KR20100076992A

KR20100076992A - Ｔｒｐｃ 도메인과 ｓｅｓｔｄ1 도메인의 복합체 및 이를 포함하는 방법 및 용도

Info

Publication number: KR20100076992A
Application number: KR1020107009065A
Authority: KR
Inventors: 주잔네 미헤; 카르슈텐 슈트뤼빙
Original assignee: 사노피-아벤티스
Priority date: 2007-10-26
Filing date: 2008-10-14
Publication date: 2010-07-06
Also published as: MX2010004097A; EP2053059A1; TW200934789A; CA2702508A1; WO2009052971A1; EP2205628A1; JP2011501757A; CN101848933A; AU2008315951A1; US20100330697A1; IL205218A0; AR069007A1

Abstract

본 발명은 TRPC(transient receptor potential channel) 또는 이의 기능적 활성 변형체를 포함하거나 이것으로 이루어진 제1 단백질 및 SESTD1(SEC14 and spectrin domains 1)의 제1 스펙트린(Spec 1) 도메인을 포함하거나 이것으로 이루어진 제2 단백질을 포함하는 분리된 복합체, 상기 제1 단백질과 제2 단백질뿐만 아니라 상기 제1 및 제2 단백질의 상호작용을 검출하는 수단을 포함하는 검사 시스템, 이 시스템을 이용하여 TRPC 조절인자를 선별하는 방법 및 TRPC 조절인자의 동정을 위한 상기 검사 시스템의 용도에 관한 것이다.

Description

ＴＲＰＣ 도메인과 ＳＥＳＴＤ1 도메인의 복합체 및 이를 포함하는 방법 및 용도{Complexes of TRPC domains and SESTD1 domains and methods and uses involving the same}

본 발명은 TRPC(transient receptor potential channel) 또는 이의 기능적 활성 변형체를 함유하거나 이것으로 이루어진 제1 단백질 및 SESTD1(SEC14 and spectrin domains 1)의 제1 스펙트린(Spec 1) 도메인을 함유하거나 이것으로 이루어진 제2 단백질을 함유하는 분리된 복합체, 상기 제1 단백질과 제2 단백질뿐만 아니라 상기 제1 및 제2 단백질의 상호작용을 검출하는 수단을 함유하는 검사 시스템, 이 시스템을 이용하여 TRPC 조절인자(modulator)를 선별하는 방법 및 TRPC 조절인자의 동정에 사용되는 상기 검사 시스템의 용도에 관한 것이다.

전형적인 TRPC 단백질은 비특이적 양이온 채널의 패밀리를 구성한다. 이 단백질은 드로소필라(Drosophila) TRP의 최초 발견된 포유동물 동족체였고, 특성이 잘 규명되어 있는 무척추동물 조상과 가장 근연성이 큰 서브패밀리이다. 이러한 사실에도 불구하고 이 단백질의 천연 조성 및 활성화 기전, 생리학적 기능 및 병리생리학과 질환에서의 역할에 관한 미결 문제가 많다.

천연 TRPC 채널의 원위치 동정은 이 채널의 광범위하고 부분 중첩되는 분포, 잠재적인 이종다량체화, 유사한 전기생리학적 성질 및 상기 채널을 절대적으로 추적하는 소량의 도구 화합물로 인해 복잡해진다. 공지된 유기 저해제, 예컨대 2-아미노에톡시디페닐 보레이트(2-APB), 에코나졸, 플루페나메이트, 루테늄 레드, SK&F 96365 및 무기 차단제, 예컨대 Gd³ ⁺, La³ ⁺는 충분하게 강력하지도 특이적이지도 않다. 유전자도입 마우스에서의 연구는 이미 특정 TRPC의 가능한 생리학적 기능을 해명하는데 귀중한 것으로 증명되어 있다. 하지만, 이 모델 시스템은 지금까지 7가지 포유동물 TRPC 채널의 각 채널마다 존재하지는 않으며, 그 모델 시스템의 생성과 분석이 시간 및 비용 소모적이고, 근연성 채널에 의한 보완 효과에 취약하기 때문에 문제점이 있다. 주요한 음성 채널 서브유닛 또는 작은 간섭 RNA(siRNA)에 의한 유전자 붕괴를 이용한 연구는 각각 단백질 발현의 유도 또는 억제에 의존적이다. 이것도 어느 정도의 시간이 걸릴 수 있는 바, 채널이 선택적 도구 화합물에 의해 즉시 차단될 때에는 관찰되지 않을 것으로 생각되는 보완 효과가 또한 가능하다.

도구 화합물의 식별의 중요성 및 가치는 TRPV-1-표적화 약물의 급속 발전으로 인해 강조되고 있다. 이 채널은 또한 TRP 수퍼패밀리에 속하고 그 생리학적 기능은 특정 활성인자(캡사이신)의 사용으로 해명되었다. 이를 클로닝한 지 10년 후, 여러 임상 실험이 진행중이고 다수의 징후, 예컨대 여러 종류의 통증, 편두통 및 절박성 요실금에 TRPV1 조절의 치료적 가치를 시험하고 있다.

내피세포의 칼슘 시그널링의 조절이상은 많은 심혈관의 병리학적 효과, 예컨대 죽상동맥경화증, 심장동맥 증후군, 심장 및 신장 부전, 고혈압 및 혈전증에 연관되어 있다. TRPC4-결손 마우스로부터의 증거는 작용제(agonist)-유도성 내피-의존적 혈관 이완에의 필요성 및 내피 장벽 기능을 조절하는데 있어서의 연관성을 시사한다. 따라서, TRPC4와 같은 TRPC의 조절은 전술한 병리생리학적 상태를 치료하는 유망한 시도일 수 있다. 하지만, TRPC의 약물 개발은 이종 발현계에서 천연의 통용물을 충실히 복원하기가 곤란함으로 인해 방해되고 있다.

따라서, 본 발명의 1가지 목적은 세포 및 그 이상에서 TRPC 채널 기능을 잘 이해하고 TRPC 채널 복합체의 신규 조절인자 또는 조절인자를 동정하는데 사용될 수 있는 신약물 도구를 개발하는 것이다. 새로운 도구는 고수율 선별 방법과 같이, 물질의 경제적이고 편리한 검사를 제공하는 것이 바람직하다.

이러한 본 발명의 목적은

- TRPC(transient receptor potential channel) 또는 이의 기능적 활성 변형체를 함유하거나 이것으로 이루어진 제1 단백질, 및

- SESTD1(SEC14 and spectrin domains 1)의 제1 스펙트린(Spec 1) 도메인을 함유하거나 이것으로 이루어진 제2 단백질을 포함하는 분리된 복합체를 제공하여 달성했다.

대안적인 분리된 복합체는

- 서열 LXXXXXYQEVXRNLVKRYVAAMIRXXKT(서열번호 1)(여기서, 각 X는 임의의 아미노산 잔기를 나타낸다)을 보유하는 TRPC 또는 이의 기능적 활성 변형체의 도메인을 함유하거나, 이 도메인으로 이루어진 제1 단백질, 및

- SESTD1의 Spec1 도메인을 함유하거나 이 도메인으로 이루어진 제2 단백질을 포함한다.

따라서, 본 발명의 제1 및 제2 관점은

- SESTD1(SEC14 and spectrin domains 1)의 제1 스펙트린(Spec 1) 도메인을 함유하거나 이것으로 이루어진 제2 단백질을 포함하는 분리된 복합체, 또는

- 도메인이 서열 LXXXXXYQEVXRNLVKRYVAAMIRXXKT(서열번호 1)(여기서, 각 X는 임의의 아미노산 잔기를 나타낸다)을 보유하는, TRPC 또는 이의 기능적 활성 변형체의 도메인을 함유하거나, 이 도메인으로 이루어진 제1 단백질, 및

- SESTD1의 Spec1 도메인을 함유하거나 이 도메인으로 이루어진 제2 단백질을 포함하는 분리된 복합체에 관한 것이다.

본 발명의 상황에서 분리된 복합체는 자연 환경에 있는 것이 아닌 본 명세서에 정의된 바와 같은 제1 및 제2 단백질의 복합체에 관한 것이다. 따라서, "분리된 복합체"는 본 명세서에 정의된 TRPC 및 SESTD1의 시그널 전달의 일부가 아닌 단백질과 연합되어 있지 않거나, 또는 "분리된 복합체"(또는 이의 성분)는 이것이 보통 발생하는 세포로부터 분리되거나 이를 암호화하는 핵산이 발현된 세포로부터 분리되거나, 또는 각각의 시그널 전달 경로에 관여하지 않는 동일한 세포 급원 유래의 다른 단백질이 실질적으로 없는 것이다. 복합체는 자연 발생의 복합체, 바람직하게는 TRPC와 SESTD1 또는 이의 일부(본 명세서에 정의되어 있음)와의 자연 발생의 복합체일 수 있다. 하지만, 복합체의 단백질들은 또한 자연 발생이 아닌, 서로 자연적으로 연결되어 있지 않은 하나 이상의 구역을 포함할 수 있다는 점에서 인공물일 수 있고, 예컨대 본 명세서에 정의된 TRPC 또는 SESTD1의 일부 및 제2 도메인과 같은 추가 단백질 또는 검출 및/또는 정제 목적 등에 사용되는 다른 성분을 함유하거나 또는 이것으로 이루어진 융합 단백질이다.

"분리된 복합체"란 용어는 자연 환경의 다른 세포 성분으로부터 본질적으로 분리된 단백질 복합체를 의미한다. 하지만, 복합체의 단백질을 분리한 후, 세포 성분은 시그널 전달 경로의 측정 등을 위해 다시 첨가할 수도 있다. 또한, 당업자는 분리된 복합체가 이 분리된 복합체의 활성을 허용하는 적당한 조건 하에서, 예컨대 적당한 완충액, pH 값, 이온 등에서 유지되어야 한다는 것을 이해할 것이다.

본 발명의 복합체의 제1 단백질은

- 제1 대안예에서, TRPC 또는 이의 기능적 활성 변형체

또는

- 제2 대안예에서, 서열 LXXXXXYQEVXRNLVKRYVAAMIRXXKT(서열번호 1)(여기서, 각 X는 임의의 아미노산 잔기를 나타낸다)을 보유하는 TRPC 또는 이의 기능적 활성 변형체의 도메인을 함유하거나, 이것으로 이루어진다.

TRPC는 자연 발생의 임의의 TRPC일 수 있다. TRPC는 아미노산 서열 상동성 및 기능적 유사성에 근거하여 4개의 그룹의 하위 분류할 수 있다. TRPC 패밀리 내에서 다소 독특한, TRPC1 및 TRPC2는 각각 자신이 서브패밀리를 구성하는 반면, TRPC4 및 TRPC5는 TRPC3, TRPC6 및 TRPC7처럼 병합된다. 이러한 서브패밀리들 내에서 헤테로머성 상호작용 및 TRPC4/5 또는 TRPC3/6/7 서브패밀리 구성원들과 TRPC1의 공동회합(coassembly)이 관찰되었다. TRPC4/5와 TRPC3/6/7 서브그룹 간에는 교차 연합이 일어나지 않는 것으로 오랫동안 생각되어왔지만, 최근 내인성 산화환원-민감성 TRPC3/4 헤테로머가 돼지 대동맥 내피 세포에서 보고되었다.

7개의 TRPC가 이하에 이들의 가능한 생체내 기능으로 소개될 것이다.

TRPC1 서브패밀리: 광범위하게 발현되는 호모머성 TRPC1의 연구는 세포주에서 이소성 단백질의 원형질막 표적화 결여로 인해 방해되었다. 사용된 과발현계에 따라서, 세포내 막에 잔류로 인한 확실한 TRPC1 시그널의 부족에서부터 sf9 세포의 채널 성질의 상세한 설명에 이르는 보고서들이 있다. 가능한 설명은 과발현계에 상호작용 단백질 또는 보조 서브유닛의 부재다. TRPC1의 원형질막 발현은 다른 단백질, 예컨대 TRPC, 카베올린-1 및 RhoA와의 상호작용에 좌우되는 것으로 밝혀져 있다. 또한, sf9 세포에서는 TRPC1에 의해 자극될 수 있는 호모머성 또는 헤테로머성 또는 심지어 천연 채널이 측정되는지가 확실하지 않다. 지금까지, 이소적으로 발현된 호모머성 TRPC1은 수용체-, DAG-, IP₃R- 또는 스트레치-활성화된 채널로서, 또는 비기능적 채널 서브유닛으로 설명되었고, 천연 TRPC1 호모머의 존재는 분명하게 입증되지 않았다. 하지만, 푸르키니에(Purkinje) 세포의 흥분성 시냅스후부 전도성(EPSC)에는 내인성 단백질이 필요하고, 이에 따라 신경세포 가소성에 연관될 수 있다. 더욱이, TRPC1은 신생혈관내막 과형성 및 심장 비대 시에 상향조절되고, 그 기능은 뒤시엔느(Duchenne) 근위축증을 앓고 있는 환자에게 영향을 미칠 수 있다. 최근, TRPC1의 역할이 유방암에서 제안되었다. 또한, TRPC1은 다낭성 신장 질환의 발달에 연관된, 먼 연관성이 있는 TRP 단백질인 TRPP2와 상호작용하는 것으로 보고되었다. 결론적으로, TRPC1은 많은 병태학적 및 생리학적 과정에 관여하는 것으로 보이며, 이의 일부 기능적 역할은 관련 TRPC에 의해 쉽게 보완되지 않는다. 이러한 특징과 함께 세포외 항체를 차단하기 위한 접근성은 잠재적 약물 표적이 되게 하지만, 광범위한 발현과 이종다량체화 선호로 인해 쉽게 이용할 수는 없을 것이다.

TRPC2 서브패밀리: TRPC2는 사람에서는 거짓유전자이지만, 설치류에서는 페로몬 감각에 중요하다. 이 채널이 부족한 수컷 마우스는 전형적인 수컷-수컷 공격 행동을 보이지 않고, 심지어 동성애를 나타낸다. TRPC2의 세포외 도메인에 대한 항체는 수정 시의 중요성을 지적하는 첨체 반응을 저해한다. 하지만, TRPC2 녹아웃(knock-out) 마우스는 생식 결함을 전혀 나타내지 않았다. TRPC2는 다른 TRPC 채널과 이종다량체화하는 것으로는 보이지 않는다.

TRPC3 /6/7 서브패밀리: 이 구성원들은 70 내지 80%의 아미노산 동일성을 공유하고 PLC 산물 DAG에 의해 직접 활성화된다. TRPC3 및 -6 활성은 비수용체 티로신 키나제 Src 및 Fyn을 통해 N-글리코실화 및 인산화에 의해서 조절된다.

사람에서 TRPC3은 뇌, 평활근 및 혈관 내피 세포에서 높게 발현된다. 이것은 축삭 성장 유도, 출산 시기 무렵의 시냅스 가소성 및 심장 Ca² ⁺ 항상성에 연관된 것으로 보인다. 심근아세포에서, TRPC3으로 인한 세포내 Na⁺ 농도의 비정상적인 축적은 Na⁺/Ca² ⁺ 교환기(NCX1) 방식을 역전시키는 것으로 밝혀졌다. 이 방식의 역전은 Ca²⁺를 세포로 수송하고 병리생리학적 과정, 예컨대 심부전 및 허혈에 연관되어 있을 수 있다. TRPC3은 산화환원-민감성 채널로 TRPC4와 공동회합하는 것으로 발견되었다. 발작 등에 의해 유도된 뇌에 산화적 스트레스는 산화환원-민감성 채널을 활성화시켜 무제한적 Ca² ⁺ 유입을 야기한다. 그 결과적인 신경변성은 결국 TRPC 길항제에 의해 최소화될 수 있었다.

