WO2011142465A1 - 新規なタンパク質およびその利用 - Google Patents

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WO2011142465A1
WO2011142465A1 PCT/JP2011/061104 JP2011061104W WO2011142465A1 WO 2011142465 A1 WO2011142465 A1 WO 2011142465A1 JP 2011061104 W JP2011061104 W JP 2011061104W WO 2011142465 A1 WO2011142465 A1 WO 2011142465A1
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protein
nni
cholesterol
polynucleotide
mixture
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PCT/JP2011/061104
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俊秀 小林
哲幸 小林
耕三 西堀
敦 倉橋
文啓 藤森
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独立行政法人理化学研究所
国立大学法人お茶の水女子大学
株式会社雪国まいたけ
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/375—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Basidiomycetes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
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    • A61P31/12—Antivirals
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    • C07K16/14—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from fungi, algea or lichens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2405/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving lipids
    • G01N2405/08—Sphingolipids

Definitions

  • the present invention relates to a novel protein having a specific binding activity to a mixture of sphingolipid and cholesterol and use thereof.
  • Lipid raft is a domain on a cell membrane having a diameter of several tens to 100 nm, mainly composed of sphingolipid and cholesterol. Lipid rafts are thought to be involved in various physiological reactions in the cell membrane, such as important reactions such as signal transduction across the membrane, infection by bacteria or viruses, and intracellular traffic.
  • Patent Document 1 which is incorporated herein by reference in its entirety includes a specific amino acid sequence of lysenin, which is a toxin protein secreted by the earthworm Have been described.
  • Patent Document 2 which is incorporated herein in its entirety by reference describes a protein in which the N-terminal and / or C-terminal of earthworm toxin lysenin 1 or earthworm toxin lysenin 3 is deleted.
  • Patent Document 3 which is incorporated herein by reference in its entirety, describes a method for detecting sphingomyelin in which lipids in a test sample are immobilized on a solid phase and lysenin bound to the solid phase is detected. ing.
  • Patent Document 4 which is incorporated herein by reference in its entirety as a substance that specifically recognizes cholesterol, describes polyethylene glycol cholesteryl ether, which is incorporated herein by reference in its entirety. 5 describes polyethylene glycol 2-aminoethylcholesteryl ether. In addition, these documents describe cholesterol detection reagents containing these substances.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a novel protein that makes it possible to specifically detect lipid rafts.
  • the present inventors have found a novel protein derived from maitake that specifically binds to a mixture of sphingolipid and cholesterol, and completed the present invention.
  • the protein according to the present invention is the following protein (A), (B) or (C).
  • A a protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • B a protein represented by an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and specific for a mixture of sphingolipid and cholesterol A protein having an excellent binding activity
  • C A protein represented by an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and having a specific binding activity to a mixture of sphingolipid and cholesterol.
  • the polynucleotide according to the present invention is characterized by encoding the above protein.
  • polynucleotide according to the present invention is preferably the following polynucleotide (A), (B), (C) or (D).
  • A a polynucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 2
  • B A polynucleotide represented by a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted, inserted or added in the base sequence of SEQ ID NO: 2, and specific for a mixture of sphingolipid and cholesterol
  • C a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and has a specific binding activity to a mixture of sphingolipid and cholesterol
  • D a polynucleotide represented by a nucleotide sequence having 70% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, which encodes a protein having a specific binding activity to a mixture of sphingo
  • the vector according to the present invention is characterized by containing the above-mentioned polynucleotide.
  • the transformant according to the present invention is characterized in that the polynucleotide is introduced.
  • the transformant according to the present invention is characterized in that the vector is introduced.
  • the antibody according to the present invention is characterized by binding to the protein.
  • the method for detecting a mixture of sphingolipid and cholesterol according to the present invention is characterized by using the above protein.
  • the lipid raft detection kit according to the present invention includes at least one selected from the group consisting of the protein, the polynucleotide, the vector, the transformant, and the antibody.
  • the protein according to the present invention is characterized by being a homologue of the protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the virus infection inhibitor according to the present invention is characterized by containing the above protein.
  • the protein according to the present invention has a specific binding activity to a mixture of sphingolipid and cholesterol, lipid rafts can be specifically detected.
  • . 3 is a graph showing the binding activity of GF-Nni to a mixture of lipid and cholesterol.
  • 2 is a graph showing the binding activity of GF-Nni to a mixture of sphingomyelin (S) and cholesterol (C). 2 is a graph showing the binding activity of GF-Nni to various sphingomyelin and cholesterol mixtures.
  • FIG. 2 is a graph showing the binding activity of GF-Nni to a mixture of sphingomyelin and various sterols. It is a thermal analysis result showing the binding activity of GF-Nni to various artificial membranes. It is a figure showing the microscope image which shows the coupling
  • the protein according to the present invention is the following (A) or (B).
  • protein is used interchangeably with “peptide” or “polypeptide”.
  • the protein according to the present invention is not limited to this as long as it is a polypeptide in which amino acids are peptide-bonded, and may be a complex polypeptide containing a structure other than a polypeptide.
  • structures other than the polypeptide include sugar chains and isoprenoid groups, but are not particularly limited.
  • the protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 has a specific binding activity for a mixture of sphingolipid and cholesterol, as shown in Examples described later. Therefore, the protein according to the present invention can specifically recognize the mixture.
  • the “mixture of sphingolipid and cholesterol” may be a mixture containing at least sphingolipid and cholesterol.
  • “Mixture” refers to a mixture of two or more, and is used interchangeably with “mixture”.
  • the “mixture” is a concept including a complex, and the mixture is preferably a complex of sphingolipid and cholesterol. More preferably, the mixture is a lipid raft or the same composition.
  • Examples of sphingolipids include sphingomyelin. Since the protein according to the present invention can specifically recognize a mixture of sphingolipid and cholesterol, it can specifically detect a mixture of sphingolipid and cholesterol, preferably lipid raft.
  • Having specific binding activity to a mixture of sphingolipid and cholesterol means having a binding activity to the mixture but not having a binding activity to each of the sphingolipid alone and cholesterol alone. “Having binding activity” means that the binding activity is higher than the binding activity to a substance other than the binding target. Further, “having no binding activity to each of sphingolipid alone and cholesterol alone” means that the binding activity is lower than the binding activity to a mixture of sphingolipid and cholesterol.
  • a method for examining the binding activity a method well known in the art can be used.
  • an ELISA method Kiniyokawa et al. Biochemistry 43, 9766 (2004), which is incorporated herein by reference in its entirety, can be used.
  • the protein according to the present invention has a specific binding activity to a mixture of sphingolipid and cholesterol, the mixture, preferably a lipid raft can be specifically recognized. Therefore, if the protein according to the present invention is used, it can be detected by a method such as visualization of lipid rafts.
  • the protein according to the present invention has binding activity regardless of whether the mixture of sphingolipid and cholesterol takes an ordered liquid phase or a disordered liquid phase, as shown in the examples described later. is there.
  • the protein according to the present invention is a known ostreolysin (Sepcic K, Berne S, Rebolj K, Batista U, Plemenitas A, Sentjurc, which is incorporated herein by reference in its entirety. M, Macek P. (2004) Ostreolysin, a pore-forming protein from the oyster mushroom, interacts specifically with membrane cholesterol-rich lipid domains. FEBS Lett. 575, 81-5.) Instead, it recognizes the structure and combines it. Therefore, the mixture can be recognized more specifically by using the protein according to the present invention.
  • mutant protein A protein thus substituted, deleted, inserted or added is also referred to as “mutant protein” or “mutant”.
  • the mutant protein may be a protein into which mutation has been artificially introduced, or may be a product obtained by isolating and purifying a naturally occurring mutant protein.
  • any base of a polynucleotide encoding a protein can be mutated.
  • a deletion mutant or an addition mutant can be prepared by designing a primer corresponding to an arbitrary site of a polynucleotide encoding a protein.
  • variant retains the specific function of the protein of interest, that is, the ability to have specific binding activity for a mixture of sphingolipid and cholesterol. Protein is intended.
  • the protein according to the present invention is represented by an amino acid sequence having 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and further preferably 95% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It may be.
  • the protein according to the present invention may be a fusion protein to which an additional polypeptide is added.
  • the additional polypeptide include a labeled polypeptide.
  • the labeled polypeptide refers to a polypeptide for labeling a protein by a known method such as epitope labeling or fluorescent labeling.
  • Examples of the labeled polypeptide include epitope-labeled peptides such as His, Myc, and Flag, and fluorescent proteins such as GFP.
  • Additional polypeptides may be added to the N-terminus or C-terminus of the protein according to the present invention. Further, the additional polypeptide is more preferably added to the N-terminus from the viewpoint of maintaining sufficient binding activity for the mixture.
  • the protein according to the present invention may be one in which an additional polypeptide has been removed after being recombinantly expressed and purified as such a fusion protein.
  • the protein according to the present invention may be isolated from a natural source, chemically synthesized, or a recombinant protein produced by a gene recombination technique.
  • a method for obtaining these proteins a method well known in the art can be used.
  • isolated protein is intended to be a protein that has been removed from its natural environment.
  • a protein in a recombinantly produced state in a host cell is considered isolated, as is a natural or recombinant protein that has been substantially purified by any suitable technique.
  • Recombinant protein refers to the product produced from the host by recombinant technology.
  • the protein according to the invention may be glycosylated or non-glycosylated.
  • the proteins according to the invention may also contain an initiating modified methionine residue in some cases as a result of a host-mediated process.
  • a recombinant production procedure for example, a method performed using a vector and cells described later may be used.
  • the protein according to the present invention may be in the form of a reagent for detecting lipid raft (reagent for detecting lipid raft) containing the protein. Since the protein according to the present invention can specifically recognize lipid rafts as described above, it is useful as a reagent for detecting lipid rafts.
  • the specific configuration of the lipid raft detection reagent is not particularly limited, and various additives, buffers, and the like may be added depending on the application and purpose.
  • the protein according to the present invention may be a protein homolog represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the homologue include a protein derived from Hypsizygus marmoreus (for example, SEQ ID NO: 13), a protein of Chlamydomonas reinhardtii (EDP07110), a protein of Hordeum vulgare (BAF03218), Camelliasacmins3 AC603, and Camelliassminsacmins3 AC60 (CAF) Protein (EER97936), Ze mays protein (ACG38107), Oryza sativa protein (EAY93540), and the like.
  • the protein homologue represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is represented by an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence of the homolog as described above. Protein is also included.
  • FIG. 11 is a diagram showing an alignment of amino acid sequences of the protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and its homologue. The abbreviations shown in FIG.
  • GF Grifola frontosa
  • HM Hypsizygus marmoreus
  • CR Chlamydomonas reinhardtii (EDP07110)
  • HV Hordeum vulgaris (BAF03C3Bs: BAF03C3S) Sorghum bicolor (EER97936)
  • ZM Zea Mays (ACG38107)
  • OS Oryza sativa (EAY93540).
  • the amino acid sequence masked in black shows a degree of coincidence of 50% or more
  • gray indicates a part where the degree of coincidence by similar amino acids is 50% or more.
  • the results are shown in the bottom row as consensus.
  • the upper case alphabet indicates 100% match.
  • polynucleotide The polynucleotide which concerns on this invention should just encode the protein which concerns on this invention mentioned above.
  • examples of the polynucleotide according to the present invention include the following polynucleotide (A), (B) or (C).
  • A a polynucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 2
  • B a polynucleotide represented by a base sequence in which 1 to 30 bases are substituted, deleted, inserted or added in the base sequence of SEQ ID NO: 2, and specific for a mixture of sphingolipid and cholesterol
  • C a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and has a specific binding activity to a mixture of sphingolipid and cholesterol
  • the polynucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 2 encodes the protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • nucleic acid sequence As used herein, the term “polynucleotide” is used interchangeably with “gene”, “DNA”, “RNA”, “nucleic acid” or “nucleic acid molecule”.
  • base sequence is used interchangeably with “nucleic acid sequence” or “nucleotide sequence” and refers to deoxyribonucleotides (abbreviated A, G, C, and T) or ribonucleic acid. Expressed as a sequence of nucleotides (abbreviated A, G, C and U).
  • polynucleotide according to the present invention can be easily designed by those skilled in the art from the amino acid sequence of the encoded protein.
  • “One or more bases are substituted, deleted, inserted or added” means that substitution, deletion, insertion or addition can be performed by a known mutant polynucleotide production method such as site-directed mutagenesis. Of 1 to 30, preferably 1 to 21, more preferably 1 to 15 and even more preferably 1 to 5 bases are substituted, deleted, inserted or added. Polynucleotides thus substituted, deleted, inserted or added are also referred to as “mutant polynucleotides” or “mutants”.
  • the mutant polynucleotide may be a polynucleotide into which a mutation is artificially introduced, or may be a product obtained by isolating and purifying a naturally occurring mutant polynucleotide.
  • any base of the polynucleotide can be mutated.
  • a deletion mutant or an addition mutant can be prepared by designing a primer corresponding to an arbitrary site of the polynucleotide.
  • the term “variant” retains the specific function of the protein of interest, that is, the ability to have a specific binding activity for a mixture of sphingolipid and cholesterol.
  • a polynucleotide encoding the selected protein is contemplated.
  • the polynucleotide according to the present invention is a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and is a mixture of sphingolipid and cholesterol. It may be a protein having specific binding activity.
