KR20150003272A - 돌연변이체 리세닌 기공 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 리세닌의 돌연변이체 형태에 관한 것이다. 본 발명은 또한 리세닌을 사용한 분석물 특성화에 관한 것이다.

Description

돌연변이체 리세닌 기공{MUTANT LYSENIN PORES}
본 발명은 리세닌의 돌연변이체 형태에 관한 것이다. 본 발명은 또한 리세닌의 돌연변이체 형태를 사용한 분석물 특성화에 관한 것이다.
나노기공 센싱이란 분석물 분자와 수용체 사이의 개별 결합 또는 상호작용 사건의 관찰에 의존하는 센싱 접근법이다. 나노기공 센서는 절연 막에 나노미터 크기의 단일 기공을 위치시키고, 분석물 분자의 존재 하에 기공을 통한 전압-구동식 이온 수송을 측정함으로써 생성시킬 수 있다. 분석물의 정체는 그의 독특한 전류 신호, 특히 전류 차단의 지속기간 및 정도, 및 전류 수준의 변동을 통해 밝혀진다.
현재, 광범위한 용도에 걸쳐 신속하고 저렴한 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA) 서열분석 기술에 대한 필요성이 존재한다. 기존의 기술은 느리고 고가인데, 이는 주로 이들이 대량의 핵산을 생산하기 위한 증폭 기술에 의존하고, 신호 검출을 위해 다량의 전문 형광 화학물질을 필요로 하기 때문이다. 나노기공 센싱은 필요한 뉴클레오티드 및 시약의 양을 감소시킴으로써 신속하고 저렴한 핵산 서열분석을 제공할 잠재력을 갖는다.
나노기공 센싱을 사용하여 핵산을 서열분석하는데 필수적인 성분 중 2가지는 (1) 기공을 통한 핵산 이동의 제어 및 (2) 핵산 중합체가 기공을 통해 이동할 때의 뉴클레오티드의 식별이다. 과거에는, 뉴클레오티드 식별을 달성하기 위해 핵산을 용혈소의 돌변변이체에 통과시켰다. 이는 서열 의존성인 것으로 나타난 전류 신호를 제공하였다. 또한, 용혈소가 사용되는 경우에는 다수의 뉴클레오티드가 관찰된 전류에 기여하여, 관찰된 전류와 폴리뉴클레오티드 사이의 직접적인 관계를 의심하게 하는 것으로 나타났다.
뉴클레오티드 식별을 위한 전류 범위는 용혈소 기공의 돌연변이를 통해 개선되었지만, 뉴클레오티드 사이의 전류 차이가 추가로 개선될 수 있다면 서열분석 시스템은 보다 높은 성능을 갖게 될 것이다. 또한, 핵산이 기공을 통해 이동할 때, 일부 전류 상태는 높은 변동을 나타내는 것으로 관찰되었다. 또한, 일부 돌연변이체 용혈소 기공은 다른 것보다 높은 변동을 나타내는 것으로 나타났다. 이들 상태의 변동은 서열 특이적 정보를 함유할 수 있지만, 시스템을 단순화하기 위해서는 낮은 변동을 갖는 기공을 생산하는 것이 바람직하다. 또한, 관찰된 전류에 기여하는 뉴클레오티드의 수를 감소시키는 것이 바람직하다.
리세닌 (efL1로도 공지됨)은 지렁이 에이세니아 페티다(Eisenia fetida)의 체강액으로부터 정제된 기공-형성 독소이다. 이것은 스핑고미엘린에 특이적으로 결합하고, 이는 리세닌-유도된 용혈을 억제한다 (문헌 [Yamaji et al., J. Biol. Chem. 1998; 273(9): 5300-6]). 리세닌의 결정 구조는 문헌 [De Colbis et al., Structure, 2012; 20: 1498-1507]에 개시되어 있다.
발명의 개요
본 발명자들은 놀랍게도 변형되어 단량체와 폴리뉴클레오티드 사이의 상호작용을 변경시킬 수 있는 리세닌 단량체 내의 영역을 확인하였다. 상기 영역은 서열 2의 대략적인 위치 44 내지 대략적인 위치 126에 상응한다. 본 발명은 폴리뉴클레오티드와 상호작용하는 단량체의 능력을 개선하기 위해 확인된 영역에 대해 하나 이상의 변형을 일으킨 돌연변이체 단량체에 관한 것이다. 또한, 본 발명자들은 놀랍게도 신규 돌연변이체 단량체를 포함하는 기공이 폴리뉴클레오티드와 상호작용하는 증진된 능력을 가짐으로써 폴리뉴클레오티드의 특징, 예컨대 서열을 추정하는 것에 대한 개선된 특성을 나타낸다는 것을 입증하였다. 돌연변이체 기공은 놀랍게도 개선된 뉴클레오티드 식별을 나타낸다. 특히, 돌연변이체 기공은 놀랍게도 상이한 뉴클레오티드 사이의 식별을 용이하게 하는 증가된 전류 범위, 및 신호 대 잡음 비를 증가시키는 감소된 상태 변동을 나타낸다. 또한, 폴리뉴클레오티드가 기공을 통해 이동할 때의 전류에 기여하는 뉴클레오티드의 수는 감소된다. 이는 폴리뉴클레오티드가 기공을 통해 이동할 때 관찰된 전류와 폴리뉴클레오티드 사이의 직접적인 관계를 확인하는 것을 보다 용이하게 한다.
따라서, 본 발명은 서열 2에 나타낸 서열의 변이체를 포함하고, 기공을 형성할 수 있으며, 여기서 변이체는 폴리뉴클레오티드와 상호작용하는 단량체의 능력을 변경시키는 서열 2의 대략적인 위치 44 내지 대략적인 위치 126의 영역 내의 하나 이상의 변형을 포함하는 것인 돌연변이체 리세닌 단량체를 제공한다.
본 발명은 또한
- 리세닌으로부터 유도된 2개 이상의 공유적으로 부착된 단량체를 포함하며, 여기서 단량체 중 적어도 1개는 본 발명의 돌연변이체 리세닌 단량체인 구축물;
- 본 발명의 돌연변이체 리세닌 단량체 또는 본 발명의 유전적으로 융합된 구축물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
- 충분한 수의 본 발명의 돌연변이체 리세닌 단량체를 포함하는 리세닌으로부터 유도된 호모-올리고머 기공;
- 적어도 1개의 본 발명의 돌연변이체 리세닌 단량체를 포함하는 리세닌으로부터 유도된 헤테로-올리고머 기공;
- 적어도 1개의 본 발명의 구축물을 포함하는 기공;
- (a) 표적 폴리뉴클레오티드를 본 발명의 기공과 접촉시켜 표적 폴리뉴클레오티드가 기공을 통해 이동하도록 하고; (b) 분석물이 기공에 대해 이동할 때 하나 이상의 측정을 수행하는 것을 포함하며, 여기서 측정은 표적 분석물의 1개 이상의 특징을 가리킴으로써 표적 분석물을 특성화하는 것인, 표적 분석물을 특성화하는 방법;
- 본 발명의 기공과 폴리뉴클레오티드 결합 단백질 사이의 복합체를 형성함으로써 표적 폴리뉴클레오티드를 특성화하기 위한 센서를 형성하는 것을 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드를 특성화하기 위한 센서를 형성하는 방법;
- 본 발명의 기공과 폴리뉴클레오티드 결합 단백질 사이의 복합체를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드를 특성화하기 위한 센서;
- 표적 분석물을 특성화하기 위한, 본 발명의 기공의 용도;
- (a) 본 발명의 기공 및 (b) 폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드를 특성화하기 위한 키트;
- (a) 다수의 본 발명의 기공 및 (b) 다수의 폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 포함하는, 샘플에서 표적 뉴클레오티드를 특성화하기 위한 장치;
- 폴리뉴클레오티드와 상호작용하는 단량체의 능력을 변경시키고 기공을 형성하는 단량체의 능력에는 영향을 미치지 않는 서열 2의 대략적인 위치 44 내지 대략적인 위치 126의 영역 내의 하나 이상의 변형을 일으키는 것을 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 특성화하는 서열 2에 나타낸 서열을 포함하는 리세닌 단량체의 능력을 개선하는 방법;
- 적어도 1개의 본 발명의 돌연변이체 리세닌 단량체를 리세닌으로부터 유도된 1개 이상의 단량체에 공유적으로 부착시키는 것을 포함하는, 본 발명의 구축물을 제조하는 방법;
- 적어도 1개의 본 발명의 돌연변이 단량체 또는 적어도 1개의 본 발명의 구축물이 충분한 수의 본 발명의 단량체, 본 발명의 구축물 또는 리세닌으로부터 유도된 단량체와 올리고머화되어 기공을 형성하도록 하는 것을 포함하는, 본 발명의 기공을 형성하는 방법
을 제공한다.
도 1은 리세닌 나노기공 (B로 표지함)을 통한 DNA 이동을 제어하기 위한 헬리카제 (A로 표지함)의 용도의 예시적인 개략도를 나타낸 것이다. 1) 콜레스테롤-태그 (D로 표지함)를 함유하는 어닐링된 프라이머를 갖는 ssDNA 기질을 이중층 (C로 표지함)의 시스 측 (X로 표지함)에 부가한다. 콜레스테롤-태그는 이중층에 결합하여, 이중층 표면에서 기질을 풍부화시킨다. 2) 시스 구획에 부가된 헬리카제는 DNA에 결합한다. 2가 금속 이온 및 NTP 기질의 존재 하에, 헬리카제는 DNA를 따라 이동한다 (회색 화살표). 3) 인가된 전압 하에, DNA 기질은 DNA 상의 리더 섹션을 통해 나노기공에 의해 포획된다. DNA에 결합된 헬리카제가 기공의 상부와 접촉할 때까지, 인가된 전위의 힘 하에 DNA가 기공을 통해 잡아당겨짐으로써 추가의 제어되지 않은 DNA 전위가 방지된다. 상기 과정 동안, dsDNA 섹션 (예컨대, 프라이머)이 제거된다. 3' → 5' 방향으로의 DNA를 따른 헬리카제 이동은 나선형 DNA를 인가된 장에 대항하여 기공 밖으로 잡아당긴다 (DNA 이동 방향은 흑색 화살표로 나타냄). 4) 헬리카제가 DNA를 나노기공 밖으로 잡아당겨, 이것을 시스 구획으로 되돌린다. 나노기공을 통과하는 DNA의 마지막 섹션은 5'-리더이다. 5) 헬리카제가 DNA를 나노기공 밖으로 이동시킬 때, 이것은 시스 구획에 다시 놓아진다. 대안적으로, DNA가 3' 단부에 의해 포획되면, DNA는 3'-5' 헬리카제의 제어 하에 시스에서 트랜스 (Y로 표지함)로 기공을 통해 이동하여 최종적으로 이중층의 트랜스 측 상에 존재할 것이다.
도 2는 실시예 1, 2, 3, 4, 5 및 6에 사용된 DNA 기질 설계를 나타낸 것이다. DNA 기질은 50T 5'-리더 (가닥 A의 파선 영역에 의해 나타냄)를 갖는, PhiX로부터의 ssDNA의 400개 염기 섹션 (서열 13, A로 표지함)으로 이루어진다. 이중층의 표면 상에서 DNA를 풍부화시킴으로써 포획 효율을 개선시키기 위해, 3' 콜레스테롤 태그 (C로 표지함)를 함유하는 프라이머 (B로 표지함)를 50T 리더 바로 뒤에서 상기 가닥에 어닐링시킨다.
도 3은 DPhPC 이중층에 삽입된 야생형 리세닌 기공의 전류 트레이스 (A 및 B에 대해 y축 = 전류 (pA), x축 = 시간 (분))를 나타낸 것이다. A)는 DNA 및 헬리카제의 부재 하에 +120 mV (625 mM KCl, 100 mM Hepes, pH 8.0, 75mM 페로시안화칼륨 (II), 25mM 페리시안화칼륨 (III), 10mM MgCl2, 야생형 리세닌 (서열 2))에서 대략 +280 pA의 안정한 개방 기공 전류가 관찰되었음을 나타낸다. B)는 DNA, 헬리카제 및 ATP (0.3 nM 400량체 DNA (서열 13 및 14), Hel308 Mbu, (100 nM, 서열 15), 1mM ATP)의 부가 시, 명백한 DNA 포획, 및 나노기공을 통한 헬리카제 제어된 DNA 이동이 존재하지 않음을 나타낸다.
도 4는 Hel308 Mbu (서열 15)가 제어된 방식으로 DNA를 리세닌 나노기공 (돌연변이 E84D/E85K를 갖는 서열 2인 리세닌-E84D/E85K)을 통해 이동시켜, DNA가 나노기공을 통해 이동할 때 전류에서의 단계적 변화를 생성할 수 있었음을 나타낸 것이다. A)는 ~400pA의 개방-기공 수준으로부터 ~200pA에서의 보다 낮은 전류 차단으로서 관찰되는, DNA 포획 및 Hel308 Mbu 제어된 400량체 DNA 이동의 예시적인 전류 트레이스 (y축 = 전류 (pA), x축 = 시간 (분))를 나타낸다 (180 mV, 625 mM KCl, 100 mM Hepes pH 8.0, 75 mM 페로시안화칼륨 (II), 25 mM 페리시안화칼륨, 0.3 nM 400량체 DNA (서열 13 및 14), 100 nM Hel308 Mbu (서열 15), 1 mM ATP, 10 mM MgCl2, 리세닌-E84D/E85K (돌연변이 E84D/E85K를 갖는 서열 2)). 별표는 헬리카제 제어된 DNA 이동을 나타낸다. 인가된 전위 하에, 헬리카제가 결합된 DNA는 리세닌 나노기공에 의해 포획된다. 이는 개방-기공 수준 (~400 pA)으로부터 DNA 수준 (~220 pA)으로의 전류에서의 차단을 생성한다. B)는 상부 트레이스에서의 헬리카제 제어된 DNA 이동의 확대도 (y축 = 전류 (pA), x축 = 시간 (분))를 나타낸다. DNA 수준은 효소가 DNA를 기공을 통해 이동시킬 때의 전류에서의 단계적 변화를 나타낸다.
도 5는 Hel308 Mbu (서열 15)가 제어된 방식으로 DNA를 리세닌 나노기공 (돌연변이 E92N/E94N/E97N/D121N/D126N을 갖는 서열 2인 리세닌-E92N/E94N/E97N/D121N/D126N)을 통해 이동시켜, DNA가 나노기공을 통해 이동할 때 전류에서의 단계적 변화를 생성할 수 있었음을 나타낸 것이다. A)는 전형적인 Hel308 Mbu 제어된 400량체 DNA 이동의 예시적인 전류 트레이스 (y축 = 전류 (pA), x축 = 시간 (분))를 나타낸다 (120 mV, 625 mM KCl, 100 mM Hepes pH 8.0, 75 mM 페로시안화칼륨 (II), 25 mM 페리시안화칼륨, 0.3 nM 400량체 DNA (서열 13 및 14), 100 nM Hel308 Mbu (서열 15), 1 mM ATP, 10 mM MgCl2, 리세닌-E92N/E94N/E97N/D121N/D126N (돌연변이 E92N/E94N/E97N/D121N/D126N을 갖는 서열 2)). 인가된 전위 하에, DNA는 리세닌 나노기공에 의해 포획된다. 상기 리세닌 돌연변이체는 WT 리세닌 대비 높은 수준의 DNA 포획을 나타낸다. 기공에 포획된 DNA는 개방-기공 수준 (~280 pA)으로부터 DNA 수준 (~110 pA)으로의 전류에서의 차단을 생성한다. 헬리카제가 결합된 DNA는 효소가 DNA를 기공을 통해 이동시킬 때 전류에서의 단계적 변화를 나타낸다. 헬리카제 제어된 DNA 이동은 별표에 의해 표시한다. B) 상부 트레이스에서의 전형적인 헬리카제 제어된 DNA 이동 중 하나의 확대도 (y축 = 전류 (pA), x축 = 시간 (분)). DNA 수준은 효소가 DNA를 기공을 통해 이동시킬 때의 전류에서의 단계적 변화를 나타낸다.
도 6은 Hel308 Mbu (서열 15)가 제어된 방식으로 DNA를 리세닌 나노기공 (돌연변이 E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A를 갖는 서열 2인 리세닌-E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A)을 통해 이동시켜, DNA가 나노기공을 통해 이동할 때 전류에서의 단계적 변화를 생성할 수 있었음을 나타낸 것이다. A)는 전형적인 Hel308 Mbu 제어된 DNA 이동의 예시적인 전류 트레이스 (y축 = 전류 (pA), x축 = 시간 (분))를 나타낸다 (180 mV, 625 mM KCl, 100 mM Hepes pH 8.0, 75 mM 페로시안화칼륨 (II), 25 mM 페리시안화칼륨, 0.6 nM 400량체 DNA (서열 13 및 14), 100 nM Hel308 Mbu (서열 15), 1 mM ATP, 10 mM MgCl2, 리세닌-E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A (돌연변이 E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A를 갖는 서열 2)). 인가된 전위 하에, DNA는 리세닌 나노기공에 의해 포획된다. 상기 리세닌 돌연변이체는 WT 리세닌 대비 높은 수준의 DNA 포획을 나타낸다. 기공에 포획된 DNA는 개방-기공 수준 (~390 pA)으로부터 DNA 수준 (~200 pA)으로의 전류에서의 차단을 생성한다. 헬리카제가 결합된 DNA는 효소가 DNA를 기공을 통해 이동시킬 때 전류에서의 단계적 변화를 나타낸다. 헬리카제 제어된 DNA 이동은 별표에 의해 표시한다. B) 상부 트레이스에서의 전형적인 헬리카제 제어된 DNA 이동 중 하나의 확대도 (y축 = 전류 (pA), x축 = 시간 (분)). DNA 수준은 효소가 DNA를 기공을 통해 이동시킬 때의 전류에서의 단계적 변화를 나타낸다.
도 7은 Hel308 Mbu (서열 15)가 제어된 방식으로 DNA를 리세닌 나노기공 (돌연변이 E76S/E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A를 갖는 서열 2인 리세닌-E76S/E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A)을 통해 이동시켜, DNA가 나노기공을 통해 이동할 때 전류에서의 단계적 변화를 생성할 수 있었음을 나타낸 것이다. A)는 전형적인 Hel308 Mbu 제어된 DNA 이동의 예시적인 전류 트레이스 (y축 = 전류 (pA), x축 = 시간 (초))를 나타낸다 (+180 mV, 625 mM KCl, 100 mM Hepes pH 8.0, 75 mM 페로시안화칼륨 (II), 25 mM 페리시안화칼륨 (III), pH 8.0, 1 mM ATP, 10 mM MgCl2, 0.6 nM DNA (서열 13 및 14), 100 nM Hel308 Mbu (서열 15), 돌연변이 E76S/E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A를 갖는 서열 2인 리세닌- E76S/E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A). B)는 상부 트레이스에서의 헬리카제 제어된 DNA 이동의 확대도 (y축 = 전류 (pA), x축 = 시간 (초))를 나타낸다. DNA 수준은 효소가 DNA를 기공을 통해 이동시킬 때의 전류에서의 단계적 변화를 나타낸다.
도 8은 Hel308 Mbu (서열 15)가 제어된 방식으로 DNA를 리세닌 나노기공 (돌연변이 E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A/E50S를 갖는 서열 2인 리세닌-E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A/E50S)을 통해 이동시켜, DNA가 나노기공을 통해 이동할 때 전류에서의 단계적 변화를 생성할 수 있었음을 나타낸 것이다. A)는 전형적인 Hel308 Mbu 제어된 DNA 이동의 예시적인 전류 트레이스 (y축 = 전류 (pA), x축 = 시간 (초))를 나타낸다 (+120 mV, 625 mM KCl, 100 mM Hepes pH 8.0, 75 mM 페로시안화칼륨 (II), 25 mM 페리시안화칼륨 (III), pH 8.0, 1 mM ATP, 10 mM MgCl2, 0.3 nM DNA (서열 13 및 14), 100 nM Hel308 Mbu (서열 15), 돌연변이 E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A/E50S를 갖는 서열 2인 리세닌-E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A/E50S). B)는 상부 트레이스에서의 헬리카제 제어된 DNA 이동의 확대도 (y축 = 전류 (pA), x축 = 시간 (초))를 나타낸다. DNA 수준은 효소가 DNA를 기공을 통해 이동시킬 때의 전류에서의 단계적 변화를 나타낸다.
도 9는 Hel308 Mbu (서열 15)가 제어된 방식으로 DNA를 리세닌 나노기공 (돌연변이 E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A/E71S를 갖는 서열 2인 리세닌-E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A/E71S)을 통해 이동시켜, DNA가 나노기공을 통해 이동할 때 전류에서의 단계적 변화를 생성할 수 있었음을 나타낸 것이다. A)는 전형적인 Hel308 Mbu 제어된 DNA 이동의 예시적인 전류 트레이스 (y축 = 전류 (pA), x축 = 시간 (분))를 나타낸다 (+180 mV, 625 mM KCl, 100 mM Hepes pH 8.0, 75 mM 페로시안화칼륨 (II), 25 mM 페리시안화칼륨 (III), pH 8.0, 1 mM ATP, 10 mM MgCl2, 0.3 nM DNA (서열 13 및 14), 100 nM Hel308 Mbu (서열 15), 돌연변이 E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A/E71S를 갖는 서열 2인 리세닌- E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A/E71S). B)는 상부 트레이스에서의 헬리카제 제어된 DNA 이동의 확대도 (y축 = 전류 (pA), x축 = 시간 (초))를 나타낸다. DNA 수준은 효소가 DNA를 기공을 통해 이동시킬 때의 전류에서의 단계적 변화를 나타낸다
도 10은 Hel308 Mbu (서열 15)가 제어된 방식으로 DNA를 리세닌 나노기공 (돌연변이 E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A/E128S를 갖는 서열 2인 리세닌-E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A/E128S)을 통해 이동시켜, DNA가 나노기공을 통해 이동할 때 전류에서의 단계적 변화를 생성할 수 있었음을 나타낸 것이다. A)는 전형적인 Hel308 Mbu 제어된 DNA 이동의 예시적인 전류 트레이스 (y축 = 전류 (pA), x축 = 시간 (초))를 나타낸다 (+180 mV, 625 mM KCl, 100 mM Hepes pH 8.0, 75 mM 페로시안화칼륨 (II), 25 mM 페리시안화칼륨 (III), pH 8.0, 1 mM ATP, 10 mM MgCl2, 0.6 nM DNA (서열 13 및 14), 100 nM Hel308 Mbu (서열 15), 돌연변이 E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A/E128S를 갖는 서열 2인 리세닌-E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A/E128S). B)는 상부 트레이스에서의 헬리카제 제어된 DNA 이동의 확대도 (y축 = 전류 (pA), x축 = 시간 (초))를 나타낸다. DNA 수준은 효소가 DNA를 기공을 통해 이동시킬 때의 전류에서의 단계적 변화를 나타낸다.
도 11은 Hel308 Mbu (서열 15)가 제어된 방식으로 DNA를 리세닌 나노기공 (돌연변이 E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A/D68S를 갖는 서열 2인 리세닌-E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A/D68S)을 통해 이동시켜, DNA가 나노기공을 통해 이동할 때 전류에서의 단계적 변화를 생성할 수 있었음을 나타낸 것이다. A)는 전형적인 Hel308 Mbu 제어된 DNA 이동의 예시적인 전류 트레이스 (y축 = 전류 (pA), x축 = 시간 (분))를 나타낸다 (+120 mV, 625 mM KCl, 100 mM Hepes pH 8.0, 75 mM 페로시안화칼륨 (II), 25 mM 페리시안화칼륨 (III), pH 8.0, 1 mM ATP, 10 mM MgCl2, 0.3 nM DNA (서열 13 및 14), 100 nM Hel308 Mbu (서열 15), 돌연변이 E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A/D68S를 갖는 서열 2인 리세닌- E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A/D68S). B)는 상부 트레이스에서의 헬리카제 제어된 DNA 이동의 확대도 (y축 = 전류 (pA), x축 = 시간 (초))를 나타낸다. DNA 수준은 효소가 DNA를 기공을 통해 이동시킬 때의 전류에서의 단계적 변화를 나타낸다.
도 12는 Hel308 Mbu (서열 15)가 제어된 방식으로 DNA를 리세닌 나노기공 (돌연변이 E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A/D121S를 갖는 서열 2인 리세닌-E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A/D121S)을 통해 이동시켜, DNA가 나노기공을 통해 이동할 때 전류에서의 단계적 변화를 생성할 수 있었음을 나타낸 것이다. A)는 전형적인 Hel308 Mbu 제어된 DNA 이동의 예시적인 전류 트레이스 (y축 = 전류 (pA), x축 = 시간 (초))를 나타낸다 (+120 mV, 625 mM KCl, 100 mM Hepes pH 8.0, 75 mM 페로시안화칼륨 (II), 25 mM 페리시안화칼륨 (III), pH 8.0, 1 mM ATP, 10 mM MgCl2, 0.6 nM DNA (서열 13 및 14), 100 nM Hel308 Mbu (서열 15), 돌연변이 E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A/D121S를 갖는 서열 2인 리세닌-E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A/D121S). B)는 상부 트레이스에서의 헬리카제 제어된 DNA 이동의 확대도 (y축 = 전류 (pA), x축 = 시간 (초))를 나타낸다. DNA 수준은 효소가 DNA를 기공을 통해 이동시킬 때의 전류에서의 단계적 변화를 나타낸다.
서열 목록의 설명
서열 1은 리세닌 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 2는 리세닌 단량체의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 3은 Phi29 DNA 폴리머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 4는 Phi29 DNA 폴리머라제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 5는 이. 콜라이(E. coli)로부터의 sbcB 유전자로부터 유래된 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 이것은 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 I 효소 (EcoExo I)를 코딩한다.
서열 6은 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 I 효소 (EcoExo I)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 7은 이. 콜라이로부터의 xthA 유전자로부터 유래된 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 이것은 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 III 효소를 코딩한다.
서열 8은 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 III 효소의 아미노산 서열을 나타낸다. 상기 효소는 이중 가닥 DNA (dsDNA)의 하나의 가닥으로부터의 5' 모노포스페이트 뉴클레오시드의 3' - 5' 방향으로의 분배성 소화를 수행한다. 가닥 상의 효소 개시는 대략 4개의 뉴클레오티드의 5' 오버행을 필요로 한다.
서열 9는 티. 써모필루스(T. thermophilus)로부터의 recJ 유전자로부터 유래된 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 이것은 티. 써모필루스로부터의 RecJ 효소 (TthRecJ-cd)를 코딩한다.
서열 10은 티. 써모필루스로부터의 RecJ 효소 (TthRecJ-cd)의 아미노산 서열을 나타낸다. 상기 효소는 ssDNA로부터의 5' 모노포스페이트 뉴클레오시드의 5' - 3' 방향으로의 진행성 소화를 수행한다. 가닥 상의 효소의 개시는 적어도 4개의 뉴클레오티드를 필요로 한다.
서열 11은 박테리오파지 람다 엑소 (redX) 유전자로부터 유래된 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 이것은 박테리오파지 람다 엑소뉴클리아제를 코딩한다.
서열 12는 박테리오파지 람다 엑소뉴클레아제의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열은 삼량체로 조립되는 3개의 동일한 서브유닛 중 하나이다. 효소는 dsDNA의 하나의 가닥으로부터의 뉴클레오티드의 5'-3' 방향으로의 고도의 진행성 소화를 수행한다 (http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0262.asp). 가닥 상의 효소 개시는 우선적으로 5' 포스페이트를 갖는 대략 4개의 뉴클레오티드의 5' 오버행을 필요로 한다.
서열 13 및 14는 실시예 1, 2, 3, 4, 5 및 6에 사용된 ssDNA의 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 서열 14는 3'-콜레스테롤 태그를 갖는다.
서열 15는 Hel308 Mbu의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 16은 리세닌 관련 단백질 (LRP) 1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 17은 리세닌 관련 단백질 (LRP) 1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 18은 리세닌 관련 단백질 (LRP) 1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 19는 파라스포린-2의 활성화 버전의 아미노산 서열을 나타낸다. 전장 단백질은 그의 아미노 및 카르복시 말단에서 절단되어 기공을 형성할 수 있는 활성화 버전을 형성한다.
발명의 상세한 설명
개시된 생성물 및 방법의 다양한 적용은 당업계의 특정 요구에 맞추어 질 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본원에 사용된 용어는 본 발명의 특정한 실시양태를 설명하는 목적만을 위한 것이며, 제한할 의도가 없다는 것이 또한 이해되어야 한다.
또한, 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같은 단수 형태는 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "돌연변이체 단량체"에 대한 언급은 "돌연변이체 단량체들"을 포함하고, "치환"에 대한 언급은 2개 이상의 이러한 치환을 포함하며, "기공"에 대한 언급은 2개 이상의 이러한 기공을 포함하고, "폴리뉴클레오티드"에 대한 언급은 2개 이상의 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식이다.
