JP2002355035A

JP2002355035A - スフィンゴミエリン検出プローブ

Info

Publication number: JP2002355035A
Application number: JP2001137087A
Authority: JP
Inventors: Toshihide Kobayashi; 俊秀小林; Etsuko Kiyokawa; 悦子清川; Akiko Hasegawa; 顕子長谷川
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2001-05-08
Filing date: 2001-05-08
Publication date: 2002-12-10

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】スフィンゴミエリン検出プローブとして利用
可能な、スフィンゴミエリンを特異的に認識し、かつ細
胞毒性が低いタンパク質を提供すること。【解決手段】シマミミズが分泌する毒素タンパク質であ
るライセニン類の特定のアミノ酸配列を有するタンパク
質。（１）１番目から４８番目のアミノ酸配列として
ライセニン１における１番目から４８番目のアミノ酸配
列を有し、４９番目から２９８番目のアミノ酸配列とし
てライセニン３における５１番目から３００番目のアミ
ノ酸配列を有するアミノ酸配列；又は（２）上記
（１）に記載のアミノ酸配列において1から複数個のア
ミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を有するアミノ酸配
列であって、スフィンゴミエリンを特異的に認識し、細
胞毒性が低いアミノ酸配列：

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、スフィンゴミエリ
ン検出プローブとして使用できる新規なタンパク質に関
する。より詳細には、本発明は、スフィンゴミエリンを
特異的に認識し、かつ細胞毒性が低いことを特徴とする
ライセニン１とライセニン３とから成るキメラタンパク
質に関する。本発明は、上記タンパク質をコードする遺
伝子、該遺伝子を有するベクター、該ベクターを有する
形質転換体、該タンパク質を含むスフィンゴミエリン検
出用試薬、該タンパク質を用いたスフィンゴミエリンの
検出方法、並びにスフィンゴミエリン検出用キットに関
する。

【０００２】

【従来の技術】細胞膜の主な脂質成分としては、グリセ
ロ脂質、スフィンゴ脂質およびコレステロールが挙げら
れる。動物細胞のグリセロ脂質はグリセロール骨格に脂
肪酸を２分子とリン酸塩基を結合した構造で、水溶液中
に分散させると疎水性の脂肪酸残基を内側に、リン酸塩
基部分を外側にした二重膜構造を形成する。形成された
二重膜構造は液晶の性質を有しており、このような液晶
の中にタンパク質が浮いているという「流動モザイクモ
デル」が1972年に米国のSingerとNicolson によって提
唱されている。

【０００３】細胞と外界とを隔てる膜細胞以外にも、細
胞は内部にも複雑な膜構造を有しており、それぞれが特
徴的な機能を持ったオルガネラを形成している。細胞膜
の構成部分は、小胞体と呼ばれるオルガネラで合成さ
れ、ゴルジ体を通って最終的に細胞膜へと輸送される。

【０００４】細胞膜の成分の一つであるグリセロ脂質
は、脂肪酸とリン酸塩基を含むが、脂肪酸の種類は多様
であり、また塩基部分もコリン、エタノールアミン、セ
リン、イノシトールなど多様性を有する。さらにスフィ
ンゴ脂質はグルコース、ガラクトース、ラクトースなど
さまざまな糖を結合しているものが存在する。上記の全
てを含めると自然界には数万の脂質分子が存在する。脂
質組成は、生物の種類、臓器の種類、細胞の種類、オル
ガネラの種類に応じて異なる。さらに、生体膜の脂質二
重層の内層と外層では脂質組成は異なっている。

【０００５】一方、スフィンゴ脂質は、グリセロ脂質と
は異なり、スフィンゴシンといわれる塩基が骨格となっ
ているため、水素結合の供与体とも受容体ともなること
ができる。また一般的には、スフィンゴ脂質は鎖長の長
い脂肪酸と結合している。このような構造上の特徴のた
めスフィンゴ脂質同士は、親水性部分は水素結合によ
り、また疎水性部分は脂肪酸鎖の疎水的相互作用によっ
て、会合しやすい性質を有している。ドイツのSimonsら
は細胞膜上のスフィンゴ脂質が会合して脂質ドメインを
形成することを提唱し、これを脂質のいかだ（lipidraf
t）と命名した（以下、単に「ラフト」とも称する）。

【０００６】上記したようなラフトの概念が提唱されて
以来、ラフトが情報伝達だけでなく、細胞接着、ウイル
スや細菌の感染、また細胞内の高分子輸送などに重要な
役割を果たしていることが示唆されている。さらに、近
年では、スフィンゴ脂質のなかでもスフィンゴミエリン
がラフト形成に必要十分な因子であることが明らかにな
っている。

【０００７】本発明者らは以前に、シマミミズ（Eiseni
a foetida）が分泌する毒素タンパク質であるライセニ
ン（Lysenin）がスフィンゴミエリンに特異的に結合す
ることを見出した。

【０００８】ライセニンは公知であり、ライセニン１、
２及び３の３種類が存在することが知られている。ライ
セニン１はアミノ酸残基２９７、ライセニン２及び３は
アミノ酸残基３００である。このうちライセニン１及び
３は細胞毒性が高いため、生きた細胞でのスフィンゴミ
エリンの標識には使用できないという問題があった。ま
た、ライセニン２はスフィンゴミエリンを認識しない。
従って、これまで報告されているライセニンは、スフィ
ンゴミエリン検出プローブとしては実用化できないもの
であった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】即ち、本発明は、スフ
ィンゴミエリン検出プローブとして利用可能な、スフィ
ンゴミエリンを特異的に認識し、かつ細胞毒性が低いタ
ンパク質を提供することを解決すべき課題とした。さら
に本発明は、上記タンパク質をコードする遺伝子、該遺
伝子を有するベクター、該ベクターを有する形質転換
体、該タンパク質を含むスフィンゴミエリン検出用試
薬、該タンパク質を用いてスフィンゴミエリンの検出を
行う方法、並びに、スフィンゴミエリン検出用キットを
提供することを解決すべき課題とした。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ライセニンの
変異体のなかから毒性が低く、かつスフィンゴミエリン
を特異的に認識するタンパク質を得ることに成功し、本
発明を完成するに至った。