  • Hybridization is described in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., which is incorporated herein by reference in its entirety. , Cold Spring Harbor Laboratory (1989).
  • the appropriate hybridization temperature varies depending on the base sequence and the length of the base sequence. For example, when a DNA fragment consisting of 18 bases encoding 6 amino acids is used as a probe, a temperature of 50 ° C. or lower is preferable.
  • stringent conditions refers to hybridization solutions (50% formamide, 5 ⁇ SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7). .6) Incubate overnight at 42 ° C. in 5 ⁇ Denhart solution, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g / ml denatured sheared salmon sperm DNA, then in 0.1 ⁇ SSC at about 65 ° C. It is intended to wash the filter with.
  • the polynucleotide according to the present invention is represented by a base sequence having the identity of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more with the base sequence of SEQ ID NO: 2. It may be a thing.
  • the polynucleotide according to the present invention includes not only double-stranded DNA but also single-stranded DNA and RNA such as sense strand and antisense strand constituting the same.
  • the antisense strand can be utilized as a probe or as an antisense agent.
  • the DNA includes, for example, cDNA and genomic DNA obtained by cloning, chemical synthesis techniques, or a combination thereof.
  • the polynucleotide according to the present invention may include sequences such as untranslated region (UTR) sequences and vector sequences (including expression vector sequences).
  • Examples of a method for obtaining the polynucleotide according to the present invention include a method for isolating and cloning a DNA fragment containing the polynucleotide according to the present invention by a known technique.
  • a probe that specifically hybridizes with a part of the base sequence of the polynucleotide in the present invention may be prepared, and a genomic DNA library, cDNA library, etc. may be screened.
  • Such a probe may be of any sequence and / or length as long as it specifically hybridizes to at least part of the base sequence of the polynucleotide of the present invention or its complementary sequence. Good.
  • examples of a method for obtaining the polynucleotide according to the present invention include a method using amplification means such as PCR.
  • amplification means such as PCR.
  • primers are prepared from 5 ′ and 3 ′ sequences (or their complementary sequences), and genomic DNA, cDNA, etc. are used as templates using these primers.
  • PCR PCR or the like and amplifying the DNA region sandwiched between both primers, a large amount of DNA fragments containing the polynucleotide according to the present invention can be obtained.
  • the polynucleotide according to the present invention is preferably obtained from basidiomycetes, and more preferably obtained from the genus Grifola.
  • the polynucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 2 can be obtained from the genomic DNA, cDNA, etc. of Grifola frontosa using the method described above.
  • the vector according to the present invention may be any vector as long as it contains the above-described polynucleotide, and may be, for example, an expression vector for expressing the protein according to the present invention.
  • the vector according to the present invention may be a vector used for in vitro translation or a vector used for recombinant expression.
  • Examples of the vector according to the present invention include a recombinant expression vector into which a polynucleotide cDNA encoding the protein according to the present invention has been inserted.
  • a method for producing a recombinant expression vector includes, but is not limited to, a method using a plasmid, phage, cosmid or the like. A known method can also be used as a method for producing the vector.
  • the specific type of vector is not particularly limited, and the type of vector that can be expressed in the host cell may be appropriately selected. That is, according to the type of host cell, the type of vector may be selected in order to reliably express the polynucleotide according to the present invention, and a vector incorporating the polynucleotide according to the present invention may be used as an expression vector.
  • the vector according to the present invention preferably contains a promoter sequence for expressing a protein encoded by a polynucleotide contained in the vector. The promoter sequence is preferably selected as appropriate according to the type of host cell.
  • the vector according to the present invention may be a vector in which the polynucleotide according to the present invention and an appropriately selected promoter sequence are incorporated into various plasmids.
  • the host cell is not particularly limited, and various conventionally known cells can be suitably used.
  • it may be a prokaryotic host or a eukaryotic host, and specifically, a bacterial cell such as Escherichia coli, a yeast cell such as Saccharomyces cerevisiae, or Schizosaccharomyces pombe. Higher plant cells, insect cells, mammalian cells and the like.
  • the method of introducing the vector into the host cell ie, the transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a liposome method, or a DEAE dextran method can be suitably used.
  • the transformant according to the present invention is a transformant into which the polynucleotide encoding the protein according to the present invention described above is introduced.
  • the “transformant” is a concept including not only cells, tissues or organs but also individual organisms.
  • the transformant according to the present invention is preferably one in which the polynucleotide according to the present invention is introduced into a host cell so that it can be expressed.
  • Examples of the method for producing the transformant according to the present invention include a method for introducing the above-described vector according to the present invention into a host cell.
  • the host cell those described above can be used.
  • the transformant according to the present invention can be cultured or grown according to a conventionally known method.
  • the protein according to the present invention can be produced in the transformant, so that the protein can be easily prepared in large quantities.
  • the antibody according to the present invention is an antibody obtained as a polyclonal antibody or a monoclonal antibody by a known method using the above-described protein according to the present invention or a partial peptide thereof as an antigen.
  • Known methods include, for example, the literature (Harlow et al., “Antibodies: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)), Iwasaki et al.,“ Monoclonal antibody hybridoma and ELISA, Kodansha (1991) ””. These documents are incorporated herein by reference in their entirety, and the antibodies thus produced are useful for the detection of the proteins of the invention.
  • the protein according to the present invention can be suitably used in a method for detecting a mixture of sphingolipid and cholesterol.
  • the method for detecting a mixture of sphingolipid and cholesterol according to the present invention uses the above-described protein according to the present invention.
  • a method for detecting the mixture in the test object a method having the following steps may be mentioned.
  • the mixture may be lipid raft. 1) A step of providing a protein according to the present invention to a test object; 2) detecting the presence or absence of specific binding with the protein according to the present invention; 3) A step of determining that a mixture of sphingolipid and cholesterol is present in the test object when there is specific binding.
  • a conventionally known method can be used.
  • a method for detecting the presence or absence of specific binding in the step 2) a method for detecting the protein remaining after removing the protein according to the present invention that did not specifically bind in the step 1).
  • the method for detecting a protein include conventionally known methods such as a method for visualizing a protein by adding a fluorescent protein or the like to cause color development or light emission, and a method for detecting the protein by an ELISA method. The visualized protein can be observed with a fluorescence microscope or the like.
  • the present invention is useful for studies on the dynamics and functions of lipid rafts.
  • the present invention can be used for detailed analysis and diagnosis of diseases involving lipid rafts.
  • diseases involving lipid rafts include dyslipidemia.
  • dyslipidemia include Niemann-Pick disease.
  • examining the localization of the protein according to the present invention it is possible to analyze the localization of lipid rafts in the above-mentioned diseased cells, diagnose whether or not the disease is the above-mentioned disease, and the like.
  • the protein according to the present invention can specifically bind to a mixture of sphingolipid and cholesterol, it can be suitably used in a method for purifying the mixture, preferably a method for purifying lipid rafts.
  • a method for purifying the mixture various conventionally known purification methods utilizing specific binding between substances can be applied.
  • the protein according to the present invention can specifically bind to lipid rafts, it can be suitably used as a medicine for various diseases involving lipid rafts.
  • One of the diseases related to lipid rafts is viral infection.
  • AIDS virus is known to be covered with lipid rafts.
  • the protein which concerns on this invention can inhibit the viral infection with respect to a cell, especially the infection by influenza virus. Therefore, the protein according to the present invention can be used as a medicine for suppressing viral infection.
  • the target virus capable of suppressing infection using the present invention is not limited to the above-described AIDS virus and influenza virus, but may be any virus targeting lipid rafts, such as hepatitis C virus. Etc.
  • viral infection can be treated by administering the protein according to the present invention to a subject.
  • the present invention also provides a method for treating a viral infection comprising administering to a subject a protein according to the present invention.
  • the protein according to the present invention can inhibit virus infection of cells as described above, it can be used as a virus infection inhibitor.
  • the virus infection inhibitor according to the present invention only needs to contain the protein according to the present invention. Examples of viruses include influenza viruses.
  • the protein according to the present invention has extremely low toxicity, it can be suitably used for the above-mentioned medicines and the like.
  • the lipid raft detection kit according to the present invention includes at least one selected from the group consisting of the above-described protein, polynucleotide, vector, transformant, and antibody.
  • kit includes at least one selected from the group consisting of the above-described protein, polynucleotide, vector, transformant, and antibody.
  • a kit for detecting lipid rafts includes at least one selected from the group consisting of the above-described protein, polynucleotide, vector, transformant, and antibody.
  • the kit according to the present invention can detect a mixture of sphingolipid and cholesterol, particularly a lipid raft, by using the protein by including the above-described protein.
  • the protein is preferably one to which a labeled polypeptide is added.
  • the polynucleotide, the vector and the transformant described above can be used for obtaining the protein described above.
  • the above-described antibody is useful for detecting the above-described protein.
  • the kit according to the present invention can be used for, for example, the above-described method for detecting a mixture of sphingolipid and cholesterol, and is therefore suitable for investigating the presence or absence of lipid rafts in a biological sample, localization, etc. Available.
  • the kit according to the present invention preferably further contains a substance having a specific binding activity to sphingomyelin.
  • the substance include lysenin, lysenin-derived protein, and the like.
  • lysenin and lysenin-derived proteins include Patent Documents 1 and 2 (for Patent Documents 1 and 2, the corresponding US Patent Application Publication Nos. 10/138634, 11 incorporated herein by reference in their entirety, respectively. / 2232394) can be suitably used. This makes it possible to compare the localization of sphingomyelin and cholesterol, for example, lipid rafts with the localization of sphingomyelin, so that the localization and dynamics of lipid rafts can be examined more accurately. become.
  • the kit according to the present invention includes a polynucleotide encoding lysenin or a lysenin-derived protein, a vector containing the polynucleotide, a transformant into which the polynucleotide or the vector is introduced, an antibody against lysenin or a lysenin-derived protein. Etc. may be further included.
  • the kit according to the present invention preferably further contains a substance having specific binding activity for cholesterol.
  • a substance having specific binding activity for cholesterol examples include polyethylene glycol cholesteryl ether, polyethylene glycol 2-aminoethyl cholesteryl ether, and the like.
  • the substance may be in the form of a cholesterol detection reagent.
  • the substance and a cholesterol detection reagent containing the substance include Patent Document 3 and Patent Application 4 (for Patent Application 4, the corresponding US Patent Application Publication No. 10/516072, which is incorporated herein by reference in its entirety. Can be suitably used. This makes it possible to compare the localization of sphingomyelin and cholesterol, for example, lipid rafts and cholesterol, so that the localization and dynamics of lipid rafts can be examined more accurately. Become.
  • the kit according to the present invention contains both the above-mentioned substance having specific binding activity to sphingomyelin and the substance having specific binding activity to cholesterol. This makes it possible to compare the mixture of sphingomyelin and cholesterol, for example, lipid raft localization, sphingomyelin localization, and cholesterol localization. It becomes possible to investigate in detail.
  • the labeled polypeptide is added to the protein which concerns on this invention.
  • the lipid raft detection kit according to the present invention preferably further includes at least one of a substance having specific binding activity for sphingomyelin and a substance having specific binding activity for cholesterol.
  • Example 1 Identification of novel proteins and genes
  • the present inventors identified a novel protein GF-Nni (SEQ ID NO: 1) that specifically binds to a mixture of sphingolipid and cholesterol from Maitake mushroom (Grifola frontosa).
  • sphingomyelin obtained from Avanti
  • cholesterol obtained from Sigma
  • the protein that binds to the liposomes was purified from the maitake protein crude juice, and the partial sequence of amino acids (MLYGVEIDEQYLRVMEEYKDKEVITQADMAKVALQRKNVYQDQAEKRQAELKAEYGVGT, XHLLRK , TTAYVEYVYSR).
  • the base sequence (SEQ ID NO: 2) of the gene encoding protein GF-Nni was identified. Specifically, tblastn analysis was performed using the Maitake cDNA database owned by Yukiguni Maitake based on the obtained partial sequence. As a result, a 373 bp DNA sequence was found in the registered sequence. Based on this sequence, two primers for RACE (5′-RACE-GF (SEQ ID NO: 3) and 3′-RACE-GF (SEQ ID NO: 4)) were designed, and SMARTer TM RACE cDNA Amplification Kit (Takara). The upstream sequence and downstream sequence of the gene encoding GF-Nni were determined by the RACE-PCR method using BIO INC.
  • the gene represented by the base sequence of SEQ ID NO: 2 was cloned from Maitake (Grifola frontosa). Specifically, a forward primer Nni-F (SEQ ID NO: 5) and reverse primer Nni-R (SEQ ID NO: 6) for cloning are designed from the determined GF-Nni sequence, and the full length gene of GF-Nni is obtained by PCR. Was cloned. The full length of GF-Nni was inserted into Invitrogen's pENTR / SD / D-TOPO vector.
  • the protein GF-Nni was expressed and purified by gene recombination technology. Specifically, the GF-Nni gene was introduced into the pET-28b vector, expressed in E. coli BL21 (DE3), and purified using a nickel column.
  • Example 2 Using the protein GF-Nni purified from Maitake, the binding to liposomes (artificial membranes) composed of various lipids and cholesterol (1: 1) was examined.
  • As the lipid of the artificial membrane sphingomyelin (SM), phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylserine (PS), phosphatidylinositol (PI), and phosphatidylglycerol (PG) were used. These lipids were purchased from Avanti. Cholesterol was purchased from Sigma.
