CN110954686A

CN110954686A - 混合纳米孔传感器

Info

Publication number: CN110954686A
Application number: CN201911345586.4A
Authority: CN
Inventors: 博扬·波亚诺夫; 杰弗里·G·曼德尔; 凯文·L·冈德森; 白经纬; 强亮亮; 布拉德利·巴斯
Original assignee: Illumina Inc
Current assignee: Illumina Inc
Priority date: 2014-07-31
Filing date: 2015-07-29
Publication date: 2020-04-03
Anticipated expiration: 2035-07-29
Also published as: JP6601852B2; US20240011089A1; SG10201809900PA; CN106796214B; JP2023164790A; JP7010911B2; US20170260582A1; CA3163156A1; JP2017523424A; JP2022058596A; US20200190577A1; SG11201700745XA; US11732301B2; AU2021229125A1; AU2015296551B2; JP7320326B2; JP2020030213A; AU2021229126A1; CN113759105A; CN110954686B

Abstract

本申请涉及混合纳米孔传感器。在一个方面，检测装置包含具有固态纳米孔阵列的固体支撑物和具有蛋白纳米孔的多个脂质纳米盘，其中脂质纳米盘被配置在固体支撑物上，使得它们在固态纳米孔处形成密封部。在另一方面，检测装置包括被膜包围的一个或更多个纳米孔，其中每个纳米孔被拴系到电极。

Description

混合纳米孔传感器

本申请是申请日为2015年07月29日，申请号为201580047480.X，发明名称为“混合纳米孔传感器”的申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年5月6日提交的标题为“TETHERED NANOPORES,NANOPORES INNANODISCS AND HYBRID NANOPORE SENSORS”的美国临时申请号62,157,749和于2014年7月31日提交的标题为“NANOPORES IN NANODISCS AND HYBRID NANOPORE SENSORS”的美国临时申请号62/031,762的权益，其公开内容通过引用并入本文用于所有目的。

技术领域

本申请涉及但不限于混合纳米孔传感器。

背景技术

蛋白纳米孔设备已经被探索用于许多传感器应用，特别是在DNA/RNA测序领域。已经通过当DNA分子通过纳米孔时读取离子电流信号证明核苷酸碱基的区别。遵循这些初步观察结果，基于蛋白的纳米孔设备已经被假设为在降低价格、快速周转和更长的读段长度方面具有推进核酸测序技术的巨大潜力。

更成熟的技术(测序合成(SBS))在过去五年中取得了快速的进展，约每六个月通量翻一番，远远超过半导体行业的摩尔定律。主要针对SBS方案的三个关键改进实现了这种快速进展：(1)循环测序化学反应改进；(2)增加表面上核酸菌落的密度；和(3)成像/扫描技术的改进。这三项技术改进已经增加了商用系统的通量，从2007年1月的每运行约1Gb增加到2012年6月的每运行超过1Tb。然而，尚未发现这些技术进步可直接方便用于到纳米孔技术。

尽管SBS改进的这种快速进展，30X基因组价格仍然超过1000美元/基因组，周转时间超过一周。此外，经由SBS获得的人基因组的从头组装和单体型分析受到短读段的限制。通过纳米孔的链测序，可潜在地在几分钟内读取多达50,000个碱基。这种单分子平台到目前为止似乎实现了速度，但是以大大降低的并行化为代价。

生物纳米孔的并行化是众所周知的困难。平台本身的脆弱性(特别是脂质双层(lipid bilayer)的半流体性质)经常需要训练有素的技术人员的专门操作，使得纳米孔系统对于广泛的商业化不太实用。目前用于组装蛋白纳米孔设备的技术大多是手工的、费力的和耗时的。在具有微米尺寸的孔隙的阵列的基底上涂覆脂质双层后，操作者用具有仔细滴定量的蛋白的溶液接触涂覆的阵列。根据泊松统计选择纳米孔的量，以使获得纳米孔的孔隙的数量最大化，同时使被加载多于一个纳米孔的孔隙的数量最小化。在经过特定的培育期后，洗去含纳米孔的溶液。泊松加载(Poisson loading)需要时间段来仔细选择以实现具有一个且仅一个纳米孔的最大可能的孔隙的数量。结果高度依赖于操作者的技术，并且不容易适应于大规模设备制造。

因此，纳米孔技术的主要挑战是增加平台的稳固性并同时改善并行化(例如在测序应用中)。本公开内容解决了这种需要并且还提供了其它优点。

发明内容

在附图和下面的描述中阐述了一个或更多个实施方案的细节。根据说明书和附图以及权利要求，其它特征、目的和优点将是明显的。

本公开内容提供了由插入固态纳米孔中的蛋白纳米孔组成的混合纳米孔。在具体实施方案中，用插入脂质纳米盘(nanodisc)中的蛋白纳米孔产生混合纳米孔，并且混合纳米孔最终包括插入脂质纳米盘中的蛋白纳米孔。根据本文阐述的方法，含有纳米孔的脂质纳米盘可以是自组装的。

在具体实施方案中，蛋白纳米孔最初在以游离溶液(free solution)的脂质纳米盘内自组装，如图1中的A所示；然后用核酸接枝蛋白纳米孔，如图1中的B所示；然后使用电泳力驱动核酸链通过固态纳米孔，直到含蛋白纳米孔的纳米盘与固态纳米孔表面接触，如图1中的C所示。

当与基于悬浮脂质膜的典型纳米孔制造技术相比时，本公开内容的脂质纳米盘辅助纳米孔组装方案的非限制性优点包括例如：

(1)结构稳定性：将蛋白纳米孔插入混合膜中，并且固体纳米孔支持大部分膜并提供纳米尺寸的孔隙。

(2)可扩展制造：含蛋白纳米孔的脂质纳米盘和固态纳米孔之间的相互作用的性质是自限制的，使得制造远不如依赖于纳米孔到固态孔隙中的泊松加载的组装方法易变。可在到脂质纳米盘的重建期间完成单个蛋白纳米孔到双层中的插入。可选择脂质纳米盘的尺寸(例如在一些实施方案中为10nm-13nm)以有利于仅掺入单一蛋白纳米孔(例如，～5nmMsp孔)。此外，可选择固态纳米孔尺寸(例如，在一些实施方案中为7nm-10nm直径的孔隙)，以允许每个固态纳米孔的孔隙仅组装一个蛋白-纳米盘复合物。因此，在许多实施方案中，不需要在多次插入的组装和筛选期间主动监测电特性。

(3)更好的电绝缘性：蛋白纳米孔在固态纳米孔中的直接插入通常需要两个纳米孔之间的尺寸和形状的精细匹配，以实现足够的离子电流隔离。在本公开内容的方法中，脂质纳米盘可仅选择为大于固态纳米孔的入口。可通过高于最小值的宽范围的纳米盘尺寸来防止电流泄漏，使得避免电流泄漏将不再需要蛋白和固态纳米孔之间的精细的形状匹配。

(4)放松对固态纳米孔的制造要求：具有孔隙大于5nm的固态纳米孔可与含蛋白纳米孔的脂质纳米盘形成功能性混合纳米孔。这种特征尺寸可通过现有技术的半导体技术容易地实现，而前沿孔制造(产生具有蛋白纳米孔直接插入所需的2nm-3nm范围内的直径的固态纳米孔所需的)是高度可变的、昂贵的并且过度依赖操作员的技术。

(5)允许大规模并行化：消除微米尺寸的脂质膜可允许固态纳米孔平台通过与芯片上放大器和数据采集电路集成而实现高度并行化。可用于数据采集的示例性放大器、电路和其它硬件在美国专利号8,673,550或8,999,716；Rosenstein等，Nano Lett 13,2682-2686(2013)；或Uddin等，Nanotechnology 24，155501(2013)中描述，其各自通过引用并入本文。

(6)较低的固有噪声：固态纳米孔通常需要适当的润湿以获得稳定的跨导(transconductance)。由于固态纳米孔在本文阐述的系统的具体实施方案中仅用作机械支撑，因此预期这些实施方案将展现出比独立的固态纳米孔更低的噪声。

本公开内容描述了制造混合纳米孔的方法，所述混合纳米孔结合自上而下的固态纳米孔的图案化和纳米制造与蛋白纳米孔的自下而上生物组装。用于利用纳米孔(特别是脂质双层中的生物纳米孔)核酸测序的现有技术以大大降低的并行化和数据通量为代价实现高速度和读段长度。现有平台的脆弱性也使得它们在商业化中不太实用。本公开内容的组合物和方法可通过建立混合生物-固态结构克服这些限制，所述混合生物-固态结构可以以高效率的稳固的自动化方式自组装。

如本文进一步详细阐述的，生物通道的基于脂质的载体可在具有直径大于10nm的固态纳米孔处组装。本文阐述的方法可用于纳米孔蛋白在脂质纳米盘中的插入、蛋白纳米孔-纳米盘与固态纳米孔的自限制组装，以及混合平台的分析应用，诸如核酸检测和测序。获得的平台可被配置以提供基于蛋白-纳米孔的核酸测序系统的速度和读段长度特征，同时提供可从已建立的半导体技术的使用获得的更大的并行化和系统稳定性。

本公开内容还提供了拴系(tether)的纳米孔。具体地，根据本公开内容，纳米孔可被拴系到电极或其它固体支撑物。

在特定实施方案中，本公开内容提供一种检测装置，其包括(a)电极；(b)被拴系到电极的纳米孔；和(c)围绕纳米孔的膜。还提供了多个实施方案。例如，本公开内容的检测装置可包括(a)多个电极；(b)多个纳米孔，每个纳米孔被拴系到多个电极中的一个电极；和(c)围绕每个纳米孔的膜。

还提供了一种制造检测装置的方法。该方法可以包括以下步骤：(a)提供具有电极阵列的固体支撑物；(b)提供多个纳米孔；(c)使多个纳米孔与电极阵列接触，以通过第一系链将单个纳米孔附接到单个电极，从而形成被拴系到所述多个电极中的电极的纳米孔阵列；和(d)使纳米孔阵列与膜材料接触以形成围绕阵列中的每个纳米孔的膜。

