JP6228128B2 - 酵素法 - Google Patents
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Description
(a)標的ポリヌクレオチドが細孔を介して移動し、RecDヘリカーゼが細孔を介する標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、標的ポリヌクレオチドを、膜貫通細孔およびRecDヘリカーゼと接触させるステップと、
(b)ポリヌクレオチドが細孔に対して移動するときに、1または複数の測定を行うステップであって、測定値が、標的ポリヌクレオチドの1または複数の特徴を示し、これにより、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるステップと
を含む方法を提供する。
・標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサーを形成する方法であって、細孔とRecDヘリカーゼとの間で複合体を形成し、これにより、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサーを形成するステップを含む方法;
・細孔を介する標的ポリヌクレオチドの移動を制御するためのRecDヘリカーゼの使用;
・標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのキットであって、(a)細孔と、(b)RecDヘリカーゼとを含むキット;ならびに
・試料中の標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための解析装置であって、複数の細孔および複数のRecDヘリカーゼを含む解析装置;
・標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、
(a)RecDヘリカーゼが標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、標的ポリヌクレオチドをRecDヘリカーゼと接触させるステップと、
(b)RecDヘリカーゼがポリヌクレオチドの移動を制御するときに、1または複数の測定を行うステップであって、測定値が、標的ポリヌクレオチドの1または複数の特徴を示し、これにより、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるステップと
を含む方法:
・ポリヌクレオチドを特徴付ける間に標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための、RecDヘリカーゼの使用;
・ポリヌクレオチドの一部または全部を配列決定する間に標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための、RecDヘリカーゼの使用;
・試料中の標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための解析装置であって、RecDヘリカーゼを含むことを特徴とする解析装置;ならびに
・標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのキットであって、(a)標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための解析装置と、(b)RecDヘリカーゼとを含むキット
も提供する。
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法を提供する。本方法は、標的ポリヌクレオチドが細孔を介して移動し、RecDヘリカーゼが、細孔を介する標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、標的ポリヌクレオチドを、膜貫通細孔およびRecDヘリカーゼと接触させるステップを含む。次いで、ポリヌクレオチドが、細孔に対して移動するときに、当技術分野で公知の標準的な方法を用いて、標的ポリヌクレオチドの1または複数の特徴を測定する。標的ポリヌクレオチドの1または複数の特徴は、ポリヌクレオチドが、細孔を介して移動するときに測定することが好ましい。ステップ(a)および(b)は、細孔を隔ててポテンシャルを印加することにより実行することが好ましい。以下でより詳細に論じられる通り、印加されるポテンシャルは、細孔とヘリカーゼとの間における複合体の形成を結果としてもたらすことが典型的である。印加されるポテンシャルは、電圧ポテンシャルでありうる。代替的に、印加されるポテンシャルは、化学ポテンシャルでもありうる。この例は、両親媒性層を隔てて塩勾配を用いることである。塩勾配は、Holdenら、J Am Chem Soc.、2007年7月、11;129(27):8650〜5において開示されている。
・アミノ酸モチーフH−(X1)2−X2−R−(X3)5〜12−H−X4−H(本明細書の以下では、MobFモチーフIIIと称する;全ての可能なMobFモチーフIII(全ての可能な数のX3を含めた)を示す配列番号46〜53)[式中、X1およびX3は、任意のアミノ酸であり、X2およびX4は、D、E、K、およびRを除く任意のアミノ酸から独立に選択される]。(X1)2は、当然ながら、X1a−X1bである。X1aとX1bとは、同じアミノ酸の場合もあり、異なるアミノ酸の場合もある。X1aは、DまたはEであることが好ましい。X1bは、TまたはDであることが好ましい。(X1)2は、DTまたはEDであることが好ましい。(X1)2は、DTであることが最も好ましい。(X3)5〜12中の5〜12のアミノ酸は、同じ場合もあり、異なる場合もある。X2およびX4は、独立に、G、P、A、V、L、I、M、C、F、Y、W、H、Q、N、S、およびTから選択される。X2およびX4は、帯電していないことが好ましい。X2およびX4は、Hでないことが好ましい。X2は、N、S、またはAであることがより好ましい。X2は、Nであることが最も好ましい。X4は、FまたはTであることが最も好ましい。(X3)5〜12は、6または10残基の長さ(配列番号47および51)であることが好ましい。(X3)5〜12の適切な実施形態は、以下の表7に示される配列番号61、65、69、73、74、82、86、90、94、98、102、110、112、113、114、117、121、124、125、129、133、136、140、144、147、151、152、156、160、164、および168(すなわち、配列番号78および106以外の全ての配列)に由来しうる。MobFモチーフIIIの好ましい実施形態を、以下の表7に示す。
