CN110777186A - Trpc1对高糖培养的内皮细胞功能影响的实验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了TRPC1对高糖培养的内皮细胞功能影响的实验方法，具体包括以下步骤：体外培养人脐静脉内皮细胞HUVEC、实验分组、检测体外高糖培养下TRPC1表达水平、上调TRPC1、HUVEC功能损伤检测、统计学分析，结果表明：TRPC1下调参与糖尿病内皮细胞功能损伤过程，TRPC1过表达能够改善高糖所致的细胞增殖、迁移功能障碍以及氧化应激水平，使SOD活性上升，MDA含量降低，ROS合成降低。本发明为TRPC1作为靶点治疗糖尿病血管病变的，改善糖尿病内皮细胞功能并发挥其促进血管损伤修复的作用提供新理论和策略。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体地说，是TRPC1对高糖培养的人脐静脉内皮细胞功能的研究方法。
背景技术
糖尿病是现阶段最常见的疾病之一，糖尿病血管病变是糖尿病人最常见的并发症之一，极大程度上降低了糖尿病病人生存质量，这也是糖尿病患者残疾和死亡的主要原因之一。近年研究已经证实，处于高糖状态下的内皮细胞功能将失常，且血管病变的始动环节之一就是血管内皮细胞的损伤、功能的紊乱，因此如何恢复血管内皮细胞功能很可能是预防治疗糖尿病血管病变进程的关键。越来越多研究指出：TRPC1能影响内皮细胞修复血管的能力。但由于目前仍未阐明糖尿病血管病变发展过程中TRPC1对内皮细胞功能异常的相关机制，极大地妨碍了以TRPC1为靶点治疗糖尿病血管病变的进程。因此迫切需要阐明TRPC1对糖尿病内皮细胞功能损害的影响和机制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种TRPC1对高糖培养的内皮细胞功能影响的实验方法，通过该方法可以得出TRPC1对糖尿病内皮细胞功能的影响机制。
本发明是通过如下的技术方案来实现的：
TRPC1对高糖培养的内皮细胞功能影响的实验方法，包括以下步骤：
S1、体外培养人脐静脉内皮细胞HUVEC：细胞培养在10％Gibco胎牛血清+1％双抗的低糖DMEM培养基中，置于5％CO2、37℃的细胞培养箱中培养，待细胞融合达80％后，用0.125％胰蛋白酶-EDTA消化传代；
S2、实验分组：将实验组分为正常对照组、渗透压对照组、高糖组、高糖+腺病毒GFP对照组、高糖+腺病毒介导TRPC1过表达组，其中腺病毒过表达TRPC1需要在高糖培养前24h作用于HUVEC，且高糖培养48h后进行后续实验。
S3、采用WB方法检测不同实验组的TRPC1蛋白表达情况；
S4、HUVEC功能损伤检测；
S5、统计分析：数据均用统计学软件SPSS处理，结果以平均值±标准差表示。
进一步地，步骤S3中WB方法检测TRPC1蛋白表达情况时采用的具体步骤为：
S31、RIPA裂解液提取细胞总蛋白；
S32、BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度；
S33、10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，上样；
S34、采用半干转法将蛋白转移到PVDF膜上，孵育TRPC1及内参GAPDH一抗，放入4度冰箱过夜；
S35、继续用二抗室温孵育2h，用TBST洗膜3次，每次5分钟；
S36、取ECL试剂A液和B液各1mL，混合后覆盖在PVDF膜上至暗处观察有荧光为止；
S37、将膜放入化学发光成像仪中曝光、显影。
进一步地，步骤S4中HUVEC功能损伤检测主要有以下几种：
S41、采用CCK-8试剂盒检测HUVEC的活性与增殖能力；
S42、采用Transwell细胞迁移实验检测HUVEC的迁移能力；
S43、采用荧光探针DCFH-DA检测活性氧ROS；
S44、采用硫代巴比妥酸法TBA测定丙二醛MDA含量；
S45、采用WST-1方法测定超氧化物歧化酶SOD；
进一步地，结果分析采用如下方法：
(1)将正常对照组、渗透压对照组、高糖组、高糖+腺病毒GFP对照组、高糖+腺病毒介导TRPC1过表达组的蛋白表达水平与正常对照组的蛋白表达水平进行比较，比值＞1，表明蛋白表达水平升高，比值＝1，表明蛋白表达水平不变，比值＜1时，表明蛋白表达水平降低；
