CN115902186A - 一种基于MtMscL纳米孔的孔膜复合体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于纳米孔检测领域，具体涉及一种基于MtMscL纳米孔的孔膜复合体及其应用。本发明提供了一种孔膜复合体，其包含嵌入在绝缘膜中的纳米孔，所述纳米孔为结核分枝杆菌大电导机械力敏感性通道蛋白(MtMscL)C端截短体，所述MtMscLC端截短体的构建方式为C端截短SEQIDNO:1的第111至第151位之间的氨基酸残基。本发明还提供了上述孔膜复合体在制备分子生物传感器中的应用。

Description

一种基于MtMscL纳米孔的孔膜复合体及其应用

本申请要求2021年08月30日提交的中国发明专利申请【CN2021110062502】、名称为“基于MtMscL的用于小分子药物检测的生物纳米孔系统”的优先权，以及，2021年12月27日提交的中国发明专利申请【CN2021116089782】、名称为“一种生物纳米孔系统及其应用”，两个优先权发明专利申请以引用方式全文并入。

技术领域

本发明属于纳米孔检测领域，具体涉及一种基于MtMscL纳米孔的孔膜复合体及其应用。

背景技术

纳米孔传感是一种单分子传感技术，有着类似于库尔特计数器(Kurt counter)的检测原理。该技术具有在单分子水平上实时和直接监测的特点，且一般不需要对待测物进行标记或修饰。这些优点使纳米孔成为生物传感和生物检测的新兴技术。大多数生物纳米孔的直径在大约1nm到大约4nm之间(如MspA、α-HL20和phi29DNA包装马达)，适用于单链DNA(ssDNA)和双链DNA(dsDNA)的传感。但对于较小分子的传感，通常需要标记或适配体，如定点诱变或修饰特定的适配器。以α-HL为例，其有限的孔径约1.4nm，因此应用范围限制在ssDNA、RNA或小分子的分析中，通过利用环糊精(cyclodextrin)修饰，可用于直接检测单磷酸脱氧核糖核苷dNMPs，无需荧光标记。但通过修饰手段改变生物纳米孔的孔径需要大量的生物工程技术辅助。虽然现在已有研究提出了基于纳米孔或药物通道相互作用的药物分子检测方法，然而，这些方法仍需要结合适配体。

发明内容

一方面，本发明提供一种孔膜复合体，其包含嵌入在绝缘膜中的纳米孔，所述纳米孔为结核分枝杆菌大电导机械力敏感性通道蛋白(MtMscL)C端截短体，所述MtMscL C端截短体的构建方式为C端截短SEQ ID NO:1的第111至第151位之间的氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述绝缘膜包括磷脂膜和/或高分子膜。

在一个实施方案中，所述MtMscL C端截短体的序列如SEQ ID NO:2所示。

在一个实施方案中，所述纳米孔还包含相对于SEQ ID NO:2的至少一个氨基酸替换。

在一个实施方案中，所述纳米孔的序列如SEQ ID NO:3所示，所述纳米孔的突变位点位于所述纳米孔的孔道。

另一方面，本发明还提供了一种生物纳米孔系统，其特征在于，所述生物纳米孔系统包括上述孔膜复合体以及第一介质和第二介质，所述孔膜复合体将所述第一介质与所述第二介质分隔开，所述纳米孔提供连通所述第一介质与所述第二介质的通道。

在一个实施方案中，所述第一介质和/或所述第二介质包括氯化钠溶液、氯化锂溶液、氯化铯溶液、氯化钾溶液和溴化钠溶液中的一种或多种。

另一方面，本发明还提供上述孔膜复合体在制备分子生物传感器中的应用，其特征在于，所述纳米孔提供所述分子穿过所述孔膜复合体的通道，所述分子生物传感器对所述分子与所述孔膜复合体相互作用所产生的信号进行传感。

在一个实施方案中，所述分子生物传感器用于检测全血样本。

在一个实施方案中，所述应用包括检测所述分子的存在和/或浓度。

有益效果

本发明创造性地将机械力敏感性通道MtMscL与绝缘膜融合，提供了一种基于MtMscL纳米孔的新型孔膜复合体。具体地，MtMscL可以被嵌入到绝缘膜中，无需额外压力刺激，即可呈现稳定的通道电流。MtMscL的C端为胞质区，其被截短C端后，MtMscLC端截短体(△C)大部分均为跨膜区，蛋白表达量和膜融合效率都较高，因此更适用于实际的检测分析。