本文阐述了用于使用拴系的纳米孔组装检测装置的具体实施方案的非限制性优点，包括，例如：

(1)由于利用空间排斥的能力，增加纳米孔沉积的空间控制水平，使得在每个电极处容纳一个且仅一个纳米孔。

(2)将多个纳米孔高度并行组装到检测装置中。

(3)能够实现纳米孔加载效率，所述加载效率超越泊松统计的限制，所述泊松统计的限制阻碍了将纳米孔加载到多重检测器中的标准方法。

本公开内容还提供以下各项：

项目1.一种检测装置，包括：

(a)固体支撑物，所述固体支撑物包含固态纳米孔阵列；

(b)多个脂质纳米盘，所述多个脂质纳米盘在所述固体支撑物的表面上，

其中所述脂质纳米盘中的每个在所述固态纳米孔中的每个处形成密封部，并且

其中所述脂质纳米盘通过所述固体支撑物的表面上的间隙区域彼此分离；和

(c)多个蛋白纳米孔，所述多个蛋白纳米孔插入所述脂质纳米盘中以在所述密封部中的每个中产生孔隙。

项目2.根据项目1所述的检测装置，其中所述固态纳米孔在由所述固体支撑物分离的贮存器之间形成孔隙。

项目3.根据前述项目中任一项所述的检测装置，其中离子电流明显地仅流过所述蛋白纳米孔而不通过所述密封部。

项目4.根据前述项目中任一项所述的检测装置，其中所述密封部防止流体或电流的流动。

项目5.根据前述项目中任一项所述的检测装置，其中所述固态纳米孔各自具有至少7nm的孔隙直径。

项目6.根据前述项目中任一项所述的检测装置，其中所述固态纳米孔各自具有至多5微米的孔隙直径。

项目7.根据前述项目中任一项所述的检测装置，其中所述蛋白纳米孔中的每一个占据所述脂质纳米盘中的直径至少为5nm的区域。

项目8.根据前述项目中任一项所述的检测装置，其中所述蛋白纳米孔中的每一个占据所述脂质纳米盘中直径至多为1微米的区域。

项目9.根据前述项目中任一项所述的检测装置，其中所述脂质纳米盘各自具有至少7nm的直径。

项目10.根据前述项目中任一项所述的检测装置，其中所述脂质纳米盘各自具有至多1微米的直径。

项目11.根据前述项目中任一项所述的检测装置，其中所述脂质纳米盘各在所述固体支撑物的表面上占据不超过50,000nm²的面积。

项目12.根据前述项目中任一项所述的检测装置，其中所述脂质纳米盘形成用于至少50％的所述固态纳米孔的密封部。

项目13.根据前述项目中任一项所述的检测装置，其中所述蛋白纳米孔被插入所述脂质纳米盘的至少50％中。

项目14.根据前述项目中任一项所述的检测装置，其中所述蛋白纳米孔被插入所述固态纳米孔的至少50％中。

项目15.根据前述项目中任一项所述的检测装置，其中所述间隙区域将所述脂质纳米盘分离至少5nm。

项目16.根据前述项目中任一项所述的检测装置，其中所述间隙区域没有任何脂质材料。

项目17.根据前述项目中任一项所述的检测装置，其中所述固态纳米孔阵列包含至少1000个固态纳米孔。

项目18.根据前述项目中任一项所述的检测装置，其中所述固态纳米孔阵列包含至少1000个脂质纳米盘。

项目19.根据前述项目中任一项所述的检测装置，其中所述固态纳米孔阵列包含至少1000个蛋白纳米孔。

项目20.根据前述项目中任一项所述的检测装置，还包含位于由所述蛋白纳米孔形成的孔隙中的核酸分析物。

项目21.根据前述项目中任一项所述的检测装置，还包含与所述固态纳米孔阵列接触的顺式贮存器，和与所述固态纳米孔阵列接触的反式贮存器。

项目22.根据项目21所述的检测装置，其中所述顺式贮存器和所述反式贮存器包含电极，所述电极被定位以施加电流通过由所述蛋白纳米孔形成的所述孔隙。

项目23.根据前述项目中任一项所述的检测装置，还包含放大器，所述放大器被配置以放大在所述蛋白纳米孔处产生的电信号。

项目24.根据前述项目中任一项所述的检测装置，其中在所述固态纳米孔阵列的固态纳米孔上形成密封部的所述脂质纳米盘中的每一个包含所述蛋白纳米孔中的不超过一个蛋白纳米孔。

项目25.根据前述项目中任一项所述的检测装置，其中所述脂质纳米盘还包含膜支架蛋白。

项目26.根据前述项目中任一项所述的检测装置，还包含附接于所述蛋白纳米孔或所述脂质纳米盘的核酸系链。

项目27.一种制造检测装置的方法，包括：

(a)提供固体支撑物，所述固体支撑物包含固态纳米孔阵列；

(b)提供多个脂质纳米盘，其中所述脂质纳米盘包含插入所述脂质中的蛋白纳米孔；

(c)使所述多个脂质纳米盘与所述固态纳米孔阵列接触，以用所述脂质纳米盘中的一个覆盖所述固态纳米孔阵列的各个固态纳米孔。

项目28.根据项目27所述的方法，其中覆盖所述固态纳米孔的所述脂质纳米盘被在所述固体支撑物的表面上的间隙区域彼此分离。

项目29.根据项目27至28中任一项所述的方法，其中与所述固态纳米孔阵列接触的所述脂质纳米盘还包含膜支架蛋白。

项目30.根据项目27至29中任一项所述的方法，其中所述提供步骤(b)还包括在用于将所述蛋白纳米孔插入所述脂质纳米盘的条件下培育具有脂质的所述蛋白纳米孔。

项目31.根据项目30所述的方法，其中所述脂质是洗涤剂增溶的，并且所述条件包括从所述蛋白纳米孔去除所述洗涤剂。

项目32.根据项目27至31中任一项所述的方法，还包括在步骤(c)中将所述脂质纳米盘电吸引到所述固态纳米孔。

项目33.根据项目27至32中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米盘还包含带电的系链。

项目34.根据项目33所述的方法，其中所述带电的系链包含附接于所述脂质或所述蛋白纳米孔的核酸。

项目35.根据项目33或34所述的方法，其中在步骤(c)中所述带电的系链被电吸引到所述固态纳米孔。

项目36.根据项目27至35中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中所述脂质纳米盘的数量超过所述固态纳米孔的数量。

项目37.根据项目36所述的方法，其中在步骤(c)中所述脂质纳米盘的数量超过所述固态纳米孔的数量至少2倍。

项目38.根据项目27至37中任一项所述的方法，其中所述固态纳米孔中的每一个被所述脂质纳米盘中的不超过一个脂质纳米盘覆盖。

项目39.根据项目27至38中任一项所述的方法，其中所述固态纳米孔在由所述固体支撑物分离的贮存器之间形成孔隙。

项目40.根据项目28至39中任一项所述的方法，其中所述覆盖防止除了通过所述蛋白纳米孔之外的流体流动或电流流动。

项目41.根据项目27至40中任一项所述的方法，其中所述固态纳米孔各自具有至少7nm的孔隙直径。

项目42.根据项目27至41中任一项所述的方法，其中所述固态纳米孔各自具有至多5微米的孔隙直径。

项目43.根据项目27至42中任一项所述的方法，其中所述蛋白纳米孔中的每一个占据所述脂质纳米盘中直径至少为5nm的区域。

项目44.根据项目27至43中任一项所述的方法，其中所述蛋白纳米孔中的每一个占据所述脂质纳米盘中直径至多为1微米的区域。

项目45.根据项目27至44中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米盘各自具有至少7nm的直径。

项目46.根据项目27至45中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米盘各自具有至多1微米的直径。

项目47.根据项目27至46中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米盘在所述固体支撑物的表面上各占据不超过50,000nm²的面积。

项目48.根据项目27至47中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米盘覆盖所述固态纳米孔的至少50％。

项目49.根据项目27至48中任一项所述的方法，其中所述蛋白纳米孔被插入所述脂质纳米盘的至少50％中。

项目50.根据项目27至49中任一项所述的方法，其中所述蛋白纳米孔插入所述固态纳米孔的至少50％中。

项目51.根据项目27至50中任一项所述的方法，其中步骤(c)在所述固体支撑物的表面上产生间隙区域，所述间隙区域将所述脂质纳米盘分离至少5nm。

项目52.根据项目28至51中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米盘不附接到所述间隙区域。

项目53.根据项目27至52中任一项所述的方法，其中所述固态纳米孔阵列包含至少1000个固态纳米孔。

项目54.根据项目27至53中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米盘中的至少1000个覆盖所述固态纳米孔阵列中的固态纳米孔。

项目55.根据项目27至54中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米盘中的覆盖所述固态纳米孔的至少1000个包含蛋白纳米孔。

项目56.根据项目27至55中任一项所述的方法，其中在步骤(c)期间所述多个脂质纳米盘与所述固态纳米孔阵列进行体接触。

项目57.一种核酸测序方法，包括：

(a)提供检测装置，所述检测装置包括：

(i)固体支撑物，所述固体支撑物包括固态纳米孔阵列；

(ii)在所述固体支撑物的表面上的多个脂质纳米盘，其中所述脂质纳米盘中的每一个在所述固态纳米孔中的每一个处形成密封部，并且其中所述脂质纳米盘被所述固体支撑物的表面上的间隙区域彼此分离；和