본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은, 상기한 것이든 하기한 것이든 관계없이, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
돌연변이체 리세닌 단량체
본 발명은 돌연변이체 리세닌 단량체를 제공한다. 돌연변이체 리세닌 단량체는 본 발명의 기공을 형성하는데 사용될 수 있다. 돌연변이체 리세닌 단량체는, 그의 서열이 야생형 리세닌 단량체 (즉, 서열 2)의 것과 상이하고, 본 발명의 다른 단량체 또는 리세닌으로부터의 또는 리세닌으로부터 유도된 다른 단량체의 존재 하에 기공을 형성하는 능력을 보유하는 단량체이다. 기공을 형성하는 돌연변이체 단량체의 능력을 확인하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있고, 하기에서 보다 상세하게 논의된다. 예를 들어, 기공을 형성하는 돌연변이체 단량체의 능력은 실시예 1에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
돌연변이체 단량체는 폴리뉴클레오티드와 상호작용하는 변경된 능력을 갖는다. 따라서, 돌연변이체 단량체 중 1개 이상을 포함하는 기공은, 예를 들어 (1) 개선된 폴리뉴클레오티드 포획 및 (2) 개선된 폴리뉴클레오티드 인식 또는 식별을 나타내는 개선된 뉴클레오티드 판독 특성을 갖는다. 특히, 돌연변이체 단량체로부터 구축된 기공은 야생형보다 용이하게 뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드를 포획한다. 또한, 돌연변이체 단량체로부터 구축된 기공은 상이한 뉴클레오티드 사이의 식별을 용이하게 하는 증가된 전류 범위, 및 신호 대 잡음 비를 증가시키는 감소된 상태 변동을 나타낸다. 또한, 폴리뉴클레오티드가 단량체로부터 구축된 기공을 통해 이동할 때의 전류에 기여하는 뉴클레오티드의 수는 감소된다. 이는 폴리뉴클레오티드가 기공을 통해 이동할 때 관찰된 전류와 폴리뉴클레오티드 사이의 직접적인 관계를 확인하는 것을 보다 용이하게 한다. 돌연변이체의 개선된 뉴클레오티드 판독 특성은 5가지 주요 메카니즘을 통해, 즉
· 입체구조에서의 변화 (아미노산 잔기의 크기 증가 또는 감소)
· 전하에서의 변화 (예를 들어, -ve 전하의 도입 또는 제거 및/또는 +ve 전하의 도입 또는 제거);
· 수소 결합에서의 변화 (예를 들어, 염기 쌍에 수소 결합할 수 있는 아미노산의 도입);
· 파이 스태킹에서의 변화 (예를 들어, 비편재화 전자 파이계를 통해 상호작용하는 아미노산의 도입); 및/또는
· 기공의 구조 변경에서의 변화 (예를 들어, 배럴 또는 채널의 크기를 증가시키는 아미노산의 도입)
에 의해 달성된다.
이들 5가지 메카니즘 중 임의의 하나 이상이 본 발명의 돌연변이체 단량체로부터 형성된 기공의 개선된 특성의 원인이 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 돌연변이체 단량체를 포함하는 기공은 변경된 입체구조, 변경된 수소 결합 및 변경된 구조의 결과로서 개선된 뉴클레오티드 판독 특성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 돌연변이체 단량체는 서열 2에 나타낸 서열의 변이체를 포함한다. 서열 2는 리세닌 단량체의 야생형 서열이다. 서열 2의 변이체는, 서열 2의 것과 상이한 아미노산 서열을 갖고, 기공을 형성하는 그의 능력을 보유하는 폴리펩티드이다.
본 발명자들은 놀랍게도 폴리뉴클레오티드가 단량체를 포함하는 기공으로의 나노기공 센싱을 사용하여 특성화될 때와 같은, 단량체와 폴리뉴클레오티드 사이의 상호작용을 변경시키기 위해 변형될 수 있는 리세닌 단량체 내의 영역을 확인하였다. 영역은 서열 2의 대략적인 위치 44 내지 대략적인 위치 126이다. 상기 영역의 적어도 일부는 전형적으로 리세닌의 막 관통 영역에 기여한다. 상기 영역의 적어도 일부는 전형적으로 리세닌의 배럴 또는 채널에 기여한다. 상기 영역의 적어도 일부는 전형적으로 리세닌의 내벽 또는 내층에 기여한다.
리세닌의 막횡단 영역은 서열 2의 위치 44 내지 67로서 확인되었다 (문헌 [De Colbis et al., Structure, 2012; 20: 1498-1507]).
본 발명에 따르면, 변이체는 폴리뉴클레오티드와 상호작용하는 단량체 또는 바람직하게는 영역의 능력을 변경시키는 서열 2의 대략적인 위치 44 내지 대략적인 위치 126의 영역 내의 하나 이상의 변형을 포함한다. 단량체와 폴리뉴클레오티드 사이의 상호작용은 증가 또는 감소될 수 있다. 단량체와 폴리뉴클레오티드 사이의 증가된 상호작용은, 예를 들어 돌연변이체 단량체를 포함하는 기공에 의한 폴리뉴클레오티드의 포획을 용이하게 할 것이다. 영역과 폴리뉴클레오티드 사이의 감소된 상호작용은, 예를 들어 폴리뉴클레오티드의 인식 또는 식별을 개선할 것이다. 폴리뉴클레오티드의 인식 또는 식별은 돌연변이체 단량체를 포함하는 기공의 상태 변동을 감소 (신호 대 잡음 비를 증가)시키고/거나 폴리뉴클레오티드가 돌연변이체 단량체를 포함하는 기공을 통해 이동할 때의 전류에 기여하는 폴리뉴클레오티드에서의 뉴클레오티드의 수를 감소시킴으로써 개선될 수 있다.
따라서, 본 발명은 서열 2에 나타낸 서열의 변이체를 포함하고, 기공을 형성할 수 있으며, 여기서 변이체는 폴리뉴클레오티드와 상호작용하는 돌연변이체 리세닌 단량체의 능력을 변경시키는 서열 2의 대략적인 위치 44 내지 대략적인 위치 126의 하나 이상의 변형을 포함하는 것인 돌연변이체 리세닌 단량체를 제공한다.
폴리뉴클레오티드와 상호작용하는 단량체의 능력은 당업계에 익히 공지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 단량체는 임의의 방식으로, 예를 들어 비-공유 상호작용, 예컨대 소수성 상호작용, 수소 결합, 반 데르 발스 힘, 파이 (π)-양이온 상호작용 또는 정전기력에 의해 폴리뉴클레오티드와 상호작용할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드에 결합하는 영역의 능력은 통상의 결합 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 적합한 검정은 형광-기반 결합 검정, 핵 자기 공명 (NMR), 등온 적정 열량측정법 (ITC) 또는 전자 스핀 공명 (ESR) 분광분석법을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드와 상호작용하는 돌연변이체 단량체 중 1개 이상을 포함하는 기공의 능력은 상기 또는 하기에 논의된 임의의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직한 검정은 실시예에 기재되어 있다.
하나 이상의 변형은 서열 2의 대략적인 위치 44 내지 대략적인 위치 126의 영역 내에 존재한다. 하나 이상의 변형은 바람직하게는 하기 영역: 대략적인 위치 40 내지 대략적인 위치 125, 대략적인 위치 50 내지 대략적인 위치 120, 대략적인 위치 60 내지 대략적인 위치 110 및 대략적인 위치 70 내지 대략적인 위치 100 중 임의의 하나 내에 존재한다. 폴리뉴클레오티드 포획을 개선하기 위해 하나 이상의 변형을 일으키는 경우에, 이는 보다 바람직하게는 하기 영역: 대략적인 위치 44 내지 대략적인 위치 103, 대략적인 위치 68 내지 대략적인 위치 103, 대략적인 위치 84 내지 대략적인 위치 103, 대략적인 위치 44 내지 대략적인 위치 97, 대략적인 위치 68 내지 대략적인 위치 97 또는 대략적인 위치 84 내지 대략적인 위치 97 중 임의의 하나 내에 일으킨다. 폴리뉴클레오티드 인식 또는 식별을 개선하기 위해 하나 이상의 변형을 일으키는 경우에, 이는 보다 바람직하게는 하기 영역: 대략적인 위치 44 내지 대략적인 위치 109, 대략적인 위치 44 내지 대략적인 위치 97 또는 대략적인 위치 48 내지 대략적인 위치 88 중 임의의 하나 내에 일으킨다. 영역은 바람직하게는 서열 2의 대략적인 위치 44 내지 대략적인 위치 67이다.
폴리뉴클레오티드 인식 또는 식별을 개선하기 위해 하나 이상의 변형을 의도하는 경우에, 이는 바람직하게는 폴리뉴클레오티드 포획을 개선하기 위한 하나 이상의 변형에 더하여 일으킨다. 하기에 논의된 바와 같이, 이는 돌연변이체 단량체로부터 형성된 기공이 폴리뉴클레오티드를 효과적으로 포획한 다음, 폴리뉴클레오티드를 특성화하는, 예컨대 그의 서열을 추정하는 것을 가능하게 한다.
폴리뉴클레오티드와 상호작용하는 그의 능력을 변경시키고, 특히 폴리뉴클레오티드를 포획 및/또는 인식 또는 식별하는 그의 능력을 개선하는 단백질 나노기공의 변형은 당업계에 익히 기록되어 있다. 예를 들어, 이러한 변형은 WO 2010/034018 및 WO 2010/055307에 개시되어 있다. 유사한 변형을 본 발명에 따른 리세닌 단량체에 일으킬 수 있다.
임의의 수의 변형, 예컨대 1, 2, 5, 10, 15, 20, 30 또는 그 초과의 변형을 일으킬 수 있다. 폴리뉴클레오티드와 상호작용하는 단량체의 능력을 변경시키는 한, 임의의 변형(들)을 일으킬 수 있다. 적합한 변형은 아미노산 치환, 아미노산 부가 및 아미노산 결실을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 하나 이상의 변형은 바람직하게는 하나 이상의 치환이다. 이는 하기에 보다 상세하게 논의된다.
하나 이상의 변형은 바람직하게는 (a) 단량체의 입체 효과를 변경시키거나, 또는 바람직하게는 영역의 입체 효과를 변경시키고/거나, (b) 단량체의 순 전하를 변경시키거나, 또는 바람직하게는 영역의 순 전하를 변경시키고/거나, (c) 폴리뉴클레오티드와 수소 결합하는 단량체, 또는 바람직하게는 영역의 능력을 변경시키고/거나, (d) 비편재화 전자 파이계를 통해 상호작용하는 화학적 기를 도입 또는 제거하고/거나, (e) 단량체의 구조를 변경시키거나, 또는 바람직하게는 영역의 구조를 변경시킨다. 하나 이상의 변형은 보다 바람직하게는 (a) 내지 (e), 예컨대 (a) 및 (b); (a) 및 (c); (a) 및 (d); (a) 및 (e); (b) 및 (c); (b) 및 (d); (b) 및 (e); (c) 및 (d); (c) 및 (e); (d) 및 (e), (a), (b) 및 (c); (a), (b) 및 (d); (a), (b) 및 (e); (a), (c) 및 (d); (a), (c) 및 (e); (a), (d) 및 (e); (b), (c) 및 (d); (b), (c) 및 (e); (b), (d) 및 (e); (c), (d) 및 (e); (a), (b), (c) 및 (d); (a), (b), (c) 및 (e); (a), (b), (d) 및 (e); (a), (c), (d) 및 (e); (b), (c), (d) 및 (e); 및 (a), (b), (c) 및 (d)의 임의의 조합을 생성한다.
(a)에 대해, 단량체의 입체 효과는 증가 또는 감소될 수 있다. 입체 효과를 변경시키는 임의의 방법이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 벌키 잔기, 예컨대 페닐알라닌 (F), 트립토판 (W), 티로신 (Y) 또는 히스티딘 (H)의 도입은 단량체의 입체구조를 증가시킨다. 하나 이상의 변형은 바람직하게는 F, W, Y 및 H 중 하나 이상의 도입이다. F, W, Y 및 H의 임의의 조합이 도입될 수 있다. F, W, Y 및 H 중 하나 이상은 부가에 의해 도입될 수 있다. F, W, Y 및 H 중 하나 이상은 바람직하게는 치환에 의해 도입된다. 이러한 잔기의 도입에 적합한 위치는 하기에 보다 상세하게 논의된다.
벌키 잔기, 예컨대 페닐알라닌 (F), 트립토판 (W), 티로신 (Y) 또는 히스티딘 (H)의 제거는 반대로 단량체의 입체구조를 감소시킨다. 하나 이상의 변형은 바람직하게는 F, W, Y 및 H 중 하나 이상의 제거이다. F, W, Y 및 H의 임의의 조합이 제거될 수 있다. F, W, Y 및 H 중 하나 이상은 결실에 의해 제거될 수 있다. F, W, Y 및 H 중 하나 이상은 바람직하게는 보다 작은 측기를 갖는 잔기, 예컨대 세린 (S), 트레오닌 (T), 알라닌 (A) 및 발린 (V)으로의 치환에 의해 제거된다.
(b)에 대해, 순 전하는 임의의 방식으로 변경될 수 있다. 순 양전하는 바람직하게는 증가 또는 감소된다. 순 양전하는 임의의 방식으로 증가될 수 있다. 순 양전하는 바람직하게는 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산를 도입, 바람직하게는 치환시키고/거나 하나 이상의 음전하를 중화, 바람직하게는 치환시킴으로써 증가된다.
순 양전하는 바람직하게는 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산을 도입함으로써 증가된다. 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산은 부가에 의해 도입될 수 있다. 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산은 바람직하게는 치환에 의해 도입된다. 양으로 하전된 아미노산은 순 양전하를 갖는 아미노산이다. 양으로 하전된 아미노산(들)은 자연 발생 또는 비-자연 발생일 수 있다. 양으로 하전된 아미노산은 합성 또는 변형될 수 있다. 예를 들어, 순 양전하를 갖는 변형된 아미노산은 본 발명에서 사용하기 위해 특이적으로 설계될 수 있다. 아미노산에 대한 다수의 상이한 유형의 변형은 당업계에 익히 공지되어 있다.
양으로 하전된 바람직한 자연 발생 아미노산은 히스티딘 (H), 리신 (K) 및 아르기닌 (R)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 하나 이상의 변형은 바람직하게는 H, K 및 R 중 하나 이상의 도입이다. 임의의 수 및 조합의 H, K 및 R이 도입될 수 있다. H, K 및 R 중 하나 이상은 부가에 의해 도입될 수 있다. H, K 및 R 중 하나 이상은 바람직하게는 치환에 의해 도입된다. 이러한 잔기의 도입에 적합한 위치는 하기에 보다 상세하게 논의된다.
자연 발생 아미노산을 부가 또는 치환하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 메티오닌 (M)은 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에서의 관련 위치에서 메티오닌 (ATG)에 대한 코돈을 아르기닌 (AGA)에 대한 코돈으로 대체함으로써 아르기닌 (R)으로 치환될 수 있다. 이어서, 폴리뉴클레오티드는 하기에 논의된 바와 같이 발현될 수 있다.
비-자연 발생 아미노산을 부가 또는 치환하는 방법 또한 당업계에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 비-자연 발생 아미노산은 기공을 발현시키는데 사용되는 IVTT 시스템에 합성 아미노아실-tRNA를 포함시킴으로써 도입될 수 있다. 대안적으로, 이것은 특정 아미노산의 합성 (즉, 비-자연 발생) 유사체의 존재 하에 그 특정 아미노산에 대한 영양요구성인 이. 콜라이에서 단량체를 발현시킴으로써 도입될 수 있다. 이것은 또한 기공이 부분적 펩티드 합성을 사용하여 생산되는 경우에 네이키드 라이게이션에 의해 생산될 수 있다.
임의의 아미노산이 양으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 하나 이상의 비하전 아미노산, 비-극성 아미노산 및/또는 방향족 아미노산이 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 비하전 아미노산은 순 전하를 갖지 않는다. 적합한 비하전 아미노산은 시스테인 (C), 세린 (S), 트레오닌 (T), 메티오닌 (M), 아스파라긴 (N) 및 글루타민 (Q)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 비-극성 아미노산은 비-극성 측쇄를 갖는다. 적합한 비-극성 아미노산은 글리신 (G), 알라닌 (A), 프롤린 (P), 이소류신 (I), 류신 (L) 및 발린 (V)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 방향족 아미노산은 방향족 측쇄를 갖는다. 적합한 방향족 아미노산은 히스티딘 (H), 페닐알라닌 (F), 트립토판 (W) 및 티로신 (Y)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 하나 이상의 음으로 하전된 아미노산은 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다. 적합한 음으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 (D) 및 글루탐산 (E)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
바람직한 도입은 E의 K로의 치환, M의 R로의 치환, M의 H로의 치환, M의 K로의 치환, D의 R로의 치환, D의 H로의 치환, D의 K로의 치환, E의 R로의 치환, E의 H로의 치환, N의 R로의 치환, T의 R로의 치환 및 G의 R로의 치환을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 가장 바람직하게는 E를 K로 치환한다.
임의의 수의 양으로 하전된 아미노산이 도입 또는 치환될 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30개 또는 그 초과의 양으로 하전된 아미노산이 도입 또는 치환될 수 있다.
순 양전하는 보다 바람직하게는 하나 이상의 음전하를 중화시킴으로써 증가된다. 하나 이상의 음전하는, 하나 이상의 음으로 하전된 아미노산을 하나 이상의 비하전 아미노산, 비-극성 아미노산 및/또는 방향족 아미노산으로 대체함으로써 중화될 수 있다. 음전하의 제거는 순 양전하를 증가시킨다. 비하전 아미노산, 비-극성 아미노산 및/또는 방향족 아미노산은 자연 발생 또는 비-자연 발생일 수 있다. 이것은 합성 또는 변형될 수 있다. 적합한 비하전 아미노산, 비-극성 아미노산 및 방향족 아미노산은 상기에 논의되어 있다. 바람직한 치환은 E의 Q로의 치환, E의 S로의 치환, E의 A로의 치환, D의 Q로의 치환, E의 N으로의 치환, D의 N으로의 치환, D의 G로의 치환 및 D의 S로의 치환을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
임의의 수 및 조합의 비하전 아미노산, 비-극성 아미노산 및/또는 방향족 아미노산이 치환될 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25 또는 30개 또는 그 초과의 비하전 아미노산, 비-극성 아미노산 및/또는 방향족 아미노산이 치환될 수 있다. 음으로 하전된 아미노산은 (1) 비하전 아미노산; (2) 비-극성 아미노산; (3) 방향족 아미노산; (4) 비하전 아미노산 및 비-극성 아미노산; (5) 비하전 아미노산 및 방향족 아미노산; 및 (5) 비-극성 아미노산 및 방향족 아미노산; 또는 (6) 비하전 아미노산, 비-극성 아미노산 및 방향족 아미노산으로 치환될 수 있다.
하나 이상의 음전하는 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산을 하나 이상의 음으로 하전된 아미노산에 근접하게, 예컨대 1, 2, 3 또는 4개 아미노산 내에, 또는 인접하게 도입함으로써 중화될 수 있다. 양으로 및 음으로 하전된 아미노산의 예는 상기에 논의되어 있다. 양으로 하전된 아미노산은 상기에 논의된 임의의 방식, 예를 들어 치환에 의해 도입될 수 있다.
순 양전하는 바람직하게는 하나 이상의 음으로 하전된 아미노산을 도입하고/거나 하나 이상의 양전하를 중화시킴으로써 감소된다. 이를 수행할 수 있는 방법은 순 양전하를 증가시키는 것과 관련한 상기 논의로부터 명백할 것이다. 순 양전하를 증가시키는 것과 관련하여 상기에 논의된 모든 실시양태는, 전하가 반대 방식으로 변경된 것을 제외하고는, 순 양전하를 감소시키는 것에 동등하게 적용된다. 특히, 하나 이상의 양전하는 바람직하게는 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산을 하나 이상의 비하전 아미노산, 비-극성 아미노산 및/또는 방향족 아미노산으로 치환하거나 또는 하나 이상의 음으로 하전된 아미노산을 하나 이상의 음으로 하전된 아미노산에 근접하게, 예컨대 1, 2, 3 또는 4개 아미노산 내에, 또는 인접하게 도입함으로써 중화된다.
순 음전하는 바람직하게는 증가 또는 감소된다. 순 양전하를 증가 또는 감소시키는 것과 관련하여 상기에 논의된 모든 상기 실시양태는 순 음전하를 감소 또는 증가시키는 것에 각각 동등하게 적용된다.
(c)에 대해, 수소 결합하는 단량체의 능력은 임의의 방식으로 변경될 수 있다. 세린 (S), 트레오닌 (T), 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q), 티로신 (Y) 또는 히스티딘 (H)의 도입은 단량체의 수소 결합 능력을 증가시킨다. 하나 이상의 변형은 바람직하게는 S, T, N, Q, Y 및 H 중 하나 이상의 도입이다. S, T, N, Q, Y 및 H의 임의의 조합이 도입될 수 있다. S, T, N, Q, Y 및 H 중 하나 이상은 부가에 의해 도입될 수 있다. S, T, N, Q, Y 및 H 중 하나 이상은 바람직하게는 치환에 의해 도입된다. 이러한 잔기의 도입에 적합한 위치는 하기에 보다 상세하게 논의된다.
세린 (S), 트레오닌 (T), 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q), 티로신 (Y) 또는 히스티딘 (H)의 제거는 단량체의 수소 결합 능력을 감소시킨다. 하나 이상의 변형은 바람직하게는 S, T, N, Q, Y 및 H 중 하나 이상의 제거이다. S, T, N, Q, Y 및 H의 임의의 조합이 제거될 수 있다. S, T, N, Q, Y 및 H 중 하나 이상은 결실에 의해 제거될 수 있다. S, T, N, Q, Y 및 H 중 하나 이상은 바람직하게는 수소 결합이 보다 약한 다른 아미노산, 예컨대 알라닌 (A), 발린 (V), 이소류신 (I) 및 류신 (L)으로의 치환에 의해 제거된다.
(d)에 대해, 방향족 잔기, 예컨대 페닐알라닌 (F), 트립토판 (W), 티로신 (Y) 또는 히스티딘 (H)의 도입은 또한 단량체에서 파이 스태킹을 증가시킨다. 방향족 잔기, 예컨대 페닐알라닌 (F), 트립토판 (W), 티로신 (Y) 또는 히스티딘 (H)의 제거 또한 단량체에서 파이 스태킹을 증가시킨다. 이러한 아미노산은 (a)와 관련하여 상기에 논의된 바와 같이 도입 또는 제거될 수 있다.
(e)에 대해, 단량체의 구조를 변경시키는 하나 이상의 변형이 본 발명에 따라 일어난다. 예를 들어, 하나 이상의 루프 영역이 제거, 단축 또는 연장될 수 있다. 이는 전형적으로 기공 내 또는 외로의 폴리뉴클레오티드 진입 또는 배출을 용이하게 한다. 하나 이상의 루프 영역은 기공의 시스 측, 기공의 트랜스 측 또는 기공의 양측일 수 있다. 대안적으로, 기공의 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단의 하나 이상의 영역이 연장 또는 결실된다. 이는 전형적으로 기공의 크기 및/또는 전하를 변경한다.
특정 아미노산의 도입이 하나 초과의 메카니즘을 통해 폴리뉴클레오티드와 상호작용하는 단량체의 능력을 증진시킬 것임은 상기 논의로부터 명백할 것이다. 예를 들어, E의 H로의 치환은 (b)에 따라 (음전하를 중화시킴으로써) 순 양전하를 증가시킬 뿐만 아니라, (c)에 따라 수소 결합하는 단량체의 능력을 증가시킬 것이다.
변이체는 바람직하게는 서열 2의 하기 위치: M44, N46, N48, E50, R52, H58, D68, F70, E71, S74, E76, S78, Y79, S80, H81, S82, E84, E85, S86, Q87, S89, M90, E92, E94, E97, E102, H103, T104, T106, R115, Q117, N119, D121 및 D126 중 하나 이상에서의 치환을 포함한다. 변이체는 바람직하게는 상기 위치 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 또는 34개에서의 치환을 포함한다. 변이체는 바람직하게는 서열 2의 하기 위치: D68, E71, S74, E76, S78, S80, S82, E84, E85, S86, Q87, S89, E92, E102, T104, T106, R115, Q117, N119 및 D121 중 하나 이상에서의 치환을 포함한다. 변이체는 바람직하게는 상기 위치 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개에서의 치환을 포함한다. 변이체 내로 치환된 아미노산은 그의 자연 발생 또는 비-자연 발생 유도체일 수 있다. 변이체 내로 치환된 아미노산은 D-아미노산일 수 있다. 상기에 나열된 각각의 위치는 아스파라긴 (N), 세린 (S), 글루타민 (Q), 아르기닌 (R), 글리신 (G), 티로신 (Y), 아스파르트산 (D), 류신 (L), 리신 (K) 또는 알라닌 (A)으로 치환될 수 있다.
변이체는 바람직하게는 서열 2의 하기 돌연변이:
(a) 위치 44에서의 세린 (S);
(b) 위치 46에서의 세린 (S);
(c) 위치 48에서의 세린 (S);
(d) 위치 52에서의 세린 (S);
(e) 위치 58에서의 세린 (S);
(f) 위치 68에서의 세린 (S);
(g) 위치 70에서의 세린 (S);
(h) 위치 71에서의 세린 (S);
(i) 위치 76에서의 세린 (S);
(j) 위치 79에서의 세린 (S);
(k) 위치 81에서의 세린 (S);
(l) 위치 84에서의 세린 (S), 아스파르트산 (D) 또는 글루타민 (Q);
(m) 위치 85에서의 세린 (S) 또는 리신 (K);
(n) 위치 87에서의 세린 (S);
(o) 위치 90에서의 세린 (S);
(p) 위치 92에서의 아스파라긴 (N) 또는 글루타민 (Q);
(q) 위치 94에서의 세린 (S) 또는 아스파라긴 (N);
(r) 위치 97에서의 세린 (S) 또는 아스파라긴 (N);
(s) 위치 102에서의 세린 (S);
(t) 위치 103에서의 세린 (S);
(u) 위치 121에서의 아스파라긴 (N) 또는 세린 (S);
(v) 위치 50에서의 세린 (S);
(w) 위치 94에서의 아스파라긴 (N) 또는 세린 (S);
(x) 위치 97에서의 아스파라긴 (N) 또는 세린 (S);
(y) 위치 121에서의 세린 (S) 또는 아스파라긴 (N);
(z) 위치 126에서의 아스파라긴 (N) 또는 글루타민 (Q) 또는 글리신 (G); 및
(aa) 위치 128에서의 세린 (S) 또는 아스파라긴 (N)
중 적어도 하나를 포함한다.
변이체는 임의의 수의 돌연변이 (a) 내지 (aa), 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27개의 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이의 바람직한 조합은 하기에서 논의된다. 변이체 내로 도입된 아미노산은 그의 자연 발생 또는 비-자연 발생 유도체일 수 있다. 변이체 내로 도입된 아미노산은 D-아미노산일 수 있다.
변이체는 바람직하게는 서열 2의 하기 돌연변이:
(a) 위치 68에서의 세린 (S);
(b) 위치 71에서의 세린 (S);
(c) 위치 76에서의 세린 (S);
(d) 위치 84에서의 아스파르트산 (D) 또는 글루타민 (Q);
(e) 위치 85에서의 리신 (K);
(f) 위치 92에서의 아스파라긴 (N) 또는 글루타민 (Q);
(g) 위치 102에서의 세린 (S);
(h) 위치 121에서의 아스파라긴 (N) 또는 세린 (S);
(i) 위치 50에서의 세린 (S);
(j) 위치 94에서의 아스파라긴 (N) 또는 세린 (S);
(k) 위치 97에서의 아스파라긴 (N) 또는 세린 (S); 및
(l) 위치 126에서의 아스파라긴 (N) 또는 글루타민 (Q) 또는 글리신 (G)
중 적어도 하나를 포함한다.
변이체는 임의의 수의 돌연변이 (a) 내지 (l), 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이의 바람직한 조합은 하기에서 논의된다. 변이체 내로 도입된 아미노산은 그의 자연 발생 또는 비-자연 발생 유도체일 수 있다. 변이체 내로 도입된 아미노산은 D-아미노산일 수 있다.
변이체는 상기에 논의된 영역에서의 변형과 조합하여 폴리뉴클레오티드 포획을 개선하고/하거나 폴리뉴클레오티드 인식 또는 식별을 개선하는, 서열 2의 대략적인 위치 44 내지 대략적인 위치 126의 영역 외부의 하나 이상의 추가의 변형을 포함할 수 있다. 적합한 변형은 D35, E128, E135, E134 및 E167 중 하나 이상에서의 치환을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특히, 위치 128, 135, 134 및 167 중 하나 이상에서의 E의 치환에 의한 음전하의 제거는 폴리뉴클레오티드 포획을 개선한다. 이들 위치 중 하나 이상에서의 E는 상기에 논의된 방식 중 임의의 것으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, E128, E135, E134 및 E167 모두가 상기에 논의된 바와 같이 치환된다. E는 바람직하게는 A로 치환된다. 즉, 변이체는 바람직하게는 E128A, E135A, E134A 및 E167A 중 하나 이상, 또는 모두를 포함한다. 또 다른 바람직한 치환은 D35Q이다.