TRPC6은 혈관 및 기도 평활근 세포(SMC) 모두에 존재하고 혈관 및 심장계에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 작용제에 의한 자극 또는 혈관내압의 상승은 막을 탈분극화하는 것으로 간주된다. 이어서, 결국 근육 수축을 매개하고 혈관수축을 반영하는, L형 전압개폐성(voltage-gated) Ca² ⁺ 채널이 활성화된다(베일리스(Bayliss) 효과). 이에 반해, 작용제 유도성 기관지수축은 주로 전압독립성 채널(예, TRPC6)에 의해 매개되는 Ca² ⁺ 유입에 의존적이어서, L형 Ca² ⁺ 채널은 천식 및 만성 폐색성 폐 질환(COPD) 등에는 효과적이지 않다. 특발성 폐동맥 고혈압(IPAH)을 앓고 있는 환자의 폐동맥 SMC(PASMC)는 과다증식성이고 TRPC6(및 TRPC3) 발현은 상당히 증가한다. PASMC 과다증식은 TRPC6 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 보센탄(IPAH 환자의 치료용으로 승인된 엔도텔린 수용체 차단제) 치료 후에 현저하게 감소된다. 또한, TRPC6은 백혈구에서도 발견되어 천식 및 COPD에서 염증 반응을 매개하는 것으로 생각된다. 따라서, TRPC6 저해는 IPAH, 진행성 수명단축성 질환(우심부전), 및 다른 만성 호흡기 질환을 치료하기에 유익한 치료 전략인 것으로 보인다. 그러나, TRPC6은 또한 차단되어야 하는 기도 SMC에서 생리적 기능을 나타내기도 한다.이는 급성 저산소폐혈관수축(HPV)을 조절하는데 필요하다. 혈류는 급성 저산소 상태 하에 적당한 기체 교환을 유지하면서 환기불량 지역에서 환기양호 지역으로 유도된다. 폐렴에서 발생하는 것과 같은 HPV의 장애, 성인호흡곤란증후군 및 간부전은 생명을 위협하는 저산소증을 일으킬 수 있다. TRPC6은 HPV에서는 필수적이나, 폐혈관고혈압 및 만성 저산소증으로 인한 개형(remodeling)에는 연관되지 않는다. 말기 신장 질환의 중요한 원인인, 유전성 국소분절사구체경화증(FSGS)에 TRPC6 연관성의 납득할만한 증거도 또한 제시되었다. TRPC6 기능획득(gain-of-function) 돌연변이체는 족세포(podocyte)의 족 돌기(foot process)에 Ca² ⁺ 유입을 증가시키지만, 이것이 질환 유발성인지 그리고 어떻게 질환을 유발하는 것인지는 알려지지 않았다. 상기 세포는 사구체 열공 격막과 함께 사구체 필터의 중요한 부분을 형성하고, 그 손상은 단백뇨를 초래한다. 사구체 필터는 극히 중대한 열공 격막 성분인 네프린 결손성인 돌연변이 마우스에서 방해를 받는다. TRPC6은 과발현되고 이러한 마우스의 족세포에 잘못 위치되어 있다. 최근, TRPC6 발현은 또한 보체-처리된 족세포에서 상향조절되어 액틴 세포골격 재배열을 야기하는 반면, 생체내 일시적 채널 과발현은 마우스의 단백뇨를 야기했다. TRPC6 결손성 마우스는 예상치못한 놀라운 표현형을 나타낸다. 전술한 채널의 제안된 생리적 기능과 반대로, 이 동물은 기관지수축제에 대한 반응으로 기도 평활근 과다반응, 산화질소(NO) 신타제의 저해에 의해 추가 증가될 수 있는 상승된 평균 동맥 혈압, 및 베일리스 효과(과대 반사 혈관수축)를 유도하는데 필수적인 혈관내압의 저하된 역치를 나타냈다. 또한, TRPC6^-/- 마우스의 SMC에 기본 및 작용제-유도성 양이온 진입이 더 높다. 부분적으로, 이것은 근연성 채널인 TRPC3의 발현 증가에 의해 설명될 수 있다. 이것은 기본 활성이 더 높고, 혈관수축제에 의해 덜 엄격하게 조절되며, 결과적으로 과다보완된 TRPC6 녹아웃을 나타내어, 두 채널이 기능적으로 중복되지 않는다는 것을 증명한다. 정반대의 시도는 심장 비대의 발병기전에서 TRPC6의 역할을 드러냈다. 돌연변이 마우스에서 심장 특이적 TRPC 과발현은 활성화된 T 세포(NFAT) 자극의 핵 인자(nuclear factor)에 칼시뉴린을 통해 커플링하는 Ca² ⁺ 유입을 증가시킨다. 병리학적 심장 개형을 가속화시켰고, 이 마우스의 수명을 단축시켰다. 심근세포(cardiomyocyte)에서 생체내 TRPC6 상향조절은 비대에 관여하는 반면, 시험관내 심장 섬유아세포에서는 보호적 항섬유증 기능을 나타내는 것으로 보인다. 또한, 생체내 연구는 TRPC6 조절의 치료적 가치를 추정하고, 심부전의 발병기전에 TRPC3 및 TRPC3/6 헤테로머의 관여를 추정하는데 필요하다.

TRPC7은 눈, 심장 및 폐에서 발현되고, 이보다 낮은 전사체 수준이 뇌, 비장 및 고환에서 발견되지만, 이의 생리학적 기능은 아직 분명하지 않다.

TRPC4/5 서브패밀리: 이 채널은 64% 동일성을 공유하고 TRPC1과 근연성이 가장 크다(일부 그룹은 TRPC1을 이 서브패밀리로 분류하도록 권고하고 있다). TRP 및 다른 저장작동(store-operated) 채널 간의 독특한 특징은 G_q _/11-수용체 매개 활성화 후 란탄계열원소(예, Gd³ ⁺, La³ ⁺)에 의한 강화이다. TRPC3/6/7 서브그룹과는 대조적으로, DAG 적용에 의해 직접 활성화되는 것이 아니고, 여러 내인성 TRPC5 활성인자, 즉 리소포스파티딜콜린(LPC) 및 스핑고신 1-포스페이트(S1P)가 동정되었다. 산화질소(NO) 등에 의한 S-니트로실화는 TRPC4 및 TRPC5를 모두 활성화시키는 것으로 밝혀졌다.

TRPC4는 마우스에서 녹아웃되는 최초의 TRP 유전자였다. 이는 광범위하게 발현되고, 내피 및 평활근 세포에서 발견된다. TRPC4^-/- 마우스는 생육성이고 성숙하게 된다. 하지만, TRPC4^-/- 마우스의 내피 세포에 작용제 유도성 Ca² ⁺ 진입은 크게 감소하여 내피 의존적 혈관이완을 현저하게 감소시킨다. 또한, 혈관 손상의 발병기전에 관여하는 중요한 염증 매개인자인 트롬빈을 이용한 연구가 수행되었다. 폐에서, 트롬빈은 혈관 투과성 및 이에 따라 조직 수분 함량을 증가시킨다. TRPC4^-/- 마우스의 폐 EC는 트롬빈 유도성 액틴 스트레스 섬유 형성이 부족하고, 세포 수축이 손상되어, 이어서 폐 미세혈관 투과성이 약 50% 정도 감소했다. 또한, TRPC4는 중추신경계 내의 다른 세포에서 발현되고 신경전달물질 방출에 관여하는 것으로 보인다. TRPC4^-/- 마우스 유래의 시상 신경세포간 F2 말단에서, 5-하이드록시트립타민(5-HT, 세로토닌)의 적용 이후에 γ-아미노부티르산(GABA)의 방출이 급격히 감소한다. 이에 반해, 대사성 글루타메이트 수용체의 자극 후의 GABA 방출은 변하지 않는다. 시상은 수면과 기상을 조절하고, TRPC4는 수면/기상 주기에 따라 가시적 정보의 프로세싱에 참여할 수 있다. 췌장 β-섬에서 발현된 TRPC4는 인슐린 분비에 관여할 수 있지만, 글루코스 내성 검사 결과는 야생형 및 TRPC-결손 마우스에서 유사했다. 마지막으로, 이 채널은 ICC(interstitial cells of Cajal)의 심박조율기 활성을 조절하여 위장관 운동성을 조절하는데 관여하는 것으로 보인다.

TRPC5는 뇌에서 고농도이고, 또한 SMC와 같은 말초에서도 발견되었다. 사람의 경우, 이 유전자는 비증후성 정신지체와 관련이 있는 X 염색체의 영역에 위치한다. 래트 해마 신경세포의 성장원뿔에서 발현된 TRPC5 호모머는 성장원뿔 형태뿐만 아니라 신경돌기 외성장(outgrowth)을 조절한다. 우성-음성 돌연변이체의 형질감염에 의한 기능성 채널 억제는 비정상적으로 연장된 신경돌기를 야기하는 반면, 과발현은 신경돌기 외성장 저해를 초래했다. 소포로부터 원형질막 내로 포스파티딜이노시톨 4-포스페이트 5-키나제(PIP(5)Kα)-의존적 채널 삽입은 TRPC5에 의한 신경돌기 길이 조절에 중요한 것으로 증명되었다. 또한, TRPC5는 심혈관계 내에서 다기능적으로 중요할 수 있다. 우성-음성 TRPC5 돌연변이체는 혈관 평활근 세포의 스핑고신 1-포스페이트(TRPC5 활성화인자)에 의해 자극된 세포 운동성을 저해했고, 이와 동일한 효과가 항-TRPC5 항체에 의해 달성되었다. SMC 운동성은 상처 치유와 같은 생리학적 적응 과정에 중요하나, 죽상동맥경화증과 같은 염증성 폐색 질환에도 관여한다. 고혈압 환자 유래의 단핵구에서는 증가된 TRPC5 발현 및 채널 매개의 Ca² ⁺ 유입이 보고되었다. 또한, TRPC5 단백질 발현 및 활성(뿐만 아니라 TRPC4, NCX 및 여러 전사 인자의 발현 및 활성)의 보완성 상향조절은 신생 래트의 심근세포에서 Ca² ⁺-ATPase SERCA2의 siRNA 매개의 하향조절에 의해 관찰되었다. 말기 특발성 확장성 심근병증 환자의 쇠약한 사람 심장에서는 TRPC5가 심지어 선택적으로 상향조절되었고, 이에 반해 TRPC3 mRNA와 단백질은 검출되지 않았고, TRPC1, TRPC4 및 TRPC6 발현 수준은 변경되지 않았다. 이러한 데이터를 기초로 하여, 심장 비대에 TRPC5(및 TRPC4)의 관여를 유추할 수 있다.

본 발명에 따르면, 제1 단백질은 또한 본 명세서에 정의된 바와 같은 임의의 TRPC의 기능적 활성 변형체를 함유하거나, 이것으로 이루어질 수 있다. TRPC의 기능적 활성 변형체는 하나 이상의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 TRPC로부터 유래될 수 있되, 여전히 자연 발생의 SESTD1에 결합할 수 있다. 변형체는 SESTD1 및/또는 SESTD1의 Spec1에 결합하는 역량을 제공하는 SESTD1 결합 도메인을 함유하는 TRPC의 단편인 것이 바람직하다. SESTD1에 대한 변형체의 결합은 실시예 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 기술된 바와 같이 조사될 수 있다.

SESTD1에 대한 기능적 활성 변형체의 친화도(K_D=k_off/k_on)는 자연발생의 TRPC, 특히 TRPC4 또는 TRPC5의 적어도 약 0.1 K_D, 더욱 바람직하게는 적어도 약 0.3 K_D, 더 더욱 바람직하게는 적어도 약 0.5 K_D, 더 더욱 바람직하게는 적어도 약 0.7 K_D, 가장 바람직하게는 적어도 약 1 K_D에 이른다. 다른 분자에 대한 단백질의 친화도는 방사능리간드 및 형광 마커 등과 같은 표지된 마커를 이용한 결합 연구를 비롯한 다양한 표준 기술을 이용해서 측정할 수 있다.

기능적 활성 변형체는 임의의 자연 발생의 TRPC의 단편일 수 있다. 대안적으로, 기능적 활성 변형체는 또한 2종 이상의 다른 TRPC의 분절 또는 도메인을 함유하는 키메릭 TRPC일 수 있다. 또한, 기능적 활성 변형체는 TRPC에 대한 변형체의 결합 성질을 변경시킬 수 있는 돌연변이(예, 치환, 부가 및/또는 결실)를 보유하는 하나 이상의 분절을 포함할 수도 있다. 하지만, 변형체는 자연 발생의 SESTD1 및/또는 SESTD1의 Spec1에 여전히 결합할 수 있는 것으로 정의된다.

본 발명의 한 양태에서, 기능적 활성 변형체는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3에 상동성인 서열을 함유하거나 이 서열로 이루어진 TRPC 변형체인 것으로 정의된다. 이 서열은 자연 발생의 TRPC의 단편인 것이 바람직하다. 다양한 TRPC 단백질의 서열은 NCBI(National Center of Biotechnology Information)와 같은 단백질 데이터베이스에서 유래될 수 있고, 상동성 서열은 숙련된 자에게 공지된 적당한 정렬 프로그램에 따라 동정될 수 있다.

본 발명의 한 양태에서, 본 발명의 제1 단백질은 마커, 특히 태그(tag)를 함유한다.

본 발명의 상황에서 마커는 쉽게 검출할 수 있는 임의의 종류의 분자일 수 있다. 본 발명에서, 분자는 TRPC 또는 이의 기능적 활성 변형체에 결합되고, 이에 따라 마커의 존재는 제1 단백질의 존재를 나타낸다. 마커(또한, 표지라고도 언급함)는 당업자에게 공지되어 있고, 예컨대 방사능표지(예, ³H, ³²P, ³⁵S 또는 ¹⁴C), 형광 마커(예, 플루오레세인, 녹색 형광 단백질, 황색 형광 단백질 또는 DyLight 488), 효소(예, 양고추냉이 퍼옥시다제, β-락타마제, 알칼리성 포스파타제 또는 β-글루코시다제) 또는 적당한 항체 또는 항체 단편에 의한 항원-검출가능물질이 포함된다.

마커는 태그인 것이 바람직하다. 태그는 보통 생화학적 지표인자로서 사용되는 펩타이드 또는 단백질이다. 태그는 단백질, 예컨대 재조합 발현 단백질에 포함될 수 있고 여러 목적으로 사용될 수 있다. 태그는 특정 태그에 적합한 표준 조건을 사용해서 태그가 부착된 단백질을 정제하는데 사용되는 것이 바람직하다. 하지만, 태그는 특정 단백질의 존재를 검출하기 위해 지표인자로도 사용될 수 있다.

현재 공지된 태그(친화도)는 다수가 있다. 이들은 보통 크기에 따라 3가지 클래스로 분류되고; 작은 태그는 아미노산 수가 최대 12개이고, 중간 크기의 태그는 아미노산 수가 최대 60개이며, 큰 태그는 60개가 넘는 것이다. 작은 태그는 Arg-태그, His-태그, Strep-태그, Flag-태그, T7-태그, V5-펩타이드-태그 및 c-Myc-태그를 포함하고, 중간 크기의 태그는 S-태그, HAT-태그, 칼모둘린-결합 펩타이드, 키틴-결합 펩타이드 및 일부 셀룰로스 결합 도메인을 포함한다. 후자는 최대 189개의 아미노산을 함유할 수 있고, GST(글루타티온-S-트랜스퍼라제) 및 MBP-태그(말토스 결합 단백질-태그)와 같이 큰 친화도 태그로서 간주된다.

특히 순수한 단백질을 생산하기 위해, 소위 2중 태그 또는 직렬 태그가 개발되었다. 이 경우에, 단백질은 2가지 다른 크로마토그래피 단계로, 각 경우마다 제1 태그의 친화도 및 그 다음 제2 태그의 친화도를 이용하여 정제한다. 이러한 2중 또는 직렬 태그의 예는 GST-His-태그(폴리히스티딘-태그에 융합된 글루타티온-S-트랜스퍼라제), 6xHis-Strep-태그(Strep-태그에 융합된 6 히스티딘 잔기), 6xHis-태그100-태그(포유동물 MAP-키나제 2의 12-아미노산 단백질에 융합된 6 히스티딘 잔기), 8xHis-HA-태그(헤마글루티닌-에피토프-태그에 융합된 8개 히스티딘 잔기), His-MBP(말토스-결합 단백질에 융합된 His-태그), FLAG-HA-태그(헤마글루티닌-에피토프-태그에 융합된 FLAG-태그) 및 FLAG-Strep-태그이다.

본 발명의 제1 단백질은 His-태그, Arg-태그, Strep-태그, Flag-태그, T7-태그, V5-펩타이드-태그, c-Myc-태그, S-태그, HAT-태그, 칼모둘린-결합 펩타이드-태그, 키틴-결합 펩타이드-태그, GST-태그 및 MBP-태그로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 태그를 함유하는 것이 바람직하다. 하지만, 임의의 다른 태그도 사용할 수 있지만, His-태그, Arg-태그, Strep-태그, Flag-태그 또는 GST-태그와 같은 일부 태그가 바람직하다. 태그를 함유하는 TRPC 또는 이의 변형체의 적당한 예는 또한 실시예에 제시된다.