・アミノ酸モチーフG−X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−H−(X8)6〜12−H−X9(本明細書の以下では、MobQモチーフIIIと称する;全ての可能なMobQモチーフIII(全ての可能な数のX8を含めた)を示す配列番号54〜60)[式中、X1、X2、X3、X5、X6、X7、およびX9は、D、E、K、およびRを除く任意のアミノ酸から独立に選択され、X4は、DまたはEであり、X8は、任意のアミノ酸である]。X1、X2、X3、X5、X6、X7、およびX9は、独立に、G、P、A、V、L、I、M、C、F、Y、W、H、Q、N、S、およびTから選択される。X1、X2、X3、X5、X6、X7、およびX9は、帯電していないことが好ましい。X1、X2、X3、X5、X6、X7、およびX9は、Hでないことが好ましい。(X8)6〜12中の6〜12のアミノ酸は、同じ場合もあり、異なる場合もある。(X8)6〜12の適切な実施形態は、以下の表7に示される配列番号78および106に由来しうる。MobFモチーフIIIの好ましい実施形態を、以下の表7に示す。
(a)標的ポリヌクレオチドが細孔を介して移動し、RecDヘリカーゼが細孔を介する標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、標的ポリヌクレオチドを、膜貫通細孔およびRecDヘリカーゼと接触させるステップと、
(b)ポリヌクレオチドが細孔に対して移動するときに細孔を通過する電流を測定するステップであって、電流が、標的ポリヌクレオチドの1または複数の特徴を示し、これにより、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるステップと
を含む。
本発明はまた、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサーを形成する方法も提供する。本方法は、細孔とRecDヘリカーゼとの間で複合体を形成するステップを含む。複合体は、標的ポリヌクレオチドの存在下で細孔とヘリカーゼとを接触させ、次いで、細孔を隔ててポテンシャルを印加することにより形成することができる。上記で記載した通り、印加されるポテンシャルは、化学ポテンシャルの場合もあり、電圧ポテンシャルの場合もある。代替的に、複合体は、細孔をヘリカーゼへと共有結合的に連結することによっても形成することができる。当技術分野では、共有結合的連結のための方法が公知であり、例えば、国際出願第PCT/GB09/001679号(WO2010/004265として公開されている)および同第PCT/GB10/000133号(WO2010/086603として公開されている)において開示されている。この複合体が、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサーである。本方法は、Mspに由来する細孔とRecDヘリカーゼとの間で複合体を形成するステップを含むことが好ましい。本発明の方法に言及しながら上記で論じた実施形態のいずれも、本方法に同様に適用される。
本発明はまた、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのキットも提供する。キットは、(a)細孔と、(b)RecDヘリカーゼとを含む。本発明の方法に言及しながら上記で論じた実施形態のいずれも同様に、キットに適用される。
本発明はまた、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための装置も提供する。装置は、複数の細孔および複数のRecDヘリカーゼを含む。装置は、本発明の方法を実施するための指示書もさらに含むことが好ましい。装置は、アレイまたはチップなど、ポリヌクレオチド解析のための任意の従来の装置でありうる。本発明の方法に言及しながら上記で論じた実施形態のいずれも同様に、本発明の装置に適用可能である。
膜および複数の細孔を支持することが可能であり、細孔およびヘリカーゼを用いてポリヌクレオチドの特徴付けを実施するのに作動可能なセンサーデバイスと、
特徴付けを実施するための材料を保持するための少なくとも1つのリザーバーと、
材料を、少なくとも1つのリザーバーから、センサーデバイスへと、制御可能な形で供給するように構成された流体力学系と、
それぞれの試料を受容するための複数の容器であって、流体力学系が、試料を、容器からセンサーデバイスへと、選択的に供給するように構成された容器と
を含むことが好ましい。装置は、国際出願第PCT/GB08/004127号(WO2009/077734として公開されている)、同第PCT/GB10/000789号(WO2010/122293として公開されている)、国際出願第PCT/GB10/002206号(未公開)、または国際出願第PCT/US99/25679号(WO00/28312として公開されている)において記載されている装置のうちのいずれかでありうる。
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドを、RecDヘリカーゼは用いるが、細孔は用いずに、部分的または完全に配列決定するなどして、特徴付ける。特に、本発明はまた、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、RecDヘリカーゼにより、標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、標的ポリヌクレオチドを、RecDヘリカーゼと接触させるステップを含む方法も提供する。本方法では、標的ポリヌクレオチドを、膜貫通細孔などの細孔と接触させないことが好ましい。RecDヘリカーゼにより、ポリヌクレオチドの移動を制御し、これにより、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるので、本方法は、1または複数の測定を行うステップを伴う。測定は、標的ポリヌクレオチドの1または複数の特徴を示す。本発明に従い、任意のこのような測定を行うことができる。このような測定には、限定せずに述べると、電気的測定および光学的測定が含まれる。これらについては、上記で詳細に論じられている。細孔を欠く方法でも、細孔ベースの本発明の方法に言及しながら上記で論じた実施形態のうちのいずれかを用いることができる。例えば、上記で論じたRecDヘリカーゼのうちのいずれかを用いることができる。
プライマーは、PhiX174の約400bpの断片を増幅するようにデザインした。これらのプライマーの5’端の各々は、50ヌクレオチドの非相補的領域、ホモポリマーの連なり、または10ヌクレオチドのホモポリマー区間の反復単位を含んでいた。これらは、ナノ細孔を介する制御された鎖の移行についての識別子のほか、移行の配向性を決定する識別子としても用いられる。加えて、フォワードプライマーの5’端を「キャッピング」して、4つの2’−O−メチル−ウラシル(mU)ヌクレオチドを含め、リバースプライマーの5’端を化学的にリン酸化させた。次いで、これらのプライマー修飾は、ラムダエクソヌクレアーゼを用いる、アンチセンス鎖だけの優先的に制御された消化を可能とする。mUキャッピングが、センス鎖をヌクレアーゼ消化から保護するのに対し、アンチセンス鎖の5’側のPO4は、ヌクレアーゼ消化を促進する。したがって、ラムダエクソヌクレアーゼを伴うインキュベーション後には、二重鎖のうちのセンス鎖だけが、ここでは、一本鎖DNA(ssDNA)として無傷を維持する。次いで、創出されたssDNAを、既に記載されている通りにPAGE精製した。
