TW200934789A

TW200934789A - Complexes of TRPC domains and SESTD1 domains and methods and uses involving the same

Info

Publication number: TW200934789A
Application number: TW097140558A
Authority: TW
Inventors: Carsten Struebing; Susanne Miehe
Original assignee: Sanofi Aventis
Priority date: 2007-10-26
Filing date: 2008-10-23
Publication date: 2009-08-16
Also published as: MX2010004097A; EP2053059A1; CA2702508A1; WO2009052971A1; EP2205628A1; JP2011501757A; CN101848933A; AU2008315951A1; KR20100076992A; US20100330697A1; IL205218A0; AR069007A1

Description

200934789 六、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明有關於一種包含有一第一蛋白質（含有一瞬時受體電位通道(transient receptor potential channel，TRPC)或 5 其功犯/舌性變異體(functionally active variant)或由瞬時受體電位通道蛋白或其一功能活性變異體所構成）以及一第一蛋白質（含有SEC 14的第一血影蛋白（f|rst： Spectrin，spec 1) ❹ 功能部位以及血影蛋白功能部位1 (SESTD 1)或由SEC14 的第一血影蛋白功能部位以及血影蛋白功能部位1所構成） 10 之經分離的複合體、一種含有該第一蛋白質以及該第二蛋白質還有用於偵測該第一與第二蛋白質之交互作用的裝置的試驗系統、一種使用該系統供篩選有關一 TRpc調節子 (modulator)的方法以及該試驗系統用於鑑定一 TRpc調節子的用途。 15 【先前技術】 © 典型的瞬時受體電位通道蛋白（transient recept〇]r potential channel，TRPC)構成一個非專一性陽離子通道的家族。它們首先被發現為果蠅屬(Z>r〇y印Μα) TRP的哺乳動物 20 同源物並且是與它已被描述之無脊椎動物祖先最為相近的亞科。儘管有這些事實，關於它們的天然組成以及活化機制、生理學功能以及在病理生理學與疾病中所扮演的角色仍有許多懸而未決的問題。天然TRPC通道的原位鑑定（zw价w identification)因為 4 200934789 它們廣泛以及部份重疊的分布、可能的異體多元化 (heteromultimerization)、相似的電生理學性質以及缺乏工具化合物(tool compounds)來明確追蹤這些通道而變得複雜。已知的有機抑制劑，例如硼酸2-.胺基乙氧基二苯酯 5 P-aminoethoxydiphenyl borate, 2-APB)、益康峻(econazole)、氟芬那酸丁酯（flufenamate)、釕紅(ruthenium red)、SK&F 96365，以及無機阻斷劑，例如Gd3+、La3+都不夠有效力以及專一性。在轉殖小鼠的研究上已證實在解開某些TRPCs 的可能生理學功能上是有償值的。然而，到目前為止這些 1〇模型系統不存在有關7種哺乳動物TRPC通道的每一者，它們的產生以及分析是耗時並且耗費的，並且因為它們藉由親近相關連的通道而對補償效應(compensatory effects)是有弱點的，它們也具有限制。利用顯性陰性通道次單位 (dominant negative channel subunit)或使用小干擾 RNA 15 (small interfering RNA，siRNA)的基因中斷(gene disruption) 的研究會分別地視蛋白質表現的誘導或抑制而定。因為這 ® 可能會耗費某些時間’補償效應也是可能的，當通道是以一選擇性工具化合物立即予以阻斷時’補償效應不期望被看見。 20 區別工具化合物的重要性以及價值是TRPV1-標把藥物(TRPV-targetingdrugs)的快速發展所強調的。這個通道亦屬於TRP超家族(TRP superfamily)並且它的生理學功能尚未透過使用一個專一性活化劑（辣椒素（capsaicin))而被解開。在它的選殖的10年之後，某些臨床試驗正在進行中並 5 200934789 且試驗TRPV1調節在一些病徵(indications)中（例如在不同類型的疼痛、偏頭痛以及急迫性尿失禁（urinary urge incontinence))的治療價值。内皮辦傳訊的失調（dysregulation of endothelial calcium 5 signaling)涉入一些心金管病理學效應，諸如動脈粥樣硬化 (atherosclerosis)、冠心症(coronary syndrome)、心臟與腎臟衰竭（heart and renal failure)、高血壓以及血栓症 Ο (thrombosis)。來自於 TRPC4-缺乏小鼠(TRPC-deficient mice) 的證據暗示它對於促效劑誘發的内皮依賴性血管舒張 ίο (agonist-induced endothelium-dependent vascular relaxation) 的必要性以及它涉入調節内皮屏障功能(endothelial barrier function)。因此，調節TRPCs，諸如TRPC4，對於治療前述病理生理學病況來說可能是一種有希望的方法。然而，有關TRPCs的藥物開發受到要在異源表現系統 15 (heterologous expression systems)中準確地重組天然電流的障礙所阻礙。 ❹ 【發明内容】因此，本發明之一個目的是要發展新的藥理學工具， 20 其可被用來獲得TRPC通道功能在細胞中的一個較佳理解並且此外，以及要鑑定TRPC通道複合體的新穎調控子 (regulators)或調節子(modulators)。較佳地，新穎的工具提供合算的並且便利的物質的測試，諸如高通量_選方法 (high throughput screening methods)。 6 200934789 本發明之目的是透過提供一經分離的複合體而被解決，該複合體包含有： _第一蛋白質，含有一瞬時受體電位通道(TRPC)或其一功能活性變異體或由瞬時受體電位通道或其一功能活性 5 變異體所構成，以及第一蛋白貝，含有SEC 14的第一血影蛋白（Spec 1)功能部位以及血影蛋白功能部位1 (SESTD 1)或由SEC14的 ❹ 第一金影蛋白（Spec 1)功能部位以及血影蛋白功能部位1 所構成。 1〇一個另擇的經分離的複合體包含有： • 一第一蛋白質’含有一瞬時受體電位通道(TRPC)或其一功能活性變異體的一功能部位或由瞬時受體電位通道 (TRPC)或其一功能活性變異體的一功能部位所構成，該、功能部位具有序列 LXXXXXYQEVXRNLVKRYVAAMIRXXKT(序 15 列辨識編號：1)，其中各個X表示任一種胺基酸殘基，以及 ❹ -一第二蛋白質，含有SESTD1的Spec 1功能部位或由 SESTD1的Spec 1功能部位所構成。因此，本發明的一第一以及第二方面有關於 20 一種經分離的複合體，包含有： -一第一蛋白質，含有一瞬時受體電位通道(TRPC)或其一功能活性變異體或由瞬時受體電位通道或其一功能活性變異體所構成，以及、 -一第二蛋白質，含有SEC14的第一血影蛋白（Spec 1) 200934789 功能部位以及血影蛋白功能部位1 (SESTD丨）或由 SEC14的第一血影蛋白（Spec 1)功能部位以及血影蛋白功能部位1所構成。 —種經分離的複合體，其包含有：第一蛋白質，含有一瞬時受體電位通道(TRPC)或其一功能活性變異體的一功能部位或由瞬時受體電位通道或其一功能活性變異體的一功能部位所構成，該功能部位具 10 有序列 LXXXXXYQEVXRNLVKRYVAAMIRXXKT (序列辨識編號：1) ’其中各個X表示任一種胺基酸殘基，以及第二蛋白質’含有SESTD1的Spec 1功能部位或由SESTD1的Spec 1功能部位所構成。

