CN114630891A - 用于生物纳米孔的组装的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于制造和使用基于一种或多种天然生物纳米孔的检测装置的方法和组合物。使用包括但不限于核酸的检测和测序。本发明总体上涉及用于制备基于蛋白质的纳米孔传感器的新的方法和组合物，更具体地，涉及在脂质纳米盘中组装天然纳米孔蛋白质的方法，所述脂质纳米盘用作载体以将所述纳米孔递送至传感器系统的脂质膜组分，以及涉及使用它们特别是在基于纳米孔的核酸测序方法中使用它们的方法。

Description

用于生物纳米孔的组装的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2019年10月30日提交的美国临时专利申请号62/928,207的权益；其中该临时申请出于所有目的以引用方式整体并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及用于制备基于蛋白质的纳米孔传感器的新的方法和组合物，更具体地，涉及在脂质纳米盘中组装天然纳米孔蛋白质的方法，该脂质纳米盘用作载体以将纳米孔递送至传感器系统的脂质膜组分，以及涉及使用它们特别是在基于纳米孔的核酸测序方法中使用它们的方法。
背景技术
在过去二十年里，纳米孔传感器已经成为一种强大的工具，并对科学和生物技术产生了巨大的影响。纳米孔技术通常按其材料分为生物纳米孔和固态纳米孔。传统地，固态纳米孔是通过使用半导体或微流体技术，如硅或石墨烯基膜(诸如Si、SiN或SiO2)中的离子或电子束雕刻)钻出纳米级的孔来制造的。然而，大多数纳米孔应用(诸如DNA测序、小分子传感、药物筛选、分子筛分和生物分子分析)都需要高精度的几何结构、灵敏度和重现性，而这些是固态孔无法实现的。
DNA测序是纳米孔最重要和期望最高的应用。然而，DNA通过纳米孔的易位速度非常快(多个核苷酸在几微秒内通过纳米孔)，与之相关的主要问题导致每个碱基的数据点很少，这阻碍了数据的进一步分析。为了解决此类问题，Stratos Genomics开发了一种称为扩展测序(“SBX”)的方法，该方法使用生化过程将DNA序列转录到称为“Xpandomer”的可测量聚合物上(参见例如Kokoris et al.，U.S.Pat.No.7,939,259，″High Throughput NucleicAcid Sequencing by Expansion″)。转录的序列沿Xpandomer主链在高信噪比报告子中编码，所述报告子相隔约10nm，专为高信噪比、分化良好的反应而设计。这些差异在Xpandomer相对于天然DNA的序列读段效率和准确性方面提供了显著的性能增强。Xpandomer可以实现多种下一代DNA测序检测技术，并且非常适合纳米孔测序。
α-溶血素(α-HL)是用于单分子分析的最广泛使用的生物纳米孔，主要是由于其小内径和结构重现性。α-HL是一种单体多肽，在脂质双层膜中自组装以形成跨膜七聚孔，其具有2.6nm直径的前庭和1.5nm直径的极限孔径(孔的最窄点)。α-HL纳米孔的极限孔径允许尺寸与单链DNA属于同一量级的线性分子通过或“易位”；然而，直径大于约2.0nm的分子，例如双链DNA，则被阻止易位。尽管α-HL(以及其它寡聚、跨膜蛋白质纳米孔)在DNA测序中具有优势，但其仍然具有固有的结构限制，例如，由于天然寡聚体在水溶液中的稳定性降低以及天然蛋白质在脂质膜中的组装不完全，从而需要改进的方法和组合物来制备生物纳米孔传感器。
本发明满足这些需要并提供如下所述的进一步的相关改进优点。
背景部分中讨论的所有主题都不一定是现有技术，不应仅仅因为其在背景部分中的讨论而被假定为现有技术。沿着这些思路，除非明确说明是现有技术，否则对背景部分中讨论的或与此类主题相关的现有技术中的问题的任何认识不应被视为现有技术。相反，背景部分中对任何主题的讨论都应被视为发明人解决特定问题的方法的一部分，其本身也可能具有创造性。
发明内容
一个或多个实施例的细节在附图和以下说明书中阐述。其他特征、目的和优点将从说明书与附图以及权利要求中显而易见。
简而言之，本公开提供了用于改进制造基于纳米孔的传感器的方法和组合物。在特定实施例中，该方法和组合物能够利用天然纳米孔结构的改进的同化作用制造基于生物纳米孔的传感器。
在一个方面，本发明提供一种制备包括一种或多种天然纳米孔蛋白质的检测装置的方法，该方法包括以下步骤：(a)形成包括纳米孔蛋白质、膜支架蛋白质(MSP)和第一脂质的水性混合物，以产生一种纳米盘-纳米孔蛋白复合物的样品，其中样品中的纳米盘-纳米孔蛋白复合物的群体各自包括天然纳米孔蛋白质；(b)提供包括一个或多个孔口的固相支持体，其中在该孔口中的每一个孔口之上形成膜，其中该膜包括第二脂质，并且其中该膜在检测装置中将顺式腔室与反式腔室分隔；(c)以及将一个或多个膜与包括天然纳米孔蛋白质的纳米孔-纳米盘复合物的群体接触，以使天然纳米孔蛋白质同化到这些膜中的每一个膜中。在一个实施例中，该方法进一步包括在将一个或多个膜与包括天然纳米孔蛋白质的纳米孔-纳米盘复合物的群体接触的步骤之前，从水性混合物中纯化包括天然纳米孔蛋白质的纳米孔-纳米盘复合物的群体的步骤。在进一步的实施例中，包括天然纳米孔蛋白质的纳米孔-纳米盘复合物的群体的纯化步骤包括尺寸排阻色谱和亲和色谱中的一者或两者。在另一个实施例中，水性混合物进一步包括洗涤剂，其中洗涤剂的最终浓度为约14mM至约40mM。在一个进一步的实施例中，第一脂质为1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhPC)，MSP为MSP1D1或其变体，纳米孔蛋白质为α-溶血素(α-HL)或其变体，洗涤剂为胆酸盐，并且第二脂质为1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhPE)。在又一个进一步的实施例中，脂质与MSP与纳米孔蛋白质的摩尔比为约101∶6∶1或约120∶6∶1。在另一个实施例中，固相支持体包括多个孔口，其中在该多个孔口中的每一个孔口之上形成膜，并且将其中这些膜中的每一个膜与包含天然纳米孔蛋白质的纳米孔-纳米盘复合物接触。