본 발명의 한 양태에서, 제1 단백질은 마커 또는 태그를 함유하며, 여기서 마커 또는 태그는 효소 절단 부위와 같은 특정 절단 부위에서 단백분해 절단에 의해 단백질로부터 제거가능하다. 이것은 TRPC 또는 이의 기능적 활성 변형체와 마커 또는 태그 사이에 위치할 수 있다. 절단 부위는 예컨대 프로테아제 절단 부위일 수 있다. 프로테아제의 예는 키모트립신, 트립신, 엘라스타제 및 플라스민이고; 해당 절단 부위는 당업자에게 공지되어 있다. 정제할 분자가 단백질이기 때문에, 특정 프로테아제, 특히 정상적으로 식물을 공격하는 바이러스 유래의 프로테아제가 바람직하다. 적당한 특정 프로테아제의 예는 트롬빈, 제Xa 인자, Igase, "담배식각바이러스" 유래의 TEV-프로테아제, 프로테아제 PreScission(Human Rhinovirus 3C 프로테아제), 엔테로키나제 또는 Kex2이다. TEV-프로테아제 및 PreScission이 특히 바람직하다.

제2의 대안예와 관련하여, 본 발명의 복합체의 제1 단백질은 앞에서 정의한 서열번호 1의 서열을 보유하는, 전형적 TRPC 또는 이의 기능적 활성 변형체의 도메인이다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 서열번호 1의 의무적 서열은 다음과 같이 추가 정의될 수 있고, 여기서 가변 아미노산 X는 다음과 같은 지수로 구체화된다: LX₁X₂X₃X₄X₅YQEVX₆RNLVKRYVAAMIRX₇X₈KT(서열번호 1):

- X₁X₂X₃X₄X₅는 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개, 더욱 바람직하게는 4개 또는 심지어 5개의 극성 아미노산 잔기(예, Asn 또는 Gln), 경우에 따라 염기성 아미노산 잔기(예, Arg 또는 His)를 포함하고, 특히 X₁X₂X₃X₄X₅의 부분 서열은 서열번호 2 또는 서열번호 3에 정의된 바와 같은 것일 수 있다;

- X₆은 바람직하게는 더 큰, 비극성 아미노산 잔기(예, Ile, Leu 또는 Met)이고/이거나;

- X₇X₈은 바람직하게는 산성 및 극성/중성 아미노산 잔기의 배합(예, Glu 및 Ala) 또는 2개의 극성/중성 아미노산 잔기의 배합(예, Asn 및 Ser)이며, X₇X₈의 부분 서열은 서열번호 2 또는 서열번호 3에 정의된 바와 같은 것일 수 있다.

본 발명의 더욱 바람직한 양태에서, 서열번호 1의 서열은 다음과 같이 추가로 정의될 수 있다:

- X₆은 바람직하게는 더 큰, 비극성 아미노산 잔기(예, Ile, Leu 또는 Met)이고;

아미노산 측쇄의 성질은 다음과 같이 정리된다:

본 발명의 제2 대안예와 관련하여 전형적 TRPC의 기능적 활성 변형체는 제1 대안예에서 제1 단백질에 대해 정의한 바와 같다.

바람직한 양태에서, 기능적 활성 변형체는 앞에서와 같이 정의될 수 있고, 서열번호 1의 서열은 다음과 같이 추가로 정의된다:

- 서열번호 2 또는 서열번호 3으로부터 하나 이상의 아미노산 치환에 의해, 바람직하게는 최대 8개, 7개, 6개 또는 5개, 더욱 바람직하게는 4개, 더 더욱 바람직하게는 최대 3개, 더 더욱 바람직하게는 최대 2개, 가장 바람직하게는 최대 1개의 아미노산 치환에 의해 유래되고; 이러한 아미노산 치환 중 1개 이상은 이하에 정의되는 바와 같은 보존적 아미노산 치환이거나,

또는

- 임의의 자연 발생의 TRPC(상기 참조)에서 유래되는 것으로 정의된다.

보존적 치환은 측쇄와 화학적 성질이 관련이 있는 아미노산 패밀리 내에서 일어나는 치환이다. 이러한 패밀리의 예는 염기성 측쇄, 산성 측쇄, 비극성 지방족 측쇄, 비극성 방향족 측쇄, 비하전성 극성 측쇄, 작은 측쇄, 큰 측쇄 등을 보유하는 아미노산이다. 한 양태에서, 1개 보존적 치환이 펩타이드에 포함된다. 다른 양태에서는 2개의 보존적 치환 또는 그 이하가 펩타이드에 포함된다. 또 다른 양태에서는 3개의 보존적 치환 또는 그 이하가 펩타이드에 포함된다.

보존적 아미노산 치환의 예는 이하에 열거된 것을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다:

제1 단백질의 제1 및 제2 대안예의 상황에서, TRPC는 TRPC4, TRPC5 및 TRPC6으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 바람직하고, 특히 TRPC4 또는 TRPC5, 특히 TRPC4α 또는 TRPC4β 또는 TRPC5이다.

본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 제1 단백질은 서열 LRRHHQYQEVMRNLVKRYVAAMIREAKTE(서열번호 2) 또는 LIQNQHYQEVIRNLVKRYVAAMIRNSKTN(서열번호 3)을 포함한다.

물론, 본 발명의 상황에서, TRPC는 임의의 종에서 유래될 수 있다. 하지만, 포유동물의 TRPC, 예컨대 사람, 래트, 마우스, 고양이, 개 또는 말에서 유래된 것, 특히 쥐 또는 사람 TRPC가 바람직하다.

본 발명의 복합체의 제2 단백질은 SESTD1의 Spec1 도메인을 함유하거나 이것으로 이루어진다. 사람 SESTD1의 서열은 진뱅크 등록번호 NP_835224에 개시되어 있다. 하지만, 자연 발생의 변형체도 공지되어 있고, 예컨대 하나는 사람 대동맥 cDNA 라이브러리의 전체 길이에서 발견되었다. 이의 아미노산 서열은 하나의 교환(H508Q)외에는 진뱅크 등록번호 NP_835224와 동일하다. 이는 게놈 BLAST에서도 발견될 수 있는 1571번에서의 점 돌연변이(NM_178123)를 기초로 한다. 1748번에서 발견되는 다른 점 돌연변이는 침묵 돌연변이이다. Spec1 도메인은 앞에서 특정한 SESTD1의 아미노산 233 내지 381로 이루어진다(또한, 도 1 참조). 본 발명에 따르면, 대안적 자연 발생의 SESTD1 유래의 상동성 Spec1 서열도 사용될 수 있다. 대안적 SESTD1은 다른 종 또는 기관 또는 피검체에서 유래될 수 있다. 다양한 SESTD1 단백질의 서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)와 같은 단백질 데이터베이스에서 유래될 수 있고, 상동성 서열은 적당한 정렬 프로그램에 의해 동정될 수 있다.

본 발명에 따르면, 제2 단백질은 Spec1 도메인이 존재하는 한, 자연 발생의 SESTD1의 단편일 수 있다. 하지만, Spec1 도메인에는 또한 임의의 자연 발생의 SESTD1과 관련이 없는 하나 이상의 아미노산 서열(C- 및/또는 N-말단)이 부가될 수 있다. 하나 이상의 아미노산 서열이 SESTD1에 부가되는 경우에는 아미노산 치환(10개 이하와 같이 제한된 수가 바람직하다), 바람직하게는 앞에서 정의한 바와 같은 보존적 치환을 추가로 포함할 수 있는 자연 발생의 SESTD1의 분절(단편 또는 키메라를 산출함)이다.

또한, 제2 단백질은 본 발명의 제1 단백질과 관련하여 정의한 바와 같은 마커 또는 태그를 포함할 수 있다. SESTD1 또는 이의 단편 및 GST-태그를 함유하는 단백질의 예는 도 5에 예시한다.

본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 제2 단백질은 SESTD1이 앞에서 정의한 바와 같은 것일 수 있는 전체 길이의 SESTD1을 함유하거나 이것으로 이루어진 것이다.

물론, 본 발명의 상황에서, SESTD1은 임의의 종에서 유래될 수 있다. 하지만, 포유동물의 SESTD1, 예컨대 사람, 래트, 마우스, 고양이, 개 또는 말에서 유래되는 것, 특히 래트, 쥐 또는 사람 SESTD1이 바람직하다.

본 발명의 제3 관점은

- 본 발명의 상황에서 앞에서 정의한 바와 같은 제1 단백질,

- 본 발명의 상황에서 앞에서 정의한 바와 같은 제2 단백질 및

- 제1 단백질과 제2 단백질의 상호작용을 검출하는 수단을 함유하는 검사 시스템에 관한 것이다.

전술한 바와 같이, TRPC 패밀리의 구성원들의 생리적, 병리생리학적 및 생화학적 역할에 대해서는 아직 충분히 밝혀지지 않았다. 따라서, TRPC의 기능 및 조절을 연구하기 위한 수단 및 이를 조절하는 물질이 필요하다. 본 발명의 검사 시스템은 TRPC의 기능과 활성을 밝혀내기 위해 사용될 수 있다. 특히, TRPC 및 SESTD1을 포함하는 기전은 본 발명의 검사 시스템을 이용하여 연구할 수 있다.

이러한 검사 시스템이 사용될 수 있고, 이러한 검사 시스템이 적용될 수 있는 일련의 검사는 당업계에 공지되어 있다. 이는 불균질 또는 균질 분석일 수 있다. 본 명세서에 사용된, 불균질 분석은 1 이상의 세척 단계를 포함하는 분석이지만, 균질 분석에서는 이러한 세척 단계가 필요 없다. 시약 및 화합물은 단지 혼합되고 측정된다.

한 양태에서, 분석은 ELISA(enzyme linked immuno sorbent assay), DELFIA(dissociation-enhanced lanthanide fluoro immuno assay), SPA(scintillation proximity assay), 플래시플레이트 분석, FRET(fluorescence resonance energy trasfer) 분석, TR-FERT(time-resolved fluorescence resonance energy transfer) 분석, FP(fluorescence polarisation) 분석, ALPHA(amplified luminescent proximity homogenous assay), EFC(enzyme fragment complementation) 분석, 2중 하이브리드 분석 또는 공동면역침전 분석이다.

ELISA 기반의 분석은 많은 회사에서 제공되고 있다. 이는 샘플 내의 항체 또는 항원의 존재를 검출하는데 사용되는 생화학적 기술이다. ELISA의 수행은 특정 항원(예, 제1 또는 제2 단백질의 분절)에 특이성이 있는 적어도 하나의 항체를 포함한다. 일반적으로, 샘플 중의 미지량의 항원이 표면에 고정화된다. 그 다음, 표면 상의 특정 항체를 세척한다. 이 항체는 색 또는 형광의 변화와 같이 검출가능한 시그널을 생산하는 효소에 결합된다. 예컨대, 미지량의 항원을 보유한 샘플은 고상 지지체(보통 미세역가 플레이트)에 비특이적(표면에 흡착을 통해) 또는 특이적("샌드위치" ELISA에서, 동일 항원에 특이적인 다른 항체에 의한 포획을 통해)으로 고정화된다. 항원이 고정화된 후, 검출 항체를 첨가하여 항원과 복합체를 형성시킨다. 검출 항체는 효소에 공유 결합할 수 있거나, 또는 생체접합(bioconjugation)을 통해 효소에 결합되는 제2 항체에 의해 검출될 수 있다. 각 단계마다 플레이트는 일반적으로 온화한 세정제 용액으로 세척하여 특이적으로 결합되지 않은 임의의 단백질 또는 항체를 제거한다. 최종 세척 단계후, 플레이트는 효소적 기질을 첨가하여 발색시켜, 샘플 중의 항원의 양을 나타내는 가시적 시그널을 수득한다. 구 ELISA는 발색원성 기질을 이용하는 반면, 신 ELISA는 감도가 훨씬 큰 형광원성 기질을 이용한다.

DELFIA(dissociation enhanced lanthanide fluoro immuno assay)계 분석은 고상 분석이다. 항체는 일반적으로 유로퓸 또는 다른 란탄족원소에 의해 표지되고 유로퓸 형광은 미결합된 유로퓸 표지된 항체를 세척해낸 후에 검출한다.

SPA(scintillation proximity assay) 및 플래시플레이트 분석은 일반적으로 방사능표지된 기질을 포획하기 위한 비오틴/아비딘 상호작용을 이용한다. 일반적으로, 반응 혼합물은 키나제, 비오틴화된 펩타이드 기질 및 γ-[P³³]ATP를 포함한다. 반응 후, 비오틴화된 펩타이드는 스트렙타비딘에 의해 포획된다. SPA 검출에서, 스트렙타비딘은 섬광제 함유 비드 상에 결합되는 반면, 플래시플레이트 검출에서 스트렙타비딘은 섬광제 함유 마이크로플레이트의 웰 내부에 결합된다. 고정화된 후, 방사능표지된 기질은 발광을 자극하기 위해 섬광제에 충분하게 근접시킨다.

형광 공명 에너지 전이(FRET)는 두 발색단 사이에 무방사선(radiation-free) 에너지 전이를 나타낸다. 공여체 발색단은 여기 상태에서 근접해 있는(보통 <10nm) 수용체 형광단에 비방사성 긴 범위 쌍극자-쌍극자 커플링 기전에 의해 에너지를 전이시킬 수 있다. 두 분자가 형광성일 때, 에너지 전이는 이 에너지가 실제 형광에 의해 전이되지는 않을지라도 종종 "형광 공명 에너지 전이"라고도 불린다. FRET는 단백질-단백질 상호작용, 단백질-DNA 상호작용 및 단백질-입체형태 변화를 검출 및 정량화하는데 유용한 도구이다. 한 단백질의 다른 단백질에 대한 결합 또는 한 단백질의 DNA에 대한 결합을 모니터링하기 위해서는 분자 중 하나를 공여체로 표지화하고, 다른 분자는 수용체로 표지화하며, 이와 같이 형광단-표지화된 분자를 혼합한다. 이들이 미결합 상태로 존재할 때, 공여체 방출은 공여체 여기 시에 검출된다. 분자의 결합 시에, 공여체와 수용체는 근접해 있고, 공여체에서 수용체로의 분자간 FRET로 인해 수용체 방출이 주로 관찰된다. FRET의 적합한 이웃은 당업계에 공지되어 있고, 당업자는 두 항체의 적당한 표지 조합을 선택할 수 있을 것이다. 본 발명에 사용된 공여체와 이에 대응하는 수용체와 관련하여, "대응하는"은 공여체의 방출 스펙트럼과 중복하는 여기 스펙트럼을 가진 수용체 형광 잔기를 의미한다. 하지만, 두 시그널은 서로 분리될 수 있어야 한다. 따라서, 수용체의 방출 스펙트럼의 최대 파장은 공여체의 여기 스펙트럼의 최대 파장보다 바람직하게는 적어도 30nm, 더욱 바람직하게는 적어도 50nm, 예컨대 적어도 80nm, 적어도 100nm 또는 적어도 150nm 이상 커야한다.

FRET 기술에서 다양한 수용체 형광 잔기와 함께 사용될 수 있는 대표적인 공여체 형광 잔기로는 플루오레세인, 루시퍼 옐로우, B-피코에리트린, 9-아크리딘이소티오시아네이트, 루시퍼 옐로우 VS, 4-아세트아미도-4'-이소티오시아네이토스틸벤-2,2'-디설폰산, 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아네이토페닐)-4-메틸쿠마린, 석신이미딜 1-피렌부티레이트 및 4-아세트아미도-4'-이소티오시아네이토스틸벤-2,2'-디설폰산 유도체를 포함한다. 대표적인 수용체 형광 잔기는 사용된 공여체 형광 잔기에 따라 LC-Red 610, LC-Red 640, LC-Red 670, LC-Red 705, Cy5, Cy5.5, 리사민 로다민 B 설포닐 클로라이드, 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트, 로다민 x 이소티오시아네이트, 에리트로신 이소티오시아네이트, 플루오레세인, 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트 또는 란탄계열 이온(예, 유로퓸 또는 테르븀)의 다른 킬레이트를 포함한다. 공여체 및 수용체 형광 잔기는 예컨대 Molecular Probes (Junction City, OR) 또는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO)에서 수득할 수 있다.