15 Q 在本發明的上下文中，如此處所定義的一種經分離的一 σ體是有關於不在它的天然環境中之一種具有第一與第 ⑶蛋白質的複合體。因此，「經分離的複合體（is〇lated 擊P ex)」與不是如此處所定義的 20 TRPC以及SESTD1的訊 ^ 一遞的部分之蛋白質沒有關聯’或它（或它的組份)是分離被正吊地出現的細胞或是分離自一編碼同一者的核酸已質♦見的細胞或基本上沒有來自相同細胞來源的其他蛋白乂入各自的訊號傳遞路徑。複合體可以是一天然地存此〇’較佳地一具有TRPC以及SESTD1或其部分(如質，定義）的天然地存在的複合體。然而，複合體的蛋白可r 了以因為它們並非天然地存在而為人工的，因為它們 '函括一或多個天然地未被彼此結合的部分，例如，一 8 200934789 含有如此處所定義之一部分TRPC或SESTD1或由如此處所定義之一部分TRPC或SESTD1所構成的融合蛋白，以及又一蛋白質諸如一第二功能部位或其他用於例如偵測和/ 或純彳匕目的之組份。 5 較佳地，術語「經分離的複合體」表示一種蛋白質複合體’它基本上是從它的天然環境的其他細胞組份被分、離。然而’在複合體的蛋白質的分離之後，細胞組份可以 ❹ 被再次添加，例如用於測量訊號傳遞路徑。此外，習於技藝者將了解到，經分離的複合體是要被維持在容許該經分 10 離的複合體之活性的適當條件(例如適當的緩衝劑、pH值、離子等等）下。本發明之複合體的第一蛋白質含有下列或由下列所構成： -在一第一選擇中一瞬時受體電位通道(TRPC)或其一功能 15 活性變異體或 ❹ 、 -在一第二選擇中一瞬時受體電位通道(TRPC)或其一功能活性變異體的一功能部位，該功能部位具有序列 LXXXXXYQEVXRNLVKRYVAAMIRXXKT (序列辨識編 20 號：U ’其中各個X表示任一種胺基酸殘基。 TRPC可以是任一種天然地存在的TRPC。根據胺基酸序列同源性（amino acid sequence homology)以及功能相似性(functional similarities) ’ TRPCs 可以被次分類成 4 群。在 TRPC家族中特別與眾不同的，TRPC1以及TRPC2本身各 9 200934789 5 Ο 10 15 ❹ 20 自構成一個次家族(subfamily)，而TRPC4以及-5被合併成 TRPC3、-6以及-7。這些次家族成員之内的異體交互作用 (heteromeric interactions)還有 TRPC1 與 TRPC4/5-或 TRPC3/6/7-次家族成員的共組合(coassembiy)已被顯示。長久以來被認為在TRPC4/5以及TRPC3/6/7次群之間沒有交叉關聯(cross-association)發生，但近來一内源性氧化還原敏感性 TRPC3/4 異體聚合物（endogenous redox-sensitive TRPC3/4 heteromer)已在豬主動脈内皮細胞中被報導。 7種TRPCs將在下面以它們的可能活體内功能而被介紹。 77^PC7次家廣：廣泛表現的同體TRPC1的研究已受到細胞株中缺少異位蛋白質（ectopic protein)的細胞膜標乾 (plasma membrane targeting)所阻礙。根據所使用的過度表現系統（overexpression system)，報導範圍從缺少強力 TRPC1訊號（因為細胞内膜的維持）至在sf9細胞中的通道性質的詳細描述。可能的解釋是在過度表現系統中缺少辅助次單位(auxiliary subunits)或交互作用蛋白質。TRPC1的細胞膜表現已被顯示會視與其他蛋白質（例如TRPCs、小窩蛋白-1 (caveolin-1)以及Rho A)的交互作用而定。在sf9細胞中也沒有確認同-或異體或即使天然的通道(可受到TRPC1所刺激)被測量。至目前為止’被異位地表現的同體TRPC1 被描述作為受體_、DAG-、IP3R-或張力（stretch)-活化的通道或作為一非-功能性通道次單位以及一天然TRPC1同種聚合物(homomer)的存在迄金不是明確地被證實。但是内源性 10 200934789 蛋白質對於浦金埃細胞中的刺激性突觸後電導(excitatory postsynaptic conductance，EPSC)是需要的，因此它可能涉入神經元可塑性(neuronal plasticity)。再者，TRPC1在新生内膜增生（neointimal hyperplasia)以及心肥大（cardiac hypertrophy)上是被向上調節（upregulated)並且它的功能可以在蒙受杜興氏肌肉失養症(Duchenne muscular dystrophy) 所苦的病患中是被影響的。近來，有關TRPC1的一個角色在乳癌中被提出。TRPC1亦已被報導與TRPP2 (—種較遠地相關之涉入多囊性腎病(polycystic kidney disease)的發展的TRP蛋白質）交互作用。總結’ TRPC1似乎從事一些病理 -與生理學過程並且它的一些功能性角色不是易於藉由相關的TRPCs而被補償。這些特徵還有它對於阻斷細胞外抗體的可接近性（accessibility)，使它成為一個可能的藥物標的，但是可能因為它的廣泛表現以及偏好異體多元化而不是容易地應用的。次家族：TRPC2在人類中是一種假基因(pSeud〇gene) 但對於在齧齒動物中的費洛蒙感覺(pheromone sensation)來說是必須的。缺乏此通道的雄性小鼠不會顯示出典型的雄性-雄性攻擊行為(male-male aggressive behaviour)並且會追求同性。針對TRPC2的一細胞外功能部位的抗體會抑制頭巾反應（acrosomal reaction)指向它在受精上的重要性。然而’ TRPC2剔除小鼠在生殖方面顯示沒有缺點。TRPC2似乎不會與其他TRPC通道異體多元化。憲7次家族：它的成員共有70-80%的胺基酸相 200934789 、同性並且直接地受到PLC產物DAG所活化。TRPC3以及 -6活性是經由非-受體酷胺酸激酶Src以及Fyn (non-receptor tyrosine kinases Src and Fyn)而受到 N-糖化作用 (N-glycosylation)以及磷酸化作用（phosphorylation)所調控。 5 在人類中TRPC3在腦部、平滑肌以及血管内皮細胞中被南度表現。它似乎是涉入軸突生長導引（axon growth guidance)、在出生的時間左右的突觸可塑性（Synaptic ❺ plasticity around the time of birth)以及心臟 Ca2+恆定性。在心肌細胞中，由於TRPC3之細胞内Na+水準的異常累積已 1〇被顯示會反轉 Na+/Ca2+交換蛋白（Na+/Ca2+ exchanger, NCX1) 、模式。這個模式逆向運輸Ca2+進入細胞中並且可能涉入病理生理學過程，例如心臟衰竭以及缺血。TRPC3被發現會與TRPC4共組合成氧化還原敏感性通道。假設腦内的氧化壓力（例如由中風所誘發的）可以活化氧化還原敏感性TRPC 15 通道造成不受控制的Ca2+進入(Ca2+ influx)。所形成的神經 ©退化可能最終地藉由TRPC拮抗劑而被最小化。 TRPC6出現在jk管以及呼吸道平滑肌細胞（smo〇th muscle cells, SMC)中並且似乎在血管以及心臟系統中扮演不可或缺的角色。它透過促效劑（agonists)或增加血管内壓 20 力（intravascular pressure)的刺激被假設會去極化細胞膜。隨後，L-型電壓-閘控 Ca2+通道（L-type valtage-gated Ca2+ channels)被活化，其最終地媒介肌肉收縮並且反射血管收縮（貝里斯效應(Bayliss effect))。相反地，促效劑-誘發的支氣管收縮（agonist-induced bronchoconstriction)主要地視由 12 200934789 電壓-非依賴性通道(諸如TRPC6)所媒介的Ca2+進入而定，因此’ L-型Ca2+通道阻斷劑例如在氣喘以及慢性阻塞性肺臟疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD)中是無效的。蒙受原發性肺動脈高血壓（idiopathic pulmonary arterial hypertensionm IPAH)的病患的肺動脈 SMC (PASMC) 是過度增生的(hyperproliferative)並且 TRPC6 (與 TRPC3)表現是顯著地被增加。在以TRPC6小干擾RNA(siRNA)或伯森坦(bosentan)(—種被核准用於治療IPAH病患的内皮素受體阻斷劑）治療之後，PASMC過度增生被顯著地減低。 TRPC6亦被發現在白血球中可能媒介氣喘以及c〇PD的發炎反慮。因此’ TRPC6抑制似乎是一種令人感到興趣的治療策略供治療IPAH，一種進行性，縮短生命的疾病（右心衰竭（right heart failure))，以及其他慢性呼吸疾病。但是TRPC6 也在不應被阻斷的呼吸道SMC中具有生理學功能。調節急性缺氧性肺臟企管收縮(hypoxic pulmonary vasoconstriction， HPV)是需要的。在急性缺氧性環境下血流是從不足地被導引至通氣區域來維持適當氣體交換。當發生在肺炎，成人呼吸性窘迫症候群以及肝臟衰竭中的HPV分布可能會造成威脅生命的低氧血症(hypoxemia)°TRPC6在HPC中是不可或缺的但是沒有涉入起因於慢性缺氧的肺臟血管高血壓以及再成型（remodeling)。關於TRPC6涉入遺傳性局部性腎小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis，FSGS)(—種末期腎臟病的明顯病因）的具說服力的證據已經被呈現。TRPC6 功能獲得(gain-of-function)突變體造成增加的Ca2+進入足細 200934789 5 10 15 ❹ 胞足突起(P〇d〇cyte foot processes)，但是不知它是否或是如何造成疾病。這些細胞與腎小球裂孔隔膜(glomerular slit diaphragm) —起形成腎小球過濾網膜的一個關鍵性部分，它的損傷造成蛋白尿。腎小球過濾網膜在缺乏腎病蛋白 (nephrin)(—種極為重要的裂孔隔膜組份）的轉殖小鼠中是不正常的。TRPC6在這些小鼠的足細胞中被過度表現並且被錯置(mislocated)。近來，亦被活體外顯示TRPC6表現在經補體處理的足細胞中被向上調節，造成肌動蛋白細胞骨架重排’而活體内瞬時通道過度表現導致小鼠中的蛋白尿。TRPC6缺乏小鼠具有一未被期待以及令人驚訝的表現型。相對於被提出的上述通道的生理學功能，這些動物顯示在對支氣管收縮反應的呼吸道平滑肌高反應性，一被升高的平均動脈血壓（透過抑制一氧化氮(N0)合成酶可以進一步被增加），以及一被降低之誘發貝里斯效應所需的血管内壓力的閾值(被增大的反應血管收縮）。在TRPC6·/·小鼠的 SMC中的基礎以及促效劑誘發的陽離子進入亦是較高的。在一定程度上，這可以由一緊密相關的通道蛋白，TRPC3 的被增高的表現所解釋。它具有一個較高的基礎活性，是較不緊密地受到血管收縮劑所調控並且具有因此過度補償 TRPC6剔除’證明這兩種通道並不是功能上多餘的。相反的方法揭露有關TRPC6在心肥大的致病機轉中的一個角色。在轉殖小鼠中的心臟專一性TRPC過度表現會導致被增加的Ca2+進入’其經由#5神經素(calcineurin)偶合至被活化的 T 細胞刺激的核因子(nuclear factor of activated T cells， 20 200934789 NFAT)刺激。病理學心臟重組被加速並且這些小鼠具有一縮短的預期壽命。而在心肌細胞中的活體内Trpc6向上調節參與肥大，在活體外心臟纖維母細胞中似乎具有抗纖維變性功能(antifibrotic functions)。更多活體内研究是被需要的以評估TRPC6調節的治療價值以及TRPC3與TRPC3/6異種聚合物涉入心臟衰竭的致病機轉。 TRPC7在眼、心臟以及肺中被表現並且較低的轉錄水準在腦、脾臟以及睪丸中被發現到但它的生理學功能仍不清楚。次豕族.這些通道共有64%的相同性並且是與TRPC1最為緊密有關的（說服某些團隊將TRPC1分類在這個次家族中）。在TRP以及其他貯庫操作的通道 (store-operated channels)之中的獨有特徵是它們在Gq/11-受體媒介的活化之後藉由鑭系元素（例如Gd3+，La3+)的增強 (potentiation)。相反於TRPC3/6/7次家族，它們不會直接地受到DAG施用所活化但是一些内源性TRPC5活化劑近來已被鑑定出.溶血構脂酿膽驗(lysophosphatidylcholine，LPC) 以及神經胺醇 1-填酸(sphingosine 1-phosphate，SIP)。S-亞硝化作用（S-nitrosylation)(例如藉由一氧化氮(NO))已被顯示會活化TRPC4與TRPC5這兩者。 TRPC4在小鼠中是第1個被剔除的TRP基因。它在内皮以及平滑肌細胞中被廣泛地表現並且發現。TRPC4"-小鼠是可存活的並且達到成熟。然而，促效劑-誘發的Ca2+進入 TRPC4"—小鼠的内皮細胞是被顯著地降低，造成被降低的内 15 200934789 皮-依賴性血管舒張。更多研究是使用凝血酶(thrombin)(— 種重要的發炎媒介物’它涉入企管損傷的致病機轉）而被執行。在肺臟，它增加血管通透性且因此組織含水量。TRPC4-/-小鼠的肺臟EC缺乏凝血酶-誘發的肌動蛋白應力纖維形成’細胞回縮被減弱，以及肺臟微血管通透性接著被降低達大約50%。TRPC4在中樞神經系統的不同細胞中亦被表現並且似乎涉入神經傳導物釋放。在TRPC4-7-小鼠的視丘神經元間的F2端’在施用5-經基色胺(5-hydroxytryptamin， 5-HT ’ 血清胺）之後的 γ-胺基丁酸（Y_amin〇butyric acid, GABA)釋放被大大地降低。相反地，GABA釋放因為代謝型楚胺酸受體的刺激而沒有被改變^視睡眠/清醒週期，視丘調節睡眠以及清醒並且TRPC4可能參與視覺形成的處理。在胰臟β-小島中被表現的TRPC4可能涉入胰島素分泌’但葡萄糖对量試驗結果在野生型以及TRPC4-缺乏的小鼠中是類似的。最後’通道似乎透過調節卡侯氏體的間質細胞(interstitial cells of Cajal，ICC)的節律活性(pacemaker activity)而涉入調節胃腸道的運動性。 TRPC5在腦部中是高度富含的並且也在週邊，例如 SMC中被發現到。在人類中，該基因是位在與非綜合症狀智能遲緩(non-syndromic mental retardation)有關之 X 染色體的一個區域。被表現在大鼠海馬體神經元的生長錐的 TRPC5同種聚合物調節轴突生長還有生長錐型態。藉由一顯性-陰性突變體的轉染的功能性通道抑制造成異常地被延長的軸突’而過度表現造成軸突生長抑制。填脂醯_肌醇4_ 200934789 填酸5-激_(ΡΙΡ(5)Κα)-依賴型通道從囊泡插入細胞膜被證實對於由TRPC5所調節的軸突長度調節而言是關鍵性的。 TRPC5在心血營系統中也可以是多功能地重要。一顯性_陰性TRPC5突變株會抑制由血管平滑激細胞的磷脂醯丨_磷酸 5 (sphingosine Ι-phosphate)(—種 TRPC5 活化劑）所引起之細胞運動性’相同的效應是使用一抗_TRPC5抗體而被達成。 SMC運動性在生理學適應性過程(像是傷口癒合）中是關鍵 _ 性的’但疋也涉入發炎性閉塞病（in£jammat〇ry 〇cclusive diseases)，例如動脈粥樣硬化。在高血壓病患的單核球中增 ίο 加的TRPC5表現以及通道-媒介的ca2+進入被報導。再者， TRPC5蛋白質表現以及活性的（還有TRpc4、Ncx以及一些轉錄因子的）補償性向上調節是藉由siRNA媒介的 Ca -ATPase SERCA2的向下調節而在新生大鼠心臟肌細胞中被觀察到。在帶有末期原發性擴張型心肌病變(end_stage 15 idi〇Pathic dilated cardiomy〇Pathy)的病患的心力衰竭（failing heart)中，TRPC5甚至被選擇性地向上調節，而TRpc3 mRNA以及蛋白質沒有被彳貞測到並且trpci、_4與-6表現水準沒有被改變◊根據這些數據，TRPC5 (與TRpC4)涉入心肥大是可理解的。根據本發明，第一蛋白質也可含有如此處所定義之 TRPCs的任一者的一功能活性變異體或由如此處所定義之 TRPCs的任一者的一功能活性變異體所構成。TRpc的功能 /舌性變異體可以透過一或多個胺肌酸添加、刪除或置換而衍生自TRPC，其中該變異體仍可以結合至一天然存在的 17 200934789 SESTD1。較佳地，該變異體是TRpc的—片段，仍含有一 SESTD1結合功能部位，提供結合至SESTm和/或啦丁⑴ 的Spec 1的能力。變異體對SESTD1的結合可以如實施例 1 ' 2、3、4、5或6中所述的被檢驗。

5 __較佳地，，對於SESTD1的功能活性變異體的親和力（KD =koff/kon)相當於天然存在的TRPC，特別是TRpc4或TRpC5 ^至少大約0.1 Kd，更佳地至少大約〇 3 Kd ,仍更佳地至 © 少大約0.5 KD，又更佳地至少大約〇 7 κ〇以及最佳地至少 1〇大約1 Kd。對於另一個分子而言一蛋白質的親和力可以透過各種不同的標準技術（包括使用一經標示之標記（諸如放射，配位子以及螢光標記等）以及那些為習於該技藝的從業人員所熟知的結合研究）而被決定。功能活性變異體可以是任一種天然存在的TRPC的一 15 片段。另擇地，該功能活性變異體也可以是一種嵌合的其包含有二或多個不同的TRPCs的功能部位或節段 © Gegmem)。功能活性變異體也可以涵括一或多個帶有突變 (例如取代、添加和/或刪除，它們會改變變異體對TRPC的、Q Q性質）的節段。然而，該變異體因為它仍然能夠結合至 2〇個天然存在的SESTD1和/或SESTD1的gpec 1而被定義。 θ 在本發明的一個具體例中，功能活性變異體是因為它二個含有一同源於序列辨識編號：1、序列辨識編號·· 2 ^序列辨識編號：3之序列或由序列辨識編號：1、序列辨織編號：2或序列辨識編號：3所構成之序列的trpc變異體而被定義。較佳地，這個序列是一天然存在的TRPC的 18 200934789 一個片段。各種不同的TRPC蛋白的序列是可衍生自蛋白質資料庫諸如 NCBI (National center for Bi〇techn〇1〇gy

Information)以及同源性序列可以藉由如同為習於該技藝的從業人貝所熟知之適當的排列程式而被鍛定。 5 Ο 10 15 Ο 在本發明的一個具體例中，本發明之第一蛋白質包含有一標記(marker)，特別是一標籤(tag)。在本發明的上下文中，一標記可以是任一種可以被容易地摘測到的分子。在本發明中，該分子被結合至TRPC 或它的一功能活性變異體，因此，該標記的存在表示有該第一蛋白質的存在。標記(亦被意指為有如標誌(labels))是為一 S於該技藝者所知曉的並且包括，例如放射線標諸 (mdiolabelX諸如3h、32P、35S或i4C)、螢光標記(諸如螢光素(fluorescein)、綠色螢光蛋白（green flu〇rescence pr〇tein)、黃色螢光蛋白（yellow fluorescence protein)或 DyLight 488)酵素(諸如辣根過氧化氣酶(h〇rseradish peroxidase)、β_ 内醯胺酶（β-lactamase)、鹼性磷酸酶（aikaline phosphatase) 或β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase))或一可被一適當的抗體或抗體片段所偵測到的抗原❶ 較佳地，該標記是一標籤。標籤通常是被用作為生化指標的肽或蛋白質。它們可以被包括在一蛋白質（諸如一重組型之被表現的蛋白質）中並且可以提供數種用途。較佳地’它們是使用適於特定標籤之標準條件而被用來純化它們所接附的蛋白質。然而’該等標籤也可以被用作為指標以偵測一特定蛋白質的存在。 19 20 200934789 5 ❹ 10 15 ❹ 20 一些的(親和力）標籤目前是已知的。這些通常依據它們的大小而被分成3類：小標籤具有一最大為12個胺基酸，中等大小者具有一最大為60個以及大者具有超過60個。小標籤包括Arg-標籤、His-標籤、Strep-標籤、Flag-標籤、 T7-標籤、V5-肽-標籤以及c-Myc-標籤，中等大小者包括S-標籤、HAT-標籤、調約素-結合肽（calmodulin-binding peptide)、幾丁質-結合肽(chitin-binding peptide)以及某些纖維素-結合功能部位。後者可含有高達189個胺基酸並且可以接著把類似GST-(麩胺基硫-S-轉移酶-)以及MBP-標籤 (麥芽糖結合蛋白-標籤)視為大的親和力標籤。為了要製造特別純的蛋白質，所謂的雙重標籤(double tags)或連續標籤(tandem tags)被發展出。在這種情況下，蛋白質在兩個分開的層析法步驟中被純化，在各個情況下使用一第一並且接著一第二標籤的親和力。這些雙重或連續標籤的例子為GST-His-標籤(麩胺基硫-S-轉移酶被融合至i 個聚組胺酸-標籤）、6xHis-Strep-標籤(6個組胺酸殘基被融合至1個Strep-標籤）、6xHis-標籤100-標籤(6個組胺酸殘基被融合至哺乳動物MAP-激酶2的1個12-胺基酸蛋白）、 8xHis-HA-標籤(8個組胺酸殘基被融合至1個血球凝集素_ 抗原決定位-標籤）、His-MBP(His-標籤被融合至1個麥芽糖 -結合蛋白）、FLAG-HA-標籤(FLAG-標籤被融合至1個血球凝集素-抗原決定位-標籤）’以及FLAG-Strep·標籤。較佳地，本發明的第一蛋白質包含有一選自於由下列所構成之群組的標籤：His-標籤、Arg-標籤、Strep-標籤、 20 200934789 5 Ο 10 15 ❹

Flag-標籤、Τ7-標籤、ν5_肽-標籤、C-Myc-標籤、S-標籤、 HAT-標籤、調鈣素_結合肽_標籤、幾丁質-結合肽-標籤、GST_ 標籤以及BMP-標籤。然而，任何其他的標籤也可以被使用’但是某些諸如His-標籤、Arg-標箴、Strep-標籤、Flag-標籤或GST-標籤是被偏好的。涵括一標籤之用於TRPCs 或它的變異體的適當實例亦被顯示於實施例中。在本發明的一個具體例中，該第一蛋白質包含有一標記或標籤’其中該標記或標記是藉由在一個特定切割位置 (例如一個用於一酵素的切割位置）的蛋白水解切割 (proteolytic cleavage)而從該蛋白質移除。這可以是位在 TRPC或它的功能活性變異體以及該標記或標籤之間。切割位置可以是例如一蛋白酶切割位置。蛋白酶的實例為胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、胰蛋白酶(trypsin)、彈性蛋白酶 (elastase)以及胞漿素(plasmin);對應的切割位置是為習於該技藝人士所知悉的。因為要被純化的分子是一個蛋白質，特定的蛋白酶，特別是來自於病毒(通常會攻擊植物）的蛋白酶是偏好的。適當的特定蛋白酶的實例是凝血酶 (thrombin)、因子 Xa (factor Xa)、lgase、來自“煙草钮紋病毒”的 TEV-蛋白酶（TEV-protease from the “Tobacco Etch Vims”）、蛋白酶 PreScission (the protease PreScission (人類鼻病毒3C蛋白酶)）、腸激酶(enterokinase)或Kex2。TEV-蛋白酶以及PreScission是尤其被偏好的。有關於第二個替代物’本發明之複合體的第一蛋白質是一種典型瞬時受體電位通道(TRPC)或它的一個功能活性 21 20 200934789 變異體的功能部位’該功能部位具有如上所定義之序列辨識編號：1的序列。