此外，本发明提供的孔膜复合体具备精确传感不同分子(例如小分子药物和多肽)的能力。所述分子可以与MtMscL纳米孔相互作用并产生特异的电流信号。通过分析不同的电流信号，进而可以检测并区分不同分子。在检测不同分子时，本发明提供的孔膜复合体不需要适配体结合，也不需要抗体修饰，即可高灵敏度地直接传感并检测不同分子(包括检测该分子是否存在和/或分子的浓度)。此外，MtMscL纳米孔还展现出较强的抗干扰能力，并能够对体液样本(例如全血样本)进行直接检测。因此，本发明提供的孔膜复合体可以应用至各种传感场景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是MtMscL(WT)的SDS-PAGE胶图和蛋白结构与表达纯化分子筛(A)及嵌孔轨迹图(B)，构建的截短体的SDS-PAGE胶图及嵌孔轨迹图(C)，MtMscL(WT)与MtMscL(△C)的SDS-PAGE胶图(D)以及MtMscL(△C)的蛋白结构与表达纯化分子筛(E)；

图2为MtMscL(WT)与MtMscL(△C)在-50mV到+50mV的电压范围下的I-V曲线图；

图3为MtMscL(WT)纳米孔在-50mV的电压下检测并区分抗生素的实验图；

图4为MtMscL(△C)纳米孔在-50mV的电压下检测并区分抗生素的实验图；

图5为MtMscL(△C)突变体A纳米孔在50mV的电压下的嵌孔轨迹图(A)和检测妥布霉素的实验图(B)；

图6是MtMscL(WT)(A)和MtMscL(△C)(B)的质粒图谱；

图7为MtMscL(WT)纳米孔在-50mV的电压下的检测并区分不同长度Complexin-I多肽的实验图(电解质条件：-trans室：200mM KCl，10mM HEPES，pH7.5；-cis室：2MKCl，10mMHEPES，pH7.5)；

图8为MtMscL(△C)纳米孔在-50mV的电压下的检测并区分不同长度Complexin-I多肽的实验图(电解质条件：-trans室：200mMKCl，10mM HEPES，pH7.5；-cis室：2MKCl，10mMHEPES，pH7.5)；

图9为本发明实施例的电生理实验装置示意图；

图10为MtMscL(WT)纳米孔检测不同梯度浓度妥布霉素(A)和Complexin-I(B)的特征信号频率变化图，以及MtMscL(△C)纳米孔检测不同梯度浓度Complexin-I(C)的特征信号频率变化图；

图11为MtMscL(WT)纳米孔在-50mV的电压下的检测并区分不同长度Complexin-I多肽的实验图(电解质条件：-trans室：30mM KCl，10mM HEPES，pH7.5；-cis室：300mM KCl，10mM HEPES，pH7.5)；

图12为MtMscL(WT)纳米孔检测SNAP-25的实验图；

图13为MtMscL(WT)纳米孔检测含妥布霉素的全血样本的实验图；

图14为MtMscL(WT)纳米孔在-50mV的电压下的检测新霉素的实验图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。

如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。

在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围1～6的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。

纳米孔

本发明所使用的纳米孔是大电导机械力敏感性通道(Mechanosensitive channelof large conductance,MscL)，优选的是MtMscL(结核分枝杆菌大电导机械力敏感性通道)或其变体。所述变体(也可以理解为“突变体”)可以是由生物体(例如结核分枝杆菌)表达的天然存在变体。变体还包括由重组技术产生的非天然存在变体。在本发明中，“MtMscL变体”、“突变型MtMscL”、“突变体MtMscL”、“MtMscL突变体”表示相同含义，除非另有说明。

在本发明的一个实施例中，所述纳米孔可以为野生型MtMscL。

在本发明的另一个实施例中，所述纳米孔可以为MtMscL变体。具体地，所述纳米孔可以为MtMscL截短体。另外，本领域技术人员还可以根据实际情况，对上述MtMscL进行修饰(例如，任何的突变、截短、融合、化学修饰等)，来获得相应MtMscL变体，且修饰手段都是本领域公知的。

