯亮蓝染色法（Bradford Method）。具体原理：考马斯亮蓝G-250存在红色和蓝色两种不同的颜色形式，蛋白与染料结合后最大吸光值有465nm变成595nm，通过测定595nm波长出光吸收的增加量便可知道蛋白质的量。标准曲线的测定，本发明中配制1g牛血清蛋白标准溶液，用PBS稀释成一系列浓度不同的溶液，按照Bradford Method测得标准曲线为y=0.0043x+0.0136，其中y为OD₅₉₅，x为牛血清蛋白浓度(μg/ml)。

酶活性检测及对比

本发明采用分光光度法测定酶的还原反应活力，LDH在pH7.4-7.8具有还原反应的催化活力，可以催化丙酮酸转化为乳酸，同时伴随着辅酶NADH到NAD+的转化，本发明测LDH及LDH-A*活力，是在一定条件下，向含丙酮酸及NADH的溶液中，加入一定量酶液，观察NADH在反应过程中340nm处光吸收减少值，减少越多，则酶活力越高，本发明定义酶比活单位：每分钟每毫克酶催化的反应中，NADH的减少量。

构建1ml LDH酶活力测定体系如下：

NADH2μL（0.1mM），丙酮酸5μL（2mM），磷酸钠缓冲液983μL（100mM,pH7.5），酶10μL，LDH浓度0.82mg/ml。

构建1ml LDH-A*酶活力测定体系如下：

NADH2μL（0.1mM），丙酮酸5μL(2mM)，磷酸钠缓冲液893μL（100mM,pH7.5），酶100μL，LDH浓度0.18mg/ml。

NADH母液浓度50mM，丙酮酸母液浓度40mM。

37℃反应10min，光程5mm分别测定340nm处吸光度的减少量，LDH为0.014，LDH-A*为0.024。

酶活力LDH-A*：LDH=1.65

由此可知，proA*与LDH的融合不仅对于原来酶没有影响，且有助于保持酶的活力。更有有利于DNA-蛋白质交联物的广泛应用。

融合蛋白LDH-A*与底物ssDNA交联反应的实施

底物ssDNA序列：5’-TCGACAACTTGATATTAATAACACTATAGAC-3’（SEQ ID NO.7），proA*可以特异性识别底物ssDNA序列并且针对特定序列进行切割，将切割后的ssDNA链通过与该蛋白中的酪氨酸残基通过形成酯键的方式连接起来。

通过融合proA*，LDH可以在不需要其他酶与生物分子的情况下，仅仅通过二价金属离子的作用即可实现与底物ssDNA的交联。

反应缓冲液成分如下：4×：Tris-HCl200mM，NaCl600mM，DTT20mM，MgCl220mM，pH7.5。

构建反应体系如下（300μL）：

LDH-A*3μM，底物DNA6μM，4×反应缓冲液75μL，ddH₂O加至300μL。

反应条件：37℃，反应时间：30min。

在0min、2min、5min、10min、30min时间点分别取样。

ssDNA-蛋白质交联物的荧光检测及SDS-PAGE电泳检测

荧光检测和SDS-PAGE电泳在生物学领域是较为成熟、常用的检测方法。

荧光素在蓝光或者紫外的照射下可以发出绿色荧光，常被用作荧光示踪物。6-羧基荧光素是荧光素衍生物的一种，最大激发波长为492nm，最大发射波长为518nm（pH=9.0），具有荧光素衍生物的普遍特性。本发明使用6-羧基荧光素（6-FAM）对底物ssDNA的3’端进行标记，通过对荧光信号的检测来判断交联反应是否进行。

首先，对进行DNA-蛋白质交联反应之后的产物透析，将没有参与反应的底物DNA透析掉。

然后，使用荧光酶标仪对透析处理后的交联产物及透析液进行荧光检测。根据检测结果可得到激发光谱图及发射光谱图，如图5、图6所示，由于在透析处理的样品及透析液中检测到了492nm波长附近激发峰和518nm波长附近发射峰的存在，可以判断交联反应成功进行。

DNA-蛋白质交联反应进行之后，与未发生反应的蛋白质相比，交联物的分子量将增加，本发明通过SDS-PAGE电泳技术展示出反应前后在分子量方面的差异。具体步骤如下：

配制11%蛋白电泳分离胶：ddH₂O3.6ml，1.5M Tris-HCl（pH8.8）2.5ml，10%SDS100μL，30%丙烯酰胺3.7ml，10%APS100μL，TEMED4μL。

