CN108728558A - 一种快速检测溶血性曼氏杆菌的pcr扩增引物及其应用 - Google Patents

一种快速检测溶血性曼氏杆菌的pcr扩增引物及其应用 Download PDF

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马春霞
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Abstract

本发明公开一种快速检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增引物及其应用，属于动物细菌学及分子生物学技术领域。所述PCR扩增引物由具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物组成；上述引物用于制备检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增试剂盒。该试剂盒提供的PCR检测方法具有高度的特异性和敏感性，重复性好，可信度高，快速准确的获得检测结果，同时价格低廉、操作简便，解决了传统鉴别方法分离率低，耗时费力等不足，适合基层使用，可作为溶血性曼氏杆菌实验室快速检测和大规模流行病学调查的一种快速、准确、简便的检测工具。

Description

一种快速检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增引物及其应用
技术领域
本发明涉及动物细菌学及分子生物学技术领域，具体涉及一种快速、简便、低成本检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增引物及其应用。
背景技术
溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica ）属于巴氏杆菌科，为革兰阴性的球杆菌，是存在于牛、绵羊、山羊等反刍动物以及其他多种动物上呼吸道的常在菌和机会致病菌。在某些诱发因素作用下，溶血性曼氏杆菌可导致上述动物引发致死性肺炎。病毒和支原体的感染使得机体溶血性曼氏杆菌更易感，如副流感病毒及绵羊肺炎支原体等。此外，环境骤变、运输等造成的机体应激以及动物整体健康状况降低均可以使这两种细菌引发呼吸道疾病或影响疾病的严重程度。目前，溶血性曼氏杆菌在全球范围内均有分布，给养牛业、养羊业造成了重大的经济损失。在临床上，溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌不仅可以单独感染，两者也可以继发感染或混合感染，且引起的呼吸道症状相似，这为采取针对性的防治措施带来困难。
常规的鉴别溶血性曼氏杆菌的方法是病原分离鉴定，即通过对细菌的表型特征和生化指标进行鉴定，但该鉴定方法存在费时费力等缺点。此外，由于溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌在形态大小、染色特性等方面极为相似，为准确鉴别这两种细菌的造成困难，并且经常无法准确鉴别这两种细菌。因此，建立一种可以快速、准确检测和鉴定溶血性曼氏杆菌的方法在实验室检测和流行病学调查方面具有重要的应用价值。
发明内容
本发明目的是提供低成本、快速、准确地检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增引物及其应用。为实现本发明目的，使用如下的技术方案：
本发明提供一种快速检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增引物，是依据溶血性曼氏杆菌gcp基因进行设计，扩增的目的片段大小为220 bp，所述PCR扩增引物引物的序列分别为：
Forward primer：5ˊ- GGGCAATACGAACTACTCGG -3ˊ SEQ ID NO:1
Reverse primer：5ˊ- TCGTATTCGCAGCAAAGGTT -3ˊ SEQ ID NO:2
使用前将引物浓度稀释至25 pmol/μL。
优选的，将所述PCR 扩增引物在制备检测溶血性曼氏杆菌试剂盒的应用。
本发明还提供一种快速检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增试剂盒，所述PCR扩增试剂盒包括具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物。
优选的，，所述PCR扩增试剂盒还包括PCR预混液和RNase-Free water；所述的PCR预混液由PCR Buffer、dNTPs、ES-Taq DNA组成，利用快速检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增试剂盒建立PCR扩增方法，其反应体系建立以25 μL计，其中
PCR 预混液 12.5 μL
Forward primer（25 pmol/μL） 1μL
Reverse primer（25 pmol/μL） 1μL
DNA模板 3 μL
RNase-Free water 补足25 μL。
DNA模板使用细菌基因组DNA提取试剂盒（CW0552S，北京康为世纪生物科技有限公司）提取溶血性曼氏杆菌及其对照细菌培养物或组织样品的细菌基因组DNA。
优选的，所述PCR扩增试剂盒中PCR反应程序为95℃ 5 min；随后进行35个95℃ 30s，60℃ 30 s，72℃30 s的循环；最后72℃延伸5 min。
