CN117255945A - 纳米孔传感器装置 - Google Patents

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Abstract

纳米孔传感器装置的示例包括：一个或多个顺式阱；顺式电极；多个反式阱，该多个反式阱中的每个反式阱通过具有纳米孔的脂质/聚合物/固态膜与该一个或多个顺式阱分离；多个反式电极，该多个反式电极中的每个反式电极与该多个反式阱中的一个反式阱相关联；第一浓度的电解质，该第一浓度的该电解质位于该一个或多个顺式阱内；以及第二浓度的该电解质，该第二浓度的该电解质位于该反式阱内，其中该第一浓度高于该第二浓度。

Description

纳米孔传感器装置
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年3月31日提交的美国临时申请序列号63/168,646的权益，该美国临时申请的内容全文以引用方式并入本文。
背景技术
各种多核苷酸测序技术涉及在局部支承表面上或在预定义反应室内进行大量受控反应。然后可观察或检测指定的反应，并且随后的分析可有助于识别或揭示反应中所涉及的多核苷酸的特性。已经开发了另一种利用纳米孔的多核苷酸测序技术，该纳米孔可提供用于离子电流的通道。将结合核苷酸的多核苷酸或标记/小标签驱动进入纳米孔，从而改变纳米孔的电阻率。每个核苷酸(或核苷酸系列)或每个标记/小标签(或标记/标签系列)产生特征电信号，并且信号水平的记录对应于多核苷酸的序列。在现有的纳米孔传感器装置中(在t＝0时)，电流由在顺式阱和反式阱之间沿相反方向易位通过纳米孔的电解质同等地携带。然而，这种纳米孔测序装置具有低寿命。
发明内容
在第一示例中，一种纳米孔传感器装置包括：一个或多个顺式阱；顺式电极；多个反式阱，该多个反式阱中的每个反式阱通过具有纳米孔的脂质/聚合物/固态膜与该一个或多个顺式阱分离；多个反式电极，该多个反式电极中的每个反式电极与该多个反式阱中的一个反式阱相关联；第一浓度的电解质，该第一浓度的该电解质位于该一个或多个顺式阱内；以及第二浓度的该电解质，该第二浓度的该电解质位于该反式阱内，其中该第一浓度高于该第二浓度。
在第二示例中，一种纳米孔传感器套件包括：i)纳米孔传感器装置，该纳米孔传感器装置包括：一个或多个顺式阱，该一个或多个顺式阱包括流体入口；顺式电极；多个反式阱，该多个反式阱中的每个反式阱通过具有纳米孔的脂质/聚合物/固态膜与该一个或多个顺式阱分离；多个反式电极，该多个反式电极中的每个反式电极与该多个反式阱中的一个反式阱相关联；以及第一浓度的电解质，该第一浓度的该电解质位于该一个或多个顺式阱和该多个反式阱内；以及ii)第二浓度的该电解质，该第二浓度的该电解质将在该纳米孔传感器装置的初始循环时通过该流体入口引入到该一个或多个顺式阱中，使得该一个或多个顺式阱包含该第二浓度的该电解质，并且该多个反式阱包含该第一浓度的该电解质，其中该第二浓度高于该第一浓度。
在第三示例中，一种检测离子电流以分析生物化合物的方法包括：在分离顺式阱和反式阱的膜内提供纳米孔，该纳米孔在该纳米孔的内表面上具有多个带正电荷的残基；在该顺式阱和该反式阱内提供电解质；以及在至少部分地暴露于该顺式阱的顺式阴极和至少部分地暴露于该反式阱的反式阳极之间施加电流，以产生通过该纳米孔的离子电流，其中该纳米孔的该多个带正电荷的残基抑制阳离子在施加该电流期间从该反式阱易位至该顺式阱。
在第四示例中，一种纳米孔传感器装置包括：一个或多个顺式阱；顺式电极；多个反式阱，该多个反式阱中的每个反式阱通过具有纳米孔的脂质/聚合物/固态膜与该一个或多个顺式阱分离；多个反式电极，该多个反式电极中的每个反式电极与该多个反式阱中的一个反式阱相关联；电解质溶液，该电解质溶液包括氧化还原非活性缓冲液，该氧化还原非活性缓冲液包括直径大于该纳米孔的收缩区的直径的阴离子和氧化还原物质。
应当理解，本文阐述的任何示例的任何特征可以任何期望的方式组合在一起。例如，第一示例和/或第二示例和/或第三示例和/或第四示例的特征的任何组合可一起使用，和/或可与本文所公开的任何其他示例组合以实现如本公开所述的益处，包括例如控制电解质物质的耗尽。
附图说明
通过参考以下具体实施方式和附图，本公开的示例的特征将变得显而易见，其中类似的附图标号对应于类似但可能不相同的部件。为了简洁起见，具有先前描述的功能的附图标号或特征可结合或可不结合它们出现的其他附图来描述。
图1是本文所公开的纳米孔传感器装置的示例的示意性部分剖视图；
图2A是纳米孔传感器装置的一部分的放大示意图，其中顺式阱包括相比反式阱更高浓度的电解质物质；
图2B是纳米孔传感器装置的示例的离子物质漂移和扩散电流的示意图，其中顺式阱包括相比反式阱更高浓度的电解质物质；
图3是在其内表面上具有多个带正电荷的残基的纳米孔的放大示意图；
图4是纳米孔传感器装置的一部分的放大示意图，其中电解质溶液包括氧化还原对和氧化还原非活性缓冲液离子，其直径大于纳米孔的收缩区的直径；
图5A和图5B是示出了顺式阱和反式阱中包括相同K+Cl-浓度的比较例纳米孔传感器装置的电流的模拟时间相关性(5A；电极电流(pA)对时间(min))和电流分量的模拟物质分解(breakdown)(5B；电流(pA)对时间(min))的图；
图6A和图6B是示出了在顺式阱中包括相比反式阱中更高的K+Cl-浓度的示例性纳米孔传感器装置的电流的模拟时间相关性(6A；电极电流(pA)对时间(min))和电流分量的模拟物质分解(6B；电流(pA)对时间(min))的图；
图7A和图7B是示出了在顺式阱中包括相比反式阱中更高的K+Cl-浓度的另一示例性纳米孔传感器装置的电流的模拟时间相关性(7A；电极电流(pA)对时间(min))和电流分量的模拟物质分解(7B；电流(pA)对时间(min))的图；
图8是实施例4中使用的COSMOL模拟域的图示；
图9A至图9C示出了3D有限元分析结果，示出了模拟域中Cl:K比率的计算空间分布(对数刻度)；
图10是示出了通过纳米孔的Cl:K通量比率与孔通道中的固定电荷密度的大小的计算相关性的图；
图11A至图11C是示出了具有经修饰的纳米孔的纳米孔传感器在各种Cl:K通量比率下的计算相关性的图；
图12A是示出了比较例MspA孔的电流(nA，Y轴)对电压(mV，X轴)的图；
图12B是示出了第一实施例MspA孔的电流(nA，Y轴)对电压(mV，X轴)的图；
图13是示出了第一实施例孔和比较例孔的平均电导率(S/m，Y轴)对使用不同浓度的KCl电解质的顺式-反式电压偏置(mV，X轴)的图；
图14A是示出了比较例MspA孔的电流(pA，Y轴)对时间(s，X轴)的图；并且
图14B是示出了第一实施例MspA孔的电流(pA，Y轴)对时间(s，X轴)的图。
具体实施方式
纳米孔测序技术使用电信号的变化来区分核苷酸碱基。纳米孔传感器装置包括顺式阱、顺式电极、多个反式阱以及与多个反式阱中的每个反式阱相关联的反式电极。每个反式阱通过具有纳米孔的脂质/聚合物/固态膜与顺式阱分离。因此，每个反式阱也与相应纳米孔相关联。在有或没有电解质缓冲液的情况下，通过氧化还原物质建立顺式电极与反式电极之间的法拉第电流。
在某些示例中，电极是活性的(即，电极主动参与氧化还原反应)，并且反应性电解质物质(即，氧化还原阴离子)通过在正极性的反式电极处镀出而被消耗，以支持通过体系的法拉第电流。在某些示例中，电极是被动的(即，电极不主动参与氧化还原反应)，并且反应性电解质物质(即，氧化还原对离子)通过在正极性的反式电极处氧化而被消耗，以支持通过体系的法拉第电流。在这些示例中，氧化还原对悬浮在氧化还原非活性电解质缓冲液中。
反式电极位于具有有限体积的受限隔室中，因此，在这些情况下，反应性电解质物质在反式阱中的补充取决于物质从顺式阱通过纳米孔的传输。在现有的纳米孔传感器装置中，反式阱内的反应性电解质的浓度可能变得部分耗尽，这降低了纳米孔传感器装置的可操作性。
在具有活性电极的Ag/Cl氧化还原体系的一个示例中，氯阴离子可能由于镀出到反式电极上而在反式侧上被部分耗尽，并且可能不会被氯阴离子通过纳米孔的传输完全取代。例如，当两个氯离子通过在反式电极处镀出而被消耗时，一个氯离子通过孔进入反式阱。如果氯离子在反式阱中的浓度低，则在反式阱中存在减少的反应性电解质物质。这降低了携带离子电流的能力，并因此导致纳米孔传感器装置的信号水平和检测降低。
因为反应性电解质物质以在现有纳米孔传感器装置中被镀出的量的一小部分被补充，所以随着时间的推移，在反式阱中发生电化学活性电解质物质的耗尽或部分消耗。反应性电解质物质的部分消耗取决于多种因素，包括通过纳米孔的电流和反式阱的尺寸(例如，较大的阱通常与较少的试剂消耗相关，而较小的室通常与较多的试剂消耗相关)。现有纳米孔传感器装置的反式阱中的反应性电解质物质完全耗尽的时间可由等式1估计：
其中V(cm3)是反式阱体积，C(mol/L)是反式阱中t＝0处的反应性电解质物质浓度，NA是阿伏伽德罗数，q(库仑或C)是反应性电解质物质的基本电荷，并且i(A)是纳米孔电流。