待测物

所述待测物是荷电物质。如果待测物带有净电荷则它是荷电的。所述待测物可以荷负电也可以荷正电。如果待测物带有净负电荷则它是荷负电的。如果待测物带有净正电荷则它是荷正电的。合适的待测物优选为小分子药物和多肽。

在本发明的一个实施例中，所述待测物可以为小分子药物。小分子药物可以是一种化合物。更具体地，“小分子药物”可以是具有1000g/mol或更低分子量的药物(例如，低于800、700、600、500、400、300或200g/mol)。作为优选，小分子药物可以是氨基糖苷类抗生素。

在本发明的另一个实施例中，所述待测物可以为多肽。“多肽”是指含有通过肽键连接的两个或多个氨基酸的肽或蛋白。多肽可以含有天然的、修饰的或合成的氨基酸。多肽也可以被天然修饰(如通过翻译后加工)或化学修饰(如酰胺化酰化、交联等)。作为优选，多肽可以是大于4kD的多肽。

纳米孔系统

“纳米孔系统”包括具有纳米级尺寸的孔(简称为“纳米孔”)、绝缘膜、第一介质和第二介质。在本发明的一个实施例中，所述具有纳米级尺寸的孔为结核分枝杆菌大电导机械力敏感性通道(MtMscL)纳米孔。野生型MtMscL是由两个结构域组成的同源五聚体，每个单体由胞质N端两亲螺旋、两个跨膜螺旋(TM1和TM2)和胞质C端螺旋组成。TM1位于孔道内侧，形成一个漏斗状的结构；TM2则位于孔道外侧，起支撑作用。MtMscL有一个孔道，其孔径(通道尺寸)范围为大约0.3-3.5nm。MtMscL(△C)除了缺少胞质C端螺旋外，其余结构都与野生型MtMscL相同。所述具有纳米级尺寸的孔允许所述待测物从所述绝缘膜的一侧易位到另一侧。

在本发明的一个实施例中，所述具有纳米级尺寸的孔被嵌入所述绝缘膜中，所述绝缘膜(也可以理解为，所述纳米级尺寸的孔和所述绝缘膜的复合体)将所述第一介质与所述第二介质分隔开，所述具有纳米级尺寸的孔的孔道提供连通所述第一介质与所述第二介质的通道；向所述第一介质和所述第二介质之间施加驱动力后，位于所述第一介质的待测物与所述MscL纳米孔相互作用以形成电流(即电信号)。在本发明中，“第一介质”是指所述待测物被加入所述纳米孔系统时位于的介质；“第二介质”则是指被所述绝缘膜分隔开的两部分介质中，“第一介质”的另一侧。在本发明中，驱动力是指通过电势、电渗流、浓度梯度等方式驱动待测物与所述纳米孔相互作用的力。

所述第一介质和所述第二介质可以相同或不同，并且所述第一介质和所述第二介质可以包括电导液。所述电导液为碱金属卤化物水溶液，具体为氯化钠(NaCl)、氯化锂(LiCl)、氯化铯(CsCl)、氯化钾(KCl)、溴化钠(NaBr)。在本发明一个实施例中，所述第一介质和所述第二介质含有的电导液的浓度是不同的，换句话说，所述第一介质和所述第二介质中电导液的浓度存在差值，进而使得所述绝缘膜两侧的渗透压存在差值。所述第一介质和/或所述第二介质还可以包括缓冲液，例如HEPES。所述第一介质和/或所述第二介质的浓度范围可以是30mM-3M。

绝缘膜是指具有搭载纳米孔并阻塞非纳米孔通过的离子电流的能力的膜。所述绝缘膜可以包括磷脂膜和/或高分子膜。示例性的磷脂膜包括DPHPC、DOPC、E.colilipid，示例性的高分子膜包括三嵌段共聚物高分子膜。

在本发明的一个具体实施例中，所述纳米孔系统包括两个电解液室，其被绝缘膜分隔开而形成反式(-trans)隔室和顺式(-cis)隔室，所述MtMscL通道的孔嵌入绝缘膜中，绝缘膜上只有MtMscL通道来连通上述两个电解液室。当向上述两个电解液室施加电势时，电解液室中溶液中的电解质离子通过电泳移动并穿过所述MtMscL通道。