대안적으로, 시간-분해 형광 공명 에너지 전이(TR-FRET)는 본 발명의 검사 시스템으로 사용될 수 있다. TR-FRET는 TRF(시간 분해 형광) 및 FRET 원리를 일체화한 것이다. 이 조합은 TRF의 낮은 배경 이점과 FRET의 균일 분석 포맷을 합친 것이다. FRET는 이미 앞에서 설명했고, TRF는 란탄계열원소 또는 반감기가 긴 임의의 다른 공여체의 독특한 성질을 이용한다. TR-FRET의 적당한 공여체는 무엇보다도 마이크로초 내지 밀리초 시간 범위의 형광 반감기를 나타낼 수 있고, 이로써 마이크로초 또는 밀리초 치수로 에너지 전이가 일어날 수 있게 하는 란탄계열원소 킬레이트(크립테이트) 및 일부 다른 금속 리간드 착물을 포함한다. 형광 란탄계열 킬레이트는 70년대 후반에 에너지 공여체로 사용되었다. 상용화된 란탄계열원소는 사마리움(Sm), 유로퓸(Eu), 테르븀(Tb) 및 디스프로슘(Dy)을 포함한다. 이들의 특이적인 광물리학적 및 분광학적 성질로 인해, 란탄계열원소의 착물은 생물학의 형광 용도에서 주요 관심의 대상이다. 구체적으로, 이들은 종래 형광단들과 비교했을 때 큰 스토크스 이동(Stokes' shift) 및 매우 긴 방출 반감기(마이크로초 내지 밀리초)를 나타낸다.

보통, 유기 발색단은 수용체로 사용된다. 그 예로는 알로피코시아닌(APC)을 포함한다. TR-FRET 및 수용체의 적당한 세부사항은 WO 98/15830에 기술되어 있다.

형광 편광(FP) 기반 분석은 용액 중의 형광 기질 펩타이드를 여기시키기 위해 편광을 이용하는 분석이다. 이 형광 펩타이드는 용액에서 유리 상태이고 텀블링하여, 방출된 광이 편광소멸되게 한다. 기질 펩타이드가 더 큰 분자에 결합하면, 그 텀블링 속도는 크게 감소하고 방출된 광은 매우 편광된 상태를 유지한다.

본 발명의 추가 양태에서, 본 발명의 검사 시스템은 ALPHA(amplified luminescence proximity homogeneous assay)이다. ALPHA는 Packard BioScience에서 최초로 개발한 용액 기반 분석이다. ALPHA는 하나의 상호작용 파트너가 공여체 비드에 부착해 있고, 다른 것은 수용체 비드에 커플링되어 있으며, 둘 모두 직경이 약 250nm 정도인, 발광 기반의 근접 분석이다. 공여체 비드에는 감광제 화합물이 매립되어 있다. 이 화합물은 약 680nm 파장의 레이저광이 조사되면, 주위 산소가 에너지가 풍부한 수명이 짧은 1중항(singlet) 산소로 변환된다. 수용체 비드가 더 이상 근접해 있지 않으면, 1중항 산소는 시그널을 생산함이 없이 붕괴한다. 공여체 및 수용체 비드가 부착된 생체분자의 생물학적 상호작용에 의해 함께 가져오면(약 250nm), 공여체 비드에 의해 방출된 1중항 산소는 근처 수용체 비드에서 발광/형광 캐스캐이드를 개시하여, 520 내지 620nm 범위에서 크게 증폭된 시그널을 야기한다. 발광 시그널은 적당한 판독기로 검출한다. ALPHA 기술에 관한 더욱 상세한 설명은 문헌[Ullman et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91, 5426-5430]을 참고한다.

EFC(enzyme fragment complementation) 기반 분석 또는 등가 분석은 특히 고 처리량의 화합물 선별에 사용할 수 있다. EFC 분석은 2개의 단편, 즉 효소 수용체(EA) 및 효소 공여체(ED)로 이루어진 유전자조작된 β-갈락토시다제 효소를 기반으로 한다. 단편이 분리되면 β-갈락토시다제 활성은 없지만, 단편이 함께 존재하면 결합(보완)하여 활성 효소를 형성한다. EFC 분석은 피분석물이 특이적 결합 단백질, 예컨대 항체 또는 수용체에 의해 인식될 수 있는 ED-피분석물 접합체를 이용한다. 특이적 결합 단백질의 부재 하에, ED-피분석물 접합체는 EA를 보완하여 활성 β-갈락토시다제를 형성할 수 있고, 이는 양성 발광 시그널을 생산한다. ED-피분석물 접합체가 특이적 결합 단백질에 의해 결합하면, EA에 의한 보완이 방해를 받아, 시그널이 생기지 않는다. 유리 피분석이 제공되면(샘플에서), 특이적 결합 단백질에 결합하기 위해 ED-피분석물 접합체와 경쟁할 것이다. 유리 피분석물은 EA에 의한 보완을 위해 ED-비분석물 접합체를 방출할 것이고, 이는 샘플에 존재하는 유리 피분석물의 양에 의존적인 시그널을 생산할 것이다.

2중 하이브리드 선별은 두 단백질 사이의 물리적 상호작용(예, 결합)에 대해 검사하여 단백질-단백질 상호작용을 찾아내는데 사용되는 분자생물학 기술이다. 이 검사 전의 전제 사항은 상류 활성화 서열에 전사 인자의 결합으로 인한 하류 리포터 유전자(들)의 활성화이다. 2중 하이브리드 선별을 위해, 전사 인자는 2개의 분리 단편, 소위 결합 도메인(BD) 및 활성화 도메인(AD)으로 나뉘어져 있다. BD는 UAS에 결합하는데 책임이 있는 도메인이고, AD는 전사 활성화에 책임이 있는 도메인이다. 적당한 2중 하이브리드 시스템은 실시예 1에 설명되어 있다.

공동면역침전(co-immunoprecipitation)은 복합체에 존재하는 것으로 생각되는 하나의 단백질을 침전시켜 단백질 복합체를 동정하는데 사용될 수 있는데, 그 이유는 복합체의 다른 구성원도 역시 포획되어 동정될 수 있기 때문이다. 단백질 복합체는 특정 항체에 결합한 후 즉시, 아가로스 비드와 같은 고상 지지체에 부착된 항체-결합 단백질에 의한 포획에 의해 벌크 용액으로부터 제거된다. 이러한 항체-결합 단백질(단백질 A, 단백질 G, 단백질 L)은 세균에서 처음 분리되었고, 다양한 항체를 인식했다. 단백질 또는 단백질 복합체의 1차 포획 후, 고상 지지체는 항체를 통해 특이적이고 단단하게 결합되지 않은 임의의 단백질을 제거하기 위해 수회 세척한다. 세척 후, 침전된 단백질(들)은 용출시키고 겔 전기영동, 질량분광분석, 웨스턴 블로팅 또는 복합체의 성분을 동정하는 임의의 수의 다른 방법을 이용해서 분석한다. 따라서, 공동면역침전은 단백질-단백질 상호작용을 평가하는 표준 방법이다. 공동면역침전을 포함하는 적합한 검사 시스템은 실시예 3에 설명되어 있다.

본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 제1 단백질과 제2 단백질 사이에 상호작용을 검출하기 위한 수단은 하나 또는 그 이상의 인지질(들), 바람직하게는 포스파티딜-이노시톨-포스페이트를 계측하는 것으로 조정될 수 있다. 계측은 하나 또는 그 이상의 인지질(들), 바람직하게는 포스파티딜-이노시톨-포스페이트의 농도의 측정을 포함할 수 있다. 농도는 본 발명의 조절인자를 선별하는 방법에 설명된 바와 같은 잠재적 TRPC 조절인자에 대한 반응으로 계측할 수 있다. 하나 이상의 인지질(들), 바람직하게는 포스파티딜-이노시톨-포스페이트의 농도를 측정하는 수단 및 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 방사능표지된 인지질(들), 바람직하게는 포스파티딜-이노시톨-포스페이트(들)를 포함하는 것, 예컨대 칼럼 크로마토그래피 또는 질량 분광분석에 의해 정제를 포함한다. 하지만, PIP 스트립 인지질 오버레이 분석 또는 Cova-PIP 플레이트 결합 분석(각각 실시예 8a 및 8b에 예시됨)을 포함하는 수단 및 방법이 바람직하다.

예시적인 검사 시스템 및 이의 용도는 실시예 1 내지 8에 설명되어 있다.

검사 시스템은 고 처리량 선별용으로 조정되는 것이 바람직하다. 이 방법에서 다수의 화합물이 당해의 TRPC에 대하여 무세포 또는 전세포 분석으로 선별된다. 일반적으로, 이러한 선별은 자동 로봇 스테이션 기반 기술을 이용한 96웰 플레이트에서, 또는 고밀도 어레이("칩") 포맷에서 수행된다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 복합체의 각 단백질은 전술한 관점들과 양태들, 특히 바람직한 양태들로 특정화된 임의의 단백질일 수 있다. TRPC는 일련의 다른 단백질과 상호작용할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 검사 시스템은 추가로 안키린 반복 도메인 35(ANKRD35), 아포지단백질 A-I 결합 단백질(APOA1BP), 아연 핑거 도메인에 인접한 브로모도메인(BAZ1B), 고 이동성 그룹 단백질 2-유사1 이소폼 b(HMG2L1), 마코린 RING 핑거 단백질 1(MKRN1), B-전구세포 백혈병 호메오박스 상호작용 단백질 1(PBXIP1), 육종 항원 NY-SAR-48, 스펙트린 알파 비-적혈구성 단백질 1(SPTAN1), 염색체 3의 구조 유지 단백질(SMC3) 및 탈린 2(TLN2)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 단백질을 포함할 수 있다.

상기 단백질은 일반적인 검사 시스템에 적합한 임의의 종으로부터 수득할 수 있는 것이다. 하지만, 단백질 및 이의 서열은 예는 다음과 같다:

검사 시스템은 예컨대 TRPC 조절인자에 대한 이하의 선별 방법에 사용할 수 있다.

제4 관점에서, 본 발명은

a) 앞에서 특정화된 본 발명에 따른 검사 시스템을 물질과 접촉시키는 단계, 및

b) 검사 시스템과 물질의 상호작용시 측정가능한 시그널을 검출하여 TRPC 조절인자로서 상기 물질을 동정하는 단계를 포함하는 TRPC 조절인자의 선별 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 검사 시스템은 본 발명의 상세한 설명에서 구체화된 바와 같이, 특히 바람직한 양태에서 구체화된 바와 같이 특정될 수 있다. 검사 시스템은 세포 시스템 또는 무세포 시스템일 수 있다. 검사 시스템은 측정가능한 시그널을 검출하기에 적합한 조건 하에서 검사 물질과 접촉할 수 있다. 이것은 적당한 온도, 화학 환경(완충액, pH 값 등)뿐만 아니라 물질의 적당한 농도와 적당한 접촉 시간을 포함한다.

접촉 후, 또는 접촉과 동시에, 시그널이 관찰되고, 이러한 시그널의 검출은 제1 단백질과 제2 단백질의 상호작용을 시사한다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 전술한 바와 같은 제1 단백질과 제2 단백질 간의 상호작용에 물질이 미치는 영향은 직접 검출되며, 즉 제1 단백질과 제2 단백질의 근접성은 TRPC/SESTD1 시그널 전달의 하류 시그널이 아닌 시그널의 유도에 의해 검출된다. 시그널 유도는 각 성분을 표지화하여 실시할 수 있고, 이러한 표지들의 근접성이 검출가능한 시그널을 유도한다. 유도된 검출가능한 시그널은 화학발광 시그널, 색 변화, 형광 시그널, 방사능 또는 임의의 다른 적당한 시그널일 수 있다. 이 시그널은 검사 시스템의 한 성분, 즉 분리된 단백질 및 보조인자에 각 표지가 결합된, 2가지 표지들의 상호작용에 의해 유도될 수 있다. 이러한 시그널은 한편으로는 방사능표지, 예컨대 ¹²⁵I 및 다른 한편으로는 적당한 반응정지제(quencher)를 포함하여 섬광 계수기(섬광 근접 분석)에서 근접성을 검출할 수 있다. 성분들로는, FRET(fluorescence resonance energy transfer, 상기 참조)를 검출하는 방식으로 표지화된 항체에 접근할 수 있는 항원을 포함할 수 있다. 다른 대안예에서, 단백질 중 하나는 그 표면에 키나제에 의해 인산화할 수 있는 생체분자가 결합해 있고, 다른 성분은 예컨대 적당한 링커, 구체적으로 니트릴로트리아세트산, 이미노디아세트산 또는 적당히 치환된 N-함유 헤테로사이클, 예컨대 트리아조헤테로사이클, 예컨대 트리아조사이클로노나네오노난, 예컨대 1-프로필아미노-4-아세테이토-1,4,7-트리아자사이클로노난을 통해 표면에 복합체화된 3가 금속 이온을 보유한다. 화학발광 시그널은 보조인자에 단백질의 결합 시에 일어나는 공여체와 수용체 입자가 근접해 있을 때 발생한다(발광 근접 분석).

단백질-단백질 상호작용을 검출하기에 적합한 검사 및 분석은 앞에서 상세히 설명한 바와 같다.

본 발명의 바람직한 한 양태에 따르면, 단백질 간의 상호작용을 검출하는 수단은 제1 단백질 또는 제2 단백질에 특이적인 적어도 하나의 항체를 포함한다. 앞에서 상세히 설명한 바와 같이, 분리된 단백질은 특정 항체를 위한, 그리고 이 항체의 검출을 위한 항원을 포함할 수 있다. 본 발명의 더 더욱 바람직한 양태에 따르면, 검사 시스템은 2개의 항체를 포함하며, 여기서 제1 항체는 제1 단백질에 특이적이고 제2 항체는 제2 단백질에 특이적이다. 항체는 각 성분의 존재를 나타내는 적당한 마커로 표지화될 수 있다. 대안적으로, 전술한 1차 항체는 이 1차 항체에 대한 적당한 2차 항체로 검출할 수 있다. 2차 항체는 1차 항체(예컨대, 2차 항체에 결합되었을 때)의 존재를 검출하기 위해 사용할 수 있다. 1차 또는 2차 항체는 앞에서 정의한 마커, 예컨대 효소, 방사능표지, 형광 마커, 화학발광 마커 등으로 표지화될 수 있다. 대안적으로, 단백질은 적당한 항체에 의해 검출가능한 태그를 포함할 수도 있다.

검사 시스템은 복합체의 적어도 한 성분을 분리하기 위한 정제 시스템을 사용하고 복합체의 존재 또는 단백질 복합체의 각 성분의 존재를 검출하는 방식으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 복합체는 겔 전기영동, 칼럼 크로마토그래피, 친화도 정제 등으로 정제할 수 있고, 이 복합체는 복합체의 한 성분 또는 복합체의 두 성분을 나타내는 하나의 시그널 또는 두 시그널의 존재를 통해 검출할 수 있다. 예를 들어, 복합체의 한 성분에 특이적인 분리 기술이 사용된다면, 검출 방법은 다른 성분에 제한되는 것일 수 있다. 대안적으로, 정제 방법이 성분 중 하나에 특이적인 것이 아닌, 예컨대 겔 전기영동일 수 있고, 이 때 복합체의 형성은 2가지 시그널, 예컨대 두 시그널, 예컨대 구별가능한 형광 마커로 표지화된 두 항체에 의해 검출될 수 있고, 이 두 형광 마커의 존재는 예컨대 겔의 동일 부위에서 복합체를 나타낸다. 이에 따라, 제1 및/또는 제2 단백질은 검출가능한 마커를 포함한다. 또한, 측정가능한 시그널의 검출은 전술한 바와 같이 제1 단백질에 대한 특이적 항체 및/또는 제2 단백질에 대한 특이적 항체의 사용을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 양태에서, TRPC 조절인자는 제2 단백질에 대한 제1 단백질의 결합을 증강시키거나 또는 바람직하게는 손상시키거나 저해한다. TRPC의 조절인자는 당해의 TRPC의 활성을 변경시킨다. 활성의 변경은 활성화 또는 저해로, 각각 TRPC의 시그널 전달을 증강 또는 손상시킬 수 있다. TRPC의 활성을 증강, 향상 또는 증가시키는 조절인자는 작용제라고 부르고, 반면 TRPC의 활성을 손상, 저해 또는 감소시키는 TRPC 조절인자는 길항제라고 부른다. 활성의 조절은 TRPC와의 비특이적 상호작용의 결과(예, 변성)가 아닌 TRPC와의 특이적 상호작용을 기반으로 한다.

본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 측정가능한 시그널은 하나 또는 그 이상의 인지질(들), 바람직하게는 포스파티딜-이노시톨-포스페이트(들)이다. 인지질은 지질의 한 클래스이며, 당지질, 콜레스테롤 및 단백질과 함께 모든 생물 막의 주요 성분이다. 포스파티딜-이노시톨은 이노시톨 고리 상의 하이드록시 기 3, 4 및 5에서 다양한 키나제에 의해 여러 다른 조합으로 인산화될 수 있기 때문에 세포 시그널링에 관여하는 다수의 효소에 대한 기질이다. 인지질(들), 바람직하게는 포스파디틸-이노시톨-포스페이트(들)의 농도는 앞에서 설명한 바와 같이 측정할 수 있다.