在另一个方面，本发明提供了一种对聚合物测序的方法，该方法包括使上述检测装置中任意装置的使用。在某些实施例中，聚合物是Xpandomer。
在另一个方面，本发明提供一种在膜中形成天然纳米孔蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：(a)形成包括纳米孔蛋白、膜支架蛋白质(MSP)和第一脂质的水性混合物，以产生一种纳米盘-纳米孔蛋白复合物的样品，其中纳米盘-纳米孔蛋白复合物的群体各自包括天然纳米孔蛋白质；(b)提供包括第二脂质的膜；(c)将膜与包括天然纳米孔蛋白质的纳米孔-纳米盘复合物的群体接触，以使天然纳米孔蛋白质同化膜。在一个实施例中，该方法进一步包括在将膜与包括天然纳米孔蛋白质的纳米孔-纳米盘复合物的群体接触的步骤之前，从水性混合物中纯化包括天然纳米孔蛋白质的纳米孔-纳米盘复合物的群体的步骤。在某些实施例中，纳米孔-纳米盘复合物的群体的纯化步骤包括尺寸排阻色谱和固定化金属亲和色谱中的一或两种。在另一个实施例中，水性混合物进一步包括洗涤剂，其中洗涤剂的最终浓度为超过14mM至40mM。在进一步的实施例中，第一脂质为1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhPC)，MSP为MSP1D1或其变体，纳米孔蛋白质为α-溶血素(α-HL)或其变体，洗涤剂为胆酸盐，并且第二脂质为1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhPE)。在又一个实施例中，脂质与MSP与纳米孔蛋白质的摩尔比为约101∶6∶1或约120∶6∶1。
在另一个方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包括水性缓冲液中的纳米孔-纳米盘复合物，其中该纳米孔-纳米盘复合物包括天然纳米孔蛋白质、膜支架蛋白质(MSP)和脂质，并且其中水性缓冲液包括洗涤剂。在一个实施例中，天然纳米孔蛋白质为α-溶血素(α-HL)或其变体，MSP为MSP1D1或其变体，脂质为1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhPC)，并且洗涤剂为胆酸盐。在进一步的实施例中，脂质与MSP与纳米孔蛋白质的摩尔比为约101∶6∶1或约120∶6∶1，并且胆酸盐的浓度为超过14mM至40mM。
在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包括冻干粉末，该冻干粉末包括纳米孔-纳米盘复合物，其中纳米孔-纳米盘复合物包括天然纳米孔蛋白质、膜支架蛋白质(MSP)和脂质。在一个实施例中，天然纳米孔蛋白质为α-溶血素(α-HL)或其变体，MSP为MSP1D1或其变体，并且脂质为1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhPC)。在进一步的实施例中，脂质与MSP与纳米孔蛋白质的摩尔比为约101∶6∶1或约120∶6∶1。
附图说明
图1是说明制备基于生物纳米孔的检测系统的方法的一个实施例的流程图。
图2A、2B、2C和2D是说明概括性XNTP的主要特征及其在扩展测序(SBX)中使用的简明示意图。
图3是示出了洗脱样品的A280随时间变化的SEC迹线。
图4是示出了取自纳米孔纯化过程的不同阶段的蛋白质样品的凝胶。
具体实施方式
通过参考以下对本发明的优选实施例和本文包括的实例的详细描述，可以更容易地理解本发明。除非另有说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语所具有的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。
已发现用于核酸测序领域的生物纳米孔蛋白质包括基于天然跨膜蛋白的那些蛋白质，当单个多肽亚基在膜中自组装并寡聚成其天然的更高级的结构时，这些蛋白质会形成孔。传统的生物纳米孔传感器(例如αHL纳米孔)通常通过将溶解的蛋白质的水溶液施加到检测器系统的微米级膜组件来组装。为了形成功能性纳米孔，可溶性蛋白质亚基必须插入到膜中并正确地自组装以形成天然的更高级的结构。在脂质双层中重构天然膜蛋白质出现了一些技术挑战是由于，例如蛋白质在水溶液中的溶解度和稳定性低以及难以在脂质底物中有效并一致地组装适当的天然结构。本公开通过提供用于制造纳米孔传感器的方法和组合物来解决这些挑战，其中在将纳米孔同化在膜中之前，将天然寡聚纳米孔结构组装在脂质纳米盘中。可以从混合物中任选地纯化掺入天然纳米孔蛋白质的纳米盘(例如，具有适当大小和/或掺入异源检测“标签”的复合物)以提供更均匀的天然纳米孔样品。然后可以将纯化的纳米孔-纳米盘复合物施加到脂质双层膜，以便使天然蛋白质结构同化到膜中以形成功能性纳米孔传感器或检测器。由本发明提供的额外优势是，在形成于纳米盘中时天然纳米孔蛋白质的结构非常稳定，因此为例如天然纳米孔蛋白质的储存和运输提供了改进的组合物。
纳米盘技术在本领域是公知的。在一些实施例中，纳米盘是纳米级盘状磷脂双层，该纳米级盘状磷脂双层通过称为膜支架蛋白质(MSP)的两个环绕的两亲性螺旋蛋白质“带”被稳定并使其可溶于水溶液。纳米盘可用作将目标膜蛋白(MP)掺入该双层以保持MP结构和活性的媒介物，并且传统上已被用于MP的生物物理、酶或结构研究(综述参见，例如Bayburt和Sligar，FEBS Lett.；584(9)：1721-1727(2010)。在这种方法中，靶膜蛋白质和/或磷脂在环绕的两亲性螺旋MSP的存在下使用洗涤剂瞬间被溶解。当洗涤剂通过透析或吸附到疏水珠上而被去除时，靶MP同时与磷脂组装成圆盘状双层，其大小由MSP的长度控制。因此，由此产生的纳米盘将膜蛋白保持在溶液中，提供一个天然样磷脂双层环境，该环境提供掺入靶的稳定性和功能要求，并且还允许控制靶膜蛋白质的寡聚状态。已知纳米盘是稳固的，可以冷冻或与掺入的MP一起冻干。如本文进一步讨论的，发明人已发现纳米盘作为纳米孔递送和储存的媒介物提供若干优势。