  • GF-Nni and liposomes were mixed, and then separated by centrifugation into a supernatant (S) and a precipitate (P) containing liposomes.
  • S supernatant
  • P precipitate
  • the supernatant (S) and the precipitate (P) were each electrophoresed, and the protein was stained by a known method. Thereby, it was examined which fraction contained GF-Nni.
  • FIG. 1 shows the results of detection of GF-Nni by electrophoresis after mixing the protein GF-Nni and various liposomes in one example of the present invention and then separating into supernatant (S) and precipitate (P).
  • S supernatant
  • P precipitate
  • FIG. 1 As shown in FIG. 1, GF-Nni was detected in the precipitate fraction only when liposomes composed of sphingomyelin and cholesterol were used. From this result, it was suggested that the protein according to the present invention specifically binds to a mixture of sphingomyelin and cholesterol.
  • Example 3 The purified protein GF-Nni was then used to further examine the binding activity against a mixture of various lipids and cholesterol (1: 1).
  • galactosylceramide (GalCer) (obtained from Avanti), glucosylceramide (GlcCer) (obtained from Matreya), lactosylceramide (LacCer) (obtained from Avanti), sphingo Silphosphorylcholine (SPC) (obtained from BioMol), ganglioside (GM1) (obtained from Wako Pure Chemical Industries), and ceramide (Cer) (obtained from Avanti) were used.
  • FIG. 2 is a graph showing the binding activity of GF-Nni to a mixture of lipid and cholesterol. As shown in FIG. 2, GF-Nni showed a high binding activity only to a mixture of sphingomyelin and cholesterol. From this result, it was shown that the protein according to the present invention selectively binds to a mixture of sphingomyelin and cholesterol.
  • Example 4 Using the purified protein GF-Nni, the binding activity to mixtures having different ratios of sphingomyelin and cholesterol was examined by the above-described ELISA method.
  • FIG. 3 is a graph showing the binding activity of GF-Nni to a mixture of sphingomyelin (S) and cholesterol (C). As shown in FIG. 3, the binding activity of GF-Nni to the mixture of sphingomyelin and cholesterol was dependent on the ratio (S / C) of sphingomyelin and cholesterol contained in the mixture.
  • the protein according to the present invention specifically binds to a mixture of sphingomyelin and cholesterol. It was also suggested that the protein according to the present invention has a high binding activity to a mixture having at least a sphingomyelin / cholesterol ratio of 6/4 to 1/9.
  • Example 5 Using the protein GF-Nni expressed and purified in the same manner as in Example 1, the binding activity to various sphingomyelin and cholesterol (1: 1) mixtures was examined by the ELISA method described above.
  • Synthetic sphingomyelin (PalSM) (obtained from Avanti) having porcine brain-derived sphingomyelin (brainSM) (obtained from Avanti), egg yolk-derived sphingomyelin (EggSM) (obtained from Avanti), and palmitic acid (C16: 0) as sphingomyelin ),
  • Synthetic sphingomyelin (OleSM) with oleic acid (C18: 1) (obtained from Sigma)
  • synthetic sphingomyelin (SteSM) with stearic acid (C18: 0) (obtained from Matreya), carbon numbers 20, 22, Synthetic sphingomyelin (C20SM, C22SM, C24SM
  • FIG. 4 is a graph showing the binding activity of GF-Nni to various sphingomyelin and cholesterol mixtures. As shown in FIG. 4, GF-Nni showed high binding activity to both porcine brain-derived sphingomyelin and egg yolk-derived sphingomyelin. In addition, GF-Nni bound to sphingomyelin having a fatty acid having 18 or more carbon atoms, regardless of whether it has a saturated fatty acid or an unsaturated fatty acid.
  • the mixture of sphingomyelin and cholesterol takes an ordered liquid phase when the fatty acid of sphingomyelin is a saturated fatty acid, and takes a disordered liquid phase when it is an unsaturated fatty acid.
  • the ordered liquid phase refers to a state in which the alignment of fatty acid (hydrocarbon chain) of sphingomyelin is aligned
  • the disordered liquid phase refers to a state in which the alignment of the fatty acid is disturbed.
  • the protein according to the present invention has binding activity regardless of whether the mixture to be bound takes an ordered liquid phase or a disordered liquid phase. That is, it was shown that the protein according to the present invention recognizes and binds not the physical properties of the mixture but the structure.
  • the protein according to the present invention has binding activity to a mixture containing sphingomyelin having at least a long fatty acid having 7 or more carbon atoms, particularly a fatty acid having 18 or more carbon atoms. Moreover, it was shown that it can couple
  • Example 6 Using the protein GF-Nni expressed and purified in the same manner as in Example 1, the binding activity to a mixture of sphingomyelin and various sterols (1: 1) was examined by the ELISA method described above.
  • sterol cholesterol (cholesterol), ergosterol (ergosterol), lanosterol (lanosterol), coprostane, cholesteryl acetate (chol acetate), 5 ⁇ -chol (5a chol), 5 ⁇ -chol-3 ⁇ -one (5a-one) chol-3b-one), 5 ⁇ -chol-7-en-3b-ol (5a-chol-7-en-3b-ol), 5 ⁇ -chol-3 ⁇ -ol (5a-chol-3b-ol), and 5 ⁇ -chol-3a-ol (5b-chol-3a-ol) was used.
  • FIG. 5 is a graph showing the binding activity of GF-Nni to a mixture of sphingomyelin and various sterols. As shown in FIG. 5, GF-Nni was shown to distinguish the difference in sterol structure.
  • Example 7 For the protein GF-Nni expressed and purified in the same manner as in Example 1, a differential thermal analyzer (Ishitsuka R, Yamaji-Hasegawa A, Makino A, Hirabayashi Y, Kobayashi T. (incorporated in its entirety by reference) 2004) A lipid-specific toxin reveals heterogeneity of sphingomyelin-containing membranes. Biophys. J. 86, 296-307.) was used for thermal analysis to examine the binding activity to various artificial membranes.
  • Artificial membranes include sphingomyelin (obtained from Matreya) and cholesterol (obtained from Sigma) (SM / chol) (1: 1), DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine) Artificial membrane (obtained from Avanti) and cholesterol (DOPC / chol) (1: 1), and DPPC (obtained from Avanti) and artificial membrane of cholesterol (DPPC / chol) (1: 1) was used.
  • FIG. 6 shows the results of thermal analysis showing the binding activity of GF-Nni to various artificial membranes.
  • GF-Nni bound to SM / chol, but did not bind to DOPC / chol and DPPC / chol. Since GF-Nni did not bind to DPPC / chol taking an ordered liquid phase, it was shown that GF-Nni recognizes the structure rather than the physical properties of the binding target.
  • Example 8 The ability of the purified protein GF-Nni to bind to the cell surface was examined.
  • lysenin that recognizes sphingomyelin (lysenin) and the cholesterol-binding domain (D4) of ⁇ -toxin that recognizes cholesterol are similarly bound to the HeLa cells described above, and then a fluorescent antibody is used. These were visualized.
  • FIG. 7 is a view showing a microscopic image showing the binding of GF-Nni to the HeLa cell surface.
  • GF-Nni bound to the surface of untreated HeLa cells, but did not bind to cells treated with SMase and cells excluding cholesterol.
  • Example 9 The ability of GFP-labeled GF-Nni to bind to cells in the presence of various artificial membranes was examined.
  • a gene (SEQ ID NO: 8) encoding a protein GFP-GF-Nni (SEQ ID NO: 7) in which GFP is fused to the N terminus of GF-Nni was prepared, and GFP-labeled by this gene recombination technique.
  • GF-Nni was expressed and purified. Specifically, a gene encoding EGFP and a gene encoding GF-Nni were introduced into the pET-28b vector, and GFP-GF-Nni was expressed using Escherichia coli BL21 (DE3) into which this was introduced, Purified using a nickel column.
  • the ability of the purified protein to bind to the surface of HeLa cells is controlled under the condition that no artificial membrane coexists (control), in the presence of sphingomyelin / cholesterol (1: 1) artificial membrane (SM / Chol), and phosphatidylcholine / cholesterol (1 1) in the presence of an artificial membrane (PC / Chol).
  • FIG. 8 is a view showing a microscopic image showing the binding of GF-Nni to the HeLa cell surface.
  • GF-Nni bound to the HeLa cell surface under conditions where no artificial membrane was present. This binding was inhibited in the presence of SM / Chol but not in the presence of PC / Chol. This result supported that GF-Nni bound to the cell surface via a mixture of sphingomyelin and cholesterol.
  • Example 10 The localization of GF-Nni and lysenin in HeLa cells was examined. Specifically, after fixing the cells, the membrane is made permeable by freezing and thawing, adding GF-Nni and lysenin, and using the antibodies against the respective proteins, the intracellular sites of GF-Nni and lysenin are added. The presence was visualized.
  • FIG. 9 is a view showing a microscopic image showing the localization of GF-Nni and lysenin in HeLa cells. Specifically, FIG. 9 shows an image showing the localization of GF-Nni (GF-Nni), an image showing the localization of lysenin (Lysenin), and an image obtained by superimposing these (Lysenin + GF-Nni).
  • GF-Nni GF-Nni
  • Lysenin lysenin
  • the localization of a mixture (lipid raft) of sphingomyelin and cholesterol in cells can be easily detected.
  • the protein according to the present invention is used in combination with lysenin, the localization, dynamics, and the like of lipid rafts and sphingomyelin that does not form lipid rafts can be compared.
  • Example 11 The localization of GF-Nni and late endosomal marker BMP in HeLa cells was examined. Specifically, after fixing the cells, the membrane is made permeable by freeze-thawing, and GF-Nni and an antibody against BMP, which is an endosome-specific lipid, are added, and each is visualized by the fluorescent antibody method. The presence was examined by microscopic observation.
  • FIG. 10 is a diagram showing a microscopic image showing the localization of GF-Nni and BMP in HeLa cells. Specifically, FIG. 10 shows an image showing the localization of GF-Nni (GF-Nni), an image showing the localization of BMP (BMP), and an image obtained by superimposing these (BMP + GF-Nni). FIG. FIG. 10 reveals that the localization of the mixture of sphingomyelin and cholesterol to which GF-Nni binds and the late endosome are partially in agreement.
  • the localization of a mixture of sphingomyelin and cholesterol (lipid raft) in a cell can be compared with the localization of other intracellular organs. It is possible to predict the dynamics and function of rafts in cells.
  • the present invention is useful for examining the localization, dynamics, function, etc. of lipid rafts in cells.
  • Example 12 As an example of the present invention, a gene encoding the homologous protein HM-Nni of Hypzygus marmoreus having homology with the protein GF-Nni was found using the following method. That is, tblastn analysis was performed on the Bunashimeji cDNA database owned by Yukiguni Maitake based on the amino acid sequence of GF-Nni to obtain a DNA fragment 228 bp having 36% homology in amino acids.
  • Example 13 Using the protein GF-Nni expressed and purified in the same manner as in Example 1, the binding between GF-Nni and liposomes was examined in the same manner as in Example 2. As the liposome, sphingomyelin / phosphatidylcholine / cholesterol liposomes (1: 0: 1, 1: 0.2: 1, 1: 0.5: 1, 1: 1: 1) were used.
  • FIG. 12 shows the results of detecting GF-Nni by electrophoresis after mixing the protein GF-Nni and various liposomes in one example of the present invention and separating the mixture into a supernatant (S) and a precipitate (P).
  • S supernatant
  • P precipitate
  • Example 14 Using the protein GF-Nni expressed and purified by the same method as in Example 1, the binding activity to various sterol and sphingomyelin mixtures (1: 1) was examined by the ELISA method (solid phase method) described above.
  • sterol cholesterol (cholesterol), ergosterol (ergosterol), lanosterol (lanosterol), coprostane, cholesteryl acetate (chol acetate), 5 ⁇ -cholestane, 5 ⁇ -cholestane-3-one (5a -cholestan-3-one), lasosterol (lathosterol, same as 5a-chol-7-en-3b-ol described above), dihydrocholesterol (same as 5a-chol-3b-ol described above), epicopros Tanol (epicoprostanol, same as 5b-chol-3a-ol described above), 6-ketocholestanol, 7-dehydrocholesterol, 5 ⁇ -cholest-8 (14) -en-3 ⁇ -Ol-15-one (5a-cholest-8 (14) -en-3b-ol-15-one), campesterol, stigmasterol, ⁇ -cytos Terol (b-sitosterol), desmosterol, epicholesterol, stigmaste
  • FIG. 13 is a graph showing the binding activity of GF-Nni to mixtures of various sterols and sphingomyelin.
  • the vertical axis represents the relative value when the cholesterol value is 100. As shown in FIG. 13, it was found that the 3 ⁇ -hydroxyl group of sterol is important for the binding of GF-Nni.
  • Example 15 The binding site of GF-Nni on the cell surface was examined by immunoelectron microscopic analysis. Specifically, protein GF-Nni expressed and purified by the method shown in Example 1 was bound to the surface of fixed HeLa cells. Thereafter, after treatment with an anti-GF-Nni antibody, a colloidal gold-labeled anti-rabbit antibody was added and observed with an electronic microscope.
  • FIG. 14 is a view showing a microscopic image showing a binding site of GF-Nni on the HeLa cell surface. As shown in FIG. 14, GF-Nni formed a cluster on the cell membrane.