孔膜复合体

“孔膜复合体”是指具有纳米级尺寸的孔(简称为“纳米孔”)与绝缘膜中形成的复合结构。在本发明的一个实施例中，所述具有纳米级尺寸的孔为结核分枝杆菌大电导机械力敏感性通道(MtMscL)纳米孔。所述具有纳米级尺寸的孔的氨基酸序列可以为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3中的任意一项。

所述纳米孔和待测物之间的相互作用

所述待测物可与所述纳米孔在所述绝缘膜两侧的任一侧接触。所述待测物可以与所述绝缘膜两侧中的任一侧相接触，使得所述待测物穿过所述纳米孔的通道以到达所述绝缘膜的另一侧。在这种情况下，所述待测物在其经由所述孔的通道穿过所述绝缘膜时，与所述纳米孔相互作用。或者，所述待测物可与所述绝缘膜的侧面接触，所述绝缘膜的侧面可使所述待测物与所述纳米孔相互作用，使其与所述纳米孔分离并停留在所述绝缘膜的同一侧。所述待测物可以以任何方式并在任何位点与所述纳米孔相互作用。所述待测物还可以撞击到所述纳米孔，与所述纳米孔相互作用，使其与所述纳米孔分离并停留在所述绝缘膜的同一侧。

在所述待测物与所述纳米孔相互作用的过程中，所述待测物会以该待测物特异性的方式影响流过所述纳米孔的电流，即流经所述纳米孔的电流对特定待测物是特征性的。可进行对照实验以测定特定待测物对流过所述纳米孔的电流的效应，然后以鉴定样本中的特定待测物或测定样本中是否存在特定待测物。更具体地，可以根据通过检测待测物所获得的电流模式与在相同的条件下使用已知的待测物获得的已知的电流模式进行比较，以鉴定待测物的存在与否或浓度等。

本发明的纳米孔系统还可以包括一个或多个测量流过所述纳米孔的电流的测量装置，例如膜片钳放大器或数据采集设备。

实施例一：材料与方法

化学品：氯化钠(NaCl，>99.0％，CAS#7647-14-5)，酵母提取物(CAS#8013-01-2)，胰蛋白酶(CAS#73049-73-7)，氨苄青霉素钠盐(≥98.5％，CAS#69-52-3)，Tris(≥99.9％，CAS#77-86-1)，咪唑(≥99％，CAS#288-32-4)，正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)(≥99％，CAS#69227-93-6)，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(≥99％，CAS#367-93-1)，苯甲基磺酰氟(PMSF)(≥99.％，CAS#329-98-6)，4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES，>99.5％，CAS#7365-45-9)购自Sigma-Aldrich。大肠杆菌极性脂质提取物(100600P)购自Avanti。

MtMscL表达和纯化：使用pET28b-6His载体，构建结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)大电导机械力敏感性通道(MscL)蛋白(即MtMscL)相应质粒。含有pET28b-MscL-6His的coli BL21(DE3)细胞在Luria-Bertani(LB)培养基中培养，卡那霉素浓度为50μg/mL，培养温度为37℃。当OD₆₀₀达到0.8-1.0时，用0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在20℃下诱导蛋白表达12h。通过3,800rpm离心15分钟收集细菌，并重悬于裂解缓冲液A(20mM Tris，100mM NaCl，5mMβ-巯基乙醇，pH7.4)。细胞被破坏并加入1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)后高压裂解。加入1％(wt/vol)的正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷(DDM)提取2h。18,000rpm离心1h，然后取上清与Ni-NTA树脂(Qiagen)共孵育2h。用缓冲液B(50mM Tris，100mMNaCl，20mM咪唑，0.025％DDM，pH7.4)洗涤混合物，用缓冲液C(50mM MTris，100mM NaCl，500mM咪唑，0.025％DDM，pH 7.4)洗脱目标蛋白。用体积排阻色谱法(Superdex 200increase 10/300 GL，GE Healthcare)进一步纯化蛋白质，用缓冲液D(200mM NH₄Ac，0.025％DDM，10％甘油，pH 7.4)预平衡柱子和纯化蛋白。通过SDS-PAGE分析确定峰组分。上述方法适用于野生型和突变型的蛋白质。

本发明实施例涉及的蛋白包括MtMscL(WT)和MtMscL(△C)。首先，构建MtMscL载体或MtMscLC端截短的载体，使用SnapGene构建质粒图谱，然后合成质粒，再用该质粒表达纯化出MtMscL(WT)或MtMscL(△C)蛋白。本发明涉及的MtMscL(WT)和MtMscL(△C)的质粒图谱如图6A和图6B所示。