在现有的纳米孔传感器装置中，部分消耗可通过初始试剂浓度的降低来证明，其中该降低大于10倍。在一些情况下，降低范围为20倍至100倍。例如，在10μm的反式阱中具有约300mM的初始氯浓度的电解质溶液的氯浓度可被耗尽至约10mM，并且因此初始浓度降低约30倍。对于另一示例，在10μm的反式阱中具有约10mM的初始氯浓度的电解质溶液的氯浓度可被耗尽至约0.1mM，并且因此初始浓度降低约100倍。应当理解，部分消耗/耗尽可接近100％(即，保留在体系中的部分消耗的电解质物质接近0％)，但将在电解质阴离子与阳离子之间建立平衡，即使在如此低水平的部分消耗的物质下。
在具有被动电极的电解质缓冲液中的亚铁氰化物/铁氰化物氧化还原对的示例中，亚铁氰化物离子(例如，Fe(CN)6 4-)在正极性的反式电极处被氧化成铁氰化物离子(例如，Fe(CN)6 3-)。反应性电解质物质可能由于在反式电极处被消耗而在反式侧上被部分耗尽，并且可能不会被通过纳米孔的反应性电解质物质的传输完全取代。
本文所公开的纳米孔传感器装置和方法的某些实施方案减少了反应性电解质物质在纳米孔传感器装置的反式阱处的耗尽。在这些示例中，在反式阱处的初始反应性电解质物质浓度的降低仍然可能存在；然而，该降低小于10％并且可能小于1％。因此，随着时间的推移存在更多的反应性电解质物质(例如，与上文提供的现有纳米孔传感器装置相比)，并且因此减少了反应性电解质物质的耗尽。在某些示例中，通过抑制氧化还原阳离子、缓冲液阴离子或两者通过纳米孔传感器装置的纳米孔的传输来减少反应性电解质物质的耗尽。在这些特定示例中，使用不平衡的电解质浓度、经修饰的纳米孔和/或在纳米孔中诱导的电荷来实现氧化还原阳离子的传输的减少。在这些特定示例中，使用不平衡的电解质浓度和/或利用大体积的缓冲液阴离子来实现阴离子的传输的减少。减少氧化还原阳离子和/或缓冲液阴离子通过纳米孔的传输导致更大量的离子电荷由反应性电解质物质携带。因此，增加量的反应性电解质物质从顺式阱传输到反式阱中。因此，减少了来自纳米孔传感器装置的反式阱的反应性电解质物质耗尽，并且延长了纳米孔传感器装置的寿命。
如上所述，纳米孔测序技术使用电信号的变化来区分核苷酸碱基。反式阱中的反应性电解质物质的耗尽降低了离子电流并降低由纳米孔传感器装置检测的信号。通过增加从顺式阱到反式阱的反应性电解质物质的补充，可增加纳米孔传感器装置的寿命。
定义
应当理解，除非另外指明，否则本文所用的术语将理解为具有其在相关领域中的普通含义。下面列出本文所用的若干术语及其含义。
除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。
术语包含、包括、容纳和这些术语的各种形式彼此同义，并且意在是同样宽泛的。
术语顶部、底部、下部、上部、上等在本文中用于描述纳米孔传感器装置和/或该纳米孔传感器装置的各种部件。应当理解，这些方向术语并非意在暗示特定取向，而是用于指定部件之间的相对取向。方向术语的使用不应被解释为将本文所公开的示例限制于任何特定取向。
术语第一、第二等也并非意在暗示特定的取向或顺序，而是用于将一个部件与另一个部件区分开来。
应当理解，本文提供的范围包括规定范围和规定范围内的任何值或子范围，如同此类值或子范围被明确列举一样。例如，约50mM至约500mM的范围应当被解释为不仅包括明确列举的约50mM至约500mM的限值，而且还包括单个值(诸如约100mM、约335mM、约400.5mM、约490mM等)和子范围(诸如约75mM至约475mM、约200mM至约300mM等)。此外，当利用“约”和/或“基本上”来描述一个值时，它们意在涵盖相对于规定值的微小变化(最多至+/-10％)。
如本文所用，术语“流体地连接”、“流体地连通”、“流体地耦合”等是指连接在一起使得液体或气体可以在两个空间区之间流动的两个空间区。例如，顺式阱可与反式阱或多个反式阱流体连接，使得电解质溶液的至少一部分可在所连接的阱之间转移。两个空间区可通过纳米孔或通过一个或多个阀门、限流器或其他用于控制或调节通过体系的离子转移的流体部件来流体地连通。
如本文所用，术语“间隙区”是指基板/固体支持物或膜中的区域，或表面上将与支持物或膜或表面相关的其他区域、区、特征分离的区域。例如，膜的间隙区可以将阵列的一个纳米孔与阵列的另一纳米孔分离。对于另一示例，基板的间隙区可以将一个反式阱与另一反式阱分离。彼此分离的两个区域可为离散的，即彼此缺乏物理接触。在许多示例中，间隙区是连续的，而区域是离散的，例如，对于在其他方面连续的膜中限定的多个纳米孔，或对于在其他方面连续的支持物中限定的多个阱，情况就是如此。由间隙区域提供的分离可以是部分分离或完全分离。间隙区域可具有与限定在表面中的特征部的表面材料不同的表面材料。例如，间隙区处的表面材料可以是脂质材料，并且在脂质材料中形成的纳米孔可以具有超过间隙区处存在的量或浓度的多肽的量或浓度。在一些示例中，多肽可能不存在于间隙区处。
如本文所用，术语“膜”是指分离两个液体/凝胶室(例如，顺式阱和反式阱)的非渗透性或半渗透性屏障或其他片材，其可在其中容纳相同的组合物或不同组合物。膜对任何给定物质的渗透性取决于膜的性质。在一些示例中，膜可以是离子、电流和/或流体不可渗透的。例如，脂质膜可以是离子不可渗透的(即，不允许任何离子转运通过)，但可以至少部分地可渗透水(例如，水扩散率在约40μm/s到约100μm/s范围内)。对于另一示例，合成/固态膜(诸如氮化硅)可以是离子、电荷和流体不可渗透的(即，所有这些物质的扩散为零)。根据本公开可使用任何膜，只要该膜能够包括跨膜纳米级开口(例如纳米孔)并且能够保持跨膜的电势差即可。膜可以是单层或多层膜。多层膜包括两个或更多个层，该层中的每一个层是非渗透性或半渗透性材料。
膜可由生物或非生物来源的材料形成。生物来源的材料是指衍生自或分离自生物环境(诸如生物体或细胞)的材料，或生物可用结构的合成制造形式(例如，仿生材料)。
由生物来源的材料制成的示例性膜包括由勃拉脂质(bolalipid)形成的单层。由生物来源的材料制成的另一示例性膜包括脂质双层。合适的脂质双层包括例如细胞的膜、细胞器的膜、脂质体、平面脂质双层和支持的脂质双层。脂质双层可例如由两个相对的磷脂层形成，该两个磷脂层被布置成使得它们的疏水性尾部基团彼此面对以形成疏水性内部，而脂质的亲水性头部基团向外朝向双层每一侧上的水性环境。脂质双层还可例如通过其中脂质单层被携带在水溶液/空气界面上经过垂直于该界面的孔隙的任一侧的方法形成。通常通过首先将脂质溶解在有机溶剂中，然后使一滴溶剂在孔隙的任一侧上的水溶液表面上蒸发来将脂质添加到水性电解质溶液的表面。一旦有机溶剂至少部分地蒸发，孔隙的任一侧上的溶液/空气界面就物理地上下移动通过孔，直到形成双层。双层形成的其他合适方法包括尖端浸渍、涂覆双层和脂质体双层的膜片钳。还可使用用于获得或产生脂质双层的任何其他方法。
非生物来源的材料也可用作膜。这些材料中的一些材料是固态材料并且可形成固态膜，并且这些材料中的其他材料可形成薄的液体薄膜或膜。固态膜可以是单层，诸如支持基板(即固体支持物)上的涂层或薄膜，或可以是独立式元件。固态膜还可以是夹层构型的多层材料的复合材料。可使用任何非生物来源的材料，只要所得膜能够包括跨膜纳米级开口并且能够保持跨膜的电势差即可。膜可包括有机材料、无机材料或两者。合适的固态材料的示例包括例如微电子材料、绝缘材料(例如，氮化硅(Si3N4)、氧化铝(Al2O3)，氧化铪(HfO2)、五氧化二钽(Ta2O5)，氧化硅(SiO2)等)、一些有机和无机聚合物(例如，聚酰胺、塑料，诸如聚四氟乙烯(PTFE)，或弹性体，诸如双组分加成固化硅橡胶)，以及玻璃。此外，固态膜可由单层石墨烯(其是致密地堆积成二维蜂窝晶格的原子级薄片的碳原子)、多层石墨烯或与一层或多层其他固态材料混合的一层或多层石墨烯制成。含石墨烯的固态膜可包括至少一个石墨烯层，该石墨烯层是石墨烯纳米带或石墨烯纳米间隙，其可用作电传感器以表征目标多核苷酸。固态膜可通过任何合适的方法制备。例如，石墨烯膜可通过化学气相沉积(CVD)或从石墨剥离来制造。可使用的合适的薄液体薄膜材料的示例包括二嵌段共聚物、三嵌段共聚物，诸如两亲性PMOXA-PDMS-PMOXA ABA三嵌段共聚物。
如本文所用，术语“纳米孔”旨在表示与膜离散并延伸穿过膜的中空结构，其允许离子、电流和/或流体从膜的一侧穿过到膜的另一侧。例如，抑制离子或水溶性分子通过的膜可包括纳米孔结构，该纳米孔结构延伸穿过膜以允许离子或水溶性分子从膜的一侧通过(通过延伸穿过纳米孔结构的纳米级开口/通道)到膜的另一侧。纳米级开口/通道的直径可沿其长度(即，从膜的一侧到膜的另一侧)变化，但在任何点处都在纳米级上(即，约1nm到约100nm，或到小于1000nm)。纳米孔的示例包括例如生物纳米孔、固态纳米孔，以及生物和固态杂化纳米孔。
如本文所用，术语“直径”旨在表示通过纳米级开口的横截面的质心在纳米级开口的横截面中可刻写的最长直线。应当理解，纳米级开口可以具有或可以不具有圆形或基本上圆形的横截面(纳米级开口的横截面基本上与顺式/反式电极平行)。此外，横截面可以是规则或不规则形状的。