【００１１】即ち、本発明によれば、下記の何れかのア
ミノ酸配列を有するタンパク質が提供される。（１）１番目から４８番目のアミノ酸配列としてライ
セニン１における１番目から４８番目のアミノ酸配列を
有し、４９番目から２９８番目のアミノ酸配列としてラ
イセニン３における５１番目から３００番目のアミノ酸
配列を有するアミノ酸配列；又は（２）上記（１）に
記載のアミノ酸配列において1から複数個のアミノ酸の
置換、欠失及び／又は付加を有するアミノ酸配列であっ
て、スフィンゴミエリンを特異的に認識し、細胞毒性が
低いアミノ酸配列：

【００１２】本発明の別の態様によれば、下記の何れか
のアミノ酸配列を有するタンパク質が提供される。（１）配列番号３に記載のアミノ酸配列；又は（２）
配列番号３に記載のアミノ酸配列において１から複数
個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を有するアミ
ノ酸配列であって、スフィンゴミエリンを特異的に認識
し、細胞毒性が低いアミノ酸配列：

【００１３】本発明のさらに別の態様によれば、上記し
た本発明のタンパク質をコードする遺伝子が提供され
る。本発明のさらに別の態様によれば、下記の何れかの
塩基配列を有する遺伝子が提供される。（１）配列番号３に記載の塩基配列；又は（２）配
列番号３に記載の塩基配列において1から複数個の塩基
の置換、欠失及び／又は付加を有する塩基配列であっ
て、スフィンゴミエリンを特異的に認識し、細胞毒性が
低いタンパク質をコードする塩基配列：

【００１４】本発明のさらに別の態様によれば、上記し
た本発明の遺伝子を有するベクターが提供される。本発
明のさらに別の態様によれば、上記した本発明のベクタ
ーを有する形質転換体が提供される。本発明のさらに別
の態様によれば、上記した本発明のタンパク質を含む、
スフィンゴミエリン検出用試薬が提供される。

【００１５】本発明のさらに別の態様によれば、上記し
た本発明のタンパク質を用いて、スフィンゴミエリンを
検出する方法が提供される。本発明のさらに別の態様に
よれば、上記した本発明のタンパク質、遺伝子、ベクタ
ー、形質転換体、又はスフィンゴミエリン検出用試薬を
含む、スフィンゴミエリン検出用キットが提供される。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て詳細に説明する。（Ａ）本発明のタンパク質本発明のタンパク質は下記の何れかのアミノ酸配列を有
する。（１）１番目から４８番目のアミノ酸配列としてライ
セニン１における１番目から４８番目のアミノ酸配列を
有し、４９番目から２９８番目のアミノ酸配列としてラ
イセニン３における５１番目から３００番目のアミノ酸
配列を有するアミノ酸配列；又は（２）上記（１）に
記載のアミノ酸配列において1から複数個のアミノ酸の
置換、欠失及び／又は付加を有するアミノ酸配列であっ
て、スフィンゴミエリンを特異的に認識し、細胞毒性が
低いアミノ酸配列：

【００１７】本発明のタンパク質はより具体的には、下
記の何れかのアミノ酸配列を有する。（１）配列番号３に記載のアミノ酸配列；又は（２）
配列番号３に記載のアミノ酸配列において1から複数
個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を有するアミ
ノ酸配列であって、スフィンゴミエリンを特異的に認識
し、細胞毒性が低いアミノ酸配列：

【００１８】上記した「アミノ酸配列において１から複
数個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を有するア
ミノ酸配列」における「１から複数個」の範囲は特には
限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１
から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好まし
くは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味
する。

【００１９】本明細書で言うスフィンゴミエリンを特異
的に認識するというのは、例えば、ELISAにおいてスフ
ィンゴミエリンと反応することが確認されるが、ホスフ
ァチジルコリンとは反応性は低いことを意味する。

【００２０】本発明のタンパク質がスフィンゴミエリン
を特異的に認識するためには、アミノ酸残基のうちトリ
プトファン（Ｔｒｐ）は保持されていることが好ましい
と考えられる。即ち、本発明の好ましい実施態様におい
ては、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列におい
て、２０番目、１１６番目、１８７番目、２４５番目、
及び２９１番目のトリプトファン残基は保持されてい
る。

【００２１】また、本明細書で言う細胞毒性は、赤血球
の溶血活性を測定することにより確認することができ、
例えば、ヒツジ赤血球に様々な濃度の被験タンパク質を
加えて、37℃で30分反応させ、遠心して血球を沈殿さ
せ、細胞破壊によって放出されたヘモグロビン量を405n
mの吸光度として測定することにより溶血活性を測定す
ることができる。本発明のタンパク質は、上記のように
して測定される細胞毒性が低いことを特徴とする。

【００２２】本発明のタンパク質の入手・製造方法は特
に限定されず、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組
み換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れで
もよい。比較的容易な操作でかつ大量に製造できるとい
う点では、組み換えタンパク質が好ましい。

【００２３】化学合成タンパク質を入手する場合には、
例えば、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル
法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合
成法に従って本発明のタンパク質を合成することができ
る。また、各種の市販のペプチド合成機（例えば、桑和
貿易(米国Advanced Chem Tech社製)、パーキンェルマー
ジャバン(米国Perkin−Elmer社製)、ファルマシアバイ
オテク(スウェーデンPharmacia Biotech社製)、アロカ
(米国Protein Technology Instrument社製)、クラボウ
(米国Synthecell-Vega社製)、日本パーセプティブ・リ
ミテッド(米国PerSeptive社製)、島津製作所等）を利用
して本発明のタンパク質を合成することもできる。

【００２４】本発明のタンパク質を組み換えタンパク質
として産生するには、該タンパク質をコードする塩基配
列（例えば、配列番号３に記載の塩基配列）を有するＤ
ＮＡまたはその変異体または相同体を入手し、これを好
適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を
製造することができる。発現ベクターおよび形質転換体
の作成およびそれを用いた組み換えタンパク質の産生に
ついては本明細書中後記する。

【００２５】なお、配列番号３に記載のアミノ酸配列に
おいて１から複数個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は
付加を有するアミノ酸配列であって、スフィンゴミエリ
ンを特異的に認識し、細胞毒性が低いアミノ酸配列を有
するタンパク質は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡ配列の一例示す配列番号３に記載の塩
基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜製造するこ
とができる。

