ES2912963T3 - Sensores híbridos de nanoporo - Google Patents

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ES2912963T3 ES20160143T ES20160143T ES2912963T3 ES 2912963 T3 ES2912963 T3 ES 2912963T3 ES 20160143 T ES20160143 T ES 20160143T ES 20160143 T ES20160143 T ES 20160143T ES 2912963 T3 ES2912963 T3 ES 2912963T3
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Boyan Boyanov
Jeffrey G Mandell
Kevin L Gunderson
Jingwei Bai
Liangliang Qiang
Bradley Baas
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Abstract

Un aparato de detección, que comprende (a) un electrodo; (b) un nanoporo de proteína; y (c) una membrana que rodea el nanoporo de proteína; estando el aparato de detección caracterizado por que el nanoporo de proteína está unido al electrodo.

Description

D E S C R IP C IÓ N
S e n so re s h íb rid o s de n an o p o ro
C a m p o d e la in ve n c ió n
La p re se n te inve nc ión se re fie re a un a p a ra to de d e te cc ió n , a un m é to d o p a ra fa b r ic a r un a p a ra to de d e te cc ió n y a un m é to do p a ra s e c u e n c ia r á c id o s n uc le icos .
A n te c e d e n te s
Los d is p o s itivo s de n a n o p o ro s de p ro te ín a s se han e xp lo ra d o p a ra m u ch as a p lica c io n e s de sen so re s , e sp e c ia lm e n te en e l ca m p o de la se cu e n c ia c ió n de A D N /A R N . La d is c rim in a c ió n de las b ases de n u c le ó tid o s se ha d e m o s tra d o m e d ia n te la le c tu ra de la se ñ a l de co rr ie n te ión ica cu a n d o la m o lé cu la de A D N p a sa a tra vé s de l n an op o ro . A ra íz de e s ta s o b s e rva c io n e s in ic ia les , se ha p o s tu la d o q u e los d is p o s itivo s de n a n o p o ro s b a sa d o s en p ro te ín a s t ie n e n un gran p o te n c ia l p a ra im p u ls a r la te c n o lo g ía de se cu e n c ia c ió n de á c id o s n u c le ico s en té rm in o s de m e n o r p rec io , re spu es ta rá p id a y m a yo r lon g itu d de lectu ra .
U na te c n o lo g ía m ás m a dura , la se cu e n c ia c ió n p o r s ín te s is (S B S ), ha p ro g re sa d o rá p id a m e n te en los ú ltim o s c inco a ño s, d u p lica n d o e l re n d im ie n to a p ro x im a d a m e n te c a d a se is m e se s , s u p e ra n d o con c re ce s la ley de M o ore p a ra la in d u s tr ia de los s e m ico n d u c to re s . Este rá p ido p ro g re so ha s ido p o s ib le g ra c ia s p rin c ip a lm e n te a tre s m e jo ra s c la ve en los p ro to co lo s de S B S : (1) m e jo ra s en la q u ím ica de se cu e n c ia c ió n de l c ic lo ; (2) a u m e n to s en la d e n s id a d de co lo n ia s de á c id o n uc le ico en las s u p e rfic ie s ; y (3) m e jo ra en la te c n o lo g ía de im á g e n e s /e sca n e o . Estas tre s m e jo ras te c n o ló g ic a s han a u m e n ta d o el re n d im ie n to de los s is te m a s c o m e rc ia le s de a p ro x im a d a m e n te 1 G b p o r e je cu c ió n en e n e ro de 2007 a m ás de 1 Tb p o r e je cu c ió n en ju n io de 2012. S in e m b a rg o , no se ha e n co n tra d o q u e e s to s a va n ce s te c n o ló g ic o s sean d ire c ta m e n te tra n s fe r ib le s a las te c n o lo g ía s de n an op oros .
A p e s a r de e s te rá p ido p ro g re so en la m e jo ra de S B S , los p re c io s d e l g e n o m a 30 X aún su p e ra n los 1000 $ /g e n o m a con tie m p o s de re sp u e s ta de m ás de u n a se m a n a . A d e m á s, e l e n s a m b la je de novo y la h a p lo tip ifica c ió n de g e n o m a s h u m a n o s o b te n id o s a tra vé s de S B S se ve n d e sa fia d o s p o r le c tu ra s co rta s . La se cu e n c ia c ió n de h e b ra s a tra vé s de n a n o p o ro s p ue de p o te n c ia lm e n te le e r h as ta 50 ,000 b ases en u no s p o co s m in u tos . E sta p la ta fo rm a de m o lé cu la ú n ica h as ta la fe c h a p a re ce lo g ra r v e lo c id a d p ero a co s ta de u n a p a ra le liza c ió n m uy re duc ida .