如本文所用，术语“生物纳米孔”旨在表示其结构部分由生物来源的材料制成的纳米孔。生物来源是指衍生自或分离自生物环境(诸如生物体或细胞)的材料，或生物可用结构的合成制造形式。生物纳米孔包括例如多肽纳米孔和多核苷酸纳米孔。
如本文所用，术语“多肽纳米孔”旨在表示延伸穿过膜并允许离子和/或流体从膜的一侧流到膜的另一侧的蛋白质/多肽。多肽纳米孔可以是单体、均聚物或杂聚物。多肽纳米孔的结构包括例如α-螺旋束纳米孔和β-桶纳米孔。示例性多肽纳米孔包括α-溶血素、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋白A(MspA)、短杆菌肽A、麦芽糖孔蛋白、OmpF、OmpC、PhoE、Tsx、F-菌毛等。蛋白质α-溶血素天然存在于细胞膜中，在细胞膜中它充当离子或分子传输进出细胞的通道。耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)是由分枝杆菌产生的膜孔蛋白，其允许亲水性分子进入细菌。MspA形成紧密互连的八聚体和跨膜β-桶，其类似于高脚杯并容纳中心通道/孔。
多肽纳米孔可以是合成的。合成多肽纳米孔包括在自然界中不存在的蛋白质样氨基酸序列。蛋白质样氨基酸序列可包括已知存在但不形成蛋白质基础的氨基酸中的一些氨基酸(即，非蛋白原氨基酸)。蛋白质样氨基酸序列可以人工合成而不是在生物体中表达，然后纯化/分离。
如本文所用，术语“多核苷酸纳米孔”旨在包括延伸穿过膜并允许离子和/或流体从膜的一侧流到膜的另一侧的多核苷酸。多核苷酸孔可以包括例如多核苷酸折纸(例如，DNA的纳米级折叠以产生纳米孔)。
还如本文所用，术语“固态纳米孔”旨在表示其结构部分包括非生物来源(即，不是生物来源)的材料的纳米孔。固态纳米孔可以由无机或有机材料形成。固态纳米孔包括例如氮化硅纳米孔、二氧化硅(SiO2)纳米孔和石墨烯纳米孔。
本文公开的纳米孔可以是杂化纳米孔。“杂化纳米孔”是指包含生物来源和非生物来源两者的材料的纳米孔。杂化纳米孔的示例包括多肽-固态杂化纳米孔和多核苷酸-固态纳米孔。
如本文所用，术语“纳米孔传感器装置”或“纳米孔测序仪”是指本文公开的可用于纳米孔测序的任何装置。在本文公开的示例中，在纳米孔测序期间，将纳米孔浸入本文公开的电解质的示例中，并且跨膜施加电势差。在示例中，电势差是电气电势差或电化学电势差。可以通过电压源在膜上施加电势差，该电压源向顺式阱或一个或多个反式阱中包含的电解质的至少一种离子注入或施用电流。电化学电势差可通过顺式和反式阱的离子组成的差异与电势的组合来建立。不同的离子组成可以是例如每个阱中的不同离子或每个阱中相同离子的不同浓度。
跨纳米孔施加位差可迫使核酸通过纳米孔易位。产生对应于核苷酸易位通过纳米孔的一个或多个信号。因此，当靶多核苷酸或单核苷酸或衍生自靶多核苷酸或单核苷酸的探针通过纳米孔时，跨膜的电流由于例如收缩部的碱基依赖性(或探针依赖性)阻塞而改变。可使用各种方法中的任一种方法来测量来自该电流变化的信号。每个信号对于纳米孔中的核苷酸(或探针)的种类是独特的，使得所得信号可用于确定多核苷酸的特征。例如，可以确定产生特征信号的一种或多种核苷酸(或探针)种类的身份。
如本文所用，“核苷酸”包括含氮杂环碱基、糖以及一个或多个磷酸基团。核苷酸是核酸序列的单体单元。核苷酸的示例包括例如核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。在核糖核苷酸(RNA)中，糖是核糖，并且在脱氧核糖核苷酸(DNA)中，糖是脱氧核糖，即在核糖中缺少存在于2'位置处的羟基基团的糖。含氮杂环碱基可以是嘌呤碱基或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及它们的经修饰的衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)以及它们的经修饰的衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9键合。磷酸基团可以是单磷酸、二磷酸或三磷酸形式。这些核苷酸是天然核苷酸，但是应当进一步理解，也可以使用非天然核苷酸、经修饰的核苷酸或前述核苷酸的类似物。
如本文所用，术语“信号”旨在意味着表示信息的指示符。信号包括例如电信号和光学信号。术语“电信号”是指表示信息的电质量的指示符。指示器可以是例如电流、电压、遂穿、电阻、电势、电导、电容、频率或电波形中的其他变化。
术语“基板”是指刚性的固体支持物，其不溶于水性液体，并且在没有孔隙、端口或其他类似液体导管的情况下不能使液体通过。在本文公开的示例中，基板可以具有限定在其中的阱或室。合适的基板的示例包括玻璃和改性或官能化玻璃、塑料(包括丙烯酸类、聚苯乙烯和苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(PTFE)(诸如来自Chemours的)、环烯烃/环烯烃聚合物(COP)(诸如来自Zeon的/>)、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷、二氧化硅或二氧化硅基材料、硅和改性硅、碳、金属、无机玻璃和光纤束。
“刺激源”是指提供使离子电流流动穿过纳米孔的刺激的电子装置。在一个示例中，刺激源可以是耦接到顺式和/或反式电极的电流源或电压源。在另一个示例中，刺激源可以是在顺式阱和反式阱之间产生电场的任何源。
如本文所用，术语“阱”、“腔”和“室”同义地使用，并且是指在装置中限定的可容纳流体(例如，液体、凝胶、气体)的离散特征。“顺式阱”是包含顺式电极或部分地由该顺式电极限定的常见室，并且还通过相应纳米孔与多个反式阱中的每个反式阱流体连接。本发明装置的阵列的示例可以具有一个顺式阱或多个顺式阱。每个反式阱是包括其自身的反式电极或部分地由该反式电极限定的单个室，并且还与一个顺式阱流体连接。每个反式阱与每个另一反式阱电隔离。在一些示例中，每个反式阱与相应刺激源连接，并且与相应放大器(例如，Axopatch 200B放大器)连接，以放大穿过与每个反式阱相关联的相应纳米孔的电信号。在其他示例中，反式阱与单个刺激源连接，该刺激源经由多路复用来单独对反式阱进行寻址。此外，应当理解，平行于基板的至少部分地限定阱的表面截取的阱的横截面可以是弯曲的、正方形的、多边形的、双曲线的、圆锥形的、角形的等。
鉴于上述定义，可理解本文所阐述的和在权利要求中列举的方面和示例。
纳米孔传感器装置
现在参考图1，示出了纳米孔传感器装置10的示例。纳米孔传感器装置10包括：一个或多个顺式阱12；顺式电极14；多个反式阱16，多个反式阱16中的每个反式阱通过具有纳米孔20的脂质/聚合物/固态膜18与一个或多个顺式阱12分离；多个反式电极22，多个反式电极22中的每个反式电极与多个反式阱16中的一个反式阱相关联。示例性纳米孔传感器装置10还包括顺式阱12和反式阱16中的电解质溶液24。装置10的不同示例包括电解质溶液24的不同示例，这将参考图2A至图4进行描述。
如图1所示，纳米孔传感器装置10包括基板26。基板26可包括限定在其中的多个反式阱16。反式阱16中的每个反式阱可通过相应纳米孔20与公共顺式阱12流体连接。虽然在图1中示出了一个公共顺式阱12，但应当理解，纳米孔传感器装置10可包括若干个顺式阱12，这些顺式阱彼此流体隔离并且与限定在基板26中的相应组反式阱16流体连接。可能需要多个顺式阱12，例如，以便能够测量单个基板26上的多个样品。
穿过纳米孔20的流体连通由图1中的箭头表示。另外，如图1所示，膜18可定位在顺式阱12和反式阱16之间的基板26上，并且纳米孔20可定位在膜18中并延伸穿过该膜，以在顺式阱12和反式阱16之间建立流体连接。
顺式阱12是由与基板26连接的侧壁28限定在基板26的一部分上的流体室。在一些示例中，侧壁28和基板26可一体成形，使得它们28、26由连续的材料片(例如，玻璃或塑料)形成。在其他示例中，侧壁28和基板26可以是彼此耦接的单独部件。在示例中，侧壁28是光可图案化聚合物。
在图1所示的示例中，顺式阱12具有由侧壁28限定的内壁30、由顺式电极14限定的上表面32和由膜18限定的下表面34。因此，顺式阱12形成在由顺式电极14、基板26的部分和膜18限定的空间内。应当理解，下表面34具有穿过定位在膜18中的纳米孔20的开口。顺式阱12可具有任何合适的尺寸。在示例中，顺式阱12可在约1mm×1mm至约5mm×5mm的范围内。
顺式电极14(其内部表面是顺式阱12的上表面32)可与侧壁28物理连接。顺式电极可14例如通过粘合剂或另一合适的紧固机构与侧壁28物理连接。顺式电极14与侧壁28之间的界面可密封顺式阱12的上部部分。
所使用的顺式电极14至少部分地取决于电解质溶液24(或者本文所述的24A、24B、24C)中的电解质物质。在一些示例中，顺式电极14可以是参与具有电化学活性电解质物质的化学反应的活性电极，并且可在半电池反应中被氧化或还原。活性电极的示例包括银(Ag)、铜(Cu)、锌(Zn)、铅(Pb)等。在其他示例中，顺式电极14可以是转移电子而不是与电解质溶液24交换离子的非活性(或惰性)电极。非活性电极的示例包括铂(Pt)、碳(C)(例如，石墨、金刚石等)、金(Au)、铑(Rh)等。在利用具有电活性阴离子(例如，氯化物、Cl-)的电解质溶液24的纳米孔传感器10的示例中，顺式电极14可以是银/氯化银(Ag/AgCl)电极。