如本文所用，术语“膜支架蛋白质”是指可以通过结合到双层外围来稳定纳米盘中的磷脂双层的蛋白质。通常，膜支架蛋白质具有可与磷脂双层的非极性内部缔合的疏水面以及可优选地与极性溶剂(如水性缓冲液)相互作用的亲水面。膜支架蛋白质序列可以是天然存在的，或者可以使用重组技术工程化或从头构建。天然存在的膜支架蛋白质包括载脂蛋白，它是脂蛋白的组分。已知的载脂蛋白类别包括：A(包括例如，apo A-I和apo A-II)、B、C、D、E和H。非天然存在的膜支架蛋白质包括美国专利号7,691,414中所述的MSP1和MSP2，该专利全部内容通过引用整体并入本文。示例性的可商购的非天然存在的MSP是可从例如Sigma获得的MSP1D1。膜支架蛋白质可以是全长蛋白质，或截短形式的蛋白质。膜支架蛋白质不旨在涵盖各种功能性膜蛋白质，包括但不限于离子通道和其他跨膜受体、孔蛋白、特定细胞粘附分子和电子传递蛋白质，诸如NADH脱氢酶和ATP合酶。
如本文所用，术语“纳米孔蛋白质”是指多肽亚基和亚基的多聚体，当适当的更高级的结构形成时，其可产生穿过膜的孔口。纳米孔蛋白可以指多聚体纳米孔蛋白质的单个多肽亚基或单个多肽亚基的不同寡聚形式。“纳米孔蛋白质的混合物”是指可以含有纳米孔蛋白质的单一和/或寡聚形式的异质组合的溶液。“天然纳米孔蛋白质”是指可以在膜中形成功能性纳米孔的亚基寡聚的天然、更高级的状态。示例性的纳米孔蛋白(即生物纳米孔)，包括α-溶血素、耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)、气单胞菌溶素、phi29、短杆菌肽A、麦芽糖孔蛋白、OmpG、OmpF、OmpC、霍乱弧菌细胞溶素、PhoE、Tsx和F-菌毛。
优选的纳米孔蛋白质为α-溶血素(α-HL)。α-HL是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)释放的主要细胞毒性剂，是成孔β-桶状毒素家族的第一个确定的成员。这种毒素主要由β折叠(68％)组成，只有大约10％的α螺旋。金黄色葡萄球菌染色体上的hla基因编码293个残基蛋白质单体，这些单体在细胞膜中形成七聚寡聚体，以形成完整的β桶状孔。因此，天然α-HL纳米孔蛋白质是七个α-HL蛋白质单体的组装体，即寡聚体。
常规的生物诱变可用于优化纳米孔-纳米盘复合物的任何蛋白质组分以用于本文所述的组合物或方法中。在一些实施例中，分离纳米盘-纳米孔复合物的过程可以受益于与MSP或纳米孔蛋白质连接的多组氨酸亲和标签(即“His-标签”)，该亲和标签用于在固定化金属亲和柱上(例如在镍亲和柱上)纯化复合物。具有末端6x His标签的α-HL或MSP可以被表达、重组和纯化，如SDS-PAGE凝胶所示。纯化的His-标签蛋白质的生物学功能预计与非标记蛋白质的生物学功能相似。出于纯化目的，也可以引入其他突变。例如，可以通过诱变将半胱氨酸部分引入蛋白质序列中并用于与亲和标签的硫醇反应性部分(例如马来酰亚胺或碘乙酰胺)的化学缀合。示例性的亲和标签包括生物素(其可通过固相链霉亲和素来介导纯化)、DNA和RNA(其可通过具有互补序列的固相核酸来介导纯化)、表位(其可通过固相抗体或抗体片段来介导纯化)或其他配体(其可通过那些配体的固相受体来介导纯化)。
蛋白质工程和诱变技术可用于改变生物孔的结构并针对特定应用定制其特性。在某些实施例中，α-溶血素可以，例如在孔的内部被突变以产生具有改进的稳定性和/或具有改变的表面电荷的变体，以优化对目标分析物的检测。合适的α-HL变体包括那些在已发布的PCT申请WO2016069806、WO2018002125和WO2019166458以及美国专利号15,274,770和10,351,908中公开的变体，这些专利通过引用并入本文。在某些实施例中，合适的α-HL变体可以包括一种或多种以下突变：A1K/R、D2N、S3K、D4K/N、K8R、T12K/R、N17K/R、D24A、V26D、H35D/E/G/L、K37S、N47K、E70K、S99K、Y101D、S106K、T109K、E111N/S、M113A/S、D127G、D128G/K、T129G、T131G、L135I、T145S、K147N/S、V149K、P151K、T233R、E287R和M298A。
如本文所用，“膜”是传感器或检测系统或装置的组件，而不是纳米孔-纳米盘复合物的组分。该膜是一种薄膜，可分隔两个隔室或储液器(例如，顺式腔室和反式腔室)，以及防止离子和其他分子在这两个隔室或储液器之间自由扩散。合适的膜是由两亲性分子形成的两亲性层，即亲水和亲油性质都具有的分子。这种两亲性分子可以是天然存在的(例如磷脂)，也可以是合成的。示例性的两亲性材料包括各种磷脂，诸如1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhPE)、棕榈酰基-油酰基-磷脂酰-胆碱(POPC)、二油酰基-磷脂酰-甲酯(DOPME)、1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhPC)二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和鞘磷脂。示例性合成的两亲性分子包括诸如聚(n-甲基丙烯酸正丁酯-磷酸胆碱)、聚(酰胺酯)-磷酸胆碱、聚丙交酯-磷酸胆碱、聚乙二醇-聚(己内酯)-二或三嵌段、聚乙二醇-聚丙交酯二或三嵌段和聚乙二醇-聚(丙交酯-乙交酯)二或三嵌段。
优选地，膜为脂质双层。脂质双层是细胞膜的模型，且已被广泛用于各实验目的。膜还可以是固态膜，即由固态材料制备的层，一个或多个孔口在该层中形成。膜可以是一层(诸如支撑底物上的涂层或薄膜)，或者它可以是独立元件。用于薄膜固态膜的材料的例子包括氮化硅、氧化铝、氧化钛和氧化硅。