본 발명의 선별 방법의 다른 양태에서, 검사 화합물(물질)은 화학적 화합물 라이브러리의 형태로 제공된다. 화학적 화합물 라이브러리는 복수의 화학적 화합물로, 임의의 여러 근원, 예컨대 화학 합성 분자 및 천연 산물로부터 조립된 것이거나, 또는 조합 화학 기술에 의해 제조된 것이다. 이것은 특히 고처리량 선별에 적합하다. 특히, 이것은 특정 구조의 화학적 화합물 또는 식물과 같은 특정 생물의 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 상황에서, 화학적 화합물 라이브러리는 단백질 및 폴리펩타이드 또는 소분자를 함유하는 라이브러리인 것이 바람직하다.

TRPC의 상기 기능들에 따라, 본 발명의 방법은 내피 기능이상을 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 선별에 사용할 수 있다.

특히, 이 방법은 심혈관 질환, 심장 비대, 심부전, 허혈, 신생내막 과형성, 특발성 확장성 심근병증, 고혈압, 심장동맥 증후군, 심장 부전, 신장 부전 및 혈전증; 천식, 만성 호흡기 질환, 만성 폐색성 폐 장애, 특발성 폐 고혈압, 급성 저산소폐혈관수축, 염증성 폐색 질환 및 죽상동맥경화증을 예방 및/또는 치료하는 약제의 선별에 사용할 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명은 TRPC 조절인자의 동정에 사용되는 전술한 본 발명에 따른 검사 시스템의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 검사 시스템 및 본 발명의 선별 방법에 대한 상기 세부사항이 유사하게 이용되어야 한다.

이하, 본 발명은 실시예와 도면으로 설명되며, 이들은 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.

실시예

실시예 1: 베이트(bait)로서 TRPC 를 이용한 효모 2중 하이브리드 ( Y2H ) 선별

내피 기능이상은 다양한 심혈관 질환의 주요 원인인 것으로 생각된다. 무엇보다도 TRPC4는 내피 기능에 중요한 역할을 하고 내피 의존적 혈관이완의 조절과 관련이 있고 산화적-스트레스 유도성 내피 손상에 기여할 수 있고 내피 장벽 기능에 관여한다.

MATCHMAKER 2중-하이브리드 시스템 3(Clontech, Mountain View, USA)은 효모 균주 AH109에서 mTRPC4α(aa615-974)의 세포질 C-말단과 상호작용하는 신규 단백질을 선별하기 위한 것이었다. 이 시스템은 4개의 리포터 유전자(ADE2, HIS3, lacZ, MEL1)의 상류에, 이의 해독 및 단백질 발현을 활성화시키는 전사 인자 GAL4의 결합을 기반으로 한다. DNA 결합 및 활성화는 물리적으로 분리될 수 있는 2가지 다른 단백질 도메인에 의해 매개된다(Fields S & Song O(1989). A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature 340, 245-246). mTRPC4α의 C-말단(aa615-974)은 베이트로 작용했다. 지금까지는 TRPC 채널의 X선 구조가 전혀 존재하지 않지만, 전압 개폐성 K⁺ 채널과의 유사성으로 인해 4량체를 형성할 것으로 예상된다. 본 발명자들은 이 단백질이 생리적 다량체 상태로 조립되는지를 확인하고 싶었다. 따라서, 단백질 4량체화를 유도하는 것으로 밝혀져 있는 류신 지퍼 도메인과 쥐 TRPC4α(NM_016984)의 C-말단을 융합시켜 베이트를 작제했다(Harbury PB, Zhang T, Kim PS, & Alber T(1993). A switch between two-, three-, and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants. Science 262, 1401-1407). 지퍼의 아미노산 서열(밑줄친 부분) 및 인접 서열은 다음과 같다: GGGSG SRMKQ IEDKL EEILS KLYHI ENELA RIKKL LGERG GSGS AAA (서열번호 4). 이 작제물을 최종적으로 pGBKT7 (Clontech, Mountain View, USA)에 통합시켜 GAL4-DNA 결합 도메인과 융합시켰다(mTRPC4α(615-974)/류신 지퍼/pGBKT7). 유도된 효모 2중 하이브리드 선별을 위한 다른 베이트는 사람 TRPC1(NM_003304), 쥐 TRPC5 (NM_009428) 및 사람 TRPC6 (NM_004621)의 C-말단을 이용하여 동일한 방식으로 작제했다. 대조 실험을 위해, 채널 C-말단을 증강 녹색 형광 단백질로 대체시켰다(EGFP/류신 지퍼/pGBKT7).

GAL4 활성화 도메인(AD)에 융합체로서 발현된 사람 대동맥 cDNA 라이브러리(pACT2 중에서, Clontech, Mountain View, USA)를 베이트와 함께 효모에 공동형질감염시켰다. 라이브러리 단백질과 베이트의 상호작용만이 DNA-BD와 AD를 충분하게 공간적으로 근접시켜, 기능적 GAL4를 재구성하여 리포터 유전자의 발현을 유도했다. 이는 영양요구성 효모 균주 AH109가 다른 필수 아데닌(Ade) 및 히스티딘(His)이 부족한 선택 배지에서 생존하게 했다. 더욱이, GAL4 활성은 X-gal의 청색 산물로의 변환에 의해 효모 콜로니에서 검출될 수 있는 β-갈락토시다제의 발현을 유도했다. 이러한 콜로니로부터의 프레이(prey) 플라스미드를 분리하고, 벡터의 다중 클로닝 부위로부터 cDNA 삽입물을 절단해내는 제한효소 EcoRI/XhoI로 분석적 분해했다. 수득되는 단편을 겔 전기영동으로 분리하여 동일한 크기의 단편은 동일한 프레이를 지시했다. 이어서, 이들을 역시 4량체화되고 DNA-BD에 융합된 에쿼리아 빅토리아(Aequorea victoria) 유래의 무관련성 증강 녹색 형광 단백질(EGFP/류신 지퍼/pGBKT7)과 함께 공동형질전환시켜 본래의 DNA-결합 및/또는 전사 활성에 대해 검사했다. EGFP와 비특이적으로 상호작용하지 않는 프레이로 공동형질전환된 효모는 -Trp/-Leu/-Ade/-His 플레이트에서 생존하지 않았다. 이와 나란히, 프레이 플라스미드를 베이트와 함께 공동형질전환시켰고, -Trp/-Leu/-His/-Ade 한천 플레이트에서 증식하는지 재검사했다. 생존 클론 유래의 프레이 플라스미드를 마지막으로 서열분석하고, 서열은 BLAST 소프트웨어를 이용해서 Genbank 데이터와 비교했다.

사람 대동맥 MATCHMAKER cDNA 라이브러리(Clontech, Mountain View, USA)를 준비하여 이.콜라이(E. coli) BNN132를 형질전환시키고, 효모에서 선별을 위한 충분한 플라스미드를 수득하기 위해 증폭시켰다. 먼저, 그 역가는 LB/amp 한천 플레이트에서 1x 10^-6, 1x 10^-7 및 2x 10^-7의 희석물을 평판배양하여 측정했다. 2일 동안 항온배양(30℃)한 후, 증식한 콜로니의 수를 계수하여, 1.8x 10⁸ 콜로니 형성 단위(cfu)/ml를 수득했다. 증폭 전에 라이브러리에 존재한 분리된 클론들의 수(3.5 x 10⁶)의 적어도 2 내지 3x를 수득하기 위해, 45,000 cfu/150mm 플레이트를 160 LB/amp 한천 플레이트(1.5% Bacto 한천, 1% Bacto 트립톤, 0.5% Bacto 효모 추출물, 1% NaCl, 100㎍/ml 앰피실린)에 도말했다. 30℃에서 36시간 항온배양한 후, 세포를 액체 LB/amp에 긁어 넣고 모아서 4개의 분취량으로 나눈 뒤, 원심분리로 펠릿화했다. 세균을 용균시켜 플라스미드를 QIAfilter Plasmid Giga Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용해서 정제했다.

효모의 형질전환을 위해, DNA-BD/베이트 및 라이브러리를 연속해서 폴리에틸렌글리콜/리튬 아세테이트(PEG/LiAc)-매개의 형질전환으로 효모에 도입시켰다(Ito H, Fukuda Y, Murata K, & Kimura A (1983). Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol 153, 163-168).

소규모 형질전환을 통해, DNA-BD/베이트는 효모에 도입시켰다. 액체 YPAD 배지(30mg/L 아데닌, 0.65g/L 완전 보충 혼합물, 6.7g 아미노산이 없는 Difco 효모 질소 염기, 2%(w/v) 글루코스)에서 30℃에서 증식된 사카로마이세스 세레비지에 AH109의 밤샘 배양물을 A₆₀₀=0.1이 되게 10ml YPAD 배지로 옮겼다. 이 세포 현탁액은 대수 증식기에 이를 때까지(A₆₀₀=0.5) 30℃에서 증식시키고, 멸균 탈이온수로 세척한 뒤, 200㎕ 리튬 아세테이트 완충액(100mM LiAc, 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA)에 재현탁시켰다. 1.5㎍ DNA-BD/베이트(공동발현을 위한 플라스미드 3㎍)를 18㎕ 열변성된 운반체 DNA(연어 정자 유래, Sigma, Munich, Germany)와 혼합하고, 40초 동안 비등시킨 뒤, 얼음으로 이동시켰다. 효모 현탁액 20㎕에 1.2ml PEG(40% PEG, 100mM LiAc, 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA)를 첨가하고 30℃에서 30분 동안 항온배양했다. 세포에 42℃의 열충격을 15분 동안 가하고, 원심분리한 뒤, 100㎕ TE-완충액에 재현탁시킨 뒤, 선택 배지에 도말하고 30℃에서 적어도 2일 동안 항온배양했다. DNA-BD/베이트로 형질전환된 효모는 -Trp 배지에서 증식했고, 프레이로 형질전환된 공동형질전환체는 -Trp/-Leu 배지에서 증식했다. 베이트는 음성 대조 벡터 pGADT7과의 공동형질전환에 의해 본래의 DNA-결합 및/또는 전사 활성이 아닌 것으로 확인되었다. pGADT7은 효모에서 GAL4-AD의 유일한 발현을 야기하는 엠티(empty) 벡터이다. 이 플라스미드는 TRPC4-상호작용성 단백질을 발현하지 않기 때문에, 이 베이트와의 공동형질전환은 GAL4를 재구성하기에 충분하지 않아서, 이 효모는 -Trp/-Leu/-Ade/-His 플레이트에서 생존하지 않았다.

단일 DNA-BD/베이트 형질전환체는 이하 AD 융합 라이브러리를 이용한 대규모 형질전환을 위한 접종물로 사용했다. 3개의 밤샘 배양물을 150ml -Trp 배지로 이동시키고, 50ml Falcon 튜브에 12부씩 나누고, 30℃에서 밤새 항온배양했다. 다음날, 이 스타터(starter) 배양물을 모아서, 원심분리(3분, 2,000 x g, 실온)로 펠릿화하고, 10ml -Trp 배지에 재현탁시켰다. 이 현탁액을 900ml -Trp 배지(A₆₀₀=0.15-0.25)에 첨가하고, 대수 증식기에 도달할 때까지(A₆₀₀=0.45-0.75) 세포를 증식시켰다. 이 현탁액을 몇몇 50ml Falcon 튜브에 나눈 뒤, 원심분리(5분, 실온, 2,000 x g)로 펠릿화하고, 300ml 멸균 탈이온수로 세척한 뒤, 10ml 멸균 탈이온수에 다시 합쳤다. 50ml 리튬 아세테이트 완충액(100mM LiAc, 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA)으로 세척한 후, 세포를 4ml 리튬 아세테이트 완충액에 재현탁시켰다. 3반복으로 라이브러리의 cDNA 40㎍을 열변성된 운반 DNA(연어 정자 유래) 145㎕, 세포 현탁액 1.2ml 및 PEG(40% PEG, 100mM LiAc, 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA) 8.6ml와 혼합하고, 250 rpm 하에 30℃에서 30분 동안 항온배양했다. 튜브당 1ml DMSO를 첨가한 후, 세포를 42℃ 열충격으로 15분 동안 처리하고, 그 다음 얼음에서 냉각한 뒤, 원심분리로 펠릿화했다(5분, 2,000 x g, 실온). 펠릿을 각각 25ml -Trp/-Leu 배지에 각각 재현탁시키고, 다시 합친 뒤, 250rpm, 30℃에서 1시간 동안 증식시켰다. 원심분리(5분, 2,000g, 실온) 후, 세포는 12ml -Trp/-Leu 배지에 재현탁하고, -Trp/-Leu/-His 한천 플레이트(150mm 직경)에 300㎕ 일정량으로 평판배양하고, 30℃에서 2 내지 5일 동안 항온배양했다. 증식한 콜로니는 -Trp/-Leu/-His/-Ade 한천 플레이트로 옮겨 2 내지 3일간 더 항온배양했다. 생존 콜로니는 β-갈락토시다제 분석으로 검사하고, 양성 반응성 클론의 플라스미드를 분리하여 서열분석했다. 형질전환 효율을 검사하기 위해, 10^-3 내지 10^-6의 희석물을 -Trp/-His 한천 플레이트에 평판배양하고, 이 플레이트를 30℃에서 2일 동안 항온배양한 후 cfu의 수를 계수했다.

β-갈락토시다제 분석을 위해, -Trp/-Leu/-His/-Ade 한천 플레이트에서 증식한 클론을 X-gal 한천(0.5% 아가로스, 500mM NaPO₄ 완충액(pH 7), 1% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 디메틸포름아미드(DMF) 중의 2% X-gal)로 덮고, 30℃에서 12시간 이하로 항온배양했다. 청색 산물의 발생은 육안으로 검사했다.

효모로부터 플라스미드를 제조하기 위해, -Trp/-Leu/-His/-Aga 한천 플레이트에서 생존하고 β-갈락토시다제 분석에서 양성 반응하는 클론을 2ml -Leu 배지에 재현탁시켜, 30℃, 250rpm 하에 24시간 동안 증식시켰다. 이것을 원심분리로 펠릿화하고 200㎕ 용균 완충액(2% Triton X-100, 1% SDS, 100mM NaCl, 10mM Tris-HCl(pH 8), 1mM EDTA)에 재현탁시켰다. 200㎕ 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜(25:24:1) 및 100㎕ 산-처리된 유리 비드를 첨가하고, 이 혼합물을 볼텍싱하여 세포벽을 붕괴시켰다. 원심분리(5분, 10,000 x g, 실온)한 후, 수성 상 135㎕를 새 튜브에 옮기고 15㎕ 나트륨 아세테이트 용액(10%) 및 375㎕ 에탄올과 혼합하고, DNA를 원심분리(30분, 10,000 x g, 실온)로 침전시켰다. DNA 펠릿은 에탄올(75%)로 세척하고, 37℃에서 30분 동안 건조시키고, 10㎕ Tris-HCl(10mM, pH 8.5)에 용해시켰다. DNA 2㎕를 이.콜라이에 전기침투시켜 형질전환시키고, 세균을 LB 카나마이신 한천 플레이트에 도말한 두, 플라스미드를 증폭시키고, QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 정제했다.

DNA 순환 서열분석 반응은 4가지 다른 형광 표지화된 디데옥시뉴클레오타이드(Parker et al., 1996)를 이용하여 디데옥시 종결인자 방법(Sanger et al., 1977)을 기반으로 하여 수행했다. ABI PRISM BigDye 종결인자 순환 서열분석 준비 반응 키트를 이용하여 수득한 PCR 단편은 전기영동으로 분리하고, 검출하여 ABI PRISM 3100 유전자 분석기로 분석했다.

11개의 단백질(이하 표에 열거됨)이 Y2H 분석에서 mTRPC4α C-말단과 물리적으로 상호작용하는 것으로 발견되었다.

이 단백질들은 모두 TRPC4 채널과 상호작용한다는 것이 종래 설명된 적은 전혀 없다. SESTD1은 가장 흥미로운 잠재적 상호작용 파트너인 것으로 보였는데, 그 이유는 도메인 조사(Marchler-Bauer A & Bryant SH(2004). CD-Search: protein domain annotations on the fly. Nucleic Acids Res 32, W327-W331) 결과, SESTD1에서 N-말단 SEC14p-유사 지질 결합 도메인이 나타났기 때문이다(도 1). 보존된 SEC14-모티프는 세포 인지질을 결합 및 수송하는 것으로 알려져 있다.