La p a ra le liza c ió n de n a n o p o ro s b io ló g ico s es n o to r ia m e n te d ifíc il. La fra g ilid a d de la p la ta fo rm a en sí, e sp e c ia lm e n te la n a tu ra le za s e m iflu id a de la b ica p a lip íd ica , e x ig e un m a ne jo e sp e c ia liz a d o a m e n u d o p o r p arte de té c n ico s a lta m e n te ca p a c ita d o s , lo q u e hace q ue los s is te m a s de n a n o p o ro s sean m e no s p rá c tico s p a ra u n a c o m e rc ia liza c ió n g e n e ra liza d a . La té c n ica a c tu a l p a ra el e n s a m b la je de d is p o s itivo s de n a n o p o ro s de p ro te ín a s es en su m a yo ría m a nu a l, la b o rio sa y re q u ie re m u ch o tie m p o . D espu és de p in ta r u na b ica p a lip íd ica sob re un su s tra to q u e tie n e una m a triz de a b e rtu ra s de l ta m a ñ o de un m ic ró m e tro , el o p e ra d o r p on e en co n ta c to la m a tr iz re cu b ie rta con u n a so lu c ió n q u e tie n e u na ca n tid a d c u id a d o s a m e n te v a lo ra d a de la p ro te ína . La ca n tid a d de n a n o p o ro s se se le cc io n a de a cu erdo con las e s ta d ís tica s de P o isson p a ra m a x im iza r e l n ú m e ro de a b e rtu ra s q u e a d q u ie re n un n an op oro m ie n tra s se m in im iza el n úm e ro de a b e rtu ra s q ue se ca rg a n con m ás de un nan op oro . U na ve z tra n s c u rrid o un p e río d o de in cu b a c ió n e sp e c ífico , la so lu c ió n q ue c o n tie n e n a n o p o ro s se e lim in a p o r lavado . La ca rg a de P o isson re q u ie re q ue el p e río d o de tie m p o se se le cc io n e cu id a d o s a m e n te p a ra lo g ra r e l m a yo r n úm e ro p o s ib le de a b e rtu ra s q ue te n g a n uno y so lo un nan op oro . Los re su lta d o s d e p e n d e n en g ran m e d id a de la h ab ilid a d d e l o p e ra d o r y no se a da p tan fá c ilm e n te a la fa b rica c ió n de d isp o s itivo s a g ran e sca la .
P o r lo tan to , un d e sa fío im p o rta n te p a ra la te c n o lo g ía de n a n o p o ro s es a u m e n ta r la ro b u s te z de la p la ta fo rm a y, al m ism o tie m p o , m e jo ra r la p a ra le liza c ió n , p o r e je m p lo , en a p lica c io n e s de se cu e n c ia c ió n . La p re se n te d ivu lg a c ió n a b o rd a e s ta n eces id ad y p ro p o rc io n a ta m b ié n o tra s ve n ta ja s .
B re v e re s u m e n
Los d e ta lle s de u n a o m ás re a liza c io n e s se e xp o n e n en los d ib u jo s a d ju n to s y en la d e sc rip c ió n a c o n tin u a c ió n . O tras c a ra c te rís tica s , o b je to s y ve n ta ja s se rán e v id e n te s a p a rtir de la d e sc rip c ió n y los d ib u jo s , y de las re iv in d ica c io n e s .
En co n secue nc ia , se p ro p o rc ion a un apa ra to de d e tecc ión según la re iv ind icac ión 1, un m é todo p ara fa b ric a r un apara to de d e tecc ión según la re iv ind icac ión 9 y un m é todo para se cu e n c ia r ác id os nuc le icos según la re iv ind icac ión 15.
La p re se n te inve n c ió n p ro p o rc io n a un a p a ra to de d e te cc ió n q u e inc lu ye (a) un e le c tro d o ; (b) un n a n o p o ro de p ro te ín a a n c la d o al e le c tro d o ; y (c) u na m e m b ra n a q ue ro de a e l n an op o ro . T a m b ié n se p ro p o rc io n a n re a liza c io n e s m ú ltip les . P o r e je m p lo , un a p a ra to de d e te cc ió n de la p re se n te inve nc ión p u e d e in c lu ir (a) u n a p lu ra lid a d de e le c tro d o s ; (b) una p lu ra lid a d de n a n o p o ro s , ca d a u no de los n a n o p o ro s a n c la d o a un e le c tro d o en la p lu ra lid a d de e le c tro d o s ; y (c) u na m e m b ra n a q u e ro de a ca d a u no de los nan op o ros .