(2)将正常对照组、高糖组、HG+腺病毒GFP对照组、HG+腺病毒介导TRPC1过表达组的细胞增殖能力与正常对照组的细胞增殖能力进行比较，比值＞1时，表明细胞增殖能力升高，比值＝1，表明细胞增殖能力不变，比值＜1时，表明细胞增殖能力降低。
(3)将高糖组、HG+腺病毒GFP对照组、HG+腺病毒介导TRPC1过表达组的细胞迁移能力与正常对照组的细胞增殖能力进行比较，判断细胞增殖能力的变化；
(4)将高糖组、HG+腺病毒GFP对照组、HG+腺病毒介导TRPC1过表达组的MDA含量与正常对照组的MDA含量进行比较，判断细胞的氧化应激水平变化；
(5)将高糖组、HG+腺病毒GFP对照组、HG+腺病毒介导TRPC1过表达组的ROS含量与正常对照组的ROS含量进行比较，判断细胞的氧化应激水平变化；
本发明相对于现有技术，有益效果在于：首次进行TRPC1对高糖培养的人脐静脉内皮细胞HUVEC的研究，发现TRPC1下调参与糖尿病内皮细胞功能损伤过程，TRPC1过表达能够改善高糖所致的细胞增殖、迁移功能障碍以及氧化应激水平。该发现为TRPC1的开发利用提供理论基础与实验依据，对糖尿病血管疾病的治疗具有重要意义。
附图说明
图1是本发明的不同处理组HUVEC的WB条带图；
图2是本发明的不同处理组HUVEC上TRPC1蛋白表达；
图3是本发明的腺病毒处理后HUVEC的WB条带图；
图4是本发明的腺病毒处理后HUVEC上TRPC1蛋白表达；
图5是本发明的腺病毒处理后HUVEC的细胞增殖图；
图6是本发明的腺病毒处理后HUVEC的细胞迁移图；
图7是本发明的腺病毒处理后HUVEC的MDA含量图；
图8是本发明的腺病毒处理后HUVEC的ROS含量图；
图9是本发明的腺病毒处理后HUVEC的SOD活性图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
以下实验所用的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自中国科学院上海细胞库，Gibco胎牛血清FBS购自杭州科涛生物技术有限公司，DMEM培养基购自浙江纳德科学仪器有限公司，4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购自杭州以恒生物科技有限公司，腺病毒由纽恩(上海)生物科技有限公司包装，过表达TRPC1的腺病毒由纽恩(上海)生物科技有限公司合成；BCA蛋白浓度测定试剂盒、脂质氧化(MDA)检测试剂盒、活性氧检测试剂盒等均购自碧云天生物技术公司；超氧化物歧化酶(SOD)测试盒购自南京建成生物工程研究所；TRPC1兔多克隆抗体购自Proteintech公司；抗GAPDH兔多克隆抗体、兔二抗均购自杭州联科生物技术有限公司；过硫酸铵(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸钠(SDS)、D-葡萄糖(D-glucose)、甘露醇(mannitol)等均购自美国Sigma公司。
实验方法：
1、HUVEC的体外培养
细胞培养在10％FBS+1％双抗(100ug/L青霉素+100ug/L链霉素)的低糖DMEM培养基中，置于5％CO2、37℃的细胞培养箱中培养。待细胞融合达80％后，用0.125％胰蛋白酶-EDTA消化传代。
2、实验分组及处理
正常对照组NG(Control，基础葡萄糖5.5mM)、渗透压对照组(Mannitol，加甘露醇19.5mM)、高糖组(HG，25mM)、高糖+腺病毒GFP对照组(HG+adGFP)、高糖+腺病毒介导TRPC1过表达组(HG+adTRPC1)，其中腺病毒过表达TRPC1皆在高糖培养前24小时作用HUVEC，且高糖培养48小时后进行后续实验。腺病毒感染细胞的载入方式及加载量：细胞密度约60％左右时，吸去细胞原有培养基，加入新鲜培养基，选定MOI(病毒感染单位数/细胞数)值为10，将病毒原液直接加入细胞中，摇匀。然后放入37℃培养箱中继续感染4小时，之后取出细胞，吸去含病毒的培养液，换上新鲜培养基，继续37℃培养。