顺式阱12能够保持电解质溶液24与纳米孔20接触。在示例中，顺式阱12与纳米孔20阵列接触，并且因此能够保持经修饰的电极24与阵列中的纳米孔20中的每个纳米孔接触。
如图1所示，纳米孔传感器装置10包括多个反式阱16。每个反式阱16是限定在基板26的一部分中的流体室。一般来讲，反式阱16可延伸穿过基板26的厚度并且可在基板26的相对端(例如，顶端36和底端38)处具有开口。在图1所示的示例中，每个反式阱16具有由基板26和/或基板26的间隙区42限定的侧壁40、由反式电极22限定的下表面44和由膜18限定的上表面46。因此，每个反式阱16形成在由反式电极22、基板26的另一部分和/或间隙区42以及膜18限定的空间内。应当理解，上表面46具有穿过定位在膜18中的纳米孔20的开口。
反式电极22(其内部表面是反式阱16的下表面44)可与基板26(例如，与间隙区42或者基板26的内壁)物理连接。反式电极22可在形成基板26的过程中(例如，在形成反式阱16期间)制造。可用于形成基板26和反式电极22的微制造技术包括光刻法、金属沉积和剥离、干燥和/或旋涂膜沉积、蚀刻等。反式电极22和基板26之间的界面可密封反式阱16的下部部分。
所使用的反式电极22至少部分地取决于电解质溶液24(或者本文所述的24A、24B、24C)中的电解质物质。反式电极22可以是参与具有电化学活性电解质物质的化学反应的活性电极，并且可在半电池反应中被氧化或还原。本文针对顺式电极14阐述的活性电极的任何示例都可用作反式电极22。在其他示例中，反式电极22可以是转移电子而不是与电解质溶液24交换离子的非活性(或惰性)电极。本文针对顺式电极14阐述的任何示例都可用作反式电极22。在利用具有电活性阴离子(例如，氯化物、Cl-)的电解质溶液24的纳米孔传感器10的示例中，反式电极22可以是银/氯化银(Ag/AgCl)电极。
可设想反式阱16的许多不同的布局，包括规则的、重复的和不规则的图案。在示例中，反式阱16设置在六边形网格中，以实现紧密的堆积和改进的密度。其他布局可包括例如直线(即，矩形)布局、三角形布局等。作为示例，布局或图案可为呈行和列形式的反式阱16的x-y格式。在一些其他示例中，布局或图案可为反式阱16和/或间隙区42的重复布置。在另外的其他示例中，布局或图案可为反式阱16和/或间隙区42的随机布置。图案可包括点、柱、条、漩涡、线、三角形、矩形、圆形、弧形、格纹、格子、对角线、箭头、正方形和/或交叉影线。
布局可相对于反式阱16的密度(即，基板26的限定区域中的反式阱16的数目)来表征。例如，反式阱16可以在约10个阱每mm2至约1,000,000个阱每mm2范围内的密度存在。密度可被调整到不同的密度包括例如至少约10个每mm2、约5,000个每mm2、约10,000个每mm2、约10万个每mm2或更大的密度。另选地或除此之外，密度可被调整为不超过约1,000,000个阱每mm2、约10万个阱每mm2、约10,000个阱每mm2、约5,000个阱每mm2或更少。还应当理解的是，支持物26中的反式阱16的密度可介于选自上述范围的下限值中的一个值和上限值中的一个值之间。
布局也可或另选地根据平均节距，即从纳米孔20的中心至相邻纳米孔20的中心的间距(中心至中心间距)来表征。图案可以是规则的，使得围绕平均节距的变化系数较小，或者图案可以是不规则的，在这种情况下变化系数可以相对较大。在示例中，平均节距可在约100nm至约500μm范围内。平均节距可以为例如至少约100nm、约5μm、约10μm、约100μm或更大。另选地或除此之外，平均节距可以为例如至多约500μm、约100μm、约50μm、约10μm、约5μm或更小。纳米孔20的包括特定图案的示例性阵列的平均节距可介于选自上述范围的下限值中的一个值和上限值中的一个值之间。在示例中，阵列具有约10μm的平均节距(中心到中心间距)。
反式阱16可以是微阱(在微米级上具有至少一个尺寸，例如，约1μm至1000μm，但不包括1000μm)或纳米阱(在纳米级上具有至少一个尺寸，例如，约10nm至1000nm，但不包括1000nm)。每个反式阱16可由其纵横比(例如，宽度或直径分别除以深度或高度)来表征。
在示例中，每个反式阱16的纵横比可在约1:1至约1:5的范围内。在另一示例中，每个反式阱16的纵横比可在约1:10至约1:50的范围内。在示例中，反式阱16的纵横比为约3.3。
可选择深度/高度和宽度/直径以便获得期望的纵横比。每个反式阱16的深度/高度可以为至少约0.1μm、约1μm、约10μm、约100μm或更大。另选地或除此之外，深度可以为至多约1,000μm、约100μm、约10μm、约1μm、约0.1μm或更小。每个反式阱16的宽度/直径可以为至少约50nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约10μm、约100μm或更大。另选地或除此之外，宽度/直径可以为至多约1,000μm、约100μm、约10μm、约1μm、约0.5μm、约0.1μm、约50nm或更小。
每个反式阱16具有开口(例如，面向顺式阱12的开口)，该开口足够大以容纳膜18的至少一部分和与其相关联的纳米孔20。例如，纳米孔20的端部可延伸穿过膜18并进入到反式阱16的开口中。
可使用各种技术制造顺式阱12和反式阱16，包括例如光刻法、纳米压印光刻法、冲压技术、压印技术、模制技术、微蚀刻技术等。如本领域技术人员所理解的，所使用的技术将取决于基板26和侧壁30的组合物和形状。在示例中，顺式阱12可由基板26的端部26处的侧壁30限定，并且反式阱16可通过基板26限定。
膜18可以是本文所述的非渗透性或半渗透性材料中的任一者。膜18定位在顺式阱12和反式阱16之间，并且因此在阱12、16之间提供屏障。膜可定位在基板26的间隙区42上。
纳米孔20可以是本文所述的生物纳米孔、固态纳米孔和杂化纳米孔中的任一者。在一个示例中，纳米孔20是如参考图3所述的经修饰的纳米孔20'。如本文所述，每个纳米孔20将反式阱16中的相应一个反式阱与顺式阱12流体连接。因此，纳米孔20与反式阱16的比率为1:1。
纳米孔20具有两个开口端和连接这两个开口端的中空芯或孔。中空芯或孔的壁是纳米孔20的内表面48。当插入膜18中时，纳米孔20的开口端中的一个开口端面向顺式阱12，并且纳米孔20的开口端中的另一个开口端面向反式阱16并且与反式阱16的开口的至少一部分对准。纳米孔20的中空芯能够实现阱12、16之间的流体连接。中空芯的直径可在约1nm至1μm的范围内，并且可沿着纳米孔20的长度变化。在一些示例中，面向顺式阱12的开口端可大于面向反式阱16的开口端。在其他示例中，面向顺式阱12的开口端可小于面向反式阱16的开口端。
纳米孔20可插入膜18中，或者膜18可围绕纳米孔20形成。在示例中，纳米孔18可将其自身插入到形成的脂质双层(膜18的一个示例)中。例如，呈单体形式或聚合形式(例如，八聚体)的纳米孔20可将自身插入到脂质双层中并且组装成跨膜孔。在另一示例中，可将纳米孔20以期望的浓度添加到脂质双层的接地侧，其中该纳米孔将自身插入到脂质双层中。在又一示例中，脂质双层可跨聚四氟乙烯(PTFE)薄膜中的孔隙形成并且定位在顺式阱与反式阱之间。可将纳米孔20添加到接地的顺式隔室中，并且可将自身插入到形成PTFE孔的区域处的脂质双层中。在又一示例中，可将纳米孔20栓系到固体支持物(例如，硅、氧化硅、石英、氧化铟锡、金、聚合物等)。栓系分子(其可以是纳米孔20自身的一部分或可附接到纳米孔20)可将纳米孔20附接到固体支持物。经由栓系分子的附接可使得单个孔20被固定(例如，在两个室/阱之间)。然后可围绕纳米孔20形成脂质双层。
纳米孔传感器装置10包括顺式阱12和反式阱16中的电解质溶液24。本文所公开的装置10的不同示例包括电解质溶液24的不同示例，这在本文中参考图2A至图4进行更详细地描述。
纳米孔传感器装置10还包括单独地和/或共同地对反式电极22中的每个反式电极进行寻址的电子器件。如本文所述，反式阱电极22中的每个反式阱电极与相应反式阱16和相应纳米孔20相关联。在图1中以电路图的形式示意性地示出了一些电子器件。这些电子器件至少包括刺激源52和控制器50。刺激源52单独地(如图1所示)或经由多路复用耦接到多个反式电极22中的每个反式电极，并且刺激源52将通过对与相应纳米孔20相关联的反式电极22进行寻址而使电流流动穿过纳米孔20中的一个或多个纳米孔。控制器50耦接到刺激源52，并且控制器50被配置为(使用刺激源)单独地/选择性地对多个反式电极22中的一个反式电极进行寻址以使离子电流流动穿过与经寻址的反式电极22连接的纳米孔20。在一个示例中，反式电极22中的每个反式电极与其自己的一组电子器件电连接，这些电子器件包括刺激源52和控制器50。在另一示例中，反式电极22中的每个反式电极与单个刺激源52和控制器50电连接，该单个刺激源和控制器与多路复用器(未示出)连接。如图1所示，电子器件还可包括放大穿过与经寻址的反式电极22相关联的相应纳米孔20的电信号的放大器54。