바람직한 실시양태에서, 변이체는 서열 2에서의 하기 치환:
i. E84D 및 E85K 중 하나 이상, 예컨대 둘 다;
ii. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G 및 E167A 중 하나 이상, 예컨대 2, 3, 4, 5 또는 6개;
iii. E92N, E94N, E97N, D121N 및 D126N 중 하나 이상, 예컨대 2, 3, 4 또는 5개;
iv. E92N, E94N, E97N, D121N, D126N 및 E128N 중 하나 이상, 예컨대 2, 3, 4, 5 또는 6개;
v. E76S, E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G 및 E167A 중 하나 이상, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개;
vi. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 E50S 중 하나 이상, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개;
vii. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 E71S 중 하나 이상, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개;
viii. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 E94S 중 하나 이상, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개;
ix. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 E102S 중 하나 이상, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개;
x. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 E128S 중 하나 이상, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개;
xi. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 E135S 중 하나 이상, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개;
xii. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 D68S 중 하나 이상, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개;
xiii. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 D121S 중 하나 이상, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개;
xiv. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 D134S 중 하나 이상, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개;
xv. E84D, E85K 및 E92Q 중 하나 이상, 예컨대 2 또는 3개;
xvi. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G 및 E135S 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개;
xvii. E85K, E92Q, E94S, E97S 및 D126G 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개;
xviii. E76S, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개;
xix. E71S, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개;
xx. D68S, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개;
xxi. E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3 또는 4개;
xxii. E84Q, E85K, E92Q, E97S, H103S 및 D126G 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개;
xxiii. E84Q, E85K, M90S, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개;
xxiv. E84Q, Q87S, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개;
xxv. E84Q, E85S, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개;
xxvi. E84S, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개;
xxvii. H81S, E84Q, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개;
xxviii. Y79S, E84Q, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개;
xxix. F70S, E84Q, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개;
xxx. H58S, E84Q, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개;
xxxi. R52S, E84Q, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개;
xxxii. N48S, E84Q, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개;
xxxiii. N46S, E84Q, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개;
xxxiv. M44S, E84Q, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개;
xxxv. E92Q 및 E97S 중 하나 이상, 예컨대 둘 다;
xxxvi. E84Q, E85K, E92Q 및 E97S 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3 또는 4개;
xxxvii. E84Q 및 E85K 중 하나 이상, 예컨대 둘 다;
xxxviii. E84Q, E85K 및 D126G 중 하나 이상, 예컨대 1, 2 또는 3개;
xxxix. E84Q, E85K, D126G 및 E167A 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3 또는 4개;
xl. E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상, 예컨대 1, 2 또는 3개;
xli. E84Q, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개;
xlii. E84Q, E85K, E92Q, E97S 및 E167A 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개;
xliii. E84Q, E85K, E92Q, D126G 및 E167A 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개;
xliv. E84Q, E85K, E97S, D126G 및 E167A 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개;
xlv. E84Q, E92Q, E97S, D126G 및 E167A 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개;
xlvi. E85K, E92Q, E97S, D126G 및 E167A 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개;
xlvii. E84D, E85K 및 E92Q 중 하나 이상, 예컨대 1, 2 또는 3개;
xlviii. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 D121S 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개;
xlix. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 D68S 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개;
l. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 E135S 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개;
li. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 E128S 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개;
lii. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 E102S 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개;
liii. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 E94S 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개;
liv. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 E71S 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개;
lv. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 E50S 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개;
lvi. E76S, E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G 및 E167A 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개;
lvii. E92N, E94N, E97N, D121N, D126N 및 E128N 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개;
lviii. E92N, E94N, E97N, D121N 및 D126N 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개; 또는
lix. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G 및 E167A 중 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개
를 포함한다.
상기에서, 첫 번째 글자는 대체되는 서열 2에서의 아미노산을 지칭하고, 숫자는 서열 2에서의 위치이고, 두 번째 글자는 첫 번째를 대체하는 아미노산을 지칭한다. 따라서, E84D는 위치 84에서의 글루탐산 (E)의 아스파르트산 (D)으로의 치환을 지칭한다.
변이체는 i 내지 lix 중 임의의 하나에서의 임의의 수, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 치환을 포함할 수 있다. 변이체는 바람직하게는 상기 i 내지 lix 중 임의의 하나에 나타낸 치환 모두를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 변이체는 상기 i 내지 xv 중 임의의 하나에서의 치환을 포함한다. 변이체는 i 내지 xv 중 임의의 하나에서의 임의의 수, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 치환을 포함할 수 있다. 변이체는 바람직하게는 상기 i 내지 xv 중 임의의 하나에 나타낸 치환 모두를 포함한다.
폴리뉴클레오티드를 인식 또는 식별하는 단량체의 능력을 개선하기 위해 하나 이상의 변형을 의도하는 경우에, 이는 바람직하게는 폴리뉴클레오티드 포획을 개선하는 상기에 논의된 변형, 예컨대 E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G 및 E167A에 더하여 일으킨다.
확인된 영역에 대해 일으킨 하나 이상의 변형은 영역에서의 하나 이상의 아미노산의, 리세닌의 상동체 또는 파라로그에서의 상응하는 위치(들)에 존재하는 아미노산으로의 치환에 관한 것일 수 있다. 리세닌의 상동체의 4가지 예는 서열 16 내지 19에 나타낸다. 이러한 치환의 이점은 상동체 단량체도 기공을 형성하기 때문에 이것이 기공을 형성하는 돌연변이체 단량체를 생산할 가능성이 있다는 것이다.
상기에 논의된 특정 돌연변이 이외에, 변이체는 다른 돌연변이를 포함할 수 있다. 이들 돌연변이는 폴리뉴클레오티드와 상호작용하는 단량체의 능력을 반드시 증진시키는 것은 아니다. 돌연변이는, 예를 들어 발현 및/또는 정제를 용이하게 해줄 수 있다. 서열 2의 아미노산 서열의 전체 길이에 대해, 변이체는 바람직하게는 아미노산 동일성을 기준으로 하여 상기 서열에 대해 적어도 50% 상동성일 것이다. 보다 바람직하게는, 변이체는 전체 서열에 대해 서열 2의 아미노산 서열에 대한 아미노산 동일성을 기준으로 하여 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 97% 또는 99% 상동성일 수 있다. 100개 이상, 예를 들어 125, 150, 175 또는 200개 또는 그 초과의 인접 아미노산의 스트레치에 대한 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 90% 또는 95% 아미노산 동일성이 존재할 수도 있다 ("강한 상동성").
당업계에서의 표준 방법을 사용하여 상동성을 결정할 수 있다. 예를 들어, UWGCG 패키지는, 예를 들어 그의 디폴트 설정 상에 사용된 상동성을 계산하기 위해 사용될 수 있는 BESTFIT 프로그램을 제공한다 (문헌 [Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395]). PILEUP 및 BLAST 알고리즘은, 예를 들어 문헌 [Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S.F et al. (1990) J Mol Biol 215:403-10]에 기재된 바와 같이, 상동성 또는 라인 업 서열을 계산 (예컨대 (전형적으로 그의 디폴트 설정 상에서) 동등한 잔기 또는 상응하는 서열을 확인)하기 위해 사용될 수 있다.
BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물 정보 센터 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 입수가능하다. 이 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어와 정렬된 경우에 일부 양성-값 역치 점수 T와 매칭되거나 또는 이를 만족시키는 질의 서열에서 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써 높은 점수의 서열 쌍 (HSP)을 확인하는 것을 포함한다. T는 인근 단어 점수 역치를 지칭한다 (상기 문헌 [Altschul et al]). 이들 초기 인근 단어 히트는 이를 함유하는 HSP를 찾아내기 위해 검색을 개시하기 위한 시드로서의 역할을 한다. 단어 히트는 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한, 각각의 서열을 따라 양쪽 방향으로 연장된다. 각 방향으로의 단어 히트의 연장은 누적 정렬 점수가 그의 최대 달성 값으로부터 X의 양만큼 하락하거나; 하나 이상의 음의 값으로 점수화된 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적 점수가 0 이하로 떨어지거나; 또는 어느 한쪽의 서열의 끝에 도달한 경우에 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 민감도 및 정렬의 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 단어 길이 (W) 11, BLOSUM62 점수화 매트릭스 (문헌 [Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919] 참조) 정렬 (B) 50, 기대치 (E) 10, M=5, N=4, 및 두 가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다.
BLAST 알고리즘은 2개의 서열 사이의 유사성의 통계적 분석을 수행하고; 예를 들어, 문헌 [Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787]을 참조한다. BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 척도는, 2개의 아미노산 서열 사이에 매치가 우연히 발생할 확률의 표시를 제공하는 최소 합계 확률 (P(N))이다. 예를 들어, 첫 번째 서열과 두 번째 서열의 비교에서의 최소 합계 확률이 약 1 미만, 바람직하게는 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우에, 서열은 또 다른 서열과 유사한 것으로 간주된다.
상기에 논의된 것 이외에, 서열 2의 아미노산 서열에 대해 아미노산 치환, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 또는 30개 이하의 치환을 일으킬 수 있다. 보존적 치환은 아미노산을 유사한 화학 구조, 유사한 화학적 특성 또는 유사한 측쇄 부피의 다른 아미노산으로 대체한다. 도입된 아미노산은 그것이 대체하는 아미노산과 유사한 극성, 친수성, 소수성, 염기성, 산성, 중성 또는 전하를 가질 수 있다. 대안적으로, 보존적 치환은 기존의 방향족 또는 지방족 아미노산 대신에 방향족 또는 지방족인 또 다른 아미노산을 도입할 수 있다. 보존적 아미노산 변화는 당업계에 익히 공지되어 있고, 하기 표 1에 정의된 바와 같은 20개의 주요 아미노산의 특성에 따라 선택될 수 있다. 아미노산이 유사한 극성을 갖는 경우에, 이는 또한 표 2에서의 아미노산 측쇄에 대한 소수친수성 스케일을 참고하여 결정될 수 있다.
표 1 - 아미노산의 화학적 특성
Figure pct00001
표 2 - 소수친수성 스케일
Figure pct00002
변이체는 아미노산이 리세닌의 상동체 및 파라로그에서의 상응하는 위치(들)에 존재하는 것으로 대체된 상기에 명시된 영역 외부의 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 리세닌의 상동체의 4가지 예는 서열 16 내지 19에 나타낸다.
서열 2의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기가 상기에 기재된 변이체로부터 추가로 결실될 수 있다. 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 또는 30개 이하의 잔기 또는 그 초과가 결실될 수 있다.
변이체는 서열 2의 단편을 포함할 수 있다. 이러한 단편은 기공 형성 활성을 보유한다. 이것은 상기에 기재된 바와 같이 검정될 수 있다. 단편은 적어도 50, 100, 150, 200 또는 250개 아미노산 길이일 수 있다. 이러한 단편은 본 발명의 기공을 생산하는데 사용될 수 있다. 서열 2의 대략적인 위치 44 내지 대략적인 위치 126의 영역이 본 발명에 따라 하나 이상의 결실에 의해 변형될 수 있기 때문에, 단편은 전체 영역을 함유할 필요는 없다. 따라서, 변형되지 않은 영역의 길이보다 짧은 단편이 본 발명에 의해 예상된다. 단편은 바람직하게는 서열 2의 기공 형성 도메인을 포함한다. 단편은 보다 바람직하게는 본 발명에 따라 변형되는 서열 2의 대략적인 위치 44 내지 대략적인 위치 126의 영역을 포함한다.
하나 이상의 아미노산이 상기에 기재된 변이체에 대안적으로 또는 부가적으로 부가될 수 있다. 그의 단편을 비롯한 서열 2의 변이체의 아미노산 서열의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 연장이 제공될 수 있다. 연장은 상당히 짧은, 예를 들어 1 내지 10개 아미노산 길이일 수 있다. 대안적으로, 연장은 보다 긴, 예를 들어 50 또는 100개 이하의 아미노산일 수 있다. 운반 단백질이 본 발명에 따른 아미노산 서열에 융합될 수 있다. 다른 융합 단백질은 하기에서 보다 상세하게 논의된다.
상기에 논의된 바와 같이, 변이체는 서열 2의 것과 상이한 아미노산 서열을 갖고 기공을 형성하는 그의 능력을 보유하는 폴리펩티드이다. 변이체는 전형적으로 기공 형성을 담당하는 서열 2의 영역, 즉 대략적인 위치 44 내지 대략적인 위치 126을 함유하고, 이 영역은 상기에 논의된 바와 같이 본 발명에 따라 변형된다. 이것은 상기에 논의된 바와 같은 상기 영역의 단편을 함유할 수 있다. 본 발명의 변형 이외에, 서열 2의 변이체는 하나 이상의 추가의 변형, 예컨대 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있다. 이들 변형은 바람직하게는 서열 2의 대략적인 위치 1 내지 대략적인 위치 43 및 대략적인 위치 127 내지 대략적인 위치 297에 상응하는 변이체에서의 스트레치 (즉, 본 발명에 따라 변형된 영역의 외부)에 위치한다.
돌연변이체 단량체는, 예를 들어 히스티딘 잔기 (hist 태그), 아스파르트산 잔기 (asp 태그), 스트렙타비딘 태그 또는 플래그 태그의 부가에 의해, 또는 세포로부터의 그의 분비를 촉진하기 위한 신호 서열의 부가에 의해 (폴리펩티드는 이러한 서열을 자연적으로 함유하지 않음) 변형되어 그의 확인 또는 정제를 보조할 수 있다. 유전적 태그를 도입하는 것에 대한 대안은 태그를 기공 상의 천연 또는 조작된 위치 상에서 화학적으로 반응시키는 것이다. 이의 예는 겔-시프트 시약을 기공의 외부 상의 조작된 시스테인에 대해 반응시키는 것일 것이다. 이는 용혈소 헤테로-올리고머를 분리하는 방법으로서 입증되어 있다 (문헌 [Chem Biol. 1997 Jul;4(7):497-505]).
돌연변이체 단량체는 표식 표지로 표지될 수 있다. 표식 표지는 기공이 검출되게 하는 임의의 적합한 표지일 수 있다. 적합한 표지는 형광 분자, 방사성동위원소, 예를 들어 125I, 35S, 효소, 항체, 항원, 폴리뉴클레오티드, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 펩티드 및 리간드, 예컨대 비오틴을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
돌연변이체 단량체는 D-아미노산을 사용하여 생산될 수도 있다. 예를 들어, 돌연변이체 단량체는 L-아미노산 및 D-아미노산의 혼합물을 포함할 수 있다. 이는 이러한 단백질 또는 펩티드를 생산하기 위해 당업계에서 통상적인 것이다.
돌연변이체 단량체는 폴리뉴클레오티드와의 상호작용을 용이하게 하기 위한 하나 이상의 특이적 변형을 함유한다. 돌연변이체 단량체는 다른 비-특이적 변형이 기공 형성을 방해하지 않는 한, 이를 함유할 수도 있다. 다수의 비-특이적 측쇄 변형이 당업계에 공지되어 있고, 돌연변이체 단량체의 측쇄에 대해 이루어질 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 알데히드와의 반응 후 NaBH4로의 환원에 의한 아미노산의 환원성 알킬화, 메틸아세트이미데이트로의 아미딘화 또는 아세트산 무수물로의 아실화를 포함한다.
돌연변이체 단량체는 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 단량체는 합성에 의해 또는 재조합 수단에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 단량체는 시험관내 번역 및 전사 (IVTT)에 의해 합성될 수 있다. 기공 단량체를 생산하는 적합한 방법은 국제 출원 번호 PCT/GB09/001690 (WO 2010/004273으로서 공개됨), PCT/GB09/001679 (WO 2010/004265로서 공개됨) 또는 PCT/GB10/000133 (WO 2010/086603으로서 공개됨)에 논의되어 있다. 기공을 막 내로 삽입하는 방법은 하기에서 논의된다.
돌연변이체 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 당업계의 표준 방법을 사용하여 유도되고 복제될 수 있다. 이러한 서열은 하기에 보다 상세하게 논의된다. 돌연변이체 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 당업계의 표준 기술을 사용하여 박테리아 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 돌연변이체 단량체는 재조합 발현 벡터로부터의 폴리펩티드의 계내 발현에 의해 세포에서 생산될 수 있다. 발현 벡터는 임의로 유도성 프로모터를 보유하여 폴리펩티드의 발현을 제어한다.
돌연변이체 단량체는 임의의 단백질 액체 크로마토그래피 시스템에 의한 기공 생산 유기체로부터의 정제 이후에, 또는 하기에 기재되는 바와 같은 재조합 발현 이후에 대규모로 생산될 수 있다. 전형적인 단백질 액체 크로마토그래피 시스템은 FPLC, AKTA 시스템, 바이오-캐드(Bio-Cad) 시스템, 바이오-래드 바이오로직(Bio-Rad BioLogic) 시스템 및 길슨(Gilson) HPLC 시스템을 포함한다. 이어서, 돌연변이체 단량체는 본 발명에 따른 용도를 위해 자연 발생 막 또는 인공 막 내로 삽입될 수 있다. 기공을 막 내로 삽입하는 방법은 하기에서 논의된다.
일부 실시양태에서, 돌연변이체 단량체는 화학적으로 변형된다. 돌연변이체 단량체는 임의의 방식으로 및 임의의 부위에서 화학적으로 변형될 수 있다. 돌연변이체 단량체는 바람직하게 분자의 하나 이상의 시스테인에 대한 부착 (시스테인 연결), 분자의 하나 이상의 리신에 대한 부착, 분자의 하나 이상의 비-천연 아미노산에 대한 부착, 에피토프의 효소 변형 또는 말단의 변형에 의해 화학적으로 변형된다. 이러한 변형을 수행하는데 적합한 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 적합한 비-천연 아미노산은 4-아지도-L-페닐알라닌 (Faz) 및 문헌 [Liu C. C. and Schultz P. G., Annu. Rev. Biochem., 2010, 79, 413-444]의 도 1에서의 아미노산 번호 1-71 중 임의의 하나를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 돌연변이체 단량체는 임의의 분자의 부착에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 단량체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 핵산, 예컨대 DNA, 염료, 형광단 또는 발색단의 부착으로서 화학적으로 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 돌연변이체 단량체는 단량체를 포함하는 기공과 표적 분석물, 표적 뉴클레오티드 또는 표적 폴리뉴클레오티드 사이의 상호작용을 용이하게 해주는 분자 어댑터로 화학적으로 변형된다. 어댑터의 존재는 기공 및 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 주객 화학을 개선함으로써, 돌연변이체 단량체로부터 형성된 기공의 서열분석 능력을 개선한다. 주객 화학의 원리는 당업계에 익히 공지되어 있다. 어댑터는 기공의 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와의 상호작용을 개선하는 기공의 물리적 또는 화학적 특성에 대해 효과를 갖는다. 어댑터는 기공의 배럴 또는 채널의 전하를 변경시킬 수 있거나, 또는 특이적으로 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 상호작용하거나 또는 이에 결합함으로써 그의 기공과의 상호작용을 용이하게 해줄 수 있다.
분자 어댑터는 바람직하게 시클릭 분자, 예를 들어 시클로덱스트린, 혼성화할 수 있는 종, DNA 결합제 또는 인터킬레이터, 펩티드 또는 펩티드 유사체, 합성 중합체, 방향족 평면 분자, 양으로 하전된 소분자 또는 수소 결합할 수 있는 소분자이다.
어댑터는 시클릭일 수 있다. 시클릭 어댑터는 바람직하게는 기공과 동일한 대칭성을 갖는다.
어댑터는 전형적으로 주객 화학법을 통해 분석물, 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 상호작용한다. 어댑터는 전형적으로 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 상호작용할 수 있다. 어댑터는 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 화학적 기를 포함한다. 하나 이상의 화학적 기는 바람직하게는 비-공유 상호작용, 예컨대 소수성 상호작용, 수소 결합, 반 데르 발스 힘, π-양이온 상호작용 및/또는 정전기력에 의해 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 상호작용한다. 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 화학적 기는 바람직하게는 양으로 하전된다. 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 화학적 기는 보다 바람직하게는 아미노 기를 포함한다. 아미노 기는 1급, 2급 또는 3급 탄소 원자에 부착될 수 있다. 어댑터는 보다 더 바람직하게는 아미노 기의 고리, 예컨대 6, 7, 8 또는 9개 아미노 기의 고리를 포함한다. 어댑터는 가장 바람직하게는 6 또는 9개 아미노 기의 고리를 포함한다. 양성자화 아미노 기의 고리는 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 내의 음으로 하전된 포스페이트 기와 상호작용할 수 있다.
기공 내에 어댑터를 정확하게 위치시키는 것은 어댑터와, 돌연변이체 단량체를 포함하는 기공 사이의 주객 화학에 의해 용이해질 수 있다. 어댑터는 바람직하게는 기공 내의 하나 이상의 아미노산과 상호작용할 수 있는 하나 이상의 화학적 기를 포함한다. 어댑터는 보다 바람직하게는 비-공유 상호작용, 예컨대 소수성 상호작용, 수소 결합, 반 데르 발스 힘, π-양이온 상호작용 및/또는 정전기력을 통해 기공 내의 하나 이상의 아미노산과 상호작용할 수 있는 하나 이상의 화학적 기를 포함한다. 기공 내의 하나 이상의 아미노산과 상호작용할 수 있는 화학적 기는 전형적으로 히드록실 또는 아민이다. 히드록실 기는 1급, 2급 또는 3급 탄소 원자에 부착될 수 있다. 히드록실 기는 기공 내의 비하전 아미노산과 수소 결합을 형성할 수 있다. 기공과 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 사이의 상호작용을 용이하게 해주는 임의의 어댑터가 사용될 수 있다.
적합한 어댑터는 시클로덱스트린, 시클릭 펩티드 및 쿠쿠르비투릴을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 어댑터는 바람직하게는 시클로덱스트린 또는 그의 유도체이다. 시클로덱스트린 또는 그의 유도체는 문헌 [Eliseev, A. V., and Schneider, H-J. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116, 6081-6088]에 개시된 것들 중 임의의 것일 수 있다. 어댑터는 보다 바람직하게는 헵타키스-6-아미노-β-시클로덱스트린 (am7-βCD), 6-모노데옥시-6-모노아미노-β-시클로덱스트린 (am1-βCD) 또는 헵타키스-(6-데옥시-6-구아니디노)-시클로덱스트린 (gu7-βCD)이다. gu7-βCD 내의 구아니디노 기는 am7-βCD 내의 1급 아민보다 pKa가 훨씬 더 높아서, 더 양으로 하전된다. 상기 gu7-βCD 어댑터는 기공 내의 뉴클레오티드의 체류 시간을 증가시키는데, 측정된 잔류 전류의 정확도를 증가시키는데, 뿐만 아니라 높은 온도 또는 낮은 데이터 취득 속도에서 염기 검출 속도를 증가시키는데 사용될 수 있다.
숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 가교제가 하기에 보다 상세하게 논의되는 바와 같이 사용되는 경우에, 어댑터는 바람직하게는 헵타키스(6-데옥시-6-아미노)-6-N-모노(2-피리딜)디티오프로판오일-β-시클로덱스트린 (am6amPDP1-βCD)이다.
보다 적합한 어댑터는 8개의 당 단위를 포함하는 (따라서 8배 대칭성을 갖는) γ-시클로덱스트린을 포함한다. γ-시클로덱스트린은 링커 분자를 함유할 수 있거나, 또는 상기에 논의된 β-시클로덱스트린의 예에서 사용된 변형된 당 단위를 모두 또는 이보다 많이 포함하도록 변형될 수 있다.
분자 어댑터는 바람직하게는 돌연변이체 단량체에 공유적으로 부착된다. 어댑터는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 기공에 공유적으로 부착될 수 있다. 어댑터는 전형적으로 화학적 연결을 통해 부착된다. 분자 어댑터가 시스테인 연결을 통해 부착되는 경우에, 하나 이상의 시스테인이 바람직하게는 치환에 의해 돌연변이체 내로 도입된다. 본 발명의 돌연변이체 단량체는 물론 위치 272 및 283 중 하나 또는 둘 다에서 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 돌연변이체 단량체는 이들 시스테인 중 하나 또는 둘 다에 대한 분자 어댑터의 부착에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 대안적으로, 돌연변이체 단량체는 다른 위치에 도입된 하나 이상의 시스테인 또는 비-천연 아미노산, 예컨대 Faz에 대한 분자의 부착에 의해 화학적으로 변형될 수 있다.
시스테인 잔기의 반응성은 인접 잔기의 변형에 의해 증진될 수 있다. 예를 들어, 플랭킹 아르기닌, 히스티딘 또는 리신 잔기의 염기성 기는 시스테인 티올 기의 pKa를 보다 반응성인 S- 기의 것으로 변화시킬 것이다. 시스테인 잔기의 반응성은 티올 보호기, 예컨대 dTNB에 의해 보호될 수 있다. 이들은 링커 부착 이전에 돌연변이체 단량체의 하나 이상의 시스테인 잔기와 반응할 수 있다. 분자는 돌연변이체 단량체에 직접 부착될 수 있다. 분자는 바람직하게는 링커, 예컨대 화학적 가교제 또는 펩티드 링커를 사용하여 돌연변이체 단량체에 부착된다.
적합한 화학적 가교제는 당업계에 익히 공지되어 있다. 바람직한 가교제는 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-(피리딘-2-일디술파닐)프로파노에이트, 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 4-(피리딘-2-일디술파닐)부타노에이트 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 8-(피리딘-2-일디술파닐)옥타노에이트를 포함한다. 가장 바람직한 가교제는 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP)이다. 전형적으로, 분자는 분자/가교제 복합체가 돌연변이체 단량체에 공유적으로 부착되기 이전에 이작용성 가교제에 공유적으로 부착되기도 하지만, 이작용성 가교제/단량체 복합체가 분자에 부착되기 이전에 이작용성 가교제가 단량체에 공유적으로 부착되는 것도 가능하다.
링커는 바람직하게는 디티오트레이톨 (DTT)에 저항성이다. 적합한 링커는 아이오도아세트아미드-기재 및 말레이미드-기재 링커를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
다른 실시양태에서, 단량체는 폴리뉴클레오티드 결합 단백질에 부착될 수 있다. 이는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 모듈식 서열분석 시스템을 형성한다. 폴리뉴클레오티드 결합 단백질은 하기에서 논의된다.
폴리뉴클레오티드 결합 단백질은 돌연변이체 단량체에 공유적으로 부착될 수 있다. 단백질은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 기공에 공유적으로 부착될 수 있다. 단량체 및 단백질은 화학적으로 융합되거나 또는 유전적으로 융합될 수 있다. 전체 구축물이 단일 폴리뉴클레오티드 서열로부터 발현되는 경우에, 단량체 및 단백질은 유전적으로 융합된다. 폴리뉴클레오티드 결합 단백질에 대한 기공의 유전적 융합은 국제 출원 번호 PCT/GB09/001679 (WO 2010/004265로서 공개됨)에 논의되어 있다.
폴리뉴클레오티드 결합 단백질이 시스테인 연결을 통해 부착되는 경우에, 하나 이상의 시스테인이 바람직하게는 치환에 의해 돌연변이체에 도입된다. 이러한 치환은 전형적으로 상동체 간에 낮은 보존성을 갖는 루프 영역 내에서 이루어지고, 이는 돌연변이 또는 삽입이 허용될 수 있음을 가리킨다. 따라서, 이것은 폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 부착시키는데 적합하다. 이러한 치환은 전형적으로 서열 2의 잔기 1 내지 43 및 127 내지 297에서 이루어진다. 시스테인 잔기의 반응성은 상기에 기재된 바와 같은 변형에 의해 증진될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 결합 단백질은 돌연변이체 단량체에 직접적으로 또는 하나 이상의 링커를 통해 부착될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 결합 단백질은 국제 출원 번호 PCT/GB10/000132 (WO 2010/086602로서 공개됨)에 기재된 혼성화 링커를 사용하여 돌연변이체 단량체에 부착될 수 있다. 대안적으로, 펩티드 링커가 사용될 수 있다. 펩티드 링커는 아미노산 서열이다. 펩티드 링커의 길이, 가요성 및 친수성은 전형적으로 단량체 및 분자의 기능을 방해하지 않도록 설계된다. 바람직한 가요성 펩티드 링커는 2 내지 20개, 예컨대 4, 6, 8, 10 또는 16개 세린 및/또는 글리신 아미노산의 스트레치이다. 보다 바람직한 가요성 링커는 (SG)1, (SG)2, (SG)3, (SG)4, (SG)5 및 (SG)8을 포함하고, 여기서 S는 세린이고 G는 글리신이다. 바람직한 경성 링커는 2 내지 30개, 예컨대 4, 6, 8, 16 또는 24개 프롤린 아미노산의 스트레치이다. 보다 바람직한 경성 링커는 (P)12를 포함하고, 여기서 P는 프롤린이다.
돌연변이체 단량체는 분자 어댑터 및 폴리뉴클레오티드 결합 단백질로 화학적으로 변형될 수 있다.
돌연변이체 리세닌 단량체의 제조
본 발명은 또한 폴리뉴클레오티드를 특성화하는 서열 2에 나타낸 서열을 포함하는 리세닌 단량체의 능력을 개선하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 폴리뉴클레오티드와 상호작용하는 단량체의 능력을 변경시키고 기공을 형성하는 단량체의 능력에는 영향을 미치지 않는 서열 2의 대략적인 위치 44 내지 대략적인 위치 126의 영역 내의 하나 이상의 변형을 일으키는 것을 포함한다. 돌연변이체 리세닌 단량체와 관련하여 상기에, 및 폴리뉴클레오티드를 특성화하는 것과 관련하여 하기에 논의된 실시양태 중 임의의 것은 본 발명의 상기 방법에 동등하게 적용된다.
구축물
본 발명은 또한 리세닌으로부터 유도된 2개 이상의 공유적으로 부착된 단량체를 포함하며, 여기서 단량체 중 적어도 1개는 본 발명의 돌연변이체 리세닌 단량체인 구축물을 제공한다. 본 발명의 구축물은 기공을 형성하는 그의 능력을 보유한다. 1개 이상의 본 발명의 구축물은 표적 분석물을 특성화하기 위한 기공을 형성하는데 사용될 수 있다. 1개 이상의 본 발명의 구축물은 표적 폴리뉴클레오티드를 특성화하기 위한, 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드를 서열분석하기 위한 기공을 형성하는데 사용될 수 있다. 구축물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 초과의 단량체를 포함할 수 있다. 2개 이상의 단량체는 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
적어도 구축물에서의 단량체는 본 발명의 돌연변이체 단량체이다. 구축물에서의 다른 단량체는 본 발명의 돌연변이체 단량체일 필요는 없다. 예를 들어, 적어도 1개의 단량체는 서열 2에 나타낸 서열을 포함할 수 있다. 구축물에서의 적어도 1개의 단량체는 서열 2의 파라로그 또는 상동체일 수 있다. 적합한 상동체는 서열 16 내지 19에 나타낸다.
