JP5328362B2 - 細孔を使用する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、貫通膜細孔を使用しての個々のヌクレオチドおよび他のホスフェート含有部分の同定に関する。特に、本発明は、貫通膜細孔を使用しての標的核酸の配列決定に関する。
DNAを配列決定するための現在の方法は、蛍光ddXTP、dXTP、プライマーおよびポリメラーゼ等の多数の高価な試薬を必要とする。この方法は、資格のある技術者によって操作される必要がある、高性能の装置を必要とする。また、この方法は、長さが1千ヌクレオチド未満の配列に限定される。
驚くべきことに、個々のヌクレオチドが、それらが貫通膜細孔と相互作用する際に、それらの電流振幅(current amplitude)から単一分子レベルで同定され得ることが実証された。したがって、個々のヌクレオチドを同定するため、およびエキソヌクレアーゼ配列決定によって核酸配列を決定するために、確率的検知が使用され得る。
(a)該ヌクレオチドを膜貫通タンパク質細孔と接触させ、その結果、該ヌクレオチドが該細孔と相互作用する工程、および
(b)該相互作用の間に該細孔を通過する電流を測定し、それによって該ヌクレオチドの実体を決定する工程
を含む、方法を提供する。
− 標的核酸配列を配列決定する方法であって、以下:
(a)プロセッシブエキソヌクレアーゼ(processive exonuclease)を使用して該標的配列の一方の末端から個々のヌクレオチドを消化する工程;
(b)該ヌクレオチドを膜貫通タンパク質細孔と接触させ、その結果、該ヌクレオチドが該細孔と相互作用する工程;
(c)該相互作用の間に該細孔を通過する電流を測定し、それによって該ヌクレオチドの実体を決定する工程;および
(d)該核酸配列の同一の末端で工程(a)〜(c)を繰り返し、それによって該核酸の配列を決定する工程
を含む、方法;ならびに
− 核酸を配列決定するためのキットであって、以下:
− シクロデキストリン;および
− プロセッシブエキソヌクレアーゼ
を含む、キット。
配列番号1は、α溶血素の1サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
個々のヌクレオチドを同定する方法
第1の態様において、本発明は、個々のヌクレオチドを同定する方法であって、該ヌクレオチドを膜貫通タンパク質細孔と接触させ、その結果、該ヌクレオチドが該細孔と相互作用する工程、および該相互作用の間に該細孔を通過する電流を測定し、それによって該ヌクレオチドの実体を決定する工程を含む方法に関する。したがって、本発明は、個々のヌクレオチドの確率的検知を含む。本発明は、貫通膜タンパク質細孔を通過する電流に対してそれらが有する異なる効果に基づいて、類似の構造のヌクレオチドを識別するために使用され得る。本発明はまた、特定のヌクレオチドがサンプル中に存在するかどうかを決定するために使用され得る。本発明はまた、サンプル中の特定のヌクレオチドの濃度を測定するために使用され得る。
膜は、イオンおよびヌクレオチドの流れに対してバリアを形成する。膜は、好ましくは、脂質二重層である。本発明に従う使用に好適な脂質二重層は、当該技術分野において公知の方法を使用して作製され得る。例えば、脂質二重層膜は、MontalおよびMueller(1972)の方法を使用して形成され得る。本発明の方法は、リン脂質、糖脂質、コレステロールおよびそれらの混合物を含むがこれらに限定されない任意の膜脂質から形成された脂質二重層を使用して行われ得る。脂質二重層は、好ましくは、1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンから形成される。
本発明の方法は、貫通膜タンパク質細孔を使用して行われる。貫通膜タンパク質細孔は、イオンが電気化学的勾配に沿って膜の一方の面から他方へ流れることを許容するポリペプチドである。細孔は、好ましくは、ヌクレオチドが電気化学的勾配に沿って膜の一方の面から他方へ流れることを許容する。