(iii)多个蛋白纳米孔，所述多个蛋白纳米孔被插入所述脂质纳米盘中以在所述密封部中的每一个中产生孔隙；和

(b)检测以下物质穿过所述密封部中的每一个密封部中的孔隙的通过

(i)核酸，

(ii)从所述核酸去除的一系列核苷酸，或

(iii)源自掺入到所述核酸的核苷酸的一系列探针，

从而确定所述核酸的序列。

项目58.一种检测装置，包括

(a)电极；

(b)拴系到所述电极的纳米孔；和

(c)围绕所述纳米孔的膜。

项目59.根据项目58所述的检测装置，其中所述纳米孔通过覆盖所述电极的一部分的电介质垫被拴系到所述电极。

项目60.根据项目59所述的检测装置，其中所述电介质垫具有小于1μm²的面积。

项目61.根据项目59或60所述的检测装置，其中所述纳米孔占据的面积大于所述电介质垫的面积。

项目62.根据项目58至61中任一项所述的检测装置，其中以双层的脂质被拴系到所述电极。

项目63.根据项目58至62中任一项所述的检测装置，其中所述纳米孔占据所述膜中至少25nm²的面积。

项目64.根据项目58至63中任一项所述的检测装置，其中所述纳米孔占据至多1μm²的面积。

项目65.根据项目8至64中任一项所述的检测装置，还包括位于由所述纳米孔形成的孔隙中的核酸分析物。

项目66.根据项目58至65中任一项所述的检测装置，其中所述纳米孔包括蛋白纳米孔。

项目67.根据项目58至66中任一项所述的检测装置，还包括放大器，所述放大器被配置以放大在所述纳米孔处产生的电信号。

项目68.根据项目58至67中任一项所述的检测装置，其中所述纳米孔通过核酸系链被拴系到所述电极。

项目69.根据项目58至68中任一项所述的检测装置，其中所述电极包含金属。

项目70.一种检测装置，包括

(a)多个电极；

(b)多个纳米孔，所述纳米孔中的每一个被拴系到所述多个电极中的电极；和

(c)围绕所述纳米孔中的每一个的膜。

项目71.根据项目70所述的检测装置，还包括多个电介质垫，所述电介质垫中的每一个覆盖所述多个电极中的电极的一部分。

项目72.根据项目71所述的检测装置，其中所述电介质垫中的每一个被拴系到所述纳米孔中的不超过一个纳米孔。

项目73.根据项目71或72所述的检测装置，其中所述电介质垫中的每一个具有小于1μm²的面积。

项目74.根据项目71至73中任一项所述的检测装置，其中所述纳米孔占据的面积大于所述电介质垫的面积。

项目75.根据项目70至74中任一项所述的检测装置，还包括将所述电极彼此分离的间隙区域。

项目76.根据项目75所述的检测装置，其中所述间隙区域将所述电极分离至少5nm。

项目77.根据项目75或76所述的检测装置，其中所述间隙区域没有任何膜材料。

项目78.根据项目70至77中任一项所述的检测装置，其中所述多个电极包括至少1000个电极。

项目79.根据项目70至78中任一项所述的检测装置，其中所述多个纳米孔包括至少1000个纳米孔。

项目80.根据项目70至79中任一项所述的检测装置，其中所述电极中的每一个被拴系到所述纳米孔中的不超过一个纳米孔。

项目81.如项目70至80中任一项所述的检测装置，其中围绕所述纳米孔中的每一个纳米孔的膜形成密封部，所述密封部用于所述纳米孔拴系至其的电极，其中所述密封部防止流体或电流从所述纳米孔被拴系至其的电极流动到所述检测装置的其它电极。

项目82.一种制造检测装置的方法，包括：

(a)提供固体支撑物，所述固体支撑物包括电极阵列；

(b)提供多个纳米孔；

(c)使所述多个纳米孔与所述电极阵列接触，以通过第一系链将各个纳米孔附接到各个电极，从而形成拴系到所述多个电极中的电极的纳米孔阵列；和

(d)使所述纳米孔阵列与膜材料接触以形成围绕所述纳米孔阵列中的纳米孔中的每个纳米孔的膜。

项目83.根据项目82所述的方法，其中在步骤(c)中与所述电极阵列接触的纳米孔的数量超过所述电极阵列中的电极的数量。

项目84.根据项目82或83所述的方法，还包括经由第二系链将所述膜材料附接到所述电极阵列中的电极的步骤。

项目85.根据项目84所述的方法，其中将所述膜材料附接到所述电极包括，在步骤(c)之前将所述电极阵列附接到所述第二系链，以及在步骤(c)之后将所述第二系链附接到所述膜材料。

项目86.根据项目84所述的方法，其中将所述膜材料附接到所述电极包括，在步骤(c)之后将所述电极阵列附接到所述第二系链，以及在步骤(c)之后将所述第二系链附接到所述膜材料。

项目87.根据项目82至86中任一项所述的方法，其中所述电极包含金属。

项目88.根据项目82至87中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中与所述电极阵列接触的纳米孔中的每一个预先被附接到所述第一系链。

项目89.根据项目82至87中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中与所述纳米孔接触的电极中的每一个预先被附接到所述第一系链。

项目90.根据项目82至89中任一项所述的方法，其中所述电极通过间隙区域彼此分离。

项目91.根据项目82至90中任一项所述的方法，其中所述纳米孔是洗涤剂增溶的，并且步骤(d)还包括从所述纳米孔去除所述洗涤剂。

项目92.根据项目82至91中任一项所述的方法，还包括在步骤(c)中将所述纳米孔电吸引到所述电极。

项目93.根据项目82至92中任一项所述的方法，其中所述第一系链包含核酸。

项目94.根据项目84至93中任一项所述的方法，其中所述第二系链包含核酸。

项目95.如项目82至94中任一项所述的方法，其中围绕所述纳米孔中的每一个的膜形成密封部，所述密封部用于所述纳米孔被拴系至其的电极，其中所述密封部防止流体或电流从所述纳米孔被拴系至其的电极流动到所述检测装置的其它电极。

项目96.根据项目82至95中任一项所述的方法，其中电介质垫被附接到所述电极中的每一个，并且其中在步骤(c)期间，所述各个纳米孔经由附接到所述各个电极的电介质垫附接到所述各个电极，从而形成各自经由所述多个电极中的电介质垫拴系到电极的纳米孔的阵列。

项目97.根据项目96所述的方法，其中所述电介质垫中的每一个具有小于1μm²的面积。

项目98.根据项目96或97所述的方法，其中所述纳米孔中的每一个占据的面积大于所述电介质垫的面积。

项目99.根据项目82至98中任一项所述的方法，其中所述多个电极包括至少1000个电极。

项目100.根据项目82至99中任一项所述的方法，其中所述多个纳米孔包括至少1000个纳米孔。

项目101.根据项目82至100中任一项所述的方法，其中所述电极中的每一个被拴系到所述纳米孔中的不超过一个纳米孔。

项目102.根据项目82至101中任一项所述的方法，其中所述各个纳米孔附接到所述电极中的至少50％。

项目103.根据项目82至102中任一项所述的方法，其中在步骤(c)期间所述多个纳米孔与所述电极阵列进行体接触。

项目104.一种核酸测序方法，包括：

(a)提供检测装置，包括：

(i)多个电极，

(ii)多个纳米孔，所述纳米孔中的每一个被拴系到所述多个电极中的电极，和

(iii)围绕所述纳米孔中的每一个纳米孔的膜；和

(b)检测以下物质穿过所述纳米孔中的每一个纳米孔的通过：

(i)核酸，

(ii)从所述核酸去除的一系列核苷酸，或

(iii)源自掺入所述核酸中的核苷酸的一系列探针，从而确定所述核酸的序列。

附图说明

图1中的A示出了最初在以游离溶液的脂质纳米盘内自组装的蛋白纳米孔的图解表示；图1中的B示出了用核酸接枝的蛋白纳米孔；图1中的C示出了由于核酸链被驱动通过固态纳米孔，直到纳米盘脂质与固态表面接触，含有蛋白纳米孔的纳米盘与固态纳米孔的组装。

图2A示出了用脂质纳米盘组装的7nm-10nm固态纳米孔的图解表示，所述脂质纳米盘转而具有插入脂质膜中的蛋白纳米孔，其中核酸被接枝到蛋白纳米孔；图2B示出了由支架蛋白(暗环)结合的10nm-13nm脂质纳米盘(浅灰色)的图解表示。

图3示出了脂质纳米盘形成过程的图解表示。

图4示出了脂质纳米盘加载技术的图解表示，其中将His-加标签的蛋白(例如孔蛋白可用于代替CYP3A4)加入到初始混合物中，并且使用金属螯合柱(metal chelatingcolumn)将蛋白加载的盘与空白盘分离。

图5示出了在聚丙烯酰胺凝胶上加载的His-加标签的MspA的表达、重构和纯化的级分。泳道M，蛋白梯；泳道S，细胞裂解物的可溶级分；泳道F，来自Ni-NTA离心柱的流出物；泳道W，第一洗涤级分；泳道E，His-加标签的MspA的洗脱物。

图6A示出了固态纳米孔测试夹具(test fixture)布局，并且图6B示出了布局的实现。将纳米孔芯片(“Si芯片”)插入指定位置，并通过O形环橡胶垫圈密封在适当位置。在孔的顺侧和反侧的Ag/AgCl电极提供电流源。使用Axopatch 200B放大器测量电流。

图7示出了通过插入悬浮膜中的MspA生物孔移位的91-mer DNA的生物孔移位测量。垂直轴被对孔隙开态电流归一化。

图8显示了其中脂质纳米盘与胆固醇-TEG DNA一起培育以在纳米盘上产生DNA系链的反应。DNA系链可以用于在固态纳米孔上电泳牵引脂质纳米盘。

图9示出了用于脂质纳米盘和固态纳米孔之间增强偶合的方法。首先用有机硅烷，然后用胆固醇衍生物处理固体支撑物的Si₃N₄表面。

图10示出了用于将MspA插入脂质纳米盘的方案的优化的结果。

图11A示出了来自图10的中间轨迹的高分子量洗脱级分的TEM图像。

图11B示出了来自图10的中间轨迹的低分子量洗脱级分的TEM图像。MspA插入的位点用箭头指示。

图12示出了将纳米孔拴系到电极的方法的图解表示，其中在纳米孔附接到电极之后，将膜系链附接到电极。

图13示出了将纳米孔拴系到电极的方法的图解表示，其中在纳米孔附接到电极之前，将膜系链附接到电极。

图14示出了将纳米孔拴系到电极的方法的图解表示，其中在电极与纳米孔接触之前，将纳米孔系链附接到电极。

具体实施方式

本公开内容提供了基于由蛋白-孔嵌入的脂质纳米盘密封的固态纳米孔的混合纳米孔系统。在图2A和2B中示出了特定实施方案的概念图示。

当前纳米孔链测序平台是基于蛋白纳米孔(本文中也称为“生物孔(biologicalpore)”或“生物孔(biopore)”)到悬浮的微米尺寸的脂质双层中的自由扩散和插入。已经开发了各种方法来检测单个插入事件，通过监测离子电流或AC阻抗来检测单个插入事件。这些方法依赖于附加的监视电路/程序，其可扩大设备封装(footprint)并增加系统复杂性。微米尺寸的脂质双层易受机械振动的影响，增加了设备制造、装运、存储和操作的复杂性。可选地，尺寸大于10nm的固态纳米孔是稳固的并且与高通量制造和操作兼容，为纳米孔技术提供有用的平台。因此，本公开内容的实施方案利用固态纳米孔作为平台来将单一蛋白纳米孔与脂质纳米盘组装为固态纳米孔的边缘密封。