대안적으로, 적어도 1개의 단량체는 그의 전체 서열에 대해 아미노산 동일성을 기준으로 하여 서열 2에 대해 적어도 50% 상동성이지만, 본 발명의 돌연변이체 단량체에 필요한 특정 돌연변이 중 어느 것도 포함하지 않는 서열 2의 변이체를 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 변이체는 전체 서열에 대해 서열 2의 아미노산 서열에 대한 아미노산 동일성을 기준으로 하여 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 97% 또는 99% 상동성일 수 있다. 변이체는 단편일 수 있거나 또는 상기에 논의된 임의의 다른 변이체일 수 있다. 본 발명의 구축물은 또한 그의 전체 서열에 대해 아미노산 동일성을 기준으로 하여 서열 16, 17, 18 또는 19에 대해 적어도 50% 상동성이거나 또는 적어도 상기에 언급된 다른 수준 중 임의의 상동성인 서열 16, 17, 18 또는 19의 변이체를 포함할 수 있다.
구축물에서의 모든 단량체는 본 발명의 돌연변이체 단량체일 수 있다. 돌연변이체 단량체는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 보다 바람직한 실시양태에서, 구축물은 2개의 단량체를 포함하고, 단량체 중 적어도 1개는 본 발명의 돌연변이체 단량체이다.
단량체는 유전적으로 융합될 수 있다. 전체 구축물이 단일 폴리뉴클레오티드 서열로부터 발현되는 경우에, 단량체는 유전적으로 융합된다. 단량체의 코딩 서열은 임의의 방식으로 조합되어 구축물을 코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드 서열을 형성할 수 있다. 유전적 융합은 국제 출원 번호 PCT/GB09/001679 (WO 2010/004265로서 공개됨)에 논의되어 있다.
단량체는 임의의 배위로 유전적으로 융합될 수 있다. 단량체는 그의 말단 아미노산을 통해 융합될 수 있다. 예를 들어, 1개의 단량체의 아미노 말단은 또 다른 단량체의 카르복시 말단에 융합될 수 있다.
2개 이상의 단량체는 직접적으로 함께 유전적으로 융합될 수 있다. 단량체는 바람직하게는 링커를 사용하여 유전적으로 융합된다. 링커는 단량체의 이동성을 제한하도록 설계될 수 있다. 바람직한 링커는 아미노산 서열 (즉, 펩티드 링커)이다. 상기에 논의된 펩티드 링커 중 임의의 것이 사용될 수 있다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 단량체는 화학적으로 융합된다. 단량체는, 예를 들어 화학적 가교제를 통해 화학적으로 부착되는 경우에 화학적으로 융합된다. 상기에 논의된 화학적 가교제 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 링커는 돌연변이체 단량체 내로 도입된 하나 이상의 시스테인 잔기 또는 비-천연 아미노산, 예컨대 Faz에 부착될 수 있다. 대안적으로, 링커는 구축물에서의 단량체 중 1개의 말단에 부착될 수 있다. 단량체는 전형적으로 서열 2의 잔기 1 내지 43 및 127 내지 297 중 하나 이상을 통해 연결된다.
구축물이 상이한 단량체를 함유하는 경우에, 방대한 과량의 단량체 중에서 링커의 농도를 유지시킴으로써 단량체의 그 자신에 대한 가교결합을 방지할 수 있다. 대안적으로, 2개의 링커가 사용되는 "자물쇠와 열쇠" 배열이 사용될 수 있다. 각 링커의 하나의 단부만이 함께 반응하여 보다 긴 링커를 형성할 수 있고, 링커의 다른 단부는 각각 상이한 단량체와 반응한다. 이러한 링커는 국제 출원 번호 PCT/GB10/000132 (WO 2010/086602로서 공개됨)에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 구축물을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 적어도 1개의 본 발명의 돌연변이체 리세닌 단량체를 리세닌으로부터 유도된 1개 이상의 단량체에 공유적으로 부착시키는 것을 포함한다. 본 발명의 구축물과 관련하여 상기에 논의된 실시양태 중 임의의 것은 구축물을 제조하는 방법에 동등하게 적용된다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 또한 본 발명의 돌연변이체 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 돌연변이체 단량체는 상기에 논의된 것 중 임의의 것일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 전체 서열에 대해 서열 1의 서열에 대한 뉴클레오티드 동일성을 기준으로 하여 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 상동성인 서열을 포함한다. 300개 이상, 예를 들어 375, 450, 525 또는 600개 또는 그 초과의 인접 뉴클레오티드의 스트레치에 대한 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 90% 또는 95% 뉴클레오티드 동일성이 존재할 수 있다 ("강한 상동성"). 상동성은 상기에 기재된 바와 같이 계산될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열은 유전자 코드의 축중성에 기반하여 서열 1과 상이한 서열을 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 유전적으로 융합된 구축물 중 임의의 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열 1에 나타낸 바와 같은 2개 이상의 서열 또는 상기에 기재된 바와 같은 그의 변이체를 포함한다.
폴리뉴클레오티드 서열은 당업계의 표준 방법을 사용하여 유도되고 복제될 수 있다. 야생형 리세닌을 코딩하는 염색체 DNA는 기공 생산 유기체, 예컨대 에이세니아 페티다로부터 추출할 수 있다. 기공 단량체를 코딩하는 유전자는 특정 프라이머를 포함하는 PCR을 사용하여 증폭시킬 수 있다. 이어서, 증폭된 서열에 부위-지정 돌연변이유발을 일으킬 수 있다. 적합한 부위-지정 돌연변이유발 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 조합 연쇄 반응을 포함한다. 본 발명의 구축물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 익히 공지된 기술, 예컨대 문헌 [Sambrook, J. and Russell, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]에 기재된 것을 사용하여 제조할 수 있다.
이어서, 생성된 폴리뉴클레오티드 서열을 재조합 복제가능한 벡터, 예컨대 클로닝 벡터 내로 도입할 수 있다. 벡터를 사용하여 상용성 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드를 복제할 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드를 복제가능한 벡터 내로 도입하고, 벡터를 상용성 숙주 세포 내로 도입하고, 벡터의 복제를 일으키는 조건 하에 숙주 세포를 성장시킴으로써 제조할 수 있다. 벡터를 숙주 세포로부터 회수할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 클로닝에 적합한 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있고, 이는 하기에서 보다 상세하게 기재된다.
폴리뉴클레오티드 서열을 적합한 발현 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 발현 벡터에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 전형적으로 숙주 세포에 의한 코딩 서열의 발현을 제공할 수 있는 제어 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 이러한 발현 벡터를 사용하여 기공 서브유닛을 발현시킬 수 있다.
"작동가능하게 연결된"이라는 용어는 기재된 성분이 그의 의도된 방식으로 기능을 할 수 있도록 허용하는 관계를 맺고 있는 병렬배치를 지칭한다. 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 제어 서열은 제어 서열과 상용성인 조건 하에 코딩 서열의 발현이 달성되도록 하는 방식으로 라이게이션된다. 동일하거나 또는 상이한 폴리뉴클레오티드 서열의 다중 카피가 벡터 내로 도입될 수 있다.
이어서, 발현 벡터를 적합한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 따라서, 본 발명의 돌연변이체 단량체 또는 구축물은 폴리뉴클레오티드 서열을 발현 벡터 내로 삽입하고, 벡터를 상용성 박테리아 숙주 세포 내로 도입하고, 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 일으키는 조건 하에 숙주 세포를 성장시킴으로써 생산할 수 있다. 재조합적으로 발현된 단량체 또는 구축물은 숙주 세포 막에서 기공 내로 자가 조립될 수 있다. 대안적으로는, 상기 방식으로 생산된 재조합 기공을 숙주 세포로부터 제거하여, 또 다른 막 내로 삽입할 수 있다. 적어도 2개의 상이한 서브유닛을 포함하는 기공을 생산하는 경우에는, 상이한 서브유닛을 상기 기재된 바와 같이 상이한 숙주 세포에서 별개로 발현시키고, 숙주 세포로부터 제거하고, 스핑고미엘린을 함유하는 별개의 막, 예컨대 양 적혈구 막 또는 리포솜에서 기공 내로 조립할 수 있다.
벡터는, 예를 들어 복제 기점, 임의로 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 위한 프로모터, 및 임의로 프로모터의 조절제와 함께 제공되는 플라스미드, 바이러스 또는 파지 벡터일 수 있다. 벡터는 하나 이상의 선택 마커 유전자, 예를 들어 테트라시클린 내성 유전자를 함유할 수 있다. 프로모터 및 다른 발현 조절 신호는 발현 벡터가 설계된 숙주 세포와 상용성이도록 선택될 수 있다. 전형적으로, T7, trc, lac, ara 또는 λL 프로모터가 사용된다.
숙주 세포는 전형적으로 기공 서브유닛을 높은 수준으로 발현한다. 폴리뉴클레오티드 서열로 형질전환된 숙주 세포는 세포를 형질전환시키는데 사용되는 발현 벡터와 상용성이도록 선택될 것이다. 숙주 세포는 전형적으로 박테리아, 바람직하게는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)이다. λ DE3 용원을 갖는 임의의 세포, 예를 들어 C41 (DE3), BL21 (DE3), JM109 (DE3), B834 (DE3), TUNER, Origami 및 Origami B는 T7 프로모터를 포함하는 벡터를 발현시킬 수 있다. 상기에 나열된 조건 이외에, 문헌 [Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Dec 30;105(52):20647-52]에서 인용된 방법 중 임의의 것이 리세닌 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다.
기공
본 발명은 또한 다양한 기공을 제공한다. 본 발명의 기공은 분석물을 특성화하는데 이상적이다. 본 발명의 기공은 상이한 뉴클레오티드 사이를 고도의 민감성으로 식별할 수 있기 때문에 폴리뉴클레오티드를 특성화, 예컨대 서열분석하는데 특히 이상적이다. 기공은 핵산, 예컨대 DNA 및 RNA를 특성화하는데, 예컨대 핵산을 서열분석하고 단일 염기 변화를 확인하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 기공은 심지어 메틸화 및 비메틸화 뉴클레오티드 사이를 구별할 수 있다. 본 발명의 기공의 염기 해상도는 놀랄 만큼 높다. 기공은 4가지 모든 DNA 뉴클레오티드의 거의 완전한 분리를 나타낸다. 기공은 추가로 기공에서의 체류 시간 및 기공을 통해 흐르는 전류에 근거하여 데옥시시티딘 모노포스페이트 (dCMP) 및 메틸-dCMP를 식별하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 기공은 또한 다양한 조건 하에 상이한 뉴클레오티드들 사이를 식별할 수 있다. 특히, 기공은 폴리뉴클레오티드를 특성화, 예컨대 서열분석하는데 바람직한 조건 하에 뉴클레오티드들 사이를 식별할 것이다. 본 발명의 기공이 상이한 뉴클레오티드들 사이를 식별할 수 있는 정도는 인가된 전위, 염 농도, 완충제, 온도 및 첨가제, 예컨대 우레아, 베타인 및 DTT의 존재 여부를 변경함으로써 조절될 수 있다. 이는 기공의 기능을, 특히 서열분석의 경우에 미세-조정되도록 한다. 이는 하기에서 보다 상세하게 논의된다. 본 발명의 기공은 또한 뉴클레오티드별로 하나씩 확인하는 것이 아니라 1개 이상의 단량체와의 상호작용으로부터 폴리뉴클레오티드 중합체를 확인하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 기공은 단리될 수 있거나, 실질적으로 단리될 수 있거나, 정제될 수 있거나, 또는 실질적으로 정제될 수 있다. 본 발명의 기공에 임의의 다른 성분, 예컨대 지질 또는 다른 기공이 완전히 존재하지 않는 경우에, 이는 단리 또는 정제된 것이다. 기공이 그의 의도된 용도를 방해하지 않을 담체 또는 희석제와 혼합된 경우에, 이는 실질적으로 단리된 것이다. 예를 들어, 기공이 다른 성분, 예컨대 지질 또는 다른 기공을 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만으로 포함하는 형태로 존재하는 경우에, 이는 실질적으로 단리되거나 또는 실질적으로 정제된 것이다. 대안적으로, 본 발명의 기공은 지질 이중층으로 존재할 수 있다.
본 발명의 기공은 개별 또는 단일 기공으로서 존재할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 기공은 2개 이상의 기공의 동종 또는 이종 집단 또는 다수 상태로 존재할 수 있다.
호모-올리고머 기공
본 발명은 또한 동일한 본 발명의 돌연변이체 단량체를 포함하는, 리세닌으로부터 유도된 호모-올리고머 기공을 제공한다. 단량체는 그의 아미노산 서열의 관점에서 동일하다. 본 발명의 호모-올리고머 기공은 폴리뉴클레오티드를 특성화, 예컨대 서열분석하는데 이상적이다. 본 발명의 호모-올리고머 기공은 상기 논의된 이점 중 임의의 것을 가질 수 있다. 본 발명의 특정 호모-올리고머 기공의 이점은 실시예에 나타낸다.
호모-올리고머 기공은 임의의 수의 돌연변이체 단량체를 함유할 수 있다. 기공은 전형적으로 2개 이상의 돌연변이체 단량체를 포함한다. 돌연변이체 단량체 중 1개 이상은 바람직하게는 상기에 논의된 바와 같이 화학적으로 변형된다. 즉, 단량체 중 1개 이상이 화학적으로 변형되는 것은 (다른 것은 화학적으로 변형되지 않음) 각각의 단량체의 아미노산 서열이 동일한 한, 기공이 호모-올리고머가 되는 것을 막지 않는다.
리세닌 기공을 제조하는 방법은 실시예 및 문헌 [Yamaji et al., J. Biol. Chem. 1998; 273(9): 5300-6]에 기재되어 있다.
헤테로-올리고머 기공
본 발명은 또한 본 발명의 적어도 1개의 돌연변이체 단량체를 포함하며, 여기서 단량체 중 적어도 1개는 다른 것과 상이한 것인, 리세닌으로부터 유도된 헤테로-올리고머 기공을 제공한다. 단량체는 그의 아미노산 서열의 관점에서 다른 것과 상이하다. 본 발명의 헤테로-올리고머 기공은 폴리뉴클레오티드를 특성화, 예컨대 서열분석하는데 이상적이다. 헤테로-올리고머 기공은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Protein Sci. 2002 Jul;11(7):1813-24]).
헤테로-올리고머 기공은 기공을 형성하기에 충분한 단량체를 함유한다. 단량체는 임의의 유형의 것일 수 있다. 기공은 전형적으로 2개 이상의 단량체를 포함한다.
기공은 본 발명의 돌연변이체 단량체에 필요한 돌연변이를 갖지 않는 서열 2에 나타낸 서열, 그의 파라로그, 그의 상동체 또는 그의 변이체를 포함하는 적어도 1개의 단량체를 포함할 수 있다. 적합한 변이체는 서열 2, 16, 17, 18 및 19, 및 그의 변이체를 비롯한, 본 발명의 구축물과 관련하여 상기에 논의된 것 중 임의의 것이다. 본 실시양태에서, 나머지 단량체는 바람직하게는 본 발명의 돌연변이체 단량체이다.
바람직한 실시양태에서, 기공은 (a) 1개의 본 발명의 돌연변이체 단량체 및 (b) 기공을 형성하기에 충분한 수의 동일한 단량체를 포함하며, 여기서 (a)에서의 돌연변이 단량체는 (b)에서의 동일한 단량체와 상이하다. (b)에서의 동일한 단량체는 바람직하게는 본 발명의 돌연변이체 단량체에 필요한 돌연변이를 갖지 않는 서열 2에 나타낸 서열, 그의 파라로그, 그의 상동체 또는 그의 변이체를 포함한다.
본 발명의 헤테로-올리고머 기공은 바람직하게는 1개의 본 발명의 돌연변이체 리세닌 단량체만을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 헤테로-올리고머 기공의 모든 단량체는 본 발명의 돌연변이체 단량체이고, 그 중 적어도 1개는 다른 것과 상이하다.
상기에 논의된 모든 실시양태에서, 돌연변이체 단량체 중 1개 이상은 바람직하게는 상기에 논의된 바와 같이 화학적으로 변형된다. 1개의 단량체 상의 화학적 변형의 존재는 헤테로-올리고머인 기공을 생성하지 않는다. 적어도 1개의 단량체의 아미노산 서열은 다른 단량체의 서열(들)과 상이해야 한다. 기공을 제조하는 방법은 하기에서 보다 상세하게 논의된다.
구축물-함유 기공
본 발명은 또한 적어도 1개의 본 발명의 구축물을 포함하는 기공을 제공한다. 본 발명의 구축물은 리세닌으로부터 유도된 2개 이상의 공유적으로 부착된 단량체를 포함하며, 여기서 단량체 중 적어도 1개는 본 발명의 돌연변이체 리세닌 단량체이다. 즉, 구축물은 1개 초과의 단량체를 함유해야 한다. 기공에서의 단량체 중 적어도 2개는 본 발명의 구축물의 형태이다. 단량체는 임의의 유형의 것일 수 있다.
기공은 전형적으로 (a) 2개의 단량체를 포함하는 1개의 구축물 및 (b) 기공을 형성하기에 충분한 수의 단량체를 함유한다. 구축물은 상기에 논의된 것 중 임의의 것일 수 있다. 단량체는 본 발명의 돌연변이체 단량체를 비롯한, 상기에 논의된 것 중 임의의 것일 수 있다.
또 다른 전형적인 기공은 1개 초과의 본 발명의 구축물, 예컨대 2, 3 또는 4개의 본 발명의 구축물을 포함한다. 이러한 기공은 기공을 형성하기에 충분한 수의 단량체를 추가로 포함한다. 단량체는 상기에 논의된 것 중 임의의 것일 수 있다. 본 발명의 추가의 기공은 2개의 단량체를 포함하는 구축물만을 포함한다. 본 발명에 따른 특정 기공은 2개의 단량체를 각각 포함하는 몇몇 구축물을 포함한다. 구축물은 각 구축물로부터의 1개의 단량체만이 기공에 기여하도록 하는 구조를 갖는 기공 내로 올리고머화될 수 있다. 전형적으로, 구축물의 다른 단량체 (즉, 기공을 형성하지 않는 것)는 기공의 외부에 있을 것이다.
돌연변이가 상기 기재된 바와 같은 구축물 내로 도입될 수 있다. 돌연변이는 교대로 있을 수 있는데, 즉 돌연변이가 2개의 단량체 구축물 내의 각각의 단량체에 대해 상이하고, 구축물이 호모-올리고머로서 조립되어 교대 변형을 생성한다. 즉, MutA 및 MutB를 포함하는 단량체가 융합 및 조립되어 A-B:A-B:A-B:A-B 기공을 형성한다. 대안적으로, 돌연변이는 이웃해 있을 수 있는데, 즉 동일한 돌연변이가 구축물에서의 2개의 단량체 내로 도입되고, 이어서 상이한 돌연변이체 단량체와 올리고머화된다. 즉, MutA를 포함하는 단량체가 융합된 후, MutB-함유 단량체와 올리고머화되어 A-A:B:B:B:B:B:B를 형성한다.
구축물-함유 기공에서 1개 이상의 본 발명의 단량체는 상기에 논의된 바와 같이 화학적으로 변형될 수 있다.
본 발명의 기공 생산
본 발명은 또한 본 발명의 기공을 생산하는 방법을 제공한다. 방법은 적어도 1개의 본 발명의 돌연변이체 단량체 또는 적어도 1개의 본 발명의 구축물이 충분한 수의 본 발명의 돌연변이체 리세닌 단량체, 본 발명의 구축물 또는 리세닌으로부터 유도된 단량체와 올리고머화되어 기공을 형성하도록 하는 것을 포함한다. 방법이 본 발명의 호모-올리고머 기공을 제조하는 것에 관한 것인 경우에, 방법에 사용된 모든 단량체는 동일한 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 돌연변이체 리세닌 단량체이다. 방법이 본 발명의 헤테로-올리고머 기공을 제조하는 것에 관한 것인 경우에, 단량체 중 적어도 1개는 다른 것과 상이하다. 본 발명의 기공과 관련하여 상기에 논의된 실시양태 중 임의의 것은 기공을 생산하는 방법에 동등하게 적용된다.
본 발명의 기공을 제조하는 바람직한 방식은 실시예 1에 개시되어 있다.
분석물을 특성화하는 방법
본 발명은 표적 분석물을 특성화하는 방법을 제공한다. 방법은 표적 분석물을 본 발명의 기공과 접촉시켜 표적 분석물이 기공을 통해 이동하도록 하는 것을 포함한다. 이어서, 분석물이 기공에 대해 이동할 때, 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 표적 분석물의 1개 이상의 특징을 측정한다. 바람직하게는 분석물이 기공을 통해 이동할 때 표적 분석물의 1개 이상의 특징을 측정한다. 단계 (a) 및 (b)는 바람직하게는 기공을 가로지르는 전위를 인가하면서 수행한다. 하기에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이, 인가된 전위는 전형적으로 기공과 폴리뉴클레오티드 결합 단백질 사이의 복합체를 형성한다. 인가된 전위는 전압 전위일 수 있다. 대안적으로, 인가된 전위는 화학 전위일 수 있다. 이의 예는 친양쪽성 층을 가로지르는 염 구배를 사용하는 것이다. 염 구배는 문헌 [Holden et al., J Am Chem Soc. 2007 Jul 11;129(27):8650-5]에 개시되어 있다.
본 발명의 방법은 표적 분석물을 특성화하기 위한 것이다. 방법은 적어도 1개의 분석물을 특성화하기 위한 것이다. 방법은 2개 이상의 분석물을 특성화하는 것에 관한 것일 수 있다. 방법은 임의의 수의 분석물, 예컨대 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100개 또는 그 초과의 분석물을 특성화하는 것을 포함할 수 있다.
표적 분석물은 바람직하게는 금속 이온, 무기 염, 중합체, 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 염료, 표백제, 제약, 진단제, 기분전환 약물, 폭발물 또는 환경 오염물질이다. 방법은 동일한 유형의 2개 이상의 분석물, 예컨대 2개 이상의 단백질, 2개 이상의 뉴클레오티드 또는 2개 이상의 제약을 특성화하는 것에 관한 것일 수 있다. 대안적으로, 방법은 상이한 유형의 2개 이상의 분석물, 예컨대 1개 이상의 단백질, 1개 이상의 뉴클레오티드 및 1개 이상의 제약을 특성화하는 것에 관한 것일 수 있다.
표적 분석물은 세포로부터 분비될 수 있다. 대안적으로, 표적 분석물은 세포 내부에 존재하는 분석물일 수 있으므로, 본 발명이 수행될 수 있기 전에 분석물은 세포로부터 추출되어야 한다.
분석물은 바람직하게는 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드 및/또는 단백질이다. 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 자연 발생 또는 비-자연 발생일 수 있다. 폴리펩티드 또는 단백질은 그의 내부에 합성 또는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 아미노산에 대한 다수의 상이한 유형의 변형은 당업계에 공지되어 있다. 적합한 아미노산 및 그의 변형은 상기에 있다. 본 발명의 목적을 위해, 표적 분석물은 당업계에서 이용가능한 임의의 방법에 의해 변형될 수 있음을 이해해야 한다.
단백질은 효소, 항체, 호르몬, 성장 인자 또는 성장 조절 단백질, 예컨대 시토카인일 수 있다. 시토카인은 인터류킨, 바람직하게는 IFN-1, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12 및 IL-13, 인터페론, 바람직하게는 IL-γ, 또는 다른 시토카인, 예컨대 TNF-α로부터 선택될 수 있다. 단백질은 박테리아 단백질, 진균 단백질, 바이러스 단백질 또는 기생충-유래 단백질일 수 있다.
표적 분석물은 바람직하게는 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 뉴클레오티드는 전형적으로 핵염기, 당 및 적어도 하나의 포스페이트 기를 함유한다. 핵염기는 전형적으로 헤테로시클릭이다. 핵염기는 퓨린 및 피리미딘, 보다 구체적으로 아데닌, 구아닌, 티민, 우라실 및 시토신을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 당은 전형적으로 펜토스 당이다. 뉴클레오티드 당은 리보스 및 데옥시리보스를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 뉴클레오티드는 전형적으로 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드이다. 뉴클레오티드는 전형적으로 모노포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트를 함유한다. 포스페이트는 뉴클레오티드의 5' 또는 3' 측 상에 부착될 수 있다.
뉴클레오티드는 아데노신 모노포스페이트 (AMP), 아데노신 디포스페이트 (ADP), 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 구아노신 모노포스페이트 (GMP), 구아노신 디포스페이트 (GDP), 구아노신 트리포스페이트 (GTP), 티미딘 모노포스페이트 (TMP), 티미딘 디포스페이트 (TDP), 티미딘 트리포스페이트 (TTP), 우리딘 모노포스페이트 (UMP), 우리딘 디포스페이트 (UDP), 우리딘 트리포스페이트 (UTP), 시티딘 모노포스페이트 (CMP), 시티딘 디포스페이트 (CDP), 시티딘 트리포스페이트 (CTP), 5-메틸시티딘 모노포스페이트, 5-메틸시티딘 디포스페이트, 5-메틸시티딘 트리포스페이트, 5-히드록시메틸시티딘 모노포스페이트, 5-히드록시메틸시티딘 디포스페이트, 5-히드록시메틸시티딘 트리포스페이트, 시클릭 아데노신 모노포스페이트 (cAMP), 시클릭 구아노신 모노포스페이트 (cGMP), 데옥시아데노신 모노포스페이트 (dAMP), 데옥시아데노신 디포스페이트 (dADP), 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 데옥시구아노신 모노포스페이트 (dGMP), 데옥시구아노신 디포스페이트 (dGDP), 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP), 데옥시티미딘 모노포스페이트 (dTMP), 데옥시티미딘 디포스페이트 (dTDP), 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP), 데옥시우리딘 모노포스페이트 (dUMP), 데옥시우리딘 디포스페이트 (dUDP), 데옥시우리딘 트리포스페이트 (dUTP), 데옥시시티딘 모노포스페이트 (dCMP), 데옥시시티딘 디포스페이트 (dCDP) 및 데옥시시티딘 트리포스페이트 (dCTP), 5-메틸-2'-데옥시시티딘 모노포스페이트, 5-메틸-2'-데옥시시티딘 디포스페이트, 5-메틸-2'-데옥시시티딘 트리포스페이트, 5-히드록시메틸-2'-데옥시시티딘 모노포스페이트, 5-히드록시메틸-2'-데옥시시티딘 디포스페이트 및 5-히드록시메틸-2'-데옥시시티딘 트리포스페이트를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 뉴클레오티드는 바람직하게는 AMP, TMP, GMP, UMP, dAMP, dTMP, dGMP 또는 dCMP로부터 선택된다. 뉴클레오티드는 무염기성 (즉, 핵염기 결여)일 수 있다. 뉴클레오티드는 추가의 변형을 함유할 수 있다. 특히, 적합한 변형된 뉴클레오티드는 2'-아미노 피리미딘 (예컨대, 2'-아미노 시티딘 및 2'-아미노 우리딘), 2'-히드록실 퓨린 (예컨대, 2'-플루오로 피리미딘 (예컨대, 2'-플루오로시티딘 및 2'-플루오로 우리딘), 히드록실 피리미딘 (예컨대, 5'-α-P-보라노 우리딘), 2'-O-메틸 뉴클레오티드 (예컨대, 2'-O-메틸 아데노신, 2'-O-메틸 구아노신, 2'-O-메틸 시티딘 및 2'-O-메틸 우리딘), 4'-티오 피리미딘 (예컨대, 4'-티오 우리딘 및 4'-티오 시티딘) 및 핵염기의 변형을 갖는 뉴클레오티드 (예컨대, 5-펜티닐-2'-데옥시 우리딘, 5-(3-아미노프로필)-우리딘 및 1,6-디아미노헥실-N-5-카르바모일메틸 우리딘)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
올리고뉴클레오티드는 전형적으로 50개 이하의 뉴클레오티드, 예컨대 40개 이하, 30개 이하, 20개 이하, 10개 이하 또는 5개 이하의 뉴클레오티드를 갖는 짧은 뉴클레오티드 중합체이다. 올리고뉴클레오티드는 무염기성 및 변형된 뉴클레오티드를 비롯한, 상기에 논의된 뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 바람직하게는 표적 폴리뉴클레오티드를 특성화하기 위한 것이다. 폴리뉴클레오티드, 예컨대 핵산은 2개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 거대분자이다. 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 임의의 뉴클레오티드의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 자연 발생 또는 인공일 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드에서의 하나 이상의 뉴클레오티드는 산화 또는 메틸화될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드에서의 하나 이상의 뉴클레오티드는 손상될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 피리미딘 이량체를 포함할 수 있다. 이러한 이량체는 전형적으로 자외선에 의한 손상과 연관되어 있고, 피부 흑색종의 주요 원인이다. 표적 폴리뉴클레오티드에서의 하나 이상의 뉴클레오티드는, 예를 들어 표지 또는 태그로 변형될 수 있다. 적합한 표지는 상기에 기재되어 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 스페이서를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드는 상기에 정의되어 있다. 폴리뉴클레오티드에 존재하는 뉴클레오티드는 전형적으로 아데노신 모노포스페이트 (AMP), 구아노신 모노포스페이트 (GMP), 티미딘 모노포스페이트 (TMP), 우리딘 모노포스페이트 (UMP), 시티딘 모노포스페이트 (CMP), 시클릭 아데노신 모노포스페이트 (cAMP), 시클릭 구아노신 모노포스페이트 (cGMP), 데옥시아데노신 모노포스페이트 (dAMP), 데옥시구아노신 모노포스페이트 (dGMP), 데옥시티미딘 모노포스페이트 (dTMP), 데옥시우리딘 모노포스페이트 (dUMP) 및 데옥시시티딘 모노포스페이트 (dCMP)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 뉴클레오티드는 바람직하게는 AMP, TMP, GMP, CMP, UMP, dAMP, dTMP, dGMP, dCMP 및 dUMP로부터 선택된다.