ナノ細孔:大腸菌(E.coli)MS(B2)8 MspA ONLP3476MS−(L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/D134R/E139K)8
酵素:TraI Eco(配列番号61;ONLP3572、約4.3μM)23.3μl→100nMの最終濃度。
図1に示される通り、ヘリカーゼ−DNA基質をMspAナノ細孔へと付加すると、図2および3に示す通り、特徴的な電流の遮断がもたらされる。ヘリカーゼを結合させないDNAは、ナノ細孔と一過性に相互作用して、短命(<<1秒間)の電流遮断をもたらす。図2および3に示す通り、ヘリカーゼを結合させ、かつ、活性(すなわち、ATPアーゼの作用下でDNA鎖に沿って移動する)のヘリカーゼを伴うDNAは、電流の段階的な変化を伴う長い特徴的な遮断レベルをもたらす。ナノ細孔内の異なるDNAモチーフは、固有の電流の遮断レベルを生じさせる。所与の基質について、DNA配列を反映する特徴的な電流遷移パターンが観察される(図3における例)。
この種のナノ細孔による鎖配列決定実験は一般に、イオン性塩を必要とする。イオン性塩は、電圧オフセットを加えて、DNAを捕捉し、移行させ、結果として得られる、DNAがナノ細孔を通過するときの配列依存性の電流変化を測定するための導電性溶液を創出するのに必要である。測定シグナルは、イオンの濃度に依存性であるので、収集されるシグナルの大きさを増大させるためには、高濃度のイオン性塩を用いることが有利である。ナノ細孔による配列決定には、100mMのKClによる過剰塩濃度が理想的であり、400mM以上のKClによる塩濃度が好ましい。
大半のヘリカーゼは、一本鎖のポリヌクレオチド基質に沿って、単一方向的に移動し、各NTPアーゼの回転に応じた特定の数の塩基を移動させる。異なる方式でのヘリカーゼの移動を利用して、DNAをナノ細孔内に制御された形で送り込むことができる。図1では、操作の2つの基本的な「フォワード」方式および「リバース」方式について例示する。フォワード方式では、DNAをヘリカーゼにより細孔へと、印加された電界の力の下でDNAが移動するのと同じ向きに送り込む。この向きを、トランス側の矢印で示す。5’〜3’ヘリカーゼであるTraIでは、この操作のために、ヘリカーゼがナノ細孔の上部に接触し、次いで、DNAを、ヘリカーゼの制御下で、ナノ細孔へと、印加されるポテンシャルに由来する電界と同じ向きに送り込む、すなわち、シス側からトランス側へと移動させるまで、DNAの5’端をナノ細孔内に捕捉することが要求される。リバース方式では、DNAの3’端を捕捉することが要求される。その後、ヘリカーゼが、印加されるポテンシャルに由来する電界と逆向きにナノ細孔から差し戻される、すなわち、トランス側からシス側へと移動して糸通しされるDNAを引き出すように進む。図1は、TraI Ecoを用いるこれらの2つの操作方式を示す。
捕捉DNA:配列番号177
緩衝液:625mMのKCl、75mMのフェロシアン化カリウム、25mMのフェリシアン化カリウム、TrwC(Atr)、TrwC(Eco)、およびTrwC(Ccr)には、pH8.0の100mM Hepesであり、TrwC(Sal)には、pH9.0の100mM Hepes
酵素:全て100nMの最終濃度である、TrwC(Atr)(100nM)またはTrwC(Sal)(100nM)またはTrwC(Ccr)(100nM)またはTrwC(Eco)(100nM)
被験ヘリカーゼの各々について、ヘリカーゼにより制御されたDNA移動が観察された。例示的な出力波形を、それぞれ、図6〜9に示す。
酵素:全て100nMの最終濃度である、TrwC(Oma)、TrwC(Afe)、およびTrwC(Mph)
被験ヘリカーゼの各々について、ヘリカーゼにより制御されたDNA移動が観察された。例示的な出力波形を、それぞれ、図10〜12に示す。
本発明は以下を提供する。
[1]
標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、
(a)標的ポリヌクレオチドが細孔を介して移動し、RecDヘリカーゼが細孔を介する標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、標的ポリヌクレオチドを、膜貫通細孔およびRecDヘリカーゼと接触させるステップと、
(b)ポリヌクレオチドが細孔に対して移動するときに、1または複数の測定を行うステップであって、測定値が、標的ポリヌクレオチドの1または複数の特徴を示し、これにより、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるステップと
を含む方法。
[2]
1または複数の特徴が、(i)標的ポリヌクレオチドの長さ、(ii)標的ポリヌクレオチドの同一性、(iii)標的ポリヌクレオチドの配列、(iv)標的ポリヌクレオチドの二次構造、および(v)標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択される、[1]に記載の方法。
[3]
標的ポリヌクレオチドが、メチル化により、酸化により、損傷により、1もしくは複数のタンパク質で、または1もしくは複数の標識、タグ、もしくはスペーサーで修飾されている、[2]に記載の方法。
[4]
標的ポリヌクレオチドの1または複数の特徴が、電気的測定および/または光学的測定により測定される、[1]から[3]のいずれか一項に記載の方法。
[5]
電気的測定が、電流測定、インピーダンス測定、トンネル効果測定、または電界効果トランジスタ(FET)測定である、[4]に記載の方法。
[6]
(a)標的ポリヌクレオチドが細孔を介して移動し、RecDヘリカーゼが細孔を介する標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、標的ポリヌクレオチドを、膜貫通細孔およびRecDヘリカーゼと接触させるステップと、
(b)ポリヌクレオチドが細孔に対して移動するときに細孔を通過する電流を測定するステップであって、電流が、標的ポリヌクレオチドの1または複数の特徴を示し、これにより、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるステップと
を含む、[1]に記載の方法。
[7]
ステップ(b)が、ポリヌクレオチドが細孔を介して移動するときに1または複数の測定を行うことを伴う、[1]から[6]のいずれか一項に記載の方法。
[8]
細孔を隔てて電圧を印加して、細孔とヘリカーゼとの間の複合体を形成するステップをさらに含む、[1]から[7]のいずれか一項に記載の方法。
[9]
ポリヌクレオチドの少なくとも一部が二本鎖である、[1]から[8]のいずれか一項に記載の方法。
[10]
細孔が、膜貫通タンパク質細孔または固体状態細孔である、[1]から[9]のいずれか一項に記載の方法。
[11]