ヌクレオチドは、膜のいずれかの面上の細孔と接触され得る。ヌクレオチドは、膜のいずれかの面上の細孔へ導入され得る。ヌクレオチドは、好ましくは、イオンが細孔へ入りそして電気化学的勾配に沿って膜を横切って流れることを可能にする膜の面上の細孔と接触される。ヌクレオチドは、好ましくは、ヌクレオチドが細孔を通って膜の他方の面へ通過することを可能にする膜の面と接触させられる。例えば、ヌクレオチドは、その天然環境においてイオンまたは小分子(例えば、ヌクレオチド)が細孔のバレルまたはチャネル中へ入ることを可能にする細孔の末端と接触させられ、その結果、イオンまたは小分子は細孔を通過し得る。
本方法は、貫通膜タンパク質細孔が膜中へ挿入されている膜/細孔システムを研究するために好適である任意の装置を使用して行われ得る。本方法は、確率的検知のために好適である任意の装置を使用して行われ得る。例えば、装置は、水溶液を含むチャンバおよびチャンバを2つの区域に分離するバリアを備える。バリアは、細孔を含む膜が形成されている開口部を有する。ヌクレオチドは、ヌクレオチドをチャンバ中へ導入することによって、細孔と接触され得る。ヌクレオチドは、チャンバの2つの区域のいずれかの中へ導入され得る。
貫通膜細孔は、好ましくは、細孔とヌクレオチドとの相互作用を促進する分子アダプターを含む。該アダプターは、典型的に、ヌクレオチドとのその相互作用を改善する細孔の物理的または化学的性質に対する効果を有する。アダプターは、典型的に、細孔のバレルまたはチャネルの電荷を変化させるか、または特異的にヌクレオチドと相互作用するかもしくはこれへ結合しそれによって細孔とのその相互作用を促進する。アダプターは、好ましくは、ヌクレオチド上の1以上のリン酸基と相互作用するか、またはp−カチオン相互作用によってヌクレオチド中の塩基と相互作用する。アダプターは、ヌクレオチドと細孔との相互作用を媒介し得る。例えば、ヌクレオチドは、アダプターを介して細孔へ可逆的に結合し得る。または、アダプターは、細孔と共にヌクレオチドと相互作用し得る。例えば、ヌクレオチドは、細孔およびアダプターの両方へ可逆的に結合し得る。アダプターは、好ましくは、バレルまたはチャネルを収縮させ、その結果、それはヌクレオチドと相互作用し得る。
本発明の方法は、任意のヌクレオチドを同定するために使用され得る。ヌクレオチドは、天然のものまたは人工のものであり得る。ヌクレオチドは、典型的に、核酸塩基、糖、および少なくとも1つのリン酸基を含有する。核酸塩基は、典型的に、複素環式のものである。好適な核酸塩基としては、プリンおよびピリミジン、ならびにより具体的には、アデニン、グアニン、チミン、ウラシルおよびシトシンが挙げられる。糖は、典型的に、五炭糖である。好適な糖としては、リボースおよびデオキシリボースが挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、典型的に、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは、典型的に、モノホスフェート、ジホスフェート、またはトリホスフェートを含有する。
本発明の方法は、ヌクレオチドとの相互作用の間に細孔を通過する電流の測定を含む。貫通膜タンパク質細孔を通るイオン電流を測定するための好適な条件は、当該技術分野において公知であり、そして実施例に開示される。本方法は、膜および細孔にわたって適用される電圧を用いて行われる。使用される電圧は、典型的に、+50 mV〜+200 mVである。使用される電圧は、好ましくは、+70 mV〜+150 mV、+85 mV〜+145 mV、または+100 mV〜+140 mVである。使用される電圧は、dAMP、dTMP、dGMPおよびdCMP等のデオキシリボヌクレオチド5’モノホスフェートについて約+130 mVであり、そしてAMP、TMP、GMPおよびUMP等のリボヌクレオチド5’モノホスフェートについて+110 mVである。
第2の態様において、本発明は、標的核酸配列を配列決定する方法であって、(a)プロセッシブエキソヌクレアーゼを使用して該標的配列の一方の末端のから個々のヌクレオチドを消化する工程;(b)該ヌクレオチドを膜貫通タンパク質細孔と接触させ、その結果、該ヌクレオチドが該細孔と相互作用する工程;(c)該相互作用の間に該細孔を通過する電流を測定し、それによって該ヌクレオチドの実体を決定する工程;および(d)該核酸配列の同一の末端で工程(a)〜(c)を繰り返し、それによって該核酸の配列を決定する工程を含む、方法に関する。したがって、第2の態様は、核酸を配列決定するための、核酸配列の各々の単一のヌクレオチドの連続した確率的検知を含む。核酸の全部または一部のみが、第2の態様の方法を使用して配列決定され得る。核酸は、天然のものまたは人工のものであり得る。例えば、第2の態様の方法は、製造されたオリゴヌクレオチドの配列を確認するために使用され得る。第2の態様の方法は、典型的にインビトロで行われる。