T a m b ié n se p ro p o rc io n a un m é to d o p a ra fa b r ic a r un a p a ra to de d e te cc ió n . El m é to do inc lu ye las e ta p a s d e : (a) p ro p o rc io n a r un so p o rte só lid o q u e te n g a u na m a triz de e le c tro d o s ; (b) p ro p o rc io n a r u n a p lu ra lid a d de n a n o p o ro s de p ro te ín a ; (c) p o n e r en co n ta c to la p lu ra lid a d de n a n o p o ro s con la m a triz de e le c tro d o s p a ra u n ir n a n o p o ro s ind iv idu a le s a e le c tro d o s in d iv id u a le s a tra vé s de un p rim e r a n c la je , c re a n d o a s í u n a m a triz de n a n o p o ro s q u e e s tá n a n c la d o s a e le c tro d o s en la p lu ra lid a d de e le c tro d o s ; y (d) p o n e r en co n ta c to la m a triz de n a n o p o ro s con m a te ria l de m e m b ra n a p a ra fo rm a r u na m e m b ra n a q ue ro de e a ca d a uno de los n a n o p o ro s de la m a triz .
Las ve n ta ja s no lim ita tiva s de las re a liza c io n e s p a rticu la re s e xp u e s ta s en el p re se n te d o c u m e n to p a ra el e n sa m b la je de a p a ra to s de d e te cc ió n q u e u tilizan n a n o p o ro s a n c la d o s inc lu ye n , p o r e je m p lo :
(1) M a yo re s n ive les de co n tro l e sp a c ia l sob re la d e p o s ic ió n de n a n o p o ro s d e b id o a la ca p a c id a d de a p ro v e c h a r la e xc lu s ió n e s té ric a de m o do q u e u no y so lo un n a n o p o ro se a co m o d e en c a d a e le c tro d o .
(2) E n sa m b la je a lta m e n te p a ra le lo de m ú ltip le s n a n o p o ro s en un a p a ra to de d e te cc ió n .
(3) C a p a c id a d p a ra lo g ra r e fic ie n c ia s de ca rg a de n a n o p o ro s q u e su p e ra n las lim ita c io n e s de las e s ta d ís tica s de P o isson q u e d ificu lta n los m é to d o s co n v e n c io n a le s de c a rg a de n a n o p o ro s en d e te c to re s m u ltip lex .
B re v e d e s c rip c ió n d e los d ib u jo s
La Fig. 1A (no d e n tro de l a lca n ce de la p re se n te in ve n c ió n ) m u e s tra u na re p re se n ta c ió n e sq u e m á tic a de un n an op oro de p ro te ín a q ue in ic ia lm e n te se a u to e n s a m b la d e n tro de un n a n o d isco de líp ido en so lu c ió n lib re ; la Fig . 1 B (no d e n tro d e l a lca n ce de la p re se n te inve n c ió n ) m u e s tra e l n a n o p o ro de p ro te ín a in je rta d o con un á c ido n uc le ico ; la Fig. 1C (no d e n tro de l a lca n ce de la p re se n te in ve n c ió n ) m u e s tra e l e n s a m b la je d e l n a n o d isco q u e c o n tie n e n a n o p o ro s de p ro te ín a con el n a n o p o ro de e s ta d o só lid o d e b id o a q u e la c a d e n a de á c id o n u c le ico se c o n d u ce a tra vé s d e l n a n o p o ro de e s ta d o só lid o h as ta q u e los líp id os d e l n a n o d isco e n tra n en co n ta c to con la s u p e rfic ie de e s ta d o só lid o .
La Fig. 2 A (no d e n tro de l a lca n ce de la p re se n te in ve n c ió n ) m u e s tra u na re p re se n ta c ió n e sq u e m á tic a de un n an op oro de e s ta d o só lid o de 7 -10 nm e n s a m b la d o con un n a n o d isco de líp ido q u e a su ve z tie n e un n a n o p o ro de p ro te ín a in se rta d o en la m e m b ra n a lip íd ica , en la q u e se in je rta un á c id o n u c le ico en e l n a n o p o ro de p ro te ín a ; la Fig. 2B (no d e n tro de l a lca n ce de la p re se n te in ve n c ió n ) m u e s tra u na re p re se n ta c ió n e sq u e m á tic a de un n a n o d isco de líp ido de 10-13 nm (g ris c la ro ) d e lim ita d o p o r u n a p ro te ín a de e s tru c tu ra (a n illo o scu ro ).