膜貫通タンパク質細孔が、ヘモリシン、ロイコシジン、マイコバクテリウム・スメグマチス(Mycobacterium smegmatis)のポリンA(MspA)、外膜ポリンF(OmpF)、外膜ポリンG(OmpG)、外膜ホスホリパーゼA、ナイセリア(Neisseria)属オートトランスポーターリポタンパク質(NalP)、およびWZAから選択される、[10]に記載の方法。
[12]
膜貫通タンパク質が、(a)配列番号2に示される8つの同一のサブユニット、または(b)7つのサブユニットのうちの1または複数が、配列の全体にわたりアミノ酸同一性に基づいて配列番号2と少なくとも50%の相同性を有し、細孔活性を保持するその変異体から形成される、[11]に記載の方法。
[13]
膜貫通タンパク質が、(a)配列番号4に示される7つの同一のサブユニットから形成されるα−ヘモリシン、または(b)7つのサブユニットのうちの1または複数が、配列の全体にわたりアミノ酸同一性に基づいて配列番号4と少なくとも50%の相同性を有し、細孔活性を保持するその変異体である、[11]に記載の方法。
[14]
RecDヘリカーゼが、
・アミノ酸モチーフX1−X2−X3−G−X4−X5−X6−X7(配列番号8)[式中、X1は、G、S、またはAであり、X2は、任意のアミノ酸であり、X3は、P、A、S、またはGであり、X4は、T、A、V、S、またはCであり、X5は、GまたはAであり、X6は、KまたはRであり、X7は、TまたはSである];および/または
・アミノ酸モチーフX1−X2−X3−X4−X5−(X6) 3 −Q−X7(配列番号9、10、および11)[式中、X1は、Y、W、またはFであり、X2は、A、T、S、M、C、またはVであり、X3は、任意のアミノ酸であり、X4は、TまたはNであり、X5は、A、T、G、S、V、またはIであり、X6は、任意のアミノ酸であり、X7は、GまたはSである]
を含む、[1]から[13]のいずれか一項に記載の方法。
[15]
RecDヘリカーゼが、以下のモチーフ:
(a) GGPGTGKT(配列番号19)および/またはWAVTIHKSQG(配列番号20);
(b) GGPGTGKS(配列番号22)および/またはYALTVHRAQG(配列番号23);
(c) GGPGVGKT(配列番号26)および/またはYAISVHKSQG(配列番号27);
(d) GGPGTGKT(配列番号19)および/またはYCISVHKSQG配列番号(29);
(e) GGPGVGKT(配列番号26)および/またはYAATIHKSQG(配列番号31);
(f) GGPGCGKS(配列番号33)および/またはYAMTIHRSQG(配列番号34);
(g) GGPGTGKS(配列番号22)および/またはYAVSIHKSQG(配列番号36);
(h) GGPGVGKT(配列番号26)および/またはYATSVHKSQG(配列番号38);
(i) GGPGTGKT(配列番号19)および/またはYAVSVHKSQG(配列番号40);
(j) GGPGVGKT(配列番号26)および/またはYATSIHKSQG(配列番号43);または
(k) GGPGTGKS(配列番号22)および/またはYALTVHRGQG(配列番号45)
を含む、[14]に記載の方法。
[16]
RecDヘリカーゼが、表4もしくは5に示されるヘリカーゼのうちの1つ、またはその変異体である、[1]から[15]のいずれか一項に記載の方法。
[17]
RecDヘリカーゼが、
(a)配列番号18、21、24、25、28、30、32、35、37、39、41、42、および44のうちのいずれか1つに示される配列;または
(b)配列の全体にわたりアミノ酸の同一性に基づいて当該配列と少なくとも25%の相同性を有し、ヘリカーゼ活性を保持するその変異体
を含む、[16]に記載の方法。
[18]
RecDヘリカーゼが、TraIヘリカーゼまたはTraI亜群ヘリカーゼである、[1]から[14]のいずれか一項に記載の方法。
[19]
TraIヘリカーゼまたはTraI亜群ヘリカーゼが、
・アミノ酸モチーフH−(X1) 2 −X2−R−(X3) 5〜12 −H−X4−H(配列番号46〜53)[式中、X1およびX3は、任意のアミノ酸であり、X2およびX4は、D、E、K、およびRを除く任意のアミノ酸から独立に選択される];または
・アミノ酸モチーフG−X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−H−(X8) 6〜12 −H−X9(配列番号54〜60)[式中、X1、X2、X3、X5、X6、X7、およびX9は、D、E、K、およびRを除く任意のアミノ酸から独立に選択され、X4は、DまたはEであり、X8は、任意のアミノ酸である]
をさらに含む、[18]に記載の方法。
[20]
TraIヘリカーゼまたはTraI亜群ヘリカーゼが、以下のモチーフ:
(a) GYAGVGKT(配列番号62)、YAITAHGAQG(配列番号63)およびHDTSRDQEPQLHTH(配列番号64);
(b) GIAGAGKS(配列番号66)、YALNVHMAQG(配列番号67)およびHDTNRNQEPNLHFH(配列番号68);
(c) GAAGAGKT(配列番号70)、YCITIHRSQG(配列番号71)およびHEDARTVDDIADPQLHTH(配列番号72);
(d) GFAGTGKS(配列番号75)、YATTVHSSQG(配列番号76)およびHETSRERDPQLHTH(配列番号77);
(e) GRAGAGKT(配列番号79)、YATTIHKSQG(配列番号80)およびGMVADWVYHDNPGNPHIH(配列番号81);
(f) GAAGTGKT(配列番号83)、YASTAHKSQG(配列番号84)およびHSTSRAQDPHLHSH(配列番号85);
(g) GHAGAGKT(配列番号87)、YAGTTHRNQG(配列番号88)およびHASSREQDPQIHSH(配列番号89);
(h) GLAGTGKT(配列番号91)、YAVTSHSSQG(配列番号92)およびHDTARPVNGYAAPQLHTH(配列番号93);
(i) GPAGAGKT(配列番号95)、YAITAHRAQG(配列番号96)およびHYDSRAGDPQLHTH(配列番号97);
(j) GWAGVGKT(配列番号99)、YAVTADHMQG(配列番号100)およびHLCGRLDPQIHNH(配列番号101);
(k) GVAGAGKT(配列番号103)、YALTIDSAQG(配列番号104)およびHMTSGDGSPHLHVH(配列番号105);
(l) GYAGTGKS(配列番号107)、YAATIHKAQG(配列番号108)およびGMIADLVNVHWDIGEDGKAKPHAH(配列番号109);
(m) GIAGAGKS(配列番号66)、YALNAHMAQG(配列番号67)およびHDTNRNQEPNLHFH(配列番号111);
(n) GVAGAGKS(配列番号115)、YALNAHMAQG(配列番号67)
およびHDTNRNQEPNAHFH(配列番号116);
(o) GGAGVGKS(配列番号118)、YAINVHIAQG(配列番号119)およびHDVSRNNDPQLHVH(配列番号120);