图1总结了根据本发明的用于形成检测装置的纳米孔传感器组件的示例性方法的三个基本步骤；每个步骤的细节在本文中进一步讨论。在步骤1中，形成纳米孔蛋白质、合适的脂质和合适的膜支架蛋白质的水性混合物以提供纳米孔-纳米盘复合物的样品。在一个实施例中，纳米孔为α-HL，合适的脂质为DPhPC，并且膜支架蛋白质为MSPD1。该样品包括纳米孔-纳米盘复合物的群体，每个纳米孔-纳米盘复合物都含有一种天然纳米孔蛋白质；然而，并非样品中的每种复合物都必然会包括正确组装的天然纳米孔蛋白质，因此，在某些实施例中，样品可被描述为“异质样品”，并且进行一个或多个纯化步骤以提供富集目标纳米孔-纳米盘复合物的样品可能是有利的。在步骤2A和2B中，可以任选地从水性混合物分离或纯化具有适当物理性质的纳米孔-纳米盘复合物。在这个实施例中，执行两个连续的纯化步骤：尺寸排阻色谱(SEC，步骤2A)和固定化金属亲和色谱(IMAC，步骤2B)。纯化步骤富集了包括天然纳米孔蛋白质的纳米孔-纳米盘复合物的群体。应当理解，本领域中已知的任何合适的纯化方案都可以根据本文所述的方法来应用。在步骤3中，将纯化的纳米孔-纳米盘复合物施加到检测细胞的脂质双层组件(即膜)以使天然纳米孔蛋白质同化到膜中，从而形成功能性纳米孔传感器。有利地，根据该方法，将富集天然、寡聚蛋白质的样品施加到膜上，以此提高形成功能性传感器的效率。相比之下，现有技术方法需要蛋白质亚基的正确膜内自组装以形成天然的更高级的结构，这是一种效率较低且潜在易出错的过程，该过程可能会损害检测系统的功能。
在某些实施例中，纳米孔-纳米盘复合物可以是，例如通过膜支架蛋白质(MSP)稳定的直径为7至16nm的脂质双层盘。在一些实施例中，MSP是apoA-I的合适衍生物，例如可商购的MSP1D1蛋白质。本发明考虑了其他类型的两亲性纳米盘“带”，例如两亲性肽。应当理解，纳米孔-纳米盘复合物的直径可以小于7nm(例如，直径小于6nm、5nm、4nm、2nm或更小)或大于16nm(例如，直径大于18nm、20nm或25nm或更大)。通常，用于本文所述方法或组合物的脂质盘面积不大于约50,000nm2，或在某些情况下不大于约10,000nm2或有时不大于约1,000nm2或甚至其他时候不大于约500nm2。纳米孔-纳米盘复合物可以但并非必然需要占据一个圆形区域。在特定条件下，纳米孔-纳米盘复合物可以与囊泡或脂质体区分开来，因为纳米盘不存在水性腔，而且可以与胶束区分开来，因为纳米盘中存在双层。应当理解，纳米孔-纳米盘复合物也可以由其他材料制成。例如，纳米盘可以由非脂质膜形成。本领域技术人员将理解纳米盘的最佳物理性质将通过特定的目标应用确定，例如靶蛋白质和掺入靶蛋白质的系统的其他组件的物理性质。例如，在将纳米孔-纳米盘组装体应用于脂质双层时，掺入纳米孔蛋白质的纳米盘应具有适合于保持天然蛋白质的膜溶解度和跨膜孔结构的尺寸。在某些实施例中，其中纳米盘与DPhPC、MSP1D1和α-HL组装在一起，预计该复合物的直径约为9.7nm，并且厚度约为4.6至5.6nm。
如本文所述，脂质纳米盘可以由被两个平行的带状MSP包围的脂质分子双层组成，其中MSP的两亲螺旋稳定了脂质盘边缘的疏水性脂肪酸。特别有用的脂质纳米盘和组合物以及它们的制造方法在例如美国专利号7,083,958和7,662,410中阐述，这些专利通过引用并入本文。在本发明的某些实施例中，用于形成纳米盘的有用脂质包括1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhPC)和1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)。
在某些实施例中，脂质纳米盘可以通过将MSP与洗涤剂稳定的磷脂混合来制备。如本文所述，纳米盘的自组装发生在从混合物去除洗涤剂的过程中。已经证明，MSP的存在限制了脂质纳米盘的形状和大小，以及在无洗涤剂的水溶液中提供了一个大小的窄分布(+/-3％)、出色的重现性和非凡的稳定性。可以选择MSP与洗涤剂的比率以实现纳米盘的期望尺寸和特性。例如，MSP的结构单元的数量可以改变，以使纳米盘直径从9.8nm调整到12.9nm，如Denisov et al.，J.Am.Chem.Soc.126，3477-3487(2004)中所述，其通过引用并入本文。用于将膜蛋白掺入纳米盘中的示例性方法如Raschle et al.，J.Am.Chem.Soc.131，17777-17779(2009)中所述。类似的方法可用于将蛋白质纳米孔(诸如α-HL、MspA、气单胞菌溶素等)插入脂质纳米盘中。在一些实施例中，纳米孔-纳米盘复合物在由20mM Tris、pH 7.4、0.5M EDTA、100mM NaCl和14mM至40mM胆酸盐组成的水性缓冲液中形成。在某些实施例中，缓冲液含有19mM胆酸盐。在一些实施例中，将DPhPC脂质添加到含有50mM DPhPC、20mMTris、pH 7.4和100mM胆酸钠的溶液中的水性混合物。在一些实施例中，纳米盘组装反应中胆酸盐的最终浓度大于约14mM；在一个具体实施例中，胆酸盐的终浓度为约19mM。
在特定实施例中，纳米孔-纳米盘复合物形成于膜支架蛋白质(MSP)、洗涤剂溶解的磷脂(例如DPhPC)和纳米孔蛋白质的混合物中。在该混合物中，MSP与洗涤剂溶解的磷脂自组装以形成嵌入α-HL纳米孔蛋白质的纳米盘。当洗涤剂从混合物移除时，会发生自组装，例如使用Bio-
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(Bio-Rad，Hercules Calif.)。在一些实施例中，纳米孔蛋白质与MSP蛋白质与脂质的摩尔比将为(约0.5至约5)至(约1至约15)至(约50至约200)。最佳比率可以根据经验确定，并将取决于目标复合物的特定蛋白质和脂质组分，以及形成纳米盘复合物的特定方法。在一个示例性实施例中，α-HL蛋白质与MSP1D1蛋白质与DPhPC脂质的摩尔比约为1比6比120(即1∶6∶120)。在另一个实施例中，α-HL蛋白质与MSP1D1蛋白质与DPhPC脂质的摩尔比约为1∶6∶101，