具体实施方案采用将蛋白纳米孔插入脂质纳米盘载体中并施加电泳力(可能使用DNA系链)，以将蛋白/脂质复合物引导至固态纳米孔。例如，脂质纳米盘可以是7到13nm直径的脂质双层盘，所述脂质双层盘任选地通过膜支架蛋白(MSP)(apoA-I的衍生物)来稳定。应当理解的是，纳米盘可以具有小于7nm的直径(例如小于6nm、5nm、4nm、2nm或更小的直径)或大于13nm的直径(例如大于15nm、20nm或25nm或更大的直径)。通常，本文阐述的方法或组合物中使用的脂质盘的面积不大于约50,000nm²，或在一些情况下不大于约10,000nm²，或有时不大于约1,000nm²，或甚至有时不大于约500nm²。

如图2B所示，脂质纳米盘可以包括被两个平行的带状MSP包围的脂质分子的双层，其中MSP的两亲性螺旋稳定在脂质盘边缘上的疏水性脂肪酸。特别有用的脂质纳米盘及组合物和其制备的方法阐述于例如Nath等，Biochemistry 46,2059-2069(2007)中，其通过引用并入本文。

脂质纳米盘可以通过将MSP与洗涤剂稳定的磷脂混合来制备。纳米盘的自组装在从混合物中除去洗涤剂期间发生，如下阐述的。已经证明，MSP的存在限制了脂质纳米盘的形状和尺寸，并且在不含洗涤剂的水溶液中提供窄的粒度分布(size distribution)(±3％)、卓越的再现性和优异的稳定性。可以选择MSP与洗涤剂的比例以实现纳米盘的所需尺寸和特性。例如，可以改变MSP的结构单元的数目，以允许纳米盘直径从9.8nm调整到12.9nm，如Denisov等，J.Am.Chem.Soc.126，3477-3487(2004)中阐述的，其通过引用并入本文。这些直径与可以用商业可获得的方法可靠制造的固态纳米孔良好匹配。纳米盘可以是有效载体以掺入膜蛋白。许多膜蛋白已经被整合到纳米盘中，诸如细胞色素、七跨膜片段蛋白、细菌化学感受器和人线粒体电压依赖性阴离子通道蛋白。将膜蛋白掺入纳米盘的示例性方法阐述于Raschle等，J.Am.Chem.Soc.131，17777-17779(2009)中。类似的方法可以用于将蛋白纳米孔(诸如α-溶血素、MspA、细胞溶素和其他)插入脂质纳米盘中。有用的蛋白纳米孔的其他示例在US 8,673,550中阐述，其通过引用并入本文。

可以通过化学设计脂质/固体界面来促进脂质纳米盘和固态纳米孔之间的偶合。例如，固体表面可以用氰丙基硅烷、胆固醇、RAFT聚合或结合或粘附到脂质和/或MSP的其它材料官能化。用于表面官能化的示例性材料和方法阐述于White等，J Am Chem Soc 129,11766-11775(2007)和Kwok等，PLOS One DOI：10.1371/journal.pone.0092880(2014)中，其各自通过引用并入本文。类似地，可以将脂质纳米盘(MSP或脂质)设计为含有能够与固态纳米孔表面上的官能化匹配的偶合或接头分子。这种设计可以在脂质纳米盘和固态纳米孔之间提供大于100GΩ的绝缘。这些绝缘水平可以促进用于核酸移位和测序应用的高水平碱基辨别。脂质纳米盘也可以使用本文在将脂质拴系到电极的上下文中阐述的试剂和方法偶合到固态纳米孔。因此，用于将脂质附接到电极的系链可以用于将纳米盘偶合到固态孔。

在具体实施方案中，脂质纳米盘形成的过程可以如图3中举例说明的那样进行，并进一步详细描述于Baas的“Characterization of monomeric human cytochrome P4503A4 and Cytochrome P450 Reductase in nanoscale phospholipid bilayer discs”，University of Illinois at Urbana-Champaign，U.S.A.(2006)，ISBN 0542987236,9780542987236A，其通过引用并入本文。如图所示，膜支架蛋白可以与洗涤剂增溶的磷脂自组装以形成纳米盘。当去除洗涤剂时(例如使用

(Bio-Rad，Hercules CA))，发生自组装。然后，可以用尺寸排阻色谱法纯化组装反应的产物。脂质/蛋白比率的优化产生单分散的纳米盘，所述纳米盘尺寸由膜支架蛋白的长度决定。

单个和甚至多个蛋白在纳米盘中的插入可以通过另外的纯化步骤来实现，所述纯化步骤使用基于镍的亲和基质特异性结合纳米孔蛋白上的多组氨酸亲和标签，例如，使用类似于Baas的“Characterization of monomeric human cytochrome P450 3A4 andCytochrome P450 Reductase in nanoscale phospholipid bilayer discs”，Universityof Illinois at Urbana-Champaign，USA(2006)，ISBN 0542987236,9780542987236A中演示的方法，其通过引用并入本文。在图4中示出了用于基于亲和性的生物孔承载的纳米盘分离的有用方法的图解表示。

生物孔诱变可用于优化用于组装的或用于本文阐述的组合物或方法中的蛋白孔。如上所述，在纳米盘中掺入蛋白通道的过程可以受益于蛋白上的多组氨酸亲和标签和受益于Ni亲和柱上的混合纳米盘群体的纯化。蛋白设计和诱变技术可用于突变生物孔，并针对特定应用定制其性质。具有C末端6xHis标签的MspA可以由如图5中所示的SDS-PAGE凝胶所证实的进行表达、重构和纯化(泳道M，蛋白梯；泳道S，来自表达His-加标签的MspA的细胞的裂解物的可溶级分；泳道F，来自Ni-NTA离心柱的流出物；泳道W，来自Ni-NTA离心柱的第一洗涤级分；泳道E，来自Ni-NTA离心柱的His-加标签的MspA的洗脱物)。发现纯化的His-加标签的MspA的生物功能与未加标签的MspA的生物功能相似。也可以出于纯化目的而引入其它突变。例如，半胱氨酸部分可以通过诱变引入蛋白序列中，并用于与亲和标签的巯基反应部分(例如马来酰亚胺或碘乙酰胺)的化学缀合。示例性亲和标签包括生物素(其可通过固相链霉亲和素介导纯化)、DNA和RNA(其可通过具有互补序列的固相核酸介导纯化)、表位(其可通过固相抗体或抗体片段介导纯化)或其它配体(其可通过这些配体的固相受体介导纯化)。

亲和标签(例如本文阐述的His标签和其他标签)和化学缀合技术(例如以上阐述的半胱氨酸的修饰)可用于将系链附接到纳米孔以用于本文阐述的多种方法、组合物或装置中。例如，所得到的系链可用于在固态纳米孔处或附近吸引或附接含有纳米孔的纳米盘。系链也可以用于将纳米孔附接到电极或其他固相支撑物。

本公开内容提供了一种使用一个或更多个混合蛋白-固态纳米孔的数据采集系统。在图6A和6B中示出了示例性系统。在该示例中，在指示位置插入固态纳米孔，并通过O形环密封在适当位置。在孔的顺侧和反侧的标准Ag/AgCl电极提供电流源。可以用Axopatch200B放大器获得来自纳米孔的数据。来自固体自支撑SiN膜(无纳米孔)的初步数据已显示大于100GΩ的电阻，表示稳固地密封的流通池(flowcell)(在200mV偏压下小于0.9pA的漏电流)。这种类型的设置与纳米孔领域中用于评估分析能力的公认的“标准”设置一致。图7中示出了来自以链置换模式移位通过生物纳米孔的91个核苷酸的DNA的代表性数据。

本公开内容提供了一种检测装置，其具有(a)固体支撑物，其包含固态纳米孔阵列；(b)在固体支撑物的表面上的多个脂质纳米盘，其中每个脂质纳米盘在每个固态纳米孔处形成密封部，并且其中脂质纳米盘被在固体支撑物的表面上的间隙区域彼此分离；和(c)多个蛋白纳米孔，其插入脂质纳米盘中以在每个密封部中产生孔隙。

检测装置还可以包括嵌入固体支撑物中的电极。电极可以用于监测纳米盘和/或蛋白纳米孔到固态纳米孔中的组装。电极还可以用于在分析物检测步骤期间的数据收集。用于监测和检测的电极不需要被嵌入在固体支撑物中，并且可以替代地被提供在例如单独的专用集成电路(ASIC)芯片中。

如本文所使用的，当提及物品的集合使用时，术语“每个(each)”旨在标识集合中的单个物品，但不一定指的是集合中的每个物品。如果明确披露或上下文另有明确规定，则可能发生例外。

如本文所用，术语“固体支撑物”是指刚性基底，所述刚性基底不溶于水性液体并且不能通过液体，没有孔隙。示例性的固体支撑物包括但不限于玻璃和改性或官能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸类、聚苯乙烯和苯乙烯与其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、Teflon^TM、环烯烃、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷、树脂、Zeonor、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性硅、碳、金属、无机玻璃、光纤束和聚合物)。特别有用的固体支撑物包含改性硅，诸如Si基底上的SiN膜。对于一些实施方案，固体支撑物位于流通池装置或其他容器内。

如本文所用的，术语“固态纳米孔”是指穿过固体支撑物以允许液体或气体通过的孔。固态纳米孔将通常具有直径在约1nm和1μm之间的内腔或孔隙。然而，更大或更小的直径是可能的。固态纳米孔通常由非生物来源的材料制成。固态孔可以是无机或有机材料。固态孔包括，例如氮化硅孔、二氧化硅孔和石墨烯孔。

如本文所用，术语“脂质纳米盘”是指占据约3nm²和3μm²之间的面积的脂质双层片。例如，所占据的面积可以是至少约5nm²、10nm²、50nm²、100nm²、1,000nm²、10,000nm²、100,000nm²或更多。可选地或另外地，所占据的面积可以是至多约100,000nm²、10,000nm²、1,000nm²、100nm²、50nm²、10nm²、5nm²或更少。脂质纳米盘可以但不一定占据圆形区域。由纳米盘占据的圆形区域可具有在约1nm和1μm之间的直径。然而，更大或更小的面积或直径是可能的。脂质纳米盘可以但不一定是平的或平面的。在特定条件下，由于纳米盘不存在水腔，脂质纳米盘可以与囊泡或脂质体区分开，并且由于在纳米盘中存在双层，脂质纳米盘可以与胶束区分开。本文例示了使用脂质纳米盘的几个实施方案。应当理解的是，纳米盘也可以由其他材料制成。例如，纳米盘可以由非脂质膜(诸如下面阐述的那些)形成。