뉴클레오티드는 무염기성 (즉, 핵염기 결여)일 수 있다.
폴리뉴클레오티드에서의 뉴클레오티드는 임의의 방식으로 서로 부착될 수 있다. 뉴클레오티드는 전형적으로 핵산에서와 같이 그의 당 및 포스페이트 기에 의해 부착된다. 뉴클레오티드는 피리미딘 이량체에서와 같이 그의 핵염기를 통해 연결될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부는 바람직하게는 이중 가닥이다. 단일 가닥 폴리뉴클레오티드는 그에 혼성화된 하나 이상 프라이머를 가질 수 있고, 따라서 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 짧은 영역을 포함할 수 있다. 프라이머는 표적 폴리뉴클레오티드와 동일한 유형의 폴리뉴클레오티드일 수 있거나, 또는 상이한 유형의 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 핵산, 예컨대 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)일 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 1개의 DNA 가닥에 혼성화된 1개의 RNA 가닥을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 합성 핵산, 예컨대 펩티드 핵산 (PNA), 글리세롤 핵산 (GNA), 트레오스 핵산 (TNA), 잠금 핵산 (LNA) 또는 뉴클레오티드 측쇄를 갖는 다른 합성 중합체일 수 있다.
상기 방법을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드 전체 또는 그의 일부만을 특성화할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 적어도 10개, 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 400개 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 쌍 길이일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 1000개 이상의 뉴클레오티드 쌍, 5000개 이상의 뉴클레오티드 쌍 길이, 또는 100000개 이상의 뉴클레오티드 쌍 길이일 수 있다.
표적 분석물, 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드는 임의의 적합한 샘플에 존재한다. 본 발명은 전형적으로 표적 분석물, 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드를 함유하는 것으로 공지되어 있거나 또는 함유하는 것으로 추정되는 샘플 상에서 수행된다. 대안적으로, 본 발명은 샘플 내 그것의 존재가 공지되어 있거나 또는 예상되는 하나 이상의 표적 분석물, 예컨대 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드의 정체를 확인하기 위해 샘플 상에서 수행될 수 있다.
샘플은 생물학적 샘플일 수 있다. 본 발명은 임의의 유기체 또는 미생물로부터 수득되거나 또는 추출된 샘플 상에서 시험관내 수행될 수 있다. 유기체 또는 미생물은 전형적으로 고세균, 원핵생물 또는 진핵생물이고, 전형적으로 5개 계: 식물계, 동물계, 진균계, 원핵생물계 및 원생생물계 중 하나에 속한다. 본 발명은 임의의 바이러스로부터 수득되거나 또는 추출된 샘플 상에서 시험관내 수행될 수도 있다. 샘플은 바람직하게는 유체 샘플이다. 샘플은 전형적으로 환자의 체액을 포함한다. 샘플은 요, 림프, 타액, 점액 또는 양수일 수 있지만, 바람직하게는 혈액, 혈장 또는 혈청이다. 전형적으로, 샘플은 인간 기원이지만, 대안적으로 그것은 또 다른 포유동물, 예컨대 말, 소, 양 또는 돼지와 같이 상업적으로 사육되는 동물로부터의 것일 수 있거나 또는 대안적으로 고양이 또는 개와 같은 애완동물로부터의 것일 수 있다. 대안적으로, 식물 기원의 샘플은 전형적으로 상업 작물, 예컨대 곡류, 콩과식물, 과일 또는 채소, 예를 들어 밀, 보리, 귀리, 카놀라, 옥수수, 대두, 벼, 바나나, 사과, 토마토, 감자, 포도, 담배, 콩, 렌틸, 사탕수수, 코코아, 목화로부터 수득된다.
샘플은 비-생물학적 샘플일 수 있다. 비-생물학적 샘플은 바람직하게는 유체 샘플이다. 비-생물학적 샘플의 예는 수술 유체, 물, 예컨대 음용수, 해수 또는 강수, 및 실험실 시험용 시약을 포함한다.
샘플은 전형적으로 검정되기 전에, 예를 들어 원심분리에 의해 또는 원치 않는 분자 또는 세포, 예컨대 적혈구를 여과해내는 막의 통과에 의해 처리된다. 샘플은 수득 직후에 측정할 수 있다. 샘플은 또한 전형적으로 검정 전에, 바람직하게는 -70℃ 미만에서 저장할 수 있다.
기공은 전형적으로 막에 존재한다. 임의의 막이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 적합한 막은 당업계에 익히 공지되어 있다. 막은 바람직하게는 스핑고미엘린을 포함한다. 막은 바람직하게는 친양쪽성 층이다. 친양쪽성 층은 적어도 하나의 친수성 부분 및 적어도 하나의 친지성 또는 소수성 부분을 둘 다 갖는 친양쪽성 분자, 예컨대 인지질로부터 형성된 층이다. 친양쪽성 분자는 합성 또는 자연 발생일 수 있다. 비-자연 발생 친양쪽성 물질 및 단일층을 형성하는 친양쪽성 물질은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 블록공중합체를 포함한다 (문헌 [Gonzalez-Perez et al., Langmuir, 2009, 25, 10447-10450]). 블록 공중합체는 2개 이상의 단량체 서브-유닛이 함께 중합되어 단일 중합체 쇄를 생성하는 중합체 물질이다. 블록 공중합체는 전형적으로 각 단량체 서브-유닛이 기여하는 특성을 갖는다. 그러나, 블록 공중합체는 개별 서브-유닛으로부터 형성된 중합체가 보유하지 않는 특유의 특성을 가질 수 있다. 블록 공중합체는 수성 매질 중에 있는 동안 단량체 서브-유닛 중 하나는 소수성 (즉, 친지성)이 되고, 다른 서브-유닛(들)은 친수성이 되도록 조작될 수 있다. 이러한 경우에, 블록 공중합체는 친양쪽성 특성을 보유할 수 있으며, 생체 막을 모방하는 구조를 형성할 수 있다. 블록 공중합체는 이블록 (2개의 단량체 서브-유닛으로 이루어짐)일 수 있지만, 2개 초과의 단량체 서브-유닛으로부터 구축되어, 친양쪽성 물질로서 거동하는 더욱 복잡한 배열을 형성할 수도 있다. 공중합체는 삼블록, 사블록 또는 오블록 공중합체일 수 있다.
친양쪽성 층은 단층 또는 이중층일 수 있다. 친양쪽성 층은 전형적으로 평면 지질 이중층 또는 지지된 이중층이다.
친양쪽성 층은 전형적으로 지질 이중층이다. 지질 이중층은 세포 막의 모델이고, 다양한 실험 연구를 위한 탁월한 플랫폼으로서의 역할을 한다. 예를 들어, 지질 이중층은 단일-채널 기록에 의한 막 단백질의 시험관내 조사에 사용될 수 있다. 대안적으로, 지질 이중층은 다양한 물질의 존재를 검출하기 위한 바이오센서로서 사용될 수 있다. 지질 이중층은 임의의 지질 이중층일 수 있다. 적합한 지질 이중층은 평면 지질 이중층, 지지된 이중층 또는 리포솜을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 지질 이중층은 바람직하게는 평면 지질 이중층이다. 적합한 지질 이중층은 국제 출원 번호 PCT/GB08/000563 (WO 2008/102121로서 공개됨), 국제 출원 번호 PCT/GB08/004127 (WO 2009/077734로서 공개됨) 및 국제 출원 번호 PCT/GB2006/001057 (WO 2006/100484로서 공개됨)에 개시되어 있다.
지질 이중층을 형성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 적합한 방법은 실시예에 개시되어 있다. 지질 이중층은 지질 단층이 수용액/공기 계면에 대해 수직인 개구부의 어느 한 측을 지나 그 계면 상에 보유되는, 몬탈(Montal) 및 뮐러(Mueller) (문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1972; 69: 3561-3566])의 방법에 의해 통상적으로 형성된다.
몬탈 & 뮐러의 방법은 단백질 기공 삽입에 적합한 우수한 품질의 지질 이중층을 형성하는 비용-효과적이고 비교적 간단한 방법이기 때문에 대중적이다. 이중층 형성의 다른 통상적인 방법은 팁-디핑(tip-dipping), 이중층 페인팅 및 리포솜 이중층의 패치-클램핑(patch-clamping)을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 지질 이중층은 국제 출원 번호 PCT/GB08/004127 (WO 2009/077734로서 공개됨)에 기재된 바와 같이 형성된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 막은 고체 상태 층이다. 고체-상태 층은 생물학적 기원의 것이 아니다. 즉, 고체 상태 층은 생물학적 환경, 예컨대 유기체 또는 세포, 또는 생물학적으로 이용가능한 구조의 합성에 의해 제조된 버전으로부터 유래 또는 단리되지 않는다. 고체 상태 층은, 마이크로전자 물질, 절연 물질, 예컨대 Si3N4, Al2O3, 및 SiO, 유기 및 무기 중합체, 예컨대 폴리아미드, 플라스틱, 예컨대 테플론(Teflon)® 또는 엘라스토머, 예컨대 2-성분 부가-경화 실리콘 고무, 및 유리를 포함하지만 이에 제한되지 않는 유기 및 무기 물질 둘 다로부터 형성될 수 있다. 고체 상태 층은 1원자 층, 예컨대 그래핀, 또는 단지 수개 원자 두께인 층으로부터 형성될 수 있다. 적합한 그래핀 층은 국제 출원 번호 PCT/US2008/010637 (WO 2009/035647로서 공개됨)에 개시되어 있다.
방법은 전형적으로 (i) 기공을 포함하는 인공 친양쪽성 층, (ii) 기공을 포함하는 단리된 자연-발생 지질 이중층, 또는 (iii) 그 안에 삽입된 기공을 갖는 세포를 사용하여 수행된다. 방법은 전형적으로 인공 친양쪽성 층, 예컨대 인공 지질 이중층을 사용하여 수행된다. 층은 기공 이외에 다른 막횡단 및/또는 막내 단백질, 뿐만 아니라 다른 분자를 포함할 수 있다. 적합한 장치 및 조건은 하기에서 논의된다. 본 발명의 방법은 전형적으로 시험관내에서 수행된다. 분석물, 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드는 막에 커플링될 수 있다. 이는 임의의 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 막이 친양쪽성 층, 예컨대 지질 이중층 (상기에 상세하게 논의된 바와 같은 것)인 경우에, 분석물, 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 막에 존재하는 폴리펩티드 또는 막에 존재하는 소수성 앵커를 통해 막에 커플링된다. 소수성 앵커는 바람직하게는 지질, 지방산, 스테롤, 탄소 나노튜브 또는 아미노산이다.
분석물, 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드는 직접적으로 막에 커플링될 수 있다. 분석물, 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 링커를 통해 막에 커플링된다. 바람직한 링커는 중합체, 예컨대 폴리뉴클레오티드, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 폴리펩티드를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드가 막에 직접적으로 커플링되면, 막과 기공의 내부 사이의 거리로 인해 특성화 시행이 폴리뉴클레오티드의 단부까지 계속될 수 없으므로 일부 데이터가 손실될 것이다. 링커가 사용되면, 폴리뉴클레오티드가 완전히 처리될 수 있다. 링커가 사용되면, 링커는 임의의 위치에서 폴리뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 링커는 바람직하게는 꼬리 중합체에서 폴리뉴클레오티드에 부착된다.
커플링은 안정적 또는 일시적일 수 있다. 특정 용도에 대해서는, 커플링의 일시적인 특성이 바람직하다. 안정적인 커플링 분자가 폴리뉴클레오티드의 5' 또는 3' 단부에 직접적으로 부착되면, 이중층과 기공의 내부 사이의 거리로 인해 특성화 시행이 폴리뉴클레오티드의 단부까지 계속될 수 없으므로 일부 데이터가 손실될 것이다. 커플링이 일시적이면, 커플링된 단부가 무작위로 이중층으로부터 자유롭게 되었을 때, 폴리뉴클레오티드가 완전히 처리될 수 있다. 막과 안정적 또는 일시적인 연결을 형성하는 화학적 기는 하기에서 보다 상세하게 논의된다. 분석물, 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드는 콜레스테롤 또는 지방 아실 쇄를 사용하여 친양쪽성 층, 예컨대 지질 이중층에 일시적으로 커플링될 수 있다. 6 내지 30개 탄소 원자 길이를 갖는 임의의 지방 아실 쇄, 예컨대 헥사데칸산이 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 분석물, 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드는 친양쪽성 층에 커플링된다. 합성 지질 이중층에 대한 분석물, 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드의 커플링은 이전에 여러 가지 다양한 테더링 전략으로 수행되어 왔다. 이들은 하기 표 3에 요약된다.
표 3
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폴리뉴클레오티드는 합성 반응에서 반응성 기, 예컨대 티올, 콜레스테롤, 지질 및 비오틴 기의 부가에 대해 용이하게 상용성인 변형된 포스포르아미다이트를 사용하여 관능화될 수 있다. 상이한 이들 부착 화학물질은 폴리뉴클레오티드에 대한 한 벌의 부착 옵션을 제공한다. 각각의 상이한 변형 기는 폴리뉴클레오티드를 약간씩 상이한 방식으로 테더링시키고, 커플링은 항상 영구적인 것은 아니어서, 이중층에 대한 폴리뉴클레오티드의 상이한 체류 시간을 제공한다. 일시적인 커플링의 이점은 상기에 논의되어 있다.
반응성 기가 폴리뉴클레오티드에 부가될 수 있는 한, 폴리뉴클레오티드의 커플링은 다수의 다른 수단에 의해 달성될 수도 있다. 반응성 기를 DNA의 한쪽 단부에 부가하는 것은 이전에 보고되어 있다. 티올 기는 폴리뉴클레오티드 키나제 및 ATPγS를 사용하여 ssDNA의 5'에 부가될 수 있다 (문헌 [Grant, G. P. and P. Z. Qin (2007). "A facile method for attaching nitroxide spin labels at the 5' terminus of nucleic acids." Nucleic Acids Res 35(10): e77]). 보다 다양한 선택의 화학적 기, 예컨대 비오틴, 티올 및 형광단은 말단 트랜스퍼라제를 사용하여 부가되어 변형된 올리고뉴클레오티드를 ssDNA의 3'에 혼입시킬 수 있다 (문헌 [Kumar, A., P. Tchen, et al. (1988). "Nonradioactive labeling of synthetic oligonucleotide probes with terminal deoxynucleotidyl transferase." Anal Biochem 169(2): 376-82)]).
대안적으로, 반응성 기는 부착이 혼성화를 통해 달성될 수 있도록, 이중층에 이미 커플링된 것에 대해 상보적인 짧은 DNA 조각의 부가인 것으로 고려될 수 있다. T4 RNA 리가제 I을 사용한 짧은 ssDNA 조각의 라이게이션이 보고되어 있다 (문헌 [Troutt, A. B., M. G. McHeyzer-Williams, et al. (1992). "Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity." Proc Natl Acad Sci U S A 89(20): 9823-5)]). 대안적으로, ssDNA 또는 dsDNA를 천연 dsDNA에 라이게이션한 다음, 2개의 가닥을 열 또는 화학 변성에 의해 분리할 수 있다. 천연 dsDNA에 대해, ssDNA 조각을 듀플렉스의 한쪽 또는 양쪽 단부에, 또는 dsDNA를 한쪽 또는 양쪽 단부에 부가하는 것이 가능하다. 이어서, 듀플렉스가 용융되면, 각각의 단일 가닥은, ssDNA가 라이게이션에 사용된 경우에는 5' 또는 3' 변형을, dsDNA가 라이게이션에 사용된 경우에는 5' 단부, 3' 단부 또는 둘 다에서의 변형을 가질 것이다. 폴리뉴클레오티드가 합성 가닥인 경우에, 커플링 화학은 폴리뉴클레오티드의 화학적 합성 동안에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 반응성 기가 부착되어 있는 프라이머를 사용하여 합성될 수 있다.
게놈 DNA의 섹션의 증폭을 위한 통상적인 기술은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 사용하는 것이다. 여기서, 2개의 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, DNA의 동일한 섹션의 다수의 카피를 생성할 수 있고, 여기서 각각의 카피에 대해 듀플렉스 내의 각각의 가닥의 5'는 합성 폴리뉴클레오티드일 것이다. 반응성 기, 예컨대 콜레스테롤, 티올, 비오틴 또는 지질을 갖는 안티센스 프라이머를 사용함으로써, 증폭된 표적 DNA의 각각의 카피는 커플링을 위한 반응성 기를 함유할 것이다.
본 발명의 방법에 사용된 기공은 본 발명의 기공 (즉, 적어도 1개의 본 발명의 돌연변이체 단량체 또는 적어도 1개의 본 발명의 구축물을 포함하는 기공)이다. 기공은 상기에 논의된 방식 중 임의의 것으로 화학적으로 변형될 수 있다. 기공은 바람직하게는 상기에 논의된 바와 같은 표적 분석물과 상호작용할 수 있는 공유 어댑터로 변형된다.
방법은 바람직하게는 표적 폴리뉴클레오티드를 특성화하기 위한 것이고, 단계 (a)는 표적 폴리뉴클레오티드를 기공 및 폴리뉴클레오티드 결합 단백질과 접촉시키는 것을 포함하고, 단백질은 기공을 통한 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어한다. 폴리뉴클레오티드 결합 단백질은 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있고 기공을 통한 그의 이동을 제어할 수 있는 임의의 단백질일 수 있다. 단백질이 폴리뉴클레오티드에 결합하는지 아닌지의 여부를 결정하는 것은 당업계에서 간단한 일이다. 단백질은 전형적으로 폴리뉴클레오티드와 상호작용하고, 그의 적어도 하나의 특성을 변형시킨다. 단백질은 폴리뉴클레오티드를 절단시켜 개별 뉴클레오티드 또는 보다 짧은 뉴클레오티드 쇄, 예컨대 디- 또는 트리뉴클레오티드를 형성함으로써 폴리뉴클레오티드를 변형시킬 수 있다. 모이어티는 폴리뉴클레오티드를 배향시키거나 또는 그것을 특정 위치로 이동시킴으로써, 즉 그의 이동을 제어함으로써 그것을 변형시킬 수 있다.
폴리뉴클레오티드 결합 단백질은 바람직하게는 폴리뉴클레오티드 취급 효소이다. 폴리뉴클레오티드 취급 효소는 폴리뉴클레오티드와 상호작용하고, 그의 적어도 하나의 특성을 변형시킬 수 있는 폴리펩티드이다. 효소는 폴리뉴클레오티드를 절단시켜 개별 뉴클레오티드 또는 보다 짧은 뉴클레오티드 쇄, 예컨대 디- 또는 트리뉴클레오티드를 형성함으로써 폴리뉴클레오티드를 변형시킬 수 있다. 효소는 폴리뉴클레오티드를 배향시키거나 또는 그것을 특정 위치로 이동시킴으로써 그것을 변형시킬 수 있다. 폴리뉴클레오티드 취급 효소는 표적 서열에 결합할 수 있고 기공을 통한 그의 이동을 제어할 수 있는 한, 효소적 활성을 나타낼 필요가 없다. 예를 들어, 효소는 그의 효소적 활성이 제거되도록 변형될 수 있거나, 또는 그것이 효소로서 작용하는 것을 방지하는 조건 하에 사용될 수 있다. 이러한 조건은 하기에서 보다 상세하게 논의된다.
폴리뉴클레오티드 취급 효소는 바람직하게는 핵산분해 효소로부터 유래된다. 효소의 구축물에서 사용된 폴리뉴클레오티드 취급 효소는 보다 바람직하게는 효소 분류 (EC) 군 3.1.11, 3.1.13, 3.1.14, 3.1.15, 3.1.16, 3.1.21, 3.1.22, 3.1.25, 3.1.26, 3.1.27, 3.1.30 및 3.1.31 중 임의의 하나의 구성원으로부터 유래된다. 효소는 국제 출원 번호 PCT/GB10/000133 (WO 2010/086603으로서 공개됨)에 개시된 것 중 임의의 것일 수 있다.
바람직한 효소는 폴리머라제, 엑소뉴클레아제, 헬리카제 및 토포이소머라제, 예컨대 기라제이다. 적합한 효소는 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 I (서열 6), 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 III 효소 (서열 8), 티. 써모필루스로부터의 RecJ (서열 10) 및 박테리오파지 람다 엑소뉴클레아제 (서열 12) 및 그의 변이체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 서열 10에 나타낸 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 3개의 서브유닛은 상호작용하여 삼량체 엑소뉴클레아제를 형성한다. 효소는 Phi29 DNA 폴리머라제 (서열 4) 또는 그의 변이체일 수 있다. 효소는 헬리카제일 수 있거나 또는 헬리카제로부터 유래할 수 있다. 전형적인 헬리카제는 Hel308, RecD 또는 XPD, 예를 들어 Hel308 Mbu (서열 15) 또는 그의 변이체이다.
서열 4, 6, 8, 10, 12 또는 15의 변이체는, 서열 4, 6, 8, 10, 12 또는 15의 것과 상이하고 폴리뉴클레오티드 결합 능력을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 효소이다. 변이체는 높은 염 농도 및/또는 실온에서 폴리뉴클레오티드의 결합을 용이하게 해주고/거나 그의 활성을 용이하게 해주는 변형을 포함할 수 있다.
서열 4, 6, 8, 10, 12 또는 15의 아미노산 서열의 전체 길이에 대해, 변이체는 바람직하게는 아미노산 동일성을 기준으로 하여 상기 서열에 대해 적어도 50% 상동성일 것이다. 보다 바람직하게는, 변이체 폴리펩티드는 전체 서열에 대해 서열 4, 6, 8, 10, 12 또는 15의 아미노산 서열에 대한 아미노산 동일성을 기준으로 하여 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 97% 또는 99% 상동성일 수 있다. 200개 이상, 예를 들어 230, 250, 270 또는 280개 또는 그 초과의 인접 아미노산의 스트레치에 대한 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 90% 또는 95% 아미노산 동일성이 존재할 수 있다 ("강한 상동성"). 상동성은 상기에 기재된 바와 같이 결정된다. 변이체는 서열 2와 관련하여 상기에 논의된 방식 중 임의의 것으로 야생형 서열과 상이할 수 있다. 효소는 상기에 논의된 바와 같이 기공에 공유적으로 부착될 수 있다.
나노기공을 사용한 폴리뉴클레오티드 서열분석, 즉 가닥 서열분석 및 엑소뉴클레아제 서열분석에 대한 2가지 주요 전략이 존재한다. 본 발명의 방법은 가닥 서열분석 또는 엑소뉴클레아제 서열분석에 관한 것일 수 있다.
가닥 서열분석에서, DNA는 인가된 전위와 함께 또는 이에 대항하여 나노기공을 통해 전위된다. 이중 가닥 DNA에 대해 계속해서 또는 연속적으로 작용하는 엑소뉴클레아제를 인가된 전위 하에 나머지 단일 가닥이 공급되도록 기공의 시스 측 상에서 사용하거나, 또는 역 전위 하에 트랜스 측 상에서 사용할 수 있다. 유사하게, 이중 가닥 DNA를 푸는 헬리카제를 또한 유사한 방식으로 사용할 수 있다. 폴리머라제를 사용할 수도 있다. 인가된 전위에 대항한 가닥 전위를 필요로 하는 서열분석 적용에 대한 가능성도 존재하지만, DNA는 먼저 역 전위 또는 전위 부재 하에 효소에 의해 "포획"되어야 한다. 이어서, 결합 이후에 전위가 되돌려지면, 가닥은 기공을 통해 시스에서 트랜스로 통과할 것이고, 전류 흐름에 의해 연장된 형태로 유지될 것이다. 단일 가닥 DNA 엑소뉴클레아제 또는 단일 가닥 DNA 의존성 폴리머라제는 방금 전위된 단일 가닥을 인가된 전위에 대항하여 기공을 통해 제어된 단계적 방식으로 트랜스에서 시스로 다시 끌어당기는 분자 모터로서 작용할 수 있다.
한 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드를 특성화하는 방법은 표적 서열을 기공 및 헬리카제 효소와 접촉시키는 것을 포함한다. 임의의 헬리카제를 방법에서 사용할 수 있다. 헬리카제는 기공에 대해 2가지 방식으로 작동할 수 있다. 첫째로, 방법은 바람직하게는 헬리카제가 인가된 전압으로부터 생성된 전계와 함께 기공을 통한 표적 서열의 이동을 제어하도록 헬리카제를 사용하여 수행된다. 상기 방식에서, DNA의 5' 단부가 먼저 기공에 포획되고, 효소는 기공 내로의 DNA의 이동을 제어하여 최종적으로 표적 서열이 이중층의 트랜스 측으로 전위될 때까지 그것을 전계와 함께 기공에 통과시킨다. 대안적으로, 방법은 바람직하게는 헬리카제 효소가 인가된 전압으로부터 생성된 전계에 대항하여 기공을 통한 표적 서열의 이동을 제어하도록 수행된다. 상기 방식에서, DNA의 3' 단부가 먼저 기공에 포획되고, 효소는 기공을 통한 DNA의 이동을 제어하여 최종적으로 표적 서열이 이중층의 시스 측으로 다시 나올 때까지 그것을 인가된 전계에 대항하여 기공 외로 잡아당긴다.
엑소뉴클레아제 서열분석에서, 엑소뉴클레아제는 표적 폴리뉴클레오티드의 하나의 말단으로부터의 개별 뉴클레오티드를 방출하고, 이들 개별 뉴클레오티드는 하기에 논의된 바와 같이 확인된다. 또 다른 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드를 특성화하는 방법은 표적 서열을 기공 및 엑소뉴클레아제 효소와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기에 논의된 엑소뉴클레아제 효소 중 임의의 것을 본 방법에서 사용할 수 있다. 효소는 상기에 논의된 바와 같이 기공에 공유적으로 부착될 수 있다.
엑소뉴클레아제는 전형적으로 폴리뉴클레오티드의 하나의 단부 상에 걸려서, 그 단부로부터 한번에 하나의 뉴클레오티드 서열을 소화시키는 효소이다. 엑소뉴클레아제는 5' → 3' 방향 또는 3' → 5' 방향으로 폴리펩티드를 소화시킬 수 있다. 엑소뉴클레아제가 결합하는 폴리뉴클레오티드의 단부는 전형적으로 사용된 효소의 선택을 통해서 및/또는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 결정된다. 폴리뉴클레오티드의 어느 한쪽 단부에서의 히드록실 기 또는 캡 구조는 전형적으로 폴리뉴클레오티드의 특정한 단부에 대한 엑소뉴클레아제의 결합을 방지하거나 또는 용이하게 하는데 사용될 수 있다.
방법은 폴리뉴클레오티드를 엑소뉴클레오티드와 접촉시켜 상기에 논의된 바와 같이 뉴클레오티드의 일부분의 특성화 또는 확인을 허용하는 속도로 뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드의 단부로부터 소화되도록 하는 것을 포함한다. 이를 행하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 에드만(Edman) 분해를 사용하여 폴리펩티드의 단부로부터 단일 아미노산을 연속적으로 소화시켜 이것이 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 확인될 수 있도록 한다. 상응하는 방법을 본 발명에서 사용할 수 있다.
엑소뉴클레아제가 기능하는 속도는 전형적으로 야생형 엑소뉴클레아제의 최적 속도보다 느리다. 본 발명의 방법에서 엑소뉴클레아제의 적합한 활성 속도는 1초당 0.5 내지 1,000개 뉴클레오티드, 1초당 0.6 내지 500개 뉴클레오티드, 1초당 0.7 내지 200개 뉴클레오티드, 1초당 0.8 내지 100개 뉴클레오티드, 1초당 0.9 내지 50개 뉴클레오티드, 또는 1초당 1 내지 20개 또는 10개 뉴클레오티드의 소화를 포함한다. 속도는 바람직하게는 1초당 1, 10, 100, 500 또는 1000개 뉴클레오티드이다. 적합한 엑소뉴클레아제 활성 속도는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 감소된 최적 활성 속도를 갖는 변이체 엑소뉴클레아제가 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 표적 분석물, 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드의 1개 이상의 특징을 측정하는 것을 포함한다. 방법은 표적 분석물, 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드의 2, 3, 4 또는 5개 또는 그 초과의 특징을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드에 대해, 1개 이상의 특징은 바람직하게는 (i) 표적 폴리뉴클레오티드의 길이, (ii) 표적 폴리뉴클레오티드의 정체, (iii) 표적 폴리뉴클레오티드의 서열, (iv) 표적 폴리뉴클레오티드의 2차 구조 및 (v) 표적 폴리뉴클레오티드의 변형 여부로부터 선택된다. (i) 내지 (v)의 임의의 조합을 본 발명에 따라 측정할 수 있다.
(i)에 대해, 폴리뉴클레오티드의 길이는 표적 폴리뉴클레오티드와 기공 사이의 상호작용의 수를 사용하여 측정할 수 있다.
(ii)에 대해, 폴리뉴클레오티드의 정체는 다수의 방식으로 측정할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 정체는 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 측정과 함께 또는 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 측정 없이 측정할 수 있다. 전자는 간단하고; 폴리뉴클레오티드를 서열분석함으로써 확인한다. 후자는 몇몇 방식으로 수행할 수 있다. 예를 들어, (폴리뉴클레오티드의 나머지 서열을 측정하지 않으면서) 폴리뉴클레오티드 내의 특정한 모티프의 존재를 측정할 수 있다. 대안적으로, 방법에서의 특정한 전기 및/또는 광학 신호의 측정은 표적 폴리뉴클레오티드를 특정한 공급원으로부터 나오는 것으로서 확인할 수 있다.
(iii)에 대해, 폴리뉴클레오티드의 서열은 이전에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다. 적합한 서열분석 방법, 특히 전기 측정을 사용하는 것은 문헌 [Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7, Lieberman KR et al., J Am Chem Soc. 2010;132(50):17961-72], 및 국제 출원 WO 2000/28312에 기재되어 있다.