含有天然纳米孔蛋白质的纳米孔-纳米盘复合物的群体可以通过常规尺寸排阻色谱法(SEC)从混合物中纯化，这在本领域是公知的。目标纳米孔-纳米盘复合物的大小将决定色谱柱和色谱方案的特性和细节。在一个实施例中，使用一个设计用于纯化具有约10,000-600,000的Mr的复合物的色谱柱收集目标纳米孔-纳米盘复合物。本领域已知的方法(例如，凝胶电泳和蛋白质印迹)可用于确认从SEC柱洗脱液保留了适当的级分。在某些实施例中，采用额外的纯化步骤来进一步富集含有天然纳米孔蛋白质的纳米孔-纳米盘复合物。例如，固定化金属亲和色谱(例如镍基亲和基质)可用于特异性保留复合物，其中MSP或纳米孔蛋白质已被工程化以表达多组氨酸亲和标签。此种方法在本技术领域中已详细描述。
本文所述的纳米孔-纳米盘复合物在水性缓冲液中表现出改进的稳定性，并且也可以被冻干(例如用于储存和运输)，以及根据需要重构(例如用于形成纳米孔传感器或检测系统)。如本文所用，术语“缓冲剂”是指能够将溶液的pH保持在几乎恒定值的水溶液。缓冲液通过包括弱酸及其共轭碱来实现这一点，因此在添加少量酸或碱后，pH不会发生实质性变化。代表性缓冲剂包括柠檬酸、乙酸、磷酸二钾(K2HPO4)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)和硼酸盐。常用的缓冲液包括但不限于TAPS、bicine、tris、tricine、TAPSO、HEPES、TES、MOPS、PIPES、二甲砷酸盐、SSC、MES和琥珀酸。在一些实施例中，纳米孔-纳米盘复合物可以储存在4℃的水性缓冲液中。
本文所述的纳米孔-纳米盘复合物可以是组合物的组分。例如，这些组分可以被干燥(例如粉末)或在稳定的缓冲液中(例如，化学稳定的、热稳定的)。例如，可以通过冻干、真空和离心辅助干燥和/或环境干燥来制备干燥组分。在各种实施例中，含有纳米孔-纳米盘复合物的组合物在单个容器中呈冻干形式。在其他实施例中，组合物是包括纳米孔-纳米盘复合物的水溶液，该纳米孔-纳米盘复合物储存于4℃下时是稳定的。
如本文中与根据本发明所述的制剂结合使用的术语“冻干”表示通过本领域已知的冷冻干燥方法稳定组合物的过程。溶剂(例如水)在真空下通过冷冻后升华，并且残留水在高温下解吸而被移除。在制药领域，冻干组合物通常具有约0.1％(w/w)至5％(w/w)的残留水分，并且以粉末或物理稳定的饼状物存在。冻干物的特征在于在添加重构介质后迅速溶解。
如本文所用，术语“重构制剂”表示被冻干并通过添加稀释剂重新溶解的制剂。稀释剂可含有但不限于水、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)、pH-缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)及其组合。
本公开提供了本文所述的纳米孔-纳米盘复合物在制造用于数据采集的系统(例如，传感器或检测装置)中的使用。在示例性系统中，脂质双层膜跨过例如PTFE的固体支持细胞中的孔口而形成。脂质双层膜可以根据以下步骤形成：i)用溶于己烷中的一层脂质薄膜(例如1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，“DPhPE”)给支持细胞涂底，ii)风干涂覆的细胞以去除己烷iii)通过将PE溶解在1-十六碳烯中以及用移液管将溶液沉积在涂底的支撑细胞上来在支持细胞上涂覆脂质以及iv)将气泡移动到支持细胞中的孔口之上以在该孔口之上形成脂质双层膜。为了将纳米孔插入到膜中，纳米孔-纳米盘复合物被应用于脂质-双层膜，然后纳米孔蛋白质同化(即插入)到膜中。在某些实施例中，天然纳米孔通过机械力插入到膜中，例如通过电穿孔或通过使用气泡。
检测系统包括分隔顺式腔室和反式腔室的膜。纳米孔顺式和反式侧上的标准电极(例如Ag/AgCl)提供电流源。使用电流传感电路测量在两个离子敏感电极之间的离子电流，该离子电流穿过含有合适电解质(例如＞1M KCl)的溶液中的纳米孔。电极通过跨阻放大器完成电路，该跨阻放大器提供的电压输出与频率范围内的离子电流成正例。可以使用Axopatch 200B放大器获取来自纳米孔的数据。这种类型的系统与纳米孔领域内用于评估分析能力的常规系统是一致的。将天然纳米孔蛋白质同化到膜中产生功能性传感器，该功能性传感器使电流能够流过膜。以这种方式，通过监测系统中的离子电流，可以检测到天然纳米孔蛋白质被正确同化到膜中，例如，在正确同化天然纳米孔时，-100mV的预期电流可能为约200pA。
在一些实施例中，检测系统可以包括具有任意合适数量的纳米孔的纳米孔阵列。在一些情况下，该阵列包括约200、约400、约600、约800、约1000、约1500、约2000、约3000、约4000、约5000、约10,000、约15,000、约20,000、约40,000、约60,000、约80,000、约100,000、约200,000、约400,000、约600,000、约800,000、约1,000,000等个纳米孔。在一些情况下，该阵列包括至少200、至少400、至少600、至少800、至少1000、至少1500、至少2000、至少3000、至少4000、至少5000、至少10,000至少15,000、至少20,000、至少40,000、至少60,000、至少80,000、至少100,000、至少200,000、至少400,000、至少600,000、至少800,000、或至少1,000,000个纳米孔，靠近传感器电路或传感电极。一个或多个纳米孔可以与单独的电极和传感集成电路或多个电极和传感集成电路相关联。在一些实施例中，在CMOS中实现的跨阻放大器阵列被布置为并行测量独立传感器电流阵列。这种放大器阵列的实例已被Kim等人公开。(例如，参见Kim，B.N.，Herbst，A.D.，Kim，S.J.，Minch，B.A.，&Lindau，M.2013.ParallelRecording of Neurotransmitters Release from Chromaffin Cells using a 10x10CMOS IC Potentiostat Array with On-Chip Working Electrodes.Biosensors andBioelectronics，41，736-744)。纳米孔装置可以包括多个可单独寻址的传感电极。每个传感电极可以包括与电极相邻的膜，以及膜中的一个或多个纳米孔。