  • Example 16 The distribution of GF-Nni, lysenin, H-ras and K-ras in the cell membrane was examined with an ultrahigh resolution fluorescence microscope. Specifically, Dronpa and Alexa647-labeled GF-Nni, lysenin, H-ras and K-ras were prepared, the cell surface was labeled, and then observed with a PALM (photoactivation localization microscope).
  • PALM photoactivation localization microscope
  • FIG. 15 is a view showing a microscopic image showing the distribution of GF-Nni, lysenin, and H-ras in the cell membrane.
  • FIG. 16 is a diagram showing a microscopic image showing the distribution of GF-Nni, lysenin, and K-ras in the cell membrane.
  • the GF-Nni binding domain in the cell membrane exists in a part of the lysenin binding domain. Further, GF-Nni distributed in the outer layer of the cell membrane was in good agreement with H-ras in the inner layer of the cell membrane, but was not in agreement with K-ras. Conventionally, H-ras was expected to exist in lipid rafts. In this example, the distribution of H-ras coincided with the distribution of GF-Nni, indicating that H-ras is actually present behind the sphingomyelin / cholesterol domain.
  • Example 17 The binding activity of GF-Nni to intracellular organelles in HeLa cells was examined. Specifically, after fixing the cells, the membrane was made permeable by freeze-thawing, and double labeling with various organelle markers and GF-Nni was performed.
  • FIG. 17 is a diagram showing a microscopic image showing the binding activity of GF-Nni to intracellular organelles. As shown in FIG. 17, the localization of GF-Nni coincided only with BMP and did not coincide with EEA1 and GM130. From this result, it was shown that the late endosome is a place for accumulation of sphingomyelin / cholesterol because GF-Nni binds to the late endosome in HeLa cells.
  • Example 18 The binding site of GF-Nni in the cells was analyzed by immunoelectron microscopic analysis. Specifically, Hela cell sections were prepared, GF-Nni was bound, and then treated with anti-GF-Nni antibody and colloidal gold-labeled anti-rabbit antibody.
  • FIG. 18 is a view showing a microscopic image showing a binding site of GF-Nni in a cell. This result indicates that GF-Nni binds to a multilamellar structure characteristic of late endosomes.
  • Example 19 Niemann-Pick disease is a congenital dyslipidemia, and types A and C are known.
  • Type A is deficient in acid sphingomyelinase
  • type C is deficient in a Neimanpic C protein, a protein involved in the intracellular transport of cholesterol.
  • Type A cells accumulate sphingomyelin in the cell, and type C accumulates cholesterol. Both have been suggested to have abnormal lipid raft functions, but the distribution of lipid rafts themselves in the cell and on the cell surface was not known.
  • lipid distribution in the cell surface and cell surface of Niemann-Pick disease cells was examined using GF-Nni, lysenin and D4 which are lipid binding proteins.
  • FIG. 19 is a diagram showing a microscopic image showing lipid distribution in cells of Niemann-Pick disease cells.
  • both types A and C of Niemann-Pick disease significant accumulation of GF-Nni in the cells was shown compared to control cells. Therefore, by using GF-Nni, it was possible to show that lipid rafts were accumulated in cells of Niemann-Pick disease.
  • GF-Nni was visualized using an anti-GF-Nni antibody and an Alexa544-labeled anti-rabbit antibody.
  • lysenin and D4 were visualized using fluorescent antibodies.
  • FIG. 20 is a view showing a microscopic image showing lipid distribution on the cell surface of Niemann-Pick disease cells. It was found that lipid rafts (sphingomyelin / cholesterol complex) stained with GF-Nni existed in a cluster on the cell surface in Niemann-Pick disease type C.
  • Example 20 Lipid rafts are thought to play an important role in viral infections, including influenza viruses. Therefore, the effect of GF-Nni on influenza virus infection was examined.
  • FIG. 21 is a graph showing the effect of GF-Nni on influenza virus infection of cultured cells (MDCK).
  • FIG. 21 shows the results 24 hours after infection.
  • the vertical axis represents the percentage (%) of the control (MDCK without GF-Nni added) to the virus infection. As shown in FIG. 21, it was shown that when GF-Nni was added 1 hour before infection and when GF-Nni was added 4 hours after infection, viral infection was inhibited more than control. .
  • FIG. 22 is a graph showing the effect of GF-Nni on influenza virus infection of cultured cells (MDCK).
  • FIG. 22 shows the results 8 hours after infection.
  • the vertical axis represents the percentage (%) of the control (MDCK without GF-Nni added) to the virus infection.
  • GF-Nni can be suitably used for the purpose of inhibiting viral infection of cells, for example, a virus infection inhibitor.
  • the present invention can specifically detect lipid rafts, it can be suitably used for research reagents and kits related to lipid rafts, and also suitable for drugs for diseases involving lipid rafts, viral infection inhibitors, and the like. Available.

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Abstract

　下記（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のタンパク質：（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列によって示される、タンパク質；（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されているアミノ酸配列によって示されるタンパク質であって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有する、タンパク質；（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列によって示される、タンパク質。

Description

新規なタンパク質およびその利用
　本発明は、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有する新規なタンパク質およびその利用に関する。
　脂質ラフト（lipid raft）は、主にスフィンゴ脂質とコレステロールとにより構成される、直径数十ｎｍ～１００ｎｍの細胞膜上のドメインである。脂質ラフトは、細胞膜における様々な生理的反応、例えば膜を介した情報伝達、細菌またはウイルスによる感染、細胞内トラフィックなどの重要な反応に関与していると考えられている。
　スフィンゴ脂質の１つであるスフィンゴミエリンを特異的に認識するタンパク質として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる特許文献１には、シマミミズが分泌する毒素タンパク質であるライセニン類の特定のアミノ酸配列を有するタンパク質が記載されている。また、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる特許文献２には、ミミズ毒素ライセニン１またはミミズ毒素ライセニン３のＮ末端および／またはＣ末端を欠失させたタンパク質が記載されている。
　また、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる特許文献３には、被験試料中の脂質を固相に固定化し、この固相に結合したライセニンを検出する、スフィンゴミエリンの検出方法が記載されている。
　コレステロールを特異的に認識する物質として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる特許文献４には、ポリエチレングリコールコレステリルエーテルが記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる特許文献５には、ポリエチレングリコール２－アミノエチルコレステリルエーテルが記載されている。また、これらの文献には、これらの物質を含むコレステロール検出試薬が記載されている。
日本国公開特許公報「特開２００２－３５５０３５号公報（２００２年１２月１０日公開）」 日本国公開特許公報「特開２００３－０６１６８０号公報（２００３年３月４日公開）」 日本国公開特許公報「特開２００６－２１４７３１号公報（２００６年８月１７日公開）」 日本国公開特許公報「特開２００３－３４４４１９号公報（２００３年１２月３日公開）」 日本国公開特許公報「特開２００４－３５４２８４号公報（２００４年１２月１６日公開）」
　しかしながら、上述した従来技術では、脂質ラフトを構成していないスフィンゴミエリン単独またはコレステロール単独の状態のものを検出してしまうため、脂質ラフトを特異的に検出することができないという問題がある。
　脂質ラフトの分布、動態、機能等を調べることは、脂質ラフトが関わる反応機構の解明のために必要であり、そのためには脂質ラフトを特異的に検出する技術が望まれている。
　本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、脂質ラフトを特異的に検出することを可能にする、新規なタンパク質を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に特異的に結合するマイタケ由来の新規のタンパク質を見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明に係るタンパク質は、下記（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のタンパク質である。
　（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列によって示される、タンパク質；
　（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されているアミノ酸配列によって示されるタンパク質であって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有する、タンパク質；
　（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列によって示されるタンパク質であって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有する、タンパク質。
　また、本発明に係るポリヌクレオチドは、上記タンパク質をコードすることを特徴とする。
　また、本発明に係るポリヌクレオチドは、下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）または（Ｄ）のポリヌクレオチドであることが好ましい。
　（Ａ）配列番号２の塩基配列によって示される、ポリヌクレオチド；
　（Ｂ）配列番号２の塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加されている塩基配列によって示されるポリヌクレオチドであって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