(iv)에 대해, 2차 구조는 다양한 방식으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 방법이 전기 측정을 포함하는 경우에, 2차 구조는 체류 시간에서의 변화 또는 기공을 통해 흐르는 전류에서의 변화를 사용하여 측정할 수 있다. 이는 단일-가닥 및 이중-가닥 폴리뉴클레오티드의 영역이 구별되도록 한다.
(v)에 대해, 임의의 변형의 존재 또는 부재를 측정할 수 있다. 방법은 바람직하게는 표적 폴리뉴클레오티드가 메틸화에 의해, 산화에 의해, 손상에 의해, 하나 이상의 단백질로, 또는 하나 이상의 표지, 태그 또는 스페이서로 변형되었는지 아닌지의 여부를 결정하는 것을 포함한다. 특정 변형은 기공과의 특정 상호작용을 생성할 것이고, 이는 하기에 기재된 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 메틸시토신은 그의 각각의 뉴클레오티드와의 상호작용 동안에 기공을 통해 흐르는 전류에 기반하여 시토신과 구별될 수 있다.
본 발명은 또한 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 추정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 표적 폴리뉴클레오티드를 서열분석하는 방법을 제공한다.
여러 가지 다양한 유형의 측정을 수행할 수 있다. 이것은 제한 없이 전기 측정 및 광학 측정을 포함한다. 가능한 전기 측정은 전류 측정, 임피던스 측정, 터널링 측정 (문헌 [Ivanov AP et al., Nano Lett. 2011 Jan 12;11(1):279-85)]), 및 FET 측정 (국제 출원 WO 2005/124888)을 포함한다. 광학 측정은 전기 측정과 조합될 수 있다 (문헌 [Soni GV et al., Rev Sci Instrum. 2010 Jan;81(1):014301]). 측정은 막횡단 전류 측정, 예컨대 기공을 통해 흐르는 이온 전류의 측정일 수 있다.
전기 측정은 문헌 [Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7, Lieberman KR et al., J Am Chem Soc. 2010;132(50):17961-72], 및 국제 출원 WO-2000/28312에 기재된 바와 같은 표준 단일 채널 기록 장치를 사용하여 수행할 수 있다. 대안적으로, 전기 측정은 다중-채널 시스템, 예를 들어 국제 출원 WO-2009/077734 및 국제 출원 WO-2011/067559에 기재된 바와 같은 것을 사용하여 수행할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 방법은
(a) 표적 폴리뉴클레오티드를 본 발명의 기공 및 폴리뉴클레오티드 결합 단백질과 접촉시켜, 표적 폴리뉴클레오티드가 기공을 통해 이동하고, 결합 단백질이 기공을 통한 표적 뉴클레오티드의 이동을 제어하도록 하고;
(b) 폴리뉴클레오티드가 기공에 대해 이동할 때 기공을 통과하는 전류를 측정하는 것
을 포함하며, 여기서 전류는 표적 폴리뉴클레오티드의 1개 이상의 특징을 가리킴으로써 표적 폴리뉴클레오티드를 특성화한다.
방법은 기공이 막 내로 삽입된 막/기공 시스템을 조사하는데 적합한 임의의 장치를 사용하여 수행할 수 있다. 방법은 막횡단 기공 센싱에 적합한 임의의 장치를 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 장치는 수용액을 포함하는 챔버 및 챔버를 2개의 섹션으로 분리하는 장벽을 포함한다. 장벽은 기공을 함유하는 막이 형성된 개구부를 갖는다.
방법은 국제 출원 번호 PCT/GB08/000562 (WO 2008/102120)에 기재된 장치를 사용하여 수행할 수 있다.
방법은 분석물, 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드가 기공에 대해 이동할 때 기공을 통과하는 전류를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 장치는 또한 전위를 인가할 수 있고 막 및 기공을 가로지르는 전기 신호를 측정할 수 있는 전기 회로를 포함할 수 있다. 방법은 패치 클램프 또는 전압 클램프를 사용하여 수행할 수 있다. 방법은 바람직하게는 전압 클램프의 사용을 포함한다.
본 발명의 방법은 분석물, 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드가 기공에 대해 이동할 때 기공을 통과하는 전류를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 막횡단 단백질 기공을 통한 이온 전류를 측정하는데 적합한 조건은 당업계에 공지되어 있고, 실시예에 개시되어 있다. 방법은 전형적으로 막 및 기공을 가로지르는 전압을 인가하면서 수행한다. 사용되는 전압은 전형적으로 +2V 내지 -2V, 전형적으로 -400 mV 내지 +400 mV이다. 사용되는 전압은 바람직하게는 -400 mV, -300 mV, -200 mV, -150 mV, -100 mV, -50 mV, -20mV 및 0 mV로부터 선택되는 하한치 및 +10 mV, + 20 mV, +50 mV, +100 mV, +150 mV, +200 mV, +300 mV및 +400 mV로부터 독립적으로 선택되는 상한치를 갖는 범위이다. 사용되는 전압은 보다 바람직하게는 100 mV 내지 240 mV 범위이고, 가장 바람직하게는 120 mV 내지 220 mV 범위이다. 증가된 인가 전위를 사용함으로써 기공에 의한 상이한 뉴클레오티드 사이의 식별을 증가시키는 것이 가능하다.
방법은 전형적으로 임의의 전하 캐리어, 예컨대 금속 염, 예를 들어 알칼리 금속 염, 할라이드 염, 예를 들어 클로라이드 염, 예컨대 알칼리 금속 클로라이드 염의 존재 하에 수행한다. 전하 캐리어는 이온성 액체 또는 유기 염, 예를 들어 테트라메틸 암모늄 클로라이드, 트리메틸페닐 암모늄 클로라이드, 페닐트리메틸 암모늄 클로라이드, 또는 1-에틸-3-메틸 이미다졸륨 클로라이드를 포함할 수 있다. 상기에 논의된 예시적인 장치에서, 염은 챔버 내 수용액 중에 존재한다. 염화칼륨 (KCl), 염화나트륨 (NaCl) 또는 염화세슘 (CsCl)이 전형적으로 사용된다. KCl이 바람직하다. 염 농도는 포화일 수 있다. 염 농도는 3M 이하일 수 있고, 전형적으로 0.1 내지 2.5M, 0.3 내지 1.9M, 0.5 내지 1.8M, 0.7 내지 1.7M, 0.9 내지 1.6M 또는 1M 내지 1.4M이다. 염 농도는 바람직하게는 150 mM 내지 1M이다. 방법은 바람직하게는 적어도 0.3M, 예컨대 적어도 0.4M, 적어도 0.5M, 적어도 0.6M, 적어도 0.8M, 적어도 1.0M, 적어도 1.5M, 적어도 2.0M, 적어도 2.5M 또는 적어도 3.0M의 염 농도를 사용하여 수행한다. 높은 염 농도는 높은 신호 대 잡음 비를 제공하고, 정상적인 전류 변동의 배경값에 대비하여 뉴클레오티드의 존재를 나타내는 전류가 확인되도록 한다.
방법은 전형적으로 완충제의 존재 하에 수행한다. 상기에 논의된 예시적인 장치에서, 완충제는 챔버 내 수용액 중에 존재한다. 임의의 완충제가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 전형적으로, 완충제는 HEPES이다. 또 다른 적합한 완충제는 트리스-HCl 완충제이다. 방법은 전형적으로 pH 4.0 내지 12.0, 4.5 내지 10.0, 5.0 내지 9.0, 5.5 내지 8.8, 6.0 내지 8.7 또는 7.0 내지 8.8 또는 7.5 내지 8.5에서 수행한다. 사용되는 pH는 바람직하게는 약 7.5이다.
방법은 0℃ 내지 100℃, 15℃ 내지 95℃, 16℃ 내지 90℃, 17℃ 내지 85℃, 18℃ 내지 80℃, 19℃ 내지 70℃, 또는 20℃ 내지 60℃에서 수행할 수 있다. 방법은 전형적으로 실온에서 수행한다. 방법은 임의로 효소 기능을 지지하는 온도, 예컨대 약 37℃에서 수행한다.
방법은 전형적으로 폴리뉴클레오티드 결합 단백질, 예컨대 헬리카제 또는 엑소뉴클레아제의 작용을 용이하게 해주는 유리 뉴클레오티드 또는 유리 뉴클레오티드 유사체 및 효소 보조인자의 존재 하에 수행한다. 유리 뉴클레오티드는 상기에 논의된 임의의 개별 뉴클레오티드 중 하나 이상일 수 있다. 유리 뉴클레오티드는 아데노신 모노포스페이트 (AMP), 아데노신 디포스페이트 (ADP), 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 구아노신 모노포스페이트 (GMP), 구아노신 디포스페이트 (GDP), 구아노신 트리포스페이트 (GTP), 티미딘 모노포스페이트 (TMP), 티미딘 디포스페이트 (TDP), 티미딘 트리포스페이트 (TTP), 우리딘 모노포스페이트 (UMP), 우리딘 디포스페이트 (UDP), 우리딘 트리포스페이트 (UTP), 시티딘 모노포스페이트 (CMP), 시티딘 디포스페이트 (CDP), 시티딘 트리포스페이트 (CTP), 시클릭 아데노신 모노포스페이트 (cAMP), 시클릭 구아노신 모노포스페이트 (cGMP), 데옥시아데노신 모노포스페이트 (dAMP), 데옥시아데노신 디포스페이트 (dADP), 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 데옥시구아노신 모노포스페이트 (dGMP), 데옥시구아노신 디포스페이트 (dGDP), 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP), 데옥시티미딘 모노포스페이트 (dTMP), 데옥시티미딘 디포스페이트 (dTDP), 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP), 데옥시우리딘 모노포스페이트 (dUMP), 데옥시우리딘 디포스페이트 (dUDP), 데옥시우리딘 트리포스페이트 (dUTP), 데옥시시티딘 모노포스페이트 (dCMP), 데옥시시티딘 디포스페이트 (dCDP) 및 데옥시시티딘 트리포스페이트 (dCTP)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 유리 뉴클레오티드는 바람직하게는 AMP, TMP, GMP, CMP, UMP, dAMP, dTMP, dGMP 또는 dCMP로부터 선택된다. 유리 뉴클레오티드는 바람직하게는 아데노신 트리포스페이트 (ATP)이다. 효소 보조인자는 헬리카제가 기능하게 하는 인자이다. 효소 보조인자는 바람직하게는 2가 금속 양이온이다. 2가 금속 양이온은 바람직하게는 Mg2 +, Mn2 +, Ca2 + 또는 Co2 +이다. 효소 보조인자는 가장 바람직하게는 Mg2 +이다.
표적 폴리뉴클레오티드는 기공 및 폴리뉴클레오티드 결합 단백질과 임의의 순서로 접촉시킬 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드를 단백질 및 기공과 접촉시킬 때, 표적 폴리뉴클레오티드가 먼저 단백질과 복합체를 형성하는 것이 바람직하다. 전압이 기공을 가로질러 인가되면, 표적 폴리뉴클레오티드/단백질 복합체는 기공과 복합체를 형성하고, 기공을 통한 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어한다.
개별 뉴클레오티드를 확인하는 방법
본 발명은 또한 개별 뉴클레오티드를 특성화하는 방법을 제공한다. 즉, 표적 분석물은 개별 뉴클레오티드이다. 방법은 뉴클레오티드를 본 발명의 기공과 접촉시켜 뉴클레오티드가 기공과 상호작용하도록 하고, 상호작용 동안 기공을 통과하는 전류를 측정함으로써 뉴클레오티드를 특성화하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명은 개별 뉴클레오티드의 나노기공 센싱을 포함한다. 본 발명은 또한 상호작용 동안 기공을 통과하는 전류를 측정함으로써 뉴클레오티드의 정체를 결정하는 것을 포함하는, 개별 뉴클레오티드를 확인하는 방법을 제공한다. 상기에 논의된 본 발명의 기공 중 임의의 것을 사용할 수 있다. 기공은 바람직하게는 상기에 논의된 바와 같은 분자 어댑터로 화학적으로 변형된다.
전류가 뉴클레오티드에 대해 특이적인 방식으로 기공을 통해 흐른다면 (즉, 뉴클레오티드와 연관된 독특한 전류가 기공을 통해 흐르는 것이 검출된다면), 그 뉴클레오티드가 존재하는 것이다. 전류가 뉴클레오티드에 대해 특이적인 방식으로 기공을 통해 흐르지 않는다면, 그 뉴클레오티드가 부재하는 것이다.
본 발명은 기공을 통과하는 전류 상에 미치는 상이한 효과에 근거하여 유사한 구조의 뉴클레오티드를 구별하는데 사용될 수 있다. 개별 뉴클레오티드는 그것이 기공과 상호작용할 때, 그의 전류 진폭으로부터 단일 분자 수준으로 확인될 수 있다. 본 발명은 또한 샘플에 특정한 뉴클레오티드가 존재하는지 아닌지의 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 샘플 중 특정한 뉴클레오티드의 농도를 측정하는데 사용될 수 있다.
기공은 전형적으로 막에 존재한다. 방법은 상기에 기재된 임의의 적합한 막/기공 시스템을 사용하여 수행될 수 있다.
개별 뉴클레오티드는 단일 뉴클레오티드이다. 개별 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 결합에 의해 또 다른 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 결합되지 않은 것이다. 뉴클레오티드 결합은 뉴클레오티드의 포스페이트 기 중 하나가 또 다른 뉴클레오티드의 당 기에 결합되는 것을 포함한다. 개별 뉴클레오티드는 전형적으로 뉴클레오티드 결합에 의해 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1000 또는 적어도 5000개 뉴클레오티드의 또 다른 폴리뉴클레오티드에 결합되지 않은 것이다. 예를 들어, 개별 뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대 DNA 또는 RNA 가닥으로부터 소화된 것이다. 본 발명의 방법은 임의의 뉴클레오티드를 확인하는데 사용될 수 있다. 뉴클레오티드는 상기에 논의된 것 중 임의의 것일 수 있다.
뉴클레오티드는 핵산 서열, 예컨대 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산의 소화로부터 유도될 수 있다. 핵산 서열은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 소화될 수 있다. 적합한 방법은 효소 또는 촉매를 사용하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 핵산의 촉매적 소화는 문헌 [Deck et al., Inorg. Chem., 2002; 41: 669-677]에 개시되어 있다.
폴리뉴클레오티드의 전체 또는 일부를 서열분석하기 위해 단일 폴리뉴클레오티드로부터의 개별 뉴클레오티드를 순차적 방식으로 기공과 접촉시킬 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 서열분석하는 것은 상기에 보다 상세하게 논의되어 있다.
뉴클레오티드는 막 어느 한 측 상에서 기공과 접촉시킬 수 있다. 뉴클레오티드를 막 어느 한 측 상에서 기공에 도입시킬 수도 있다. 뉴클레오티드를 막의 한 측과 접촉시켜, 뉴클레오티드가 기공을 통해 막의 다른 측으로 통과하도록 할 수도 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드가 기공을 통과할 수 있도록 그의 천연 환경에서 이온 또는 소분자, 예컨대 뉴클레오티드가 기공의 배럴 또는 채널 내로 진입되는 것을 허용하는 기공의 한쪽 단부와 뉴클레오티드를 접촉시킨다. 이러한 경우에, 뉴클레오티드는 기공의 배럴 또는 채널을 통해 막을 가로질러 통과할 때 기공 및/또는 어댑터와 상호작용한다. 대안적으로, 뉴클레오티드를 막의 한 측과 접촉시켜, 뉴클레오티드가 어댑터를 통해 또는 그와 함께 기공과 상호작용하고, 기공으로부터 해리되고, 막의 동일한 측 상에 남아있도록 할 수 있다. 본 발명은 어댑터의 위치가 고정되어 있는 것인 기공을 제공한다. 그 결과, 뉴클레오티드는 바람직하게는 어댑터가 뉴클레오티드와 상호작용하는 것을 허용하는 기공의 단부와 접촉된다.
뉴클레오티드는 임의의 방식으로 임의의 부위에서 기공과 상호작용할 수 있다. 상기에 논의된 바와 같이, 뉴클레오티드는 바람직하게는 어댑터를 통해 또는 그와 함께 기공에 가역적으로 결합한다. 뉴클레오티드는 가장 바람직하게는 막을 가로지르는 기공을 통과할 때 어댑터를 통해 또는 그와 함께 기공에 가역적으로 결합한다. 뉴클레오티드는 또한 막을 가로지르는 기공을 통과할 때 어댑터를 통해 또는 그와 함께 기공의 배럴 또는 채널에 가역적으로 결합할 수 있다.
뉴클레오티드와 기공 사이의 상호작용 동안에, 뉴클레오티드는 그 뉴클레오티드에 대해 특이적인 방식으로 기공을 통해 흐르는 전류에 영향을 미친다. 예를 들어, 특정한 뉴클레오티드는 특정한 평균 시간 동안 및 특정한 범위까지 기공을 통해 흐르는 전류를 감소시킬 것이다. 즉, 기공을 통해 흐르는 전류는 특정한 뉴클레오티드에 대해서 독특하다. 대조 실험을 수행하여 기공을 통해 흐르는 전류에 대한 특정한 뉴클레오티드의 효과를 결정할 수 있다. 이어서, 샘플 중의 특정한 뉴클레오티드를 확인하기 위해, 또는 특정한 뉴클레오티드가 샘플에 존재하는지의 여부를 결정하기 위해, 시험 샘플에 대해 본 발명의 방법을 수행한 결과를 이러한 대조 실험으로부터 유도된 것과 비교할 수 있다. 특정한 뉴클레오티드임을 가리키는 방식으로 기공을 통해 흐르는 전류가 영향을 받는 빈도를 사용하여 샘플 중의 상기 뉴클레오티드의 농도를 결정할 수 있다. 샘플 내의 상이한 뉴클레오티드의 비 또한 계산할 수 있다. 예를 들어, dCMP 대 메틸-dCMP의 비를 계산할 수 있다.
방법은 상기에 논의된 임의의 장치, 샘플 또는 조건의 사용을 포함할 수 있다.
센서를 형성하는 방법
본 발명은 또한 표적 폴리뉴클레오티드를 특성화하기 위한 센서를 형성하는 방법을 제공한다. 방법은 본 발명의 기공과 폴리뉴클레오티드 결합 단백질, 예컨대 헬리카제 또는 엑소뉴클레아제 사이의 복합체를 형성하는 것을 포함한다. 복합체는 표적 폴리뉴클레오티드의 존재 하에 기공과 단백질을 접촉시킨 다음, 기공을 가로지르는 전위를 인가함으로써 형성할 수 있다. 인가된 전위는 상기에 기재된 바와 같은 화학 전위 또는 전압 전위일 수 있다. 대안적으로, 복합체는 기공을 단백질에 공유적으로 부착시킴으로써 형성할 수 있다. 공유적으로 부착시키는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 국제 출원 번호 PCT/GB09/001679 (WO 2010/004265로서 공개됨) 및 PCT/GB10/000133 (WO 2010/086603으로서 공개됨)에 개시되어 있다. 복합체는 표적 폴리뉴클레오티드를 특성화하기 위한 센서이다. 방법은 바람직하게는 본 발명의 기공과 헬리카제 사이의 복합체를 형성하는 것을 포함한다. 상기에 논의된 실시양태 중 임의의 것은 상기 방법에 동등하게 적용된다.
본 발명은 또한 표적 폴리뉴클레오티드를 특성화하기 위한 센서를 제공한다. 센서는 본 발명의 기공과 폴리뉴클레오티드 결합 단백질 사이의 복합체를 포함한다. 상기에 논의된 실시양태 중 임의의 것은 본 발명의 센서에 동등하게 적용된다.
키트
본 발명은 또한 표적 폴리뉴클레오티드를 특성화, 예컨대 서열분석하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 (a) 본 발명의 기공 및 (b) 폴리뉴클레오티드 결합 단백질, 예컨대 헬리카제 또는 엑소뉴클레아제를 포함한다. 상기에 논의된 실시양태 중 임의의 것은 본 발명의 키트에 동등하게 적용가능하다.
본 발명의 키트는 상기에 언급된 실시양태 중 임의의 것을 수행할 수 있게 하는 하나 이상의 다른 시약 또는 기기를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 시약 또는 기기는 하기: 적합한 완충제(들) (수용액), 대상체로부터 샘플을 수득하기 위한 수단 (예컨대, 바늘을 포함하는 용기 또는 기기), 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭 및/또는 발현시키기 위한 수단, 상기에 정의된 바와 같은 막, 또는 전압 또는 패치 클램프 장치 중 하나 이상을 포함한다. 시약은 키트에 건조 상태로 존재하여, 유체 샘플로 시약을 재현탁시킬 수 있다. 키트는 또한 임의로, 키트를 본 발명의 방법에 사용할 수 있도록 하는 지침 또는 방법을 사용할 수 있는 환자에 관한 세부사항을 포함할 수 있다. 키트는 임의로 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
장치
본 발명은 또한 샘플 중의 표적 폴리뉴클레오티드를 특성화, 예컨대 서열분석하기 위한 장치를 제공한다. 장치는 (a) 다수의 본 발명의 기공 및 (b) 다수의 폴리뉴클레오티드 결합 단백질, 예컨대 헬리카제 또는 엑소뉴클레아제를 포함할 수 있다. 장치는 분석물 분석을 위한 임의의 통상적인 장치, 예컨대 어레이 또는 칩일 수 있다.
장치는 바람직하게는
다수의 기공을 지지할 수 있고, 기공 및 단백질을 사용한 폴리뉴클레오티드 특성화 또는 서열분석을 수행하도록 작동할 수 있는 센서 장치;
- 특성화 또는 서열분석을 수행하기 위한 물질을 보유하기 위한 적어도 하나의 저장소;
- 물질을 적어도 하나의 저장소로부터 센서 장치로 제어가능하게 공급하도록 구성된 유체공학 시스템; 및
- 각각의 샘플을 수용하기 위한 다수의 용기
를 포함하며, 유체공학 시스템은 샘플을 용기로부터 센서 장치로 선택적으로 공급하도록 구성된다.
장치는 국제 출원 번호 PCT/GB10/000789 (WO 2010/122293으로서 공개됨), 국제 출원 번호 PCT/GB10/002206 (아직 공개되지 않음) 또는 국제 출원 번호 PCT/US99/25679 (WO 00/28312로서 공개됨)에 기재된 것 중 임의의 것일 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 예시한다.
실시예 1 - 기공 제조
DNA 합성
리세닌에 대한 폴리펩티드를 젠스크립트 유에스에이 인크.(GenScript USA Inc.)에서 합성하여, NdeI 및 HindIII 제한 부위를 사용하여 pT7 벡터 내로 클로닝하였다. 발현 목적을 위해 Met에 대한 코돈 (ATG)을 DNA의 시작 지점에 위치시키고, 번역을 종결시키기 위해 2개의 정지 코돈 (TAA TGA)을 DNA의 단부에 위치시켰다.
단백질 발현 및 올리고머화
원형 DNA를 위한 이. 콜라이 T7-S30 추출 시스템을 사용하여 시험관내 전사 및 번역 (IVTT)을 커플링시킴으로써 단백질을 생성하였다. 단량체 단위의 발현 시에 올리고머화를 용이하게 하기 위해 스핑고미엘린 (SM) 함유 지질 소포의 존재 하에 단백질을 발현시켰다. SM 소포를 제조하기 위해, 클로로포름 중 SM (아반티 폴라 리피즈(Avanti Polar Lipids), 카탈로그 번호 860062C)의 25mg/ml 원액 0.5mL를 37℃에 두어 클로로포름을 증발시켰다. 클로로포름이 증발하였으면, TE 완충제 (10mM 트리스, 1mM EDTA, pH 8.0) 5mL를 바이알에 첨가하여 지질을 용해시켰다. 이어서, 혼합물을 약 1분 동안 와동시키고, 질소로 급속 동결시켰다. 이어서, 지질 혼합물을 37℃에서 해동시키고, 와동시키고, 다시 급속 동결시켰다. 이것을 5-6회 반복하였다. 지질 소포의 존재 하에 IVTT 단백질 100uL를 생성하기 위해, 제조된 SM 지질 소포 25μL를 10분 동안 20,000g로 회전시킴으로써 펠릿화하였다. 상청액을 제거하였으면, IVTT 키트 (인비트로젠 익스프레스웨이 맥시 익스프레션 모듈(Invitrogen Expressway Maxi Expression Module), 카탈로그 번호 45-4001)의 성분, 메티오닌 L-[35S] (퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 제품 번호 NEG009A005MC, 비활성: >1000Ci (37.0TBq)/mmol) 및 DNA 주형을 제조업체의 지침에 따라 펠릿에 첨가하였다. 간략하게, 이.콜라이 slyD-추출물 20uL, 아미노산이 없는 2.5X IVPS 반응 완충제 20uL, 메티오닌이 결여된 50mM 아미노산 1.25uL, 75mM 메티오닌 0.5uL, 메티오닌 L-[35S] 0.5uL, T7 효소 믹스 1.0uL, 400ng/uL의 DNA 주형 2.5uL (1ug) 및 RNase 무함유 물 4.25uL를 막 펠릿에 첨가하고, 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 2X IVPS 피드 완충제 25uL, 메티오닌이 결여된 50mM 아미노산 1.25uL, 75mM 메티오닌 0.5uL, 메티오닌 L-[35S] 0.5uL 및 RNase 무함유 물 22.75uL를 함유하는 피드 완충제 50uL를 혼합물에 첨가하고, 추가 90분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플을 10분 동안 20,000g로 회전시키고, 상청액을 제거하였다. 3X SDS를 함유하는 램리(Laemmli) 로딩 완충제 (1X) 100uL를 상청액에 첨가하였다. 이어서, 샘플을 7.5% 겔 상의 SDS-PAGE 전기영동에 적용하였다.
단백질 정제
겔을 진공 하에 종이 (와트만(Whatman) 3MM Chr) 위에서 3시간 동안 50℃로 건조시키고, 밤새 (약 18시간) X선 필름에 노출시켰다. 자가방사선사진을 주형으로 사용하여, 단백질 올리고머 밴드를 건조된 겔로부터 절단하였다. 150uL TE 완충제 중에서 재수화시킨 후에, 종이를 제거하였다. 이어서, 일회용 막자를 사용하여 겔을 분쇄하고, 슬러리를 10분 동안 25,000g로 원심분리함으로써 코스타 스핀-X(Costar spin-X) 원심분리 튜브 필터 (0.22μm 기공 CA 막, 제품 번호 8160)를 통해 여과하였다. 이어서, 단백질 용액 (여과물)을 취하여 평면 지질 이중층 실험에 사용하였다.
상기 실시예 1에서 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, 하기 리세닌 돌연변이체를 제조 및 정제하였다: 리세닌-(E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E135S) (돌연변이 E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E135S를 갖는 서열 2), 리세닌-(E85K/E92Q/E94S/E97S/D126G) (돌연변이 E85K/E92Q/E94S/E97S/D126G를 갖는 서열 2), 리세닌-(E76S/E85K/E92Q/E97S/D126G) (돌연변이 E76S/E85K/E92Q/E97S/D126G를 갖는 서열 2), 리세닌-(E71S/E85K/E92Q/E97S/D126G) (돌연변이 E71S/E85K/E92Q/E97S/D126G를 갖는 서열 2), 리세닌-(D68S/E85K/E92Q/E97S/D126G) (돌연변이 D68S/E85K/E92Q/E97S/D126G를 갖는 서열 2), 리세닌-(E85K/E92Q/E97S/D126G) (돌연변이 E85K/E92Q/E97S/D126G를 갖는 서열 2), 리세닌-(E84Q/E85K/E92Q/E97S/H103S/D126G) (돌연변이 E84Q/E85K/E92Q/E97S/H103S/D126G를 갖는 서열 2), 리세닌-(E84Q/E85K/M90S/E92Q/E97S/D126G) (돌연변이 E84Q/E85K/M90S/E92Q/E97S/D126G를 갖는 서열 2), 리세닌-(E84Q/Q87S/E85K/E92Q/E97S/D126G) (돌연변이 E84Q/Q87S/E85K/E92Q/E97S/D126G를 갖는 서열 2), 리세닌-(E84Q/E85S/E92Q/E97S/D126G) (돌연변이 E84Q/E85S/E92Q/E97S/D126G를 갖는 서열 2), 리세닌-(E84S/E85K/E92Q/E97S/D126G) (돌연변이 E84S/E85K/E92Q/E97S/D126G를 갖는 서열 2), 리세닌-(H81S/E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G) (돌연변이 H81S/E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G를 갖는 서열 2), 리세닌(Y79S/E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G) (돌연변이 Y79S/E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G를 갖는 서열 2), 리세닌-(F70S/E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G) (돌연변이 F70S/E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G를 갖는 서열 2), 리세닌-(H58S/E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G) (돌연변이 H58S/E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G를 갖는 서열 2), 리세닌-(E92Q/E97S) (돌연변이 E92Q/E97S를 갖는 서열 2), 리세닌-(E84Q/E85K/E92Q/E97S) (돌연변이 E84Q/E85K/E92Q/E97S를 갖는 서열 2), 리세닌-(E84Q/E85K/D126G) (돌연변이 E84Q/E85K/D126G를 갖는 서열 2), 리세닌-(E84Q/E85K/D126G/E167A) (돌연변이 E84Q/E85K/D126G/E167A를 갖는 서열 2), 리세닌-(E92Q/E97S/D126G) (돌연변이 E92Q/E97S/D126G를 갖는 서열 2), 리세닌-(E84D/E85K/E92Q) (돌연변이 E84D/E85K/E92Q를 갖는 서열 2), 리세닌-(E84Q) (돌연변이 E84Q를 갖는 서열 2), 리세닌-(D126N) (돌연변이 D126N을 갖는 서열 2), 리세닌-(E92Q) (돌연변이 E92Q를 갖는 서열 2).