在特定实施例中，施加于本文所述阵列的膜的脂质纳米盘中的每一个脂质纳米盘将具有不超过一个在其中同化的蛋白质纳米孔。或者，单独的纳米盘可以包括一个以上的蛋白质纳米孔。
本公开的检测装置可用以检测多种分析物中的任意一者，包括但不限于离子、核酸、核苷酸、多肽、生物活性小分子、脂质、糖等。因此，这些分析物的一种或多种分析物可以存在于或穿过本文所述装置中的蛋白质纳米孔的孔口。
在优选的实施例中，本公开进一步提供了基于“扩展测序”的用于核酸测序的系统和方法。由Stratos Genomics开发的“扩展测序”(SBX)方案(参见，例如Kokoris et al.，U.S.Pat.No.7,939,259，″High Throughput Nucleic Acid Sequencing by Expansion″)是基于非天然单体底物的聚合，称为“XNTP”。一般而言，SBX使用这种生化聚合将DNA模板的序列转录到称为“Xpandomer”的可测量聚合物上。转录的序列沿Xpandomer主链在高信噪比报告子中编码，所述报告子相隔约10nm，专为高信噪比、分化良好的反应而设计。这些差异在Xpandomer相对于天然DNA的序列读段效率和准确性方面提供了显著的性能增强。SBX过程的概述在图2A、图2B、图2C和图2D中描述。
XNTP是与模板依赖性酶促聚合相容的可展开的、5’三磷酸修饰的非天然底物。高度简化的XNTP在图2A中示出，其强调了这些非天然底物的独特特征：XNTP 200具有两个不同的功能区；即：可选择性切割的氨基磷酸酯键210，将5’α-磷酸215连接到核碱基205；以及连接在核苷三磷酸氨基酯内的某些位置处的系链220，该位置允许通过氨基磷酸酯键的切割来控制扩展。XNTP的系链包含被可选择性切割的氨基磷酸酯键分开的连接臂部分225A和225B。每个连接基通过连接基团(LG)连接到报告子构建体230的一端，如公开于Kokoris等人的美国专利号8,324,360，其通过引用整体并入本文。XNTP 200以“受约束构型”说明，这是XNTP底物和聚合后子链的特征。聚合XNTP的受限构型是扩展构型的前体，如Xpandomer产物中所见。从受限构型到扩展构型的转变发生在子链的主要主链内的氨基磷酸酯的P-N键断裂时。
Xpandomer聚合物的合成总结在图2B和图2C中。在组装期间，单体XNTP底物245(XATP、XCTP、XGTP和XTTP)通过使用单链模板240作为向导的模板导向聚合过程在新生子链250的可延伸末端聚合。通常，该过程从引物开始并沿5′到3′方向进行。通常，使用DNA聚合酶或其他聚合酶来形成子链，并且选择条件以便获得模板链的互补拷贝。在合成子链之后，偶联的系链包含进一步包含子链的受约束Xpandomer。子链中的系链具有XNTP底物的“受约束构型”。系链的受约束构型是扩展构型的前体，如Xpandomer产物中所见。
如图2C所示，从受约束的构型260到展开的构型265的转变是由于子链的主要主链内可选择性切割的氨基磷酸酯键(为简单起见用无阴影椭圆表示)的切割引起的。在该实施例中，系链包含一个或多个对它们所连接的核碱基具有特异性的报告子或报告子构建体，230A、230C、230G或230T，从而编码模板的序列信息。以这种方式，系链提供了一种手段来扩展Xpandomer的长度并降低母链序列信息的线性密度。
图2D说明Xpandomer 265通过纳米孔280从顺式储器275易位到反式储器285。如图1所示，α-HL纳米孔-纳米盘组装体被同化为脂质双层，该脂质双层膜将两个电解质贮器分开并电隔离。典型的电解质具有缓冲至7.0的pH值的1摩尔KCl。α-HL纳米孔被定向以首先从茎侧捕获Xpandomer。使用易位控制方法时，该定向是有利的，因为它会减少首次进入前庭那时发生的阻塞伪影。当在双层上施加小电压(通常为100mV)时，纳米孔会限制离子电流的流动，并且是电路中的主要电阻。通过纳米孔后，线性化Xpandomer的报告子构建体中的每个报告子构建体(在此图示中，标记为“G”、“C”和“T”)产生对它所连接的核碱基具有特异性的独特且可重复的电子信号(由叠加迹线290表示)。
实例
实例1
在纳米盘载体中组装和纯化α-溶血素纳米孔
纳米盘的形成。
该实施例描述了天然α-溶血素纳米孔蛋白质在脂质纳米盘中的重构和纳米孔-纳米盘复合物的纯化，以同化脂质膜中的天然纳米孔蛋白质。
通过将α-溶血素蛋白质、MSP蛋白质和DPhPC脂质以1∶6∶101的摩尔比一起孵育来形成纳米孔-纳米盘复合物。反应缓冲液由20mM Tris、pH 7.4、0.5mM EDTA、100mM NaCl和30mM胆酸盐组成。从Sigma获得野生型α-溶血素蛋白质，并在50％甘油/50％水中制备20μM(针对七聚体形式计算)的储备溶液。在补充有100mM胆酸钠的20mM pH 7.4的Tris溶液中制备DPhPC(可从Avanti Polar Lipids获得)的50mM储备溶液。从Sigma获得MSP1D1蛋白质(带有N端his-标签)，并根据制造商的说明制备202μM储备溶液。134μL纳米盘组装混合物包括0.675mM DPhPC、6.67μM α-HL、和40μM MSP。胆酸盐的最终浓度确定为＞14mM，发明人发现这对于α-HL/DPhPC/MSP纳米盘复合物的组装是优选的。将组装混合物在室温下孵育60分钟。为了去除洗涤剂，添加78.8mg biobeads SM-2(可从BioRad获得)，并在室温下将混合物以1200rpm摇动2.5小时。通过使混合物通过45μ过滤器来移除beads。
纳米孔-纳米盘复合物纯化。