(p) GIAGAGKS(配列番号66)、YALNMHMAQG(配列番号122)およびHDTSRALDPQGHIH(配列番号123);
(q) GVAGAGKS(配列番号115)、YALNAHMAQG(配列番号67)およびHDTSRALDPQGHIH(配列番号123);
(r) GRAGTGKT(配列番号126)、FASTAHGAQG(配列番号127)およびHEASRNLDPQLHSH(配列番号128);
(s) GYAGTGKT(配列番号130)、YAMTSHAAQG(配列番号131)およびHDISRDKDPQLHTH(配列番号132);
(t) GLAGTGKT(配列番号91)、YAQTVHASQG(配列番号134)およびHNTSRDLDPQTHTH(配列番号135);
(u) GFAGTAKT(配列番号137)、YVQTAFAAQG(配列番号138)およびHETSRAQDPQLHTH(配列番号139);
(v) GYAGTAKT(配列番号141)、YVDTAFAAQG(配列番号142)およびHGTSRAQDPQLHTH(配列番号143);
(w) GYAGTAKT(配列番号141)、YASTAFAAQG(配列番号145)およびHGTSRALDPQLHSH(配列番号146);
(x) GSAGSGKT(配列番号148)、YAVTSYSAQG(配列番号149)およびHDTARPVGGYAAPQLHTH(配列番号150);
(y) GEAGTGKT(配列番号153)、YAHTSYKEQG(配列番号154)およびHETNRENEPQLHNH(配列番号155);
(z) GYAGVAKT(配列番号157)、YVLTNYKVQG(配列番号158)およびQPSSRANDPALHTH(配列番号159);
(aa) GSAGTGKT(配列番号161)、YSLTANRAQG(配列番号162)およびHSMSRAGDPEMHNH(配列番号163);
(bb) AGAGTGKT(配列番号165)、YAGTVYAAQG(配列番号166)およびHYTTREGDPNIHTH(配列番号167);または
(cc) APAGAGKT(配列番号169)、YAVTVHAAQG(配列番号170)およびHETSRAGDPHLHTH(配列番号171)
を含む、[14]に記載の方法。
[21]
TraIヘリカーゼまたはTraI亜群ヘリカーゼが、表6もしくは7に示されるヘリカーゼのうちの1つ、またはその変異体である、[18]から[20]のいずれか一項に記載の方法。
[22]
TraIヘリカーゼまたはTraI亜群ヘリカーゼが、(a)配列番号61、65、69、73、74、78、82、86、90、94、98、102、106、110、112、113、114、117、121、124、125、129、133、136、140、144、147、151、152、156、160、164、および168のうちのいずれか1つに示される配列、または(b)配列の全体にわたりアミノ酸の同一性に基づいて当該配列と少なくとも10%の相同性を有し、ヘリカーゼ活性を保持するその変異体を含む、[21]に記載の方法。
[23]
少なくとも0.3Mの塩濃度を用いて実行され、塩が、場合によって、KClである、[1]から[22]のいずれか一項に記載の方法。
[24]
塩濃度が、少なくとも1.0Mである、[23]に記載の方法。
[25]
標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサーを形成する方法であって、細孔とRecDヘリカーゼとの間で複合体を形成し、これにより、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサーを形成するステップを含む方法。
[26]
複合体が、(a)細孔とヘリカーゼとを、標的ポリヌクレオチドの存在下で接触させ、(a)細孔を隔ててポテンシャルを印加することにより形成される、[25]に記載の方法。
[27]
ポテンシャルが、電圧ポテンシャルまたは化学ポテンシャルである、[26]に記載の方法。
[28]
複合体が、細孔をヘリカーゼへと共有結合的に連結することにより形成される、[26]に記載の方法。
[29]
細孔を介する標的ポリヌクレオチドの移動を制御するためのRecDヘリカーゼの使用。
[30]
標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのキットであって、(a)細孔と、(b)RecDヘリカーゼとを含むキット。
[31]
両親媒性層を含むチップをさらに含む、[29]に記載のキット。
[32]
試料中の標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための解析装置であって、複数の細孔および複数のRecDヘリカーゼを含む解析装置。
[33]
複数の細孔を支持することが可能であり、細孔およびヘリカーゼを用いてポリヌクレオチドの特徴付けを実施するのに作動可能なセンサーデバイスと、
特徴付けを実施するための材料を保持するための少なくとも1つのリザーバーと、
材料を、少なくとも1つのリザーバーからセンサーデバイスへと、制御可能な形で供給するように構成された流体力学系と、
それぞれの試料を受容するための複数の容器であって、流体力学系が、試料を、容器からセンサーデバイスへと、選択的に供給するように構成された容器と
を含む、[32]に記載の解析装置。
[34]
標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、
(a)RecDヘリカーゼが、標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、標的ポリヌクレオチドをRecDヘリカーゼと接触させるステップと、
(b)RecDヘリカーゼがポリヌクレオチドの移動を制御するときに、1または複数の測定を行うステップであって、測定値が、標的ポリヌクレオチドの1または複数の特徴を示し、これにより、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるステップと
を含む方法。
[35]
(a)1もしくは複数の特徴が、[2]に記載の通りであるか、
(b)標的ポリヌクレオチドが、[3]もしくは[9]に記載の通りであるか、
(c)1もしくは複数の特徴が、[4]もしくは[5]に記載の通りに測定されるか、
(d)RecDが、[14]から[22]のいずれか一項に記載の通りであるか、または
(e)方法が、[23]もしくは[24]のいずれかに記載の通りに実行される、
[34]に記載の方法。
[36]
ポリヌクレオチドを特徴付ける間に標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための、RecDヘリカーゼの使用。
[37]
ポリヌクレオチドの一部または全部を配列決定する間に標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための、RecDヘリカーゼの使用。
[38]