MtMscL(WT)的序列信息为：MLKGFKEFLARGNIVDLAVAVVIGTAFTALVTKFTDSIITPLINRIGVNAQSDVGILRIGIGGGQTIDLNVLLSAAINFFLIAFAVYFLVVLPYNTLRKKGEVEQPGDTQVVLLTEIRDLLAQTNGDSPGRHGGRGTPSPTDGPRASTESQ(SEQ ID NO:1)

MtMscL(△C)的序列信息为：MLKGFKEFLARGNIVDLAVAVVIGTAFTALVTKFTDSIITPLINRIGVNAQSDVGILRIGIGGGQTIDLNVLLSAAINFFLIAFAVYFLVVLPYNTLRKKGEVEQPGDTQ(SEQ ID NO:2)

MtMscL(△C)蛋白是一种截短C端(胞质区)的截短突变体。C端在结构上较为突出，截短C端后，MtMscL(△C)蛋白大部分为跨膜区。此外，截短后，蛋白表达量更高和嵌孔能力更强，适用于检测分析。

膜结合和单通道记录：实验是在华纳仪器提供的垂直采样池中进行的，所有的电流轨迹都是用HEKAepc10 USB膜片钳放大器记录的，采样频率为9900hz。将1μL25mg/mL大肠杆菌提取物磷脂预涂于150μm的杯口上，然后分别向样品池的两侧添加1mL电解质溶液(-trans室：30mM NaCl，10mM HEPES，pH7.0；-cis室：300mM NaCl，10mM HEPES，pH7.0)。然后用1mL移液管从-cis室中吸取约2/3的电解质溶液，电解质溶液再被驱动到样品池的-cis室，当平均电流接近0pA时，形成平面磷脂双层膜(即，通过移液枪提拉cis室的电解质溶液，形成磷脂双分子层)。平面磷脂双层膜形成后，将MtMscL蛋白(野生型和/或突变型)溶液加入-cis室。当MtMscL嵌入到平面磷脂双层膜中时，电流发生显著变化，进行后续实验。

抗生素检测：利用MtMscL纳米孔(野生型和突变型)检测抗生素。当在平面磷脂双层膜上形成稳定的MtMscL纳米孔时，在-50mV下记录并观察20min背景信号，再将待检测的抗生素加入样品槽的顺式室(-cis室)中，然后施加电压并记录电流信号。

蛋白多肽检测：利用MtMscL纳米孔检测蛋白多肽。当在平面磷脂双层膜上形成稳定的MtMscL纳米孔时，在-50mV下记录并观察20min背景信号，再将待检测的蛋白多肽加入样品槽的顺式室中，然后施加电压并记录电流信号。

电生理数据分析：本实验采用Clampfit软件对电生理数据进行处理，并用Origin软件进行绘图。

实施例二：MtMscL通道的结构及其电生理测试

MtMscL通道的结构：

如图1A所示，MtMscL(WT，野生型)通道是由两个结构域组成的同源五聚体，每个单体由胞质N端两亲螺旋、两个跨膜螺旋(TM1和TM2)和胞质C端螺旋组成。TM1位于孔道内侧，形成一个漏斗状的结构；TM2则位于孔道外侧，起支撑作用。MtMscL有一个孔道，其孔径(通道尺寸)范围为大约0.3-3.5nm。

MtMscL通道的电生理测试：

MtMscL通道的单通道电生理研究是在平面磷脂双层膜中进行的，电生理装置示意图如图9所示。如图1B所示，在电解质溶液(-trans室：30mM NaCl，10mM HEPES，pH7.5；-cis室：300mM NaCl，10mM HEPES，pH 7.5)中，MtMscL(WT)通道在+50mV和+200mV的电压下可以形成稳定的通道电流，分别为38pA和175pA(此记录为一次嵌孔代表性事件)。上述实验表明MtMscL通道可以进行平面磷脂膜电生理传感。

本发明还构建了基于MtMscL(WT)的多种截短体，并通过SDS-PAGE胶图和嵌孔轨迹图来验证所构建的截短体能否表达和嵌孔，实验结果如图1C、图1D所示。其中，截短N端的截短体不能表达，截短C端(截掉97-151位氨基酸)的截短体不能嵌孔，只有截短C端(截掉111-151位氨基酸，表示为MtMscL(△C))的截短体既能表达又能嵌孔。如图1E所示，MtMscL(△C)缺少胞质C端螺旋。