【００２６】（Ｂ）本発明の遺伝子本発明は、上記した本発明のタンパク質をコードする遺
伝子にも関する。本発明の遺伝子の具体例としては、下
記の何れかの塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。（１）配列番号３に記載の塩基配列；又は（２）配
列番号３に記載の塩基配列において1から複数個の塩基
の置換、欠失及び／又は付加を有する塩基配列であっ
て、スフィンゴミエリンを特異的に認識し、細胞毒性が
低いタンパク質をコードする塩基配列：

【００２７】上記した「配列番号３に記載の塩基配列に
おいて1から複数個の塩基の置換、欠失及び／又は付加
を有する塩基配列」における「１から複数個」の範囲は
特には限定されないが、例えば、１から６０個、好まし
くは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さら
に好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個
程度を意味する。

【００２８】本発明の遺伝子の取得方法は特に限定され
ない。本明細書中の配列表の配列番号１（ライセニン１
の塩基配列とアミノ酸配列）、配列番号２（ライセニン
３の塩基配列とアミノ酸配列）、並びに配列番号３（以
下の実施例で作成したライセニン１と３とから成る本発
明のキメラタンパク質の塩基配列とアミノ酸配列）に記
載した塩基配列及びアミノ酸配列の情報に基づいて適当
なプライマーを調製し、それらを用いて本発明の遺伝子
を作製することができる。

【００２９】本明細書中上記した、「配列番号３に記載
の塩基配列において1から複数個の塩基の置換、欠失及
び／又は付加を有する塩基配列であって、スフィンゴミ
エリンを特異的に認識し、細胞毒性が低いタンパク質を
コードする塩基配列」を有する遺伝子（変異遺伝子）
は、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発など
の当業者に既知の任意の方法で作製することもできる。

【００３０】このような変異遺伝子は、例えば、配列番
号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これら
ＤＮＡに変異を導入することにより取得することができ
る。即ち、配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
に対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外
線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うこ
とができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的
変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法
であることから有用であり、Molecular Cloning: A lab
oratory Mannual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Labor
atory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.；又はCurrent
Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,
John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じ
て行うことができる。

【００３１】（Ｃ）本発明の遺伝子を有するベクター本発明の遺伝子は適当なベクター中に組み込んで組み換
えベクターとして使用することができる。ベクターの種
類は発現ベクターでも非発現ベクターでもよく、目的に
応じて選ぶことができる。クローニングベクターとして
は、大腸菌Ｋ１２株中で自律複製できるものが好まし
く、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれで
も使用できる、具体的には、ZAP Express、pBluescript
II SK(+)、Lambda ZAP II(ストラタジーン社製)、λgt
10、λgt11、λTriplEx(クローンテック社製)、λExCel
l(ファルマシア社製)、pT7T318U(ファルマシア社製)、p
cD2、pMW218(和光純薬社製)、pUC118(宝酒造社製)、pQE
-30 (QIAGEN社製)等をあげることができる。

【００３２】発現ベクターとしては、好ましくは宿主細
胞において自立複製可能であるか、あるいは宿主細胞の
染色体中へ組込み可能であるものを使用する。また、発
現ベクターとしては、本発明の遺伝子を発現できる位置
にプロモーターを含有しているものが使用される。

【００３３】細菌を宿主細胞として用いる場合は、本発
明の遺伝子を発現させるための発現ベクターは該細菌中
で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソ
ーム結合配列、上記DNAおよび転写終結配列より構成さ
れた組換えベクターであることが好ましい。プロモータ
ーを制御する遺伝子が含まれていてもよい。

【００３４】細菌用の発現ベクターとしては、例えば、
pBTrP2、pBTac1、pBTac2(いずれもべ一リンガーマンハ
イム社より市販)、pKK233-2(Pharmacia社製)、pSE280(I
nvitrogen社製)、pGEMEX-1(Promega社製)、pQE-8(QIAGE
N社製)、pQE-30(QIAGEN社製)、pKYP10(特開昭58-11060
0)、pKYP200〔Agrc.Biol.Chem., 48, 669(1984)〕、PLS
A1〔Agrc. Blo1. Chem., 53, 277(1989)〕、pGEL1〔Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBlues
crlptII SK+、pBluescriptII SK(-)(Stratagene社製)、
pTrS30(FERMBP-5407)、pTrS32(FERM BP-5408)、pGEX(Ph
armacia社製)、pET-3(Novagen社製)、pTerm2(US468619
1、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC
194、pUC18〔Gene, 33, 103(1985)〕、pUC19〔Gene, 3
3, 103(1985)〕、pSTV28(宝酒造社製)、pSTV29(宝酒造
社製)、pUC118(宝酒造社製)、pQE-30(QIAGEN社製)等が
挙げられる。細菌用のプロモーターとしては、例えば、
trpプロモーター(P trp)、lacプロモーター(P lac)、P_L
プロモーター、P_Rプロモーター、P_SEプロモーター等
の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SP01
プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーター等
を挙げることができる。

【００３５】酵母用の発現ベクターとして、例えば、YE
p13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、Ycp5O(ATCC3741
9)、pHS19、pHS15等を例示することができる。酵母用の
プロモーターとしては、例えば、PHO5プロモーター、PG
Kプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、g
al1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショック
タンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP1プ
ロモーター等のプロモーターを挙げることができる。

【００３６】動物細胞用の発現ベクターとして、例え
ば、pcDNAI、pcDM8(フナコシ社より市販)、pAGE107〔特
開平3-22979; Cytotechnology, 3, 133,(1990)〕、pAS3
-3(特開平2-227075)、pCDM8〔Nature, 329, 840,(198
7)〕、pcDNAI/AmP(Invitrogen社製)、pREP4(Invitrogen
社製)、pAGE103〔J.Blochem., 101, 1307(1987)〕、pAG
E210等を例示することができる。動物細胞用のプロモー
ターとしては、例えば、サイトメガロウイルス(ヒトCM
V)のIE(immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40
の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、
メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモ
ーター、SRαプロモーター等を挙げることができる。

【００３７】植物細胞用の発現ベクターとしては、例え
ば、pIG121-Hm〔Plant Cell Report, 15, 809-814(199
5)〕、pBI121〔EMBO J. 6, 3901-3907(1987)〕等を例示
することができる。植物細胞用のプロモーターとして
は、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロ
モーター〔Mol.Gen.Genet (1990) 220, 389-392〕、ル
ブロースビスフォスフェートカルボキシラーゼスモール
サブユニットプロモーター等を挙げることができる。