試料中の標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための解析装置であって、RecDヘリカーゼを含むことを特徴とする解析装置。
[39]
標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのキットであって、(a)標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための解析装置と、(b)RecDヘリカーゼとを含むキット。
配列番号2は、MspA単量体のMS−B1突然変異体の成熟形態のアミノ酸配列を示す。この突然変異体は、シグナル配列を欠き、以下の突然変異:D90N、D91N、D93N、D118R、D134R、およびE139Kを含む。
配列番号3は、α−ヘモリシン−E111N/K147N(α−HL−NN;Stoddartら、PNAS、2009; 106(19): 7702〜7707)の1つのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号4は、α−HL−NNの1つのサブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号5〜7は、MspB、MspC、およびMspDのアミノ酸配列を示す。
配列番号8は、RecD様モチーフIの配列を示す。
配列番号9、10、および11は、伸長RecD様モチーフIの配列を示す。
配列番号12は、RecDモチーフIの配列を示す。
配列番号13、14、および15は、伸長RecDモチーフIの配列を示す。
配列番号16は、RecD様モチーフVの配列を示す。
配列番号17は、RecDモチーフVの配列を示す。
配列番号18〜45は、表5のRecDヘリカーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号46〜53は、MobFモチーフIIIの配列を示す。
配列番号54〜60は、MobQモチーフIIIの配列を示す。
配列番号61〜171は、表7に示されるTraIヘリカーゼおよびTraI亜群ヘリカーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号172〜182は、実施例で用いられる配列を示す。
Claims (28)
- 標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、
(a)標的ポリヌクレオチドが細孔を介して移動し、RecDヘリカーゼが細孔を介する標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、標的ポリヌクレオチドを、膜貫通細孔およびRecDヘリカーゼと接触させるステップと、
(b)ポリヌクレオチドが細孔に対して移動するときに、1または複数の測定を行うステップであって、測定値が、標的ポリヌクレオチドの1または複数の特徴を示し、これにより、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるステップと
を含み、
前記方法は少なくとも0.3Mの塩濃度を用いて実行され、前記RecDヘリカーゼは前記塩濃度で機能することが可能である、
方法。 - 1または複数の特徴が、(i)標的ポリヌクレオチドの長さ、(ii)標的ポリヌクレオチドの同一性、(iii)標的ポリヌクレオチドの配列、(iv)標的ポリヌクレオチドの二次構造、および(v)標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択される、請求項1に記載の方法。
- 標的ポリヌクレオチドが、メチル化により、酸化により、損傷により、1もしくは複数のタンパク質で、または1もしくは複数の標識、タグ、もしくはスペーサーで修飾されている、請求項2に記載の方法。
- 標的ポリヌクレオチドの1または複数の特徴が、電気的測定および/または光学的測定により測定され、ここで前記電気的測定が、電流測定、インピーダンス測定、トンネル効果測定、または電界効果トランジスタ(FET)測定である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 細孔を隔てて電圧を印加して、細孔とヘリカーゼとの間の複合体を形成するステップをさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- ポリヌクレオチドの少なくとも一部が二本鎖である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 細孔が、膜貫通タンパク質細孔または固体状態細孔である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 膜貫通タンパク質細孔が、ヘモリシン、ロイコシジン、マイコバクテリウム・スメグマチス(Mycobacterium smegmatis)のポリンA(MspA)、外膜ポリンF(OmpF)、外膜ポリンG(OmpG)、外膜ホスホリパーゼA、ナイセリア(Neisseria)属オートトランスポーターリポタンパク質(NalP)、およびWZAから選択される、請求項7に記載の方法。
- 膜貫通タンパク質が、(a)配列番号2に示される8つの同一のサブユニット、もしくは7つのサブユニットのうちの1もしくは複数が、配列の全体にわたり配列番号2と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有し、細孔活性を保持するその変異体から形成されるものであり、または、(b)配列番号4に示される7つの同一のサブユニットから形成されるα−ヘモリシン、もしくは7つのサブユニットのうちの1もしくは複数が、配列の全体にわたり配列番号4と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有し、細孔活性を保持するその変異体である、請求項7または8に記載の方法。
- RecDヘリカーゼが、
・アミノ酸モチーフX1−X2−X3−G−X4−X5−X6−X7(配列番号8)[式中、X1は、G、S、またはAであり、X2は、任意のアミノ酸であり、X3は、P、A、S、またはGであり、X4は、T、A、V、S、またはCであり、X5は、GまたはAであり、X6は、KまたはRであり、X7は、TまたはSである];および/または
・アミノ酸モチーフX1−X2−X3−X4−X5−(X6)3−Q−X7(配列番号9、10、および11)[式中、X1は、Y、W、またはFであり、X2は、A、T、S、M、C、またはVであり、X3は、任意のアミノ酸であり、X4は、TまたはNであり、X5は、A、T、G、S、V、またはIであり、X6は、任意のアミノ酸であり、X7は、GまたはSである]
を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。 - RecDヘリカーゼが、以下のモチーフ:
(a) GGPGTGKT(配列番号19)および/またはWAVTIHKSQG(配列番号20);