실시예 2
본 실시예는 1,2-디피타노일-글리세로-3-포스포콜린 지질 (DPhPC) 이중층 내로의 야생형 리세닌 (서열 2) 나노기공의 기공 삽입을 관찰하는 것이 가능하였음을 예시한다. 시험된 실험 조건 하에서 DNA 포획 사건 또는 임의의 헬리카제 제어된 DNA 이동을 관찰하는 것은 가능하지 않았다. 본 실시예 전반에 걸쳐 사용된 일반적 방법 및 기질은 도 1에 나타나 있고 도면 설명에 기재되어 있다.
물질 및 방법
PhiX174의 ~400 bp 단편을 증폭시키도록 프라이머를 설계하였다. 이들 프라이머의 각각의 5'-단부는 단독중합체 스트레치 또는 10개 뉴클레오티드의 단독중합체 섹션의 반복 단위인 50개 뉴클레오티드의 비-상보적 영역을 포함하였다. 또한, 정방향 프라이머의 5'-단부는 "캡핑"되어 4개의 2'-O-메틸-우라실 (mU) 뉴클레오티드를 포함하였고, 역방향 프라이머의 5'-단부는 화학적으로 인산화되었다. 이어서, 이들 프라이머 변형은 람다 엑소뉴클레아제를 사용한 안티센스 가닥만의 우세한 제어적 소화를 가능하게 한다. mU 캡핑은 센스 가닥을 뉴클레아제 소화로부터 보호하는 반면, 안티센스 가닥의 5'에서의 PO4는 이를 촉진한다. 따라서, 람다 엑소뉴클레아제와의 인큐베이션 후, 듀플렉스의 센스 가닥만이, 이제는 단일 가닥 DNA (ssDNA)로서 무손상으로 유지된다. 이어서, 생성된 ssDNA를 이전에 기재된 바와 같이 PAGE 정제하였다.
여기 기재된 모든 실험에서 사용된 DNA 기질 설계는 도 2에 나타나 있다. DNA 기질은 50T 5'-리더를 갖는, PhiX로부터의 ssDNA의 400개 염기 섹션으로 이루어진다. 이중층의 표면 상에서 DNA를 풍부화시킴으로써 포획 효율을 개선시키기 위해, 3' 콜레스테롤 태그를 함유하는 프라이머를 50T 리더 바로 뒤에서 상기 가닥에 어닐링시켰다.
전기 측정값을 1,2-디피타노일-글리세로-3-포스포콜린 지질 (DPhPC, 아반티 폴라 리피즈) 이중층에 삽입된 단일 야생형 리세닌 (서열 2) 나노기공으로부터 획득하였다. 몬탈-뮐러 기술을 통해 (주문형 델린(Delrin) 챔버에서) 20μm 두께의 PTFE 필름에서 ~100μm 직경의 개구부에 걸쳐 이중층을 형성하고, 2개의 1 mL 완충 용액으로 분리하였다. 모든 실험은 언급된 완충 용액 중에서 수행하였다. 1440A 디지타이저가 장착된 악소패치(Axopatch) 200B 증폭기 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices)) 상에서 단일-채널 전류를 측정하였다. 백금 전극을, (나노기공 및 효소/DNA 둘 다가 첨가된) 시스 구획은 악소패치 헤드스테이지의 접지에 연결되고 트랜스 구획은 헤드스테이지의 활성 전극에 연결되도록 완충 용액에 연결하였다.
완충제 (625 mM KCl, 100 mM Hepes pH 8.0, 75mM 페로시안화칼륨 (II), 25mM 페리시안화칼륨 (III), 10 mM MgCl2) 중에서 이중층 내 단일 야생형 리세닌 (서열 2) 기공을 달성한 후, 제어를 5분 동안 +120 mV에서 실행하였다. DNA 폴리뉴클레오티드 (서열 13 및 14) 및 Hel308 Mbu (서열 15)를 완충제 (625 mM KCl, 100 mM Hepes pH 8.0, 75mM 페로시안화칼륨 (II), 25mM 페리시안화칼륨 (III), 10 mM MgCl2) 50 μL에 첨가하고, 5분 동안 예비-인큐베이션하였다 (DNA = 6 nM, 효소 (Hel308 Mbu) = 2 μM). 상기 예비-인큐베이션 믹스를 전기생리학 챔버의 시스 구획 내 완충제 (625 mM KCl, 100 mM Hepes pH 8.0, 75mM 페로시안화칼륨 (II), 25mM 페리시안화칼륨 (III), 10 mM MgCl2) 950 μL에 첨가하여 리세닌 나노기공으로의 헬리카제-DNA 복합체의 포획을 개시하고자 하였다 (DNA = 0.3 nM, 효소 (Hel308 Mbu) = 100 nM (서열 15)의 최종 농도를 제공함). 또 다른 제어를 5분 동안 +120 mV에서 실행하였다. 필요에 따라 NTP (1 mM ATP)를 시스 구획에 첨가함으로써 헬리카제 ATPase 활성을 개시하였다. 실험은 +120 mV의 일정한 전위에서 수행하였다.
결과 및 논의
DPhPC 이중층 내로의 WT 리세닌 (서열 2) 나노기공의 삽입을 관찰하는 것이 가능하였다 (도 3). 대략 280 pA의 안정한 개방 기공 전류가 관찰되었다. 그러나, 시스 구획에 대한 헬리카제-DNA 기질 믹스의 첨가 시, DNA 포획 사건 또는 헬리카제 제어된 DNA 이동은 관찰되지 않았다.
실시예 3
본 실시예는 돌연변이체 리세닌 나노기공 (돌연변이 E84D/E85K를 갖는 서열 2인 Lys-E84D/E85K)을 통한 무손상 DNA 가닥의 이동을 제어하기 위한 Hel308 헬리카제 (Hel308 MBu, 서열 15)의 사용을 예시한다. 본 실시예 전반에 걸쳐 사용된 일반적 방법 및 기질은 도 1에 나타나 있고 도면 설명에 기재되어 있다.
전기 측정값을 실시예 2에 기재된 바와 같이 획득하였다. 완충 조건 (625 mM KCl, 100 mM Hepes pH 8.0, 75 mM 페로시안화칼륨 (II), 25 mM 페리시안화칼륨 (III)) 하에 이중층 내 단일 리세닌-E84D/E85K (돌연변이 E84D/E85K를 갖는 서열 2) 기공을 달성한 후, MgCl2 (10 mM)를 시스 구획에 첨가하고, 제어를 5분 동안 +120 mV에서 실행하였다. DNA 폴리뉴클레오티드 (서열 13 및 14) 및 Hel308 Mbu (서열 15)를 완충제 (625 mM KCl, 100 mM Hepes pH 8.0, 75 mM 페로시안화칼륨 (II), 25 mM 페리시안화칼륨 (III), 10 mM MgCl2) 50 μL에 첨가하고, 5분 동안 예비-인큐베이션하였다 (DNA = 6 nM, 효소 = 2 μM). 상기 예비-인큐베이션 믹스를 전기생리학 챔버의 시스 구획 내 완충제 (625 mM KCl, 100 mM Hepes pH 8.0, 75 mM 페로시안화칼륨 (II), 25 mM 페리시안화칼륨 (III), 10 mM MgCl2) 950 μL에 첨가하여 리세닌 나노기공으로의 헬리카제-DNA 복합체의 포획을 개시하였다 (DNA = 0.3 nM, 효소 = 100 nM (서열 15)의 최종 농도를 제공함). 또 다른 제어를 10분 동안 +120 mV에서 실행하였다. 필요에 따라 NTP (1 mM ATP)를 시스 구획에 첨가함으로써 헬리카제 ATPase 활성을 개시하였다. 실험은 +120 또는 +180 mV의 일정한 전위에서 수행하였다.
결과 및 논의
도 1에 나타낸 바와 같은 리세닌-E84D/E85K (돌연변이 E84D/E85K를 갖는 서열 2)에 대한 헬리카제-DNA 기질의 부가는, (+180 mV의 인가된 전위에서) 도 4에 나타낸 바와 같은 특징적 전류 차단을 생성한다. 헬리카제가 결합되지 않은 DNA는 나노기공과 일시적으로 상호작용하여 전류에서의 짧은 수명의 차단 (<< 1초)을 생성한다. 헬리카제가 결합되고 활성인 (즉, ATPase 작용 하에 DNA 가닥을 따라 이동하는) DNA는 도 4에 나타낸 바와 같은 전류에서의 단계적 변화를 갖는 긴 특징적 차단 수준을 생성한다. 나노기공에서의 상이한 DNA 모티프는 특유의 전류 차단 수준을 일으킨다.
주어진 기질에 대해, 본 발명자들은 DNA 서열을 반영하는 전류 전이의 특징적 패턴을 관찰하였다 (도 4에서의 예). 사건 범위는 (+180 mV의 인가된 전위에서) 대략 25 pA인 것으로 관찰되었다.
실시예 4
본 실시예는 돌연변이체 리세닌 나노기공 (돌연변이 E92N/E94N/E97N/D121N/D126N을 갖는 서열 2인 리세닌-E92N/E94N/E97N/D121N/D126N)을 통한 무손상 DNA 가닥의 이동을 제어하기 위한 Hel308 헬리카제 (Hel308 MBu, 서열 15)의 사용을 예시한다. 본 실시예 전반에 걸쳐 사용된 일반적 방법 및 기질은 도 1에 나타나 있고 도면 설명에 기재되어 있다.
전기 측정값을 실시예 2에 기재된 바와 같이 획득하였다. 완충 조건 (625 mM KCl, 100 mM Hepes pH 8.0, 75 mM 페로시안화칼륨 (II), 25 mM 페리시안화칼륨 (III)) 하에 이중층 내 단일 리세닌-E92N/E94N/E97N/D121N/D126N (돌연변이 E92N/E94N/E97N/D121N/D126N을 갖는 서열 2) 나노기공을 달성한 후, MgCl2 (10 mM)를 시스 구획에 첨가하고, 제어를 5분 동안 +120 mV에서 실행하였다. DNA 폴리뉴클레오티드 (서열 13 및 14) 및 Hel308 Mbu (서열 15)를 완충제 (625 mM KCl, 100 mM Hepes pH 8.0, 75 mM 페로시안화칼륨 (II), 25 mM 페리시안화칼륨 (III), 10 mM MgCl2) 50 μL에 첨가하고, 5분 동안 예비-인큐베이션하였다 (DNA = 6 nM, 효소 = 2 μM). 상기 예비-인큐베이션 믹스를 전기생리학 챔버의 시스 구획 내 완충제 (625 mM KCl, 100 mM Hepes pH 8.0, 75 mM 페로시안화칼륨 (II), 25 mM 페리시안화칼륨 (III), 10 mM MgCl2) 950 μL에 첨가하여 리세닌 나노기공으로의 헬리카제-DNA 복합체의 포획을 개시하였다 (DNA = 0.3 nM, 효소 = 100 nM의 최종 농도를 제공함). 또 다른 제어를 10분 동안 +120 mV에서 실행하였다. 필요에 따라 NTP (1 mM ATP)를 시스 구획에 첨가함으로써 헬리카제 ATPase 활성을 개시하였다. 실험은 +120 mV의 일정한 전위에서 수행하였다.
결과 및 논의
도 1에 나타낸 바와 같은 리세닌-E92N/E94N/E97N/D121N/D126N (돌연변이 E92N/E94N/E97N/D121N/D126N을 갖는 서열 2)에 대한 헬리카제-DNA 기질의 부가는 도 5에 나타낸 바와 같은 특징적 전류 차단을 생성한다. 헬리카제가 결합되지 않은 DNA는 나노기공과 일시적으로 상호작용하여 전류에서의 짧은 수명의 차단 (<< 1초)을 생성한다. 헬리카제가 결합되고 활성인 (즉, ATPase 작용 하에 DNA 가닥을 따라 이동하는) DNA는 도 5에 나타낸 바와 같은 전류에서의 단계적 변화를 갖는 긴 특징적 차단 수준을 생성한다. 나노기공에서의 상이한 DNA 모티프는 특유의 전류 차단 수준을 일으킨다. 주어진 기질에 대해, 본 발명자들은 DNA 서열을 반영하는 전류 전이의 특징적 패턴을 관찰하였다 (도 5에서의 예). 사건 범위는 대략 60 pA인 것으로 관찰되었다.
실시예 5
본 실시예는 돌연변이체 리세닌 나노기공 (돌연변이 E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A를 함유하는 서열 2인 리세닌-E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A)을 통한 무손상 DNA 가닥의 이동을 제어하기 위한 Hel308 헬리카제 (Hel308 MBu, 서열 15)의 사용을 예시한다. 본 실시예 전반에 걸쳐 사용된 일반적 방법 및 기질은 도 1에 나타나 있고 도면 설명에 기재되어 있다.
전기 측정값을 실시예 2에 기재된 바와 같이 획득하였다. 완충 조건 (625 mM KCl, 100 mM Hepes pH 8.0, 75 mM 페로시안화칼륨 (II), 25 mM 페리시안화칼륨 (III)) 하에 이중층 내 단일 리세닌-E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A (돌연변이 E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A를 갖는 서열 2) 기공을 달성한 후, MgCl2 (10 mM)를 시스 구획에 첨가하고, 제어를 5분 동안 +120 mV에서 실행하였다. 6개의 돌연변이 중, 처음 5개 (E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G)는 본 발명에 따라 44 내지 126의 영역 내에 일으킨 것이다. 마지막의 것 (E167A)은 상기에 논의된 바와 같이 영역 외부의 추가 돌연변이이다. DNA 폴리뉴클레오티드 (서열 13 및 14) 및 Hel308 Mbu (서열 15)를 완충제 (625 mM KCl, 100 mM Hepes pH 8.0, 75 mM 페로시안화칼륨 (II), 25 mM 페리시안화칼륨 (III), 10 mM MgCl2) 50 μL에 첨가하고, 5분 동안 예비-인큐베이션하였다 (DNA = 12 nM, 효소 = 2 μM). 상기 예비-인큐베이션 믹스를 전기생리학 챔버의 시스 구획 내 완충제 (625 mM KCl, 100 mM Hepes pH 8.0, 75 mM 페로시안화칼륨 (II), 25 mM 페리시안화칼륨 (III), 10 mM MgCl2) 950 μL에 첨가하여 리세닌 나노기공으로의 헬리카제-DNA 복합체의 포획을 개시하였다 (DNA = 0.6 nM, 효소 = 100 nM의 최종 농도를 제공함). 또 다른 제어를 10분 동안 +120 mV에서 실행하였다. 필요에 따라 NTP (1 mM ATP)를 시스 구획에 첨가함으로써 헬리카제 ATPase 활성을 개시하였다. 실험은 +120 또는 +180 mV의 일정한 전위에서 수행하였다.
결과 및 논의
도 1에 나타낸 바와 같은 리세닌 나노기공 리세닌-E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A (돌연변이 E84Q/E85K/E92Q/E97S/D126G/E167A를 갖는 서열 2)에 대한 헬리카제-DNA 기질의 부가는, (+180 mV의 인가된 전위에서) 도 6에 나타낸 바와 같은 특징적 전류 차단을 생성한다. 헬리카제가 결합되지 않은 DNA는 나노기공과 일시적으로 상호작용하여 전류에서의 짧은 수명의 차단 (<< 1초)을 생성한다. 헬리카제가 결합되고 활성인 (즉, ATPase 작용 하에 DNA 가닥을 따라 이동하는) DNA는 도 6에 나타낸 바와 같은 전류에서의 단계적 변화를 갖는 긴 특징적 차단 수준을 생성한다. 나노기공에서의 상이한 DNA 모티프는 특유의 전류 차단 수준을 일으킨다. 주어진 기질에 대해, 본 발명자들은 DNA 서열을 반영하는 전류 전이의 특징적 패턴을 관찰하였다 (도 6에서의 예). 사건 범위는 (+180 mV의 인가된 전위에서) 대략 30 pA인 것으로 관찰되었다.
실시예 6
본 실시예는 다수의 상이한 돌연변이체 리세닌 나노기공 (시험된 돌연변이체 기공의 목록에 대해서는 표 4 참조)을 통한 무손상 DNA 가닥의 이동을 제어하기 위한 Hel308 헬리카제 (Hel308 MBu, 서열 15)의 사용을 예시한다. 본 실시예에서 사용된 일반적 방법 및 기질은 도 1에 나타나 있고 도면 설명에 기재되어 있다.
전기 측정값을 실시예 2에 기재된 바와 같이 획득하였다. 완충 조건 (625 mM KCl, 100 mM Hepes pH 8.0, 75 mM 페로시안화칼륨 (II), 25 mM 페리시안화칼륨 (III)) 하에 이중층 내 단일 리세닌 돌연변이체 기공 (하기 시험된 나노기공의 목록 참조)을 달성한 후, MgCl2 (10 mM)를 시스 구획에 첨가하고, 제어를 5분 동안 +120 mV에서 실행하였다. DNA 폴리뉴클레오티드 (서열 13 및 14) 및 Hel308 Mbu (서열 15)를 완충제 (625 mM KCl, 100 mM Hepes pH 8.0, 75 mM 페로시안화칼륨 (II), 25 mM 페리시안화칼륨 (III), pH 8.0, 10 mM MgCl2) 50 μL에 첨가하고, 5분 동안 예비-인큐베이션하였다 (DNA = 12, 6 또는 3 nM, 효소 = 2 μM). 상기 예비-인큐베이션 믹스를 전기생리학 챔버의 시스 구획 내 완충제 (625 mM KCl, 100 mM Hepes pH 8.0, 75 mM 페로시안화칼륨 (II), 25 mM 페리시안화칼륨 (III), pH 8.0, 10 mM MgCl2) 950 μL에 첨가하여 리세닌 나노기공으로의 헬리카제-DNA 복합체의 포획을 개시하였다 (DNA = 0.6, 0.3 또는 0.15 nM, 효소 = 100 nM의 최종 농도를 제공함). 또 다른 제어를 10분 동안 +120 mV에서 실행하였다. 필요에 따라 NTP (1 mM ATP)를 시스 구획에 첨가함으로써 헬리카제 ATPase 활성을 개시하였다. 실험은 +120 mV 또는 +180 mV의 일정한 전위에서 수행하였다.
결과 및 논의
도 1에 나타낸 바와 같은 단일 리세닌 나노기공 (하기 표 4에서의 기공의 목록 참조)에 대한 헬리카제-DNA 기질 (서열 13 및 14)의 부가는, (+120 또는 +180 mV의 인가된 전위에서) 도 7-12에 나타낸 바와 같은 특징적 전류 차단을 생성한다. 헬리카제가 결합되지 않은 DNA는 나노기공과 일시적으로 상호작용하여 전류에서의 짧은 수명의 차단 (<< 1초)을 생성한다. 헬리카제가 결합되고 활성인 (즉, ATPase 작용 하에 DNA 가닥을 따라 이동하는) DNA는 시험된 다양한 리세닌 돌연변이체에 대해 도 7-12에 나타낸 바와 같은 전류에서의 단계적 변화를 갖는 긴 특징적 차단 수준을 생성한다. 나노기공에서의 상이한 DNA 모티프는 특유의 전류 차단 수준을 일으킨다.
표 4
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
실시예 7
본 실시예는 이. 콜라이 발현을 이용함으로써 돌연변이체 리세닌 나노기공을 합성하는 방법을 기재한다.
물질 및 방법
이.콜라이 Rosetta2(DE3)pLysS 세포를 구축물 Strep-TrxEco-TEV-리세닌을 함유하는 플라스미드로 형질전환시키고, 발현을 0.2 mM IPTG의 첨가로 유도하고, 밤새 18℃에 두었다. 세포를 30분 동안 400 rpm에서 펠릿화하였다. 세포 펠릿을 50 mM 트리스 300 mM NaCl 0.1 μl/ml 벤조나제 10 μl/ml 칼바이오켐(Calbiochem) 세트 V 프로테아제 억제제 중 1X 버그버스터(Bugbuster) 중에 재현탁시키고, 4시간 동안 4℃에 두었다. 용해물을 30분 동안 20000 rpm으로 회전시키고, 0.2 μm 필터에 통과시켰다.
여과된 용해물을 스트렙트랩(StrepTrap) 칼럼 상에 로딩하고, 100 mM 트리스 300 mM NaCl 10 mM 데티오비오틴 pH 8.0으로 용리시켰다. Strep-TrxEco-TEV 태그를 Strep 태그부착된 TEV 프로테아제 (1:20 w/w)와 함께 밤새 4℃에서 인큐베이션함으로써 제거하였다. 임의의 절단되지 않은 단백질, 절단된 태그 및 TEV 프로테아제를 스트렙 비드와 함께 인큐베이션함으로써 제거하였다. 비드를 원심분리에 의해 제거하고, 스핑고미엘린 (1 mg/ml)을 상청액에 첨가하고, 밤새 37℃에 두었다.
SEQUENCE LISTING <110> Oxford Nanopore Technologies Limited <120> Mutant Pores <130> N. 116729A <150> US 61/622,174 <151> 2012-04-10 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 897 <212> DNA <213> Eisenia fetida <400> 1 atgagtgcga aggctgctga aggttatgaa caaatcgaag ttgatgtggt tgctgtgtgg 60 aaggaaggtt atgtgtatga aaatcgtggt agtacctccg tggatcaaaa aattaccatc 120 acgaaaggca tgaagaacgt taatagcgaa acccgtacgg tcaccgcgac gcattctatt 180 ggcagtacca tctccacggg tgacgccttt gaaatcggct ccgtggaagt ttcatattcg 240 catagccacg aagaatcaca agtttcgatg accgaaacgg aagtctacga atcaaaagtg 300 attgaacaca ccattacgat cccgccgacc tcgaagttca cgcgctggca gctgaacgca 360 gatgtcggcg gtgctgacat tgaatatatg tacctgatcg atgaagttac cccgattggc 420 ggtacgcaga gtattccgca agtgatcacc tcccgtgcaa aaattatcgt tggtcgccag 480 attatcctgg gcaagaccga aattcgtatc aaacatgctg aacgcaagga atatatgacc 540 gtggttagcc gtaaatcttg gccggcggcc acgctgggtc acagtaaact gtttaagttc 600 gtgctgtacg aagattgggg cggttttcgc atcaaaaccc tgaatacgat gtattctggt 660 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Leu Leu Pro 1 5 10 15 Leu Lys Gly Leu Arg Glu Ala Ala Ala Leu Leu Glu Glu Ala Leu Arg 20 25 30 Gln Gly Lys Arg Ile Arg Val His Gly Asp Tyr Asp Ala Asp Gly Leu 35 40 45 Thr Gly Thr Ala Ile Leu Val Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gly Ala Asp 50 55 60 Val His Pro Phe Ile Pro His Arg Leu Glu Glu Gly Tyr Gly Val Leu 65 70 75 80 Met Glu Arg Val Pro Glu His Leu Glu Ala Ser Asp Leu Phe Leu Thr 85 90 95 Val Asp Cys Gly Ile Thr Asn His Ala Glu Leu Arg Glu Leu Leu Glu 100 105 110 Asn Gly Val Glu Val Ile Val Thr Asp His His Thr Pro Gly Lys Thr 115 120 125 Pro Pro Pro Gly Leu Val Val His Pro Ala Leu Thr Pro Asp Leu Lys 130 135 140 Glu Lys Pro Thr Gly Ala Gly Val Ala Phe Leu Leu Leu Trp Ala Leu 145 150 155 160 His Glu Arg Leu Gly Leu Pro Pro Pro Leu Glu Tyr Ala Asp Leu Ala 165 170 175 Ala Val Gly Thr Ile Ala Asp Val Ala Pro Leu Trp Gly Trp Asn Arg 180 185 190 Ala Leu Val Lys Glu Gly Leu Ala Arg Ile Pro Ala Ser Ser Trp Val 195 200 205 Gly Leu Arg Leu Leu Ala Glu Ala Val Gly Tyr Thr Gly Lys Ala Val 210 215 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<213> Bacteriophage lambda <400> 11 tccggaagcg gctctggtag tggttctggc atgacaccgg acattatcct gcagcgtacc 60 gggatcgatg tgagagctgt cgaacagggg gatgatgcgt ggcacaaatt acggctcggc 120 gtcatcaccg cttcagaagt tcacaacgtg atagcaaaac cccgctccgg aaagaagtgg 180 cctgacatga aaatgtccta cttccacacc ctgcttgctg aggtttgcac cggtgtggct 240 ccggaagtta acgctaaagc actggcctgg ggaaaacagt acgagaacga cgccagaacc 300 ctgtttgaat tcacttccgg cgtgaatgtt actgaatccc cgatcatcta tcgcgacgaa 360 agtatgcgta ccgcctgctc tcccgatggt ttatgcagtg acggcaacgg ccttgaactg 420 aaatgcccgt ttacctcccg ggatttcatg aagttccggc tcggtggttt cgaggccata 480 aagtcagctt acatggccca ggtgcagtac agcatgtggg tgacgcgaaa aaatgcctgg 540 tactttgcca actatgaccc gcgtatgaag cgtgaaggcc tgcattatgt cgtgattgag 600 cgggatgaaa agtacatggc gagttttgac gagatcgtgc cggagttcat cgaaaaaatg 660 gacgaggcac tggctgaaat tggttttgta tttggggagc aatggcgatc tggctctggt 720 tccggcagcg gttccgga 738 <210> 12 <211> 226 <212> PRT <213> Bacteriophage lambda <400> 12 Met Thr Pro Asp Ile Ile Leu Gln Arg Thr Gly Ile Asp Val Arg Ala 1 5 10 15 Val Glu Gln Gly Asp Asp Ala Trp His Lys Leu Arg Leu Gly Val Ile 20 25 30 Thr Ala Ser Glu Val His Asn Val Ile Ala Lys Pro Arg Ser Gly Lys 35 40 45 Lys Trp Pro Asp Met Lys Met Ser Tyr Phe His Thr Leu Leu Ala Glu 50 55 60 Val Cys Thr Gly Val Ala Pro Glu Val Asn Ala Lys Ala Leu Ala Trp 65 70 75 80 Gly Lys Gln Tyr Glu Asn Asp Ala Arg Thr Leu Phe Glu Phe Thr Ser 85 90 95 Gly Val Asn Val Thr Glu Ser Pro Ile Ile Tyr Arg Asp Glu Ser Met 100 105 110 Arg Thr Ala Cys Ser Pro Asp Gly Leu Cys Ser Asp Gly Asn Gly Leu 115 120 125 Glu Leu Lys Cys Pro Phe Thr Ser Arg Asp Phe Met Lys Phe Arg Leu 130 135 140 Gly Gly Phe Glu Ala Ile Lys Ser Ala Tyr Met Ala Gln Val Gln Tyr 145 150 155 160 Ser Met Trp Val Thr Arg Lys Asn Ala Trp Tyr Phe Ala Asn Tyr Asp 165 170 175 Pro Arg Met Lys Arg Glu Gly Leu His Tyr Val Val Ile Glu Arg Asp 180 185 190 Glu Lys Tyr Met Ala Ser Phe Asp Glu Ile Val Pro Glu Phe Ile Glu 195 200 205 Lys Met Asp Glu Ala Leu Ala Glu Ile Gly Phe Val Phe Gly Glu Gln 210 215 220 Trp Arg 225 <210> 13 <211> 526 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence included in the examples <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> n = 2'-O-methy uracil <400> 13 nnnntttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttg ccatcagatt 60 gtgtttgtta gtcgctggtt gtttctgttg gtgctgatat tgcttttgat gccgacccta 120 aattttttgc ctgtttggtt cgctttgagt cttcttcggt tccgactacc ctcccgactg 180 cctatgatgt ttatcctttg aatggtcgcc atgatggtgg ttattatacc gtcaaggact 240 gtgtgactat tgacgtcctt ccccgtacgc cgggcaataa cgtttatgtt ggtttcatgg 300 tttggtctaa ctttaccgct actaaatgcc gcggattggt ttcgctgaat caggttatta 360 aagagattat ttgtctccag ccacttaagt gaggtgattt atgtttggtg ctattgctgg 420 cggtattgct tctgctcttg ctggtggcgc catgtctaaa ttgtttggag gcggtctttt 480 tccccctttt tccccctttt tccccctttt tccccctttt tccccc 526 <210> 14 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence included in the examples <400> 14 agcgactaac aaacacaatc tgatggcttt tttttttttt tttttttttt ttttttt 57 <210> 15 <211> 760 <212> PRT <213> Methanococcoides burtonii <400> 15 Met Met Ile Arg Glu Leu Asp Ile Pro Arg Asp Ile Ile Gly Phe Tyr 1 5 10 15 Glu Asp Ser Gly Ile Lys Glu Leu Tyr Pro Pro Gln Ala Glu Ala Ile 20 25 30 Glu Met Gly Leu Leu Glu Lys Lys Asn Leu Leu Ala Ala Ile Pro Thr 35 40 45 Ala Ser Gly Lys Thr Leu Leu Ala Glu Leu Ala Met Ile Lys Ala Ile 50 55 60 Arg Glu Gly Gly Lys Ala Leu Tyr Ile Val Pro Leu Arg Ala Leu Ala 65 70 75 80 Ser Glu Lys Phe Glu Arg Phe Lys Glu Leu Ala Pro Phe Gly Ile Lys 85 90 95 Val Gly Ile Ser Thr Gly Asp Leu Asp Ser Arg Ala Asp Trp Leu Gly 100 105 110 Val Asn Asp Ile Ile Val Ala Thr Ser Glu Lys Thr Asp Ser Leu Leu 115 120 125 Arg Asn Gly Thr Ser Trp Met Asp Glu Ile Thr Thr Val Val Val Asp 130 135 140 Glu Ile His Leu Leu Asp Ser Lys Asn Arg Gly Pro Thr Leu Glu Val 145 150 155 160 Thr Ile Thr Lys Leu Met Arg Leu Asn Pro Asp Val Gln Val Val Ala 165 170 175 Leu Ser Ala Thr Val Gly Asn Ala Arg Glu Met Ala Asp Trp Leu Gly 180 185 190 Ala Ala Leu Val Leu Ser Glu Trp Arg Pro Thr Asp Leu His Glu Gly 195 200 205 Val Leu Phe Gly Asp Ala Ile Asn Phe Pro Gly Ser Gln Lys Lys Ile 210 215 220 Asp Arg Leu Glu Lys Asp Asp Ala Val Asn Leu Val Leu Asp Thr Ile 225 230 235 240 Lys Ala Glu Gly Gln Cys Leu Val Phe Glu Ser Ser Arg Arg Asn Cys 245 250 255 Ala Gly Phe Ala Lys Thr Ala Ser Ser Lys Val Ala Lys Ile Leu Asp 260 265 270 Asn Asp Ile Met Ile Lys Leu Ala Gly Ile Ala Glu Glu Val Glu Ser 275 280 285 Thr Gly Glu Thr Asp Thr Ala Ile Val Leu Ala Asn Cys Ile Arg Lys 290 295 300 Gly Val Ala Phe His His Ala Gly Leu Asn Ser Asn His Arg Lys Leu 305 310 315 320 Val Glu Asn Gly Phe Arg Gln Asn Leu Ile Lys Val Ile Ser Ser Thr 325 330 335 Pro Thr Leu Ala Ala Gly Leu Asn Leu Pro Ala Arg Arg Val Ile Ile 340 345 350 Arg Ser Tyr Arg Arg Phe Asp Ser Asn Phe Gly Met Gln Pro Ile Pro 355 360 365 Val Leu Glu Tyr Lys Gln Met Ala Gly Arg Ala Gly Arg Pro His Leu 370 375 380 Asp Pro Tyr Gly Glu Ser Val Leu Leu Ala Lys Thr Tyr Asp Glu Phe 385 390 395 400 Ala Gln Leu Met Glu Asn Tyr Val Glu Ala Asp Ala Glu Asp Ile Trp 405 410 415 Ser Lys Leu Gly Thr Glu Asn Ala Leu Arg Thr His Val Leu Ser Thr 420 425 430 Ile Val Asn Gly Phe Ala Ser Thr Arg Gln Glu Leu Phe Asp Phe Phe 435 440 445 Gly Ala Thr Phe Phe Ala Tyr Gln Gln Asp Lys Trp Met Leu Glu Glu 450 455 460 Val Ile Asn Asp Cys Leu Glu Phe Leu Ile Asp Lys Ala Met Val Ser 465 470 475 480 Glu Thr Glu Asp Ile Glu Asp Ala Ser Lys Leu Phe Leu Arg Gly Thr 485 490 495 Arg Leu Gly Ser Leu Val Ser Met Leu Tyr Ile Asp Pro Leu Ser Gly 500 505 510 Ser Lys Ile Val Asp Gly Phe Lys Asp Ile Gly Lys Ser Thr Gly Gly 515 520 525 Asn Met Gly Ser Leu Glu Asp Asp Lys Gly Asp Asp Ile Thr Val Thr 530 535 540 Asp Met Thr Leu Leu His Leu Val Cys Ser Thr Pro Asp Met Arg Gln 545 550 555 560 Leu Tyr Leu Arg Asn Thr Asp Tyr Thr Ile Val Asn Glu Tyr Ile Val 565 570 575 Ala His Ser Asp Glu Phe His Glu Ile Pro Asp Lys Leu Lys Glu Thr 580 585 590 Asp Tyr Glu Trp Phe Met Gly Glu Val Lys Thr Ala Met Leu Leu Glu 595 600 605 Glu Trp Val Thr Glu Val Ser Ala Glu Asp Ile Thr Arg His Phe Asn 610 615 620 Val Gly Glu Gly Asp Ile His Ala Leu Ala Asp Thr Ser Glu Trp Leu 625 630 635 640 Met His Ala Ala Ala Lys Leu Ala Glu Leu Leu Gly Val Glu Tyr Ser 645 650 655 Ser His Ala Tyr Ser Leu Glu Lys Arg Ile Arg Tyr Gly Ser Gly Leu 660 665 670 Asp Leu Met Glu Leu Val Gly Ile Arg Gly Val Gly Arg Val Arg Ala 675 680 685 Arg Lys Leu Tyr Asn Ala Gly Phe Val Ser Val Ala Lys Leu Lys Gly 690 695 700 Ala Asp Ile Ser Val Leu Ser Lys Leu Val Gly Pro Lys Val