在本發明的一個較佳具體例中，序列辨識編號：1的必要序列可被進一步定義如下，其中可變異的胺基酸X是藉 5 由下列符號而被指定：LXiXsXdaXsYQEVXeRNLVK RYVAAMIRX7X8KT(序列辨識編號：1): -X1X2X3X4X5較佳地包含有至少2、較佳地3、更佳地4 或最佳地5個極性(諸如Asn或Gin)，選擇性地鹼性胺基 0 酸殘基(諸如Arg或His) ’特別地其中又1乂2又3又4又5的部 1〇分序列可以是如同被定義在序列辨識編號：2或序列辨識編號：3中； -X6較佳地是較大的、非極性胺基酸殘基(諸如Ile、Leu 或Met);和/或 _ X?X8較佳地是一酸性以及一極性/中性胺基酸殘基(諸如 15 Glu以及Ala)的一個組合或兩個極性/中性胺基酸殘基(諸如Asn以及Ser)的一個組合，其中χ7χ8的部分序列可以 ® 是如同被定義在序列辨識編號或序列辨識編號：3中。在本發明的一個更佳具體例中，序列辨識編號：丨的序列可被進一步定義如下： 20 -又1又2又3又4乂5較佳地包含有至少2、較佳地3、更佳地4 或最佳地5個極性(諸如Asn或Gin)，選擇性地鹼性胺基酸殘基(諸如Arg或His)，特別地其中ΧιΧ2χ3Χ4Χ5的部分序列可以是如同被定義在序列辨識編號：2或序列辨識編號：3中； 22 200934789 ❹ &較仏地疋較大的、非極性胺基酸殘基（諸如… 或Met);和 X7 X8、較佳地疋一酸性以及一極性/中性胺基酸殘基(諸如 Glu以及Ala)的-個組合或兩個極性/中性胺基酸 ί = Γ㈣的一個組合，其中xA的部分序列可ΐ 疋如同被定義在序列辨識：乂胺基酸側鏈的性㈣h b Α斤霸為編波.3中。鐵買破知納在下面：丙胺酸精胺酸 ❹ 天門冬酿胺酸天門冬胺酸半胱胺酸麩胺酸麩醯胺酸甘胺酸組胺酸異白胺酸白胺酸離胺酸甲硫胺酸苯丙胺酸脯胺酸絲胺酸蘇胺酸色胺酸酪胺酸纈胺酸非極性極性极性極性核性極性核性非極性極性非極性非極性植性部極性非極性非極性极性極性非極性栋性非極性酸性/鹼性中性鹼性中性酸性中性酸性中性中性鹼性中性中性鹼性中性中性中性中性中性中性中性中性 23 200934789 關於本發明之第二替代物的一典型瞬時受體電位通遘 (TRPC)的雜活_異體是被定義如同那個有關第一蛋奋質的第一替代物所具有者。在一個較佳具體例中，該功能活性變異體可被定義妒 5 上，其中序列辨識編號：1的序列在下面被進一步定義，因為： -它是藉由一或多個胺基酸取代、較佳地最多8、7、6或5, 〇更佳地最多4、仍為最佳地最多3、又更佳地最多5以及更佳地最多1個胺基酸取代而衍生自序列辨識編號：2威序列辨識編號：3 ;較佳地一或多個這些胺基酸取代是〆如下所定義的保守性胺基酸取代 -它是衍生自任一種天然存在的TRP(：(見上）。保守性取代是那些發生在一個家族的胺基酸（它們在 =們的側鏈以及化學性質是相關的）中者。此等家族的實例 15 是帶有鹼性側鏈、帶有酸性側鏈、帶有非極性脂肪族側鏈、帶有非極性芳香族側鏈、帶有不帶電荷的極性側鏈、帶有小側鏈、帶有大侧鏈等等的胺基酸。在一個具體例中，一個保寸性取代被包括在該肽中。在另—個具體例中，兩個保守性取代或更少被包括在該肽中。在又一個具體例中， 20 三個保守性取代或更少被包括在該肽中。保守性胺基酸取代的實例包括，但不限於那些被列在下面者： 24 200934789 原殘基保守性取代 Ala Ser Arg Lys Asn Gin; His 5 Asp Glu Cys Ser Gin Asn ❹ Glu Asp His Asn; Gin 10 lie Leu, Val Leu lie; Val Lys Arg; Gin; Asn Met Leu; lie Phe Met; Leu; Tyr 15 Ser Thr Thr Ser ❹ Trp Tyr Tyr Trp; Phe Val lie; Leu 20 在第一蛋白質的第一以及第二替代物的上下文中，該 TRPC較佳地是選自於由下列所構成的群組：TRPC4、 TRPC5，以及TRPC6，特另丨j地它是TRPC4或TRPC5，尤其是 TRPC4a 或 TRPC4p 或 TRPC5。 25 200934789 在本發明的另一個較佳具體例中，該第一蛋白質含有序列 LRRHHQYQEVMRNLVKRYVAAMIREAKTE (序列辨識編號：2)或 LIQNQHYQEVIRNLVKRYVAAMIRNSKTN (序列辨識編號：3)。 5 G 10 15 Ο 應被理解的是，在本發明的上下文中，TRPC可以是衍生自任何物種。然而’哺乳動物TRPCs，諸如那些衍生自人類、大鼠、小鼠、貓、狗或馬者，特別地鼠類或人類TRPCs 是被偏好的。本發明之複合體的第二蛋白質含由SESTD1的Specl 功能部位或由SESTD1的Specl功能部位所構成。人類 SESTD1的序列被揭示在GenBank登錄編號NP_835224 中。然而天然存在的變異體亦為已知的，例如一個在人類主動脈cDNA存庫中所發現到的全長。除了一個置換 (H508Q)以外’它的胺基酸序列是相同於GenBank登錄編號 NP—835224。它是根據一個也可以在基因體blast中被發現到之在1571的點突變(NM_178123)。另一個在1748被發現的點突變是沉默的。Specl功能部位是由如上所指定之 SESTD1的胺基酸233至381所構成（亦參見第i圖）。依據本發明，衍生自另擇天然存在的SESTD1的同源性Spec J 序列亦可被使用。另擇的SESTD1也可以是衍生自另一個物種或器官或個體。各種SESTD1蛋白的序列可衍生自蛋白質資料庫諸如 NCBI (National Center f〇r Biotechnology Information)以及同源性序列可以藉由適當的排列程式而被鑑定。 26 20 200934789 依據本發明，該第二蛋白質也可以是—天然存在的 SESTD1的一個片段’假設該补沉1功能部位仍存在的話。然而，該Spec 1功能部位也可以已被添加(c_和/或n_端地) 或夕個與任何天然存在之SESTD1無關的胺基酸序列。 5 Ο 10 15 ❿ 20 車乂佳地若一或多個胺基酸序列被添加至該igESTDi，它/ 匕們疋天然存在的SESTD的節段(造成節段或喪合體），它們也可以涵括胺基酸取代（較佳地一個限定數目諸如高至 10個），較佳地保守性取代，有如上面所定義的。此外，第二蛋白質也可以涵括一個標記或標籤，有如關於本發明之第一蛋白質所定義的。-包含有SESTD1或其片段以及一 GST-標籤的蛋白質的實例在第5圖中被說明。在本發明的另一個較佳具體例中，該第二蛋白質包含有全長SESTD1或由全長SESTm所構成，其中SESTm 可以是如上所定義的。應被了解的是，在本發明的上下文中，SESTD1可以是衍生自任何物種。然而，哺乳動物SESTDls，諸如那些衍生自人類、大鼠、小鼠、描、狗或馬者，特別地大氣、鼠類或人類SESTD1是被偏好的。本發明的-個第三方面是有關於一種試驗系統，它包含有 -在本發明的上下文中一如上所定義的第一蛋白質 -在本發明的上下文中一如上所定義的第二蛋白質，以及 -用於偵測該第一以及第二蛋白質之交互作用的裝置。 27 200934789 如上所詳述的TRPC豕族之成員的生理學、病理生理學以及生化學角色未被完全地說明。因此，用於研究TRPCs 的功能與控制的工具以及調節彼的物質是需要的。本發明的試驗系統可以被用來說明TRPCs的功能以及活性。特別 5 地，涉及TRPC以及SESTD1的機制可以藉由使用本發明的試驗系統而被研究。一系列的測試在該技藝中為已知的，其中該試驗系統可以被使用以及該試驗系統可以被採用者。這可以是一個〇異質性(heterogeneous)或同質性(homogeneous)分析。如此處 10 所使用的，一異質性分析是一種包括一或多個洗滌步驟的分析，而在一同質性分析中此等洗滌步驟不是必要的。試劑以及化合物僅被混合以及被測量。在一個具體例中該分析是一 ELISA (酵素結合免疫吸附分析法，enzyme linked immuno sorbent assay)、DELFIA 15 (解離增強鑛I系元素氟免疫分析，dissociation enhanced lanthanide fluoro immuno assay)、一 SPA (閃爍親近分析， ❹ scintillation proximity assay)、一閃爍板分析（flashplate assay)、一 FRET (螢光共振能量轉移，fluorescence resonance energy transfer)分析、TR-FRT (時間分辨螢光共振能量轉 2〇移，time-resolved fluorescence resonance energy transfer)分析、一 FP (螢光極化，fluorescence polarisation)分析、一 ALPHA(放大發光親近同質性分析，amplified luminescent proximity homogenous assay)、一 EFC (酵素片段互補， enzyme fragment complementation)分析、一雙雜交分析(two 28 200934789 ybrid assay)或一共免疫沉澱分析（c〇imr_^〇precipitau〇n assay) ° 以ELISA (酵素結合免疫吸附分析法）為基礎的分析是由不同公司所提供。它是一種被用來偵測一抗體或一抗原在一樣品中的存在的生化技術。實施一 EUSA涉及至少一帶有針對一特定抗原（例如第一或第二蛋白質的一個節段) 之專一性的抗體。—般來說’在一樣品中一個未知數量的抗原被固定在一表面上。吾人接著洗滌一特定抗體通過該表面。此抗體被連結至一製造一可偵測到的訊號(諸如在顏色的改變或螢光）的酵素。舉例來說，具有一個未知數量之抗原的樣品被是非專一地(經由吸附至該表面）或專一地(經由被另一個專一於相同抗原之抗體的捕捉，在一個“三明治’，ELISA中）固定在一固體撐體(solid support)(通常是一微量盤)上。在抗原被固定之後，偵測抗體被加入，與該抗原形成一個複合體。偵測抗體可以被共價地連結至至一酵素’或者本身可藉由一個二級抗體（它是透過生物綴合而被連結到一個酵素)被偵測。在各個步驟之間，該盤典型地是以一溫和的清潔劑溶液予以洗滌以移除任何非專一性地被結合的蛋白質或抗體。在最後的洗滌步驟之後，該平盤是藉由添加一酵素受質以產生一可見訊號（它指出抗原在樣品中的數量）而被顯色。較早的ELISAs採用產色受質 (chromogenic substrates)，然而較新的分析採用具有更高敏感性的螢光受質（f|u〇r〇genic substrates)。以DELFIA (解離增強鑭系元素螢光免疫分析）為基礎 29 200934789 的分析疋固相分析。抗體通常被標記以銪（Eur〇pjuin)或另一種鑭系元素並且銪螢光在已被洗去未結合的銪_標記的抗體之後被偵測。 5 e 10 15 ❹ SPA (閃爍親近分析）以及閃爍板分析通常利用生物素/ 抗生物素蛋白（biotin/avidin)交互作用以供捕捉放射線標定的物質。通常反應混合物包括激酶、一經生物素化的肽受質以及γ-[Ρ33]ΑΤΡ。在反應之後，經生物素化的肽被鏈黴抗生物素蛋白（streptavidin)所捕捉。在SPA偵測中，鏈黴抗生物素蛋白是被結合在含有珠粒的閃爍體(scintiUant)上，而在閃爍板偵測中，鏈黴抗生物素蛋白被結合在含有閃爍體的微量盤之井的内部。一但被固定，經放射線標定的物質是足夠靠近閃爍體以刺激光的發射。螢光共振能量轉移（FRET)描述一種在兩個發色團 (chromophores)間的無放射線能量轉移。一在它的激態的供體發色團藉由一非放射性長範圍偶極_偶極偶合機制而轉移能量給一個在鄰近處（典型地< 1〇 nm)的受體螢光團 (fluorophore)。因為兩個分子都是螢光的，能量轉移通常被意指為有如「螢光共振能量轉移」，雖然能量不是真的藉由螢光而被轉移。FRET是一種偵測並且定量蛋白質_蛋白質交互作用、蛋白質-DNA交互作用以及蛋白質_構型變化的有用工具。有關監測一蛋白質對另一個蛋白質或一蛋白質對DNA的結合，分子中的一者被標定以一供體以及另一者以一受體並且這些螢光團-標定的分子被混合。當它們以一個未結合的狀態存在，一但供體激發，供體發射被偵測。 30 20 200934789 根據分子的結合’供體以及受體被帶到親近處並且受體發射因為來自供體對受體的分子間fret而被優先地觀察。用於FRET的適合鄰居(neighbors)在該技藝中為已知的並且習於技藝者將能夠選擇一種用於兩種抗體的標記的組合。 5 如此處所使用的，有關供體以及對應的受體，“對應”意指一個具有一激發光譜與供體的發射光譜重疊的受體螢光部分。然而’兩種訊號應該是彼此分離的。因此，受體的發 0 射光譜的最大波長較佳地應為大於供體的激發光譜之最大波長至少30 nm ’更佳地至少50 nm，諸如至少8〇 nm、至 ίο 少 1〇〇 nm 或至少 150 nm。可以與各種受體螢光部分一起被使用在FRET技術中的代表性供體螢光部分包括螢光素、螢黃(Lucifer Yellow)、 B-藻紅素（B-phycoerythrin)、9-吖咬異硫氰酸鹽 (9-acridineisothiocyanate)、螢黃 VS (Lucifer Yellow VS)、4- 15 乙醯胺基-4’-異硫氰酸二苯乙烯_2,2，_二磺酸 (4-acetamido-4’-isothiocyanatostilbene-2,2，-disulfonic acid)、7-® 二乙基胺-3-(4’-異硫氰酸苯基）-4-曱基香豆素 [7-diethylamino-3-(45-isothiocyanatophenyl)-4-methylcoumar ]、號拍酿亞胺基 1-β比咬酸(succinimdyl 1-pyrenebutyrate)， 20 以及4-乙酿胺基-4’-異硫氰酸二苯乙稀-2,2，-二續酸衍生物。代表性受體螢光部分，視所使用的供體螢光部分而定，包括 LC-Red 610、LC-Red 640、LC-Red 670、LC-Red 705、 Cy5、Cy5.5、麗絲胺玫瑰紅 B 橫醢氯(Lissamine rhodamine B sulfonyl chloride)、四曱基玫瑰紅異硫氰酸（tetramethyl 31 200934789 rhodamine isothiocyanate)、玫瑰紅 X 異硫氰酸鹽(rh〇damine 5 ❹ 10 15 ❹ X isothiocyanate)、紅螢素異硫氰酸（ery thro sine isothiocyanate)、螢光素、伸乙基三胺五乙酸 (diethylenetriamine pentaacetate)或其他鑭系元素離子的螯合物(例如銪或鎰）。受體以及供體螢光部分可以被獲得，例如自 Molecular Probes(Junction City，OR)或 sigma Chemical