第2の態様の方法は、核酸配列をプロセッシブエキソヌクレアーゼと接触させ核酸の一方の末端から個々のヌクレオチドを放出する工程を含む。プロセッシブエキソヌクレアーゼは、典型的に核酸配列の一方の末端へ付着しそしてその末端から一度に1つのヌクレオチドで該配列を消化する酵素である。プロセッシブエキソヌクレアーゼは、5’から3’方向でまたは3’から5’方向へ核酸を消化し得る。プロセッシブエキソヌクレアーゼが結合する核酸の末端は、使用される酵素の選択によっておよび/または当該技術分野において公知の方法を使用して、典型的に決定される。核酸配列のいずれかの末端でのヒドロキシル基またはキャップ構造体(cap structures)は、核酸配列の特定の末端へのプロセッシブエキソヌクレアーゼの結合を防止または促進するために典型的に使用され得る。
第3の態様において、本発明はまた、本発明の第2の態様を行うために使用され得るキットに関する。したがって、該キットは、核酸を配列決定するために好適である。キットは、シクロデキストリンおよびプロセッシブエキソヌクレアーゼを含む。シクロデキストリンは、好ましくは、ヘプタキス-6-アミノ-β-シクロデキストリンである。プロセッシブエキソヌクレアーゼは、第2の態様を参照して上記で議論されたもののいずれかであり得る。キットは、好ましくは、貫通膜タンパク質細孔をさらに含む。細孔は、第1の態様を参照して上記で議論されたもののいずれかであり得る。
α溶血素(M113R)7突然変異体(図1A)のイオン伝導路のサイズを、検出されるヌクレオチドのサイズへより近づけるために、ナノ細孔の直径を、該細孔の収縮部の近くにシクロデキストリンをフィットさせることによって縮小した。第1級の位置(the primary positions)に7つのアミノ基を有する、ヘプタキス-6-アミノ-β-シクロデキストリン(am7-βCD)(図1B)を使用した。前記タンパク質変異体上の113位の7つのアルギニンと共に、前記シクロデキストリンが細孔内にある場合(図1C)、一方の面上の7つのアミノ基の1つの環、および7つのアルギニン基の第2の環は、細孔を通る通路の最も狭い領域において、互いに短い距離内に存在する。このアミノ/アルギニン環構造は、リン酸基を可逆的に結合しそれによって5〜30ms間細孔中にXMPおよびdXMPを固定する特性を有する。これらの結合事象は、得られる電流振幅変化によって明確に検出可能である。
α溶血素突然変異体(M113R)7を、以前に記載されるように(Cheley, S., L.-Q. Gu, et al. (2002), Chem. & Biol. 9: 829-838)、発現させ、そして精製した。
1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンはAvanti Polar Lipids Incから購入した。ペンタンをJT Bakerから購入し、そしてヘキサデカン99+%をSigma- Aldrichから購入した。ヘプタキス(6-デオキシ-6-アミノ)-β-シクロデキストリン.HCl>99%をCYCLOLAB Ltd Budapest, Hungaryから購入した。2-デオキシ-グアノシン5’一リン酸ナトリウム塩99%をAcrosから購入し、2-デオキシ-シトシン5’一リン酸二ナトリウム塩>95%、2-デオキシ-チミジン5’一リン酸二ナトリウム塩>97%、および2-デオキシ-アデノシン5’一リン酸二ナトリウム塩>95%をFlukaから購入した。ウリジン5’一リン酸二ナトリウム塩99%、およびシトシン5’一リン酸>98%をFlukaから購入した。アデノシン5’一リン酸99%、およびグアノシン5’一リン酸二ナトリウム塩97%をAcrosから購入した。Trizma Base 99.9%をSigma-Aldrichから購入し、そして濃HCl分析試薬等級をFisher Scientificから購入した。塩化カリウム99%、塩化ナトリウム99.9%をSigma-Aldrichから購入した。ヨウ化カリウム99.5%および塩化セシウム99%をFlukaから購入した。