여러 보고서에 따르면, 인지질, 특히 PIP₂에 의한 TRP 채널의 조절이 밝혀져 있다. 이것은 본 발명자들로 하여금 SESTD1이 TRPC4의 조절에 관여하는 것으로 생각하게 했다. SEC14p-유사 지질-결합 도메인 외에도, 스펙트린 반복체라 불리는 2개의 나선형 구조가 SESTD1에서 발견되었다. 이 도메인은 단백질-단백질 상호작용을 매개하는 것으로 알려져 있고 몇몇 세포골격 단백질에서 발견된다.

SESTD1은 사람 대동맥 cDNA 라이브러리에서 전체 길이가 발견되었다. 이의 아미노산 서열은 1개의 교환(H508Q) 외에는 진뱅크 등록번호 NP_835224와 동일하다. 이것은 게놈 BLAST에서도 발견할 수 있는 bp 1571에서의 점 돌연변이를 기초로 한다(NM_178123). bp 1748번에서 발견되는 다른 점 돌연변이는 침묵 돌연변이이다.

실시예 2: mTRPC4 α측으로부터 상호작용 부위 맵핑

SESTD1과 TRPC4의 상호작용 부위를 더 자세하게 정의하기 위해, 유도성 효모 2중 하이브리드 선별(실시예 1 참조)을 수행했다. 효모는 SESTD1 및 다양한 C-말단 mTRPC4α 단편과 공동형질전환시키고 선택 배지에서 평판배양했다. 실험은 실시예 1에서와 유사하게 수행했다. 하지만, TRPC4에 대한 SESTD1 상호작용 부위를 맵핑하기 위해, 클로닝이 용이하도록 단량체성 베이트 작제물을 만들었다(지퍼는 제외).

TRPC4 단편의 반복적인 단축에 의해, 29개 아미노산(aa 700-728)의 작은 서열이 전체 길이의 SESTD1과의 상호작용을 매개하기에 충분하다는 것을 발견했다(도 2). 이러한 추정상의 SESTD1 결합 서열은 더 짧은 TRPC4β 이소폼은 물론 TRPC5에서도 보존된다.

SESTD1과 TRPC4/5 간의 상호작용의 특이성을 입증하기 위해, 효모를 SESTD1 및 hTRPC1, mTRPC4β, mTRPC5 또는 hTRPC6의 C-말단으로 공동형질전환시키고 선택 배지에서 평판배양했다. 결과는 TRPC4 및 TRPC5의 C-말단 꼬리와 SESTD1의 특이적인 상호작용을 나타냈다(도 3).

실시예 3: GST 풀다운( pulldown )

단백질 생화학적 방법으로 SESTD1과 mTRPC4 간의 물리적 상호작용을 확인하기 위해, GST 풀다운 분석을 수행했다.

세균에서 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 융합 단백질의 재조합 발현을 위한 작제물은 pGEX-4T-1 벡터(Amersham, Munich, Germany)에 사람 SESTD1(NM_178123)을 삽입하여 GST와 N-말단 융합체가 산출되도록 제조했다. pGEX 벡터로부터 GST 융합 단백질 발현은 tac 프로모터의 조절 하에 있으며 락토스 유사체 이소프로필 β-D 티오갈락토사이드(IPTG)에 의해 유도성이다. 각 플라스미드로 형질전환된 BL21 스타(DE3) 원 샷 화학적 컴피턴트 이.콜라이(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)는 선택적 LB 배지(단백질 발현을 억제하기 위해 0.2%(m/v) 글루코스 함유)에서 밤새 배양하고, 이어서 100ml 선택 LB 배지(0.2% (m/v) 글루코스 함유)로 옮겨 A₆₀₀=0.1을 수득했다. 이 액체 배양물을 실온에서 250rpm 하에 증식시켜 A₆₀₀=0.6-0.8을 수득했다. 단백질 발현은 10mM(GST) 또는 20mM(GST-SESTD1, GST-SESTD1-단편) IPTG를 첨가하여 유도하고, 6시간 동안 항온배양을 지속했다. 원심분리(16,000 x g, 1분, 실온)로 세균 현탁액을 5ml 분취량씩 펠릿화하고, 2ml D-PBS(Ca² ⁺, Mg² ⁺ 무함유)로 1회 세척하고 -80℃에 보관하거나, 즉시 용균시켰다. 각 펠릿을 250㎕ 용균 완충액(1mg/ml 리소자임 함유)에 재현탁시키고 얼음에서 20분 동안 항온배양했다. 초음파처리(1x 5초) 후, 용균물을 16,000 x g, 4℃에서 30분 동안 원심분리하고, 상청액을 새 바이알로 옮겼다. 50㎕ 글루타티온 세파로스 현탁액은 500㎕ 용균 완충액(G27 바늘을 사용해서)으로 3회 세척한 다음, 상청액을 첨가하고, 용균 완충액으로 1ml로 채웠다. 회전기(실온)에서 1시간 동안 항온처리한 후, 비드를 500㎕ 용균 완충액으로 3회 세척했다. 글루타티온 세파로스에 결합된 GST 융합 단백질은 GST 풀다운 분석에 사용했다.

mTRPC4α-C-말단 또는 전체 길이의 mTRPC4α로 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포는 용균시키고 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트를 이용해서 측정했다. 총 단백질 50㎍의 해당량을 글루타티온 세파로스에 결합된 GST 또는 GST-SESTD1에 첨가하고, 용균 완충액으로 1ml로 채운 뒤, 회전기(2시간, 실온)에서 항온처리했다. 세파로스는 500㎕ 용균 완충액 및 G27 바늘로 3회 세척하고, 그 다음 1x LDS 샘플 완충액(5% β-ME 함유)(Invitrogen, Karlsruhe, Germany) 20㎕를 첨가했다. 프로브는 변성(95℃, 3분)시키고, 원심분리한 뒤, 웨스턴 블롯으로 분석했다.

웨스턴 블로팅을 위해, 샘플을 Bis-Tris-HCl 구배 겔(4-12%) 위에 로딩하고, NuPAGE MOPS SDS 전개 완충액에서 150V 하에 75분 동안 전기영동적으로 분리했다. 겔은 NuPAGE 전이 완충액(Invitrogen, Karlsruhe, Germany) 및 Novex XCell 2 Blotmodul(Invitrogen, Karlsruhe, Germany) 또는 iBlot Dry System(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)을 제조자의 지시에 따라 이용해서 니트로셀룰로스 막 위로 블로팅했다. 전이를 입증하기 위해, 니트로셀룰로스 막 위의 단백질을 0.1% Ponceau S 용액(Sigma, Munich, Germany)으로 1분 동안 염색하고, 과량의 염료는 물로 세척해서 제거했다. 막은 0.6% Tween 20 함유 TBS(500mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.4)와 1:1로 희석한 차단 완충액(오디세이 차단 완충액)으로 1시간(실온) 동안 차단시킨 후, 1차 항체와 항온처리했다(1시간, 실온)(이하, 항체 목록 참조). 이것을 TBST(500mM NaCl, 20mM Tris-HCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4)로 4회 세척한 후, 형광 표지화된 항체와 항온처리하고(45분, 실온)(이하 항체 목록 참조), 다시 TBST로 4회 세척했다. 막은 오디세이 적외선 영상화 시스템(LiCor, Lincoln, USA) 또는 Lumi Imager(Roche, Mannheim, Germany)로 분석했다.

GST 풀다운 분석은 단백질 생화학적 방법에 의해 SESTD1과 mTRPC4 사이의 물리적 상호작용을 확인하기 위해 수행했다. 이.콜라이에서, 먼저 발현 및 정제된 재조합 GST-SESTD1을 사용하여 HEK293 세포 용균물로부터 과발현된 전체 길이 mTRPC4α를 풀다운시켰다. 하지만, 두 단백질은 크기가 동일한바, 항-TRPC4 항체에 의해 검출되는 채널 시그널은 SESTD1에 대한 비특이적 결합에 의해 가장될 수 있다. 이 문제를 회피하기 위해, 다시 더 작은 mTRPC4α C-말단(aa 615-974)을 GST-SESTD1과의 풀다운 실험에 사용했다. 이 실험에서, SESTD1 및 mTRPC4α-C-말단이 물리적으로 상호작용할 수 있다는 것을 입증할 수 있었다(도 4).

실시예 4: SESTD1 측으로부터 상호작용 부위 맵핑

GST 풀다운 시도(실시예 3 참조)를 조정해서 mTRPC4α와 SESTD1 간의 상호작용 부위를 조사하는데 사용했다. 예상한 도메인에 따라 3개의 SESTD1-작제물(도 5 참조)을 pGEX-5X-3(Amersham, Munich, Germany)에 클로닝하고 원 샷 BL21 스타(DE3) 화학적 컴피턴트 이.콜라이(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)에서 GST 융합 단백질로 발현되었다.

선택된 조건 하에서 세균으로부터 SEC14p-유사 지질 결합 도메인을 보유한 GST-Sec14(aa 1-192)의 원하는 양을 정제하는 것은 불가능했다. 발현 유도는 세균이 GST-Spec1(aa193-406), GST-Spec2(aa407-696) 또는 전체 길이의 GST-SESTD1로 형질전환된 세균보다 훨씬 느리게 성장했기 때문에 세균에게 독성인 것으로 보였다.

mTRPC4α에서 맵핑된 SESTD1-결합 부위는 TRPC4-β 이소폼에도 존재하고 mTRPC5에서도 고도로 보존적이기 때문에, 본 발명자들은 세 채널 모두와 GST-결합된 SESTD1 단편의 상호작용에 대해 검사했다. mTRPC4α, -β 및 mTRPC5는 모두 제1 스펙트린 도메인과 강하게 상호작용했고, 일부 블롯에서는 제2 도메인에 대한 약한 결합도 관찰할 수 있었다. 제1 스펙트린 도메인은 상호작용의 주요 부위인 것으로 보이지만 SEC14p-유사 지질-결합 도메인의 참여를 배제할 수는 없다(도 6).

본 발명자들은 SEC14 도메인과 풀다운 실험을 수행할 수 없었기 때문에, 유도된 효모 2중 하이브리드 선별을 이용하여, TRPC4/5 결합에 다른 SESTD1 도메인들의 관여를 더 더욱 상세하게 밝히고자 했다. 3가지 SESTD1 작제물, SESTD1-Sec14(aa 1-192), SESTD1-Spec 1(aa 193-406) 및 SESTD1-Spec2(aa 407-696)를 각각의 SESTD1 유전자 단편을 효모 발현 벡터 pACT2(Clontech, Mountain View, USA)에 삽입하여 도 5에 도시된 작제물과 유사하게 클로닝함으로써 GAL4 활성화 도메인에 대한 융합체로서 발현을 유도했다.

실험 결과는 SESTD1과 mTRPC4α C-말단 사이의 상호작용 부위로서 제1 스펙트린 도메인을 확인시켜 주었다. 또한, SEC14p-유사 지질-결합 도메인은 관여하지 않는다는 것을 보여주었다(도 7). 몇몇 GST 풀다운 실험에서 관찰된 Spec2 도메인과 mTRPC4α C-말단 사이의 약한 상호작용은 선택 배지에서 공동형질전환된 효모의 생존을 허용할 정도로 충분하게 강한 것은 아니었다. 이에 반해, mTRPC5-C-말단은 유도된 효모 2중 하이브리드에서 Spec 1 및 Spec2 도메인과 독립적으로 상호작용했다. 이를 정리하면, 조정된 GST 풀다운 및 유도된 효모 2중 하이브리드 분석의 결과들은 Spec1 도메인을 SESTD1에서 주요 상호작용 측임을 확인시켜준다.

실시예 5: 공동면역침전

상기 Y2H 및 GST 풀다운 실험은 SESTD1이 mTRPC4α, -β 및 mTRPC5와 상호작용한다는 것을 밝혀냈다. 이러한 단백질-단백질 상호작용이 또한 생체내에서도 일어나는지를 입증하기 위해 공동면역침전 실험을 수행했다. SESTD1에 대한 시판 항체는 이용할 수 있는 것이 없기 때문에, 2개의 폴리클로날 펩타이드 항체를 Eurogentec(Seraing, Belgium)에 주문하여 맞춤제작하고 특성규명했다. 항-SESTD1 #147 항체는 제1 스펙트린 도메인(aa 265-280, CRQRSKRTQLEEIQQK; 서열번호 5) 내의 서열에 대하여 지시된 것이었고, 항-SESTD1 #148은 상기 C-말단(aa 682-696, KRQQLRHPEMVTTES; 서열번호 6)으로 토끼를 면역화시켜 생산했다. 항체는 각 펩타이드에 대해 친화도 정제해서 공급했다.

hSESTD1은 벡터 pCMV-HA(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)에 삽입하여 사람 인플루엔자 바이러스(HA 태그 YPYDV PDYA; 서열번호 7)의 헤마글루티닌 항원 에피토프를 보유한 N-말단 융합 단백질로 발현시켰다. HA-SESTD1로 일시적으로 형질감염된 HM1 세포(무스카린성 M1 수용체를 안정하게 발현하는 HEK293 세포주(Peralta EG, Ashkenazi A, Winslow JW, Ramachandran J, & Capon DJ(1988). Nature 334, 434-437)) 뿐만 아니라 비형질감염된 HM1 세포를 용균시키고(1mM EDTA, 150mM NaCl, 50mM Tris-HCl, 1% Triton X-100, 완전 프로테아제 저해제가 보충됨), 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트를 이용해서 측정했다.

웨스턴 블로팅을 위해, 동량의 단백질 샘플을 Bis-Tris-HCl 구배 겔(4-12%) 위에 로딩하고, 전기영동적으로 분리했다(실시예 3 참조). 웨스턴 블롯으로 검사했을 때, 두 항체는 HM1 세포 용균물에서 과발현된 HA-태그화된 SESTD1을 검출했다(예상 크기 79kDa). 또한, 비형질감염된 세포에서는 HA-SESTD1과 공동이동하는 내인성 단백질이 두 항체에 의해 강하게 인식되었고, 이는 이 단백질이 천연의 SESTD1인 것을 시사한다. SESTD1 외에도, 항-SESTD1 #147은 사용된 희석물과 무관하게 웨스턴 블롯에서 여러 다른 단백질을 인식했고, 항-SESTD1 #148은 겉보기 질량이 50kDa인 다른 단백질도 검출했다(도 8).

HM1 세포를 HA-태그화된 SESTD1 및 FLAG-태그화된 mTRPC4β, GFP-태그화된 mTRPC5 또는 pcDNA3.1(음성 대조군)로 각각 공동형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후, 세포를 얼음에 10분 동안 두어 수거한 뒤, 10ml 빙냉 D-PBS(Ca² ⁺, Mg² ⁺ 무함유)로 2회 세척했다. 세포를 하나의 디쉬로부터 균질화 완충액 600㎕(320mM 수크로오스, 5mM HEPES, pH 7.4, 완전 프로테아제 저해제 보충됨) 내로 긁어넣어 세포막을 분리했다. 형질감염 조건마다 4개의 디쉬로부터의 세포 현탁액을 합쳐서, 초음파처리하고(1x 5초), 원심분리하고(100 x g, 10분), 수득되는 상청액을 3개의 바이알에 나누어 원심분리했다(100,000 x g, 30분). 수득되는 펠릿으로부터 펠릿당 600㎕ 용균 완충액(완전 프로테아제 저해제 보충됨)으로 막 단백질을 용해시키고, 얼음에서 1시간 동안 항온처리한 뒤, 원심분리했다(15분, 16000 x g, 4℃). 상청액을 새 바이알에 넣고 혼합했다. 일정량은 투입 대조군으로 유지시켰고, 나머지 용해물은 2개의 바이알에 나누어 담았다. 각 프로브에 4㎍의 제1 항체를 첨가하고, 회전기에서 4℃ 하에 밤새 항온배양했다. 세포 용해물을 형질감염 조건당 4개의 디쉬로부터 수득했다. 각 디쉬의 세포는 600㎕ 용균 완충액(완전 프로테아제 완충액이 보충됨)에 직접 긁어넣고, 얼음에서 1시간 동안 항온배양한 뒤, 원심분리했다(15분, 16000 x g, 4℃). 상청액은 새 바이알에 담고, 나머지 3 디쉬의 용균물과 합하여 전술한 바와 같이 처리했다. 다음날, 30㎕ 단백질 A-세파로스 또는 단백질 G-세파로스 현탁액을 각각 세척하고 프로브들에 첨가했다. 이것을 4℃에서 2시간 이상 항온처리했다. 세파로스는 게이지 27 바늘로 3회 세척하고 500㎕ 용균 완충액, 그 다음 20㎕ 2x LDS 샘플 완충액(10% β-ME 함유)을 첨가했다. 프로브를 변성(95℃, 3분)시키고, 원심분리한 뒤, 항-SESTD1 항체를 이용하여 웨스턴 블롯(실시예 2 참조)으로 분석했다. 이온 채널의 성공적인 침전은 항-FLAG(mTRPC4β) 및 항-TRPC5로 탐침하여 검사했다.

mTRPC4β 및 mTRPC5가 HM1 세포 용균물로부터 침전되었을 때, 침전된 샘플에서 SESTD1이 발견되었다. 또한, FLAG-태그화된 mTRPC4β 또는 GFP-태그화된 mTRPC5는 없이 HA-SESTD1만을 발현한 대조용 HM1 세포 용균물에서는 FLAG 및 GFP 항체에 의해 극소량의 SESTD1이 침전되었다. 이러한 비특이적 결합은 다른 침전 조건 하에서 관찰되었다. 이것은 항상 이온 채널 단백질과의 공동면역침전보다 훨씬 적었다(도 9).