Co. (St. Louis，MO)。另擇地’時間分辨螢光共振能量轉移(TR—FRET)可以被用於本發明的試驗系統中。TR-FRET採用TRF (時間分辨螢光）以及FRET原理。這個組合結合TRF的低背景優點以及FRET的同質性分析形式。雖然fret在上面已被描述， TRF利用鋼系元素或任何其他具有長半衰期的供體的獨特性質。用於TR-FRET的適合供體包括，在它們之中，鋼系元素螯合物（lanthanide chelates)(穴狀化合物（cryptates))以及某些其俾金屬配位子複合體，它們可具有在微_毫秒時間範圍内的螢光半衰期並且它們’因此亦容許能量轉移在微秒至毫秒測量中發生。螢光鑭系元素螯合物已在7〇年代晚期被用作為能量供體。經常被使用的鑭系元素包括釤 (samarium, Sm)、銪（europium，Eu)、錯(terbium, Tb)以及鋪 (dysprosium, Dy)。因為它們特有的光物理以及光譜性質，鑭系元素的複合體對於在生物學中的螢光應用而言是有很大的利益。特別地，當相較於更多的傳統螢光團，它們具有大的斯托克斯位移（Stoke’s shift)並且極長的發射半衰期 (從微秒至毫秒）。 32 20 200934789 通常，有機發色團被用作為受體。這些包括別藻藍蛋白（allophycocyanm，APC)。針對TR_FRET還有受體的適當細節被描述在WO 98/15830中。 5 Ο 10 15 Ο 以榮光極化(FP)-為基礎的分析是使用偏極光來激發溶液中的螢光受質肽的分析。這些螢光肽沒有在溶液以及滾筒(tumble)中，造成被發射的光線變得去極化。當受質肽結合至一個較大的分子時’它的翻滾率(tumbling rate)被大幅地降低’以及被發射的光線被維持高度地極化。在本發明的又一個具體例中，本發明的試驗系統是於供一放大發光親近同質性分析(ALPHA)。ALPHA是一種以洛液為基礎的分析’它起初是由packar(j BioScience所發展的。ALPHA —種以發光為基礎的親近分析，其中一反應夥伴被接附至供體珠粒’而另一者被偶合至受體珠粒，兩者具有一僅為大約250 nm的直徑。一光敏劑(ph〇t〇sensitizer) 化合物被包埋在供體珠粒中。在這個化合物以在一為大約 680 nm的波長的雷射光的照射下，環境氧被轉換成富含能量、短壽命的單線態氧(singlet oxygen)。當沒有受體珠粒在鄰近處時’單線態氧衰減而沒有生成一個訊號。若供體以及受體珠粒藉由被接附的生物分子的交互作用而靠近在一起（約250 nm)，由供體珠粒所釋放的單線態氧在旁邊的受體珠粒起始一個發光/螢光級聯，造成一個範圍在520-620 nm的被高度放大的訊號。發光訊號是在一適當讀取儀中被偵測到。有關於ALPHA技術的更多細節，參見Ulman et al.， 1994, Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 91，5426-5430。 33 20 200934789 5 Ο ίο 15 ❾ 以EFC (酵素片段互補）為基礎的分析或相同的分析可特別地被用於化合物的高通量篩選。EFC分析是根據一經處理的β-半乳糖_酶(β-galactosidase)酵素（由兩個片段-酵素受體(enzyme acceptor，ΕΑ)以及酵素供體（enzyme donor， ED)-所構成）。當該等片段被分開時，沒有β_半乳糖苷酶活性’但當該等片段在一起時’它們締合以形成活化的酵素。 EFC分析採用一 ED-分析物綴合物，其中分析物可被一專一性結合蛋白（諸如一抗體或受體)所辨識。在缺乏專一性結合蛋白的情況下’ ED-分析物綴合物能夠補充ΕΑ以形成活化的β-半乳糖苷酶，生成一陽性發光訊號。若ED-分析物綴合物是透過一專一性結合蛋白而被結合，與ΕΑ的互補被預防，並且沒有訊號。若游離的分析物被提供（在一樣品中），它將會與ED-分析物綴合物競爭結合至該專一性結合蛋白。游離的分析物將釋放ED-分析物綴合物供用於與ΕΑ 的互補’生成一視樣品中存在的游離分析物數量而定的訊號。雙雜交篩選是一種藉由測試有關兩個蛋白質間的物理交互作用（諸如結合）而被用來發現蛋白質-蛋白質交互作用的分子生物學技術。測試的前提是下游報導子基因的活化是藉由一轉錄因子結合到一上游活化序列上。關於雙雜交篩選的目的，轉錄因子被分成兩個分開的片段，被稱為結合功能部位(BD)以及活化功能部位(AD)°BD是負責結合至 UAS的功能部位以及AD是負責活化轉錄的功能部位。一適合的雙雜交系統被描述於實施例1中。 34 20 200934789 5 ❹ 10 15 ❹ 共免疫沉澱法可以藉由沉澱一個被相信是在一複合體中的蛋白質而被用於鑑定蛋白質複合體，因為該複合體的額外成員也被捕捉並且可被鑑定。蛋白質複合體，一但結合至該專一性抗體’會藉由以一抗體-結合蛋白（接附至一固體樓體’諸如一瓊脂珠粒）的捕捉而從本體溶液被移除。這些抗體結合蛋白（蛋白A、蛋白G、蛋白G)起初是從細菌被分離並且辨識一廣泛不同的抗體。在一蛋白質或蛋白質複合體的起始捕捉之後’固體撐體被洗滌數次以移除任何不是透過抗體而專一性地並且緊密結合的蛋白質。在洗滌之後’沉澱的蛋白質被洗提並且使用凝膠電泳、質譜測定法 (mass spectrometry)、西方墨點法’或一些其他用於鑑定該複合體中的組份的方法而被分析。因此，共免疫沉澱法是一種評估蛋白質-蛋白質交互作用的標準方法。一涉及共免疫沉澱法的適當試驗系統被描述在實施例3中。在本發明的另一個較佳具體例中，用於偵測第一以及第二蛋白質間的交互作用的方法可以被用來測量一或多個磷脂質（phospholipid)，較佳地磷脂醯-肌醇-磷酸 (phosphatidyl-inositol-phosphate)。該測量法可以包括決定一或多個鱗脂質的濃度(較佳地墙脂醯-肌醇_磷酸）。濃度可以對一潛在的TRPC調節劑起反應而如同在本發明用於篩選一調節劑的方法中被測量。用於決定一或多個磷脂質（較佳地鱗脂酿-肌醇-磷酸）的手段(means)以及方法對於習於該技藝者而言是熟知的並且包括涉及放射線·標定的磷脂質（較佳地磷脂醯-肌醇-磷酸）’包括藉由例如管柱層析法或質譜 35 20 200934789 測定法的純化。然而，涉及一 ριρ條剪貼填脂質分 Co:a PIP平盤結合分析(如同分別在實施例^以及8 例示的）的方法是被偏好的。、不範性試驗系統以及它們的使用被描述在實施例i至 5 8中。較佳地，試驗系統適於高通量篩選。在這個方法中，在無細胞或全細胞分析中大量的化合物被篩選針對有問題 ❹ 的TRPC。典型地，這些篩選是在96井平盤中使用自動化、自動輸送站（robotic station)為基礎的技術或以較高密度陣 1〇列(‘‘晶片”)形式中被執行。根據本發明，本發明之複合體的蛋白質的各者可以是任一種在以上方面以及具體例（特別佳的具體例）中所指明的蛋白質。可以被顯示的是，TRPC可以與一系列的更多蛋白質交互作用。因此，該試驗系統可進一步包含有至少一 15 選自於由下列所構成之群組的蛋白質：錨蛋白重複功能部 ❹ 位 35 (ankyrin repeat domain 35, ANKRD35)、脂蛋白元 A-1 結合蛋白（apolipoproteinA-1 binding protein，APO A IBP)、鄰近鋅手指功能部位的漠功能部位(bromodomain adjacent to zinc finger domain，BAZ1B)、似高-運動性群蛋白2之1異 20 構型 b (high-mobility group protein 2-like 1 isoform b, HMG2Ll)、makorin 環指蛋白 1 (makorin RING finger protein 1，MKRN1)、前-B-細胞白血病同源盒交互作用蛋白1 (pre-B-cell leukemia homeobox interacting protein 1， PBXIP1)、肉瘤抗原 NY-SAR-48 (sarcoma antigen 36 200934789 NY_SAR-48)、血影蛋白阿伐非紅血球i (Spectrin aipha non-erythrocytic 1，SPTAN1)、染色體 3 的結構維持 (structural maintenance of chromosomes 3，SMC3)以及人踩蛋白 2 (talin 2, TLN2)。上面蛋白質可以從任何物種被獲得有如適用在普遍的试驗系統中。然而’示範性蛋白質以及它們的序列如下：定義基因名稱 GenBank登錄編號錨蛋白重複功能部位35 ANKRD35 NM 144698 脂蛋白元A-1結合蛋白 APOA1BP NM 144772 鄰攻鋅手指功能部位的溴功能都办 ------ BAZ1B AB032253 動性群蛋白2之1異構型ij HMG2L1 CR456504

MKRN1 NM 013446 makorin環指蛋白i Ο 胞白血病同源盒交互作用杏白1 肉瘤抗原NY-SAR-48 --------— ，阿伐，非紅血破1 結構維持人踩蛋白2 PBXIP1 SPTAN1 SMC3 TLN2 NM 020524 NM—033417 U83867 AF067163 NM 015059