图2显示了电解质溶液(-trans室：30mM NaCl，10mM HEPES，pH7.5；-cis室：300mMNaCl，10mM HEPES，pH 7.5)中MtMscL(WT)和MtMscL(△C)在-50mV到+50mV的电压范围下的I-V曲线图。图2A-2B的I-V曲线图表明MtMscL(WT)和MtMscL(△C)在此电压范围内保持稳定，无高电压门控(使用平均值±SD表示每个值，MtMscL(WT)来自5次重复实验；MtMscL(△C)来自7次重复实验)。且通过图2A-2B所示的I-V曲线的斜率可以获得MtMscL(WT)和MtMscL(△C)的电导大小(斜率为电导值)，分别为0.616±0.007nS和0.683±0.007nS。

MtMscL(WT)和MtMscL(△C)蛋白均为五聚体结构，其中MtMscL(WT)为全长蛋白，MtMscL(△C)缺少C端结构域。由上可知，除了MtMscL(△C)的电导比MtMscL(WT)略大，MtMscL(WT)和MtMscL(△C)的其他电生理性质相似。

实施例三：基于MtMscL通道的小分子药物检测

本实施例采用MtMscL通道(MtMscL(WT)和MtMscL(△C))来检测小分子药物(摩尔质量小于1000g/mol)，分别为硫酸庆大霉素(分子量MW:561.65)、硫酸妥布霉素(分子量MW:565.595)和硫酸卡那霉素(MW:582.577)。

当在平面磷脂双层膜(绝缘膜中的一种)上形成稳定的MtMscL纳米孔时，将待检测的单一抗生素加入样品槽的-cis室中，然后施加-50mV的电压并记录电流信号。检测实验是在300mM NaCl(-cis室)和30mM NaCl(-trans室)、10mM HEPES、pH7.0的电解质条件下进行的。

待测物通过MtMscL纳米孔时分别产生了特定的电流信号(图3和图4)。其中，MtMscL(WT)典型的庆大霉素信号的峰值电流阻塞率为40％，峰值滞留时间为2ms；典型的妥布霉素信号的电流阻塞率为32％，峰值滞留时间为5ms；典型的卡那霉素信号的电流阻塞率为30％，峰值滞留时间为5ms(图3)。MtMscL(△C)典型的庆大霉素信号的峰值电流阻塞率为40％，峰值滞留时间为2ms；典型的妥布霉素信号的电流阻塞率为35％，峰值滞留时间为2ms；典型的卡那霉素信号的电流阻塞率为31％，峰值滞留时间为1ms(图4)。另外，MtMscL(WT)典型的新霉素(分子量MW:614.644)信号的电流阻塞率为35％，峰值滞留时间为1.5ms(图14)。

当施加偏置电压时，纳米孔捕获待测物抗生素，由于抗生素的大小、结构和带电荷性等差异，可观察到独特的电流阻断事件。硫酸庆大霉素、硫酸妥布霉素和硫酸卡那霉素都具备亲水性和正电荷性且分子量相近，但是MtMscL纳米孔都可以直接区分出上述氨基糖苷类抗生素，展现出稳健且敏感地检测和区分不同小分子药物的能力。换句话说，本发明提供的MtMscL纳米孔不仅可以用于检测和区分氨基糖苷类抗生素(例如庆大霉素、妥布霉素和卡那霉素)，还可以用于检测和区分其他摩尔质量小于1000g/mol的小分子药物(例如盐酸肾上腺素)，应用场景广阔。

如图10A所示，MtMscL(WT)纳米孔检测不同浓度梯度的硫酸妥布霉素，会产生不同的信号频率，且硫酸妥布霉素的浓度与对应的信号频率呈线性关系。因此，还可以通过得到的信号频率来检测小分子药物(例如硫酸妥布霉素)的浓度。此外，还可以看出，MtMscL纳米孔检测小分子药物的检测限为100nM。