(b) GGPGTGKS(配列番号22)および/またはYALTVHRAQG(配列番号23);
(c) GGPGVGKT(配列番号26)および/またはYAISVHKSQG(配列番号27);
(d) GGPGTGKT(配列番号19)および/またはYCISVHKSQG配列番号(29);
(e) GGPGVGKT(配列番号26)および/またはYAATIHKSQG(配列番号31);
(f) GGPGCGKS(配列番号33)および/またはYAMTIHRSQG(配列番号34);
(g) GGPGTGKS(配列番号22)および/またはYAVSIHKSQG(配列番号36);
(h) GGPGVGKT(配列番号26)および/またはYATSVHKSQG(配列番号38);
(i) GGPGTGKT(配列番号19)および/またはYAVSVHKSQG(配列番号40);
(j) GGPGVGKT(配列番号26)および/またはYATSIHKSQG(配列番号43);または
(k) GGPGTGKS(配列番号22)および/またはYALTVHRGQG(配列番号45)
を含む、請求項10に記載の方法。 - RecDヘリカーゼが、表4もしくは5に示されるヘリカーゼのうちの1つ、または配列の全体にわたり当該ヘリカーゼの配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有し、ヘリカーゼ活性を保持するその変異体である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- RecDヘリカーゼが、
(a)配列番号18、21、24、25、28、30、32、35、37、39、41、42、および44のうちのいずれか1つに示される配列;または
(b)配列の全体にわたり当該配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有し、ヘリカーゼ活性を保持するその変異体を含む、請求項12に記載の方法。 - RecDヘリカーゼが、TraIヘリカーゼまたはTraI亜群ヘリカーゼである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- TraIヘリカーゼまたはTraI亜群ヘリカーゼが、
・アミノ酸モチーフH−(X1) 2 −X2−R−(X3) 5〜12 −H−X4−H(配列番号46〜53)[式中、X1およびX3は、任意のアミノ酸であり、X2およびX4は、D、E、K、およびRを除く任意のアミノ酸から独立に選択される];または
・アミノ酸モチーフG−X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−H−(X8) 6〜12 −H−X9(配列番号54〜60)[式中、X1、X2、X3、X5、X6、X7、およびX9は、D、E、K、およびRを除く任意のアミノ酸から独立に選択され、X4は、DまたはEであり、X8は、任意のアミノ酸である]
をさらに含む、請求項14に記載の方法。 - TraIヘリカーゼまたはTraI亜群ヘリカーゼが、以下のモチーフ:
(a) GYAGVGKT(配列番号62)、YAITAHGAQG(配列番号63)およびHDTSRDQEPQLHTH(配列番号64);
(b) GIAGAGKS(配列番号66)、YALNVHMAQG(配列番号67)およびHDTNRNQEPNLHFH(配列番号68);
(c) GAAGAGKT(配列番号70)、YCITIHRSQG(配列番号71)およびHEDARTVDDIADPQLHTH(配列番号72);
(d) GFAGTGKS(配列番号75)、YATTVHSSQG(配列番号76)およびHETSRERDPQLHTH(配列番号77);
(e) GRAGAGKT(配列番号79)、YATTIHKSQG(配列番号80)およびGMVADWVYHDNPGNPHIH(配列番号81);
(f) GAAGTGKT(配列番号83)、YASTAHKSQG(配列番号84)およびHSTSRAQDPHLHSH(配列番号85);
(g) GHAGAGKT(配列番号87)、YAGTTHRNQG(配列番号88)およびHASSREQDPQIHSH(配列番号89);
(h) GLAGTGKT(配列番号91)、YAVTSHSSQG(配列番号92)およびHDTARPVNGYAAPQLHTH(配列番号93);
(i) GPAGAGKT(配列番号95)、YAITAHRAQG(配列番号96)およびHYDSRAGDPQLHTH(配列番号97);
(j) GWAGVGKT(配列番号99)、YAVTADHMQG(配列番号100)およびHLCGRLDPQIHNH(配列番号101);
(k) GVAGAGKT(配列番号103)、YALTIDSAQG(配列番号104)およびHMTSGDGSPHLHVH(配列番号105);
(l) GYAGTGKS(配列番号107)、YAATIHKAQG(配列番号108)およびGMIADLVNVHWDIGEDGKAKPHAH(配列番号109);
(m) GIAGAGKS(配列番号66)、YALNAHMAQG(配列番号67)およびHDTNRNQEPNLHFH(配列番号111);
(n) GVAGAGKS(配列番号115)、YALNAHMAQG(配列番号67)およびHDTNRNQEPNAHFH(配列番号116);
(o) GGAGVGKS(配列番号118)、YAINVHIAQG(配列番号119)およびHDVSRNNDPQLHVH(配列番号120);
(p) GIAGAGKS(配列番号66)、YALNMHMAQG(配列番号122)およびHDTSRALDPQGHIH(配列番号123);
(q) GVAGAGKS(配列番号115)、YALNAHMAQG(配列番号67)およびHDTSRALDPQGHIH(配列番号123);
(r) GRAGTGKT(配列番号126)、FASTAHGAQG(配列番号127)およびHEASRNLDPQLHSH(配列番号128);
(s) GYAGTGKT(配列番号130)、YAMTSHAAQG(配列番号131)およびHDISRDKDPQLHTH(配列番号132);
(t) GLAGTGKT(配列番号91)、YAQTVHASQG(配列番号134)およびHNTSRDLDPQTHTH(配列番号135);
(u) GFAGTAKT(配列番号137)、YVQTAFAAQG(配列番号138)およびHETSRAQDPQLHTH(配列番号139);
(v) GYAGTAKT(配列番号141)、YVDTAFAAQG(配列番号142)およびHGTSRAQDPQLHTH(配列番号143);
(w) GYAGTAKT(配列番号141)、YASTAFAAQG(配列番号145)およびHGTSRALDPQLHSH(配列番号146);
(x) GSAGSGKT(配列番号148)、YAVTSYSAQG(配列番号149)およびHDTARPVGGYAAPQLHTH(配列番号150);
(y) GEAGTGKT(配列番号153)、YAHTSYKEQG(配列番号154)およびHETNRENEPQLHNH(配列番号155);
(z) GYAGVAKT(配列番号157)、YVLTNYKVQG(配列番号158)およびQPSSRANDPALHTH(配列番号159);