如本文所用的，术语“膜”是指防止电流或流体通过的片或其它屏障。与本文阐述的固体支撑物相比，膜通常是柔性的或可压缩的。膜可以由脂质材料制成(例如以形成脂质双层)或者膜可以由非脂质材料制成。膜可以是共聚物膜的形式，例如由二嵌段聚合物或三嵌段聚合物形成，或者是单层的形式，例如由勃拉脂质(bolalipid)形成。参见例如Rakhmatullina等，Langmuir：the ACS Journal of Surfaces and Colloids 24：6254-6261(2008)，其通过引用并入本文。

如本文所使用的，术语“间隙区域”是指基底中的或表面上的区域，其分离基底或表面的其它区域。例如，间隙区域可以将阵列的一个纳米孔与阵列的另一个纳米孔分离。彼此分离的两个区域可以是离散的，彼此没有接触。在许多实施方案中，间隙区域是连续的，而特征是离散的，例如，如在其它连续表面中的孔或孔隙的阵列的情况。由间隙区域提供的分离可以是部分的或完全的分离。间隙区域通常将具有表面材料，该表面材料不同于表面上的特征的表面材料。例如，阵列的特征可以具有脂质材料或蛋白材料的量或浓度，所述脂质材料或蛋白材料的量或浓度超过存在于间隙区域的量或浓度。在一些实施方案中，脂质材料或蛋白材料可以不存在于间隙区域。

间隙区域可以在本文阐述的装置中将脂质纳米盘分离至少1nm、5nm、10nm、100nm、1000nm或更多。可选地或另外地，分离可不超过1000nm、100nm、50nm、10nm或5nm。

如本文所用的术语“蛋白纳米孔”是指形成为一种或更多种亚基以产生通过膜或固体支撑物的孔隙的多肽。示例性的蛋白纳米孔包括α-溶血素、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋白A(MspA)、短杆菌肽A、麦芽糖孔蛋白、OmpF、OmpC、PhoE、Tsx、F-菌毛、SP1(Wang等，Chem.Commun.，49：1741-1743，2013)和线粒体孔蛋白(VDAC)XX、Tom40(美国专利号6,015,714和Derrington等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，107：16060(2010))。“耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)”是由分枝杆菌产生的膜孔蛋白，允许亲水性分子进入细菌。MspA形成紧密相连的八聚体和跨膜β桶状结构，其类似于杯状物并且包含中心通道/孔。其它有用的孔在US8,673,550中阐述。上述每一个纳米孔参考文献通过引用并入本文。

如本文所用的，术语“混合纳米孔”旨在表示由生物和非生物来源的材料制成的孔隙，其延伸穿过屏障(诸如膜)，例如其允许水合离子和/或水溶性分子从屏障的一侧穿透到屏障的另一侧。生物来源的材料如上定义，并且包括：例如多肽和多核苷酸。生物和固态混合孔包括：例如多肽-固态混合孔和多核苷酸-固态孔。

如本文所用的术语“拴系”旨在指通过接头部分附接的两个物品的状态。附接可以是共价的，例如，使得连续的共价键链连接两个物品。可选地，附接可以通过至少一个非共价键介导，所述非共价键诸如受体和配体之间的特异性结合相互作用。示例性的受体-配体对包括但不限于链霉亲和素(及其类似物)和生物素(或其类似物)；抗体(或其功能片段)和表位；凝集素和碳水化合物；互补核酸，核酸结合蛋白及其核酸底物。

“系链”是可任选地用于附接两个物品的接头部分。在一些配置中，系链附接到单个物品，诸如纳米孔、脂质、膜材料或固体支撑物。附接到一个物品的系链可以任选地附接到第二物品或用于其他目的。系链可以包括核苷酸或核酸材料。可选地，系链可以由除了核酸材料之外的材料制成或可以没有核苷酸。

在具体实施方案中，检测装置可以包括固态纳米孔，所述固态纳米孔在由固体支撑物分离的贮存器之间形成孔隙。

在特定实施方案中，在固态纳米孔上形成的密封部防止流体流动和/或电流流动。然而，蛋白纳米孔可以在密封部中形成孔隙。

蛋白纳米孔可以占据脂质纳米盘表面上直径至少约5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm或更大的区域。可选地或另外，蛋白纳米孔可以占据脂质纳米盘表面上直径至多约1微米、500nm、100nm、10nm、9nm、8nm、7nm、6nm、5nm或更小的区域。

在具体实施方案中，检测装置可以包括至少10、100、1x 10³、1x 10⁴、1x 10⁵、1x10⁶或更多个固态纳米孔。

在具体实施方案中，检测装置可以包括覆盖至少10、100、1x 10³、1x 10⁴、1x 10⁵、1x 10⁶或更多个固态纳米孔的脂质纳米盘。不论固态纳米孔的总数，脂质纳米盘可以覆盖检测装置的固态纳米孔的至少10％、25％、50％、75％、90％、95％、99％或更多。因此，检测装置可以包括至少10、100、1x 10³、1x 10⁴、1x 10⁵、1x 10⁶或更多个纳米盘。

在具体实施方案中，检测装置可以包括在脂质纳米盘中覆盖至少10、100、1x 10³、1x 10⁴、1x 10⁵、1x 10⁶或更多个固态纳米孔的蛋白纳米孔。不论固态纳米孔的总数，蛋白纳米孔可插入到脂质纳米盘，所述脂质纳米盘覆盖检测装置的固态纳米孔的至少10％、25％、50％、75％、90％、95％、99％或更多。因此，检测装置可以包括具有插入的纳米孔的至少10、100、1x 10³、1x 10⁴、1x 10⁵、1x 10⁶或更多个纳米盘。

本公开内容的检测装置可以用于检测多种分析物中的任何一种，所述分析物包括但不限于离子、核酸、核苷酸、多肽、生物活性小分子、脂质、糖等。因此，这些分析物中的一种或更多种可以存在于或穿过本文阐述的装置中的蛋白纳米孔的孔隙。

在具体实施方案中，检测装置可以包括与固态纳米孔阵列接触的顺式贮存器，和与固态纳米孔阵列接触的反式贮存器。顺式和反式贮存器可以含有电极，所述电极被定位以施加电流通过由蛋白纳米孔形成的孔隙。顺式贮存器、反式贮存器或两者可以被配置以保持液体与本文阐述的装置中的多个纳米孔大量流体连通。可选地，贮存器中的一个或两个可以与本文阐述的阵列或装置中发现的纳米孔的仅一个或仅一个子集接触。

在具体实施方案中，覆盖本文阐述的阵列的固态纳米孔的每个脂质纳米盘将具有插入其中的不超过一个蛋白纳米孔。然而，制备和使用每个固态纳米孔插入多于一个单板纳米孔的装置也是可能的。类似地，单个纳米盘，无论是否覆盖固态纳米孔，可以包括不超过一个蛋白纳米孔。可选地，单个纳米盘可以包括多于一个蛋白纳米孔。

脂质纳米盘可以由多种膜或脂质中的任何一种制成。合适的脂质双层和用于制备或获得脂质双层的方法是本领域公知的，并公开在例如US2010/0196203和WO 2006/100484中，其各自通过引用并入本文。合适的脂质双层包括：例如细胞膜、细胞器的膜、脂质体、平面脂质双层和支撑的脂质双层。例如，脂质双层可以由两个相对的磷脂层形成，布置所述两个相对的磷脂层使得它们的疏水性尾部基团朝向彼此以形成疏水性内部，而脂质的亲水性头部基团在双层的每一侧面向水性环境。例如，脂质双层也可以通过Montal和Mueller(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1972；69：3561-3566，通过引用并入本文)的方法形成，其中在穿过垂直于水溶液/空气界面的孔隙的任一侧的该界面上携带脂质单层。通常通过首先将脂质溶解在有机溶剂中，然后允许溶剂滴在孔隙的任一侧上的水溶液的表面上蒸发，将脂质添加到电解质水溶液的表面。有机溶剂蒸发后，孔隙的任一侧上的溶液/空气界面物理地上下移动通过孔隙直到形成双层。双层形成的其他常见方法包括尖端浸渍、涂覆双层和脂质体双层的膜片钳。用于获得或产生膜的多种其它方法是本领域公知的，并且同样可适用于本公开内容的组合物和方法(例如，关于混合纳米孔的那些或关于拴系纳米孔的那些)中。以上阐述的试剂和方法还可以与拴系的纳米孔组合使用或在膜材料被拴系于电极或其它固体支撑物的实施方案中使用。

本公开内容还提供了一种制造检测装置的方法。该方法可以包括以下步骤：(a)提供具有固态纳米孔阵列的固体支撑物；(b)提供多个脂质纳米盘，其中脂质纳米盘包括插入脂质中的蛋白纳米孔；(c)使多个脂质纳米盘与固态纳米孔阵列接触，以用脂质纳米盘之一覆盖阵列的单个固态纳米孔。该方法可以用于制造具有在本文其他地方阐述的一个或更多个特征的检测装置。

在具体实施方案中，步骤(b)还可以包括在用于将蛋白纳米孔插入脂质纳米盘的条件下用脂质培育蛋白纳米孔。例如，脂质可以是洗涤剂增溶的，并且条件可以包括用于从蛋白纳米孔去除洗涤剂的技术。

如本文其他地方阐述的，脂质纳米盘可以被电吸引到固态纳米孔(例如通过电泳)。任选地，脂质纳米盘可以包括带电的系链以介导吸引。作为一个示例，带电的系链可以是以天然存在的形式或以非天然存在的类似物形式的核酸。系链的附接位点可用于将具有特定取向的纳米盘插入固态纳米孔内。这允许蛋白纳米孔在固态纳米孔内在正向或反向方向上取向。系链附接位点的混合物可以产生穿过固态纳米孔阵列的任何期望的正向到反向生物孔的比率。通过放置系链的类似的纳米孔方向的控制可以在纳米孔系链被附接到电极的实施方案中实现。

为了增强从溶液的分析物捕获并促进分析物在固态纳米孔膜的平面内二维扩散到生物纳米孔附近，固态纳米孔膜可以用与分析物可逆地相互作用的化合物衍生。可以选择分析物和膜之间的动力学开/关速率，以允许分析物跨越固态纳米孔膜的表面的快速随机游走。这种相互作用的示例包括与脂质单层或双层的胆固醇标签相互作用、与DNA表面的DNA标签相互作用，以及其它相互作用，诸如Yusko等，Nat Nanotechnol 6(4)：253-260(2011)中阐述的那些。DNA标签与DNA表面的相互作用可以通过使用重组酶来促进，所述重组酶允许通过跨越固态纳米孔膜的表面的链入侵的游走。