3、检测体外高糖培养下TRPC1表达水平
采用WB方法检测TRPC1水平的变化。应用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，每孔上样量30μg，半干转法将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，孵育TRPC1(1:1000稀释，R)及内参GAPDH一抗(1:2000稀释，R)，放入4度冰箱过夜，用二抗(R，1:5000稀释)室温孵育2h，用TBST洗膜3次，每次5分钟。取ECL试剂A液和B液各1mL，混合后覆盖在PVDF膜上至暗处观察有荧光为止，然后将膜放入化学发光成像仪中曝光、显影。显影时观察内参的影像条带(如图1和图3)，影像的条带粗细深浅一致则说明已调齐。
4、检测HUVEC功能损伤：
采用CCK-8试剂盒(CellCountingKit-8)检测HUVEC活性与增殖能力。往有细胞的96孔板中，每孔加入10μlCCK-8试剂，采用相应细胞培养液和CCK-8检测液在没有加入细胞的孔作为空白对照，于37℃恒温箱中孵育3h，酶标仪450nm下读取吸光度OD值。
采用Transwell细胞迁移实验检测HUVEC迁移能力。细胞胰蛋白酶消化重悬种在24孔的Transwell小室中，24h后固定、染色，随机选择高倍(400×)视野5个进行拍照，观察并计数迁移到小室膜下面的细胞，取平均值作为迁移细胞数。
硫代巴比妥酸法(TBA)测定丙二醛(MDA)含量：使用细胞裂解液裂解细胞后，10,000g-12,000g离心10分钟取上清，取100μl上清液加入EP管，随后加入200μlMDA检测工作液，混匀后在100℃或沸水浴加热15min；冷却至室温，1000g室温离心10分钟；取200μl上清液加入到96孔板中，随后用酶标仪在532nm测定吸光度，并计算MDA含量。
采用荧光探针DCFH-DA测定活性氧(ROS)：去除96孔板细胞培养液，每孔加入100μl浓度10μM的DCFH-DA，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA，采用荧光酶标仪法，在488nm激发波长、525nm发射波长下检测ROS荧光强度。
采用WST-8方法测定超氧化物歧化酶(SOD)：吸净细胞培养液，用4℃预冷的PBS洗涤一遍，加入试剂盒提供的SOD样品制备液，适当吹打以充分裂解细胞，4℃约12,000g离心3-5分钟，取上清液作为待测样品，取20μl上清液加入到96孔板中，并依次加入160μlWST-8/酶工作液与20μl反应启动工作液，充分混匀后，37℃孵育30分钟，酶标仪在450nm测定吸光度。
5、统计学方法
所有实验均重复三次，数据均用统计学软件SPSS处理，结果以平均值(mean)±标准差(SD)表示，采用方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
实验结果：
参见图2，图中横坐标分别为正常对照组(NG)、渗透压对照组(Mannl)
高糖培养人体静脉细胞24小时(HG-24h)，高糖培养人体静脉细胞48小时(HG-48h)，纵坐标为各个分组的蛋白表达水平与正常对照组(NG)的蛋白表达水平的比值。比值＞1时，表明蛋白表达水平升高，比值＝1，表明蛋白表达水平不变，比值＜1时，表明蛋白表达水平降低。从图中可以看出，与正常对照组(NG)比较，渗透压对照组(Mannl)的TRPC1蛋白表达水平不变，高糖组(HG)的TRPC1蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与24h相比，高糖处理48h后TRPC1蛋白表达水平进一步降低，差异有统计学意义(P<0.05)。有此可知，高糖显著降低了TRPC1蛋白的表达。
参见图4，图中横坐标分别为正常对照组(NG)、高糖组(HG)、HG+腺病毒GFP对照组(HG+adGFP)、HG+腺病毒介导TRPC1过表达组(HG+adTRPC1)，纵坐标为各个分组的蛋白表达水平与正常对照组(NG)的蛋白表达水平的比值，比值＞1时，表明蛋白表达水平升高，比值＝1，表明蛋白表达水平不变，比值＜1时，表明蛋白表达水平降低。与正常对照组(NG组)比较，HG+腺病毒GFP对照组的RPC1蛋白表达水平降低，HG+腺病毒介导TRPC1过表达组的蛋白表达水平升高。由此可知，过表达TRPC1使TRPC1蛋白表达增加，而不是作为载体的腺病毒本身。