【００３８】（Ｄ）本発明の遺伝子を有する形質転換体本発明のタンパク質をコードする遺伝子を有する形質転
換体は、上記した組み換えベクター（好ましくは発現ベ
クター）を宿主に導入することにより作製することがで
きる。細菌の宿主細胞の具体例としては、Escherichia
属、Corynebacterium属、Brevibacterium属、Bacillus
属、Microbacterium属、Serratia属、Pseudomonas属、A
grobacterium属、Alicyclobacillus属、Anabaena属、An
acystis属、Arthrobacter属、Azobacter属、Chromatium
属、Erwinia属、Methylobacterium属、Phormidium属、R
hodobacter属、Rhodopseudomonas属、Rhodospiri11um
属、Scenedesmun属、Streptomyces属、Synnecoccus属、
Zymomonas属等に属する微生物をあげることができる。
細菌宿主へ組換えベクターを導入する方法としては、例
えば、カルシウムイオンを用いる方法やプロトプラスト
法等を挙げることができる。

【００３９】酵母宿主の具体例としては、サッカロミセ
ス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisae)、シゾサッ
カロミセス・ボンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ク
リュイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、
トリコスポロン・プルランス(Trichosporon pu11ulan
s)、シュワニオミセス・アルビウス(Schwanniomyces a1
1uvius)等を挙げることができる。酵母宿主への組み換
えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポ
レーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等
を挙げることができる。

【００４０】動物細胞宿主としては、ナマルバ細胞、CO
S1細胞、COS7細胞、CHO細胞等を挙げることができる。
動物細胞への組み換えベクターの導入方法としては、例
えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム
法、リポフェクション法等を用いることができる。

【００４１】昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組
換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫
細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルス
を得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染さ
せ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Ba
culovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua
1；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラ
ー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等に
記載）。

【００４２】バキュロウイルスとしては、例えば、ヨト
ウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・
カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイル
ス(Autographa californica nuclear polyhedrosis vir
us)等を用いることができる。昆虫細胞としては、Spodo
ptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１
〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクター
ズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイ
チ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman a
nd Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Tri
choplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビト
ロジェン社製)等を用いることができる。組換えウイル
スを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベ
クターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、
例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等
を挙げることができる。

【００４３】（Ｅ）本発明の形質転換体を用いた組み換
えタンパク質の製造本発明においては、上記のようにして作製した本発明の
遺伝子を有する形質転換体を培養し、培養物中に本発明
のタンパク質を生成蓄積させ、該培養物より本発明のタ
ンパク質を採取することにより組み換えタンパク質を単
離することができる。

【００４４】本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生
物、酵母菌等の真核生物である場合、これら微生物を培
養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、
無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行え
る培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
培養は好気的条件下で行うことが好ましく、培養温度は
通常15〜40℃であり、培養時間は、通常１６時間〜７日
間である。培養液のpHは、無機あるいは有機の酸、アル
カリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用
いて調整することができる。また培養中必要に応じて、
アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に
添加してもよい。

【００４５】動物細胞を宿主細胞として得られた形質転
換体を培養する培地としては、一般に使用されているRP
M11640培地、EagleのMEM培地、DMEM培地またはこれら培
地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養
は、通常pH6〜8、30〜40℃、5%C0₂存在下等の条件下で1
〜7日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシ
ン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

【００４６】植物細胞を宿主細胞として得られた形質転
換体を培養する培地としては、ＭＳ培地、Ｒ２Ｐ培地
等、その植物種に応じて通常用いられる培地が用いられ
る。培養は、通常ｐＨ６〜８、１５〜３５℃等の条件下
で１〜２１日間行う。また、培養中必要に応じて、カナ
マイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加
してもよい。

【００４７】形質転換体の培養物から、本発明のタンパ
ク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精
製法を用いればよい。例えば、本発明のタンパク質が、
細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細
胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波
破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイ
ザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液
を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得ら
れた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、
溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒に
よる沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース
等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー
法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用
いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファ
ロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水
性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、
アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォー
カシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を
単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることが
できる。

【００４８】（Ｆ）スフィンゴミエリン検出用試薬本発明は、上記した本発明のタンパク質を含む、スフィ
ンゴミエリン検出用試薬にも関する。本発明のタンパク
質は、スフィンゴミエリンを特異的に認識することがで
きるため、スフィンゴミエリン検出用試薬として有用で
ある。本発明のタンパク質をスフィンゴミエリン検出用
試薬として用いる場合、本発明のタンパク質はそのまま
単独に使用してもよいし、あるいは検出のための物質で
標識した標識タンパク質として使用してもよい。検出の
ための標識物質の種類は特に限定されないが、例えば、
親和性物質（例えば、マルトース結合タンパク質（Malt
ose-binding protein）、ビオチン、アビジン、ストレ
プトアビジンなど）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオ
キシダーゼ又はアルカリホスファターゼなど）蛍光物質
（Ｃｙ５、Ｃｙ３（以上アマシャム）、フルオレセイ
ン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、アクリ
ジンオレンジなど）、化学発光物質（例えば、ルミノー
ル、アクリジニウム−Ｉなど）、放射性物質などが挙げ
られる。

【００４９】（Ｇ）本発明のタンパク質を用いるスフィ
ンゴミエリンの検出方法本発明のタンパク質は、スフィンゴミエリンを特異的に
認識し、細胞毒性が低いことを特徴とするものである。
従って、本発明のタンパク質をプローブとして用いるこ
とによりスフィンゴミエリンを検出することが可能であ
る。スフィンゴミエリンの検出方法は特に限定されず、
ELISAなどのインビトロ法でも細胞染色などのインビボ
法でもよい。