실시예 6: SESTD1 및 TRPC5 의 기능적 상호작용

TRPC5 및 SESTD1의 기능적 상호작용 연구를 위해, mTRPC5-YFP를 안정하게 발현하는 HM1 세포주(HM1-C5Y 세포)를 생성했다.

HM1 세포는 리포펙타민 2000을 이용해서 4㎍ mTRPC5-YFP 작제물로 형질감염시켰다. 이 작제물은 mTRPC5-GFP(Strubing C, Krapivinsky G, Krapivinsky L, & Clapham DE (2003). Formation of novel TRPC channels by complex subunit interactions in embryonic brain. J Biol Chem 278, 39014-39019)의 XbaI/NotI 단편을 pcDNA3.1(-)zeo 내로 삽입하여 수득했다. YFP 융합체는 NotI/EcoRI 절단된 YFP-PCR 단편을 채널 C-말단에 결합시켜 수득했다. 24시간 형질감염 후, 클론 선택은 세포를 완전 배지(10%(v/v) FBS(PAA, Pasching, Austria), 1mM 글루타민, 400㎍/ml 제네티신, 50㎍/ml 제오신(모두 Invitrogen, Karlsruhe, Germany)이 보충된 DMEM/Nutrient F12(glutaMAX I 보유; Invitrogen, Karlsruhe, Germany)에서 배양하여 개시했다. 수일 동안 선택 후, 성장된 콜로니를 수작업으로 채취하여 단일 클론들을 분리했다. 한 클론을 추가 연구를 위해 선택했다. 이온 채널의 기능적 발현은 전기생리학적 계측으로 검사했다. 종래 기술된 바와 같이 측정한 카르바콜 및 트립신 유도된 이온 전류의 전류 밀도(Strubing C, Krapivinsky G, Krapivinsky L, & Clapham DE(2001) TRPC1 and TRPC5 form a novel cation channel in mammalian brain. Neuron 29, 645-655)는 15.9±5.5 pA/pF(n=10, 카르바콜) 및 127.8±57.6 pA/pF(n=6, 트립신)였다. 이에 반해, 비형질감염된 HM1 세포에서는 카르바콜 또는 트립신에 의해 전류가 유의적으로 유도되지 않았다.

세포질 칼슘 [Ca² ⁺]_i의 변화는 Ca² ⁺ 결합 시에 형광 여기 최대값이 더 짧은 파장쪽으로 이동하지만, 형광 방출 최대값은 상대적으로 변화되지 않는 널리 사용되는 지시제인 Ca² ⁺-민감성 형광 염료 fura-2 AM(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)을 사용해서 측정했다. 일반적으로, 340nm 및 380nm에서 여기된 형광 강도의 비가 측정된다.

20,000 내지 40,000 세포/웰을 흑색 폴리-L-리신 코팅된 유리 바닥 96웰 플레이트(Greiner, Frickenhausen, Germany)에 접종하고, 거의 융합성 단층에 이를 때까지 밤새 증식시켰다. 이것을 135mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 10 mM HEPES, 10 mM 글루코스(pH 7.35)로 구성되고 2μM fura-2 AM이 보충된 100㎕ 표준 세포외 용액(E)에 로딩하고(37℃, 30분), 80㎕ E에서 37℃ 하에 15분 동안 탈에스테르화시켰다. 세포내 칼슘 시그널은 탁상용 스캐닝 형광계(FLEX; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)에서 비율계량적으로 계측했다. 형광은 340nm 및 380nm에서 교대로 여기시키고, 495nm에서 장파 여과하고, 4초 간격으로 포착했다. 340/380nm 여기비는 SoftMax Pro 소프트웨어(Molecular Devices)로 계산했다. 기준선 형광은 무스카린 작용제 카르바콜 또는 프로테아제-활성화된 수용체(PAR) 작용제 트립신을 FLEX 피펫기로 적용하기 전에 30초 동안 검출했다. 카르바콜 및 트립신은 둘 다 각각 M1-수용체 및 PAR을 통해 HM1 세포에서 포스포리파제 C 활성화로 연결짓는다. 포스포리파제 C는 결국 세포내 저장소(store)로부터의 Ca² ⁺ 방출(PI 반응) 및 TRPC5의 활성화를 자극한다. 저장소로부터의 Ca² ⁺ 방출 및 TRPC5를 통한 Ca² ⁺ 진입은 fura-2-로딩된 세포에서 형광계량적으로 계측한다. 세포외 Ca² ⁺가 존재할 때에는 세포내 Ca² ⁺의 카르바콜 및 트립신 유도 상승이 TRPC5와 무관하게 오로지 내부 저장소로부터의 방출 때문이다. 따라서, Ca²⁺ 방출은 Ca² ⁺ 유리된 세포외 용액에서 측정된 형광 곡선 이하 면적으로 계산했다. TRPC5 매개의 Ca² ⁺ 유입은 표준(Ca² ⁺ 함유) 세포외 용액에서 측정된 곡선 이하의 면적에서 Ca² ⁺ 방출을 빼서 계산했다.

HA-SESTD1이 HM1-CY5 세포에서 과발현되었을 때, 카르바콜 또는 트립신의 적용 후에 TRPC5 매개의 Ca² ⁺ 유입은 무관련 단백질(β-갈락토시다제, bGAL)로 형질감염된 대조용 세포와 크게 다르지 않았다. 내부 저장소로부터의 Ca² ⁺ 방출은 또한 HA-태그화된 SESTD1의 존재 또는 부재 하에서 크게 변화되지 않았다.

SESTD1을 내인적으로 발현하는 HM1 세포주에서 HA-SESTD1의 과발현(실시예 5)은 TRPC5-매개의 Ca² ⁺ 유입에 영향을 미치지 않았다. 따라서, 이 세포들의 SESTD1 단백질 발현의 녹다운 TRPC5 기능을 변경시키는지를 검사했다.

SESTD1의 녹다운은 여러 SESTD1 서열에 대한 3가지 siRNA 듀플렉스 수집물(Dharmacon, 서열은 표 2 참조)로 세포를 형질감염시켜 수행했다. FBS는 형질감염 효율에 큰 영향을 미치지 않기 때문에, 세포는 Lipofectamine 2000(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)을 이용해서 완전 배지에서 형질감염시켰다. 오로지 리포좀을 만들어 형질감염 배지(Opti-MEM, Invitrogen)에 로딩했다. 3x10⁵ HM1 세포/2ml/웰을 6웰 플레이트에 접종하고 다음날까지 30 내지 50% 융합성으로 증식시켰다. 20μM siRNA 스톡 용액 2.5㎕ 또는 50μM siRNA 스톡 용액 1㎕를 각각 형질감염 배지 250㎕에 희석하고, 5㎕ Lipofectamine 2000(또한 250㎕ Opti-MEM에 희석됨)과 20분(실온) 동안 항온처리했다. 이 혼합물을 최종 siRNA 농도가 20nmol/L가 되도록 세포에 적용했다. 형질감염 48시간 후, SESTD1은 20nM siRNA에 의해 거의 완전하게 녹다운되었고(각각 6.6μM), 이에 반해 무관련 단백질(GAPDH)의 발현은 변경되지 않았다(도 10).

20nM 수집된 SESTD-siRNA 듀플렉스로 형질감염된 HM1-C5Y 세포, 비특이적 무침묵성 대조용 siRNA(SilencerR 음성 대조군 #2, Ambion) 또는 리포좀만을 형광계량 [Ca² ⁺]_i 계측으로 기능적으로 검사했다. M1 및 PAR 활성화 후 내부 저장소로부터의 TRPC5-독립적 Ca² ⁺ 방출은 3 그룹 간에 크게 다르지 않았다. 이에 반해, 카르바콜 또는 트립신의 적용 후에 TRPC5-매개의 Ca² ⁺ 유입은 특이적 SESTD1 siRNA로 처리된 세포에서 크게 감소했다. 카르바콜 자극 후에 TRPC5-매개의 Ca² ⁺ 유입은 거짓 형질감염된 세포에 비해 45.4±2.8%(n=14) 또는 대조용 siRNA로 형질감염된 세포에 비해 49.6±3.1%(n=14)로 감소했다. 세포가 100nM 트립신에 의해 활성화되었을 때; TRPC5-매개의 Ca² ⁺ 유입은 거짓 형질감염된 세포에 비해 51.4±3.7%(n=15) 또는 대조용 siRNA로 형질감염된 세포에 비해 57.5±4.2%(n=15)로 감소했다.

실시예 7: SESTD1 의 발현

SESTD1의 조직 분포는 설명된 것이 없지만, 여러 조직의 실시간 정량적 PCR(TaqMan, Livak KJ, Flood SJ, Marmaro J, Giusti W, & Deetz K (1995). Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl 4, 357-362) 분석을 수행했다. 결과는 SESTD1 mRNA가 사람 조직에서 어디서나 발현된다는 것을 보여주었다(도 11 참조).

본 발명자들은 사람 대동맥으로부터 제조된 cDNA 라이브러리에서 SESTD1을 발견했고, 어떠한 혈관 세포 종류에서 이 단백질이 발현되는지를 조사하는 것이 흥미로웠다. 따라서, 사람 주요 세포의 용해물을 SESTD1 발현에 대한 웨스턴 블롯으로 분석했다. SESTD1은 대동맥(AoSMC) 및 관상동맥(CASMC) 평활근 세포 뿐만 아니라 대동맥(HAEC) 및 미세혈관(HMVEC-d) 내피 세포에도 존재했다(도 12).

실시예 8: 시험관내 인지질 결합

SESTD1의 N-말단 SEC14p-유사 지질-결합 도메인은 여러 인지질을 특이적으로 결합하여 수송할 수 있는 구성원을 보유한 완전한 진핵생물성 단백질 패밀리의 기원이다. TRPC 채널 활성(Kwon Y, Hofmann T, & Montell C (2007). Integration of phosphoinositide- and calmodulin-mediated regulation of TRPC6. Mol Cell 25, 491-503) 뿐만 아니라 많은 다른 세포 세포 기능(예, 세포 형태 및 부착, Raucher D, Stauffer T, Chen W, Shen K, Guo S, York JD, Sheetz MP, & Meyer T (2000). Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate functions as a second messenger that regulates cytoskeleton-plasma membrane adhesion. Cell 100, 221-228)은 인지질 함량 및 분포에 의해 조절될 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 SESTD1에 대한 인지질 결합을 검출하고 정량하는데 사용할 수 있는 분석법을 개발했다.

a) PIP 스트립 인지질 중층 분석

PIP 스트립(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)은 15가지 다른 인지질의 샘플 100pmol과 블랭크 샘플을 함유하는 시판 니트로셀룰로스 막이다. 이 스트립은

a) TBST(150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 0.1% Tween 20, pH 8),

b) 0.06 μM 유리된 Ca² ⁺를 보유하는 TBST(150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl₂, 0.9 mM CaCl₂, 0.1% Tween 20, pH 8),

c) 2.5 μM 유리된 Ca² ⁺를 보유하는 TBST(150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl₂,1 mM CaCl₂, 0.1% Tween 20, pH 8)

중에 3%의 필수적으로 지방산 유리된 BSA(Sigma, Munich, Germany)로 구성된 PIP 스트립의 여러 차단 완충액으로 1시간(실온) 동안 차단시키고, 이어서 500ng/ml 정제된 GST를 함유하는 차단 완충액 a), 또는 각각 500ng/ml GST-SESTD1을 함유하는 차단 완충액 b) 또는 c)(4시간, 실온)와 항온처리했다. 세척(각 차단 완충액으로 2회, 그 다음 차단 완충액 a)로 1회) 후, 4℃에서 제1 항체 항-GST(차단 완충액 a) 중의 1:2,000)와 밤새 항온처리했다. TBST(pH 8)로 3회 세척 단계 이후, 제2 HRP-접합된 항-토끼 항체(차단 완충액 a) 중의 1:20,000)와 45분 동안 항온처리했다. 막은 다시 TBST로 3회 세척했고, 1ml Lumi-LightPLUS 웨스턴 블로팅 기질(5분)(Roche, Mannheim, Germany)과 항온처리하고, 화학발광 시그널은 Lumi Imager(Roche, Mannheim, Germany)로 분석했다.

모든 생리적으로 발견된 포스파티딜-이노시톨-모노포스페이트 및 디포스페이트(PIP, PIP₂)뿐만 아니라 포스파티드산에 대한 SESTD1의 특이적 결합은 인지질 중층 분석에서 검출되었다. 이러한 기질들에 대한 SESTD1의 결합은 Ca² ⁺ 농도에 따라 달라졌다. SESTD1은 휴지 세포 중의 대략적인 생리적 농도인 60nM Ca² ⁺의 존재 하에 PIP에 강하게 결합했고, 이보다 적은 정도로 다른 PIP₂ 및 포스파티드산에 결합했다. Ca² ⁺ 농도의 상승(2.5μM)에 의한 세포 활성화의 모의실험은 PI(3,4)P₂, PI(3)P-및-PI(4)P 뿐만 아니라 PI(3,5)P₂, PI(4,5)₂, 포스파티드산의 결합을 증가시켰다.

b) Cova-PIP 플레이트 결합 분석

LL5-α의 GST-태그화된 PH-도메인, GST 단독 또는 GST-SESTD1은 PIP 스트립용 차단 완충액 a)로 희석했다(실시예 8a). 웰당 10 또는 100 pmol PIP_n이 로딩된 Cova-PIP 특이성 플레이트(Echelon, Salt Lake City, USA)를 웰당 100㎕ 단백질 용액과 함께 실온에서 3시간 동안 항온처리했다. 플레이트를 PIP 스트립용 차단 완충액 a)로 3회 수작업으로 세척한 후, PIP 스트립용 항-GST(차단 완충액 a) 중의 1:1000) 100㎕를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리했다. 플레이트를 자동 플레이트 세척기를 이용해서 TBST(150mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 0.1% Tween 20, pH 8)로 4회 세척했다.

DELFIA(dissociation enhanced lanthanide fluorescence immunoassay)에서는 2차 Eu-N1-표지화된 항-토끼 항체(PIP 스트립용 차단 완충액 a) 중에 500ng/ml) 100㎕를 웰당 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리했다. 플레이트를 자동 플레이트 세척기로 TBST로 4회 세척한 뒤, 웰마다 100㎕ 증강제 용액(Perkin Elmer, Waltham, USA)을 첨가했다. 20분 동안 항온처리 후, 란탄계열원소의 형광은 여기되었고(λ_exc=340nm) Tecan Ultra 플레이트 판독기(Tecan, Crailsheim, Germany)로 판독했다(λ_exc=620nm).

LL5-α의 GST-태그화된 PH-도메인은 모든 포스포이노시타이드를 인식하는 대조 시약으로 제안되어 있다. 따라서, GST-SESTD1 및 LL5-α의 결합을 먼저 웰당 10pmol 기질이 로딩된 Cova PIP 특이성 플레이트에서 비교했다. 선택된 조건 하에서 LL5-α의 GST-태그화된 PH-도메인의 유의적인 결합은 있었지만, GST-SESTD1의 유의적인 결합은 관찰되지 않았다.