电解质浓度
现在参见图2A，纳米孔传感器装置10的一个示例包括顺式阱12中的电解质溶液24A和反式阱16中的每个反式阱中的电解质溶液24B，其中电解质溶液24A、24B在其中具有不同浓度的反应性电解质物质(由C+、A-表示)。例如，C+可表示氧化还原阳离子或氧化还原还原剂离子，并且A-可表示氧化还原阴离子或氧化还原氧化剂离子。更具体地，顺式阱12内的电解质溶液24A中的电解质C+、A-的浓度高于反式阱16内的电解质溶液24B中的电解质C+、A-的浓度。在这些示例中，电极14、22可以是有源电极或无源电极。
虽然电解质溶液24A、24B中的反应性电解质物质C+、A-的类型相同，但电解质溶液24A、24B中的反应性电解质物质C+、A-的浓度不同。更具体地，待引入或包含在顺式阱12中的电解质溶液24A中的反应性电解质物质C+、A-的浓度高于待引入或包含在反式阱16中的电解质溶液24B中的反应性电解质物质C+、A-的浓度。在某些示例中，电解质溶液24A(对于顺式阱12)中的电解质C+、A-浓度与电解质溶液24B(对于反式阱16)中的电解质C+、A-浓度的比率在约10:1至约3:1的范围内。在一个示例中，电解质溶液24A(对于顺式阱12)中的电解质C+、A-浓度与电解质溶液24B(对于反式阱16)中的电解质C+、A-浓度的比率在约8:1至约5:1的范围内。在某些示例中，电解质溶液24A中的反应性电解质物质C+、A-浓度可在从约300mM至约1000mM的范围内，并且电解质溶液24B中的电解质C+、A-浓度可以是约100mM。
电解质溶液24A、24B中的每个电解质溶液还包括极性溶剂。在一个示例中，极性溶剂是水。将不同浓度的电解质C+、A-溶解到极性溶剂中以形成相应电解质溶液24A、24B。
在某些示例中，纳米孔传感器装置10可存储有电解质溶液24B，该电解质溶液在顺式阱12和反式阱16中具有相同浓度的电解质C+、A-。当期望例如在感测操作中利用纳米孔传感器装置10时，可将附加量的反应性电解质物质引入或交换到电解质溶液24A中，以在顺式阱12中形成更高浓度的反应性电解质物质C+、A-(例如，经由流体入口56)。
因此，本文所公开的一个示例是纳米孔传感器套件，其包括将通过流体入口56引入到一个或多个顺式阱12中的附加量的反应性电解质物质C+、A-，使得在纳米孔传感器装置10的初始循环时，一个或多个顺式阱12包含较高浓度的电解质C+、A-，并且多个反式阱16包含较低浓度的电解质C+、A-。
当相应电解质溶液24A、24B被包含在顺式阱12和反式阱16内时，核苷酸样品可例如经由流体入口/出口端口56和58添加到顺式阱12中。然后可使用控制器50来激活刺激源52，以单独地/选择性地对多个反式电极22中的一个反式电极进行寻址。刺激源52(例如，电流源、电压源)使离子电流流动穿过与经寻址的反式电极22连接的纳米孔20。由于顺式阱12中的高反应性电解质物质C+、A-浓度，离子电流包括反应性电解质物质C+，A-中通过纳米孔20易位至经寻址的反式阱16的一定量的A-(例如，氧化还原阴离子、氧化还原氧化剂离子)，该A-的该量高于反应性电解质物质C+、A-中从经寻址的反式阱16易位通过纳米孔20的C+(例如，氧化还原阳离子、氧化还原还原剂离子)的量。
在一个示例中，刺激源52在顺式阱12和多个反式阱16中的至少一个反式阱之间并且因此穿过膜18施加电压偏置(使用电极14、22)。所施加的电压偏置可以是反式电极22的正极性以将顺式阱12中的负电荷化合物(诸如带负电荷的核苷酸、带负电荷的标记/标签)吸引向纳米孔20，和/或反式电极22的负极性以将顺式阱12中的带负电荷的化合物(诸如带负电荷的核苷酸、带负电荷的标记/标签)排斥远离纳米孔20。在示例中，在顺式阱12和多个反式阱16中的经寻址的一个反式阱之间的电压偏置在约-1V至约1V的范围内。当电解质溶液24A、24B存在于相应阱12、16中时，可施加给定范围内的任何电压偏置。在某些示例中，纳米孔传感器装置10以双极模式(例如，交变电流)操作，从而向反式电极22提供负偏置和正偏置。在某些示例中，纳米孔传感器装置10以单极模式(例如，直流电流)操作，从而向反式电极22提供负偏置。
顺式-反式电压偏置使离子电流流动穿过与经寻址的反式电极22相关联的纳米孔20。在一个示例中，穿过纳米孔20的电流迫使相应核苷酸和/或标签/标记与携带电荷的反应性电解质物质A-一起易位到纳米孔20中。当核苷酸和/或标记穿过纳米孔20时，例如由于纳米孔收缩部60的阻塞(参见图3)、纳米孔20的电阻变化和纳米孔20的电容变化，穿过屏障的电流发生变化。可使用放大器54或另一已知信号检测装置来测量来自该变化的信号。取决于偏置，携带电荷的反应性电解质物质A-可从顺式阱14传输到反式阱16。
在该示例中，通常施加电压极性，使得带负电荷的核酸和/或标签/标记被电泳驱动进入到纳米孔20中。在一些情况下，可降低电压或反转极性，以促进适当功能。
当反应性电解质物质C+、A-浓度在顺式阱12中相比在反式阱16中高时，反应性电解质物质C+漂移和扩散电流在相反方向上。这种情况的示意图如图2B所示。在启动感测时在顺式侧12上具有较高的反应性电解质物质C+浓度的情况下，在t＝0处的初始反应性电解质物质C+电流被减小并且甚至被消除。以此方式，从t＝0开始，反应性电解质物质A-被迫携带大部分离子电流，从而缓解电流的初始下降，并且总电流将在整个感测运行中保持更稳定。纳米孔传感器装置10的使用寿命可被延长，部分是因为更大比例的电流被迫通过纳米孔20而被另外的限制性反应性电解质物质A-所携带。另外，顺式侧12上增加的反应性电解质物质A-浓度用于增加反应性电解质物质A-扩散电流，从而保持更高的总电流。
经修饰的纳米孔
纳米孔传感器装置10的另一示例包括在纳米孔20中的每个纳米孔的位置中的经修饰的纳米孔。经修饰的纳米孔20'的示例示于图3中。
经修饰的纳米孔20'是蛋白质或固态纳米孔，其内表面48已被修饰以引入至少一个固定正电荷(称为带正电荷的残基)来代替负电荷或中性电荷。在蛋白质纳米孔中，正电荷可以带正电荷的氨基酸残基的形式引入，诸如精氨酸和赖氨酸。可将带负电荷的氨基酸残基和/或中性氨基酸残基突变为带正电荷的氨基酸残基。还可通过将所选的氨基酸残基突变为半胱氨酸，然后使用半胱氨酸反应性接头(诸如马来酰亚胺)用正电荷官能化半胱氨酸残基来引入正电荷。在固态纳米孔中，正电荷(或带正电荷的残基)可以带正电荷的有机物质和/或带正电荷的无机物质(例如，HfO2涂层)的形式引入。在其他示例中，带正电荷的物质可经由氨基硅烷或其他偶联剂接枝到固态纳米孔的表面。
将带正电荷的残基引入内表面48可排除或减少反应性电解质物质C+通过经修饰的纳米孔20'的传输。
在一个示例中，经修饰的纳米孔20'是经修饰的蛋白质，其中带负电荷的残基、带中性电荷的残基、或者带负电荷的残基和带中性电荷的残基两者突变为带正电荷的残基。许多蛋白质纳米孔表现出至少7倍对称性，这意味着它们由七个或更多个相同的多肽链组成，这些多肽链组装成具有由单独链的数目确定的对称性的环。该对称性可允许单一类型氨基酸残基的每个亚基的同时突变以完全改变内表面48的电荷。然而，在一些情况下，可能期望突变少于单一类型氨基酸残基的每个亚基，从而将更少的电荷引入经修饰的纳米孔20'。在这些情况下，可能期望使特定残基的一些亚基(但不是全部7、8个等)发生突变，或通过使蛋白质纳米孔的单链发生适当突变(例如，点突变)。
作为一个示例，蛋白质纳米孔是MspA，其是八聚体的，即具有8倍对称性。带正电荷的残基可携带1或2的电荷，这使得每个突变的残基类型能够在内表面48处引入8个正电荷至16个正电荷(假设全部8个残基都发生突变)。MspA蛋白质具有超窄(例如，约1nm)和超短(约2nm)通道，因此添加约2.8个正电荷对于基本上减少或消除反应性电解质物质C+传输可能是期望的(参见实施例4)。
在一个示例中，可将MspA纳米孔的带负电荷的天冬氨酸残基D139和D118突变为带正电荷的精氨酸或赖氨酸。该定位可有助于将核苷酸样品吸引到经修饰的纳米孔20'并且还排斥存在于顺式阱12中的反应性电解质物质C+。
在另一个示例中，可将MspA纳米孔的带负电荷的天冬氨酸残基D90、D91和/或D93突变为带正电荷的精氨酸或赖氨酸。这些残基存在于MspA纳米孔的狭窄收缩区60。因此，在一些示例中，内表面48上的多个带正电荷的残基位于经修饰的纳米孔20'的收缩区60处。作为示例，可将带负电荷的天冬氨酸残基D90、D91和/或D93分别突变为D90R、D91R和/或D93R，这将为每个亚基引入1或2个正电荷。在其他示例中，可将带负电荷的天冬氨酸残基D90、D91和/或D93分别突变为D90K、D91K和/或D93K，或者D90H、D91H和/或D93H。还可产生D90、D91和/或D93突变的任何组合。残基D90和D91是最暴露于溶剂的，因此当突变为包括带正电荷的残基时，可能是阳离子排斥的最大决定因素。