TRPC 々該試驗系統可以例如被使用於下列用於有關調節劑之篩選的方法。在一個之後的方面本發明有關於一種用於篩選有關一 TRPC調節劑的方法，包含有下列步驟： a)令如上所指明之依據本發明的試驗系統與一物質接觸以及 37 10 200934789 b)根據該物質與該試驗系統的交互作用來偵測一玎測量的訊號，藉此鑑定該物質為一 TRPC調節劑。依據本發明，該試驗系統可以是如同在本發明的現有描述中所詳述而被表示，特別地有如在較佳具體例中所詳 5 述者。該試驗系統可以被涵括在一細胞中或它可以是一個無細胞系統。該試驗系統可以在適於偵測—可測量之訊號的條件下與一測試物質接觸。這包括一適當的溫度、化學環境(緩衝劑、pH值等）還有一適合的物質^度二=觸的/ ® 恰當時間。 ' 10 在接觸之後或同時，一訊號被觀察到，其中一訊號的偵測是該第一以及第二蛋白質交互作用的指標。在本發明的一個較佳具體例中，該物質在如上所定義之第一以及第二蛋白質間之交互作用上的影響被直接地偵測’亦即第一以及第二蛋白質的近端是藉由一訊號的誘發 15 而被偵測而不是TRPC/SESTD1訊號傳遞下游的一訊號。一訊號的誘導可以受到各組份的標幟所影響，其中標定的近 © 端會誘發一個可偵測的訊號。被誘發之可偵測的訊號可以是一種化學發光訊號、在顏色上的改變、一螢光訊號、一放射線或任何其他適合的訊號。該訊號可以是藉由兩個標 20 織的父互作用而被誘發，其中各標諸被連結到試驗系統的一組份，亦即經分離的蛋白質以及辅酶。此類訊號包括一放射線標記，諸如1251，在一個臂上以及一適當的淬滅體 (quencher)在另一個臂上以债測在一閃燦計數器 (scintillation counter)的近端（閃爍近端分析，scintillation 38 200934789 proximity assay)。組份可能涵括可供抗體以一要偵測FRET (螢光共振能量轉移，參見上面）的方式來標定的抗廣。在另一個替代物中’蛋白質的一者在它的表面已被結合一個能夠受到一激酶磷酸化的生物分子以及另一個具有一個3價 5 金屬離子複合至它的表面的組份，例如經由一個適當的連接子’諸如氮三醋酸（nitrilotriacetic acid)、亞胺二乙酸 (iminodiacetic acid) ’或一個被適當取代之含有n的雜環，例如一三唑雜環(triazoheterocycle)，例如一三唑環壬烷壬烷 (triazocyclononaneononane)，諸如 1-丙胺-4-乙酸根合-1，4,7_ 〇二。坐環壬烧(1卞1：〇卩丫1&11^11〇_4_&(；€;加〇_1，4,7_[0〇23〇>^1〇11〇仙116)。當供體以及受體粒子在近端時，一個化學發光訊號被產生(它因為蛋白質結合至辅酶而發生)(發光鄰近分析，luminescent proximity assay)。用於偵測蛋白質-蛋白質交互作用的適當測試以及分 5 析在下面被描述。在本發明的一個較佳具體例中，用於偵測蛋白質間之交互作用的方法包括至少一對該第一蛋白質或該第二蛋白質有專一性的抗體。如上所詳述的，經分離的蛋白質可以包括一用於一專一性抗體以及該抗體的偵測的抗原。在本 :〇發明的又一更佳具體例中，該試驗系統包含有兩個抗體，其中第一抗體對第一蛋白質具有專一性而第二抗體對該第一蛋白質具有專一性。該抗體可以被標定以一適當的標記，其為個別組份存在的指標。另擇地，上述一級抗體可以藉由—個針對一級抗體的適當二級抗體而被偵測。二級 39 200934789 抗體可以被使用以债測一級抗體的存在，例如當被結合至 =級抗體。一級或二級抗體可以被標定以一如上所定義的標§己，例如一酵素、一放射性標誌(radiolabel)、一螢光標記、一化學螢光標記等。另擇地，該等蛋白質可以涵括一標籤， 5 它可以利用一適當抗體而為可偵測的。試驗系統可以下列的方式被使用：一用於分離該複合體的至少一組份的純化系統被使用以及該複合體的存在或 ❹蛋白質之複合體的各個组份的存在被偵測到。舉例來說，該複合體可以藉由凝膠電泳、管柱層析法、親和力純化等 10 而被純化並且該複合體可藉由該複合體的一組份或該複合體的兩個組份的指標的一個訊號或兩個訊號存在而被偵測。舉例來說，若一分離技術被使用（它對組份的一複合體具有專一性），偵測方法對於另一個組份是受限的。另擇地，去了以不是對該等組份的一者具有專一性，諸如凝 15 膠電泳，以及複合體的形成可以透過兩個訊號而被偵測， ❹紗^被標定以可區別之螢光標記的抗體’其中這兩種，光私5己的存在，例如在一凝膠的相同區域是複合體的指松。據此，第一和/或第二蛋白質包含有一可偵測的標記。較佳地，—-T· Μ、β 可測罝之訊號的偵測亦涉及使用一專一性抗體 20 對抗該第一和/或一專一性抗體對抗該第二蛋白質，如上所詳述的在本發明的一個較佳具體例中，TRPC調節劑增強或較佳地削弱或抑制第一蛋白質對第二蛋白質的結合。TRP C的一侧節#|改變討論中的 TRPC的活性。活性的改變可能 40 200934789 疋活化或抑制，因而分別地增強或削弱TRpc的訊息傳遞 (Signaitransduction)。_個增強、促進或增加 TRpc =活ς 的調節劑被意指為促效劑(agonist)，而—削弱、抑制或降低 a 的/舌丨生的TRPC s周卽劑被意指為拮抗劑。活性的調節疋根據與TRPC的專一性交互作用而不是與TRpc的非專性父互作用（例如變性）的結果。在本發明的另一個較佳具體例中，可測量的訊號是一或多個磷脂質（較佳地磷脂醯-肌醇_磷酸）。磷脂質是一類的脂質，並且連同醣脂、膽固醇以及蛋白質是所有生物細胞膜的個重要組份。磷脂醯-肌醇對於多數涉及細胞傳訊的酵素來說是受質，因為它可以藉由各種激酶而以7種不同組合在肌醇環上的羥基基團3、4以及5被磷酸化。磷脂質 (較佳地磷脂醯-肌醇_磷酸）的濃度可如上所述般被決定。在本發明之篩選方法的另一個具體例中，該試驗化合物（物質）呈一化學化合物存庫(chemicai c〇mp〇und iibrary) 的形式被提供。化學化合物存庫包括是多數的化合化合物並且已從任何多重來源被組合，包括化學合成的分子以及天然產物’或已藉由組合式化學技術而被產生。他們尤適於局通量篩選。他們可以包含具有一特定結構的化學化合物或一特定生物(諸如一植物）的化合物。在本發明的上下文中’該化學化合物存庫較佳地是一個包含有蛋白質以及多肽或小分子的存庫。依據上面TRPC的功能，本發明的方法可以被用於篩選有關一用於預防和/或治療一涉及内皮障礙（endothelial 41 200934789 dysfunction)的疾病的醫藥品(medicament)。特別地’該方法可以被用於篩選有關一用於預防和/或治療一涉及下列疾病的醫藥品：心血管疾病（cardiovascular disease)、心肥大（cardiac hypertrophy)、心臟衰竭（heart 5 failure)、缺企(ischemia)、内皮新生(neointima hyperplasia)、原發性擴張型心肌病（idiopathic dilated cardiomyopathy)、高企壓、冠狀動脈症候群(coronary syndrome)、心臟衰竭、腎臟衰竭、血栓症(thrombosis);氣喘（asthma)、一慢性呼吸道〇疾病（chronic respiratory disease)、慢性阻塞性肺臟疾病 10 (chronic obstructive pulmonary disorder)、原發性肺性高血壓 (idiopathic pulmonary hypertension)、急性缺氧性肺血管收縮（acute hypoxic pulmonary vasoconstriction)、發炎性·閉塞病（inflammatory occlusive disease)以及動脈粥樣硬化 (atherosclerosis) ° 15 在又一個方面，本發明有關於一依據本發明之如上所指明的試驗系統供用於鑑定一 TRPC調節劑的用途，其中 ❹ 上面對於本發明之試驗系統以及本發明之篩選方法的細節類似地被應用。在下面中，本發明藉由非欲為限定本發明之範疇的實 20 施例以及圖式而被說明。【實施方式】實施例1 :以TRPC作為誘餌的酵母菌雙雜交(Y2H)篩選内皮障礙(Endothelial dysfunction)被相信是各種心血 42 200934789 管疾病的主要病因。其中TRPC4在内皮功能扮演一個關鍵性的角色，它與内皮-依賴性血管鬆弛（endothelium-dependent vascular relaxation) 的調節的關聯性可能提供氧化壓力-誘發之内皮損傷並且涉入内皮障壁功能(endothelial 5 barrier function)。 MATCHMAKER 雙雜交系統 3 (MATCHMAKER two-hybrid system 3)(Clontech，Mountain View, USA)是要在酵母菌菌株AH109中篩選有關會與mTRPC4a之細胞質C· ® 端(&& 615-974)交互作用的新穎蛋白質。這個系統是以轉錄 10 因子 GAL4 在 4 個報導子基因（ADE2、HIS3、lacZ、MEL1) 下游的結合會活化它們的轉譯以及蛋白質表現。DNA結合以及活化是藉由兩種不同的蛋白質功能部位（它們可以是物理上分開的）所媒介(Fields S & Song Ο (1989). A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature 15 340,245-246)。111丁10^4〇1的（：端(&& 615-974)作為一個誘餌。至目前無止，沒有TRPC通道的X-射線結構存在但因 © 為與電壓-閘控K+通道蛋白的相似性，它們被預期形成四聚體(tetramers)。我們想要確認該蛋白質在生理多元性狀態中是被組合的。因此，誘餌是藉由將鼠類TRPC4a (ΝΜ__016984) 20 與一白胺酸拉鍊功能部位(leucine zipper domain)(它已被顯示為指導蛋白質四聚體化)(Harbury PB，Zhang T，Kim PS，& Alber T (1993). A switch between two·, three-, and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants. •Sc/ewce 262，1401-1407)融合而被建構。拉鍊的胺基酸序列 43 200934789 (被晝底線）以及側翼序列（flanking sequences)為GGGSG SRMKO IEDKL EEILS KLYHI ENELA RIKKL LGERG GSGS AAA (序列辨識編號：4)。這個建構物最後被併入 pGBKT7 (Clontech，Mountain View，USA)，造成它與 5 GAL4-DNA結合功能部位(mTRPC4a (615-974)/白胺酸拉鍊 /pGBKT7)的融合。其他用於針對酵母菌雙雜交篩選的誘餌以相同於人類TRPC1 (NM_003304)、鼠類TRPC5 (NM_009428)以及人類 TRPC6 (NM_004621)的 C 端的方式 ® 被建構。有關控制組實驗，通道C端藉由增強的綠色螢光 10 蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein)(EGFP/白胺酸拉鍊/pGBKT7)而被取代。一種被表現為一融合至GAL4活化功能部位(AD)之人類主動脈 cDNA 存庫(在 pACT2 中，Clontech，Mountain View, USA)與誘餌被一起共轉染至酵母菌中。僅有誘餌與一存庫 15 蛋白的交互作用使DNA-BD以及AD進入充分空間近端重建功能性GAL4並且因此造成報導子基因的表現。這些允〇許營養缺陷型(auxotroph)酵母菌菌株AH109在缺乏其他必須腺嘌呤（Ade)以及組胺酸(His)之選擇性培養基上的存活。再者’ GAL4活性會導致可以藉而x_gai轉換成一個藍 2〇色產物而在酵母菌菌落中被偵測到的β_半乳糖苷酶的表現。從這些菌株而來的餌食(Prey)質體被分離並且以將 cDNA插入物切出載體多重選殖位置之限制内切酶 EcoRI/XhoI予以分析地消化。所形成的片段藉由凝膠電泳而被分離’藉此具有相同大小的片段指出相同的餌食。隨 44 200934789 5 ❹ 10 15 ❹ 20 後’它們藉由與不相關之來自維多利亞多管水母(J叫⑽refl WcMr/a)的增強的綠色螢光蛋白（它亦被四聚體化並且被融合至DNA-BD)(EGFP/白胺酸拉鍊/pGBKT7)之共轉形而被測試有關内源性(intrinsic) DNA-結合和/或轉錄活性。經共轉形以餌食(不會非專一性地與EGFP交互作用）的酵母菌不會在_Trp/-Leu/-Ade/-His平盤上存活。相似地，餌食質體已被共轉形以誘餌並且被再測試有關在_Trp/-Leu/-His/-Ade 複脂平盤上的生長。來自存活菌落的餌食質體最後被定序並且序列是藉由使用BLAST軟體而與Genbank數據相比較0 人類主動脈 MATCHMAKER cDNA 存庫（Clontech, Mountain View，USA)是轉形至五.BNN132地被提供並且被放大以獲得足夠的質體供在酵母菌中的篩選。首先它的效價是透過在LB/amp瓊脂平盤上之1 X 1〇·6、1 X 1〇·7以及2 X UT7的平盤稀釋而被決定。在它們被培育歷時2天之後(30°C) ’被生長之菌落的數目被計數並且結果是每mL為 1.8 X 10 菌落形成單位(c〇i〇ny f〇rming units，cfu)。為了在放大之前獲得至少2·3χ數目的存在於存庫中之獨立選殖株 (有如由製造商所提供的3.5 X 106)，45,000 cfu/150-mm平盤被塗佈在160 LB/amp瓊脂平盤（1.5% Bacto瓊脂、1% Bacto 胰蛋白脒(tryptone)、0.5% Bacto酵母菌萃取物、1% Naa、 100 pg/mL安比西林)上。在於3(rc下36小時培育之後，細胞被到至液體LB/amp中、集中、分開至4個部分，並且藉由離心而被沉溯：。細菌被溶解並且質體是使用QIAfilter 45 200934789

Plasmid Giga Kit (Qiagen, Hilden，Germany)而被純化。 5 e 10 15 〇 20 有關酵母菌的轉形，DNA-BD/誘餌以及存庫接著被聚乙二醇/乙酸鋰（PEG/LiAc)-媒介的轉形至酵母菌（Ito H, Fukuda Y, Murata K, & Kirmura A (1983). Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol 153, 163-168)中。

透過一個小規模的轉形，DNA-BD/誘餌被引入酵母菌中。一個於液體YPAD培養基(30 mg/L腺嘌呤，〇.65g/L完全補充混合物(complete supplement mixture)、6.7 g Difco 酵母菌氮基w/o胺基酸、2% (w/v)葡萄糖）中被生長在3〇°c下之啤酒酵母菌AH109的過夜培養物被轉移到1〇 mL ypad 培養基造成一 A_ = 〇.l。細胞懸浮液被生長在3〇它下直到對數生長期被達到（A6〇0 = 0.5)，以無菌去離子水予以洗滌並且再懸浮於200 μΐ乙酸鐘(lithium acetate)緩衝液（1〇〇 mM

LiAc、10 mM Tris-HCn、1 mM EDTA)中。1.5 DNA-BD/ 誘餌（用於共表現的3pg質體)被混合以18 μΐ經熱_變性的載體DNΑ(來自於鞋:魚精子’ Sigma，Munich，Germany)、滞騰歷時40秒鐘並且轉移至冰。將丨2 mL PEG (40% PEG，100 mM LiAc，10 mM Tris-HCL，1 mM EDTA)加入至 200 μΐ 的酵母菌懸浮液中並且在30°C下被培育歷時3〇分鐘。細胞在 42C下被熱休克歷時15分鐘、離心、再懸浮於1〇〇 μ1 TE_ 緩衝液、塗佈於選擇性培養基上，並且在3(rc下被培育歷時至少2天。經DNA-BD/誘餌轉形的酵母菌生長在_Trp培養基上，帶有一餌食的共轉形株生長在_Trp/_Leu培養基 46 200934789 與陰性對照組載體PGADT7的共轉形而被確斜疋㈣性職妨和/鱗錄活化的。ρ_τ7是一個^載體&成GAL4~AD在酵母菌巾的單獨表現^因為這個、體不會表ί見TRPC4·交互作用蛋白，利用誘_的共轉 5 Ο 10 15 Ο 形不足以重建GAL4，因而酵母菌無法在_Trp/_Leu/ -Ade/-His平盤上存活。 __單DNA_BD/誘部轉形株被用作為用於下面使用AD 融合存庫的大規模轉形的接種源。3㈣夜培養物被轉移到 150 mL -Trp培養基’分成12個部分在5〇 mL Fak〇n管中並且在30C下被培育過夜。隔天這些起始培養物被集中，藉由離心被沉澱(3分鐘，2,〇〇〇xg，RT)並且再懸浮於1〇mL -Trp培養基中。這個懸浮液被添加至9〇〇mL Trp培養基中 (八6〇〇 = 0.15-0.25)並且細胞生長直到對數期被達到（A_ = 0.45-0.75)。懸浮液被分到數個50 mLFalc〇n管，藉由離心被沉澱(5分鐘，RT，2,000 X g)，以3〇〇 mL滅菌去離子水予以洗條並且再集合於滅菌去離子水中。在以5〇 mL乙酸鐘緩衝液（100 mM LiAc，10 mM Tris-HCl，ImM EDTA)洗蘇之後’細胞被再懸浮於4 mL乙酸鐘緩衝液中。在三重複中， 40 pg的存庫cDNA被混合以145 μΐ經熱-變性的載體DNA (來自於鮭魚精子），1.2 mL細胞懸浮液以及8.6 mL PEG (40% PEG，100 mM LiAc, 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA)並且在30°C下以250rpm予以培育歷時半小時。在每管加入l mLDMSO之後，細胞在42°C下被熱休克歷時15分鐘，接著在冰上被冷卻並且藉由離心(5分鐘，2,000 g，RT)而被沉 47 20 200934789 澱。各個沉澱物被再懸浮於25 mL -Trp/_Leu培養基中，再集中並且在250 rpm以及30°C下被生長歷時1小時。在離心之後(5分鐘，2,000 g’RT)，細胞再懸浮於12 mL-Trp/-Leu 培養基中’以300 μί部分被平盤培養在_Trp/_Leu/_His培養 5 基（直徑150 mm)上’並且在30。(：下被培育歷時2至5天。被生長的菌株被轉移到_Trp/-Leu/-His/-Ade瓊脂平盤上並且被培育歷時超過2至3天。存活的菌株被測試β_半乳糖普酶分析並且陽性反應菌株的質體被分離並且被定序。為 © 了測試轉形效率，1〇·3至10_6的稀釋物被平盤培養在 ίο _TrP/-His瓊脂平盤上並且cfu的數目在於3〇。〇下培育該等平盤歷時2天之後被計數。有關β-半乳糖苷酶分析，被生長在_Trp/-Leu/-His/-Ade 瓊脂平盤上的菌株被層疊以X_gal瓊脂(0.5%瓊脂、500 mM NaP04 緩衝液(pH 7)、1%十二烧基硫酸納(s〇dium dodecyl 15 sulphate, SDS)、2% X-gal 配於二甲基曱醯胺 (dimethylformamide，DMF)並且在30。〇下被培養高至12小 ❾ 時。一藍色產物的產生被視覺上地確認。有關從酵母菌的質體製備，存活在_Trp/-Leu/-His/-Ade 瓊脂平盤上並且在β-半乳糖苷酶分析為陽性反應的菌株被 20 再懸浮於2 mL -Leu培養基中並且在30°C下以及250 rpm被

生長24小時。它們藉由離心被沉澱，並且被再懸浮在2〇〇溶解緩衝液(2% Triton Χ-100，1% SDS, 100 mM NaCl，1〇 mM Tris-HCl (pH 8)，1 mM EDTA)。200 pL 酚氯仿異戊醇 (phenole/chloroforme/isoamyl alcohol)(25:24:1)以及 100 gL 48 200934789 5 ❹ 10 15 ❹ 經酸處理的玻璃珠被加入並且細胞壁藉由渦動（v〇rtexing) 這個混合物而被破壞。在離心（5分鐘，ι〇,〇〇〇 χ g ’ RT)之後，135 pL的水相被轉移到一個新的管中，混合以15叫乙酸鈉溶液（10%)以及375 pL乙醇，並且DNA藉由離心（30 分鐘，10,000 X g ’ RT)而被沉澱。DNA沉澱物被洗滌以乙醇(75%)、在37°C下被乾燥歷時30分鐘，並且被溶解於1〇 μι Tris-HCl (10 mM，pH 8.5)。2 pL DNA 藉由電穿孔至 E. coli而被轉形至五.⑺"中，細菌被塗佈在lb康黴素 (kanamycine)瓊脂平盤上以及質體被放大並且使用QIAprep

Spin Miniprep Kit (Qiagen，Hilden，Germany)而被純化。 DNA 循環定序反應(DNA cycle sequencing reactions)是根據雙脫氧終止子法(dideoxy terminator method)(Sanger ei <3/.，1977)使用4種經不同螢光標定的雙去氧核苷酸而被施行(Parker ei α/·，1996)。PCR 片段(藉由使用 ABI PRISM BigDye terminator cycle sequencing ready reaction kit 而被產生)被電泳地分離、偵測，並且在一個ABI PRISM 3100遺傳分析儀上被分析。 11個蛋白質（被列在下表中）被發現在Y2H分析中與 mTRPC4a C端物理地反應。 49 200934789 表1 : YTH餌食定義

複功能部脂蛋白元A-1結合蛋白基因名稱 GenBank登錄編號 ANKRD35 NM 144698 APOA1BP NM 144772 溴功能似高-運動性群蛋白2之i異構型b BAZ1B HMG2L1 AB032253 CR456504 makcrin環指蛋白！ MKRN1 NM 013446 刖-B-細胞白血病同源盒交互作用私今1 PBXIP1 NM 020524 肉瘤抗原NY-SAR-48 NM 033417 SEC14以及血影蛋白功能部位1 SESTD1 NM 178123 血影蛋白，阿伐，非紅血球1 SPTAN1 U83867 染色體3的結構維持 SMC3 AF067163 人踝蛋白2 TLN2 NM 015059