본 발명자들은 웰당 기질 로딩량의 증가가 GST-SESTD1에 의해 관찰되는 시그널을 증가시킬 수도 있다고 생각했다. 따라서, 웰당 100pmol 기질을 로딩한 플레이트를 이용해서 변동량의 SESTD1의 결합을 유사하게 검사했다. 실제, SESTD1은 모든 포스포이노시타이드에 특이적으로 결합했고, 가장 높은 친화도는 PI(4,5)P₂ 및 PI(3,4)P₂에 대한 것이었다(도 14).

도면의 설명

도 1: SESTD1의 토폴로지. 전체 길이의 단백질은 696개 아미노산(예상 분자량 79kDa)으로 이루어지고 3개의 구조 도메인을 포함한다. Sec 14(aa 8-147); SEC14p-유사 지질-결합 도메인; Spec 1(aa 233-281), Spec2 (aa 430-605): 스펙트린 반복체 1 및 2.

도 2: mTRPC4α-C-말단의 SESTD1-결합 부위의 맵핑. (A) SESTD1 결합에 대해 선별된 mTRPC4α C-말단의 모식도. (B) mTRPC4α C-말단의 절두 돌연변이체(베이트) 및 전체 길이의 hSESTD1(프레이)로 공동형질전환된 효모 콜로니를 선택적 -Trp/-Leu/-Ade/-His 한천 플레이트에서 평판배양했다. 효모 증식(밝은 색)은 작제물의 상호작용을 나타낸다.

도 3: 여러 TRPC의 C-말단과 SESTD1 간의 상호작용의 효모 2중 하이브리드 분석. 선택적 -Trp/-Leu/-Ade/-His 한천 플레이트에서 평판배양된 주어진 TRPC 채널의 C-말단(베이트) 및 전체 길이의 hSESTD1(프레이)로 공동형질전환된 효모 콜로니가 도시된다. 효모 증식(밝은 색)은 작제물의 상호작용을 나타낸다.

도 4: mTRPC4α-C-말단(aa 615-974)의 GST-SESTD1 풀다운. mTRPC4α-C 말단(aa 615-974)을 과발현하는 HEK293 세포 유래의 GST-SESTD1(레인 3) 또는 GST(음성 대조군, 레인 4)로 침전된 샘플의 항-TRPC4(1:200) 면역블롯. 이 블롯은 2차 Alexa Fluor 680 염소 항-토끼(1:2,500) 항체로 발색시켰다.

도 5: GST-SESTD1 융합 단백질의 모식도. SESTD1의 여러 부분을 함유하는 GST 융합 단백질을 주어진 모식도에 따라 작제했다. GST 풀다운 조사용 세균으로부터 단백질이 발현되어 정제했다.

도 6: SESTD1의 상호작용 부위로서 Spec 1의 동정. (A, B) mTRPC4α(A) 또는 mTRPC4β(B)를 과발현하는 HEK293 세포 유래의 제시된 GST 융합 단백질 또는 GST로 침전된 샘플의 항-TRPC4 면역블롯. (c) mTRPC5를 과발현하는 HEK293 세포를 사용한 유사한 실험의 항-TRPC5 면역블롯. 블롯은 2차 Alexa Fluor 680 염소 항-토끼(1:2,500) 항체로 발색시켰다.

도 7: SESTD1 중의 TRPC4/5-상호작용 부위로서 Spec 1의 확인. -Trp/-Leu/-His/-Ade에 평판배양된, mTRPC4α 또는 mTRPC5-C-말단 및 전체 길이의 SESTD1 또는 SESTD1-Sec 14, -Spec 1, 또는 -Spec 2 작제물로 공동형질전환된 효모 콜로니가 도시된다. 효모 증식(밝은 색)은 작제물의 상호작용을 나타낸다.

도 8: 폴리클로날 SESTD1 항체가 내인성 및 과발현된 SESTD1을 검출한다. 비형질감염된(N) HM1 세포 및 HA-태그화된 SESTD1로 형질감염된 HM1 세포(T) 유래의 용해물을 항-HA 및 항-SESTD1 #147(A) 또는 항-SESTD1 #148(B) 항체 및 2차 Alexa Fluor 680 염소 항-토끼(1:2,500) 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 탐침했다. 두 항체는 HA-SESTD1 및 내인성 SESTD1(비형질감염된 세포에서)을 겉보기 질량이 약 80kDa인 단백질로서 검출했다.

도 9: SESTD1은 mTRPC4β 및 mTRPC5와 공동면역침전한다. (A) 항-TRPC4 면역침전물(P) 및 HA-태그화된 SESTD1 및 FLAG-태그화된 mTRPC4β 또는 pcDNA3.1로 공동형질감염된 HM1 세포의 막에서 유래하는 대응 용균물(L)의 웨스턴 블롯. (B) 항-GFP 면역침전물(P) 및 HA-태그화된 SESTD1 및 GFP-태그화된 mTRPC5 또는 pcDNA3.1로 공동형질감염된 HM1 세포 유래의 대응 용균물(L). 두 블롯(A, B)은 항-SESTD1 항체 #148(1:5,000) 및 Alexa Fluor 680 염소 항-토끼(1:2,500)로 탐침했다.

도 10: siRNA의 형질감염은 HM1-C5Y 세포에서 SESTD1 단백질의 발현을 효과적으로 감소시킨다. HM1-C5Y 세포는 20nM 특이적 SESTD1 siRNA, 비특이적 대조용 siRNA 또는 리포좀 단독(모의)으로 형질감염시키고, 형질감염 후 48시간 후에 분석했다. 항-SESTD1 및 항-GAPDH 항체와 함께 항온처리된 웨스턴 블롯은 siRNA 형질감염된 세포에서 내인성 SESTD1 단백질 수준의 유의적인 감소를 나타냈다.

도 11: 사람 조직에서 SESTD1 mRNA의 발현. SESTD1 mRNA 발현은 여러 사람 조직에서 qRT-PCR로 측정하고 하우스키핑(housekeeping) 유전자 RPL37a의 발현에 대해 표준화했다. 제시된 데이터는 2반복의 평균이다.

1 뇌; 2 소뇌; 3 해마; 4 피질; 5 척수; 6 부신; 7 심장; 8 대동맥; 9 지방질; 10 비장; 11 골수; 12 골격근; 13 피부; 14 기관; 15 폐; 16 위; 17 소장; 18 결장; 19 간; 20 췌장; 21 신장; 22 유방; 23 난소; 24 자궁; 25 태반; 26 고환; 27 전립선; 28 AoSMC; 29 HUVEC. *는 TRPC4 또는 TRPC5의 유의적 발현이 보고된 조직을 나타낸다.

도 12: 사람 주요 세포에서 SESTD1 발현. 항-SESTD1 #148(1:5,000) 및 2차 Alexa Fluor 680 염소 항-토끼 항체(1:2,500)로 발색된 제시된 세포 샘플의 웨스턴 블롯. 각 레인에는 단백질 15㎍을 로딩했다. 하우스키핑 유전자 GAPDH를 병행 염색하여 동일한 로딩량을 입증했다.

도 13: 인지질의 SESTD1 결합은 Ca² ⁺ 의존적이다. GST-SESTD1은 Ca² ⁺ 의존적 방식으로 다양한 포스파티딜이노시톨포스페이트(PIP) 및 포스파티드산(PA)에 특이적으로 결합했지만, 다른 인지질에는 결합하지 않았다. PIP 스트립(Echelon)은 60nM 또는 2.5 μM 유리 Ca² ⁺을 함유하는 차단 완충액 중의 GST-SESTD1 또는 차단 완충액 중의 GST로 탐침한 뒤, 항-GST 항체(1:2,000) 및 HRP-커플링된 염소 항-토끼 항체(1:20,000)로 탐침했다. 시그널은 ECL(enhanced chemiluminescence)으로 검출했다.

도 14: DELFIA를 이용한 Cova-PIP 특이성 플레이트에서의 SESTD1-인지질 결합의 검출. 각각 100 pmol PIP_n이 로딩된 폴리스티렌 미세역가 웰을 주어진 농도의 GST-SESTD1 또는 단지 완충액으로만 3시간 동안 항온처리했다. 결합된 단백질은 항-GST(1:1,000) 및 2차 Eu-N1-표지화된 염소 항-토끼 항체(50ng/웰)로 검출했다. 란탄계열원소 형광(λ_exc=340nm, λ_em=620nm)을 측정했다.

<110> Sanofi-Aventis <120> Complexes of TRPC domains and SESTD1 domains and methods and uses involving the same <130> DE2007/050 <150> EP 07291300.7 <151> 2007-10-26 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(6) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(26) <223> Xaa = any amino acid <400> 1 Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gln Glu Val Xaa Arg Asn Leu Val Lys 1 5 10 15 Arg Tyr Val Ala Ala Met Ile Arg Xaa Xaa Lys Thr 20 25 <210> 2 <211> 29 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Leu Arg Arg His His Gln Tyr Gln Glu Val Met Arg Asn Leu Val Lys 1 5 10 15 Arg Tyr Val Ala Ala Met Ile Arg Glu Ala Lys Thr Glu 20 25 <210> 3 <211> 29 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Leu Ile Gln Asn Gln His Tyr Gln Glu Val Ile Arg Asn Leu Val Lys 1 5 10 15 Arg Tyr Val Ala Ala Met Ile Arg Asn Ser Lys Thr Asn 20 25 <210> 4 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> inserted leucine zipper <400> 4 Gly Gly Gly Ser Gly Ser Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Leu Glu 1 5 10 15 Glu Ile Leu Ser Lys Leu Tyr His Ile Glu Asn Glu Leu Ala Arg Ile 20 25 30 Lys Lys Leu Leu Gly Glu Arg Gly Gly Ser Gly Ser 35 40 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HA tag <400> 5 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antigen aa 265-280 of SESTD1 <400> 6 Lys Arg Gln Gln Leu Arg His Pro Glu Met Val Thr Thr Glu Ser 1 5 10 15 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antigen aa 682-696 of SESTD1 <400> 7 Cys Arg Gln Arg Ser Lys Arg Thr Gln Leu Glu Glu Ile Gln Gln Lys 1 5 10 15 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> siGENOME Set of 4, human SESTD1, Duplex 1 S <400> 8 gaacuuaauc agcaaauugu u 21 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> siGENOME Set of 4, human SESTD1, Duplex 1 A <400> 9 caauuugcug auuaaguucu u 21 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> siGENOME Set of 4, human SESTD1, Duplex 2 S <400> 10 uauagaacca ugccaauuau u 21 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> siGENOME Set of 4, human SESTD1, Duplex 2 A <400> 11 uaauuggcau gguucuauau u 21 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> siGENOME Set of 4, human SESTD1, Duplex 3 S <400> 12 gagaguacau agauuggaau u 21 <210> 13 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> siGENOME Set of 4, human SESTD1, Duplex 3 A <400> 13 uuccaaucua uguacucucu u 21 <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> siGENOME Set of 4, human SESTD1, Duplex 4 S <400> 14 ggaugaaacu aguuaaucuu u 21 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> siGENOME Set of 4, human SESTD1, Duplex 4 A <400> 15 agauuaacua guuucauccu u 21

Claims

- TRPC(transient receptor potential channel) 또는 이의 기능적 활성 변형체를 포함하거나 이것으로 이루어진 제1 단백질, 및
- SESTD1(SEC14 and spectrin domains 1)의 제1 스펙트린(Spec 1) 도메인을 포함하거나 이것으로 이루어진 제2 단백질
을 포함하는, 분리된 복합체.
- 도메인이 서열 LXXXXXYQEVXRNLVKRYVAAMIRXXKT(서열번호 1)(여기서, 각 X는 임의의 아미노산 잔기를 나타낸다)을 보유하는, TRPC 또는 이의 기능적 활성 변형체의 도메인을 포함하거나, 이 도메인으로 이루어진 제1 단백질, 및
- SESTD1의 Spec1 도메인을 포함하거나 이 도메인으로 이루어진 제2 단백질
을 포함하는, 분리된 복합체.
- TRPC 또는 이의 기능적 활성 변형체를 포함하거나 이것으로 이루어진 제1 단백질, 및
- 안키린 반복 도메인 35(ANKRD35), 아포지단백질 A-I 결합 단백질(APOA1BP), 아연 핑거 도메인에 인접한 브로모도메인(BAZ1B), 고 이동성 그룹 단백질 2-유사1 이소폼 b(HMG2L1), 마코린 RING 핑거 단백질 1(MKRN1), B-전구세포 백혈병 호메오박스 상호작용 단백질 1(PBXIP1), 육종 항원 NY-SAR-48, 스펙트린 알파 비-적혈구성 단백질 1(SPTAN1), 염색체 3의 구조 유지 단백질(SMC3) 및 탈린 2(TLN2)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 단백질을 포함하거나, 이것으로 이루어지는 제2 단백질
을 포함하는, 분리된 복합체.
제1항 또는 제3항에 있어서, TRPC가 TRPC4, TRPC5 및 TRPC6으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 특히 TRPC4 또는 TRPC5이거나, 특히 TRPC4α 또는 TRPC4β 또는 TRPC5인 복합체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 단백질이 서열 LRRHHQYQEVMRNLVKRYVAAMIREAKTE(서열번호 2) 또는 LIQNQHYQEVIRNLVKRYVAAMIRNSKTN(서열번호 3)을 포함하는 복합체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, TRPC가 포유동물의 TRPC, 특히 쥐 또는 사람 TRPC인 복합체.
제1항, 제2항, 제4항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 단백질이 SESTD1을 포함하거나 이것으로 이루어지는 복합체.
제1항, 제2항, 제4항, 제5항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, SESTD1이 포유동물의 SESTD1, 특히 래트, 쥐 또는 사람 SESTD1인 복합체.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 제1 단백질,
- 제1항, 제2항, 제3항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 정의된 제2 단백질, 및
- 제1 및 제2 단백질의 상호작용을 검출하는 수단
을 포함하는, 검사 시스템.
a) 제9항의 검사 시스템을 물질과 접촉시키는 단계, 및
b) 상기 검사 시스템과 상기 물질의 상호작용시 측정가능한 시그널을 검출하여, 상기 물질을 TRPC 조절인자로서 동정하는 단계
를 포함하는, TRPC 조절인자의 선별 방법.
제10항에 있어서, 상기 검사 시스템의 제1 및 제2 단백질 간의 상호작용에 미치는 상기 물질의 영향이 직접 검출되는 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 제1 및/또는 제2 단백질이, 검출가능한 마커를 포함하는 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 측정가능한 시그널의 검출이 제1 단백질에 대한 특이적 항체 및/또는 제2 단백질에 대한 특이적 항체의 사용을 포함하는 방법.
제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, TRPC 조절인자가 제2 단백질에 대한 제1 단백질의 결합을 증강시키거나, 바람직하게는 손상시키거나 저해하는 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에서 제2 단백질로서 정의된 단백질, 및
- 인지질, 및
- 상기 단백질과 상기 인지질의 상호작용을 검출하는 수단
을 포함하는 검사 시스템.
제15항에 있어서, 인지질이 리소포스파티드산, 리소포스포콜린, 포스파티딜-이노시톨-(3)포스페이트, 포스파티딜-이노시톨-(4)포스페이트, 포스파티닐-이노시톨-(5)포스페이트, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 스핑고신-1-포스페이트, 포스파티딜이노시톨 (3,4) 비스포스페이트, 포스파티딜이노시톨 (3,5) 포스페이트, 포스파티딜이노시톨 (4,5) 비스포스페이트, 포스파티딜이노시톨 (3,4,5) 트리스포스페이트, 포스파티드산, 포스파티딜세린 및 모노포스페이트로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
c) 제15항 또는 제16항의 검사 시스템을 물질과 접촉시키는 단계; 및
d) 상기 검사 시스템과 상기 물질의 상호작용시 측정가능한 시그널을 검출하여, 단백질과 인지질 간의 상호작용의 조절인자로서 상기 물질을 동정하는 단계
를 포함하여, 단백질과 인지질의 상호작용의 조절인자를 선별하는 방법.
제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 내피 기능장애를 수반하는 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 약제의 선별에 사용되는 방법.
제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 심혈관 질환, 심장 비대, 심부전, 허혈, 신생내막 과형성, 특발성 확장성 심근병증, 고혈압, 심장동맥 증후군, 심장 부전, 신장 부전, 혈전증, 만성 호흡기 질환, 천식, 만성 폐색성 폐 장애, 특발성 폐 고혈압, 급성 저산소폐혈관수축, 염증성 폐색 질환 및 죽상동맥경화증을 예방 및/또는 치료하기 위한 약제의 선별에 사용되는 방법.
TRPC 조절인자의 동정을 위한, 제9항에 따른 검사 시스템의 용도.