【００５０】ELISAを行うためには、ELISAプレートをス
フィンゴミエリン含有試料でコートし、ウシ血清アルブ
ミン等でブロッキングした後、本発明のタンパク質をプ
レートに添加し、インキュベートする。プレートを洗浄
後、本発明のタンパク質を検出するための適当な試薬を
順次添加・反応させることにより、試料中のスフィンゴ
ミエリンを検出することができる。例えば、検出プロー
ブとして、MBP(Maltose-binding protein) 配列を有す
る本発明のタンパク質を用いる場合には、試料との反応
後に、抗MBPウサギ血清をインキュベートし、洗浄す
る。次いで、ビオチン標識した抗ウサギ抗体、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ(HRP)標識したストレプトアビジン
でインキュベートし、o‐phenylendiamine で発色し、4
92mmの吸光度を測定することにより、試料中のスフィン
ゴミエリンを検出することができる。

【００５１】細胞染色法を行うためには、例えば、カバ
ースリップ上に細胞を固定した後、ジギトニン処理で細
胞形質膜に穴をあけ、本発明のタンパク質と反応させ
る。反応後、本発明のタンパク質を検出するための適当
な試薬を順次添加・反応させることにより、細胞におけ
るスフィンゴミエリンを検出することができる。例え
ば、検出プローブとして、MBP(Maltose-binding protei
n) 配列を有する本発明のタンパク質を用いる場合に
は、細胞との反応後に、希釈した抗MBPウサギ血清(NE
B)、蛍光標識した抗ウサギ抗体でインキュベートし、封
入し、共焦点顕微鏡で細胞を観察することにより細胞に
おけるスフィンゴミエリンを検出することができる。

【００５２】（Ｈ）スフィンゴミエリン検出用キット本明細書中上記した、本発明のタンパク質、遺伝子、ベ
クター、形質転換体、又はスフィンゴミエリン検出用試
薬は、スフィンゴミエリン検出用キットの形態で提供す
ることも可能である。このようなスフィンゴミエリン検
出用キットには、上記したタンパク質、遺伝子、ベクタ
ー、形質転換体、又はスフィンゴミエリン検出用試薬に
加えて、所望により、必要な他の試薬を含めることがで
きる。このような他の試薬としては、例えば、反応に必
要な緩衝液、ブロッキング液、洗浄液、あるいは標識の
検出に必要な他の試薬などが挙げられる。当業者であれ
ばこのような試薬を適宜選択し、キットを構成すること
ができる。以下の実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明は実施例によって限定されることはな
い。

【００５３】

【実施例】実施例１：ミミズ毒素ライセニンのｃＤＮＡ
のクローニングミミズ毒素ライセニンのｃＤＮＡのクローニングは既に
報告されている（Sekizawa, Y., Kubo, T., Kobayashi,
H., Nakajima, T., and Natori, S.(1997). Molecular
cloning of cDNA for lysenin, a novel protein in t
he earthworm Eisenia foetida that causes contracti
on of rat vascular smooth muscle. Gene 191, 97-10
2）。また、ライセニン１及びライセニン３の塩基配列
は、データベースにも登録されている（Lysenin 1 : Ge
nBank85846；及びLysenin3 : GenBank85848）。ライセ
ニン１の塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１
に、ライセニン３の塩基配列とアミノ酸配列を配列表の
配列番号２にそれぞれ示す。

【００５４】実施例２：MBP-lysenin1-3の作成（１）pMBP-lysenin1, pMBP-lysenin3の作成 PCRで増幅した際、5'末端がBamHI, 3' 末端が HindIII
を持つような以下のプライマーをlysenin1,3 の両方に
ついて作成した。 lysenin1 forward; ttcggatccatgtcggctaaagcagca（配
列番号４） lysenin1 reverse; aagcttccgctttagttgcacctcatc（配
列番号５） lysenin3 forward; ttcggatccatgtcgtctagagcagga（配
列番号６） lysenin3 reverse; aagcttaaaacatgcggaagcaaatgt（配
列番号７）

【００５５】ライセニン１およびライセニン３の全長を
実施例１で採取されたcDNAを鋳型にしてPCRで増幅した
後、PCR-TOPOIIベクター(Invitrogen)にクローニングし
た後、全塩基配列を確認した。以上のプラスミドをBamH
IとHindIIIで処理し、ライセニンを含むフラグメントを
回収し、やはりBamHIとHindIIIで処理したpMAL-C2X(New
England Biolab) にライゲーションし、５'末端にMBP
(Maltose-binding protein) 配列を持つプラスミド、pM
BP-Lysnin1,及びpMBP-Lysenin3 を得た。

【００５６】（２）pMBP-lysenin1-3 の作成 pMBP-lysnin1には141bpに、pMBP-lysenin3 には147bp
にEcoRI サイトが存在する。また、pMAL-C2Xには、269
5bpの位置にEcoRIサイトがある（BamHI は2701bp,HindI
II は2727bpに位置する）。 pMBP-Lysnin1, pMBP-Lysen
in3を各々EcoRIで処理し、lysnin3の5' 端をlysenin1で
入れ替えた。EcoRIはlysnin1 では、47番目のバリン、4
8番目のアスパラギン、49番目のセリン、lysnin3では、
49番目のロイシン、50番目のアスパラギン、51番目のセ
リンに、相当する。従って、lysenin1-3 は、1番目のメ
チオニンから48番目のアスパラギンまではlysenin1を、
51番目のセリンから300番目のプロリンまではlysenin3
から得ているキメラとなる。

【００５７】実施例３：タンパク質の発現以上のプラスミドを大腸菌JM109に形質転換し、定法に
よりIPTG により蛋白発現誘導をかけ、菌を回収、ソニ
ケーションによる可溶化した。更にアミロースレジン(N
EB)により、アフィニティー精製したのち、銀染色・抗M
BP抗体によるウエスタン・ブロッテリングにより発現を
確認した。

【００５８】実施例４：ELISA(enzyme-linked immunoso
rbent assay; 固定酵素免疫検定法)による、本発明のタ
ンパク質とスフィンゴミエリンとの特異的反応の確認 96穴ELISAプレート(Immulon 1, Dynatech Laboratorie
s) を10μmのスフィンゴミエリン（SM）（コントロール
としてホスファチジルコリン）でコートした。3% ウシ
血清アルブミン(bovine serum albumin ; BSA) でブロ
ッキングした後、MBP-lysenin1, MBP- lysenin-3, MBP-
lysenin1-3を適量に希釈し、室温にて２時間プレート
をインキュベートした。プレートを３回洗浄した後、1:
1000に希釈した抗MBPウサギ血清(NEB)を２時間インキュ
ベートし、洗浄した。更にビオチン標識した抗ウサギ抗
体、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識したストレ
プトアビジンでインキュベートし、o‐phenylendiamine
で発色し、492mm(コントロールとして630nm)の吸光度
を測定した。得られた結果を図1の左のグラフ及び図３
に示す。これらの結果から、MBP- lysenin1-3は、MBP-l
ysenin1及び MBP- lysenin-3と同様にスフィンゴミエリ
ン（SM）に特異的に結合することが示された。