　（Ｃ）配列番号２の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
　（Ｄ）配列番号２の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列によって示されるポリヌクレオチドであって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
　また、本発明に係るベクターは、上記ポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
　また、本発明に係る形質転換体は、上記ポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする。
　また、本発明に係る形質転換体は、上記ベクターが導入されていることを特徴とする。
　また、本発明に係る抗体は、上記タンパク質と結合することを特徴とする。
　また、本発明に係るスフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体を検出する方法は、上記タンパク質を用いることを特徴とする。
　また、本発明に係る脂質ラフト検出用キットは、上記タンパク質、上記ポリヌクレオチド、上記ベクター、上記形質転換体、および上記抗体からなる群より選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする。
　また、本発明に係るタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列によって示されるタンパク質のホモログであることを特徴とする。
　本発明に係るウイルス感染阻害剤は、上記タンパク質を含むことを特徴とする。
　本発明に係るタンパク質は、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するので、脂質ラフトを特異的に検出することができる。
　本発明の他の目的、特徴、及び優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
本発明の一実施例におけるタンパク質ＧＦ－Ｎｎｉと種々のリポソームとを混合した後に上清（Ｓ）と沈殿（Ｐ）とに分離し、電気泳動によりＧＦ－Ｎｎｉを検出した結果を示す図である。 脂質とコレステロールとの混合物に対するＧＦ－Ｎｎｉの結合活性を示すグラフである。 スフィンゴミエリン（Ｓ）とコレステロール（Ｃ）との混合物に対するＧＦ－Ｎｎｉの結合活性を示すグラフである。 種々のスフィンゴミエリンとコレステロールとの混合物に対するＧＦ－Ｎｎｉの結合活性を示すグラフである。 スフィンゴミエリンと種々のステロールとの混合物に対するＧＦ－Ｎｎｉの結合活性を示すグラフである。 種々の人工膜に対するＧＦ－Ｎｎｉの結合活性を示す熱分析結果である。 ＨｅＬａ細胞表面へのＧＦ－Ｎｎｉの結合を示す顕微鏡画像を表す図である。 ＨｅＬａ細胞表面へのＧＦ－Ｎｎｉの結合を示す顕微鏡画像を表す図である。 ＨｅＬａ細胞内におけるＧＦ－Ｎｎｉおよびライセニンの局在を示す顕微鏡画像を表す図である。 ＨｅＬａ細胞におけるＧＦ－ＮｎｉおよびＢＭＰの局在を示す顕微鏡画像を表す図である。 配列番号１のアミノ酸配列によって示されるタンパク質と、そのホモログとのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。 本発明の一実施例におけるタンパク質ＧＦ－Ｎｎｉと種々のリポソームとを混合した後に上清（Ｓ）と沈殿（Ｐ）とに分離し、電気泳動によりＧＦ－Ｎｎｉを検出した結果を示す図である。 種々のステロールとスフィンゴミエリンとの混合物に対するＧＦ－Ｎｎｉの結合活性を示すグラフである。 ＨｅＬａ細胞表面へのＧＦ－Ｎｎｉの結合部位を示す顕微鏡画像を表す図である。 細胞膜中におけるＧＦ－Ｎｎｉ、ライセニン、及びＨ－ｒａｓの分布を示す顕微鏡画像を表す図である。 細胞膜中におけるＧＦ－Ｎｎｉ、ライセニン、及びＫ－ｒａｓの分布を示す顕微鏡画像を表す図である。 細胞内オルガネラへのＧＦ－Ｎｎｉの結合活性を示す顕微鏡画像を表す図である。 細胞内におけるＧＦ－Ｎｎｉの結合部位を示す顕微鏡画像を表す図である。 ニーマンピック病の細胞の細胞内における脂質分布を示す顕微鏡画像を表す図である。 ニーマンピック病細胞の細胞表面における脂質分布を示す顕微鏡画像を表す図である。 培養細胞（ＭＤＣＫ）へのインフルエンザウイルス感染に対するＧＦ－Ｎｎｉの効果を示すグラフである。 培養細胞（ＭＤＣＫ）へのインフルエンザウイルス感染に対するＧＦ－Ｎｎｉの効果を示すグラフである。
　以下、本発明の実施形態について、詳細に説明する。
　〔タンパク質〕
　本発明に係るタンパク質は、下記（Ａ）または（Ｂ）である。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列によって示されるタンパク質；
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されているアミノ酸配列によって示されるタンパク質であって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するタンパク質。
　本明細書中において使用される場合、用語「タンパク質」は、「ペプチド」または「ポリペプチド」と交換可能に使用される。本発明に係るタンパク質は、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖、イソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
　配列番号１のアミノ酸配列によって示されるタンパク質は、後述する実施例にて示すように、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有する。したがって、本発明に係るタンパク質は、当該混合体を特異的に認識することができる。
　本明細書中において、「スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体」は、少なくともスフィンゴ脂質とコレステロールとを含む混合体であればよい。「混合体」とは、２つ以上のものが混ざりあっているものをさし、「混合物」と交換可能に使用される。また、「混合体」とは、複合体を含む概念であり、当該混合体は、好ましくはスフィンゴ脂質とコレステロールとの複合体である。当該混合体は、脂質ラフトまたはこれと同じ構成のものであることがより好ましい。スフィンゴ脂質としては、スフィンゴミエリン等が挙げられる。本発明に係るタンパク質は、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体を特異的に認識することができるため、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体、好ましくは脂質ラフトを特異的に検出することができる。
　「スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有する」とは、当該混合体に対する結合活性を有するが、スフィンゴ脂質単独およびコレステロール単独のそれぞれに対する結合活性を有しないことをいう。「結合活性を有する」とは、当該結合活性が、その結合対象以外の物質に対する結合活性よりも高いことを意味する。また、「スフィンゴ脂質単独およびコレステロール単独のそれぞれに対する結合活性を有しない」とは、当該結合活性が、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する結合活性よりも低いことを意味する。
　結合活性を調べる方法としては、当該分野において周知の方法を用いて行なうことができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＫｉｙｏｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　４３，９７６６（２００４））等を用いることができる。
　本発明に係るタンパク質は、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するので、当該混合体、好ましくは脂質ラフトを特異的に認識することができる。したがって、本発明に係るタンパク質を用いれば、脂質ラフトを可視化するなどの方法によって検出することが可能になる。
　また、本発明に係るタンパク質は、後述する実施例にて示すように、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体が秩序液体相をとるか無秩序液体相をとるかにかかわらず、結合活性を有するものである。すなわち、本発明に係るタンパク質は、これまでに知られているオストレオリシン（ostreolysin）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるSepcic K, Berne S, Rebolj K, Batista U, Plemenitas A, Sentjurc M, Macek P. (2004) Ostreolysin, a pore-forming protein from the oyster mushroom, interacts specifically with membrane cholesterol-rich lipid domains. FEBS Lett. 575, 81-5.）等とは異なり、混合体の物性ではなく構造を認識して結合するものである。よって、本発明に係るタンパク質を用いることによって、より特異的に混合体を認識することが可能になる。
　上記「１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されている」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入もしくは付加できる程度の数（１～１０個、好ましくは１～７個、より好ましくは１～５個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されていることを意味する。このように置換、欠失、挿入もしくは付加されているタンパク質を、「変異タンパク質」または「変異体」とも称する。変異タンパク質は、人為的に変異が導入されたタンパク質であってもよいし、天然に存在する変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
　当業者は、周知技術を使用して、タンパク質を構成するアミノ酸残基のうちの１～１０個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。
　本明細書中においてタンパク質に関して用いられる場合、用語「変異体」とは、目的のタンパク質が有する特定の機能、すなわちスフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するという機能を保持したタンパク質が意図される。
　なお、タンパク質を構成するアミノ酸残基のうちのいくつかのアミノ酸が、このタンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
　また、本発明に係るタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列によって示されるものであってもよい。
　また、本発明に係るタンパク質は、付加的なポリペプチドが付加された融合タンパク質であってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば標識ポリペプチド等が挙げられる。標識ポリペプチドとは、タンパク質を、エピトープ標識、蛍光標識などの公知の方法によって標識するためのポリペプチドをさす。標識ポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ペプチド、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質などが挙げられる。付加的なポリペプチドは、本発明に係るタンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加されてもよい。また、付加的なポリペプチドは、混合体に対する十分な結合活性を保持する観点から、Ｎ末端に付加されることがより好ましい。また、本発明に係るタンパク質は、このような融合タンパク質として組み換え発現されて精製された後に、付加的なポリペプチドが除去されたものであってもよい。
　本発明に係るタンパク質は、天然供給源より単離されたものでもよいし、化学合成されたものでもよいし、遺伝子組み換え技術により作製された組み換えタンパク質であってもよい。これらのタンパク質を得る方法としては、当該分野において周知の方法を使用して行なうことができる。
　用語「単離された」タンパク質とは、その天然の環境から取り出されたタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中において組み換え産生された状態のタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組み換えのタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
　組み換えタンパク質とは、宿主から組み換え技術によって産生された産物をさす。組み換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るタンパク質は、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。本発明に係るタンパク質はまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。また、組み換え産生手順として、例えば、後述するベクターおよび細胞を用いて行なう方法を用いてもよい。
　本発明に係るタンパク質は、当該タンパク質を含む、脂質ラフトを検出するための試薬（脂質ラフト検出用試薬）の形態であってもよい。本発明に係るタンパク質は、上述したように脂質ラフトを特異的に認識できるものであるため、脂質ラフト検出用試薬として有用である。脂質ラフト検出用試薬の具体的な構成は特に限定されるものではなく、用途および目的に応じて、種々の添加剤、緩衝液などを加えればよい。
　本発明に係るタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列によって示されるタンパク質のホモログであってもよい。当該ホモログとしては、例えば、ブナシメジ（Ｈｙｐｓｉｚｙｇｕｓ　ｍａｒｍｏｒｅｕｓ）由来のタンパク質（例えば、配列番号１３），Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのタンパク質（ＥＤＰ０７１１０），Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅのタンパク質（ＢＡＦ０３２１８），Ｃａｍｅｌｌｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓのタンパク質（ＡＣＶ６０３５６），Ｓｏｒｇｈｕｍ　ｂｉｃｏｌｏｒのタンパク質（ＥＥＲ９７９３６），Ｚｅａ　ｍａｙｓのタンパク質（ＡＣＧ３８１０７），Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａのタンパク質（ＥＡＹ９３５４０）などが挙げられる。
　また、配列番号１のアミノ酸配列によって示されるタンパク質のホモログには、上述したようなホモログのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されているアミノ酸配列によって示されるタンパク質もまた含まれる。
　配列番号１のアミノ酸配列によって示されるタンパク質と、そのホモログとのアミノ酸配列を、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてアライメントし、ＢｏｘＳｈａｄｅを用いて配列整形した。図１１は、配列番号１のアミノ酸配列によって示されるタンパク質と、そのホモログとのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。なお、図１１に示す略は、以下を意味する：ＧＦ：Ｇｒｉｆｏｌａ　ｆｒｏｎｄｏｓａ，ＨＭ：Ｈｙｐｓｉｚｙｇｕｓ　ｍａｒｍｏｒｅｕｓ，ＣＲ：Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ（ＥＤＰ０７１１０），ＨＶ：Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ（ＢＡＦ０３２１８），ＣＳ：Ｃａｍｅｌｌｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ（ＡＣＶ６０３５６），ＳＢ：Ｓｏｒｇｈｕｍ　ｂｉｃｏｌｏｒ（ＥＥＲ９７９３６），ＺＭ：Ｚｅａ　ｍａｙｓ（ＡＣＧ３８１０７），ＯＳ：Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ（ＥＡＹ９３５４０）。
　図１１において、黒色でマスクされるアミノ酸配列は５０％以上の一致度を示し、灰色は類似アミノ酸による一致度が５０％以上の部分を示す。それらの結果はコンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）として下段に示される。大文字のアルファベットは１００％マッチを示す。