表1列出了蛋白质纳米孔的另外示例和提出的内表面修饰，当用作纳米孔传感器装置10中的经修饰的纳米孔20'时，这些内表面修饰可实现反应性电解质物质C+排斥。如果所提出的带正电荷的突变是在被替换的带负电荷或中性电荷的残基的每个亚基上进行的，则所提出的净电荷等于引入的电荷。因此，可能期望使特定残基的一些亚基(但不是全部7、8或9个)发生突变，或使蛋白质纳米孔的单链或双链发生突变(例如，点突变)。
表1
#表示由CsgF结合CsgG孔所赋予的第二收缩区
*表示仅计算整个收缩区面积的一小部分
CsgG蛋白质纳米孔共享由残基N55和F56限定的狭窄收缩区60，尽管这种收缩发生在较大孔的中间，其中表面由残基46-61的环限定。该孔的测量尺寸为直径1.3nm并且高度0.3nm。0.4的净电荷可能足以实现该微小通道(1.2nm2)中的阳离子排斥。如果将CsgF肽添加到CsgG纳米孔中，则在第一收缩区下方大约3nm处形成第二收缩区(从顺式变为反式)。该收缩区由残基N17限定。在该示例中，可使用本文公开的阳性氨基酸突变在一个或两个收缩区处赋予离子选择性。
由于跨膜部分的α-螺旋性质，fragacea毒素C纳米孔在ssDNA穿线纳米孔中是独特的，该跨膜部分还限定狭窄收缩区60，其中残基D10赋予负电荷。阳离子排斥可通过使八个D10带负电荷的残基中的一者或多者发生突变来实现。
气单胞菌溶素和α-溶血素(aHL)各自具有长且窄的桶收缩区60，通过对称性，由两个β-链限定。该桶的内表面电荷可被调节，以在整个过程中的任何点处赋予净正电荷。即使具有9.3nm桶高的气单胞菌溶素孔，也可用两个适度的突变(D216N和E254Q)实现>+11的总净电荷，这两个适度的突变中和了桶内部表面上的两个带负电荷的侧链，并且有效地用由R282和K242制成的两个正环覆盖桶。α-溶血素桶较小，高度约5.5nm，但可类似地通过中和突变E111Q和D127N而调节为在入口和出口处具有带正电荷的环。在该示例中，正环可由残基K147和K131限定。
在另一示例中，经修饰的纳米孔20'是固态纳米孔，其中带正电荷的有机物质、带正电荷的无机物质或者带正电荷的有机物质和带正电荷的无机物质两者作为带正电荷的残基。在一个示例中，带正电荷的无机物质是固态纳米孔上的HfO2涂层。在另一示例中，可将氨基硅烷(例如(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷、(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷、(3-乙氧基二甲基甲硅烷基)丙胺、双[3-三甲氧基甲硅烷基)丙基]胺等)或赖氨酸接枝到表面上以引入正电荷。
检测离子电流以分析生物化合物的方法的示例包括：在分离顺式阱12和反式阱16的膜18内提供纳米孔20'，该纳米孔20'在纳米孔20'的内表面48上具有多个带正电荷的残基；在顺式阱12和反式阱16内(分别)提供电解质24或24A和24B；以及在至少部分地暴露于顺式阱12的顺式阴极14和至少部分地暴露于反式阱16的反式阳极22之间施加电流以产生通过纳米孔20'的离子电流，其中纳米孔20'的多个带正电荷的残基抑制反应性电解质物质C+在施加电流期间从反式阱16易位至顺式阱12。
在该方法的一些示例中，电解质溶液24可包括能够离解成抗衡离子(阳离子C+及其相关联的阴离子A-)的任何反应性电解质物质C+、A-，其中这些抗衡离子中的一者(例如，阳离子C+或阴离子A-)参与顺式电极14和反式电极22处的半反应。该电解质溶液24还包括极性溶剂，诸如水。
在该方法的其他示例中，顺式阱12包括电解质溶液24A(具有较高浓度的反应性电解质物质C+、A-)并且反式阱16包括电解质溶液24B(具有较低浓度的反应性电解质物质C+、A-)。因此，在施加电流期间，顺式阱12包括比反式阱16更高浓度的反应性电解质物质C+、A-。当经修饰的纳米孔20'和电解质溶液24A、24B在纳米孔传感器装置10中一起使用时，可实现几种有益效果：可降低经修饰的纳米孔的固定电荷的大小(与在顺式阱12和反式阱16中使用相同电解质溶液24时相反)；可降低浓度梯度的大小(与当使用未修饰的纳米孔20时相反)，这降低了跨膜18的渗透压差；并且可增加纳米孔电流。
当电解质24或相应电解质溶液24A、24B被包含在顺式阱12和反式阱16内时，核苷酸样品可例如经由流体入口或出口56和58添加到顺式阱12中。然后可使用控制器50来激活刺激源52，以单独地/选择性地对多个反式电极22中的一个反式电极进行寻址。刺激源52(例如，电流源、电压源)使离子电流流动穿过与经寻址的反式电极22连接的经修饰的纳米孔20'。
在该示例性方法中，顺式阴极14和反式阳极22之间的电流施加可由刺激源52启动，该刺激源在顺式阱12和多个反式阱16中的至少一个反式阱之间并且穿过膜18施加电压偏置。在一些示例中，所施加的电流是单极电流。在其他示例中，所施加的电流是顺式电极14和多个反式阱16中的经寻址的反式阱16的经寻址的反式电极22之间的交变电流。在该示例中，通常施加电压极性，使得带负电荷的核酸被电泳驱动进入到经修饰的纳米孔20'中。作为示例，电压在约5mV至约500mV(任一极性)的范围内。
顺式-反式电压偏置使离子电流流动穿过与经寻址的反式阳极22相关联的经修饰的纳米孔20'。穿过经修饰的纳米孔20'的电流迫使相应核苷酸与携带电荷的阴离子A-一起易位通过经修饰的纳米孔20。经修饰的纳米孔20'的带正电荷的残基也能有助于吸引带负电荷的核苷酸。此外，带正电荷的残基还能够排斥电解质溶液24或24A和24B的阳离子C+。由于由经修饰的纳米孔20'的至少部分带正电荷的表面引起的阳离子排斥，离子电流包括电解质C+、A-中通过经修饰的纳米孔20'易位至经寻址的反式阱16的一定量的阴离子A-，该A-的该量高于电解质C+、A-中从经寻址的反式阱16易位通过经修饰的纳米孔20'的阳离子C+的量。当不同浓度的电解质溶液24A、24B与经修饰的纳米孔20'组合使用时，可增强该效果。
经修饰的纳米孔20'经由漂移或扩散来减少或阻碍阳离子C+通过纳米孔20'的传输。因此，在t＝0时的初始阳离子C+电流被减少甚至消除。以此方式，从t＝0开始，阴离子A-被迫携带大部分离子电流，从而缓解电流的初始下降，并且总电流将在整个感测运行中保持更稳定。纳米孔传感器装置10的使用寿命可被延长，部分是因为更大比例的电流被迫通过纳米孔20而被另外的限制性阴离子A-所携带。
氧化还原非活性缓冲液
现在参见图4，纳米孔传感器装置10的一个示例包括：电解质溶液24C(在顺式阱12和反式阱16中的每个反式阱中)，该电解质溶液包括氧化还原非活性缓冲液62，该氧化还原非活性缓冲液包括直径大于纳米孔20或20'的收缩区60的直径的氧化还原非活性物质(例如，阳离子X+、阴离子Y-)；以及氧化还原对(例如，RC+、RC-)。在这些示例中，电极14、22被选择为可转移电子而不是交换离子的非活性材料。
在这些示例中，电解质溶液24C包括氧化还原对RC+、RC-。利用氧化还原对，相同的反应物RC可经历还原和氧化，并且氧化形式(RC+)和还原形式(RC-)两者都可存在于电解质溶液中。可使用可转移电子的任何氧化还原对RC+、RC-。合适的氧化还原对的示例包括FeCN(例如，)。由于FeCN氧化还原对都是带负电荷的，因此包括抗衡离子以保持溶液24C的总体电中性。可存在的合适抗衡离子的示例包括Na+、Li+、Ca2+、K+。电解质溶液24C还包括极性溶剂，诸如水。
当氧化还原对带正电荷时，选择氧化还原非活性缓冲液62的阳离子X+，使得其直径大于纳米孔收缩区60的直径。该大体积的氧化还原非活性阳离子X+将太大而不能通过纳米孔20传输，并且因此不会有害地影响带正电荷的氧化还原对的平衡。
大体积的氧化还原非活性阳离子X+包括阳离子络合剂和在阳离子络合剂的中心络合的阳离子。选择阳离子络合剂的中心空腔的直径以匹配阳离子的大小。“匹配”是指阳离子可配合在中心空腔内，并且阳离子络合剂的原子可与阳离子络合。
合适阳离子络合剂的示例包括冠醚、杯芳烃和缬氨霉素。合适冠醚的示例包括：
以及/>应当理解，还可使用这些冠醚的衍生物，诸如苯并或二苯并-15-冠-5、苯并或二苯并-18-冠-6、苯并或二苯并-21-冠-7、二环己烷并-18-冠-6、二环己烷并-21-冠-7等。还可使用氮杂冠醚(例如，氮杂-15-冠-5)或冠杂硫醚。合适的杯芳烃的示例包括C3Cal-5、C3Cal-6和杯[4]芳烃四酯。缬氨霉素如下所示：
匹配阳离子和阳离子络合剂的示例示于表2中。
表2
阳离子络合剂的量可至少部分地取决于络合剂对氧化还原非活性缓冲液62中的阳离子的亲和力而变化。考虑到该亲和力，阳离子络合剂可以任何合适的量使用，该量将导致至少99％的可用阳离子络合以产生大体积的氧化还原非活性阳离子X+。一般来讲，阳离子络合剂的摩尔浓度可在大于0mM至约1M的范围内。在示例中，18-冠-6可以约50mM至约500mM的范围内的摩尔浓度用于含钾电解质中。在更具体的示例中，18-冠-6可以约300mM的摩尔浓度用于含钾电解质中。在另一示例中，杯芳烃可以大于0mM至约20mM的范围内的摩尔浓度用于含钾或含钠电解质中。所使用的浓度中的任一者可取决于阳离子络合剂在电解质溶液24C中的溶解度。