Ala Tyr 705 710 715 720 Asn Ile Leu Ser Gly Ile Gly Val Arg Val Asn Asp Lys His Phe Asn 725 730 735 Ser Ala Pro Ile Ser Ser Asn Thr Leu Asp Thr Leu Leu Asp Lys Asn 740 745 750 Gln Lys Thr Phe Asn Asp Phe Gln 755 760 <210> 16 <211> 300 <212> PRT <213> Eisenia fetida <400> 16 Met Ser Ser Ser Thr Val Met Ala Asp Gly Phe Glu Glu Ile Glu Val 1 5 10 15 Asp Val Val Ser Val Trp Lys Glu Gly Tyr Ala Tyr Glu Asn Arg Gly 20 25 30 Asn Ser Ser Val Gln Gln Lys Ile Thr Met Thr Lys Gly Met Lys Asn 35 40 45 Leu Asn Ser Glu Thr Lys Thr Leu Thr Ala Thr His Thr Leu Gly Arg 50 55 60 Thr Leu Lys Val Gly Asp Pro Phe Glu Ile Ala Ser Val Glu Val Ser 65 70 75 80 Tyr Thr Phe Ser His Gln Lys Ser Gln Val Ser Met Thr Gln Thr Glu 85 90 95 Val Tyr Ser Ser Gln Val Ile Glu His Thr Val Thr Ile Pro Pro Asn 100 105 110 Lys Lys Phe Thr Arg Trp Lys Leu Asn Ala Asp Val Gly Gly Thr Gly 115 120 125 Ile Glu Tyr Met Tyr Leu Ile Asp Glu Val Thr Ala Ile Gly Ala Asp 130 135 140 Leu Thr Ile Pro Glu Val Asn Lys Ser Arg Ala Lys Ile Leu Val Gly 145 150 155 160 Arg Gln Ile His Leu Gly Glu Thr Glu Ile Arg Ile Lys His Ala Glu 165 170 175 Arg Lys Glu Tyr Met Thr Val Ile Ser Arg Lys Ser Trp Pro Ala Ala 180 185 190 Thr Leu Gly Asn Ser Asn Leu Phe Lys Phe Val Leu Phe Glu Asp Ser 195 200 205 Ser Gly Ile Arg Ile Lys Thr Leu Asn Thr Met Tyr Pro Gly Tyr Glu 210 215 220 Trp Ala Tyr Ser Ser Asp Gln Gly Gly Ile Tyr Phe Asp Glu Ser Ser 225 230 235 240 Asp Asn Pro Lys Gln Arg Trp Ala Leu Ser Lys Ala Met Pro Leu Arg 245 250 255 His Gly Asp Val Val Thr Phe Arg Asn Asn Phe Phe Thr Asn Ser Gly 260 265 270 Met Cys Tyr Asp Asp Gly Pro Ala Thr Asn Val Tyr Cys Leu Glu Lys 275 280 285 Arg Glu Asp Lys Trp Ile Leu Glu Val Val Asn Thr 290 295 300 <210> 17 <211> 300 <212> PRT <213> Eisenia fetida <400> 17 Met Ser Ser Arg Ala Gly Ile Ala Glu Gly Tyr Glu Gln Ile Glu Val 1 5 10 15 Asp Val Val Ala Val Trp Lys Glu Gly Tyr Val Tyr Glu Asn Arg Gly 20 25 30 Ser Thr Ser Val Glu Gln Lys Ile Lys Ile Thr Lys Gly Met Arg Asn 35 40 45 Leu Asn Ser Glu Thr Lys Thr Leu Thr Ala Ser His Ser Ile Gly Ser 50 55 60 Thr Ile Ser Thr Gly Asp Leu Phe Glu Ile Ala Thr Val Asp Val Ser 65 70 75 80 Tyr Ser Tyr Ser His Glu Glu Ser Gln Val Ser Met Thr Glu Thr Glu 85 90 95 Val Tyr Glu Ser Lys Glu Ile Glu His Thr Ile Thr Ile Pro Pro Thr 100 105 110 Ser Lys Phe Thr Arg Trp Gln Leu Asn Ala Asp Val Gly Gly Ala Asp 115 120 125 Ile Glu Tyr Met Tyr Leu Ile Asp Glu Val Thr Pro Ile Gly Gly Thr 130 135 140 Leu Ser Ile Pro Gln Val Ile Lys Ser Arg Ala Lys Ile Leu Val Gly 145 150 155 160 Arg Glu Ile Tyr Leu Gly Glu Thr Glu Ile Arg Ile Lys His Ala Asp 165 170 175 Arg Lys Glu Tyr Met Thr Val Val Ser Arg Lys Ser Trp Pro Ala Ala 180 185 190 Thr Leu Gly His Ser Lys Leu Tyr Lys Phe Val Leu Tyr Glu Asp Met 195 200 205 Tyr Gly Phe Arg Ile Lys Thr Leu Asn Thr Met Tyr Ser Gly Tyr Glu 210 215 220 Tyr Ala Tyr Ser Ser Asp Gln Gly Gly Ile Tyr Phe Asp Gln Gly Ser 225 230 235 240 Asp Asn Pro Lys Gln Arg Trp Ala Ile Asn Lys Ser Leu Pro Leu Arg 245 250 255 His Gly Asp Val Val Thr Phe Met Asn Lys Tyr Phe Thr Arg Ser Gly 260 265 270 Leu Cys Tyr Tyr Asp Gly Pro Ala Thr Asp Val Tyr Cys Leu Asp Lys 275 280 285 Arg Glu Asp Lys Trp Ile Leu Glu Val Val Lys Pro 290 295 300 <210> 18 <211> 300 <212> PRT <213> Eisenia fetida <400> 18 Met Ser Ala Thr Ala Val Thr Ala Asp Gly Leu Glu Glu Ile Glu Val 1 5 10 15 Asp Val Val Ala Val Trp Lys Glu Gly Tyr Val Tyr Glu Asn Arg Gly 20 25 30 Asp Thr Ser Val Glu Gln Lys Ile Thr Met Thr Lys Gly Met Lys Asn 35 40 45 Leu Asn Ser Glu Thr Lys Thr Leu Thr Ala Thr His Thr Val Gly Arg 50 55 60 Thr Leu Lys Val Gly Asp Pro Phe Glu Ile Gly Ser Val Glu Val Ser 65 70 75 80 Tyr Ser Phe Ser His Gln Glu Ser Gln Val Ser Met Thr Gln Thr Glu 85 90 95 Val Tyr Ser Ser Gln Val Ile Glu His Thr Val Thr Ile Pro Pro Thr 100 105 110 Ser Lys Phe Thr Arg Trp Lys Leu Asn Ala Asp Val Gly Gly Thr Asp 115 120 125 Ile Glu Tyr Met Tyr Leu Ile Asp Glu Val Thr Pro Ile Ser Val Thr 130 135 140 Gln Thr Ile Pro Gln Val Ile Arg Ser Arg Ala Lys Ile Leu Val Gly 145 150 155 160 Arg Gln Ile His Leu Gly Thr Thr Ala Val Arg Ile Lys His Ala Glu 165 170 175 Arg Gln Glu Tyr Met Thr Val Ile Glu Arg Lys Lys Trp Pro Ala Ala 180 185 190 Thr Leu Gly Lys Ser Asn Leu Phe Lys Phe Val Leu Phe Glu Asp Ser 195 200 205 Ser Gly Thr Arg Ile Lys Thr Leu Asn Thr Met Tyr Pro Gly Tyr Glu 210 215 220 Trp Ala Tyr Ser Ser Asp Gln Gly Gly Val Tyr Phe Asp Glu Ser Ser 225 230 235 240 Asp Asn Pro Lys Gln Arg Trp Ala Leu Ser Lys Ala Leu Pro Leu Arg 245 250 255 His Gly Asp Val Val Thr Phe Met Asn Lys Tyr Phe Thr Asn Ser Gly 260 265 270 Leu Cys Tyr Asp Asp Gly Pro Ala Thr Asn Val Tyr Cys Leu Asp Lys 275 280 285 Arg Glu Asp Lys Trp Ile Leu Glu Val Val Asn Pro 290 295 300 <210> 19 <211> 252 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 19 Met Asp Val Ile Arg Glu Tyr Leu Met Phe Asn Glu Leu Ser Ala Leu 1 5 10 15 Ser Ser Ser Pro Glu Ser Val Arg Ser Arg Phe Ser Ser Ile Tyr Gly 20 25 30 Thr Asn Pro Asp Gly Ile Ala Leu Asn Asn Glu Thr Tyr Phe Asn Ala 35 40 45 Val Lys Pro Pro Ile Thr Ala Gln Tyr Gly Tyr Tyr Cys Tyr Lys Asn 50 55 60 Val Gly Thr Val Gln Tyr Val Asn Arg Pro Thr Asp Ile Asn Pro Asn 65 70 75 80 Val Ile Leu Ala Gln Asp Thr Leu Thr Asn Asn Thr Asn Glu Pro Phe 85 90 95 Thr Thr Thr Ile Thr Ile Thr Gly Ser Phe Thr Asn Thr Ser Thr Val 100 105 110 Thr Ser Ser Thr Thr Thr Gly Phe Lys Phe Thr Ser Lys Leu Ser Ile 115 120 125 Lys Lys Val Phe Glu Ile Gly Gly Glu Val Ser Phe Ser Thr Thr Ile 130 135 140 Gly Thr Ser Glu Thr Thr Thr Glu Thr Ile Thr Val Ser Lys Ser Val 145 150 155 160 Thr Val Thr Val Pro Ala Gln Ser Arg Arg Thr Ile Gln Leu Thr Ala 165 170 175 Lys Ile Ala Lys Glu Ser Ala Asp Phe Ser Ala Pro Ile Thr Val Asp 180 185 190 Gly Tyr Phe Gly Ala Asn Phe Pro Lys Arg Val Gly Pro Gly Gly His 195 200 205 Tyr Phe Trp Phe Asn Pro Ala Arg Asp Val Leu Asn Thr Thr Ser Gly 210 215 220 Thr Leu Arg Gly Thr Val Thr Asn Val Ser Ser Phe Asp Phe Gln Thr 225 230 235 240 Ile Val Gln Pro Ala Arg Ser Leu Leu Asp Glu Gln 245 250

Claims (50)

  1. 서열 2에 나타낸 서열의 변이체를 포함하고, 기공을 형성할 수 있으며, 여기서 변이체는 폴리뉴클레오티드와 상호작용하는 돌연변이체 리세닌 단량체의 능력을 변경시키는 서열 2의 대략적인 위치 44 내지 대략적인 위치 126의 영역 내의 하나 이상의 변형을 포함하는 것인 돌연변이체 리세닌 단량체.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 변형이 (a) 단량체의 입체 효과를 변경시키고/거나, (b) 단량체의 순 전하를 변경시키고/거나, (c) 폴리뉴클레오티드와 수소 결합하는 단량체의 능력을 변경시키고/거나, (d) 비편재화 전자 파이계를 통해 상호작용하는 화학적 기를 도입 또는 제거하고/거나, (e) 단량체의 구조를 변경시키는 것인 돌연변이체 리세닌 단량체.
  3. 제2항에 있어서, 하나 이상의 변형이 순 양전하를 증가시키거나 또는 감소시키는 것인 돌연변이체 리세닌 단량체.
  4. 제3항에 있어서, 순 양전하가 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산을 도입하고/거나 하나 이상의 음전하를 중화시킴으로써 증가되는 것인 돌연변이체 리세닌 단량체.
  5. 제4항에 있어서, 하나 이상의 음전하가, 하나 이상의 음으로 하전된 아미노산을 하나 이상의 비하전 아미노산, 비-극성 아미노산 및/또는 방향족 아미노산으로 치환하거나 또는 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산을 하나 이상의 음으로 하전된 아미노산에 인접하게 도입함으로써 중화되는 것인 돌연변이체 리세닌 단량체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체가 서열 2의 하기 위치: M44, N46, N48, E50, R52, H58, D68, F70, E71, S74, E76, S78, Y79, S80, H81, S82, E84, E85, S86, Q87, S89, M90, E92, E94, E97, E102, H103, T104, T106, R115, Q117, N119, D121 및 D126 중 하나 이상에서의 치환을 포함하는 것인 돌연변이체 리세닌 단량체.
  7. 제6항에 있어서, 변이체 내로 치환된 아미노산(들)이 아스파라긴 (N), 세린 (S), 글루타민 (Q), 아르기닌 (R), 글리신 (G), 티로신 (Y), 아스파르트산 (D), 류신 (L), 리신 (K) 또는 알라닌 (A)으로부터 선택되는 것인 돌연변이체 리세닌 단량체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체가 하기 돌연변이:
    (a) 위치 44에서의 세린 (S);
    (b) 위치 46에서의 세린 (S);
    (c) 위치 48에서의 세린 (S);
    (d) 위치 52에서의 세린 (S);
    (e) 위치 58에서의 세린 (S);
    (f) 위치 68에서의 세린 (S);
    (g) 위치 70에서의 세린 (S);
    (h) 위치 71에서의 세린 (S);
    (i) 위치 76에서의 세린 (S);
    (j) 위치 79에서의 세린 (S);
    (k) 위치 81에서의 세린 (S);
    (l) 위치 84에서의 세린 (S), 아스파르트산 (D) 또는 글루타민 (Q);
    (m) 위치 85에서의 세린 (S) 또는 리신 (K);
    (n) 위치 87에서의 세린 (S);
    (o) 위치 90에서의 세린 (S);
    (p) 위치 92에서의 아스파라긴 (N) 또는 글루타민 (Q);
    (q) 위치 94에서의 세린 (S) 또는 아스파라긴 (N);
    (r) 위치 97에서의 세린 (S) 또는 아스파라긴 (N);
    (s) 위치 102에서의 세린 (S);
    (t) 위치 103에서의 세린 (S);
    (u) 위치 121에서의 아스파라긴 (N) 또는 세린 (S);
    (v) 위치 50에서의 세린 (S);
    (w) 위치 94에서의 아스파라긴 (N) 또는 세린 (S);
    (x) 위치 97에서의 아스파라긴 (N) 또는 세린 (S);
    (y) 위치 121에서의 세린 (S) 또는 아스파라긴 (N);
    (z) 위치 126에서의 아스파라긴 (N) 또는 글루타민 (Q) 또는 글리신 (G); 및
    (aa) 위치 128에서의 세린 (S) 또는 아스파라긴 (N)
    중 적어도 하나를 포함하는 것인 돌연변이체 리세닌 단량체.
  9. 제8항에 있어서, 변이체가 하기 치환:
    i. E84D 및 E85K 중 하나 이상;
    ii. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G 및 E167A 중 하나 이상;
    iii. E92N, E94N, E97N, D121N 및 D126N 중 하나 이상;
    iv. E92N, E94N, E97N, D121N, D126N 및 E128N 중 하나 이상;
    v. E76S, E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G 및 E167A 중 하나 이상;
    vi. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 E50S 중 하나 이상;
    vii. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 E71S 중 하나 이상;
    viii. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 E94S 중 하나 이상;
    ix. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 E102S 중 하나 이상;
    x. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 E128S 중 하나 이상;
    xi. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 E135S 중 하나 이상;
    xii. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 D68S 중 하나 이상;
    xiii. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 D121S 중 하나 이상;
    xiv. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 D134S 중 하나 이상; 또는
    xv. E84D, E85K 및 E92Q 중 하나 이상;
    xvi. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G 및 E135S 중 하나 이상;
    xvii. E85K, E92Q, E94S, E97S 및 D126G 중 하나 이상;
    xviii. E76S, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상;
    xix. E71S, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상;
    xx. D68S, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상;
    xxi. E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상;
    xxii. E84Q, E85K, E92Q, E97S, H103S 및 D126G 중 하나 이상;
    xxiii. E84Q, E85K, M90S, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상;
    xxiv. E84Q, Q87S, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상;
    xxv. E84Q, E85S, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상;
    xxvi. E84S, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상;
    xxvii. H81S, E84Q, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상;
    xxviii. Y79S, E84Q, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상;
    xxix. F70S, E84Q, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상;
    xxx. H58S, E84Q, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상;
    xxxi. R52S, E84Q, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상;
    xxxii. N48S, E84Q, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상;
    xxxiii. N46S, E84Q, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상;
    xxxiv. M44S, E84Q, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상;
    xxxv. E92Q 및 E97S 중 하나 이상;
    xxxvi. E84Q, E85K, E92Q 및 E97S 중 하나 이상;
    xxxvii. E84Q 및 E85K 중 하나 이상;
    xxxviii. E84Q, E85K 및 D126G 중 하나 이상;
    xxxix. E84Q, E85K, D126G 및 E167A 중 하나 이상;
    xl. E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상;
    xli. E84Q, E85K, E92Q, E97S 및 D126G 중 하나 이상;
    xlii. E84Q, E85K, E92Q, E97S 및 E167A 중 하나 이상;
    xliii. E84Q, E85K, E92Q, D126G 및 E167A 중 하나 이상;
    xliv. E84Q, E85K, E97S, D126G 및 E167A 중 하나 이상;
    xlv. E84Q, E92Q, E97S, D126G 및 E167A 중 하나 이상;
    xlvi. E85K, E92Q, E97S, D126G 및 E167A 중 하나 이상;
    xlvii. E84D, E85K 및 E92Q 중 하나 이상;
    xlviii. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 D121S 중 하나 이상;
    xlix. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 D68S 중 하나 이상;
    l. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 E135S 중 하나 이상;
    li. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 E128S 중 하나 이상;
    lii. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 E102S 중 하나 이상;
    liii. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 E94S 중 하나 이상;
    liv. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 E71S 중 하나 이상;
    lv. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G, E167A 및 E50S 중 하나 이상;
    lvi. E76S, E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G 및 E167A 중 하나 이상;
    lvii. E92N, E94N, E97N, D121N, D126N 및 E128N 중 하나 이상;
    lviii. E92N, E94N, E97N, D121N 및 D126N 중 하나 이상; 또는
    lix. E84Q, E85K, E92Q, E97S, D126G 및 E167A 중 하나 이상
    을 포함하는 것인 돌연변이체 리세닌 단량체.
  10. 제9항에 있어서, 변이체가 i 내지 lix 중 어느 하나에서의 치환을 모두 포함하는 것인 돌연변이체 리세닌 단량체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체가 화학적으로 변형된 것인 돌연변이체 리세닌 단량체.
  12. 제11항에 있어서, 돌연변이체가 하나 이상의 시스테인에 대한 분자의 부착, 하나 이상의 리신에 대한 분자의 부착, 하나 이상의 비-천연 아미노산에 대한 분자의 부착, 에피토프의 효소 변형 또는 말단의 변형에 의해 화학적으로 변형된 것인 돌연변이체 리세닌 단량체.
  13. 제12항에 있어서, 하나 이상의 시스테인 또는 하나 이상의 비-천연 아미노산이 치환에 의해 돌연변이체에 도입된 것인 돌연변이체 리세닌 단량체.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 분자가 (a) 단량체를 포함하는 기공과 표적 분석물, 표적 뉴클레오티드 또는 표적 폴리뉴클레오티드 사이의 상호작용을 용이하게 해주는 분자 어댑터 또는 (b) 폴리뉴클레오티드 결합 단백질인 돌연변이체 리세닌 단량체.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 부착이 링커를 통한 것인 돌연변이체 리세닌 단량체.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 서열 2의 대략적인 위치 1 내지 대략적인 위치 43 및 대략적인 위치 127 내지 대략적인 위치 297에 상응하는 변이체에서의 위치 중 하나 이상에 부착된 것인 돌연변이체 리세닌 단량체.
  17. 리세닌으로부터 유도된 2개 이상의 공유적으로 부착된 단량체를 포함하며, 여기서 단량체 중 적어도 1개는 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 돌연변이체 리세닌 단량체인 구축물.
  18. 제17항에 있어서, 2개 이상의 단량체가 동일하거나 또는 상이한 것인 구축물.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 적어도 1개의 단량체가 서열 2에 나타낸 서열을 포함하는 것인 구축물.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 단량체를 포함하는 구축물.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 단량체가 유전적으로 융합된 것인 구축물.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 단량체가 링커를 통해 부착된 것인 구축물.
  23. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이체 리세닌 단량체 또는 제21항에 따른 구축물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  24. 충분한 수의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이체 리세닌 단량체를 포함하는 리세닌으로부터 유도된 호모-올리고머 기공.
  25. 적어도 1개의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이체 리세닌 단량체를 포함하는 리세닌으로부터 유도된 헤테로-올리고머 기공.
  26. 제25항에 있어서, 서열 2에 나타낸 서열 또는 그의 파라로그, 상동체 또는 변이체를 포함하는 적어도 1개의 단량체를 포함하는 헤테로-올리고머 기공.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, (a) 1개의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이체 리세닌 단량체 및 (b) 기공을 형성하기에 충분한 수의 동일한 단량체를 포함하며, 여기서 (a)에서의 돌연변이체 단량체는 (b)에서의 동일한 단량체와 상이한 것인 헤테로-올리고머 기공.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 1개의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이체 리세닌 단량체만을 포함하는 헤테로-올리고머 기공.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 리세닌 단량체 중 적어도 1개가 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같이 화학적으로 변형된 것인 기공.
  30. 적어도 1개의 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 구축물을 포함하는 기공.
  31. 제30항에 있어서, (a) 1개의 제18항에 정의된 바와 같은 구축물 및 (b) (i) 서열 2에 나타낸 서열 또는 (ii) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 서열 2의 변이체를 각각 포함하는 기공을 형성하기에 충분한 수의 단량체를 포함하는 기공.
  32. 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 구축물 중 적어도 1개가 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같이 화학적으로 변형된 것인 기공.
  33. (a) 표적 폴리뉴클레오티드를 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 기공과 접촉시켜 표적 폴리뉴클레오티드가 기공을 통해 이동하도록 하고;
    (b) 분석물이 기공에 대해 이동할 때 하나 이상의 측정을 수행하는 것
    을 포함하며, 여기서 측정은 표적 분석물의 1개 이상의 특징을 가리킴으로써 표적 분석물을 특성화하는 것인, 표적 분석물을 특성화하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 표적 분석물이 금속 이온, 무기 염, 중합체, 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 염료, 표백제, 제약, 진단제, 기분전환 약물, 폭발물 또는 환경 오염물질인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 표적 분석물이 표적 폴리뉴클레오티드인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 단계 (a)가 표적 폴리뉴클레오티드를 기공 및 폴리뉴클레오티드 결합 단백질과 접촉시키는 것을 포함하고, 단백질이 기공을 통한 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하는 것인 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 표적 뉴클레오티드를 특성화하는 것이 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 추정하거나 또는 서열분석하는 것을 포함하는 것인 방법.
  38. 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 기공과 폴리뉴클레오티드 결합 단백질 사이의 복합체를 형성함으로써 표적 폴리뉴클레오티드를 특성화하기 위한 센서를 형성하는 것을 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드를 특성화하기 위한 센서를 형성하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 복합체가 (a) 표적 폴리뉴클레오티드의 존재 하에 기공과 폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 접촉시키고, (a) 기공을 가로지르는 전위를 인가함으로써 형성되는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 전위가 전압 전위 또는 화학 전위인 방법.
  41. 제38항에 있어서, 복합체가 기공을 단백질에 공유적으로 부착시킴으로써 형성되는 것인 방법.
  42. 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 기공과 폴리뉴클레오티드 결합 단백질 사이의 복합체를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드를 특성화하기 위한 센서.
  43. 표적 분석물을 특성화하기 위한, 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 기공의 용도.
  44. (a) 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 기공 및 (b) 폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드를 특성화하기 위한 키트.
  45. 제44항에 있어서, 친양쪽성 층을 포함하는 칩을 추가로 포함하는 키트.
  46. (a) 다수의 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 기공 및 (b) 다수의 폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 포함하는, 샘플에서 표적 뉴클레오티드를 특성화하기 위한 장치.
  47. 제46항에 있어서,
    다수의 기공을 지지할 수 있고, 기공 및 단백질을 사용한 폴리뉴클레오티드 특성화를 수행하도록 작동할 수 있는 센서 장치;
    특성화를 수행하기 위한 물질을 보유하기 위한 적어도 하나의 저장소;
    물질을 적어도 하나의 저장소로부터 센서 장치로 제어가능하게 공급하도록 구성된 유체공학 시스템; 및
    각각의 샘플을 수용하기 위한 다수의 용기
    를 포함하며, 유체공학 시스템은 샘플을 용기로부터 센서 장치로 선택적으로 공급하도록 구성된 것인 장치.
  48. 폴리뉴클레오티드와 상호작용하는 단량체의 능력을 변경시키고 기공을 형성하는 단량체의 능력에는 영향을 미치지 않는 서열 2의 대략적인 위치 44 내지 대략적인 위치 126의 영역 내의 하나 이상의 변형을 일으키는 것을 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 특성화하는 서열 2에 나타낸 서열을 포함하는 리세닌 단량체의 능력을 개선하는 방법.
  49. 적어도 1개의 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이체 리세닌 단량체를 리세닌으로부터 유도된 1개 이상의 단량체에 공유적으로 부착시키는 것을 포함하는, 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 구축물을 제조하는 방법.
  50. 적어도 1개의 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 단량체 또는 적어도 1개의 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 구축물이 충분한 수의 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 단량체, 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 구축물 또는 리세닌으로부터 유도된 단량체와 올리고머화되어 기공을 형성하도록 하는 것을 포함하는, 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 기공을 형성하는 방법.
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