【００５９】実施例５：溶血 3 x 10⁷/mL のヒツジ赤血球に様々な濃度のMBP- lysen
in1, MBP- lysenin3MBP- lysenin1-3 を加えて、37℃
で30分反応させ、遠心して血球を沈殿させ、細胞破壊に
よって放出されたヘモグロビン量を405nmの吸光度とし
て測定した。細胞が全て破壊されたときの値を100%と
し、各々のポイントの値を算出した。得られた結果を図
１の右のグラフに示す。これらの結果から、MBP- lysen
in1及びMBP- lysenin-3は一定濃度以上において溶血活
性を示すのに対し、MBP- lysenin1-3は高濃度でも溶血
活性を示さないことが示された。

【００６０】実施例６：Niemann-Pick type A 線維芽細
胞を用いた細胞染色ガラス製カバースリップにＡ型 Niemann-Pick患者よ
り得られた線維芽細胞を数日培養した。パラホルム・ア
ルデヒドにて固定した後、ジギトニン処理で細胞形質膜
に穴をあけ、MBP- lysenin1, MBP- lysenin-3 MBP- lys
enin1-3 と反応させる。希釈した抗MBPウサギ血清(NE
B)、蛍光標識した抗ウサギ抗体、でインキュベートし、
封入、共焦点顕微鏡で観察する。得られた結果を図２に
示す。図２の結果から、本発明のMBP- lysenin1-3を用
いることによって線維芽細胞のスフィンゴミエリンをイ
ンビボでも検出できることが示された。

【００６１】

【発明の効果】本発明により、スフィンゴミエリン検出
プローブとして利用可能な、スフィンゴミエリンを特異
的に認識し、細胞毒性が低いタンパク質を提供すること
が可能になった。

【００６２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> RIKEN <120> A probe for detection of sphingomyelin <130> A11145MA <160> 7

【００６３】 <210> 1 <211> 894 <212> DNA <213> Eisenia foetida <400> 1 atg tcg gct aaa gca gca gag gga tat gaa cag ata gaa gta gat gtg 48 Met Ser Ala Lys Ala Ala Glu Gly Tyr Glu Gln Ile Glu Val Asp Val 1 5 10 15 gtg gca gta tgg Aaa gaa ggc tat gta tac gaa aat cgc gga agc acc 96 Val Ala Val Trp Lys Glu Gly Tyr Val Tyr Glu Asn Arg Gly Ser Thr 20 25 30 agt gtg gat cag aag atc aca ata aca aaa ggc atg aaa aat gtg aat 144 Ser Val Asp Gln Lys Ile Thr Ile Thr Lys Gly Met Lys Asn Val Asn 35 40 45 tca gaa aca agg aca gtg act gct acg cat agt att ggt tct act att 192 Ser Glu Thr Arg Thr Val Thr Ala Thr His Ser Ile Gly Ser Thr Ile 50 55 60 agc act gga gat gca ttc gaa att gga agc gtg gag gtt agc tac agc 240 Ser Thr Gly Asp Ala Phe Glu Ile Gly Ser Val Glu Val Ser Tyr Ser 65 70 75 80 cat tca cat gaa gaa tcc caa gtt agc atg acg gaa act gaa gtt tat 288 His Ser His Glu Glu Ser Gln Val Ser Met Thr Glu Thr Glu Val Tyr 85 90 95 gaa tca aag gtg atc gaa cac act ata acg att cca cct act tca aaa 336 Glu Ser Lys Val Ile Glu His Thr Ile Thr Ile Pro Pro Thr Ser Lys 100 105 110 ttc aca aga tgg caa ctg aat gct gac gtt ggt gga gcg gat att gaa 384 Phe Thr Arg Trp Gln Leu Asn Ala Asp Val Gly Gly Ala Asp Ile Glu 115 120 125 tac atg tat ttg att gat gaa gtc aca ccc ata gga ggg act cag agt 432 Tyr Met Tyr Leu Ile Asp Glu Val Thr Pro Ile Gly Gly Thr Gln Ser 130 135 140 att cca cag gtc atc aca agt cgg gct aaa att ata gtt ggc cga cag 480 Ile Pro Gln Val Ile Thr Ser Arg Ala Lys Ile Ile Val Gly Arg Gln 145 150 155 160 ata atc ctt gga aaa aca gaa att cga att aag cat gca gaa agg aag 528 Ile Ile Leu Gly Lys Thr Glu Ile Arg Ile Lys His Ala Glu Arg Lys 165 170 175 gag tac atg aca gtc gtt tca aga aaa agt tgg cca gct gca act ctt 576 Glu Tyr Met Thr Val Val Ser Arg Lys Ser Trp Pro Ala Ala Thr Leu 180 185 190 gga cat agc aaa ctt ttc aag ttt gtg ctc tat gaa gat tgg ggg gga 624 Gly His Ser Lys Leu Phe Lys Phe Val Leu Tyr Glu Asp Trp Gly Gly 195 200 205 ttt cga att aaa acg ctg aac acc atg tat tcg ggc tat gag tat gcc 672 Phe Arg Ile Lys Thr Leu Asn Thr Met Tyr Ser Gly Tyr Glu Tyr Ala 210 215 220 tat tcc tct gat caa gga gga atc tac ttt gat cag ggt act gat aat 720 Tyr Ser Ser Asp Gln Gly Gly Ile Tyr Phe Asp Gln Gly Thr Asp Asn 225 230 235 240 ccg aaa cag cgc tgg gca atc aat aag tca ttg cct ctt cgt cat ggt 768 Pro Lys Gln Arg Trp Ala Ile Asn Lys Ser Leu Pro Leu Arg His Gly 245 250 255 gac gta gtc acc ttc atg aat aag tac ttc act cgc agt ggg ctg tgc 816 Asp Val Val Thr Phe Met Asn Lys Tyr Phe Thr Arg Ser Gly Leu Cys 260 265 270 tac gat gat gga ccg gca aca aac gtg tac tgt ctg gac aaa cgt gaa 864 Tyr Asp Asp Gly Pro Ala Thr Asn Val Tyr Cys Leu Asp Lys Arg Glu 275 280 285 gac aag tgg att ttg gaa gtg gtt ggt taa 894 Asp Lys Trp Ile Leu Glu Val Val Gly 290 295