当氧化还原对带正电荷时，氧化还原非活性缓冲液62的阴离子Y-可以是在纳米孔传感器装置10的电极14、22处为氧化还原非活性的任何阴离子。可使用任何阴离子Y-，因为电极14、22是非活性的。在示例中，阴离子Y-是氯离子。
当氧化还原对带负电荷时，选择氧化还原非活性缓冲液62的阴离子Y-，使得其直径大于纳米孔收缩区60的直径。该大体积的氧化还原非活性阴离子Y-将太大而不能通过纳米孔20或经修饰的纳米孔20'传输，并且因此不会有害地影响带负电荷的氧化还原物质的平衡。
当氧化还原物质带负电荷时，氧化还原非活性缓冲液62的阳离子X+可以是在纳米孔传感器装置10的电极14、22处为氧化还原非活性的任何阳离子。可使用任何阳离子C+，因为电极14、22是非活性的。可存在的合适阳离子的示例包括Na+、Li+、Ca2+、K+。
当电解质24C被包含在顺式阱12和反式阱16内时，核苷酸样品可例如经由流体入口或出口56和58添加到顺式阱12中。然后可使用控制器50来激活刺激源52，以单独地/选择性地对多个反式阳极22中的一个反式阳极进行寻址。刺激源52(例如，电流源、电压源)使离子电流流动穿过与经寻址的反式阳极22连接的纳米孔20或经修饰的纳米孔20'。
在一个示例中，刺激源52在顺式阱12和多个反式阱16中的至少一个反式阱之间并且因此穿过膜18施加电压偏置(使用电极14、22)。所施加的电压偏置的大小和极性(正或负)可部分地取决于电解质溶液24C中氧化还原对的浓度。可调节大小和极性以便考虑氧化还原对的扩散率和迁移率。在示例中，在顺式阱12和多个反式阱16中的一个反式阱中的经寻址的电极22之间的电压偏置在约-1V至约1V的范围内。当电解质溶液24C存在于相应阱12、16中时，可施加给定范围内的任何电压偏置。
在一些示例中，控制器50被配置为使刺激源52在顺式电极14和多个反式阱16中的经寻址的反式阱16的经寻址的反式电极22之间施加单极电流。作为一个示例，当氧化还原对带负电荷并因此是携带电荷的期望物质时，在阱12、16之间诱导正电流并因此穿过纳米孔20或20'和膜18。作为另一示例，当氧化还原对带正电荷并且因此是携带电荷的期望物质时，在阱12、16之间诱导负电流并因此穿过纳米孔20或20'和膜18。在其他示例中，控制器50被配置为使刺激源52在顺式电极14和多个反式阱16中的经寻址的反式阱16的经寻址的反式电极22之间施加交变电流。
顺式-反式电压偏置使离子电流流动穿过与经寻址的反式电极22相关联的纳米孔20或20'。穿过纳米孔20或20'的电流迫使相应核苷酸与携带电荷的带负电荷的氧化还原对一起易位通过经修饰的纳米孔20或20'。非活性氧化还原缓冲液62的大体积离子太大而不能易位纳米孔20或20'。
当在该示例中使用经修饰的纳米孔20'时，经修饰的纳米孔20'的带正电荷的残基可有助于吸引带负电荷的核苷酸，以及排斥氧化还原非活性缓冲液62的阳离子C+以及与氧化还原对结合使用的阳离子。由于由经修饰的纳米孔20'的至少部分带正电荷的表面引起的阳离子排斥，离子电流包括氧化还原对中通过经修饰的纳米孔20'易位至经寻址的反式阱16的一定量的阴离子RC-，该RC-的该量高于氧化还原非活性缓冲液62中从经寻址的反式阱16易位通过经修饰的纳米孔20'的阴离子A-的量。
为了进一步说明本公开，本文给出了实施例。应当理解，提供该实施例是出于说明目的，而不应理解为限制本公开的范围。
非限制性工作实施例
比较实施例1
在该比较实施例中，计算了具有相同K+Cl-浓度的纳米孔传感器在顺式阱和反式阱中的行为。纳米孔电流的时间和物质相关性是通过在商业软件包(Comsol)中对Nernst-Planck方程进行数值求解而获得的。
对具有以下的纳米孔传感器进行计算：直径为200μm且高度为200μm的顺式阱、直径为20μm且高度为20μm的反式阱、K+Cl-浓度为100mM的每个阱和约200mV的顺式-反式偏置电压。
图5A示出了电流的时间相关性，并且图5B示出了电流分量的物质分解。
从该模拟可明显看出，电流在大约50分钟的时间内迅速衰减，这与等式(1)的计算结果一致(该计算是使用在该实施例中阐述的参数并使用氯化物作为反应性物质进行的)。如图5B所示，在时间t＝0处，电流由K+阳离子和Cl-阴离子等量携带。随时间推移，两种分量都下降，阳离子分量下降得迅速得多，达到电流几乎仅由阴离子携带的点。此时，Cl-阴离子的供给和消耗达到平衡，并且达到新的平衡。然而，该新的平衡处于实际上不能用于纳米孔传感器装置的低得多的电流水平(例如，初始电流的约15％)。
实施例2
在该实施例中，计算了顺式阱中K+Cl-浓度高于反式阱中K+Cl-浓度的纳米孔传感器的行为。纳米孔电流的时间和物质相关性是通过在商业软件包(Comsol)中对Nernst-Planck方程进行数值求解而获得的。
对具有以下的纳米孔传感器进行计算：直径为200μm且高度为200μm的顺式阱、K+Cl-浓度为500mM的顺式阱、直径为20μm且高度为20μm的反式阱、K+Cl-浓度为100mM的反式阱和约80mV的顺式-反式偏置电压。
图6A示出了电流的时间相关性，并且图6B示出了电流分量的物质分解。
如图6B所示，在时间t＝0处，由于氯阴离子的电流部分比钾阳离子的电流部分大10倍，导致实际上有用的平衡条件(初始电流的约60％)不同于比较实施例(在顺式和反式阱中具有相等的电解质浓度)。
实施例3
在该实施例中，计算了顺式阱中K+Cl-浓度高于反式阱中K+Cl-浓度的另一纳米孔传感器的行为。纳米孔电流的时间和物质相关性是通过在商业软件包(Comsol)中对Nernst-Planck方程进行数值求解而获得的。
对具有以下的纳米孔传感器进行计算：直径为200μm且高度为200μm的顺式阱、K+Cl-浓度为850mM的顺式阱、直径为20μm且高度为20μm的反式阱、K+Cl-浓度为100mM的反式阱和约55.35mV的顺式-反式偏置电压。
图7A示出了电流的时间相关性，并且图7B示出了电流分量的物质分解。
如图7B所示，K+在整个孔中的传输比Cl-分量低近3个数量级，因此Cl-的供给和消耗达到平衡，并且孔电流稳定。在该实施例中，浓度梯度和顺式-反式偏置完全抵消了漂移和扩散阳离子电流，但总电流大致等于比较实施例1的总电流。
实施例4
为了评估生物纳米孔的超窄且超短的通道是否能够以期望水平排除阳离子，对几何结构进行了3D有限元分析，如图8所示。完整的结构是旋转对称的，因此在图8中仅示出了模拟域的一半。
在该分析中，纳米孔宽为1nm并且高为2nm，其近似于MspA收缩部的尺寸。将不同量的固定表面电荷放置在该收缩部的表面上。将“顺式”阱和“反式”阱置于模拟K+和Cl-的无限源的边界条件下，以便从模拟中消除耗尽效应。
对0.01q/nm2至1q/nm2范围内的表面电荷密度进行模拟，其中q是基本电荷。这是不存在电解质的情况下以理想化的“无水”状态存在的净电荷。原则上，这种电荷密度在蛋白质纳米孔中是可以实现的。
对σ＝0.01q/nm2、σ＝0.1q/nm2以及σ＝1q/nm2进行模拟的结果分别示于图9A、图9B和图9C中。更具体地，图9示出了模拟域中Cl:K比率的计算空间分布(对数刻度)。图9A、图9B和图9C中的数据被绘制在对数刻度上，并且每个图像伴随有刻度标记。虽然对于所有三种条件，Cl:K比率在纳米通道中达到峰值，但效应的大小与电荷密度呈指数关系。这在图10中更清晰可见。图10是通过纳米孔的Cl:K通量比率与孔通道中的固定电荷密度的大小的计算相关性。
为了表征抑制通过纳米孔的总K+通量的有益效果，如实施例1(D＝200μm/H＝200μm的顺式阱；D＝20μm/H＝20μm的反式阱；在顺式阱和反式阱中的100mM的K+Cl；以及顺反偏置为100mV)所述在三个不同的Cl:K通量比率值下进行了另外的模拟：R＝1.2(σ＝0.01q/nm2)；R＝5(σ＝0.1q/nm2)；和R＝40(σ＝0.4q/nm2)。结果分别示于图11A、图11B和图11C中。由这些结果可知，抑制K+通过纳米孔的传输的有益效果是显而易见的。在R＝40(σ＝0.4q/nm2)时，耗尽效应几乎被完全抑制。电流漂移显著减少，这有利于纳米孔传感器的实际使用。
实施例5
在该实施例中，比较了四种不同类型的经修饰的MspA孔。比较例MspA孔包括在D90、D91和D93处的中性天冬酰胺残基。第一实施例MspA孔包括在D90和D93处的中性天冬酰胺残基以及在D91处的带正电荷的精氨酸残基。第二实施例MspA孔包括在D91和D93处的中性天冬酰胺残基以及在D90处的带正电荷的精氨酸残基。第三实施例MspA孔包括在D93处的中性天冬酰胺残基以及在D90和D91处的带正电荷的精氨酸残基。使用深为5μm且宽为16μm的阱测试所有孔。该实施例中示出的数据表示十个或更多个相应孔的平均结果(例如，在150mM下测试19个比较例MspA孔，在150mM下测试58个第一实施例MspA孔，在300mM下测试21个比较例MspA孔，并且在300mM下测试10个第一实施例MspA孔)。