在所述方法的一些实施方案中，与固态纳米孔阵列接触的脂质纳米盘的数量超过阵列中固态纳米孔的数量。脂质纳米盘可以包括插入的蛋白纳米孔。因此，不需要依赖泊松统计来获得具有仅一个蛋白纳米孔的固态纳米孔。而是，饱和量的脂质纳米盘(具有或不具有插入的蛋白纳米孔)可以与固态纳米孔阵列接触。例如，脂质纳米盘(具有或不具有插入的蛋白纳米孔)的量可以超过固态纳米孔的量至少2倍、5倍、10倍或更多。

本公开内容提供一种检测装置，其包括(a)电极；(b)被拴系到电极的纳米孔；和(c)围绕纳米孔的膜。还提供了多个实施方案。例如，本公开内容的检测装置可包括(a)多个电极；(b)多个纳米孔，每个纳米孔被拴系到多个电极中的一个电极；和(c)围绕每个纳米孔的膜。

在本公开内容的方法或装置中使用的电极可以由在纳米孔检测设备或用于电化学过程的其它设备中使用的各种材料中的任意一种制成。在特定实施方案中，电极由金属制成。电极可以在固体支撑物上图案化，使得支撑物包括多个电极。例如，固体支撑物可以包括至少1、2、10、100、1x 10³、1x 10⁴、1x 10⁵、1x 10⁶或更多个电极。可选地或另外，固体支撑物可以包括不超过1x 10⁶、1x 10⁵、1x 10⁴、1x 10³、100、10、2或1个电极。

在固体支撑物上的电极可以被间隙区域彼此分离，所述间隙区域缺少电极材料或以其它方式不导电。因此，电极可以是在空间上和功能上离散的。在一些实施方案中，每个电极位于固体支撑物上的阱(well)或其他凹陷特征内，并且凹陷特征的壁用作电极之间的间隙区域。间隙区域可以分离固体支撑物上的电极，使得电极的平均间距(中心到中心)间隔例如为至少5nm、10nm、25nm、50nm、100nm、1μm、10μm、100μm或更大。可选地或另外，间距可以是例如不超过100μm、10μm、1μm、100nm、50nm、25nm、10nm、5nm或更小。在一些实施方案中，间隙区域也可以缺少脂质或纳米孔或本文描述的被附接到电极的其它材料。

在本文阐述的装置或方法中使用的电极可以具有实现检测装置的期望用途的各种尺寸或形状中的任何一种。例如，电极可以具有圆形、矩形、正方形、多边形等的封装(footprint)。由电极占据的面积可以是例如至少25nm²、100nm²、500nm²、1μm²、50μm²、100μm²、1mm²或更大。可选地或另外，电极的面积可以是例如至多1mm²、100μm²、50μm²、1μm²、500nm²、100nm²、25nm²或更小。

在特定实施方案中，电极可以至少部分地被电介质垫覆盖。电介质垫可以提供与分子(诸如系链分子)相互作用的反应部分，以实现分子到电介质垫的附接。硅烷偶合化学反应对于偶合特别有用。示例性的偶合化学反应在美国专利申请公布号2014/0200158 A1或2015/0005447 A1中阐述，其各自通过引用并入本文。附接到电介质垫的分子将通过电介质垫有效地附接到电极。

在本文阐述的方法或装置中使用的电介质垫可以具有在上面针对电极示例的范围内的面积。在一些情况下，电介质垫将占据电极表面的一定比例，所述比例为电极表面的至多75％、50％、25％、10％、5％、1％或更少。特别有用的电介质垫将具有与纳米孔的封装相当或更小的面积。因此，电介质垫将具有一个且仅一个纳米孔的容量。所得的空间排斥允许具有电介质垫的电极阵列与过量的纳米孔(即，大于阵列中的电极数量的纳米孔的数量)接触，使得所有或大部分电极可以附接到纳米孔，同时避免在单个电极处附接多个纳米孔的风险，如果不实现空间排斥则可能发生这种风险。

本文阐述的或本领域另外已知的多种纳米孔的任何一种可以用于本文阐述的系链附接实施方案中。特别有用的纳米孔是蛋白纳米孔，诸如Msp A。

纳米孔可以使用共价部分或非共价结合部分拴系到电极(例如通过电介质垫)。共价连接的示例是当核酸系链共价附接到纳米孔并共价附接到电介质垫时。其它系链可类似地用于共价附接，所述其它系链包括例如非核酸系链，诸如聚乙二醇或其它合成聚合物。非共价附接的示例是当纳米孔具有附接的亲和部分时，诸如聚组氨酸标签、链霉亲和素-标签(Strep-tag)或其它氨基酸编码的亲和部分。亲和部分可非共价地结合到电介质垫上的配体，诸如结合多组氨酸的镍或其它二价阳离子或结合链霉亲和素-标签的生物素(或其类似物)。在一些实施方案中，不需要使用这种氨基酸亲和部分。

本文阐述的装置可以包括任何数量的所需的拴系的纳米孔。例如，装置可以包括至少1、2、10、100、1x 10³、1x 10⁴、1x 10⁵、1x 10⁶或更多个拴系的纳米孔。可选地或另外，装置可以包括不超过1x 10⁶、1x 10⁵、1x 10⁴、1x 10³、100、10、2或1个拴系的纳米孔。

多种膜材料中的任何一种可用于本文阐述的纳米孔拴系实施方案中。可以使用的示例性脂质包括本文在纳米盘实施方案的上下文中阐述的那些或在那些实施方案的上下文中引用的参考文献中阐述的那些。其它有用的脂质材料在美国专利号8,999,716中阐述，其通过引用并入本文。

在具体实施方案中，膜可以被拴系到电极。膜可以被拴系到纳米孔也被拴系(例如，经由电介质垫)到其上的电极。用于将膜材料附接到电极的系链可以选自本文关于纳米孔系链所示例的那些。具有反应性硫醇的系链可特别地用于附接到含金电极。其它系链也是可能的，包括例如具有硅烷或膦酸酯反应基团的系链，其可用于附接到导电金属氧化物(参见例如Folkers等，Langmuir 11：813(1995)，其通过引用并入本文)。在一些实施方案中，与用于纳米孔的系链相比，不同的系链材料被用于膜材料。可选地，相同的系链类型可用于纳米孔和膜材料二者。应当理解的是，在一些实施方案中，或在检测装置的制备的一些阶段中，围绕纳米孔的膜材料不需要被拴系到纳米孔被拴系至其的电极上。

在一些检测装置中，特别是具有多个电极的检测装置中，围绕每个纳米孔的膜可以形成用于纳米孔被拴系到的电极的密封部。可以制作密封部以防止流体或电流从纳米孔被拴系的电极到检测装置的其他电极的流动。例如，电极可以出现在阱(或其他凹陷特征)内，并且膜可以通过形成接触阱壁的连续片来密封阱。因此，在由电极、阱的壁和膜限定的空间内形成腔室。根据电极的相对方向和插入的纳米孔的方向，腔室可以用作顺式或反式腔室。

如下文进一步详细阐述的，具有拴系的纳米孔的检测装置可以特别用于核酸检测，包括在测序方法中的核酸检测。因此，检测装置可以在核酸分析物位于由纳米孔形成的孔隙中时的状态下发生。作为待检测的分析物的核酸与可用作装置中的系链的核酸是有区别的和不同的。

检测装置可以包括用于检测纳米孔的其它硬件，诸如被配置以产生跨越膜和穿过纳米孔的电流的电极、被配置以放大在纳米孔处产生的电信号的放大器、耦合到装置以评估从一个或更多个纳米孔检测的信号的计算机等。可用于检测来自纳米孔的信号并且可以被修改以用于本文阐述的方法的硬件在本领域中被描述，例如，美国专利号8,673,550或8,999,716；Rosenstein等，Nano Lett 13,2682-2686(2013)；或Uddin等，Nanotechnology24,155501(2013)，其各自通过引用并入本文。

在图12中示出了将纳米孔拴系到电极的方法的示例性实施方案。提供了一种金属电极，该电极的表面具有覆盖该表面的一部分的电介质垫。例如，电介质垫可以是直径约为10nm-50nm的近似圆形的垫。电介质垫可以具有能够与存在于纳米孔系链上的部分形成共价键的反应性硅烷。纳米孔可以被化学修饰以包括具有所述部分的核酸系链。然后，可以在硅烷与系链反应以将纳米孔共价附接到电介质垫的条件下使含有系链的纳米孔与电介质垫接触。纳米孔已经附接后，膜系链可以与电极的金属表面反应。例如，膜系链可包括与金属表面形成共价键的硫醇。在所示的最后一个步骤中，膜材料(例如脂质材料)可以在形成围绕拴系的纳米孔的膜(例如脂质双层)，并在膜系链和双层中的脂质之间形成共价键的条件下与系统接触。因此，膜也被拴系到电极。

在图13中示出了另一个实施方案。方法使用与图12中使用的那些类似的组件。然而，这里膜系链在附接纳米孔之前附接到电极的金属表面。

在图14中示出了另一示例性实施方案。在该实施方案中，金属电极不包括电介质垫。在第一步中使金属电极与膜系链反应。然后，使用纳米印刷技术(诸如光刻)将纳米孔系链附接到金属电极的表面。纳米孔系链可在小区域中印刷(例如直径约10nm-50nm的近似圆形区域)。然后，可以在产生纳米孔和系链之间的共价键的条件下使纳米孔与含系链的电极接触。在最后步骤中，可以在拴系的纳米孔周围形成膜(例如脂质膜)，并与膜系链反应以变得附接到电极。

在具体实施方案中，多个纳米孔与多个电极体接触(bulk contact)。例如，包括纳米孔的溶液可以与具有多个电极的固体支撑物接触，使得溶液中的纳米孔与多个电极流体连通。与电极阵列接触的纳米孔的数量可以超过阵列中的电极的数量。这可以被进行，例如，以增加大多数或所有电极将被拴系到纳米孔的可能性。电极可以被配置以具有不超过一个纳米孔的容量。例如，电极可具有与纳米孔的尺寸相比相对小的表面或表面部分。因此，第一纳米孔附接到电极后，随后纳米孔在空间上被排除于附接到同一电极。因此，阵列可以包括具有单个纳米孔的电极的数目超过从典型的泊松统计所预期的数目。例如，阵列可以在阵列中的电极的至少50％、65％、75％、90％、95％、99％或更多的每一个处用单个纳米孔加载。