La Fig. 3 m u e s tra u n a re p re se n ta c ió n e s q u e m á tic a de un p ro ce so p a ra la fo rm a c ió n de n a n o d isco s de líp ido.
La Fig . 4 m u e s tra u n a re p re se n ta c ió n e sq u e m á tic a de u n a té c n ic a de ca rg a de n a n o d isco s de líp ido en la q u e se a g re g a p ro te ín a e tiq u e ta d a con H is (p o r e je m p lo , se p ue de u sa r u n a p o rin a en lu g a r de C Y P 3 A 4 ) a la m e zc la in ic ia l, y se u sa u na c o lu m n a de q u e la c ió n de m e ta l p a ra s e p a ra r los d isco s c a rg a d o s de p ro te ín a de los d is co s en b la n co . La Fig. 5 m u es tra fra cc io n e s de exp re s ió n , reconstituc ión y purificac ión de M spA m a rcad a con H is ca rg a d a en un ge l de p o lia crilam id a . C arril M, e sca le ra s de p ro te ína s; carril S, fra cc ió n so lu b le de lisado ce lu la r; carril F, flu jo a tra vé s de la co lu m n a de cen trifug ac ión de N i-N TA ; carril W , p rim e ra fra cc ió n de lavado ; carril E, e luc ión de M spA m arcad a con His. La Fig. 6 A (no d e n tro de l a lca n ce de la p re se n te in ve n c ió n ) m u e s tra un d ise ñ o de d isp o s itivo de p ru e b a de n an o p o ro s de e s ta d o só lid o y la Fig. 6B (no d e n tro de l a lca n ce de la p re se n te inve n c ió n ) m u e s tra u na im p le m e n ta c ió n d e l d ise ño . Se in se rta un ch ip de n a n o p o ro s ("ch ip de S i") en la u b ica c ió n in d ica d a y se se lla en su lu g a r m e d ia n te u na ju n ta de g o m a de ju n ta tó rica . Los e le c tro d o s de A g /A g C l en e l lado c is y tra n s de l p o ro p ro p o rc io n a n la fu e n te de co rrie n te . La co rr ie n te se m ide con un a m p lif ic a d o r A xo p a tch 200B .
La Fig . 7 (no d e n tro d e l a lca n ce de la p re se n te inve n c ió n ) m u e s tra la m e d ic ión de tra n s lo c a c ió n de b io p o ro s de un A D N de 91 u n id a d e s tra n s lo c a d o a tra vé s de b io p o ro s de M sp A in se rta d o s en u na m e m b ra n a su sp e n d id a . El e je ve rtic a l se n o rm a liza a la co rr ie n te de e s ta d o a b ie rto de poro .
La Fig. 8 (no d e n tro d e l a lca n ce de la p re se n te in ve n c ió n ) m u e s tra u n a re acc ión en la q u e un n a n o d isco de líp ido se in cu b a con A D N de c o le s te ro l-T E G p a ra p ro d u c ir un a n c la je de A D N en el n an od isco . El a n c la je de A D N se p ue de u sa r p a ra t ira r e le c tro fo ré tic a m e n te de l n a n o d isco de líp ido sob re un n an o p o ro de e s ta d o só lido .
La F ig . 9 (no d e n tro d e l a lca n ce de la p re se n te inve n c ió n ) m u e s tra un m é to do p a ra m e jo ra r e l a co p la m ie n to e n tre un n a n o d isco de líp ido y un n a n o p o ro en e s ta d o só lid o . La su p e rfic ie de Si3N4 de l so p o rte só lid o se tra ta p rim e ro con un o rg a n o s ila n o , se g u id o de un d e riva d o de co le s te ro l.
La Fig. 10 m u es tra los resu ltados de la op tim izac ión de un p ro to co lo p ara la inserc ión de M spA en un n an od isco de lípido. La Fig. 11A m u es tra u na im agen TE M de la fra cc ió n de e luc ión de a lto peso m o le cu la r de la tra za cen tra l de la Fig. 10. La Fig. 11B m u e s tra u n a im agen T E M de la fra cc ió n de e lu c ió n de b a jo p e so m o le cu la r de la tra z a ce n tra l de la Fig.