Axon instruments製のパッチクランプ増幅器Axopatch 200Bを、Digidata 1200 A/Dコンバータ(Axon instruments)を備えたコンピュータと共に使用した。Teflonチャンバを使用した。データをpClamp 9.2において回収し、そしてClampfit 9.0において分析した。プロットおよびグラフをMicrocal Origin 6.0で得、そして積分(integration)を個人用計算機において実行した。
脂質二重層膜を、トランスおよびシスチャンバを隔離する20μmポリカーボネートフィルム(Goodfellow, Malvern PA製の20μm厚)中の100-150μm直径オリフィス(orifice)上に、MontalおよびMueller(1972)の方法によって1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンから形成した。チャンバのシス側は地面にあり、そしてチャンバのトランス側はヘッドステージ(head stage)へ接続された。電位は、トランス側の電極の電位を指す。アダプター分子をトランス側へ添加し、前記α溶血素突然変異体および被検体分子をシス側へ添加した。dXMP実験を+130mVで行い、XMP実験を+110mVで行った。ここで報告される全ての実験は、1M KCl中pH 8.0 トリス-HCl 25 mMで得られた。ヌクレオチド溶液の新鮮なアリコートを毎日使用した。特に述べない限り、実験を室温22.5 +/- 2℃で行った。
2-デオキシ-ヌクレオチド5’モノホスフェートは、(Ml13R) 7 /ヘプタキス6アミノβ-シクロデキストリンによって形成されたホモ7量体(homoheptameric)細孔を部分的に遮断する
シングルチャネルレコーディング(single-channel recordings)を、トランス側から適用されたam7-βCDと共にαHL-M113Rから形成されたホモ7量体細孔において行った(図2Aおよび2B)。am7-βCDの非存在下において、細孔は、pH 8.0 トリス-HCl 25mM緩衝液中の1M KCl中おいて、145±5 pA(+130 mV)の単位電流(unitary current)(L1)で、常時開いたまま(図2Aおよび2B、B)であった。トランスチャンバのみの中における40 μM am7-βCDの添加は、65±5 pAの電流レベルまで可逆的遮断事象へ導く(図2A、Bおよび図2B、C中のL2)。シスチャンバへの5μM dCMPの添加時に、第3の電流レベルが、電流レベルL2に由来する、22±1 pA(図2A、Cおよび図2B、D中のL3)で観察される。L3は、am7-βCDとの(M113R)7の複合体へのdCMPの結合を示す。チャンバのシス側の代わりにトランス側への300 μMまででのdXMPの添加は、前記シクロデキストリン結合伝導状態(binding conductance states)のいかなる変化へも至らなかった(データは示さず)。
一過性複合体(M113R)7/am7-βCDの部分的遮断は、どのdXMPがシスチャンバへ添加されるかに依存して、振幅が異なった(図3)。シス側へのdGMP(5 μM)の添加は、16 pAの電流レベルへの平均遮断を示した(図3A)。図3Aに示されるトレースの全点振幅ヒストグラム(all points amplitude histogram)は、dGMPの構造と共にトレースの右に示される。他のヌクレオチドは全て、dTMPについての図3B、dAMPについての3C、およびdCMPについての3Dに示されるのとは異なる振幅を示す。前記4つのdXMPうち、dGMPが最も多くの電流を遮断する。
pH 8.0で、突然変異体(M113R)7は、タンパク質チャネルが空いている(unoccupied)場合、2つの電流レベルL1/L1’を示す(図4)。シクロデキストリンアダプターは、前記タンパク質がどの電流レベルL1/L1’にあるかに関わらず、前記タンパク質へ結合し得る。
(M113R)7/am7-βCD細孔の部分的遮断は、どのdXMPがシスチャンバへ添加されるかに依存して、振幅が異なることが分かった。異なる振幅は、dGMP、dTMP、dAMP、およびdCMPが同時にシスチャンバへ添加された場合、分解され(resolve)得た(図5)。