优选的，所述的快速检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增试剂盒，包括以下组分：
①PCR预混液：包含PCR Buffer、dNTPs、ES-Taq DNA
②RNase-Free water（灭菌双蒸水）
③PCR扩增引物： Forward primer和Reverse primer
④阳性对照：含有溶血性曼氏杆菌特异性核酸片段的重组质粒。
结果判定
所述的结果判定是采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法：将PCR扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察是否有目的条带。首先阳性对照和阴性对照成立，如果从样品中扩增出了220 bp的特异性条带，则说明该样品存在溶血性曼氏杆菌；如果样品没有扩增出220bp的特异性条带，则说明该样品不含有溶血性曼氏杆菌。
本发明的实质性特点和显著的进步是：
1）特异性强
本发明提供的溶血性曼氏杆菌的PCR扩增引物具有高度特异性，特异性检测出溶血性曼氏杆菌，所检测的阴性对照病原菌如隐秘杆菌、克雷伯氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、牛支原体和水对照均无阳性结果。
2）灵敏度高，检测结果准确
使用传统方法检测溶血性曼氏杆菌—体外分离培养，当样品的溶血性曼氏杆菌含量较低时，或者样品在保存运输不当时导致病原菌失活，会出现分离不到病原菌的情况，因而做出该样品不存在溶血性曼氏杆菌的误判。
本发明提供的溶血性曼氏杆菌的PCR扩增引物具有灵敏度高的特点，最小检测限为0.855×10-4 ng/μL。即使样品中溶血性曼氏杆菌含量低或已经失活，使用本发明的PCR扩增引物进行扩增也可以检测到，因而做出正确的判定。
3）耗时少，迅速获得结果
传统方法检测鉴别溶血性曼氏杆菌的方法为：病原菌分离鉴定，溶血性曼氏杆菌在血平板上需要20小时以上才长出明显菌落。生化试验通常耗时24-72小时，做出正确的鉴定将花费3-4天时间，该方法耗时费力，且分离率低，不能很好的确定样品中是否存在溶血性曼氏杆菌。利用本发明提供的溶血性曼氏杆菌PCR扩增引物所建立的检测方法，在时间成本、工作量等方面具有明显的优势，从核酸提取到琼脂糖凝胶电泳进行结果分析判定，可在5小时内完成。
4）准确性高、稳定性好
用浓度为0.855×101 ng/μL、0.855×100 ng/μL、0.855×10-1 ng/μL、0.855×10-2 ng/μL、0.855×10-3 ng/μL的重组质粒标准样品同时进行PCR，分别重复3次检测。结果显示3次扩增的结果一致，表明建立的PCR检测方法的反应体系重复性好。
附图说明
图1是退火温度筛选试验结果，其中M：DNA marker 100 bp ladder 、1：45℃、2：47℃、
3：49℃、4：51℃、5：53℃、6：55℃、7：57℃、8：水对照。
图2是特异性检测结果：其中M：DNA marker 100bp ladder、1：溶血性曼氏杆菌、2：隐秘杆菌、3：克雷伯氏菌、4：大肠杆菌、5：沙门氏菌、6：巴氏杆菌、7：牛支原体；8：水对照。
图3是敏感性检测结果：其中M：DNA marker 100bp ladder、1：0.855×10 ng/μL、2：0.855×100 ng/μL、3：0.855×10-1 ng/μL、4：0.855×10-2 ng/μL、5：0.855×10-3 ng/μL、6：0.855×10-4 ng/μL、7：0.855×10-5 ng/μL；8：水对照。
图4是临床样品检测电泳图：其中M：DNA marker 100bp ladder，P为阳性对照，N为阴性对照；泳道3、4、8、12、13、14、16、17、18、19为阴性结果；泳道1、2、5、6、7、9、10、11、15为阳性结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1、材料的准备
溶血性曼氏杆菌、隐秘杆菌、克雷伯氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、牛支原体为广西兽医研究所分离鉴定保存，组织样品来自兽医临床。PCR预混液、细菌基因组DNA提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。
2 、PCR引物的设计与合成
下载GenBank 中的溶血性曼氏杆菌gcp基因序列，进行同源性比较分析筛选，选择保守序列区作为扩增区域，设计出特异性扩增引物，其中引物的序列分别为：
Forward primer：5ˊ- GGGCAATACGAACTACTCGG -3ˊ SEQ ID NO:1
Reverse primer：5ˊ- TCGTATTCGCAGCAAAGGTT -3ˊ SEQ ID NO:2
扩增的目的基因片段大小为220 bp，
上、下游引物使用前稀释到25 pmol/μL。
3、模板DNA的提取
样品处理：
病原菌培养物：取适量至于灭菌离心管中，若为液体培养物，则离心后去上清，取沉淀。
组织样品：首先进行研磨，反复冻融，离心后取上清。
再使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取病原菌基因组DNA。
4、PCR反应体系建立
所述的快速检测溶血性曼氏杆菌的PCR方法，其反应体系建立以25μL计
PCR 预混液 12.5 μL
Forward primer（25 pmol/μL） 1μL
Reverse primer（25 pmol/μL） 1μL
DNA模板 3 μL