這些蛋白質中沒有一者在先前已被描述會與TRPC4通道交互作用。SESTD1似乎是最令人感到興趣之有潛力的交互作用夥伴’因為一個功能部位研究(Marchler-Bauer A & Bryant SH (2004). CD-Search: protein domain annotations on the fly. Λ^/c/ezc Jc/办及以 32, W327-W331)顯示出在 SESTD1 中的一個N端似SEC14p脂質·結合功能部位（第1圖）。保守的SEC14-模組已知會結合並且運輸細胞磷脂質。一些報導已顯示TRP通道藉由磷脂質（特別是PIP2)的調節。這讓我們假設SESTD1涉入TRPC4的調節。除了似 SEC14p脂質-結合功能部位以外，被稱為血影蛋白重複的2 50 10 200934789 個螺旋結構在SESTD1中被發現到。這些功能部位已知會媒介蛋白質-蛋白質交互作用並且在某些細胞骨架蛋白中被發現。 5 ❿ 10

15 G 20 SESTD1在人類主動脈cDNA存庫中被發現到全長。它的胺基酸序列是相同於GenBank登錄編號NP_835224除了一個置換(H508Q)外。它是依據一個在bp 1571 (NM_178123) 處的點突變，它亦可以在一個基因體blast中被發現到。另一個在bp 1748處的點突變是沉默的。實施例2:從mTRPC4a側的交互作用位置作圖（interaction site mapping) 為了要更詳細地定義TRPC4與SESTD1的交互作用，一個定向的酵母菌雙雜交篩選(directed yeast two-hybrid screen)(參見實施例1)被施行。酵母菌被共轉形以SESTD1 以及各種C端mTRPC4a片段並且被平盤培養在選擇性培養基上。實驗是類似於那個在實施例1中者被進行。然而，為了繪製SESTD1在TRPC4上的交互作用位置，單體誘餌建構物(缺少拉鍊)被產生以促進選殖。藉由TRPC4片段的反覆縮短(iterative shortening)，我們發現一個29個胺基酸(aa 700-728)的小序列就足以媒介與全長SESTD的交互作用（第2圖）。這個推測的SESTD1 結合序列在較短的TRPC4p異構型還有在TRPC5中是保守的。為了要確認SESTD1以及TRPC4/5間的交互作用的專 51 200934789 一性’酵母菌被共轉形以SESTD1以及hTRPCl、 mTRPC4p、mTRPC5或hTRPC6的C端並且被平盤培養在選擇性培養基上。結果指出SESTD1與TRPC4以及TRPC5 之C端尾部的一個專一性交互作用（第5圖）。 5 實施例 3 : GST 拉下(GST pulldown) 為了要確認SESTD1以及mTRPC4間的物理性交互作用’藉由一蛋白質生化法的GST拉下分析被施行。 ❾ 一用於在細痛中' —麵胺基硫S-轉移酶（glutathione 10 S-transferase, GST)融合蛋白的重組型表現的建構物是藉由將人類 SESTD1 (NM—178123)插入至 PGEX-4T-1 載體 (Amersham，Munich, Germany)因此導致它的 N 端與 GST 融合而被製備。源自於pGEX載體的GST融合蛋白表現是在 tac啟動子的控制下並且由乳糖類似物異丙基β_〇硫半乳糖 15 苷(isopropyl β-D thiogalactoside，IPTD)誘發。經轉形個別質體的 BL21 star (DE3) one shot 化學勝任五// (invitr〇gen， © Karlsruhe，Germany)被培養在選擇性LB培養基(含有0.2% (m/v)葡萄糖以抑制蛋白質表現）中過夜並且隨後轉移到1〇〇 mL選擇性LB培養基(具有0.2% (m/v)葡萄糖)造成A600 = 20 0.1。這個液體培養物被生長在室溫下以及250 rpm直到A_ =0.6-0.8。蛋白質表現藉由添加1〇 mM (GST)或20 mM (GST-SESTD1、GST-SESTD1-片段）iptg 而被誘發並且培育被持續歷時6小時。藉由離心（16,〇〇〇 X g，1分鐘，RT)，細菌懸浮液被沉澱成5 mL部分，它以2 mL D-PBS (w/o Ca2+， 52 200934789

Mg2+)予以《丨次並且_存於镇 ❹ 10 15

解。各個沉殿物被再懸浮於㈣&溶解緩衝液（含Ρ = mg/mL溶菌酶)並且在冰上被培育歷時2〇分鐘處理σ X 5秒鐘)之後，溶胞產物(1鱗)於16，_ x g = 4C下被離〜3G ；7鐘並且上清液被轉移到—個新的管中。在上清液被添加並且以轉緩驗充填至lmL之前，5〇此麵胺基硫S_a贿上清㈣⑧溶解緩衝液予以洗務3 次(使用-個G27針頭）。在於一轉子上的培育（室溫)歷時ι 小時之後，珠粒以500 pL溶解緩衝液洗滌3次。被結合至麵胺基硫sepharose的GST融合蛋白被用於GST拉下^析。 HEK293細胞被暫時地轉染以mTRpC4a_c端或者全長 mTRPC4a被溶解並且蛋白質濃度是使用BCA蛋白質分析套組而被決定。一個50叩總蛋白質的等量物被添加至結合至麩胺基硫sepharose的GST或GST-SESTD1 ’以溶解緩衝液充填至1 mL並且被培育在一轉子上（2小時，尺丁）。

Sepharose是利用500 μί溶解緩衝液以及一個G27針頭在 20 pL 的 lx LDS 樣品緩衝液(含有 5% β-MEXInvitrogen， Karlruhe，Germany)被添加之前予以洗滌3次。探針被變性 (95°C，3分鐘）、離心並且藉由西方墨點法而被分析。有關西方墨點法，樣品被裝載在Bis-Tris-HCl梯度凝膠(4-12%) 上並且於150 V下在NuPAGE MOPS SDS運行緩衝液 (running buffer)中被電泳地分開歷時75分鐘。凝膠是依據製造商的操作指南使用 NuPAGE Transfer Buffer (Invitrogen,

Karlruhe, Germany)以及一 Novex Xcell 2 Blotmodul 53 20 200934789 iBlot(Invitrogen, Karlruhe，Germany)或 iBlot Dry System (Invitrogen，Karlruhe, Germany)而被點潰在一硝化纖維素膜上。為了確認轉移，在硝化纖維素膜上的蛋白質被染色以 0.1%麗春紅 S 溶液（Ponceau S Solution)(Sigma，Munich, 5 Germany)歷時1分鐘並且過量的染劑是藉由以水洗滌而被移除。在將膜以一級抗體（參見下列抗體的列表）予以培養 (lhr，RT)之前，該膜是以阻斷緩衝液（blocking buffer) (Odyssey blocking buffer 經以含有 TBS (500 mM NaCl, 29 ❹ 》1]\4 1^-11(：1，卩117.4)的0.6%丁\\^1120稀釋為1:1)歷時1小 i〇時(RT)。在將它以 TBST (500 mM NaCl，20 mM Tris-HCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4)予以洗滌4次之後，它被培育以經螢光標定的抗體(45分鐘，RT)(參見抗體的列表）並且再次以 TBST 予以洗膝 4 次。膜是使用 Odyssey Infrared Imaging System (LiCor，Lincoln，USA)或 Lumi Imager (Roche， 15 Mannheim，Germany)而被分析。 ❹ 54 200934789 ❹ Ο ,2二所使用的以及下面實施例)的列表

Alexa Fluor 680抗小鼠(兔子） X^orltiinP iriam-nonxr lllVlirogCllj JS-cUiiuuc, vjciiiiciiiy Aiexa Fluor⑽υ抗兔子(山羊、 lHVlirOgwTl, ivainUilCj VJCimdliy Alexa Fluor bSU抗大鼠(山羊） --_ lIlVlirUgClx5 JVaiAi uiic, vjdxiiaiiy 抗-FLAG (兔子） Rockland, Gilbertsville, USA 抗-GAPDH (小鼠） Chemicon, A^esbanden, Germany ---- 抗-GFP (小鼠） Roche, Mannheim, Germany ~~----_ 抗-GST (兔子） Sigma, Munich, Germany ---— 抗-GST (兔子）’經Eu-Nl輕令 Perkin Elmer, Waltham, USA ------ 抗-HA (大鼠） Roche, Mannheim, Germany 抗-兔子(山羊），經Eu~Nl德金 Perkin Elmer, Waltham, USA --：^ 抗-兔子(山羊）’經辣根過氣化氫酶 (HRP)-綴合 Pierce, Rockford, USA 抗mg/mL Eurogentec, Seraing, Belgium 抗-TRPC4 (兔子） Alomone, Jerusalem, Israel 抗-TRPC5 (兔子） Alomone, Jerusalem, Israel GST拉下分析被執行以藉由一蛋白質生化法來確認 SESTD1以及mTRPC4之間的物理性交互作用。在五.⑶" 中’被表現以及經純化的重組型GST-SESTD1首先被用來拉下源自於一 HEK293細胞溶胞產物之過度表現的全長 mTRPC4cx。然而，因為兩個蛋白質具有相同的大小，由一抗-TRPC4抗體所偵測到的通道訊號可藉由對於seSTDI的非專一性結合而被捏造。為了克服這個問題，較小的 55 5 200934789 mTRPC4aC端(aa 615-974)被使用在利用 GST-SESTD1 的進一步拉下實驗中。在這些實驗中，可以被證實的是，SESTD1 以及mTRPC4a C端可物理性地交互作用（第4圖）。 5 ❹ 10 15 Ο 20 實施例4 :從SESTD1侧的交互作用位置作圖 GST拉下方法（參見實施例3)被採用並且被用來研究 mTRPC4a以及SESTD1之間的交互作用位置。依據所預測的功能部位，3個SESTD1_建構物（參見第5圖）被選殖到 pGEX-5X-3 (Amersham，Munich, Germany)中並且在 One shot BL21 star (DE3)經化學修飾的五.C0// (Invitrogen， Karlsruhe，Germany)中被表現有如GST融合蛋白。在被選定的條件下’從細菌純化出所欲數量之帶有似 SEC-14p脂質·結合功能部位的GST_Sec 14 (⑽i_192)是不可能的。誘發它的表現對於細菌而言似乎是有毒性的，因為它們比經轉形以GST-Spec 1 (aa 193-406)或全長 GST-SESTD1的細菌生長的更為緩慢。因為在mTRPC4a中經作圖的SESTD-1結合位置亦存在於TRPC4-P異構型中並且在虹处。中是高度保守的，，們式驗有騎有3個通道與GST_連結之卿皿片段的父互作用。mTRPC4a-p以及mTRPC5全都與第一金影蛋白功能部位㈣地交互作料且在錢墨財對於第二功能部位的—個微弱結合也可以被觀制。第-血影蛋白功能 [M立似乎疋交互作用的主要位置，但吾人無法排除似 SEC14p脂質結合功能部位的參與(第6圖）。 56 200934789 、因為我們無法施行利用SEC 14功能部位的拉下實驗，一個定向酵母菌雙雜交篩選被採用來更為詳細地定義不同 SESTD1功能部位涉入TRPC4/5結合。3個SESTD1建構物，SESTDl_Sec 14 (aa 1，192)、SESTD1-Spec 1 (aa 193-406) 5 以及 SESTDl-Spec 2 (aa 407-696)是藉由將個別的 SESTD1 基因片段插入至酵母菌表現載體PACT2 (Clontech， Mountain View，USA)而被相似地選殖到第6圖中所描述的建構物’造成它們的表現有如一對GAL4活化功能部位的 ® 融合。 10 實驗結果證實，第一血影蛋白功能部位作為SESTD1 、以及mTRPC4cxC端間之交互作用的位置。亦顯示似SEC14p 脂質結合功能部位沒有涉入（第7囷）。在某些GST拉下實驗中所觀察到的Spec 2功能部位以及mTRPC4a C端間的微弱交互作用未強烈到足以允許經共轉形的酵母菌在選擇性 15 培養基上的存活。相反地’在定向酵母菌雙雜交中 mTRPC4-C端獨立地與Spec 1以及Spec 2功能部位交互作〇用。總結’從所採用的GST拉下以及定向酵母菌雙雜交分析而來的結果中確認Spec 1功能部位在SESTD1中作為主要的交互作用位置。 20 實施例5:共免疫沉溉法先前的Y2H以及GST拉下實驗已顯示，SESTD1與 mTRPC4a、-(3以及mTRPC5交互作用。共免疫沉澱實驗被執行以確認這些蛋白質-蛋白質交互作用也在活體内發生。 57 200934789 5 10 15 ❹ 20 因為沒有對抗SESTD1的商業抗體可供利用，兩個多株肽抗體是透過Eurogentec (Seraing, Belgium)被客製化並且被說明。抗-SESTD1 #147抗體是針對對抗在第一血影蛋白功能部位中的一個序列(aa 265-280，CRQRSKRTQLEEIQQK;序列辨識編號：5)以及抗-SESTD1 #148是藉由以C端（aa 682-696 ’ KRQQLRHPEMVTTES ;序列辨識編號：6)來免疫兔子而被產生。抗體在個別的肽上是經親和力純化而被提供的。 hSESTDl 被插入至載體 pCMV-HA (Invitrogen， Karlsruhe, Germany)導致它的表現有如具有人類流行性感冒病毒的血球凝集素抗原抗原決定位的一 N端融合蛋白 (ΗA標截：YP YDV PD YA ;序列辨識編號：7)。HM1細胞（一種穩定地表現蕈鹼Ml受體的HEK293細胞株)(Peralta EG， Ashkenazi A, Winslow JW, Ramachandran J, & Capon DJ (1988). 334, 434-437)被暫時地轉染以 HA-SESTD1 還有未經轉染的HM1細胞被溶解（1 mM EDTA、150 mM NaCb 50mMTris-Ha、l%TritonX-100，補充有完全蛋白酶抑制劑)並且蛋白質濃度是使用bca蛋白質分析套組而被決定。有關西方墨點法，相同數量的蛋白質樣品被裝載在 Bis-Tris-HCl梯度凝膠(4_ 12%)上並且被電泳地分離(參見實施例3)。當在西方墨點法中被測試時，兩種抗體在HM1細胞溶胞產物中偵測到過度表現HA-標籤的SESTD1 (被預期的大小為79 kDa)。此外，在未經轉染的細胞中，一内源性 58 200934789 蛋白質與HA-SESTD1的共移動（co-migration)被兩種抗體所辨識，強烈地暗示這個蛋白質是天然的SESTD1。除了 SESTD1以外，抗-SESTD1 #147不受所使用的稀釋度所影響而在西方墨點上辨識到一些其他的蛋白質以及抗 5 -SESTD1 #148亦偵測到另一個帶有一大約重量為50 kDa 的蛋白質（第8圖）。 HM1細胞分別地被共轉染以HA-標籤的SESTD1以及 FLAG-標籤的 mTRPC4p，GFP-標籤的 mTRPC5 或 pcDNA3.1 ❹ （陰性對照組）。細胞藉由在轉染之後24小時以1〇 mL冰冷 ίο D-pBS (w/o Ca2+，Mg2+)洗滌它們2次之前，將它們置於冰上歷時10分鐘而被收穫。細胞膜是藉由將細胞從一個碟 (dish)上到至600 μΐ均質化緩衝液(32〇 mM蔗糖、5 mM HEPES、pH 7.4，補充有完全蛋白酶抑制劑）中而被分離。從每個轉染條件4個碟而來的細胞懸浮液被集中、超音波 15 處理（1 x 5秒鐘）、離心（1㈧X g，10分鐘）並且所形成的上清液被進一步離心分裝在3個管（l〇〇,〇〇〇xg，3〇分鐘）。膜 ❹ 蛋白從所形成的沉澱物中以每個沉澱物600 μΐ溶解緩衝液 (補充有完全蛋白酶抑制劑）予以溶解，被培育在冰上歷時1 小時並且離心（15分鐘’ WOOOxg，4。〇。上清液被^移到 20 一個新的管中並且被集中。一部分被保留作為輸入對照組 (input control)以及剩餘的溶胞產物被分成兩管。4肫^第一抗體被添加至各探針並且它們在4°C下於一轉子上被块育過夜。細胞溶胞產物從每個轉染條件4個碟中被取得二從一個碟而來的細胞被直接地刮入6〇〇溶解緩衝液(補 59 200934789 t有完全蛋白酶抑制劑）’在冰上被培育歷時】小時並且被離心（15分鐘，16000xg’ 4°〇。上清液被轉移到一個新的管’與其餘3碟的溶胞產物集中並且如上所述的被處理。隔天30 pL蛋白質A-sepharose或蛋白質G_sephar〇se上清 5 液分別地洗務並且被添加至探針。它們在4。(：下被培育超過 2小時。在20 pL 2x LDS樣品緩衝液(含有1〇% β ΜΕ)被添加之前’ Sepharose以規格27的針頭與5〇〇队溶解緩衝液予以洗滌3次。探針被變性(95°C，3分鐘）、離心並且藉由 © 西方墨點法（參見實施例2)利用抗-SESTD1抗體予以分析。 ίο 離子通道的成功沉澱是藉由以抗-FLAG (mTRPC4p)以及抗 -TRPC5來探測而被檢驗。當mTRPC4p以及mTRPC5從HM1細胞溶胞產物被沉殿’ SESTD1在被沉殿的樣品中被發現到。—個非常少量的 SESTD1亦藉由FLAG以及GFP抗體而從對照組HM1細胞 15 溶胞產物（僅表現HA-SESTD1但沒有FLAG-標籤的 mTRPC4p或GFP-標籤的mTRPC5)中被沉殿。這個非專一 ❹ 性的結合在不同的沉澱條件下被看見。它總是遠低於與離子通道蛋白的共免疫沉澱（第9圖）。 20 實施例6 : SESTD1以及TRPC5的功能性交互作用有關TRPC5以及SESTD1的功能性交互作用研究，一種穩定地表現mTRPC5-YFP的HM1細胞株(HM1-C5Y細胞) 被產生。 HM1細胞使用Lipofectamine 2000而被轉染以4 pg的 60 200934789 mTRPC5-YFP建構物。該建構物是藉由將一個 mTRPC5-GFP 的 Xbal/Notl 片段(Strubing C, Krapivinsky G, Krapivinsky L, & Clapham DE (2003). Formation of novel TRPC channels by complex subunit interactions in embryonic 5 brain. ·/ C/iem 278，39014-39019)插入至 pcDNA3.1(-) zeo中。YFP融合物是藉由將一個Notl/EcoRI剪切的 YFP-PCR片段結合到通道C端而被獲得。在轉染後的24 小時，單株選擇(clonal selection)是藉由將細胞培養在完全 G 培養基（complete medium)(DMEM/Nutrient F12 (具有 ίο glutaMAX I; Invitrogen, Karlsruhe，Germany)補充有 10% (v/v) FBS (PAA，Pasching，Austria)、1 mM 麵醢胺酸、400 pg/mL 遺傳黴素(geneticine)、50 pg/mL zeocin (全部來自 Invitrogen，Karlsruhe，Germany))中而被起始。在數天選擇之後，選擇單一選殖株是藉由手工挑出被生長的菌落而被 15 分離。一個選殖株被選出以供進一步研究。離子通道的功能性表現是藉由電生理學測量法而被測試。碳醯膽鹼〇 (carbachol)的電流密度以及經胰蛋白酶誘導的離子電流有如先前所描述的（Strubing C，Krapivinsky G，Krapivinsky L， & Clapham DE (2001). TRPC1 and TRPC5 form a novel 2〇 cation channel in mammalian brain. 29, 645-655)被測量為 15.9±5.5 pA/pF (n = 10，碳醯膽鹼）以及 127·8±57·6 pA/pF (η = 6，胰蛋白酶）。相反地，在未經轉染的ΗΜ1細胞中沒有明顯的電流是藉由碳醯膽鹼或胰蛋白酶而被誘發。 61 200934789 在細胞質鈣[Ca2·^的變化是使用Ca2+-敏感性螢光染料 fura-2 AM (Invitrogen，Karlsruhe，Germany)(—種被廣泛使用的指標’它的螢光激發最大值會視Ca2+結合而轉移到較短的波長而螢光發射最大值是相對未改變的）而被測量。典 5 型地在34〇 nm以及380 nm下被激發的螢光強度的比例被測量。 20,000-40,000細胞/井被植入黑色經聚-L-離胺酸塗層的玻璃底部 96 井平盤（Greiner, Frickenhausen, Germany)並 © 且被生長過夜至一幾乎匯聚的單層（confluent monolayer) 〇 10 它們被裝載在100 μί»標準細胞外溶液(standard extracellular solution)(E)(由 135 mM NaCl、1 mM MgCl2、5.4 mM KC1、 2 mM CaCl2、10 mM HEPES、10 mM 葡萄糖(pH 7·35)所構成並且補充有2 μΜ fura-2 AM (30分鐘，37。〇)中並且被允許於37°C下在80 pL的E中去酯化歷時15分鐘。細胞内#5 15 訊號在一工作台上掃描螢光計（benchtop scanning fluorometer)(FLEX; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) ❹ 中被比例測量（ratiometrically measured)。榮光在340 nm以及380 nm被交替地激發、在495 nm被長波濾過(l〇ng_paSs filtered)並且以4秒鐘間隔被捕捉。340/380 nm激發比例是 2〇使用 SoftMax Pro 軟體(Molecular Devices)而被計算。基線螢光（baseline fluorescence)在蕈鹼促效劑（muscarinic agonist)碳醯膽驗或經蛋白酶-活化的受體