为了分离含有天然七聚体α-HL蛋白质的纳米孔-纳米盘复合物，首先使用基于目标复合物的预测大小选择的Superdex 200 Increase柱(可从GEH商购)执行尺寸排阻色谱(SEC)。用MSP缓冲液(20mM Tris、pH 7.4、100mM NaCl和0.5mM EDTA)平衡柱，然后添加105μL纳米盘组装体混合物，以及将流速调整为160psi下的0.5mL/min。色谱柱轨迹如图13中所示，收集的两个级分表示为“1”和“2”。通过凝胶电泳证实了级分2中七聚体α-HL蛋白质的存在。
接下来，执行Ni-NTA纯化步骤。通过将50μL树脂添加到空的Ni-NTA离心柱中来制备树脂柱(可从Qiagen商购)，并以700x g的速度将该柱旋转两分钟以移除储备缓冲液。然后用含有20mM Tris、pH 7.5和10mM咪唑的400μL EQ缓冲液平衡该柱。通过以700x g的速度旋转该柱两分钟来去除EQ缓冲液。然后将F2纳米盘样品添加到该柱中，并通过将该柱固定在翻转式旋转器上15分钟来混合柱内容物。将该柱以700x g的速度离心两分钟，以及用700μL含有20mM Tris、pH 7.5和25mM咪唑的洗涤缓冲液洗涤三次。然后通过添加150μL含有20mM Tris、pH 7.5和250mM咪唑的缓冲液来洗脱带His标签的蛋白质/纳米盘组装体。将该柱孵育5分钟，然后通过将该柱以700x g的速度离心两分钟来收集洗脱液。
纯化步骤的功效通过凝胶电泳分析以下样品来监测和评估：负载样品(施加到SEC柱上的1μL样品)；样品1(在16：30-17：55从SEC柱收集的15μL级分1)；样品2(在19：00-20：45从SEC柱收集的15μL级分2)；FT样品(15μL的柱流过液)；样品W1、W2和W3(来自IMAC的第一次、第二次和第三次洗涤样品中的每一种洗涤样品各15μL)；和样品E1(从IMAC洗脱下的15μL样品)。代表性凝胶示于图3中。箭头表示七聚体α-HL蛋白质和MSP蛋白质的位置。这些结果证实了含有天然纳米孔蛋白质的α-HL纳米孔-纳米盘复合物的成功组装和纯化。凝胶上的微弱条带代表单体α-HL蛋白质，可能是蛋白质样品在凝胶中运行时天然七聚寡聚体解离的结果。
本发明已经在本文中广泛和一般地进行了描述。属于一般公开内容的每个较窄的物种和亚属组也构成本发明的一部分。这包括本发明的一般性描述，带有从属中去除任何主题的附带条件或否定限制，无论此处是否具体引用了切除的材料。
还应理解，本文和所附权利要求中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式，除非上下文另有明确规定，术语“X和/或Y”表示“X”或“Y”或“X”和“Y”，名词后面的字母“s”表示该名词的复数和单数形式。此外，在根据马库什基团描述本发明的特征或方面的情况下，意图并且本领域技术人员将认识到，本发明包括并因此也在马库什基因的任何个体成员和任何成员亚基团方面进行描述，并且申请人保留修改申请或权利要求的权利，以明确提及马库什基团的任何个体成员或任何成员亚基团。
应理解，本文使用的术语只是为了描述具体实施例的目的，并非旨在进行限制。还应理解的是，除非在此具体定义，否则在此使用的术语将被赋予其在相关领域中已知的传统含义。
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如在本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”、“该”和“所述”包括复数指代物，即一个或多个，除非上下文另外明确规定。例如，术语“传感器”是指一个或多个传感器，且术语“包含传感器的检测装置”是指包括至少一个传感器的检测装置，其中包含传感器的检测装置可具有例如，1个传感器、10个传感器、102个传感器、103个传感器、104个传感器、105个传感器、106个传感器或超过106个传感器。多个传感器是指多于一个的传感器。还应注意的是，连接术语“和”和“或”通常以最广泛的含义使用以包括“和/或”，除非内容和上下文根据具体情况明确规定了包容性或排他性。因此，替代方案(例如，“或”)的使用应被理解为表示替代方案中的任一个、两者或其任何组合。此外，“和”和“或”的组成在本文中被引用为“和/或”时旨在涵盖包括所有相关项或想法的实施例，以及包括少于所有相关项或想法的一个或多个其他替代实施例。
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通常，在以下权利要求中，所使用的术语不应被解释为将权利要求限制在说明书和权利要求中公开的特定实施例，而应被解释为包括所有可能的实施例以及这些权利要求所授权的等效物的完整范围。因此，权利要求不受本公开的限制。
此外，该专利的书面说明部分包括所有权利要求。此外，所有权利要求，包括所有原始权利要求以及来自任何和所有优先权文件的所有权利要求，特此通过引用整体并入说明书的书面说明部分，并且申请人保留物理并入本申请的书面说明或任何其他部分、任何和所有此类权利要求的权利。因此，例如，在任何情况下，专利都不能被解释为据称没有为权利要求提供书面描述，因为在专利的书面描述部分中没有用这些短语阐明权利要求的准确措辞。
权利要求将依法解释。然而，尽管在解释任何权利要求或其部分时声称或认为容易或困难，在任何情况下，在导致本专利的一个或多个申请的审查期间对权利要求或其任何部分的任何调整或修改均不得解释为已被没收对不构成现有技术一部分的任何和所有等效物的任何权利。
其他非限制性实施例在以下权利要求内。该专利不能被解释为限于本文具体和/或明确公开的具体示例或非限制性实施例或方法。在任何情况下，专利都不得解释为受任何审查员或专利商标局的任何其他官员或雇员所作的任何声明的限制，除非该声明是由申请人在响应性书面材料中明确采用的，并且没有限制或保留。

Claims (21)

1.一种制备包含一种或多种天然纳米孔蛋白质的检测装置的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)形成包含纳米孔蛋白质、膜支架蛋白质(MSP)和第一脂质的水性混合物以产生纳米盘-纳米孔蛋白质复合物的样品，其中所述样品中的所述纳米盘-纳米孔蛋白质复合物的群体各自包含天然纳米孔蛋白质；