RNase-Free water 补足25 μL。
5、PCR反应程序
所述的快速检测溶血性曼氏杆菌的PCR方法的反应程序，首选进行最佳退火温度确定试验，确定退火温度后，使用的PCR反应程序为95℃ 5 min；随后进行35个95℃ 30 s，退火温度30 s，72℃ 30 s的循环；最后72℃延伸5 min。
6、结果判定
所述的结果判定是采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法：将PCR扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察是否有目的条带。首先阳性对照和阴性对照成立，如果从样品中扩增出了220 bp的特异性条带，则说明该样品存在溶血性曼氏杆菌；如果样品没有扩增出220bp的特异性条带，则说明该样品不含有溶血性曼氏杆菌。
7. 溶血性曼氏杆菌PCR扩增引物在PCR扩增试剂中的使用
7.1 标准品制备
以溶血性曼氏杆菌DNA为模板，使用本发明PCR扩增引物进行扩增，将PCR扩增得到的目的基因片段连接于载体pMD18-T，转化大肠杆菌感受细胞DH5a，氨苄西林抗性筛选获得单克隆菌，提取重组的质粒DNA，经测序确认后，测定重组质粒pMD18-T-gcp的起始浓度，作为标准样品，-70℃保存备用。
7.2 特异性检测
以提取的试验菌株和对照菌株的基因组DNA进行PCR扩增，检验所设计PCR扩增引物的特异性。
7.3 敏感性检测
将溶血性曼氏杆菌的PCR扩增的目的片段与PMD-18T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒，经PCR鉴定，重组质粒送上海英骏生物技术有限公司进行测序确定。纯化阳性重组质粒，测定起始浓度后，用RNA-Free Water连续10倍倍比稀释，采用优化的反应条件进行PCR扩增，进行敏感性检测。
7.4 重复性检测
用0.855×10 ng/μL、0.855×100 ng/μL、0.855×10-1 ng/μL、0.855×10-2 ng/μL、0.855×10-3 ng/μL和0.855×10-4 ng/μL的重组质粒标准样品同时进行PCR，分别重复3次检测，检验本发明检测方法的准确性和稳定性。
7.5 临床样品检测
将临床采集的20份组织样品分别研磨，反复冻融，使用试剂盒提取基因组DNA，使用建立的PCR方法进行扩增。
实施例2快速检测溶血性曼氏杆菌PCR扩增引物的退火温度试验
分别对退火温度45℃、47℃、49℃、51℃、53℃、55℃、57℃进行PCR扩增，确定最佳的退火温度。结果显示，所设计的引物对退火温度的包容性强，在上述退火温度下，均能很好的扩增出单一的目的条带（图1）。本发明建立的PCR方法使用的退火温度为51℃。
实施例3溶血性曼氏杆菌PCR扩增引物的特异性检测
提取溶血性曼氏杆菌、隐秘杆菌、克雷伯氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、牛支原体的基因组DNA和水，使用优化好的反应体系和反应程序进行PCR扩增，检测本发明的PCR扩增引物的特异性，结果显示，只有溶血性曼氏杆菌样品扩增出了目的片段条带，为阳性结果，6株对照菌株反应管和水对照反应管均未检测到扩增条带，为阴性结果（图2），表明本发明的PCR扩增引物具有很好的特异性。
实施例4溶血性曼氏杆菌PCR扩增引物的敏感性检测
将溶血性曼氏杆菌的PCR扩增的目的片段与PMD-18T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒，经PCR鉴定，重组质粒送上海英骏生物技术有限公司进行测序确定。纯化阳性重组质粒，反应模板的起始浓度为0.855×101 ng /μL，用RNA-FreeWater连续10倍倍比稀释，采用优化的反应条件进行PCR扩增，进行敏感性检测，结果显示，建立的PCR检测方法最低检测限为0.855 ×10-4 ng/μL（图3）。
实施例5 溶血性曼氏杆菌PCR扩增引物的准确性和稳定性检测
用0.855 × 10 ng/μL、0.855 × 100 ng/μL、0.855× 10-1 ng/μL、0.855×10-2 ng/μL、0.855×10-3 ng/μL和0.855×10-4 ng/μL的标准样品同时进行PCR扩增，分别重复3次检测。结果显示，重复结果良好，表明建立的PCR检测方法重复性好、稳定性高。
实施例6 溶血性曼氏杆菌PCR扩增引在临床样品检测中的应用
将临床采集的21份组织样品分别研磨，反复冻融，使用试剂盒提取基因组DNA，使用本发明的PCR扩增引物建立的PCR方法分别进行PCR扩增。结果显示，有10份样品检测出溶血性曼氏杆菌的特异性条带，为阳性结果（图4）。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
序列表
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> 一种快速检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增引物及其应用
<141> 2018-05-30
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)
<400> 1
gggcaatacg aactactcgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)
<400> 2
tcgtattcgc agcaaaggtt 20