(aa) GSAGTGKT(配列番号161)、YSLTANRAQG(配列番号162)およびHSMSRAGDPEMHNH(配列番号163);
(bb) AGAGTGKT(配列番号165)、YAGTVYAAQG(配列番号166)およびHYTTREGDPNIHTH(配列番号167);または
(cc) APAGAGKT(配列番号169)、YAVTVHAAQG(配列番号170)およびHETSRAGDPHLHTH(配列番号171)
を含む、請求項14または15に記載の方法。 - TraIヘリカーゼまたはTraI亜群ヘリカーゼが、表6もしくは7に示されるヘリカーゼのうちの1つ、または配列の全体にわたり当該ヘリカーゼの配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有し、ヘリカーゼ活性を保持するその変異体である、請求項14〜16のいずれか一項に記載の方法。
- TraIヘリカーゼまたはTraI亜群ヘリカーゼが、(a)配列番号61、65、69、73、74、78、82、86、90、94、98、102、106、110、112、113、114、117、121、124、125、129、133、136、140、144、147、151、152、156、160、164、および168のうちのいずれか1つに示される配列、または(b)配列の全体にわたり当該配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有し、ヘリカーゼ活性を保持するその変異体を含む、請求項17に記載の方法。
- 塩がKClである、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサーを形成する方法であって、細孔とRecDヘリカーゼとの間で複合体を形成し、これにより、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサーを形成するステップを含み、標的ポリヌクレオチドの特徴付けは少なくとも0.3Mの塩濃度を用いて実行され、前記RecDヘリカーゼは前記塩濃度で機能することが可能である、方法。
- 複合体が、(a)細孔とヘリカーゼとを、標的ポリヌクレオチドの存在下で接触させ、細孔を隔てて電圧ポテンシャルもしくは化学ポテンシャルを印加することにより形成され、または(b)細孔をヘリカーゼへと共有結合的に連結することにより形成される、請求項20に記載の方法。
- 少なくとも0.3Mの塩濃度で標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのキットであって、(a)標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための解析装置およびRecDヘリカーゼ、または、(b)細孔およびRecDヘリカーゼを含み、前記RecDヘリカーゼは前記塩濃度で機能することが可能である、前記キット。
- 両親媒性層を含むチップをさらに含む、請求項22に記載のキット。
- 少なくとも0.3Mの塩濃度で試料中の標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための解析装置であって、(a)RecDヘリカーゼまたは(b)複数の細孔および複数のRecDヘリカーゼを含み、前記RecDヘリカーゼは前記塩濃度で機能することが可能である、前記解析装置。
- 複数の細孔を支持することが可能であり、細孔およびヘリカーゼを用いてポリヌクレオチドの特徴付けを実施するのに作動可能なセンサーデバイスと、
特徴付けを実施するための材料を保持するための少なくとも1つのリザーバーと、
材料を、少なくとも1つのリザーバーからセンサーデバイスへと、制御可能な形で供給するように構成された流体力学系と、
それぞれの試料を受容するための複数の容器であって、流体力学系が、試料を、容器からセンサーデバイスへと、選択的に供給するように構成された容器と
を含む、請求項24に記載の解析装置。 - 標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、
(a)RecDヘリカーゼが、標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、標的ポリヌクレオチドをRecDヘリカーゼと接触させるステップと、
(b)RecDヘリカーゼがポリヌクレオチドの移動を制御するときに、1または複数の測定を行うステップであって、測定値が、標的ポリヌクレオチドの1または複数の特徴を示し、これにより、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるステップと
を含み、
前記方法は少なくとも0.3Mの塩濃度を用いて実行され、前記RecDヘリカーゼは前記塩濃度で機能することが可能である、方法。 - (a)1または複数の特徴が、(i)標的ポリヌクレオチドの長さ、(ii)標的ポリヌクレオチドの同一性、(iii)標的ポリヌクレオチドの配列、(iv)標的ポリヌクレオチドの二次構造、および(v)標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択され、
(b)標的ポリヌクレオチドが、メチル化により、酸化により、損傷により、1もしく
は複数のタンパク質で、または1もしくは複数の標識、タグ、もしくはスペーサーで修飾され、および/または標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部が二本鎖であり、
(c)1または複数の特徴が、電気的測定および/または光学的測定により測定され、または
(d)RecDが、表4もしくは5に示されるヘリカーゼのうちの1つ、または配列の全体にわたり当該ヘリカーゼの配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有し、ヘリカーゼ活性を保持するその変異体であり、および/またはRecDヘリカーゼが、TraIヘリカーゼもしくはTraI亜群ヘリカーゼであり、ならびに/またはRecDヘリカーゼが、
・アミノ酸モチーフX1−X2−X3−G−X4−X5−X6−X7(配列番号8)[式中、X1は、G、S、またはAであり、X2は、任意のアミノ酸であり、X3は、P、A、S、またはGであり、X4は、T、A、V、S、またはCであり、X5は、GまたはAであり、X6は、KまたはRであり、X7は、TまたはSである];および/または
・アミノ酸モチーフX1−X2−X3−X4−X5−(X6)3−Q−X7(配列番号9、10、および11)[式中、X1は、Y、W、またはFであり、X2は、A、T、S、M、C、またはVであり、X3は、任意のアミノ酸であり、X4は、TまたはNであり、X5は、A、T、G、S、V、またはIであり、X6は、任意のアミノ酸であり、X7は、GまたはSである]
を含む、
請求項26に記載の方法。 - 塩がKClである、請求項26または27に記載の方法。
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