(b)提供包含一个或多个孔口的固体支持物，其中在所述孔口中的每一个孔口之上形成膜，其中所述膜包含第二脂质，并且其中所述膜在所述检测装置中将顺式腔室与反式腔室分隔；以及
(c)将一个或多个膜与包含所述天然纳米孔蛋白质的纳米孔-纳米盘复合物的群体接触，以使天然纳米孔蛋白质同化到所述膜中的每一个膜中。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在将所述一个或多个膜与包含所述天然纳米孔蛋白质的所述纳米孔-纳米盘复合物的群体接触的步骤之前，从所述水性混合物中纯化包含所述天然纳米孔蛋白质的所述纳米孔-纳米盘复合物的群体的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其中纯化包含所述天然纳米孔蛋白质的所述纳米孔-纳米盘复合物的群体的所述步骤包含尺寸排阻色谱和亲和色谱中的一者或两者。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述水性混合物进一步包含洗涤剂，其中所述洗涤剂的最终浓度为约14mM至约40mM。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一脂质为1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhPC)，所述MSP为MSP1D1或其变体，所述纳米孔蛋白质为α-溶血素(α-HL)或其变体，所述洗涤剂为胆酸盐，并且所述第二脂质为1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhPE)。
6.根据权利要求5所述的方法，其中脂质与MSP与纳米孔蛋白质的摩尔比为约101∶6∶1或约120∶6∶1。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述固体支持物包含多个孔口，其中在所述多个孔口中的每一个孔口之上形成膜，并且其中所述膜中的每一个膜与包含所述天然纳米孔蛋白质的所述纳米孔-纳米盘复合物接触。
8.一种对聚合物测序的方法，所述方法包括使用根据权利要求1至7中任一项所述的检测系统。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述聚合物为Xpandomer。
10.一种在膜中形成天然纳米孔蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)形成包含纳米孔蛋白质、膜支架蛋白质(MSP)和第一脂质的水性混合物以产生纳米盘-纳米孔蛋白质复合物的样品，其中所述纳米盘-纳米孔蛋白质复合物的群体各自包含天然纳米孔蛋白质；
(b)提供包含第二脂质的膜；以及
(c)将所述膜与包含所述天然纳米孔蛋白质的纳米孔-纳米盘复合物的群体接触，以使天然纳米孔蛋白质同化所述膜。
11.根据权利要求10所述的方法，其进一步包括在将所述膜与包含所述天然纳米孔蛋白质的所述纳米孔-纳米盘复合物的群体接触的步骤之前，从所述水性混合物中纯化包含所述天然纳米孔蛋白质的所述纳米孔-纳米盘复合物的群体的步骤。
12.根据权利要求11所述的方法，其中纯化所述纳米孔-纳米盘复合物的群体的所述步骤包含尺寸排阻色谱和固定化金属亲和色谱中的一者或两者。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述水性混合物进一步包含洗涤剂，其中所述洗涤剂的最终浓度为超过14mM至40mM。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一脂质为1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhPC)，所述MSP为MSP1D1或其变体，所述纳米孔蛋白质为α-溶血素(α-HL)或其变体，所述洗涤剂为胆酸盐，并且所述第二脂质为1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhPE)。
15.根据权利要求14所述的方法，其中脂质与MSP与纳米孔蛋白质的摩尔比为约101∶6∶1或约120∶6∶1。
16.一种在水性缓冲液中包含纳米孔-纳米盘复合物的组合物，其中所述纳米孔-纳米盘复合物包含天然纳米孔蛋白质、膜支架蛋白质(MSP)和脂质，并且其中所述水性缓冲液包含洗涤剂。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述天然纳米孔蛋白质为α-溶血素(α-HL)或其变体，所述MSP为MSP1D1或其变体，所述脂质为1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhPC)，并且所述洗涤剂为胆酸盐。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中脂质与MSP与纳米孔蛋白质的摩尔比为约101∶6∶1或约120∶6∶1，并且胆酸盐的浓度为超过14mM至40mM。
19.一种包含冻干粉末的组合物，所述冻干粉末包含纳米孔-纳米盘复合物，其中所述纳米孔-纳米盘复合物包含天然纳米孔蛋白质、膜支架蛋白质(MSP)和脂质。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述天然纳米孔蛋白质为α-溶血素(α-HL)或其变体，所述MSP为MSP1D1或其变体，并且所述脂质为1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhPC)。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中脂质与MSP与纳米孔蛋白质的摩尔比为约101∶6∶1或约120∶6∶1。
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