　〔ポリヌクレオチド〕
　本発明に係るポリヌクレオチドは、上述した本発明に係るタンパク質をコードするものであればよい。本発明に係るポリヌクレオチドとしては、例えば、下記（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のポリヌクレオチドが挙げられる。
（Ａ）配列番号２の塩基配列によって示される、ポリヌクレオチド；
（Ｂ）配列番号２の塩基配列において、１～３０個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加されている塩基配列によって示されるポリヌクレオチドであって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｃ）配列番号２の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
　配列番号２の塩基配列によって示されるポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列によって示されるタンパク質をコードするものである。
　本明細書中において使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用される。本明細書中において使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）又はリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＵと省略される）の配列として表記される。
　本発明に係るポリヌクレオチドとしては、コードするタンパク質のアミノ酸配列から、当業者であれば容易に設計することができる。
　「１若しくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加されている」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリヌクレオチド作製法により置換、欠失、挿入もしくは付加できる程度の数（１～３０個、好ましくは１～２１個、より好ましくは１～１５個、さらに好ましくは１～５個）の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加されていることを意味する。このように置換、欠失、挿入もしくは付加されているポリヌクレオチドを、「変異ポリヌクレオチド」または「変異体」とも称する。変異ポリヌクレオチドは、人為的に変異が導入されたポリヌクレオチドであってもよいし、天然に存在する変異ポリヌクレオチドを単離精製したものであってもよい。
　当業者は、周知技術を使用して、ポリヌクレオチドを構成する塩基のうちの１～３０個の塩基を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。
　本明細書中においてポリヌクレオチドに関して用いられる場合、用語「変異体」とは、目的のタンパク質が有する特定の機能、すなわちスフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するという機能を保持したタンパク質をコードするポリヌクレオチドが意図される。
　本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するタンパク質であってもよい。
　ハイブリダイゼーションは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｄ　Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
　本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。
　また、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列によって示されるものであってもよい。
　本発明にかかるポリヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。アンチセンス鎖は、プローブとしてまたはアンチセンス薬剤として利用できる。またＤＮＡには例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡなどが含まれる。さらに、本発明に係るポリヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列、ベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
　本発明に係るポリヌクレオチドを取得する方法としては、公知の技術により、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー等をスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものを用いてもよい。
　あるいは、本発明に係るポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ等を鋳型にしてＰＣＲ等を行ない、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
　また、本発明に係るポリヌクレオチドは、担子菌類から得られたものであることが好ましく、グリフォラ（Ｇｒｉｆｏｌａ）属から得られたものであることがより好ましい。例えば、配列番号２の塩基配列によって示されるポリヌクレオチドは、グリフォラ・フロンドーサ（Ｇｒｉｆｏｌａ　ｆｒｏｎｄｏｓａ）のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ等から、上述した方法を用いて取得することができる。
　〔ベクター〕
　本発明に係るベクターは、上述したポリヌクレオチドを含むものであればよく、例えば本発明に係るタンパク質を発現させるための発現ベクター等であってもよい。本発明に係るベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。
　本発明に係るベクターは、例えば、本発明に係るタンパク質をコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。また、ベクターの作製方法についても公知の方法を用いることができる。
　ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターの種類を適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるためにベクターの種類を選択し、これに本発明に係るポリヌクレオチドを組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。また、本発明に係るベクターは、ベクターに含まれるポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させるためのプロモーター配列を含んでいることが好ましい。プロモーター配列は、宿主細胞の種類に応じて適宜選択することが好ましい。このように、本発明に係るベクターは、本発明に係るポリヌクレオチドと、適宜選択したプロモーター配列とを各種プラスミド等に組み込んだベクターであってもよい。
　宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。例えば、原核生物宿主であっても真核生物宿主であってもよく、具体的には大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等の細菌細胞、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）等の酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞などが挙げられる。
　ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法は特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
　〔形質転換体〕
　本発明に係る形質転換体は、上述した本発明に係るタンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体である。ここで「形質転換体」とは、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含む概念である。
　本発明に係る形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチドが、宿主細胞内に発現可能に導入されたものであることが好ましい。
　本発明に係る形質転換体を作製する方法としては、例えば上述した本発明に係るベクターを宿主細胞に導入する方法等を挙げることができる。宿主細胞としては、上述したものを用いることができる。また、本発明に係る形質転換体は、従来公知の方法に従って培養または生育させることができる。
　本発明に係る形質転換体を用いれば、当該形質転換体内において本発明に係るタンパク質を生産することができるため、当該タンパク質を容易に大量調製することが可能となる。
　〔抗体〕
　本発明に係る抗体は、上述した本発明に係るタンパク質、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる抗体である。公知の方法としては、例えば、文献（Harlowらの「Antibodies : A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1988))、岩崎らの「単クローン抗体 ハイブリドーマとELISA,講談社(1991)」」に記載の方法が挙げられる。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。こうして作製した抗体は、本発明のタンパク質の検出に有効である。
　〔本発明に係るタンパク質の利用方法〕
　本発明に係るタンパク質は、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体を検出する方法に好適に利用することができる。
　本発明に係るスフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体を検出する方法は、上述した本発明に係るタンパク質を用いるものである。例えば、検査対象物中の当該混合体を検出する方法として、以下の工程を有する方法が挙げられる。なお、当該混合体としては、脂質ラフトであってもよい。
１）検査対象物に対して、本発明に係るタンパク質を供する工程；
２）本発明に係るタンパク質との特異的結合の有無を検出する工程；
３）特異的結合がある場合に、検査対象物中にスフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体が存在すると判定する工程。
　これらの工程としては、従来公知の方法を用いることができる。例えば上記２）の工程において、特異的結合の有無を検出する方法としては、上記１）の工程において特異的結合しなかった本発明に係るタンパク質を除去した後、残った当該タンパク質を検出する方法を用いることができる。タンパク質を検出する方法としては、当該タンパク質に蛍光タンパク質等を付加させて発色または発光させることによって可視化する方法、ＥＬＩＳＡ法によって当該タンパク質を検出する方法等、従来公知の方法が挙げられる。可視化されたタンパク質は、蛍光顕微鏡等によって観察可能である。
　上述したような方法を用いることによって、例えば生物サンプル（細胞、組織等）中における脂質ラフトの局在を検出することができる。したがって、本発明は、脂質ラフトの動態、機能等の研究に有用である。
　例えば、本発明は、脂質ラフトが関わる疾患の詳細な解析、診断等に用いることが可能である。脂質ラフトが関わる疾患として、脂質代謝異常症が挙げられる。脂質代謝異常症としては、例えばニーマンピック病などが挙げられる。例えば、本発明に係るタンパク質の局在を調べることにより、上述した疾患の細胞における脂質ラフトの局在の解析、上述した疾患か否かの診断等が可能である。
　また、本発明に係るタンパク質は、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に特異的に結合できるため、当該混合体を精製する方法、好ましくは脂質ラフトを精製する方法に好適に用いることができる。当該混合体を精製する方法としては、物質間の特異的結合を利用する従来公知の種々の精製方法を適用することができる。
　また、本発明に係るタンパク質は、脂質ラフトに特異的に結合できるため、脂質ラフトが関わる種々の疾病に対する医薬に好適に利用することができる。脂質ラフトが関わる疾病の１つとして、ウイルス感染等が挙げられる。例えばエイズウイルス等は、脂質ラフトに覆われていることが知られている。また、後述する実施例において示すように、本発明に係るタンパク質は、細胞に対するウイルス感染、特にインフルエンザウイルスによる感染を阻害することができる。したがって、本発明に係るタンパク質は、ウイルス感染を抑えるための医薬などに利用できる。
　本発明を利用して感染を抑制することができる対象となるウイルスとしては、上述したエイズウイルス及びインフルエンザウイルスに限らず、脂質ラフトをターゲットとする任意のウイルスであればよく、例えばＣ型肝炎ウイルスなどが挙げられる。
　また、本発明に係るタンパク質を対象に投与することにより、ウイルス感染を治療することができる。本発明は、本発明に係るタンパク質を対象に投与することを含むウイルス感染の治療方法をも提供する。
　また、本発明に係るタンパク質は、上述したように細胞に対するウイルス感染を阻害することができるため、ウイルス感染阻害剤に利用できる。本発明に係るウイルス感染阻害剤は、本発明に係るタンパク質を含んでいればよい。ウイルスとしては、インフルエンザウイルス等が挙げられる。
　また、本発明に係るタンパク質は毒性が極めて低いため、上述した医薬などに好適に用いることが可能である。
　〔脂質ラフト検出用キット〕
　本発明に係る脂質ラフト検出用キット（以下、単に「キット」ともいう。）は、上述したタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、形質転換体、および抗体からなる群より選択される少なくともいずれか１つを含む、脂質ラフトを検出するためのキットである。
　本発明に係るキットは、上述したタンパク質を含むことによって、当該タンパク質を用いてスフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体、特に脂質ラフトを検出することができる。なお、タンパク質としては、標識ポリペプチドが付加されたものであることが好ましい。また、上述したポリヌクレオチド、ベクターおよび形質転換体は、上述したタンパク質を取得するために用いることができる。また、上述した抗体は、上述したタンパク質を検出するために有用である。
　本発明に係るキットは、例えば上述したスフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体を検出する方法に利用することが可能なため、生物サンプル中における脂質ラフトの存在の有無、局在などの調査に好適に利用できる。
　本発明に係るキットは、スフィンゴミエリンに対する特異的な結合活性を有する物質をさらに含んでいることが好ましい。当該物質の例としては、例えばライセニン（lysenin）、ライセニン由来のタンパク質等が挙げられる。ライセニンおよびライセニン由来のタンパク質としては、特許文献１および２（特許文献１および２については、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる対応米国特許出願公開第１０／１３８６３４号明細書、第１１／２２３９７４号明細書を参照）に記載されたものを好適に用いることができる。これにより、スフィンゴミエリンとコレステロールとの混合体、例えば脂質ラフトの局在と、スフィンゴミエリンの局在とを比較することができるため、脂質ラフトの局在、動態等をより正確に調べることが可能になる。
　また、本発明に係るキットは、ライセニンまたはライセニン由来のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ポリヌクレオチドまたは該ベクターが導入された形質転換体、ライセニンまたはライセニン由来のタンパク質に対する抗体などをさらに含んでいてもよい。
　また、本発明に係るキットは、コレステロールに対する特異的な結合活性を有する物質をさらに含んでいることが好ましい。このような物質の例としては、例えばポリエチレングリコールコレステリルエーテル、ポリエチレングリコール２－アミノエチルコレステリルエーテル等が挙げられる。また、当該物質は、コレステロール検出試薬の形態であってもよい。当該物質、およびこれを含むコレステロール検出試薬としては、特許文献３および特許出願４（特許出願４については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる対応米国特許出願公開第１０／５１６０７２号明細書を参照）に記載されたものを好適に用いることができる。これにより、スフィンゴミエリンとコレステロールとの混合体、例えば脂質ラフトの局在と、コレステロールの局在とを比較することができるため、脂質ラフトの局在、動態等をより正確に調べることが可能になる。