【００６４】 <210> 2 <211> 903 <212> DNA <213> Eisenia foetida <400> 2 atg tcg tct aga gca gga atc gca gag gga tat gaa cag ata gaa gta 48 Met Ser Ser Arg Ala Gly Ile Ala Glu Gly Tyr Glu Gln Ile Glu Val 1 5 10 15 gat gtg gtg gca gta tgg aaa gaa ggc tac gtt tac gaa aat cgg gga 96 Asp Val Val Ala Val Trp Lys Glu Gly Tyr Val Tyr Glu Asn Arg Gly 20 25 30 agc acc agt gtg gag cag aag atc aaa ata aca aaa ggc atg aga aat 144 Ser Thr Ser Val Glu Gln Lys Ile Lys Ile Thr Lys Gly Met Arg Asn 35 40 45 ttg aat tca gaa aca aag aca ttg acg gct tcg cat agt att ggt tct 192 Leu Asn Ser Glu Thr Lys Thr Leu Thr Ala Ser His Ser Ile Gly Ser 50 55 60 act att agc act gga gat cta ttt gaa ata gca acc gtg gat gtt agc 240 Thr Ile Ser Thr Gly Asp Leu Phe Glu Ile Ala Thr Val Asp Val Ser 65 70 75 80 tac agc tac tca cat gaa gaa tcc caa gtt agt atg acg gaa act gaa 288 Tyr Ser Tyr Ser His Glu Glu Ser Gln Val Ser Met Thr Glu Thr Glu 85 90 95 gtt tat gaa tca aag gaa atc gaa cac act ata acg att cca cct act 336 Val Tyr Glu Ser Lys Glu Ile Glu His Thr Ile Thr Ile Pro Pro Thr 100 105 110 tca aaa ttc aca aga tgg caa ctg aat gct gac gtt ggt gga gcg gat 384 Ser Lys Phe Thr Arg Trp Gln Leu Asn Ala Asp Val Gly Gly Ala Asp 115 120 125 att gaa tac atg tat ttg att gat gaa gtc aca ccc ata gga ggg act 432 Ile Glu Tyr Met Tyr Leu Ile Asp Glu Val Thr Pro Ile Gly Gly Thr 130 135 140 ctg agt att cca cag gtc atc aaa agt cgg gct aaa att cta gtt ggc 480 Leu Ser Ile Pro Gln Val Ile Lys Ser Arg Ala Lys Ile Leu Val Gly 145 150 155 160 cga gaa ata tac ctt gga gaa aca gaa att cga ata aag cat gcg gac 528 Arg Glu Ile Tyr Leu Gly Glu Thr Glu Ile Arg Ile Lys His Ala Asp 165 170 175 agg aaa gag tat atg aca gtc gtt tca aga aaa agc tgg cca gct gca 576 Arg Lys Glu Tyr Met Thr Val Val Ser Arg Lys Ser Trp Pro Ala Ala 180 185 190 act ctt gga cat agc aaa ctt tac aag ttt gtg ctc tat gaa gat atg 624 Thr Leu Gly His Ser Lys Leu Tyr Lys Phe Val Leu Tyr Glu Asp Met 195 200 205 tat gga ttt cga att aaa acg ctg aac acc atg tat Tcg ggc tat gag 672 Tyr Gly Phe Arg Ile Lys Thr Leu Asn Thr Mer Tyr Ser Gly Tyr Glu 210 215 220 tat gcc tat tcc tct gat caa gga gga atc tac ttt gat cag ggt agt 720 Tyr Ala Tyr Ser Ser Asp Gln Gly Gly Ile Tyr Phe Asp Gln Gly Ser 225 230 235 240 gat aat ccg aaa cag cgc tgg gca atc aat aag tca ttg cct ctt cgt 768 Asp Asn Pro Lys Gln Arg Trp Ala Ile Asn Lys Ser Leu Pro Leu Arg 245 250 255 cat ggt gac gta gtc acc ttc atg aat aag tac ttc act cgc agt ggt 816 His Gly Asp Val Val Thr Phe Mer Asn Lys Tyr Phe Thr Arg Ser Gly 260 265 270 ctg tgc tac tat gat gga ccg gca aca gac gtg tac tgt ttg gac aaa 864 Leu Cys Tyr Tyr Asp Gly Pro Ala Thr Asp Val Tyr Cys Leu Asp Lys 275 280 285 cgt gaa gac aag tgg att tta gaa gtg gtt aaa ccc taa 903 Arg Glu Asp Lys Trp Ile Leu Glu Val Val Lys Pro 290 295 300