5%蛋白电泳浓缩胶：ddH₂O3.15ml，1.0M Tris-HCl（pH6.8）0.57ml，10%SDS45μL，30%丙烯酰胺0.75ml，10%APS45μL，TEMED4.5μL。

用4×蛋白上样缓冲液处理样品，每孔上样30μL进行不连续垂直电泳。当溴酚蓝染料处于浓缩胶中时，电压为80V，当染料进入分离胶后，电压升至120V，直至染料电泳出分离胶。

经过染色，脱色处理后即可展示出电泳结果。

通过对不同时间点的电泳图进行灰度分析获得交联反应的产率及反应速率。如图8，在10min后交联物产量即不再变化。本发明优选反应时间为10min，本发明所提供的交联方法高效且迅速，具有通用性。

本发明采用的是通过构建重组原核表达质粒，来实现蛋白proA*与目的蛋白的融合，然后借助于蛋白proA*具有识别、切割并催化特定序列的ssDNA与自身酪氨酸残基（Tyr）通过形成酯键相偶联的特性来实现目的蛋白与底物DNA的交联。通过构建重组表达质粒制备融合蛋白的方法是一种通用的分子生物学方法，因此本发明是以乳酸脱氢酶(LDH)为模式蛋白建立蛋白质与ssDNA高效交联的通用方法。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种ssDNA-蛋白质酶法交联方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备proA*与目标蛋白的融合蛋白，所述proA*来源于噬菌体ΦX174，其protein ID: NP_040704；

（2）融合蛋白与ssDNA交联，所述ssDNA含有识别和结合序列。

2.根据权利要求1所述的一种ssDNA-蛋白质酶法交联方法，其特征在于，步骤（1）中目标蛋白为乳酸脱氢酶LDH，制备LDH-A*融合蛋白包括以下步骤：

（1）构建含有LDH-A*融合蛋白基因的重组质粒pET28a-LDH-A*；

（2）将（1）构建的重组质粒转入宿主菌株得到重组菌；

（3）使用2×YT培养基进行发酵，使用终浓度为0.5mM IPTG进行诱导，在30℃的诱导温度下培养8小时；

（4）对发酵后的菌体超声破碎；

（5）使用Ni-NTA亲和柱进行融合蛋白的纯化，洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，400mM 咪唑，pH7.4；

（6）收集洗脱峰样品进行透析处理，即制得LDH-A*融合蛋白。

3.根据权利要求2所述的一种ssDNA-蛋白质酶法交联方法，其特征在于，构建pET28a-LDH-A*设计的引物如下：

为构建重组质粒pET28a-LDH设计如下引物：

LDH上游引物LF1: CTAGCTAGCATGGCAAGTATTACGGATAAGGATCACC；

LDH下游引物LF2: CCGCTCGAGTTACTGACGGGTTTCGATGTCG；

为构建重组质粒pET28a-LDH-A*设计如下引物：

LDH上游引物LAF1: CTAGCTAGCATGGCAAGTATTACGGATAAGG；

LDH下游引物LAF2:CCAGAGCCGCCGCCGCCAGAGCCGCCGCCGCCCTGACGGGTTTCGATGTCATTCTTAG；

proA*上游引物LAF3: TCTGGCGGCGGCGGCTCTGGCGGCGGCGGCTCTATGAAGAGCCGCCGTGGTTTTACGAT；

proA*下游引物LAF4: GCCCTCGAGTCATTTACCGCCCGCCGTCCACTTG。

4.根据权利要求1所述的一种ssDNA-蛋白质酶法交联方法，其特征在于，步骤（2）交联反应缓冲液的成分如下：4×：Tris-HCl 200mM，NaCl 600mM，DTT 20mM，MgCl₂ 20mM，pH 7.5。

5.根据权利要求1所述的一种ssDNA-蛋白质酶法交联方法，其特征在于，步骤（2）融合蛋白与ssDNA摩尔质量比为1：2。

6.根据权利要求1所述的一种ssDNA-蛋白质酶法交联方法，其特征在于，步骤（2）交联反应温度为37℃，时间为5-30min。

7.根据权利要求6所述的一种ssDNA-蛋白质酶法交联方法，其特征在于，交联反应时间为10min。

8.来源于噬菌体ΦX174的蛋白proA*在权利要求1所述ssDNA-蛋白质酶法交联方法中的应用，其特征在于，所述ssDNA含有识别和结合序列，蛋白proA*在二价金属离子的作用下在体外识别、切割并催化特定序列的ssDNA 与自身酪氨酸残基Tyr通过形成酯键相偶联。

9.权利要求1所述的一种ssDNA-蛋白质酶法交联方法在制备蛋白质和/或酶-ssDNA交联物中的应用。