Claims (8)

1.一种快速检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增引物，其特征在于，所述PCR扩增引物由具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物组成。
2.根据权利要求1所述快速检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增引物，其特征在于，所述的PCR扩增引物是依据溶血性曼氏杆菌gcp基因进行设计，扩增的目的片段大小为220 bP。
3.根据权利要求1或2所述快速检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增引物，其特征在于，所述PCR 扩增引物在制备检测溶血性曼氏杆菌试剂盒的应用。
4.一种如权利要求1所述快速检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂盒包括具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物。
5.根据权利要求4所述快速检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂盒还包括PCR预混液和RNase-Free water；所述的PCR预混液由PCR Buffer、dNTPs、ES-Taq DNA组成。
6.根据权利要求4所述快速检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂盒的SEQ ID NO:1引物和SEQ ID NO:2引物使用浓度为25 pmol/μL。
7.根据权利要求4或5所述快速检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂盒中PCR反应程序为95℃ 5 min；随后进行35个95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃30 s的循环；最后72℃延伸5 min。
8.根据权利要求4或5所述快速检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂盒的结果判定是采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法：将PCR扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察是否有目的条带；首先阳性对照和阴性对照成立，如果从样品中扩增出了220 bp的特异性条带，则说明该样品存在溶血性曼氏杆菌；如果样品没有扩增出220 bp的特异性条带，则说明该样品不含有溶血性曼氏杆菌。
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CN113249503A (zh) * 2021-05-21 2021-08-13 华中农业大学 用于检测溶血性曼氏杆菌的lamp引物组及方法

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