【００６５】 <210> 3 <211> 894 <212> DNA <213> Eisenia foetida <400> 3 atg tcg gct aaa gca gca gag gga tat gaa cag ata gaa gta gat gtg 48 Met Ser Ala Lys Ala Ala Glu Gly Tyr Glu Gln Ile Glu Val Asp Val 1 5 10 15 gtg gca gta tgg Aaa gaa ggc tat gta tac gaa aat cgc gga agc acc 96 Val Ala Val Trp Lys Glu Gly Tyr Val Tyr Glu Asn Arg Gly Ser Thr 20 25 30 agt gtg gat cag aag atc aca ata aca aaa ggc atg aaa aat gtg aat 144 Ser Val Asp Gln Lys Ile Thr Ile Thr Lys Gly Met Lys Asn Val Asn 35 40 45 tca gaa aca aag aca ttg acg gct tcg cat agt att ggt tct act att 192 Ser Glu Thr Lys Thr Leu Thr Ala Ser His Ser Ile Gly Ser Thr Ile 50 55 60 agc act gga gat cta ttt gaa ata gca acc gtg gat gtt agc tac agc 240 Ser Thr Gly Asp Leu Phe Glu Ile Ala Thr Val Asp Val Ser Tyr Ser 65 70 75 80 tac tca cat gaa gaa tcc caa gtt agt atg acg gaa act gaa gtt tat 288 Tyr Ser His Glu Glu Ser Gln Val Ser Met Thr Glu Thr Glu Val Tyr 85 90 95 gaa tca aag gaa atc gaa cac act ata acg att cca cct act tca aaa 336 Glu Ser Lys Glu Ile Glu His Thr Ile Thr Ile Pro Pro Thr Ser Lys 100 105 110 ttc aca aga tgg caa ctg aat gct gac gtt ggt gga gcg gat att gaa 384 Phe Thr Arg Trp Gln Leu Asn Ala Asp Val Gly Gly Ala Asp Ile Glu 115 120 125 tac atg tat ttg att gat gaa gtc aca ccc ata gga ggg act ctg agt 432 Tyr Met Tyr Leu Ile Asp Glu Val Thr Pro Ile Gly Gly Thr Leu Ser 130 135 140 att cca cag gtc atc aaa agt cgg gct aaa att cta gtt ggc cga gaa 480 Ile Pro Gln Val Ile Lys Ser Arg Ala Lys Ile Leu Val Gly Arg Glu 145 150 155 160 ata tac ctt gga gaa aca gaa att cga ata aag cat gcg gac agg aaa 528 Ile Tyr Leu Gly Glu Thr Glu Ile Arg Ile Lys His Ala Asp Arg Lys 165 170 175 gag tat atg aca gtc gtt tca aga aaa agc tgg cca gct gca act ctt 576 Glu Tyr Met Thr Val Val Ser Arg Lys Ser Trp Pro Ala Ala Thr Leu 180 185 190 gga cat agc aaa ctt tac aag ttt gtg ctc tat gaa gat atg tat gga 624 Gly His Ser Lys Leu Tyr Lys Phe Val Leu Tyr Glu Asp Met Tyr Gly 195 200 205 ttt cga att aaa acg ctg aac acc atg tat Tcg ggc tat gag tat gcc 672 Phe Arg Ile Lys Thr Leu Asn Thr Met Tyr Ser Gly Tyr Glu Tyr Ala 210 215 220 tat tcc tct gat caa gga gga atc tac ttt gat cag ggt agt gat aat 720 Tyr Ser Ser Asp Gln Gly Gly Ile Tyr Phe Asp Gln Gly Ser Asp Asn 225 230 235 240 ccg aaa cag cgc tgg gca atc aat aag tca ttg cct ctt cgt cat ggt 768 Pro Lys Gln Arg Trp Ala Ile Asn Lys Ser Leu Pro Leu Arg His Gly 245 250 255 gac gta gtc acc ttc atg aat aag tac ttc act cgc agt ggt ctg tgc 816 Asp Val Val Thr Phe Met Asn Lys Tyr Phe Thr Arg Ser Gly Leu Cys 260 265 270 tac tat gat gga ccg gca aca gac gtg tac tgt ttg gac aaa cgt gaa 864 Tyr Tyr Asp Gly Pro Ala Thr Asp Val Tyr Cys Leu Asp Lys Arg Glu 275 280 285 gac aag tgg att tta gaa gtg gtt aaa ccc 894 Asp Lys Trp Ile Leu Glu Val Val Lys Pro 290 295

【００６６】 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 4 ttcggatcca tgtcggctaa agcagca 27

【００６７】 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 5 aagcttccgc tttagttgca cctcatc 27

【００６８】 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 6 ttcggatcca tgtcgtctag agcagga 27

【００６９】 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 7 aagcttaaaa catgcggaag caaatgt 27

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ELISAによる本発明のタンパク質とス
フィンゴミエリンとの反応性の確認実験の結果（左のグ
ラフ）、並びに本発明のタンパク質を用いた溶血実験の
結果（右のグラフ）を示す。

【図２】図２は、Niemann-Pick type A 線維芽細胞を用
いた細胞染色の結果の図を示す。

【図３】図３は、ELISAによる本発明のタンパク質とス
フィンゴミエリンとの特異性反応性の確認実験の結果を
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 5/10 5/00 Ａ (72)発明者長谷川顕子埼玉県和光市広沢２番１号理化学研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA01 GA11 4B065 AA90Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA46 4H045 AA10 AA30 BA41 CA50 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の何れかのアミノ酸配列を有するタ
ンパク質。（１）１番目から４８番目のアミノ酸配列としてライ
セニン１における１番目から４８番目のアミノ酸配列を
有し、４９番目から２９８番目のアミノ酸配列としてラ
イセニン３における５１番目から３００番目のアミノ酸
配列を有するアミノ酸配列；又は（２）上記（１）に記載のアミノ酸配列において1か
ら複数個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を有す
るアミノ酸配列であって、スフィンゴミエリンを特異的
に認識し、細胞毒性が低いアミノ酸配列：
【請求項２】下記の何れかのアミノ酸配列を有するタ
ンパク質。（１）配列番号３に記載のアミノ酸配列；又は（２）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１か
ら複数個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を有す
るアミノ酸配列であって、スフィンゴミエリンを特異的
に認識し、細胞毒性が低いアミノ酸配列：
【請求項３】請求項１又は２に記載のタンパク質をコ
ードする遺伝子。
【請求項４】下記の何れかの塩基配列を有する遺伝
子。（１）配列番号３に記載の塩基配列；又は（２）配列番号３に記載の塩基配列において1から複
数個の塩基の置換、欠失及び／又は付加を有する塩基配
列であって、スフィンゴミエリンを特異的に認識し、細
胞毒性が低いタンパク質をコードする塩基配列：
【請求項５】請求項３又は４に記載の遺伝子を有する
ベクター。
【請求項６】請求項５に記載のベクターを有する形質
転換体。
【請求項７】請求項１又は２に記載のタンパク質を含
む、スフィンゴミエリン検出用試薬。
【請求項８】請求項１又は２に記載のタンパク質を用
いて、スフィンゴミエリンを検出する方法。
【請求項９】請求項１又は２に記載のタンパク質、請
求項３又は４に記載の遺伝子、請求項５に記載のベクタ
ー、請求項６に記載の形質転換体、又は請求項７に記載
のスフィンゴミエリン検出用試薬を含む、スフィンゴミ
エリン検出用キット。