　本発明に係るキットは、上述したスフィンゴミエリンに対する特異的な結合活性を有する物質およびコレステロールに対する特異的な結合活性を有する物質の両方を含んでいることがより好ましい。これにより、スフィンゴミエリンとコレステロールとの混合体、例えば脂質ラフトの局在と、スフィンゴミエリンの局在と、コレステロールの局在とを比較することができるため、脂質ラフトの局在、動態等をさらに詳細に調べることが可能になる。
　〔付記事項〕
　なお、本発明に係るタンパク質には、標識ポリペプチドが付加されていることが好ましい。
　また、本発明に係る脂質ラフト検出用キットは、スフィンゴミエリンに対する特異的な結合活性を有する物質およびコレステロールに対する特異的な結合活性を有する物質の少なくとも一方をさらに含むことが好ましい。
　本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　〔実施例１：新規なタンパク質および遺伝子の同定〕
　以下の方法により、本発明者らは、マイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ　ｆｒｏｎｄｏｓａ）から、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に特異的に結合する新規なタンパク質ＧＦ－Ｎｎｉ（配列番号１）を同定した。具体的には、スフィンゴミエリン（Ａｖａｎｔｉより入手）／コレステロール（Ｓｉｇｍａより入手）（１：１）リポソームに結合するタンパク質をマイタケタンパク質粗汁液より精製し、アミノ酸の部分配列（MLYGVEIDEQYLRVMEEYKDKEVITQADMAKVALQRKNVYQDQAEKRQAELKAEYGVGV, XHLLRVYATX, HGQTGNETTAVEY, SFRGHFGAHTREK, TTAYVEYVYSR）を得た。
　次に、タンパク質ＧＦ－Ｎｎｉをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号２）を同定した。具体的には、得られた部分配列をもとに雪国まいたけ社が保有するマイタケｃＤＮＡデータベースを用いてｔｂｌａｓｔｎ解析を実施したところ、登録配列中に３７３ｂｐのＤＮＡ配列を見出した。この配列をもとに、ＲＡＣＥ用のプライマー２つ（５’－ＲＡＣＥ－ＧＦ（配列番号３）及び３’－ＲＡＣＥ－ＧＦ（配列番号４））を設計し、ＳＭＡＲＴｅｒＴＭ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いたＲＡＣＥ－ＰＣＲ法によって、ＧＦ－Ｎｎｉをコードする遺伝子の上流配列及び下流配列を決定した。
　次に、マイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ　ｆｒｏｎｄｏｓａ）から、配列番号２の塩基配列で示される遺伝子をクローニングした。具体的には、決定したＧＦ－Ｎｎｉ配列より、クローニング用のフォワードプライマーＮｎｉ－Ｆ（配列番号５）及びリバースプライマーＮｎｉ－Ｒ（配列番号６）を設計し、ＰＣＲ法によってＧＦ－Ｎｎｉの全長遺伝子をクローニングした。ＧＦ－Ｎｎｉの全長はインビトロジェン社のｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ－ＴＯＰＯベクターに挿入した。
　この遺伝子を用いて、遺伝子組み換え技術によって、タンパク質ＧＦ－Ｎｎｉを発現精製した。具体的には、ｐＥＴ－２８ｂベクターにＧＦ－Ｎｎｉ遺伝子を導入し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現した後、ニッケルカラムを用いて精製した。
　〔実施例２〕
　マイタケより精製したタンパク質ＧＦ－Ｎｎｉを用いて、種々の脂質およびコレステロール（１：１）からなるリポソーム（人工膜）との結合を調べた。人工膜の脂質としては、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、およびホスファチジルグリセロール（ＰＧ）を用いた。これらの脂質はAvanti社より購入した。コレステロールはＳｉｇｍａ社より購入した。
　まず、ＧＦ－Ｎｎｉとリポソームとを混合し、その後遠心によって上清（Ｓ）とリポソームを含む沈殿（Ｐ）とに分離した。次に、これらの上清（Ｓ）と沈殿（Ｐ）とをそれぞれ電気泳動し、公知の方法によってタンパク質を染色した。これにより、いずれの画分にＧＦ－Ｎｎｉが含まれるかを調べた。
　図１は、本発明の一実施例におけるタンパク質ＧＦ－Ｎｎｉと種々のリポソームとを混合した後に上清（Ｓ）と沈殿（Ｐ）とに分離し、電気泳動によりＧＦ－Ｎｎｉを検出した結果を示す図である。図１に示すように、ＧＦ－Ｎｎｉは、スフィンゴミエリンとコレステロールとからなるリポソームを用いた場合にのみ、沈殿画分に検出された。この結果から、本発明に係るタンパク質は、スフィンゴミエリンとコレステロールとの混合体に特異的に結合することが示唆された。
　〔実施例３〕
　次に、精製したタンパク質ＧＦ－Ｎｎｉを用いて、種々の脂質およびコレステロール（１：１）の混合物に対する結合活性をさらに調べた。脂質としては、実施例２にて用いたものの他に、ガラクトシルセラミド（ＧａｌＣｅｒ）（Ａｖａｎｔｉより入手）、グルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）（Ｍａｔｒｅｙａより入手）、ラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）（Ａｖａｎｔｉより入手）、スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）（ＢｉｏＭｏｌより入手）、ガングリオシド（ＧＭ１）（和光純薬より入手）、およびセラミド（Ｃｅｒ）（Ａｖａｎｔｉより入手）を用いた。
　まず、９６穴プラスチックプレートに、種々の脂質とコレステロールとを１：１において含むエタノール溶液を添加し、その後エタノールを蒸発させた。これに、ＧＦ－Ｎｎｉ、抗ＧＦ－Ｎｎｉ抗体（ウサギポリクローナル抗体）、ＨＲＰ結合抗ウサギ抗体をこの順で加え、公知のＥＬＩＳＡ法（固相法）によって、脂質とコレステロールとの混合物に結合したＧＦ－Ｎｎｉの量を定量した（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるKiyokawa E, Makino A, Ishii K, Otsuka N, Yamaji-Hasegawa A, Kobayashi T. (2004) Recognition of sphingomyelin by lysenin and lysenin-related proteins. Biochemistry 43, 9766-9773）。
　図２は、脂質とコレステロールとの混合物に対するＧＦ－Ｎｎｉの結合活性を示すグラフである。図２に示すように、ＧＦ－Ｎｎｉは、スフィンゴミエリンとコレステロールとの混合物にのみ高い結合活性を示した。この結果から、本発明に係るタンパク質は、スフィンゴミエリンとコレステロールとの混合物に選択的に結合することが示された。
　〔実施例４〕
　精製したタンパク質ＧＦ－Ｎｎｉを用いて、上述したＥＬＩＳＡ法によって、スフィンゴミエリンとコレステロールとの比率が異なる混合物に対する結合活性を調べた。
　図３は、スフィンゴミエリン（Ｓ）とコレステロール（Ｃ）との混合物に対するＧＦ－Ｎｎｉの結合活性を示すグラフである。図３に示すように、ＧＦ－Ｎｎｉにおける、スフィンゴミエリンとコレステロールとの混合物に対する結合活性は、混合物に含まれるスフィンゴミエリンとコレステロールとの比率（Ｓ／Ｃ）に依存した。
　この結果から、ＧＦ－Ｎｎｉは、スフィンゴミエリン／コレステロールの比率が６／４～１／９である混合物に効率よく結合することが示された。また、スフィンゴミエリンのみ含むサンプル（Ｓ／Ｃ＝１０／０）およびコレステロールのみ含むサンプル（Ｓ／Ｃ＝０／１０）に対する結合活性が、非常に低いことが示された。
　以上により、本発明に係るタンパク質は、スフィンゴミエリンとコレステロールとの混合体に特異的に結合することが強く示唆された。また、本発明に係るタンパク質は、少なくともスフィンゴミエリン／コレステロールの比率が６／４～１／９である混合体に対する結合活性が高いものであることが示唆された。
　〔実施例５〕
　実施例１と同じ方法で発現精製したタンパク質ＧＦ－Ｎｎｉを用いて、上述したＥＬＩＳＡ法によって、種々のスフィンゴミエリンおよびコレステロール（１：１）の混合物に対する結合活性を調べた。スフィンゴミエリンとして、ブタ脳由来スフィンゴミエリン（ｂｒａｉｎＳＭ）（Ａｖａｎｔｉより入手）、卵黄由来スフィンゴミエリン（ＥｇｇＳＭ）（Ａｖａｎｔｉより入手）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）を有する合成スフィンゴミエリン（ＰａｌＳＭ）（Ａｖａｎｔｉより入手）、オレイン酸（Ｃ１８：１）を有する合成スフィンゴミエリン（ＯｌｅＳＭ）（Ｓｉｇｍａより入手）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）を有する合成スフィンゴミエリン（ＳｔｅＳＭ）（Ｍａｔｒｅｙａより入手）、炭素数２０、２２、２４、６、２の飽和脂肪酸をそれぞれ有する合成スフィンゴミエリン（Ｃ２０ＳＭ、Ｃ２２ＳＭ、Ｃ２４ＳＭ、Ｃ６ＳＭ、Ｃ２ＳＭ）（Ｍａｔｒｅｙａより入手）を用いた。
　図４は、種々のスフィンゴミエリンとコレステロールとの混合物に対するＧＦ－Ｎｎｉの結合活性を示すグラフである。図４に示すように、ＧＦ－Ｎｎｉは、ブタ脳由来スフィンゴミエリンおよび卵黄由来スフィンゴミエリンのいずれに対しても高い結合活性を示した。また、ＧＦ－Ｎｎｉは、炭素数１８以上の脂肪酸を有するスフィンゴミエリンであれば、飽和脂肪酸を有するものであるか不飽和脂肪酸を有するものであるかにかかわらず、結合した。
　ここで、スフィンゴミエリンとコレステロールとの混合体は、スフィンゴミエリンが有する脂肪酸が飽和脂肪酸である場合には秩序液体相をとり、不飽和脂肪酸である場合には無秩序液体相をとる。秩序液体相とは、スフィンゴミエリンの脂肪酸（炭化水素鎖）の配向が揃っている状態をさし、無秩序液体相とは、当該脂肪酸の配向が乱れている状態をさす。
　本実施例の結果から、本発明に係るタンパク質は、結合対象である混合体が秩序液体相をとるか無秩序液体相をとるかにかかわらず、結合活性を有するものであることが示された。すなわち、本発明に係るタンパク質は、混合体の物性ではなく構造を認識して結合するものであることが示された。
　また、本発明に係るタンパク質は、少なくとも炭素数７以上の長い脂肪酸、特に炭素数１８以上の脂肪酸を有するスフィンゴミエリンを含む混合体に対して結合活性を有することが示された。また、種々の由来のスフィンゴミエリンを含む混合体に対して結合できることが示された。
　〔実施例６〕
　実施例１と同じ方法で発現精製したタンパク質ＧＦ－Ｎｎｉを用いて、上述したＥＬＩＳＡ法によって、スフィンゴミエリンおよび種々のステロール（１：１）の混合物に対する結合活性を調べた。ステロールとしては、コレステロール（cholesterol）、エルゴステロール（ergosterol）、ラノステロール（lanosterol）、コプロスタン（coprostane）、コレステリルアセテート（chol acetate）、５α－ｃｈｏｌ（5a chol）、５α－ｃｈｏｌ－３β－ｏｎｅ（5a-chol-3b-one）、５α－ｃｈｏｌ－７－ｅｎ－３ｂ－ｏｌ（5a-chol-7-en-3b-ol）、５α－ｃｈｏｌ－３β－ｏｌ（5a-chol-3b-ol）、および５β－ｃｈｏｌ－３ａ－ｏｌ（5b-chol-3a-ol）を用いた。
　図５は、スフィンゴミエリンと種々のステロールとの混合物に対するＧＦ－Ｎｎｉの結合活性を示すグラフである。図５に示すように、ＧＦ－Ｎｎｉは、ステロール構造の違いを見分けていることが示された。
　〔実施例７〕
　実施例１と同じ方法で発現精製したタンパク質ＧＦ－Ｎｎｉについて、示差熱分析装置（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるIshitsuka R, Yamaji-Hasegawa A, Makino A, Hirabayashi Y, Kobayashi T. (2004) A lipid-specific toxin reveals heterogeneity of sphingomyelin-containing membranes. Biophys. J. 86, 296-307.）を用いて熱分析を行ない、種々の人工膜に対する結合活性を調べた。人工膜としては、スフィンゴミエリン（Ｍａｔｒｅｙａより入手）とコレステロール（Ｓｉｇｍａより入手）との人工膜（ＳＭ／ｃｈｏｌ）（１：１）、ＤＯＰＣ（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine）（Ａｖａｎｔｉより入手）とコレステロールとの人工膜（ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌ）（１：１）、およびＤＰＰＣ（dipalmitoyl phosphatidyl choline）（Ａｖａｎｔｉより入手）とコレステロールとの人工膜（ＤＰＰＣ／ｃｈｏｌ）（１：１）を用いた。
　図６は、種々の人工膜に対するＧＦ－Ｎｎｉの結合活性を示す熱分析結果である。図６に示すように、ＧＦ－Ｎｎｉは、ＳＭ／ｃｈｏｌには結合したが、ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌおよびＤＰＰＣ／ｃｈｏｌには結合しなかった。秩序液体相をとるＤＰＰＣ／ｃｈｏｌにＧＦ－Ｎｎｉが結合しなかったことから、ＧＦ－Ｎｎｉが、結合対象の物性ではなく構造を認識していることが示された。
　〔実施例８〕
　精製したタンパク質ＧＦ－Ｎｎｉの細胞表面に対する結合能を調べた。
　まず、未処理のＨｅＬａ細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）、スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭａｓｅ）を処理してスフィンゴミエリンを除いたＨｅＬａ細胞、およびメチルベータサイクロデキストリン（ＭβＣＤ）を処理してコレステロールを除いたＨｅＬａ細胞をそれぞれ固定した。次に、これらのＨｅＬａ細胞の表面にＧＦ－Ｎｎｉを結合させた後、抗ＧＦ－Ｎｎｉ抗体、およびＡｌｅｘａ５４４標識抗ウサギ抗体を用いてこのＧＦ－Ｎｎｉを可視化した。
　また、比較のために、スフィンゴミエリンを認識するライセニン（lysenin）、およびコレステロールを認識するθ－毒素のコレステロール結合ドメイン（Ｄ４）についても同様に、上述したＨｅＬａ細胞に結合させた後、蛍光抗体を用いてこれらを可視化した。
　図７は、ＨｅＬａ細胞表面へのＧＦ－Ｎｎｉの結合を示す顕微鏡画像を表す図である。図７に示すように、ＧＦ－Ｎｎｉは、未処理のＨｅＬａ細胞の表面に対して結合するが、ＳＭａｓｅを処理した細胞およびコレステロールを除いた細胞に対しては結合しなかった。一方、ライセニンは、コレステロールを除いた細胞に対して結合し、Ｄ４は、ＳＭａｓｅを処理した細胞に対して結合した。
　〔実施例９〕
　種々の人工膜を共存させた条件下における、ＧＦＰ標識したＧＦ－Ｎｎｉの細胞への結合能を調べた。
　ＧＦ－ＮｎｉのＮ末にＧＦＰを融合させたタンパク質ＧＦＰ－ＧＦ－Ｎｎｉ（配列番号７）をコードする遺伝子（配列番号８）を作製し、この遺伝子を用いて、遺伝子組み換え技術によって、ＧＦＰ標識したＧＦ－Ｎｎｉを発現精製した。具体的にはｐＥＴ－２８ｂベクターにＥＧＦＰをコードする遺伝子とＧＦ－Ｎｎｉをコードする遺伝子とを導入し、これを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を用いてＧＦＰ－ＧＦ－Ｎｎｉを発現させた後、ニッケルカラムを用いて精製した。
　精製したタンパク質とＨｅＬａ細胞の表面との結合能を、人工膜を共存させない条件（ｃｏｎｔｒｏｌ）、スフィンゴミエリン／コレステロール（１：１）の人工膜（ＳＭ／Ｃｈｏｌ）共存下、およびホスファチジルコリン／コレステロール（１：１）の人工膜（ＰＣ／Ｃｈｏｌ）共存下において調べた。
　図８は、ＨｅＬａ細胞表面へのＧＦ－Ｎｎｉの結合を示す顕微鏡画像を表す図である。図８に示すように、ＧＦ－Ｎｎｉは、人工膜を共存させない条件下ではＨｅＬａ細胞表面に結合した。この結合は、ＳＭ／Ｃｈｏｌ共存下では阻害されたが、ＰＣ／Ｃｈｏｌ共存下では阻害されなかった。この結果から、ＧＦ－Ｎｎｉは、スフィンゴミエリンとコレステロールとの混合体を介して細胞表面に結合することが支持された。
　〔実施例１０〕
　ＨｅＬａ細胞内におけるＧＦ－Ｎｎｉおよびライセニンの局在を調べた。具体的には、細胞を固定した後、凍結融解を行なうことによって膜を透過性にし、ＧＦ－Ｎｎｉとライセニンとを添加し、それぞれのタンパク質に対する抗体を用いてＧＦ－Ｎｎｉとライセニンの細胞内局在を可視化した。
　図９は、ＨｅＬａ細胞内におけるＧＦ－Ｎｎｉおよびライセニンの局在を示す顕微鏡画像を表す図である。具体的には、図９は、ＧＦ－Ｎｎｉの局在を示す画像（ＧＦ－Ｎｎｉ）と、ライセニンの局在を示す画像（Ｌｙｓｅｎｉｎ）と、これらを重ね合わせた画像（Ｌｙｓｅｎｉｎ＋ＧＦ－Ｎｎｉ）とを表す図である。ＧＦ－Ｎｎｉとライセニンとの局在が一致していることから、ＧＦ－Ｎｎｉが結合するスフィンゴミエリンおよびコレステロールの混合体の局在と、ライセニンが結合するスフィンゴミエリンの局在とが一致することが明らかとなった。
　このように本発明に係るタンパク質を用いれば、細胞内におけるスフィンゴミエリンおよびコレステロールの混合体（脂質ラフト）の局在を容易に検出することができる。また、本発明に係るタンパク質は、ライセニンと組み合わせて用いることによって、脂質ラフトと、脂質ラフトを形成していないスフィンゴミエリンとの局在、動態等を比較することができる。