10. Los s itio s de inse rc ión de M sp A se ind ican con fle ch a s .
La Fig. 12 m u e s tra u n a re p re se n ta c ió n e sq u e m á tic a de un m é to do seg ún u n a re a liza c ió n de la p re se n te inve nc ión p a ra a n c la r un n a n o p o ro a un e le c tro d o , en e l q ue los a n c la je s de m e m b ra n a se unen al e le c tro d o d e sp u é s de q u e el n a n o p o ro se u na al e le c trod o .
La Fig . 13 m u e s tra u na re p re se n ta c ió n e sq u e m á tic a de un m é to do seg ún o tra re a liza c ió n de la p re se n te inve nc ión p a ra a n c la r un n a n o p o ro a un e le c tro d o , en el q u e los a n c la je s de m e m b ra n a se unen al e le c tro d o a n te s de q ue el n a n o p o ro se u na al e le c trod o .
La Fig. 14 m u e s tra u n a re p re se n ta c ió n e s q u e m á tic a de un m é to d o de a cu e rd o con u n a re a liza c ió n a d ic io n a l de la p re se n te inve nc ión p a ra a n c la r un n a n o p o ro a un e le c tro d o , en el q u e los a n c la je s de l n an op o ro se u nen al e le c tro d o a n te s de q u e e l e le c tro d o e n tre en co n ta c to con el n an op oro .
D e s c rip c ió n d e ta lla d a
Las p la ta fo rm a s a c tu a le s de se cu e n c ia c ió n de c a d e n a s de n a n o p o ro s se b asan en la lib re d ifu s ió n e inse rc ió n de un n a n o p o ro de p ro te ín a (ta m b ié n d e n o m in a d o en el p re se n te d o c u m e n to "p o ro b io ló g ico " o "b io p o ro ") en u n a b ica pa lip íd ica su sp e n d id a de l ta m a ñ o m ic ro m é trico . Se han d e s a rro lla d o d ive rso s m é to d o s p a ra d e te c ta r a co n te c im ie n to s de inse rc ión ú n icos , ya se a m e d ia n te e l co n tro l de la co rr ie n te ión ica o la im p e d a n c ia de CA. E s to s e n fo q u e s se b asan en c irc u ito s /p ro g ra m a s de m o n ito re o a d ic io n a le s q u e p ue de n a m p lia r la h u e lla de l d isp o s itivo y a u m e n ta r la co m p le jid a d d e l s is te m a . La b ica p a lip íd ica de ta m a ñ o m ic ro m é trico es s u sce p tib le a la v ib ra c ió n m e cá n ica , lo q u e a g re g a c o m p le jid a d a la fa b ric a c ió n , e nv ío , a lm a ce n a m ie n to y o p e ra c ió n de l d isp o s itivo . A lte rn a tiva m e n te , los n a n o p o ro s de e s ta d o só lid o con ta m a ñ o s s u p e rio re s a 10 nm son ro b u s to s y c o m p a tib le s ta n to con la fa b rica c ió n co m o con la o p e ra c ió n de a lto re n d im ie n to , lo q ue p ro p o rc io n a u n a p la ta fo rm a ú til p a ra la te c n o lo g ía de n an op oros .
E jem p lo s p a rticu la re s fu e ra d e l a lca n ce de la p re se n te inve n c ió n e m p le a n la inse rc ión de un n an o p o ro de p ro te ín a en un p o rta d o r de n a n o d isco de líp ido y a p lican fu e rz a e le c tro fo ré tica , p o s ib le m e n te con un a n c la je de A D N , p a ra g u ia r e l c o m p le jo de p ro te ín a /líp id o al n an op o ro de e s ta d o só lid o . Un n a n o d isco de líp ido p u e d e ser, p o r e je m p lo , un d isco de b ica p a lip íd ica de 7 a 13 nm de d iá m e tro q u e e s tá o p c io n a lm e n te e s ta b iliz a d o p o r p ro te ín a de e s tru c tu ra de m e m b ra n a (M S P ), un d e riva d o de a po A -I. Se e n te n d e rá q ue un n a n o d isco p u e d e te n e r un d iá m e tro in fe rio r a 7 nm (p. e j., in fe rio r a 6 nm , 5 nm , 4 nm , 2 nm o m e no s de d iá m e tro ) o s u p e r io r a 13 nm (p. e j., s u p e r io r a 15 nm , 20 nm o 25 nm o m ás de d iá m e tro ). P o r lo g e n e ra l, e l á re a d e l d is co de líp ido q u e se u tiliza en un m é to d o o u n a co m p o s ic ió n e xp u e s ta en el p re se n te d o cu m e n to no es s u p e r io r a los 50 ,000 nm 2 o, en a lg u n o s caso s, no es s u p e r io r a a p ro x im a d a m e n te 10 ,000 nm 2 o, a ve ce s , no es s u p e r io r a a p ro x im a d a m e n te 1 ,000 nm 2 o inc lu so o tra s v e ce s no es s u p e r io r a a p ro x im a d a m e n te 500 nm 2.