另外，在MtMscL(△C)的基础上进行了突变，突变方式为将MtMscL(△C)的第20位氨基酸—丙氨酸(A)突变为半胱氨酸(C)(表示为突变体A20C)，该突变位点位于MtMscL(△C)的孔道内，该突变体的序列信息为：MLKGFKEFLARGNIVDLAVCVVIGTAFTALVTKFTDSIITPLINRIGVNAQSDVGILRIGIGGGQTIDLNVLLSAAINFFLIAFAVYFLVVLPYNTLRKKGEVEQPGDTQ(SEQ ID NO:3)

突变体A20C在50mV的嵌孔图和检测妥布霉素结果图，分别如图5A和图5B所示。上述实验结果表明，即使对MtMscL(△C)进行突变(例如氨基酸替换)，得到的突变体仍与MtMscL(△C)的性质接近，突变体仍具备检测小分子药物的能力。

实施例四：基于MtMscL通道的蛋白多肽检测

本实施例采用MtMscL通道(MtMscL(WT)和MtMscL(△C))分别检测和表征不同长度的Complexin-I多肽。

其中，Complexin(1-134)的序列信息及分子量为：MEFVMKQALGGATKDMGKMLGGDEEKDPDAAKKEEERQEALRQAEEERKAKYAKMEAEREVMRQGIRDKYGIKKKEEREAEAQAAMEANSEGSLTRPKKAIPPGCGDEPEEEDESILDTVIKYLPGPLQDMFKK(15.122kDa)(SEQ ID NO:4)

Complexin(26-134)的序列信息及分子量为：KDPDAAKKEEERQEALRQAEEERKAKYAKMEAEREVMRQGIRDKYGIKKKEEREAEAQAAMEANSEGSLTRPKKAIPPGCGDEPEEEDESILDTVIKYLPGPLQDMFKK(12.466kDa)(SEQ ID NO:5)

Complexin(48-83)的序列信息及分子量为：RKAKYAKMEAEREVMRQGIRDKYGIKKKEEREAEAQ(4.355kDa)(SEQ ID NO:6)

当在平面磷脂双层膜上形成稳定的MtMscL纳米孔时，将待检测的不同长度的Complexin-I多肽加入样品槽的-cis室中(多肽在纳米孔系统中带电)，然后施加-50mV的电压并记录电流信号。

本实施例测试了MtMscL(WT)纳米孔在-50mV的电压、两种电解质条件下检测不同长度的Complexin-I。在-trans室：30mM KCl，10mM HEPES，pH7.5；-cis室：300mM KCl，10mMHEPES，pH7.5的电解质条件的检测结果如图11所示，MtMscL(WT)典型的Complexin(1-134)信号的峰值电流阻塞率为35％，峰值滞留时间为5ms；典型的Complexin(26-134)信号的电流阻塞率为25％，峰值滞留时间为1ms；典型的Complexin(48-83)信号的电流阻塞率为17％，峰值滞留时间为0.5ms。

在-trans室：200mM KCl，10mM HEPES，pH7.5；-cis室：2M KCl，10mM HEPES，pH 7.5的电解质条件的检测结果如图7所示。其中，MtMscL(WT)典型的Complexin(1-134)信号的峰值电流阻塞率为9.91％，峰值滞留时间为4.94ms；典型的Complexin(26-134)信号的电流阻塞率为31.32％，峰值滞留时间为7.76ms；典型的Complexin(48-83)信号的电流阻塞率为6.65％，峰值滞留时间为4.75ms。实验结果表明，在“-trans室：200mM KCl，10mM HEPES，pH7.5；-cis室：2M KCl，10mM HEPES，pH7.5”电解质条件下MtMscL(WT)区分不同多肽的效果更好，部分多肽信号中的“峰值滞留时间”明显改善。

基于此，在“-trans室：200mM KCl，10mM HEPES，pH7.5；-cis室：2M KCl，10mMHEPES，pH7.5”电解质条件下，利用MtMscL(△C)检测不同长度的Complexin-I。典型的Complexin(1-134)信号的峰值电流阻塞率为20.08％，峰值滞留时间为4.94ms；典型的Complexin(26-134)信号的电流阻塞率为30.03％，峰值滞留时间为5.01ms；典型的Complexin(48-83)信号的电流阻塞率为15.18％，峰值滞留时间为4.85ms(图8)。上述实验表明，MtMscL(WT)和MtMscL(△C)都具备检测并区分不同多肽的能力。