与膜材料接触的纳米孔可以是洗涤剂增溶的。然后，可以从蛋白纳米孔中除去洗涤剂，以允许膜(例如脂质双层)包围纳米孔。例如，纳米孔附接到电极表面后，可以进行原位透析。示例性的原位透析方法和系链组成在Giess等，Biophysical J.87：3213-3220(2004)中阐述，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，纳米孔可以被电吸引到电极以促进附接。可以基于固有电荷吸引纳米孔。然而，使用带电的系链(诸如核酸)并将系链吸引到电极也是可能的。用于将核酸电辅助定位到电极的示例性方法在美国专利No.8,277,628中被阐述，其通过引用并入本文。

本文描述的或本领域已知的多种系链的任何一种可以用于本文阐述的方法中。特别有用的系链是核酸系链。在一些实施方案中(诸如图12和图13中示例的那些实施方案)，系链可在将系链附接到电极之前附接到纳米孔。可选地，例如如图14所示，纳米孔系链可以首先附接到电极，并且然后使纳米孔与纳米孔系链反应，以在纳米孔和系链之间产生附接。

本文阐述的方法可以包括通过系链将膜材料附接到一个或更多个电极的步骤。特别有用的膜系链是具有亲脂性结构域和亲水性间隔物的双功能分子。亲脂性结构域(例如磷脂、胆固醇或植烷基)插入膜中，并且亲水性间隔物可附接于固体支撑物(诸如电极)。示例性膜系链阐述于例如Giess等，Biophysical J.87：3213-3220(2004)，其通过引用并入本文。

本公开内容还提供了一种测序核酸的方法。该方法可以包括以下步骤：(a)提供检测装置，其具有：(i)包含固态纳米孔阵列的固体支撑物；(ii)在固体支撑物的表面上的多个脂质纳米盘，其中每个脂质纳米盘在每个固态纳米孔处形成密封部，并且其中脂质纳米盘被在固体支撑物的表面上的间隙区域彼此分离；和(iii)多个蛋白纳米孔，其插入脂质纳米盘中以在每个密封部中产生孔隙；和(b)检测以下物质穿过每个密封部中的孔隙的通过：(i)核酸，(ii)从核酸去除的一系列核苷酸，或(iii)源自掺入到核酸中的核苷酸的一系列探针，从而确定核酸的序列。

还提供了测序核酸的方法，其包括以下步骤：(a)提供检测装置，其包括(i)多个电极，(ii)多个纳米孔，每个纳米孔被拴系到多个电极中的电极，和(iii)围绕每个纳米孔的膜；和(b)检测以下物质穿过每个纳米孔的通过：(i)核酸，(ii)从核酸去除的一系列核苷酸，或(iii)源自掺入核酸中的核苷酸的一系列探针，从而确定核酸的序列。

在本公开内容的方法中检测的核酸可以是单链、双链或包含单链和双链序列。核酸分子可以起源于双链形式(例如dsDNA)，并且可以任选地被转化为单链形式。核酸分子还可以起源于单链形式(例如ssDNA、ssRNA)，并且ssDNA可以任选地被转化为双链形式。通过孔移位多核苷酸的示例性模式在WO 2013 057495中阐述，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，测序可以通过使核酸通过蛋白纳米孔并检测指示特定核苷酸或核苷酸系列(例如由2、3、4、5或更多个核苷酸组成的“表达(word)”)的通过的电信号来进行。在一些实施方案中，可以在分子马达(诸如解旋酶、移位酶或聚合酶)的引导下针对电位差实现多核苷酸通过纳米孔的一定水平的受控移位。分子马达可以用步进式的方式(通常以每个步骤一个或更多个核苷酸)移动多核苷酸。这种受控棘轮效应减慢了通过纳米孔的多核苷酸移位，从微秒/核苷酸的天然速率减慢到毫秒/核苷酸。

检测方法可以利用跨越屏障(例如，膜)的位差。位差可以是电位差、化学位差或电化学位差。可以通过将电流注入或施加到最后一个液体池的电压源跨越屏障(例如，膜)施加电位差。可以通过两个池的离子组成中的差异跨越屏障施加化学位差。可以通过两个池的离子组成与电位的组合的差异来建立电化学位差。例如，不同的离子组成可以是每个池中不同的离子或每个池中不同浓度的相同离子。

跨越孔施加电位以迫使核酸通过孔的移位是本领域熟知的，并且可以根据本发明的装置和方法使用(Deamer等，Trends Biotechnol.，18：147-151(2000)；Deamer等，AccChem Res.，35：817-825(2002)；和Li等，Nat Mater.，2(9)：611-615(2003)，其各自通过引用并入本文)。本文阐述的方法可以在跨越孔施加电压的情况下进行。电压的范围可以选自40mV至高于1V。通常，本文阐述的方法将在100mV至200mV的范围内运行。在特定情况下，该方法在140mV或180mV运行。在马达的运动期间，电压不需要是静态的。通常施加电压极性，使得带负电荷的核酸被电泳驱动到孔中。在一些情况下，可以减小电压，或者反转极性，以促进适当的功能。

在一些情况下，施加压力差可以用于迫使核酸移位通过孔。压力差可以用于代替本文示例的方法中的电位差或其它位差。可选地，压力差可以与本文示例的方法中的电位差或其它位差组合使用。

本公开内容的方法可以产生对应于一个或更多个核苷酸通过孔的移位的一个或更多个信号。因此，例如由于缩窄的碱基依赖性(或探针依赖性)堵塞，跨越屏障的电流改变，作为靶多核苷酸，或作为源自靶多核苷酸或者单核苷酸的单核苷酸或探针，穿过孔。来自该电流变化的信号可以使用本文描述的或本领域另外已知的多种方法中的任何一种来测量。每个信号对于孔中核苷酸(或探针)的种类是独特的，使得所得信号可用于确定多核苷酸的特征。例如，可以确定产生特有的信号的一种或更多种核苷酸(或探针)的身份。在本发明的方法中有用的信号包括例如电信号和光信号。在一些方面，电信号可以是电流、电压、隧道效应(tunneling)、电阻、电压、电导的测量；或横向电测量(参见WO 2013/016486，其通过引用并入本文)。在一些方面，电信号是通过孔的电流。

在本公开内容的方法中有用的光信号包括例如荧光和拉曼信号。可以通过将靶核苷酸与产生光信号的标记(例如荧光部分或产生拉曼信号的部分)耦合来产生光信号。例如，在dela Torre等，Nanotechnology，23(38)：385308(2012)中，采用全内反射荧光(TIRF)显微术的光学方案来照射大面积的TiO₂涂覆的膜。在Soni等，Rev Sci lustrum.，81(1)：014301(2010)中，使用一种方法用于整合两个单分子测量模态，即全内反射显微术和使用纳米孔的生物分子的电检测。上述两篇参考文献被并入本文。

如本文所述，纳米孔(无论混合纳米孔或拴系的纳米孔)可以与检测电路耦合，检测电路包括例如膜片钳电路、隧道电极电路或横向电导测量电路(诸如石墨烯纳米带，或石墨烯纳米隙(nanogap))，以记录本公开内容的方法中的电信号。此外，孔还可以与检测多核苷酸上的标记(例如荧光部分或拉曼信号产生部分)的光学传感器耦合。

分子马达可以使用核苷酸水解的能量来驱动靶多核苷酸通过纳米孔的移位。解旋酶是其中ATP水解是多核苷酸移位的能量来源的示例。例如，在一个模型中，单链多核苷酸保持在带负电荷的裂口中，所述带负电荷的裂口将解旋酶的两个RecA结构域与第三结构域分离。在不存在ATP的情况下，书夹残基(bookend residue)(例如，HCV解旋酶中的Trp501)和钳残基(clamp residue)(例如，HCV解旋酶中的Arg393)防止单链多核苷酸滑动通过裂口。在ATP结合后，RecA结构域旋转，移动带正电荷的Arg-钳。Arg-钳吸引带负电荷的单链多核苷酸，其转而清除书夹。然后，单链多核苷酸被带负电荷的裂口排斥，并且单链多核苷酸通过解旋酶移位直到ATP被水解。因此，在该示例性模型中，通过解旋酶的多核苷酸移位包括至少两个步骤：第一步，其中解旋酶结合ATP并经历构象变化；第二步，其中ATP被水解并且多核苷酸通过解旋酶移位。

可应用于本文阐述的装置的其他检测技术包括但不限于检测事件，诸如分子或该分子的一部分的运动，特别是当分子是DNA或结合DNA的酶，诸如聚合酶时。例如，Olsen等，JACS 135：7855-7860(2013)，其通过引用并入本文，公开了将DNA聚合酶I的Klenow片段(KF)的单分子生物缀合进入电子纳米电路，以允许酶功能和单个核苷酸掺入事件的分辨率的动态变化性的电记录。或，例如，Hurt等，JACS 131：3772-3778(2009)，其通过引用并入本文，公开了在施加的电场中测量纳米孔顶上的DNA与KF的复合物的停留时间。或，例如，Kim等，Sens.Actuators B Chem.177：1075-1082(2012)，其通过引用并入本文，公开了在涉及在α-溶血素纳米孔中捕获的DNA的实验中使用电流测量传感器。或，例如，Garalde等，J.Biol.Chem.286：14480-14492(2011)，其通过引用并入本文，公开了当在α-溶血素孔顶部的电场中捕获时基于它们的性质区分KF-DNA复合物。公开涉及α溶血素测量的其他参考文献包括以下：都属于Howorka等，其通过引用并入本文：PNAS 98：12996-13301(2001)；Biophysical Journal 83：3202-3210(2002)；和Nature Biotechnology 19：636-639(2001)。

通过引用并入本文的属于Turner等的美国专利号8,652,779公开了使用单一聚合酶复合物测序核酸的组合物及方法，所述组合物及方法包括聚合酶和近端附接纳米孔的模板核酸和溶液中的核苷酸类似物。核苷酸类似物包括附接核苷酸类似物的多磷酸部分的电荷阻断标记，使得当核苷酸类似物掺入生长的核酸中时，电荷阻断标记被切割。根据Turner的文献，电荷阻断标记被纳米孔检测以确定掺入的核苷酸的存在和身份，并从而确定模板核酸的序列。美国专利公布号2014/0051069(其通过引用并入本文)涉及包含跨膜蛋白孔亚基和核酸操作酶的构建体。