トランス側におけるam7-βCDおよびシス側における被検体ヌクレオチドの1つの存在下での(M113R)7の電流トレースを、300Hz(ローパスガウスフィルター)でデジタル的にフィットさせ、そして全点振幅ヒストグラムを構築した。これらのヒストグラムは、am7-βCDが(M113R)7α溶血素突然変異体へ結合した場合に観察される電流振幅に対応する大きなピークを示す(図1中のL2に対応)。この電流振幅は、実験ごとに5%内で、タンパク質チャネル間で異なる。このため、全点振幅ヒストグラムを、0電流と、65 pAで設定された主要シクロデキストリンピークとの間で標準化した。標準化されたヒストグラムにおいて、ヌクレオチドピークをガウス分布へフィットした。同一のヌクレオチドの平均値およびシグマ(σ)値を、各々1000事象を含む少なくとも3つの独立した実験から平均化した(表2に列挙される値)。
示される結果は、確率的検知は、単一ヌクレオチドの同一についての見込みのある代替法であることを示している。それはまた、エキソヌクレアーゼ配列決定が、安価であり、迅速であり、かつ簡単な、単一分子レベルでのDNA配列決定法として使用され得ることを意味する。エキソヌクレアーゼ配列決定はまた、DNAを配列決定する安価な方法であり、それは何故かと言うと、フルオロフォア等の高価な試薬を必要としないためである。
結合事象は電圧依存性である。50 mVで、非常に少ない結合事象が観察され、これは、dXMPおよびXMPを結合部位へ推進するために最小場(minimum field)が必要とされることを示唆している。+150および+200 mVでの振幅では、ヌクレオチドの識別はもはや可能ではない。+130 mVが、デオキシリボヌクレオチド5’モノホスフェートについて最善な電圧であると分かり、そして+110 mVは、リボヌクレオチド5’モノホスフェートについて最善の分解能を提供した。
トリス-HCl pH 8緩衝液 0.5、1および2M KClを試験した。全点振幅ヒストグラムから、ピーク間の最善の分解能は、1M KClで得られた。
電流振幅はpH依存性であり、トリスHCl緩衝液1M KClを、pH 7.5、8.0、8.2、8.5、9.0、および9.5で、試験した。pH 8.0以上で、上記2つの電流レベルが、am7-βCDの結合時に観察される(図4)。pH 7.5で、ヘプタキス6アミノβ-シクロデキストリンは、第3の電流レベルを示す(示さず)。これは、異なる振幅を有する2つのタイプの事象をdTMPに示させ、その1つはdGMP事象の範囲内にあり、したがって分解能の喪失を導く。pH 9.5で、ヌクレオチド結合事象は、もはや観察されない。最善のピーク分離は、pH 8.0で得られる。
dXMPおよびXMP間の分解能は、NaClまたはCsClを用いるよりも、KClを用いてより良好である。1M KClは、2M KClよりもより良好な分解能を生じる。各結合事象が一過性複合体(M113R)7/am7-βCDの完全な遮断へ導いたため、KBrの使用は、異なるヌクレオチドの同定を可能にしなかった。
温度を14℃へ低下させることまたはそれを50℃へ上昇させることは、dXMP/XMPの検出を妨げなかった。しかし、それは、振幅ヒストグラムの分解能を改善しなかった。
(M113N)7はam7-βCDに結合すると見られたが、ヌクレオチド検出は観察されなかった。(M113F)7および(M113F/147K)7は、am7-βCDが添加されるかどうかに関わらず、検出を生じなかった。(M113K)7を同一条件で試験した。この場合、記録は、図1のそれと非常に類似する。ヌクレオチド結合は、(M113K)7突然変異体およびam7-βCDを用いて検出されたが、ヌクレオチド間のピーク分離は、(M113R)7が使用された場合よりも小さかった。
XMPが本方法で首尾良く同定され、各塩基間の分解能は、U、A、およびCについて1pAよりも小さなピーク分離を伴って、dXMPのそれよりも劣っていた。全点ヒストグラム電流振幅は、dXMPのそれらと同一の順序で現れ、GMPは最も低い電流(最も大きな遮断)を示し、UMP、AMPが続き、そしてCMPは最も高い電流振幅(最も小さな遮断)を伴う。XMP同定についての最適な電圧は、pH 8.0 1M KClで、+110mVであると分かった。