参见图5，图中横坐标分别为正常对照组(NG)、高糖组(HG)、HG+腺病毒GFP对照组(HG+adGFP)、HG+腺病毒介导TRPC1过表达组(HG+adTRPC1)，纵坐标为各个分组的细胞增殖能力与正常对照组(NG)的细胞增殖能力的比值，比值＞1时，表明细胞增殖能力升高，比值＝1，表明细胞增殖能力不变，比值＜1时，表明细胞增殖能力降低。与对照组(NG组)比较，高糖组(HG组)、高糖+腺病毒GFP对照组(HG+adGFP)的细胞增殖能力降低，高糖+腺病毒介导TRPC1过表达组(HG+adTRPC1)的细胞增殖能力升高，差异有统计学意义(P<0.05)。由此可知，上调TRPC1可逆转高糖导致的HUVEC的细胞增殖能力。
参见图6，图中横坐标分别为正常对照组(NG)、高糖组(HG)、HG+腺病毒GFP对照组(HG+adGFP)、HG+腺病毒介导TRPC1过表达组(HG+adTRPC1)，纵坐标为各个分组的细胞迁移能力。与对照组(NG组)比较，高糖组(HG组)、高糖+腺病毒GFP对照组(HG+adGFP)的细胞迁移能力降低，高糖+腺病毒介导TRPC1过表达组(HG+adTRPC1)的细胞迁移能力升高差异有统计学意义(P<0.05)。由此可知，上调TRPC1可逆转高糖导致的HUVEC的细胞迁移能力。
参见图7，图中横坐标分别为正常对照组(NG)、高糖组(HG)、HG+腺病毒GFP对照组(HG+adGFP)、HG+腺病毒介导TRPC1过表达组(HG+adTRPC1)，纵坐标为各个分组的MDA含量。与对照组(NG组)比较，高糖组(HG组)、高糖+腺病毒GFP对照组(HG+adGFP)的MDA含量升高，高糖+腺病毒介导TRPC1过表达组的MDA含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；由此可知，上调TRPC1可逆转高糖导致的HUVEC的MDA含量。
参见图8，图中横坐标分别为正常对照组(NG)、高糖组(HG)、HG+腺病毒GFP对照组(HG+adGFP)、HG+腺病毒介导TRPC1过表达组(HG+adTRPC1)，纵坐标为各个分组的ROS含量。与对照组(NG组)比较，高糖组(HG组)、高糖+腺病毒GFP对照组(HG+adGFP)的ROS含量升高，高糖+腺病毒介导TRPC1过表达组的ROS含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；由此可知，上调TRPC1可逆转高糖导致的HUVEC的ROS含量。
参见图9，图中横坐标分别为正常对照组(NG)、高糖组(HG)、HG+腺病毒GFP对照组(HG+adGFP)、HG+腺病毒介导TRPC1过表达组(HG+adTRPC1)，纵坐标为各个分组的细胞SOD活性。与对照组(NG组)比较，高糖组(HG组)、高糖+腺病毒GFP对照组(HG+adGFP)的SOD活性降低，高糖+腺病毒介导TRPC1过表达组的SOD活性上升，差异有统计学意义(P<0.05)；由此可知，上调TRPC1可逆转高糖导致的HUVEC的SOD活性。
实验结论：
高血糖导致的氧化应激是促使血管内皮细胞损伤的主要原因，氧化应激一方面是由于催化活性氧的酶活性增强；另一方面是清除ROS等酶类如超氧化物歧化酶(SOD)活性降低，导致脂质过氧化反应的产物丙二醛(MDA)增多，活性氧大量堆积。因此，可以得出以下结论：(1)高糖环境下人脐静脉内皮细胞的TRPC1表达水平降低，细胞增殖、迁移功能明显减弱；而在过表达TRPC1后能够显著改善高糖导致的细胞增殖、迁移功能障碍；(2)高糖环境下人脐静脉内皮细胞内MDA含量增加，ROS合成增多，SOD活性下降；TRPC1过表达后能逆转高糖所致的氧化应激水平升高，使SOD活性上升，MDA含量降低，ROS合成降低。
氧化应激可能是TRPC1参与糖尿病内皮细胞功能受损的下游信号分子。据此我们推测下调TRPC1是高糖引起血管内皮细胞功能障碍比较上游的分子机制，而且TRPC1的下调很可能是通过扰乱细胞内Ca2+稳态进而加重氧化应激过程参与糖尿病导致的血管内皮功能障碍的。