(protease-activated receptor，PAR)促效劑騰蛋白酶以 FLEX 量吸管(pipettor)被提供之前被偵測歷時30秒鐘。碳醯膽驗 62 200934789 以及胰蛋白酶在HMl細胞中分別地經由Ml-受體以及 PARs偶合至磷脂酶c (phospholipase C)。磷脂酶C依次刺激從細胞内存庫（stores)而出的Ca2+釋放（pi反應）還有 TRPC5的活化。從存庫而出的Ca2+釋放以及透過TRPC5的 5 Ca2+進入在fura-2_裝載的細胞中被螢光測量。當細胞外ca2+ 不存在時’在細胞内Ca2+的經碳醯膽鹼_以及胰蛋白酶-誘發的升高單獨地是因為從内部存庫的釋放而與TRPC5無關。因此’ Ca2+釋放被計算為在無Ca2+細胞外溶液中所計算之 ❹ 螢光曲線下的面積。TRPC5-媒介的Ca2+進入是透過將在標 ίο 準細胞外溶液(含有Ca2+)中於所計算之曲線下的面積減去

Ca2+釋放而被計算。當HA-SESTD1在HM1-CY5細胞中被過度表現時， TRPC5-媒介的Ca2+進入在碳醯膽鹼或胰蛋白酶的施用之後沒有顯著地有別於經轉染以一不相關之蛋白質（β-半乳糖苷 15 酶，bGAL)的對照組細胞。從内部存庫而來的Ca2+釋放在有或沒有HA-標籤的SESTD1存在時亦沒有被顯著地改變。 ❹ HA-SESTD1在一會内源性地表現SESTD1的jjMl細胞株(實施例5)中的過度表現不會影響TRPC5_媒介的Ca2+ 進入。因此’要測試的是在這些細胞中剔除(kn〇ck_d〇wn) 20 SESTD1蛋白表現是否會改變TRPC5功能。 SESTD1的剔除是藉由以一群3種針對不同SESTD1 序列的siRNA雙螺旋物(Dharmacon，序列參見表2)來轉染細胞而被達成。因為FBS對於轉染效率沒有明顯的效果，細胞在完全培養基(full medium)中使用Lipofeetamine 2000 63 200934789 (Invitrogen，Karlsruhe, Germany)而被轉染。只有脂質體被形成並且被裝載入轉染培養基（Opti-MEM，也來自於 Invitrogen)中。3xl05 HM1細胞/2mL/井被植入一個6井平盤中，隔天生長至30-50%匯聚。2.5pL的20pMsiRNA原 5 液(stock solution)或1 μι的50 μΜ siRNA原液分別地被稀釋在250 pL轉染培養基中並且以5 pL Lipofectamine 2000 (亦被稀釋在250 μίν Opti-MEM中)予以培育歷時20分鐘 (RT)。混合物被施用至細胞造成一為20 nmol/L的最終〇 siRNA濃度。轉染之後48小時，SESTD1幾乎被2〇 nM的 ίο siRNA (各者為6.6 μΜ)完全地剔除而一個不相關的蛋白質 (GAPDH)的表現未被改變（第10圖）。 ❹ 64 200934789 表3 :所使用的siRNAs的列表 siRNA 序列供應商或序列辨識編號目錄編號 siGENOME 組 4 ’ 人類SESTD卜雙螺旋物1 S ： GAACUUAAU CAG CAAAUU GUU A : 5，-PCAAUUU GCUGAUUAA GUUCUU (序列辨識編號：8) (序列辨識編號：9) D-018379-01 siGENOME 組 4，人類SESTD1，雙螺旋物3 S ： GAGAGUACA UAGAUUGGA AUU A : 5’-PUUCCAA UCUAUGUAC UCUCUU (序列辨識編號：10) (序列辨識編號：11) D-018379-03 siGENOME 組 4，人類SESTD卜雙螺旋物4 S ： GGAUGAAAC UAGUUAAUC UUU A : 5，-PAGAUUA ACUAGUUUC AUCCUU (序列辨識編號：12) (序列辨識編號：13) D-018379-04 沉je子r陰性對照組#2 Ambion 4613 ❹ 經轉染以20 nM被集中的SESTD-siRNA雙螺旋物（一種非專一性的非默化對照組siRNA (沉嚴子R陰性對照組 #2，Ambion))或僅有脂質體的HM1-C5Y細胞在螢光[Ca2·^ 5 測量法中被功能性地試驗。在Ml以及PAR活化之後，從内部存庫而來之TRPC5-非依賴性Ca2+釋放在3群之間沒有顯著的不同。相反地，在碳酿膽驗或胰蛋白酶的施用之後， 65 200934789 TRPC5-媒介的Ca2+進入在以專一性SESTDl siRNA處理的細胞中被顯著地降低。相較於假轉染的細胞，TRPC5-媒介的Ca2+進入在碳醢膽驗或胰蛋白酶刺激之後被降低至 45.4±2.8% (η = 14)或相較於經轉染以對照組siRNA的細胞 5 為49.6±3.1%(n= 14)。當細胞以ΙΟΟηΜ胰蛋白酶予以活化時；相較於假轉染的細胞TRPC5-媒介的Ca2+進入被降低至 51.4±3.7% (η = 15)或相較於經轉染以對照組siRNA的細胞為 57.5±4.2% (n= 15)。 ❹ 10 實施例7 : SESTD1的表現因為SESTD1的組織分布(tissue distribution)未曾被描述，不同組織的即時定量PCR (TaqMan，Livak KJ, Flood SJ， Marmaro J, Giusti W, & Deetz K (1995). Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched 15 probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PC7? 4，357-362)分析被執 ❹ 行。結果顯示，SESTDl mRNA在人類組織中被普遍地表現 (參見第11圖）。我們發現SESTDl在一個由人類主動脈所製成的 2〇 cDNA存庫中並且有興趣看看該蛋白質在哪種血管細胞類型中被表現。因此人類初級細胞的溶胞產物是藉由西方墨點法而被分析有關SESTDl表現。SESTDl存在於主動脈 (AoSMC)以及冠狀動脈(CASMC)平滑肌細胞中還有在主動脈(HAEC)以及微血管(HMVEC-d)内皮細胞中（第12圖）。 66 200934789 實施例8 ··活艎外磷脂質結合 SESTD1的N端似SEC14p脂質結合功能部位是一個完整的真核細胞蛋白質家族的名稱，這個家族的成員能夠專一性地結合並且運輸不同的磷脂質。TRPC通道活性(Kwon 5 Y, Hofmann T, & Montell C (2007). Integration of phosphoinositide- and calmodulin-mediated regulation of TRPC6. Mol Cell 25, 49卜503)還有許多其他的細胞功能（例如細胞外形以及附著，Raucher D, Stauffe T，Chen W, Shen K, Guo S, York JD, ❹ Sheetz MP, & Meyer T (2000). Phosphatidylinositol 4,5- 10 bisphosphate functions as a second messenger that regulates cytoskeleton-plasma membrane adhesion. Cell 100, 221-228) 可以藉由磷脂質含量與分布而被調節。因此，我們發展出可以被用來偵測並且定量結合至SESTD1的磷脂質的分析。 a) PIP 條填脂質寶·貼分析(PIP strip phospholipid overlay 15 assay) PIP 條(Invitrogen，Karlsruhe, Germany)是商業上可獲得 ❹ 的硝化纖維素膜(含有100 pmol的15種不同磷脂質的樣品以及一個空白樣品）。它們是以用於PIP條的不同阻斷緩衝液予以阻斷歷時1小時(RT)，該阻斷緩衝液是由3%基本上 2〇無脂肪酸的BSA (Sigma, Munich, Germany)配於下列而構成： a) TBST (150 mM NaCl, 10 M Tris-HCl, 0.1% Tween 20, pH 8)， b) 具有 0.06 μΜ 游離 Ca2+的 TBST (150 mM NaCl，l〇 67 200934789 mM Tris-HCl, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 0.9 mM CaCl2, 0.1% Tween 20, pH 8) c)具有 2·5 μΜ 游離 Ca2+的 TBST (150 mM NaCl，10 mM Tris-HCl, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 1 mM 5 CaCl2, 0.1% Tween 20, pH 8)

並且接著分別以含有500 ng/mL經純化之GST的阻斷缓衝液a)或阻斷緩衝液b)或c)予以培育(4小時，RT)，與500 ng/mLGST-SESTDl (4小時，RT)。在洗滌（以個別的阻斷緩 © 衝液2次以及隨後1次以阻斷缓衝液a))之後，它們在4°C 10 下以第一抗體抗-GST (1:2,000配於阻斷緩衝液a)中）予以培育過夜。3個使用TBST (pH 8)的洗滌步驟隨後為使用二級 HRP-綴合的抗-兔子抗體（1:2〇,〇〇〇配於阻斷缓衝液a)中）的 45分鐘培育。該膜被再次使用TBST予以洗蘇3次，以lmL Lumi-LightPLUS Western Blotting substrate (Roche, 15 Mannheim，Germany)予以培育（5分鐘）並且化學發光訊號是使用一 Lumi Imager (Roche, Mannheim, Germany)而被分 ❹ 析。 SESTD1對所有生理學被發現到的磷脂醯_肌醇_單_以及雙磷酸(PIP，PIP2)還有磷脂酸的專一性結合在一磷脂質剪 20 貼分析中被偵測到。SESTD1對這些受質的結合會視Ca2+ 濃度而改變。在有60 nM Ca2+(在靜止細胞中的大約生理學濃度)存在時’ SESTD1強烈地結合PIPs並且不同的ρπ>2 與磷脂酸達一較少的程度。藉由升高Ca2+濃度(2.5 μΜ)來刺激細胞活化會造成Π(3,5)2、ΡΙ(4,5)2、磷脂酸還有π(3,4)2、 68 200934789 PI(3)P以及PI(4)P的被增加之結合（第π圖）。 b) Cova-PIP 平盤結合分析（c〇va-PIP plate binding assay) LL5_a的GST-標籤的PH-部位、GST單獨或 GST-SESTD1被稀釋於阻斷緩衝液a)中供用於pip條(實施 5 例8a)。裝載有每井10或100pmolPIPn的Cova-PIP專一性