实施例I

实验设计的两个主要推力是：(a)工程化、合成和纯化蛋白-纳米盘复合物；和(b)通过电泳力在固态纳米孔平台上组装复合物。可以通过将聚电解质或DNA分子附接在盘或成孔蛋白上来增强电泳驱动力。可需要另外的表面处理以改善脂质盘-固体纳米孔界面上的绝缘。

特定目的#1：演示将MspA纳米孔掺入脂质纳米盘

重要事件：(a)组装和表征空白脂质纳米盘；(b)工程化具有His标签的MspA蛋白，用于分离和纯化目的；(c)将MspA蛋白掺入脂质纳米盘中，纯化产物并表征形态。

合成生物孔掺入的脂质纳米盘

空白脂质纳米盘通过脂质和MSP比例的滴定合成。上面结合图3回顾了实验方法。制备具有C-末端His-标签的生物孔突变体。在除去洗涤剂之前将His加标签的生物孔突变体加入到纳米盘前体混合物中，使得生物孔掺入将在脂质纳米盘自组装过程期间发生。过量的纳米盘组分用于确保高产率的掺入。纳米孔-纳米盘复合物通过His标签亲和柱与空纳米盘分离。通过尺寸排阻色谱法(SEC)和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)监测和分析整个过程，并且通过液相原子力显微术和透射电子显微术进一步表征。

特定目的#2：实现插入固态纳米孔的脂质纳米盘的>100GΩ密封

重要事件：(a)建立纳米孔和电泳基础设施；(b)将空白脂质纳米盘电泳组装到固态纳米孔上；(c)如果需要，化学官能化固态纳米孔以确保>100GΩ密封；(d)在混合系统中证明MspA生物孔隙活性。

构建固态纳米孔系统

固态纳米孔的制造方法历史上已经使用能量束钻孔，例如用在透射电子显微镜(TEM)中的电子束(例如参见Storm等，Nature Materials 2,537-540(2003)，通过引用并入本文)或聚焦离子束(FIB)中的Ga离子束(参见例如Patterson等，Nanotechnology 19,235304(2008)，通过引用并入本文)或氦离子束(HIB)(参见例如Yang等，Nanotechnology22,285310(2011)，通过引用并入本文)。7nm-10nm纳米孔的商业供应将用于初始示范和系统开发。所需设备的初始原型设计如上面关于图6A和图6B阐述的进行。电生理学工具诸如膜片钳放大器和电化学工作站，并且洁净室设施被用于另外的纳米制造工作。

实现具有>100GΩ电阻的脂质纳米盘密封的纳米孔

在过去十年中，电泳驱动的生物分子通过固态纳米孔的移位已经被广泛研究。相同的策略可以应用于用相对大尺寸的脂质纳米盘密封固态纳米孔，留下并入的蛋白纳米孔作为离子电流的唯一路径，并且是将由穿过孔的通过检测的分析物的唯一路径。用空白脂质纳米盘(无生物孔)测试密封效率。由于脂质纳米盘是轻微带电的，因此可以利用用胆固醇-TEG衍生化的DNA分子来改善捕获脂质纳米盘的电泳效果。胆固醇加标签的DNA倾向于通过将疏水性胆固醇单位插入膜中来结合脂质膜。在图8中示出了具有核酸系链的空白纳米盘的图解表示。

电场通过捕获高度带电的DNA链来引导含有系链的纳米盘。捕获概率也受纳米孔尺寸、离子强度、电压和粘度的影响，其可以被调节以实现期望的加载。在该中间步骤，将DNA系链多重插入单个纳米盘中是可能的，但不应影响评估纳米盘和固态纳米孔表面之间的密封效率的能力。

例如，在不完全经由电泳作用创建密封的实施方案中，可以使用另外的修改来实现>100GΩ的密封。如果需要，固态纳米孔可以被官能化以密封界面泄漏路径。确保界面的疏水性可以防止溶剂化离子的转运。一种技术是用胆固醇衍生物涂覆固态纳米孔的顶部表面，所述胆固醇衍生物确保表面是疏水性的，同时还将它们的疏水性末端基团插入膜中。在图9中示出了可以使用的特定表面化学反应。

另一种方法是脂质纳米盘的局部拴系，例如，如在Stackmann Science 271,43-48(1996)；Steinem等，Biochim.Biophys.Acta,1279,169-180(1996)；Vallejo，Bioelectrochemistry 57,1-7(2002)；和Avanti Polar Lipids，Inc.(2013年10月)，“Preparation of Liposomes”，获得自http://avantilipids.com/index.php？option＝com_content&id＝1384&Itemid＝372If中描述的，其各自通过引用并入本文。可选地或另外，可用膜涂覆Si₃N₄芯片的整个表面，例如，如Yusko等，Nature Nanotech 6,253(2011)中描述的，其通过引用并入本文。然后，可以在形成该膜涂层之后直接插入MspA生物孔。可以利用空间位阻来确保只有单个孔蛋白可以插入每个孔隙，并且从3维(即在溶液中)到2维(即在膜中)的扩散的有效转化可以提供足够的插入效率。可以获得直径为约100nm的大单层囊泡(参见例如Avanti Polar Lipids，Inc.(2013年10月)，“Preparation ofLiposomes”，获得自http://avantilipids.com/index.php？option＝com_content&id＝1384&Itemid＝372If，其通过引用并入本文)并且可以桥接较小的固态纳米孔(例如本实施例中描述的～10nm的纳米孔)。

另外，可以进行固态纳米孔的化学官能化以防止沿着脂质纳米盘和固态纳米孔之间的界面的任何残留泄漏路径。因此，脂质盘将与之接触的固态纳米孔的顶表面可以用疏水性自组装分子化学官能化。可用于官能化的示例性部分是胆固醇衍生物，其可将其疏水部分插入膜中，结果防止水合离子沿着界面迁移。将胆固醇衍生物缀合到固体基底上的有用的表面化学反应在图9中被示例说明。

表面官能化可以改变固态纳米孔的电特性。通过减少与固体表面的DNA相互作用的粘附事件，该效果可以是有益的。然而，固态纳米孔疏水性的增加可能影响其传输性质(参见例如Powell等，Nature Nanotechnology 6,798-802(2011)，其通过引用并入本文。可以平衡这两个效应以实现最佳系统性能)。

测试作为混合纳米孔装置的一部分的生物孔活性

具体目的#2b将演示脂质纳米盘/生物孔复合物在固态纳米孔上的组装。可以在核酸测序条件下表征混合纳米孔的电学表征、噪声水平和稳定性。混合纳米孔可以具有比常规蛋白纳米孔设备更高的噪声，主要由通过硅支撑基底的电容耦合贡献。参见例如Waggoner等，Journal of Vacuum Science&Technology B 29,032206(2011)，其通过引用并入本文。可以通过流体接触区域的树脂钝化或在Si₃N₄膜和Si基底之间添加微米厚的SiO₂来优化噪声水平，例如使用在Rosenstein等，Nature Methods 9,487-492(2012)中阐述的技术和材料，其通过引用并入本文。当前的纳米孔测序化学反应在接近中性pH缓冲液中包含聚合酶、ATP和盐，预期其不影响脂质盘/生物孔复合物的稳定性。混合纳米孔的性能可以针对常规的脂质支撑的生物孔进行基准(benchmark)，以表征其性能。

实施例II

该实施例描述了实施例I的具体目的#1的进展。更具体地，建立了以下方案：(a)组装和表征具有10nm-13nm直径的空白脂质纳米盘，和(b)将MspA纳米孔蛋白掺入到脂质纳米盘中，并表征复合物的形态。

如图10所示，使用快速蛋白液相色谱(FPLC)来优化纳米盘形成和MspA插入。底部轨迹(黑色)仅用于纳米盘，显示来自FPLC仪器的良好限定的洗脱峰。将MspA加入到前体混合物中使反应不稳定，并导致在较高分子量处的第二洗脱峰，如中间轨迹(红色)所示。行为类似于在过量脂质存在下的纯纳米盘合成的行为。虽然不一定旨在受假设的限制，在溶液中稳定MspA蛋白所需的表面活性剂表现为与纳米盘自组装过程相互作用。通过减少合成期间使用的脂质的量，恢复1/3正常行为，如通过顶部轨迹(蓝色)所示。

此外，对来自图10的两个洗脱级分(A和B)执行透射电子显微术(TEM)表征。在TEM成像之前用乙酸铀酰(uranyl acetate)染色样品以增强对比度。在图11A和11B中示出了所得的TEM图像。在两种样品中观察到MspA(具有黑点的盘)的表观插入，在高MW级分中具有如预期的重附聚(heavy agglomeration)。空白纳米盘(未示出)的TEM图像没有表现出这种特征。通过蛋白电泳和经由产物的金属柱纯化可以获得MspA插入的进一步确认，如实施例I的具体目的#1中所记录的。

上述结果证实了用于合成裸露纳米盘的方案的建立。此外，结果提供在自组装纳米盘中的MspA插入的原理证明的确认。

遍及本申请，引用了各种出版物、专利或专利申请。这些出版物公开的全部内容通过引用特此并入本申请。

在本文中术语包含旨在是开放式的，不仅包括所引用的要素，而且还包括任何另外的要素。

已经描述了多个实施方案。然而，应当理解的是，可以进行各种修改。因此，其他实施方案在所附权利要求的范围内。

Claims

1.一种检测装置，包括：

(a)固体支撑物，所述固体支撑物包含固态纳米孔阵列；

2.根据权利要求1所述的检测装置，其中所述固态纳米孔在由所述固体支撑物分离的贮存器之间形成孔隙。

3.根据前述权利要求中任一项所述的检测装置，其中离子电流明显地仅流过所述蛋白纳米孔而不通过所述密封部。

4.根据前述权利要求中任一项所述的检测装置，其中所述密封部防止流体或电流的流动。

5.根据前述权利要求中任一项所述的检测装置，其中所述固态纳米孔各自具有至少7nm的孔隙直径。

6.根据前述权利要求中任一项所述的检测装置，其中所述固态纳米孔各自具有至多5微米的孔隙直径。

7.根据前述权利要求中任一项所述的检测装置，其中所述蛋白纳米孔中的每一个占据所述纳米盘中的直径至少为5nm的区域。

8.根据前述权利要求中任一项所述的检测装置，其中所述蛋白纳米孔中的每一个占据所述纳米盘中直径至多为1微米的区域。

9.根据前述权利要求中任一项所述的检测装置，其中所述脂质纳米盘各自具有至少7nm的直径。

10.根据前述权利要求中任一项所述的检测装置，其中所述脂质纳米盘各自具有至多1微米的直径。