在第一实验中，顺式阱和反式阱中的K+Cl-浓度为300mM。将顺式-反式电压偏置从-175mV扫描至175mV，并记录电流(nA)。图12A示出了比较例MspA孔的电流(nA，Y轴)对电压(mV，X轴)的图，并且图12B示出了第一实施例MspA孔的电流对电压的图。虽然第二实施例MspA孔和第三实施例MspA孔的数据在本文中没有再现，但所有孔(比较例和实施例MspA孔)在较高的正电势下表现出较高的电阻。第一实施例MspA孔和第二实施例MspA孔(各自具有两个中性残基)在负偏置下表现出预期的电流整流(第一实施例MspA孔的结果参见图12B)。第三实施例MspA孔(具有两个正残基)在使用大的正电势之前几乎没有电导率。
在第二实验中，用不同的K+Cl-浓度(即150mM和300mM)测试比较例MspA孔和第一实施例MspA孔。将偏置电压从50mV扫描至150mV，并记录电流(pA)。图13绘制了第一实施例孔和比较例孔的平均电流(pA，Y轴)对不同电解质中的顺式-反式电压偏置(mV，X轴)。显然，不管电解质浓度如何，第一实施例MspA孔都具有比比较例MspA孔更高的电导率。
在第三实验中，用150mM的K+Cl-浓度和50mV的顺式-反式偏置电压来测试比较例MspA孔和第一实施例MspA孔。图14A绘制了比较例MspA孔的电流(pA，Y轴)对时间(s，X轴)，并且图14B绘制了第一实施例MspA孔的外推电流(pA，Y轴)对时间(s，X轴)。比较例孔在前20分钟内表现出显著的电流衰减，而第一实施例MspA孔没有表现出电流衰减。
附加说明
应当理解，前述概念和下文更详细讨论的附加概念(假设此类概念不相互矛盾)的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。具体地讲，出现在本公开末尾的要求保护的主题的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。还应当理解，本文明确采用的也可出现在以引用方式并入的任何公开中的术语应被赋予与本文所公开的特定概念最一致的含义。
本说明书通篇提及的“一个示例”、“另一个示例”、“一种示例”等意指结合该示例描述的特定元素(例如，特征、结构和/或特性)包括在本文所述的至少一个示例中，并且可存在于或不存在于其他示例中。此外，应当理解，用于任何示例的所述元素可以任何合适的方式组合在各种示例中，除非上下文另有明确说明。
虽然已经详细描述了若干示例，但是应当理解，可以对所公开的示例进行修改。因此，上述说明应被认为是非限制性的。

Claims (21)

1.一种纳米孔传感器装置，包括：
一个或多个顺式阱；
顺式电极；
多个反式阱，所述多个反式阱中的每个反式阱通过具有纳米孔的脂质/聚合物/固态膜与所述一个或多个顺式阱分离；
多个反式电极，所述多个反式电极中的每个反式电极与所述多个反式阱中的一个反式阱相关联；
第一浓度的电解质，所述第一浓度的所述电解质位于所述一个或多个顺式阱内；和
第二浓度的所述电解质，所述第二浓度的所述电解质位于所述反式阱内，其中所述第一浓度高于所述第二浓度。
2.根据权利要求1所述的纳米孔传感器装置，还包括：
刺激源，所述刺激源单独地或经由多路复用耦接到所述多个反式电极中的每个反式电极，其中所述刺激源将使电流流动穿过所述纳米孔；和
控制器，所述控制器耦接到所述刺激源，所述控制器被配置为单独地/选择性地对所述多个反式电极进行寻址，以使离子电流通过所述多个反式阱的经寻址的反式电极的所述纳米孔。
3.根据权利要求2所述的纳米孔传感器装置，其中所述离子电流包括所述电解质中通过所述纳米孔易位至经寻址的反式阱的一定量的阴离子，所述阴离子的所述量高于所述电解质中从所述经寻址的反式阱易位通过所述纳米孔的阳离子的量。
4.根据权利要求2所述的纳米孔传感器装置，其中所述控制器被进一步配置为使所述刺激源在所述顺式电极和所述多个反式阱中的所述经寻址的反式阱的所述经寻址的反式电极之间施加单极电流。
5.根据权利要求1所述的纳米孔传感器装置，其中所述纳米孔在所述纳米孔的内表面上具有多个带正电荷的残基。
6.根据权利要求5所述的纳米孔传感器装置，其中所述内表面上的所述多个带正电荷的残基位于所述纳米孔的收缩区处。
7.根据权利要求1所述的纳米孔传感器装置，其中所述第一浓度与所述第二浓度的比率在约10:1至约3:1的范围内。
8.一种纳米孔传感器套件，包括：
纳米孔传感器装置，所述纳米孔传感器装置包括：
一个或多个顺式阱，所述一个或多个顺式阱包括流体入口；
顺式电极；
多个反式阱，所述多个反式阱中的每个反式阱通过具有纳米孔的脂质/聚合物/固态膜与所述一个或多个顺式阱分离；
多个反式电极，所述多个反式电极中的每个反式电极与所述多个反式阱中的一个反式阱相关联；和
第一浓度的电解质，所述第一浓度的所述电解质位于所述一个或多个顺式阱和所述多个反式阱内；和
第二浓度的所述电解质，所述第二浓度的所述电解质将在所述纳米孔传感器装置的初始循环时通过所述流体入口引入到所述一个或多个顺式阱中，使得所述一个或多个顺式阱包含所述第二浓度的所述电解质，并且所述多个反式阱包含所述第一浓度的所述电解质，其中所述第二浓度高于所述第一浓度。
9.一种检测离子电流以分析生物化合物的方法，包括：
在分离顺式阱和反式阱的膜内提供纳米孔，所述纳米孔在内表面上具有多个带正电荷的残基；
在所述顺式阱和所述反式阱内提供电解质；以及
在至少部分地暴露于所述顺式阱的顺式阴极和至少部分地暴露于所述反式阱的反式阳极之间施加电流，以产生通过所述纳米孔的离子电流，
其中所述纳米孔的所述多个带正电荷的残基抑制阳离子在施加所述电流期间从所述反式阱易位至所述顺式阱。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述内表面上的所述多个带正电荷的残基位于所述纳米孔的收缩区处。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述纳米孔是经修饰的蛋白质，其中带负电荷的残基、带中性电荷的残基或者带负电荷的残基和带中性电荷的残基两者突变为所述带正电荷的残基。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述纳米孔是固态纳米孔，其中带正电荷的有机物质、带正电荷的无机物质或者带正电荷的有机物质和带正电荷的无机物质两者作为所述带正电荷的残基。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所施加的电流是单极电流。
14.根据权利要求9所述的方法，其中在施加所述电流期间，所述顺式阱相比所述反式阱包括更高浓度的所述电解质。
15.根据权利要求9所述的方法，其中以下各项中的一者：
所述电解质是具有负电荷的氧化还原对，并且掺入到氧化还原非活性缓冲液中，所述氧化还原非活性缓冲液包括直径大于所述纳米孔的收缩区的直径的阴离子；以及
所述电解质是具有正电荷的氧化还原对，并且掺入到氧化还原非活性缓冲液中，所述氧化还原非活性缓冲液包括直径大于所述纳米孔的收缩区的直径的阳离子。
16.一种纳米孔传感器装置，包括：
一个或多个顺式阱；
顺式电极；
多个反式阱，所述多个反式阱中的每个反式阱通过具有纳米孔的脂质/聚合物/固态膜与所述一个或多个顺式阱分离；
多个反式电极，所述多个反式电极中的每个反式电极与所述多个反式阱中的一个反式阱相关联；
电解质溶液，所述电解质溶液包括：
氧化还原非活性缓冲液，所述氧化还原非活性缓冲液包括直径大于所述纳米孔的收缩区的直径的氧化还原非活性物质；和
氧化还原对。
17.根据权利要求16所述的纳米孔传感器装置，还包括：
刺激源，所述刺激源单独地或经由多路复用耦接到所述多个反式电极中的每个反式电极，其中所述刺激源将使电流流动穿过所述纳米孔；和
控制器，所述控制器耦接到所述刺激源，所述控制器被配置为单独地/选择性地对所述多个反式电极进行寻址，以使离子电流通过所述多个反式阱的经寻址的反式电极的所述纳米孔。
18.根据权利要求17所述的纳米孔传感器装置，其中所述离子电流包括通过所述纳米孔易位至所述经寻址的反式电极的一定量的所述氧化还原对，而不包括一定量的所述氧化还原非活性物质。
19.根据权利要求17所述的纳米孔传感器装置，其中所述控制器被进一步配置为在所述顺式电极和所述多个反式阱中的所述经寻址的反式阱的所述经寻址的反式电极之间施加单极电流。
20.根据权利要求16所述的纳米孔传感器装置，其中所述纳米孔在所述纳米孔的内表面上具有多个带正电荷的残基。
21.一种纳米孔传感器装置，包括：
一个或多个顺式阱；
顺式电极；
多个反式阱，所述多个反式阱中的每个反式阱通过具有纳米孔的脂质/聚合物/固态膜与所述一个或多个顺式阱分离，在所述纳米孔的内表面上具有多个带正电荷的残基；和
多个反式电极，所述多个反式电极中的每个反式电极与所述多个反式阱中的一个反式阱相关联。
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