如图10B和图10C所示，MtMscL纳米孔(MtMscL(WT)和MtMscL(△C))检测不同浓度梯度的Complexin，会产生不同的信号频率，且Complexin的浓度与对应的信号频率呈线性关系。因此，还可以通过得到的信号频率来检测多肽(例如Complexin)的浓度。其中，MtMscL(WT)的灵敏度更高，换句话说，在检测更低浓度待测物或相同浓度待测物时，MtMscL(WT)检测到的信号更多(例如，信号频率更多)。此外，本实施例实验中能检测到信号的最低多肽浓度是2μM，结合图10B还可以看出，MtMscL纳米孔检测多肽的检测限为2μM。

本实施例还利用MtMscL(WT)检测SNAP-25，实验结果如图12所示。其中，SNAP-25的序列信息及分子量为：MAEDADMRNELEEMQRRADQLADESLESTRRMLQLVEESKDAGIRTLVMLDEQGEQLERIEEGMDQINKDMKEAEKNLTDLGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQDGVVASQPARVVDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANQRATKMLGSG(23.315kDa)(SEQ ID NO:7)。

MtMscL检测多肽的潜在原理可能包括：(1)多肽分子上的氨基酸与MtMscL纳米孔内或附近的氨基酸相互作用(例如电荷吸引、亲水/疏水性影响等)并产生电流信号；(2)多肽分子在电解质溶液中运动，与MtMscL纳米孔发生碰撞并产生电流信号；(3)线性的多肽分子通过MtMscL纳米孔并产生电流信号。

综上所述，本实施例验证了MtMscL检测和表征多种多肽(例如Complexin-I和SNAP-25)的能力。Complexin-I和SNAP-25都与囊泡运输有关，因此本发明提供的MtMscL可以用于检测神经递质释放障碍疾病相关生物标志物、检测合成多肽的生产过程中是否存在该多肽、研究蛋白多肽相互作用等多种应用场景。

实施例五：基于MtMscL通道的全血检测

本实施例测试了MtMscL(WT)纳米孔检测全血样本中的小分子药物的能力。本实施例使用的全血样本为购买的兔全血样本，然后向其中加入一定浓度的小分子药物(本实施例使用妥布霉素)以配制成小分子药物的浓度为100μM的母液。向检测体系中添加10μL母液(使全血样本中的小分子药物终浓度为1μM)以进行检测。如图13所示，上述实验结果表明MtMscL纳米孔能够直接检测全血样本中的小分子药物(例如妥布霉素)。

上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (10)

1.一种孔膜复合体，其包含嵌入在绝缘膜中的纳米孔，所述纳米孔为结核分枝杆菌大电导机械力敏感性通道蛋白(MtMscL)C端截短体，所述MtMscL C端截短体的构建方式为C端截短SEQ ID NO:1的第111至第151位之间的氨基酸残基。

2.如权利要求1所述的孔膜复合体，其特征在于，所述绝缘膜包括磷脂膜和/或高分子膜。

3.如权利要求1所述的孔膜复合体，其特征在于，所述MtMscL C端截短体的序列如SEQID NO:2所示。

4.如权利要求3所述的孔膜复合体，其特征在于，所述纳米孔还包含相对于SEQ ID NO:2的至少一个氨基酸替换。

5.如权利要求4所述的孔膜复合体，其特征在于，所述纳米孔的序列如SEQ ID NO:3所示，所述纳米孔的突变位点位于所述纳米孔的孔道。

6.一种生物纳米孔系统，其特征在于，所述生物纳米孔系统包括如权利要求1-5任一项所述的孔膜复合体以及第一介质和第二介质，所述孔膜复合体将所述第一介质与所述第二介质分隔开，所述纳米孔提供连通所述第一介质与所述第二介质的通道。

7.如权利要求6所述的生物纳米孔系统，其特征在于，所述第一介质和/或所述第二介质包括氯化钠溶液、氯化锂溶液、氯化铯溶液、氯化钾溶液和溴化钠溶液中的一种或多种。

8.权利要求1-5任一项所述的孔膜复合体在制备分子生物传感器中的应用，其特征在于，所述纳米孔提供所述分子穿过所述孔膜复合体的通道，所述分子生物传感器对所述分子与所述孔膜复合体相互作用所产生的信号进行传感。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述分子生物传感器用于检测全血样本。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括检测所述分子的存在和/或浓度。

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