上述的对实施例的描述是为便于本技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对上述实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.TRPC1对高糖培养的内皮细胞功能影响的实验方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、体外培养人脐静脉内皮细胞：细胞培养在10％Gibco胎牛血清+1％双抗的低糖DMEM培养基中，置于5％CO2、37℃的细胞培养箱中培养，待细胞融合达80％后，用0.125％胰蛋白酶-EDTA消化传代；
S2、实验分组：将实验组分为正常对照组、渗透压对照组、高糖组、高糖+腺病毒GFP对照组、高糖+腺病毒介导TRPC1过表达组，其中腺病毒过表达TRPC1需要在高糖培养前24h作用于HUVEC，且高糖培养48h后进行后续实验；
S3、采用WB方法检测不同实验组的TRPC1蛋白表达情况；
S4、人脐静脉内皮细胞的功能损伤检测；
S5、统计分析：数据均用统计学软件SPSS处理，结果以平均值±标准差表示。
2.根据权利要求1所述的TRPC1对高糖培养的内皮细胞功能影响的实验方法，其特征在于，步骤S3中WB方法检测TRPC1蛋白表达情况时采用的具体步骤为：
S31、RIPA裂解液提取细胞总蛋白；
S32、BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度；
S33、10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，上样；
S34、采用半干转法将蛋白转移到PVDF膜上，孵育TRPC1及内参GAPDH一抗，放入4度冰箱过夜；
S35、继续用二抗室温孵育2h，用TBST洗膜3次，每次5分钟；
S36、取ECL试剂A液和B液各1mL，混合后覆盖在PVDF膜上至暗处观察有荧光为止；
S37、将膜放入化学发光成像仪中曝光、显影。
3.根据权利要求1所述的TRPC1对高糖培养的内皮细胞功能影响的实验方法，其特征在于，步骤S4中HUVEC功能损伤检测主要有以下几种：
S41、采用CCK-8试剂盒检测HUVEC的活性与增殖能力；
S42、采用Transwell细胞迁移实验检测HUVEC的迁移能力；
S43、采用荧光探针DCFH-DA检测活性氧ROS；
S44、采用硫代巴比妥酸法TBA测定丙二醛MDA含量；
S45、采用WST-1方法测定超氧化物歧化酶SOD。
4.根据权利要求1所述的TRPC1对高糖培养的内皮细胞功能影响的实验方法，其特征在于，步骤S5中的统计分析的方法如下所示：
(1)将正常对照组、渗透压对照组、高糖组、高糖+腺病毒GFP对照组、高糖+腺病毒介导TRPC1过表达组的蛋白表达水平与正常对照组的蛋白表达水平进行比较，比值＞1，表明蛋白表达水平升高，比值＝1，表明蛋白表达水平不变，比值＜1时，表明蛋白表达水平降低；
(2)将正常对照组、高糖组、HG+腺病毒GFP对照组、HG+腺病毒介导TRPC1过表达组的细胞增殖能力与正常对照组的细胞增殖能力进行比较，比值＞1时，表明细胞增殖能力升高，比值＝1，表明细胞增殖能力不变，比值＜1时，表明细胞增殖能力降低。
(3)将高糖组、HG+腺病毒GFP对照组、HG+腺病毒介导TRPC1过表达组的细胞迁移能力与正常对照组的细胞增殖能力进行比较，判断细胞增殖能力的变化；
(4)将高糖组、HG+腺病毒GFP对照组、HG+腺病毒介导TRPC1过表达组的MDA含量与正常对照组的MDA含量进行比较，判断细胞的氧化应激水平变化；
(5)将高糖组、HG+腺病毒GFP对照组、HG+腺病毒介导TRPC1过表达组的ROS含量与正常对照组的ROS含量进行比较，判断细胞的氧化应激水平变化；
(6)将高糖组、HG+腺病毒GFP对照组、HG+腺病毒介导TRPC1过表达组的SOD活性与正常对照组的SOD活性进行比较，判断细胞的氧化应激水平变化。
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