　〔実施例１１〕
　ＨｅＬａ細胞内におけるＧＦ－Ｎｎｉおよび後期エンドソームマーカーＢＭＰの局在を調べた。具体的には、細胞を固定した後、凍結融解することによって膜を透過性にし、ＧＦ－Ｎｎｉとエンドソーム特異的脂質であるＢＭＰに対する抗体とを添加し、それぞれを蛍光抗体法により可視化し、局在を顕微鏡観察によって調べた。
　図１０は、ＨｅＬａ細胞におけるＧＦ－ＮｎｉおよびＢＭＰの局在を示す顕微鏡画像を表す図である。具体的には、図１０は、ＧＦ－Ｎｎｉの局在を示す画像（ＧＦ－Ｎｎｉ）と、ＢＭＰの局在を示す画像（ＢＭＰ）と、これらを重ね合わせた画像（ＢＭＰ＋ＧＦ－Ｎｎｉ）とを表す図である。図１０から、ＧＦ－Ｎｎｉが結合するスフィンゴミエリンおよびコレステロールの混合体と後期エンドソームとの局在は、一部一致していることが明らかとなった。
　このように本発明に係るタンパク質を用いれば、細胞内におけるスフィンゴミエリンおよびコレステロールの混合体（脂質ラフト）の局在を、他の細胞内器官の局在と比較することができ、これにより、脂質ラフトの細胞内における動態、機能等を予測することができる。
　以上のように、本発明は、脂質ラフトの細胞内における局在、動態、機能等を調べるために有用である。
　〔実施例１２〕
　本発明の一実施例として、タンパク質ＧＦ－Ｎｎｉと相同性を有する、ブナシメジ（Ｈｙｐｓｉｚｙｇｕｓ　ｍａｒｍｏｒｅｕｓ）のホモログタンパク質ＨＭ－Ｎｎｉをコードする遺伝子を、下記の方法を用いて見出した。すなわちＧＦ－Ｎｎｉのアミノ酸配列をもとに雪国まいたけ社が保有するブナシメジｃＤＮＡデータベース対してｔｂｌａｓｔｎ解析を実施し、アミノ酸で３６％のホモロジーを有するＤＮＡ断片２２８ｂｐを得た。この配列をもとに、ＲＡＣＥ用のプライマー２つ（５’－ＲＡＣＥ－ＨＭ（配列番号９）及び３’－ＲＡＣＥ－ＨＭ（配列番号１０））を設計し、ＳＭＡＲＴｅｒＴＭ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（タカラバイオ株式会社）を用いてＲＡＣＥ－ＰＣＲ法によって未知上流配列並びに下流配列を決定した（配列番号１４）。決定したＨＭ－Ｎｎｉ配列より、クローニング用のフォワードプライマーＨＭ－Ｆ（配列番号１１）及びリバースプライマーＨＭ－Ｒ（配列番号１２）を設計し、PCRによってＨＭ－Ｎｎｉの全長遺伝子をクローニングした。この遺伝子を用いて、実施例１と同様の方法によってタンパク質ＨＭ－Ｎｎｉ（配列番号１３）を発現精製した。
　〔実施例１３〕
　実施例１と同じ方法で発現精製したタンパク質ＧＦ－Ｎｎｉを用いて、実施例２と同様の方法により、ＧＦ－Ｎｎｉとリポソームとの結合を調べた。リポソームとしては、スフィンゴミエリン／ホスファチジルコリン／コレステロールリポソーム（１：０：１，１：０．２：１，１：０．５：１，１：１：１）を用いた。
　図１２は、本発明の一実施例におけるタンパク質ＧＦ－Ｎｎｉと種々のリポソームとを混合した後に上清（Ｓ）と沈殿（Ｐ）とに分離し、電気泳動によりＧＦ－Ｎｎｉを検出した結果を示す図である。
　図１２に示すように、リポソームにおけるホスファチジルコリンの割合が増加するほど、ＧＦ－Ｎｎｉの結合が阻害された。この結果から、ＧＦ－Ｎｎｉは、スフィンゴミエリンとコレステロールとの複合体を形成することができず、あらかじめ存在するスフィンゴミエリン／コレステロール複合体に結合することができることが示された。
　〔実施例１４〕
　実施例１と同じ方法で発現精製したタンパク質ＧＦ－Ｎｎｉを用いて、上述したＥＬＩＳＡ法（固相法）によって、種々のステロールとスフィンゴミエリンとの混合物（１：１）に対する結合活性を調べた。
　ステロールとしては、コレステロール（cholesterol）、エルゴステロール（ergosterol）、ラノステロール（lanosterol）、コプロスタン（coprostane）、コレステリルアセテート（chol acetate）、５α－コレスタン（5a-cholestane）、５α－コレスタン－３－ｏｎｅ（5a-cholestan-3-one）、ラソステロール（lathosterol，上述した5a-chol-7-en-3b-olと同じ）、ジヒドロコレステロール（dihydrocholesterol，上述した5a-chol-3b-olと同じ）、エピコプロスタノール（epicoprostanol，上述した5b-chol-3a-olと同じ）、６－ケトコレスタノール（6-ketocholestanol）、７－デヒドロコレステロール（7-dehydrocholesterol）、５α－ｃｈｏｌｅｓｔ－８（１４）－ｅｎ－３β－ｏｌ－１５－ｏｎｅ（5a-cholest-8(14)-en-3b-ol-15-one）、カンペステロール（campesterol）、スチグマステロール（stigmasterol）、β－シトステロール（b-sitosterol）、デスモステロール（desmosterol）、エピコレステロール（epicholesterol）、コプロスタノール（coprostanol）、及びコプロステノール（coprostenol）を用いた。
　図１３は、種々のステロールとスフィンゴミエリンとの混合物に対するＧＦ－Ｎｎｉの結合活性を示すグラフである。縦軸は、コレステロールの値を１００としたときの相対値を表す。図１３に示すように、ＧＦ－Ｎｎｉの結合には、ステロールの３β－ヒドロキシル基が重要であることがわかった。
　〔実施例１５〕
　免疫電子顕微鏡解析により、細胞表面におけるＧＦ－Ｎｎｉの結合部位を調べた。具体的には、固定したＨｅＬａ細胞の表面に、実施例１に示す方法で発現精製したタンパク質ＧＦ－Ｎｎｉを結合させた。その後、抗ＧＦ－Ｎｎｉ抗体で処理した後、金コロイド標識抗ウサギ抗体を加え、電子件微鏡で観察した。
　図１４は、ＨｅＬａ細胞表面へのＧＦ－Ｎｎｉの結合部位を示す顕微鏡画像を表す図である。図１４に示すように、ＧＦ－Ｎｎｉは、細胞膜上でクラスターを形成していた。
　〔実施例１６〕
　超高解像能蛍光顕微鏡により、ＧＦ－Ｎｎｉ、ライセニン、Ｈ－ｒａｓ及びＫ－ｒａｓの細胞膜中での分布を調べた。具体的にはＤｒｏｎｐａおよびＡｌｅｘａ６４７標識したＧＦ－Ｎｎｉ、ライセニン、Ｈ－ｒａｓ及びＫ－ｒａｓを調製し、細胞表面を標識した後、ＰＡＬＭ（photoactivation localization microscope）により観察した。
　図１５は、細胞膜中におけるＧＦ－Ｎｎｉ、ライセニン、及びＨ－ｒａｓの分布を示す顕微鏡画像を表す図である。また図１６は、細胞膜中におけるＧＦ－Ｎｎｉ、ライセニン、及びＫ－ｒａｓの分布を示す顕微鏡画像を表す図である。
　本実施例では、細胞膜におけるＧＦ－Ｎｎｉ結合ドメインは、ライセニン結合ドメインの一部に存在することがわかった。また、細胞膜外層に分布するＧＦ－Ｎｎｉは、細胞膜内層のＨ－ｒａｓとはよく一致していたが、Ｋ－ｒａｓとは一致していなかった。なお、従来、Ｈ－ｒａｓは脂質ラフトに存在すると予想されていた。本実施例においてＨ－ｒａｓの分布がＧＦ－Ｎｎｉの分布と一致したことから、Ｈ－ｒａｓはスフィンゴミエリン／コレステロールドメインの裏側に実際に存在することが示された。
　このように、ＧＦ－Ｎｎｉを用いることにより、Ｈ－ｒａｓが脂質ラフトに実際に存在することを示すことができた。
　〔実施例１７〕
　ＨｅＬａ細胞における細胞内オルガネラへのＧＦ－Ｎｎｉの結合活性を調べた。具体的には細胞を固定化した後、凍結融解によって膜を透過性にし、種々のオルガネラマーカーとＧＦ－Ｎｎｉとの二重標識を行った。
　図１７は、細胞内オルガネラへのＧＦ－Ｎｎｉの結合活性を示す顕微鏡画像を表す図である。図１７に示すように、ＧＦ－Ｎｎｉの局在は、ＢＭＰとのみ一致し、ＥＥＡ１、ＧＭ１３０とは一致しなかった。この結果から、ＨｅＬａ細胞内ではＧＦ－Ｎｎｉが後期エンドソームに結合するため、後期エンドソームがスフィンゴミエリン／コレステロールの蓄積の場であることが示された。
　このように、ＧＦ－Ｎｎｉを用いることにより、脂質ラフトの局在を容易に検出することができる。
　〔実施例１８〕
　免疫電子顕微鏡解析により、細胞内におけるＧＦ－Ｎｎｉの結合部位を解析した。具体的にはＨｅｌａ細胞の切片を調製し、ＧＦ－Ｎｎｉを結合させた後、抗ＧＦ－Ｎni抗体、金コロイド標識抗ウサギ抗体で処理を行った。
　図１８は、細胞内におけるＧＦ－Ｎｎｉの結合部位を示す顕微鏡画像を表す図である。この結果から、ＧＦ－Ｎｎｉは、後期エンドソームに特徴的な多重膜構造に結合することが示された。
　〔実施例１９〕
　ニーマンピック病は、先天性の脂質代謝異常症であり、Ａ型、Ｃ型などが知られている。Ａ型は、酸性スフィンゴミエリナーゼの欠損であり、Ｃ型は、ニーマンピックＣタンパク質というコレステロールの細胞内輸送にかかわるタンパク質を欠損している。Ａ型の細胞は細胞内にスフィンゴミエリンを蓄積し、Ｃ型はコレステロールを蓄積する。どちらも脂質ラフトの機能に異常があることが示唆されているが、脂質ラフトそのものの細胞内および細胞表面での分布はわかっていなかった。
　そこで、本実施例では、脂質結合タンパク質であるＧＦ－Ｎｎｉ、ライセニン及びＤ４を用いて、ニーマンピック病細胞の細胞内及び細胞表面における脂質の分布を調べた。
　まず、正常な細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）、ニーマンピック病Ａ型の細胞（ＮＰＡ）、およびニーマンピック病Ｃ型の細胞（ＮＰＣ）に対し、凍結融解することより細胞に穴をあけ、膜を透過性にした。次いで、ＧＦ－Ｎｎｉ、ライセニン及びＤ４を添加し、それぞれのタンパク質に対する抗体を用いて細胞内局在を可視化した。
　図１９は、ニーマンピック病の細胞の細胞内における脂質分布を示す顕微鏡画像を表す図である。ニーマンピック病のＡ型、Ｃ型どちらの細胞においても、コントロール細胞に比べ、細胞内におけるＧＦ－Ｎｎｉの有意な蓄積が示された。したがって、ＧＦ－Ｎｎｉを用いることにより、ニーマンピック病の細胞では、細胞内に脂質ラフトが蓄積していることを示すことができた。
　次に、これらの細胞をそれぞれ固定し、細胞の表面にＧＦ－Ｎｎｉ、ライセニン及びＤ４のそれぞれを結合させた。その後、ＧＦ－Ｎｎｉについては抗ＧＦ－Ｎｎｉ抗体、およびＡｌｅｘａ５４４標識抗ウサギ抗体を用いて可視化した。また、ライセニン、Ｄ４についても同様に、蛍光抗体を用いて可視化した。
　図２０は、ニーマンピック病細胞の細胞表面における脂質分布を示す顕微鏡画像を表す図である。ニーマンピック病のＣ型では、ＧＦ－Ｎｎｉによって染色される脂質ラフト（スフィンゴミエリン・コレステロール複合体）が細胞表面にかたまりとなって存在していることがわかった。
　以上のように、ＧＦ－Ｎｎｉを用いることによって、脂質ラフトが関係する遺伝病等の疾患の詳細な解析が可能である。
　〔実施例２０〕
　脂質ラフトは、インフルエンザウイルスをはじめとするウイルス感染において重要な役割を果たすと考えられている。そこで、インフルエンザウイルス感染に対するＧＦ－Ｎｎｉの効果を調べた。
　まず、インフルエンザウイルスの感染１時間前又は４時間後に培養細胞（ＭＤＣＫ）にＧＦ－Ｎｎｉを添加した場合における効果を調べた。具体的には、培養細胞（ＭＤＣＫ）にＧＦ－Ｎｎｉを一定時間処理した後、インフルエンザウイルスを感染させ、一定時間後にウイルスのタイターを測定した。
　図２１は、培養細胞（ＭＤＣＫ）へのインフルエンザウイルス感染に対するＧＦ－Ｎｎｉの効果を示すグラフである。なお、図２１は、感染後２４時間後における結果を示す。また、縦軸は、コントロール（ＧＦ－Ｎｎｉを添加しないＭＤＣＫ）のウイルス感染に対する割合（％）を表す。図２１に示すように、感染１時間前にＧＦ－Ｎｎｉを添加した場合、感染４時間後にＧＦ－Ｎｎｉを添加した場合の両方において、コントロールよりもウイルス感染が阻害されていることが示された。
　次に、上述した方法を用いて、細胞とＧＦ－Ｎｎｉとの接触時間を、インフルエンザウイルスの感染１時間前から感染後２時間までとした場合（実験１）、感染後３時間後から８時間後までとした場合（実験２）、感染１時間前から感染後８時間までとした場合（実験３）における効果を調べた。
　図２２は、培養細胞（ＭＤＣＫ）へのインフルエンザウイルス感染に対するＧＦ－Ｎｎｉの効果を示すグラフである。なお、図２２は、感染後８時間後における結果を示す。また、縦軸は、コントロール（ＧＦ－Ｎｎｉを添加しないＭＤＣＫ）のウイルス感染に対する割合（％）を表す。
　図２２に示すように、実験１、すなわちインフルエンザウイルスの感染初期の細胞への吸着・細胞内侵入時点のみＧＦ－Ｎｎｉを接触させた場合には、ウイルス感染に対する阻害効果は低かった。一方、実験２では、高い阻害効果が見られた。したがって、ＧＦ－Ｎｎｉの作用点は感染の中～後期であると推察される。また、ＧＦ－Ｎｎｉは、ウイルスの細胞への吸着ではなく細胞からのウイルスの遊離を阻害していることが示唆される。
　以上の結果は、ＧＦ－Ｎｎｉが、細胞に対するウイルス感染を阻害する目的、例えばウイルス感染阻害剤に好適に使用できることを示唆している。
　発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
　なお、本出願は、２０１０年５月１４日付けで出願された日本特許出願（特願２０１０－１１２６８１）に基づいており、その全体が引用により援用される。
　本発明は、脂質ラフトを特異的に検出することができるので、脂質ラフトに関する研究用試薬、キットなどに好適に利用できるとともに、脂質ラフトが関わる疾病に対する医薬、ウイルス感染阻害剤などにも好適に利用できる。

Claims (13)

  1. 　下記（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のタンパク質：
    　（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列によって示される、タンパク質；
    　（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されているアミノ酸配列によって示されるタンパク質であって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有する、タンパク質；
    　（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列によって示されるタンパク質であって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有する、タンパク質。
  2. 　標識ポリペプチドが付加されていることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
  3. 　請求項１または２に記載のタンパク質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
  4. 　下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）または（Ｄ）のポリヌクレオチド：
    　（Ａ）配列番号２の塩基配列によって示される、ポリヌクレオチド；
    　（Ｂ）配列番号２の塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加されている塩基配列によって示されるポリヌクレオチドであって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
    　（Ｃ）配列番号２の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
    　（Ｄ）配列番号２の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列によって示されるポリヌクレオチドであって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
  5. 　請求項３または４に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
  6. 　請求項３または４に記載のポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする形質転換体。
  7. 　請求項５に記載のベクターが導入されていることを特徴とする形質転換体。
  8. 　請求項１または２に記載のタンパク質と結合することを特徴とする抗体。
  9. 　請求項１または２に記載のタンパク質を用いることを特徴とするスフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体を検出する方法。
  10. 　請求項１または２に記載のタンパク質、請求項３または４に記載のポリヌクレオチド、請求項５に記載のベクター、請求項６または７に記載の形質転換体、および請求項８に記載の抗体からなる群より選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする脂質ラフト検出用キット。
  11. 　スフィンゴミエリンに対する特異的な結合活性を有する物質およびコレステロールに対する特異的な結合活性を有する物質の少なくとも一方をさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載の脂質ラフト検出用キット。
  12. 　配列番号１のアミノ酸配列によって示されるタンパク質のホモログであることを特徴とする、タンパク質。
  13. 　請求項１、２又は１２に記載のタンパク質を含むことを特徴とするウイルス感染阻害剤。
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