(M113R)7/am7-βCD一過性複合体はまた、グルコースリン酸(グルコース1Pおよびガラクトース1P)に結合しそしてこれを識別することが示された。それは、一方の面上のアルギニン環、他方の面上のam7-βCDからのアミン環およびリン酸基間の強力な相互作用を示唆する。未修飾のβ-シクロデキストリンは、いずれの検出をも生じさせない。XMPおよびdXMP間で僅かな差異が観察され、これは、ヒドロキシル基が結合において大きな役割を果たしていないことを示唆している。
Claims (10)
- 個々のモノホスフェートヌクレオチドを同定する方法であって、
(a)該モノホスフェートヌクレオチドを膜貫通タンパク質細孔と接触させ、その結果、該モノホスフェートヌクレオチドが該細孔と相互作用する工程であって、
前記細孔が、前記モノホスフェートヌクレオチドと前記細孔との相互作用を促進するシクロデキストリンを含み、かつ更に前記細孔が、(i)7つの同一の、配列番号2に示されるサブユニットから形成されているα溶血素、または(ii)7つのサブユニットのうち1つ以上が全配列にわたって配列番号2に対して少なくとも80%の同一性を有し、かつ細孔活性を保持する、その変異体である
前記工程、ならびに
(b)該相互作用の間に該細孔を通過する電流を測定し、それによって該モノホスフェートヌクレオチドの実体を決定する工程
を含む、方法。 - 相互作用が、モノホスフェートヌクレオチドが細孔のチャネルへ可逆的に結合することを伴う、請求項1記載の方法。
- 前記7つのサブユニットのうち1つ以上がM113Rである、請求項1または2記載の方法。
- 前記分子アダプターが、ヘプタキス-6-アミノ-β-シクロデキストリン(am7-β-CD)である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 前記個々のモノホスフェートヌクレオチドが、モノホスフェートリボヌクレオチドまたはモノホスフェートデオキシリボヌクレオチドである、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 工程(a)の前にリボ核酸(RNA)配列を消化し前記個々のモノホスフェートヌクレオチドを提供する工程をさらに含む、請求項5記載の方法。
- 工程(a)の前にデオキシリボ核酸(DNA)配列を消化し前記個々のモノホスフェートヌクレオチドを提供する工程をさらに含む、請求項5記載の方法。
- 前記RNAまたはDNA配列の2つ以上の前記個々のモノホスフェートヌクレオチドを、連続して、前記細孔と接触させ、その結果、該配列の全部または一部の実体が決定され得る、請求項6または7記載の方法。
- 標的核酸配列を配列決定する方法であって、
(a)プロセッシブエキソヌクレアーゼ(processive exonuclease)を使用して該標的配列の一方の末端から個々のモノホスフェートヌクレオチドを消化する工程;
(b)該モノホスフェートヌクレオチドを膜貫通タンパク質細孔と接触させ、その結果、該モノホスフェートヌクレオチドが該細孔と相互作用する工程であって、
前記細孔が、前記モノホスフェートヌクレオチドと前記細孔との相互作用を促進するシクロデキストリンを含み、かつ更に前記細孔が、(i)7つの同一の、配列番号2に示されるサブユニットから形成されているα溶血素、または(ii)7つのサブユニットのうち1つ以上が全配列にわたって配列番号2に対して少なくとも80%の同一性を有し、かつ細孔活性を保持する、その変異体である
前記工程;
(c)該相互作用の間に該細孔を通過する電流を測定し、それによって該モノホスフェートヌクレオチドの実体を決定する工程;および
(d)該核酸配列の同一の末端で工程(a)〜(c)を繰り返し、それによって該核酸の配列を決定する工程
を含む、方法。 - 核酸を配列決定するためのキットであって、
− シクロデキストリン;
− プロセッシブエキソヌクレアーゼ;および
− 膜貫通タンパク質細孔であって、前記細孔が、(i)7つの同一の、配列番号2に示されるサブユニットから形成されているα溶血素、または(ii)7つのサブユニットのうち1つ以上が全配列にわたって配列番号2に対して少なくとも80%の同一性を有し、かつ細孔活性を保持する、その変異体である、前記膜貫通タンパク質細孔
を含む、キット。
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