平盤(Echelon, Salt Lake City, USA)在室溫下以每井 100 pL 蛋白質溶液被培育歷時3小時。在用於pip條的100 pL抗 -GST (1:1，〇〇〇配於阻斷緩衝液a))被添加至各井並且在室溫 © 下被培育歷時1小時之前，平盤被手動地以供用於PIP條 ίο 的阻斷緩衝液a)予以洗滌3次。平盤使用一自動平盤清洗機以 TBST (150 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，0.1% Tween 20, pH 8)予以洗務4次。有關解離-增強的鑭系元素螢光免疫分析(DELfia)，用於PIP條的100 μι二級EU-N1-標定的抗-兔子抗體(500 15 ng/mL配於阻斷緩衝液a))被每井地添加並且在下被培月 1 小時。在 100 μ!^ 增強溶液(enhancer solution)(Perkin O Elmer，Waltham，USA)被每井地添加之前，平盤利用一自動平盤清洗機以TBST予以洗滌4次。在20分鐘培育之後，鋼系元素的螢光在一個Tecan Ultra平盤讀取儀（Tecan， 2〇 CraiIsheim，Germany)中被激發(Xexc = 340 nm)以及讀取(Xexc =620 nm)。 LL5-a的GST-標籤的pH-功能部位被暗示為一個辨識所有構酸肌醇的對照組試劑。因此，GST-SESTD1以及 LL5-a的結合首先在裝載有每井1〇 pm〇i受質的c〇va pip 69 200934789 專一性平盤上被比較。而在所選定的條件下，有LL5-a之 GST_標籤的功能部位的顯著結合但沒有GST-SESTD1 的顯著結合被觀察到。我們推論’增加载入每井中的受質數量會增加使用 5 GST_SESTD1所觀察到的訊號。因此，多樣化數量的SESTD1 的結合是使用裝載有每井1〇〇 pm〇l受質的平盤而被相似地測試。甚至’ SESTD1在對pi(4,5)P2以及pi(3,4)p2有最高親和力的情況下專一性地結合所有磷酸肌醇（第14圖）。 10 【圖式簡單說明】第1圖：SESTD1的拓樸學。由696個胺基酸所構成的全長蛋白質(被預期的分子量為79 kDa)並且由3個結構功能部位所構成。Sec 14 (aa 8-147):似SEC14p脂質結合功能部位；Spec 1 (aa 233-381)，Spec 2 (aa 430-605):血影 15 蛋白重複1與2。第2圖：mTRPC4a-C端的SESTD1-結合位置的作圓。 ❹ （A)被篩選有關SESTD1結合的mTRPC4a-C端截斷之概要表示。（B)經共轉形以mTRPC4a-C端的截斷突變體(誘甸^ 以及全長hSESTDl (餌食)之酵母菌菌落被平盤培養在選擇 20 性-Trp/-Leu/-Ade/-His瓊脂培養盤上。酵母菌生長（明亮的顏色)表示建構物的交互作用。第3圖：不同TRPCs的C端與SESTD1間之交互作用的酵母菌雙雜交分析。被顯示的是經共轉形以被指明的 TRPC通道的C端（誘餌）以及全長hSESTDl (餌食)之酵母菌 70 200934789 菌落被平盤培養在選擇性-Trp/-Leu/-Ade/-His瓊脂培養盤上。酵母菌生長（明亮的顏色)表示建構物的交互作用。第 4 圖：mTRPC4a-C 端(aa 615-974)的 GST-SESTD1 5 Ο 10 15 ❹ 20 拉下。與來自過度表現111丁尺？〇4〇1-0!端（3& 615-974)之 HEK293細胞的GST-SESTD1 (徑3)或GST (陰性對照組，徑4)沉澱之樣品的抗-TRPC4 (1:200)免疫墨點。墨點是以二級Alexa Fluor 680山羊抗-兔子（1:2,500)抗體予以顯像。第5圖：GST-SESTD1融合蛋白的概要描述。含有不同部分之SESTD1的GST融合蛋白是依據所給定的組合而被建構。蛋白質被表現並且從細菌被純化以供GST拉下研究。第6圖：Spec 1在SESTD1中作為交互作用位置的鍟定。（A，B)與來自過度表現mTRPC4a (A)或mTRPC4p (B) 之HEK293細胞的被指明的GST融合蛋白或GST沉殿之樣品的抗-TRPC4免疫墨點。（C)一使用過度表現mTRPC5的 HEK293細胞的類似實驗之抗-TRPC5免疫墨點。墨點是以二級AlexaFluor680山羊抗-兔子（1:2,500)抗體予以顯像。第7圖：Specl在SESTD1中作為TRPC4/5-交互作用位置的碟認。被平盤培養在_Trp/-Leu/-His/-Ade上之經共轉形以mTRPC4a-或mTRPC5-C-端以及全長SESTD1或 SESTDl-Sec 14、-Spec卜或Spec 2建構物的酵母菌菌落被顯示。酵母菌生長（明亮的顏色)表示建構物的交互作用。第8圖：多株SESTD1抗體偵測内源性以及過度表現的SESTD1。來自於未經轉染的HM1細胞(N)以及來自於經 71 200934789 5 Ο 10 15 ❹ 20

轉染以ΗΑ-標籤的SESTD1的ΗΜ1細胞(Τ)的溶胞產物在西方墨點上利用抗-ΗΑ以及抗-SESTD1 #147 (Α)或抗 SESTD1 #148 (Β)抗體以及二級 Alexa Fluor 680 山羊抗-兔子（1:2,500)抗體予以探測。兩種抗體偵測到11人-3£8丁01還有内源性SESTD1 (在未經轉染的細胞中）作為具有一表觀質量為大約80 kDa的蛋白質。第9圖：SESTD1與mTRPC4p或mTRPC5的共免疫沉澱。（A)抗-TRPC4免疫沉澱物（p)與來自於經轉染以HA· 標籤之SESTD1與FLAG-標籤之mTRPC4p或pcDNA3.1的 HM1細胞之細胞膜的對應溶胞產物(L)的西方墨點。（B)抗 -GFP免疫沉澱物(P)與來自於經轉染以HA-標籤之SESTD1 與FLAG-標籤之mTRPC5或pcDNA3.1的HM1細胞的對應溶胞產物(L)的西方墨點。兩種墨點(A, B)以抗-SESTD1抗體 #148 (1:5,000)以及 Alexa Fluor 680 山羊抗-兔子（1:2,500) 予以探測。第10圖：siRNA的轉染有效率地降低SESTD1蛋白在 HM1-C5Y細胞中的表現。HM1-CY5細胞被轉染以20 nM 專一性 SESTD1 siRNA (Sp.siRNA)、非專一性對照組 siRNA (Unsp. siRNA)或僅有脂質體(假)並且在轉染之後的48小時被分析。被培育以抗-SESTD1以及抗-GAPDH抗體的西方墨點顯示在經siRNA轉染的細胞中有内源性SESTD1蛋白水準的顯著降低。第11圖：SESTD1 mRNA在人類組織中的表現。 SESTD1 mRNA表現在不同的人類組織中是利用qRT-PCR 72 200934789 5 Ο 10 15 ❹ 20 而被決定並且相對於管家基因RPL37a的表現而被常規化。所顯示的數據是二重複的平均。 1腦；2小腦；3海馬；4皮質；5脊髓；6腎上腺，7心臟；8主動脈；9脂肪細胞；10脾臟；11骨髓；12骨骼肌；13皮膚；14氣管；15肺臟；16胃；17小腸；18結腸；19肝臟；20胰臟；21腎臟；22胸；23卵巢；24子宮；25 胎盤；26 睪丸；27 前列腺：28AoSMC;29HUVEC。星號表示TRPC4或TRPC5的顯著表現已被報導的組織。第12圖：SESTD1表現在人類初級細胞中。以抗 •SESTD1 #148 (1:5,000)以及二級 Alexa Fluor 680 山羊抗-兔子抗體（1:2,500)予以顯像之所指明的細胞樣品的西方墨點。各徑被裝載15 pg蛋白質。相同的裝載量是藉由管家基因GAPDH的平行染色而被確認。第13圖：磷脂質的SESTD1結合是Ca2+-依賴性。 GST-SESTD1以一 Ca2+依賴性的方式專一性地結合至各種磷脂醯肌醇磷酸(PIP s)以及磷脂酸(PA)但沒有其他的磷脂質。PIP條(Echelon)是以配於阻斷緩衝液(含有60 nM或2.5 μΜ游離Ca2+)中的GST-SESTD卜或以配於阻斷缓衝液中的GST接著藉由抗-GST抗體（1:2,〇〇〇)以及HRP-偶合的山羊抗-兔子抗體（1:20,000)予以探測。訊號是藉由被增強的化學發光(ECL)而被偵測。第14圖：SESTD1-鱗脂質結合在使用DELFIA的 Cova-PIP專一性平盤中的偵測。各個被裝載以1〇〇 pm〇1 的piPn的聚苯乙烯微量井被培育以給定濃度的 73 200934789 GST-SESTD1或僅有緩衝液歷時3小時。被結合的蛋白質是使用抗-GST(l:l,000)以及二級Eu-N卜標定的山羊抗-兔子抗體(50 ng/井）而被偵測。鑭系元素螢光(Xexc = 340 nm, λεΐΏ = 620 nm)被測量。 5 【主要元件符號說明】益 Ο 74

Claims

200934789 七、申請專利範圍： L 一種經分離的複合體，含有：、 --第一蛋白質，含有一瞬時受體電位通道(TRPC) 5 或其一功能活性變異體，或由該瞬時受體電位通道或其一功能活性變異體所構成，以及 --第二蛋白質，含有SEC14的第一血影蛋白（Spec 1) 功能部位以及血影蛋白功能部位1 (SESTD 1)或由 Q SEC14的第一血影蛋白（Spec 1)功能部位以及血影蛋白功能部位1所構成。 10 0 一種經分離的複合體，含有： -一第一蛋白質，含有一瞬時受體電位通道(TRPC) 或其一功能活性變異體的一功能部位或由該瞬時受體電位通道或其一功能活性變異體的一功能部位所構成，該功能部位具有序列 15 LXXXXXYQEVXRNLVKRYVAAMIRXXKT (序列辨識編號：1)’其中各個X表示任一種胺基酸殘基，以及 -一第二蛋白質，含有SESTD1的Specl功能部位，或由SESTD1的Spec 1功能部位所構成。 3· —種經分離的複合體，含有： --第一蛋白質，含有一瞬時受體電位通道(TRPC；) 、或其一功能活性變異體，或由該瞬時受體電位通道或其一功能活性變異體所構成，以及 -一第二蛋白質’含有至少一選自於下列的蛋白質或 75 由至少一選自於下列的蛋白質所構成：錨蛋白重複功能部位35 (ANKRD35)、脂蛋白元A_i結合蛋白 (AP0A1BP))、鄰近辞手指工力能部位的漠功能部位 (BAZ1B)、似咼-運動性群蛋白2之1異構型b (HMG2L1)、makorin 環指蛋白 i (MKRN1)、前_B_ 細胞白血病同源盒父互作用蛋白丨（PBXjPi)、肉瘤抗原NY-SAR-48、血影蛋白阿伐非紅血球i (SPTAN1)、染色體3的結構維持（SMC3)#及人踝蛋白 2 (TLN2)。如申請專利範圍第1或3項中任一項的複合體，其中該TRPC是選自於由下列所構成的群組：TRpC4、 TRPC5 ’ 以及 TRPC6 ’ 特別地 TRPC4 或 TRPC5，尤其是 TRPC4(x 或 TRPC4P 或 TRPC5。如申請專利範圍第1至4項中任一項的複合體，其中該第一蛋白質包含有序列LRRHHQYQEVMRNLVK RYVAAMIREAKTE (序列辨識編號：2)或 LIQNQHY qKVIRNLVKRYVAAMIRNSKTN(序列辨識編號：3)。如申請專利範圍第1至5項中任一項的複合體，其中該TRPC是哺乳動物TRPC，特別是鼠類或人類 TRPC ° 如申請專利範圍第1、2、4、5或6項中任一項的複合體’其中第二蛋白質含有SESTD1或由SESTD1所構成。如申請專利範圍第1、2、4、5、6或7項中任一項的 200934789 9. ，複合體，其中該SESTD1是哺乳動物SESTD卜特別是大鼠、鼠類或人類SESTD1。一種試驗系統，含有： -一種如申請專利範圍第1至6項中任一項所定義的 5 第一蛋白質， -一種如申請專利範圍第1、2、3、7以及8項中任一項所定義的第二蛋白質，以及 6 -用於偵測該第一以及第二蛋白質之交互作用的手段。 ίο 10. 一種用於篩選一 TRPC調節劑的方法，含有下列步驟： a) 令如申請專利範圍第9項的試驗系統與一物質接觸以及 b) 根據該物質與該試驗系統的交互作用來偵測一可測量的訊號，藉此鑑定該物質為一 TRPC調節劑。 15 11. 如申請專利範圍第10項的方法，其中該物質在該試驗系統之第一以及第二蛋白質間的交互作用上的影 ❹ 響是直接地被偵測。 12. 如申請專利範圍第10或11項的方法，其中該第一和 /或第二蛋白質含有一可偵測的標記。 20 13. 如申請專利範圍第10至12項中任一項的方法，其中偵測一可測量的訊號涉及使用一針對該第一蛋白質的專一性抗體和/或一針對該第二蛋白質的專一性抗艚。 77 200934789 14. 如申請專利範圍第10至13項中任一項的方法，其中 .該TRPC調節劑增強或較佳地削弱或抑制該第一蛋白質對該第二蛋白質的結合。 15. —種試驗系統，含有： -一種如申請專利範圍第1、2、7以及8項中任一項 - 所定義的蛋白質，以及 ---麟脂質，以及

10 15

-用於偵測該蛋白質以及該磷脂質之交互作用的手段。 16. 如申請專利範圍第15項的系統，其中該磷脂質是選自於下列所構成的群組：溶血磷脂酸、溶血磷脂醯膽鹼、磷脂醯-肌醇-(3)-磷酸、磷脂醯-肌醇-(4)-磷酸、磷脂醯-肌醇-(5)-磷酸、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯膽鹼、神經胺醇1-磷酸、磷脂醯肌醇(3,4)二磷酸、磷脂醯肌醇(3,5)二磷酸、磷脂醯肌醇(4,5)二磷酸、磷脂醯肌醇 (3,4,5)三磷酸、磷脂酸、磷脂醯絲胺酸，或一單磷酸鹽0 17. —種用於篩選一蛋白質與一磷脂質之交互作用的調節劑的方法，含有下列步驟： c) 令如申請專利範圍第15或16項的試驗系統與一物質接觸，以及 d) 根據該物質與該試驗系統的交互作用來偵測一可測量的訊號，藉此鑑定該物質為該蛋白質與該磷脂質間之交互作用的一調節劑。 78 20 200934789 18. 如申請專利範圍第10至17項中任一項的方法，其中該方法被用於篩選有關一用於預防和/或治療一涉及内皮障礙的疾病的醫藥品。 19. 如申請專利範圍第10至17項中任一項的方法，其中 5 該方法可以被用於篩選有關一用於預防和/或治療下列疾病的醫藥品：心血管疾病、心肥大、心臟衰竭、缺血、内皮新生、原發性擴張型心肌病、高血壓、冠狀動脈症候群、心臟衰竭、腎臟衰竭、血栓症、慢性呼吸道疾病、氣喘、慢性阻塞性肺臟疾病、原發性肺 10 .性高血壓、急性缺氧性肺血管收縮、發炎性閉塞病以及動脈粥樣硬化。 20. 一種如申請專利範圍第9項的試驗系統之用途，其係供鑑定一 TRPC調節劑。

79 200934789 四、指定代表圖： (一）本案指定代表圖為：第（1 )圖。 (二）本代表圖之元件符號簡單說明：無

五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：無

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