C om o se e je m p lific a en la Fig. 2 B , e l n a n o d isco de líp ido p ue de e s ta r co m p u e s to p o r u n a b ica p a de m o lécu la s lip íd ica s ro d e a d a s p o r d os M S P p a ra le la s en fo rm a de c in tu ró n en las q u e las h é lices a n fip á tica s d e las M S P e s ta b iliza n el á c id o g ra so h id ro fó b ico en e l b o rd e de l d is co lip íd ico . Se e xp o n e n n a n o d isco s de líp ido p a rticu la rm e n te ú tile s y co m p o s ic io n e s y m é to do s p ara su fa b rica c ió n , p o r e je m p lo , en N ath e t al., B io c h e m is try 46, 2059 -2069 (2007 ).
Los n a n o d isco s de líp ido se p ue de n p re p a ra r m e zc la n d o M S P con fo s fo líp id o e s ta b iliza d o con d e te rg e n te . El a u to e n sa m b la je de los n a n o d isco s o cu rre d u ra n te la e lim in a c ió n d e l d e te rg e n te de la m e zc la , co m o se e xp o n e a c o n tin u a c ió n . Se ha d e m o s tra d o q u e la p re se n c ia de M S P lim ita la fo rm a y e l ta m a ñ o d e l n a n o d isco de líp ido y p ro p o rc io n a u na d is trib u c ió n de ta m a ñ o e s tre c h a (±3 % ), e xce le n te re p ro d u c ib ilid a d y e xce p c io n a l e s ta b ilid a d en so lu c ió n a cu o sa sin d e te rg e n te . La p ro p o rc ió n de M S P a d e te rg e n te se p u e d e s e le cc io n a r p a ra lo g ra r el ta m a ñ o y las ca ra c te rís tic a s d e se a d o s de los n a n o d isco s . P or e je m p lo , e l n ú m e ro de u n id a d e s e s tru c tu ra le s de la M S P se p uede v a r ia r p a ra p e rm itir q u e e l d iá m e tro de l n a n o d isco se a ju s te de 9.8 nm a 12.9 nm co m o se e xp o n e en D e n iso v y col., J. A m . C hem . Soc. 126, 3477 -3487 (2004 ). E s tos d iá m e tro s se a d a p ta n b ien a los n a n o p o ro s de e s ta d o só lid o q u e se p ue de n fa b r ic a r de m a n e ra co n fia b le con m é to d o s d isp o n ib le s co m e rc ia lm e n te . Los n a n o d isco s p ue de n s e r un ve h ícu lo e fica z p a ra in c o rp o ra r p ro te ín a s de m e m b ra n a . Se han in te g rad o v a r ia s p ro te ín a s de m e m b ra n a en n a n o d isco s , co m o c ito c ro m o , p ro te ín a s de s ie te se g m e n to s tra n s m e m b ra n a , q u im io rre c e p to re s b a c te ria n o s y p ro te ín a de ca n a l de a n io n e s d e p e n d ie n te de v o lta je m ito co n d ria l h um a na . Los m é to d o s e je m p la re s p a ra in c o rp o ra r p ro te ín a s de m e m b ra n a en n a n o d isco s se e xp o n e n en R asch le y co l., J. A m . C he m .S oc . 131, 17777 -17779 (2009 ). Se p ue de n u sa r m é to d o s s im ila re s p a ra in s e rta r n a n o p o ro s de p ro te ín a , co m o a -h e m o lis in a , M spA , c ito lis in a y o tros , en n a n o d isco s de líp ido . O tros e je m p lo s de n a n o p o ro s de p ro te ín a ú tile s se e xp o n e n en el d o c u m e n to US 8 ,673 ,550.
El a co p la m ie n to e n tre e l n a n o d isco de líp ido y el n a n o p o ro de e s ta d o só lid o se p ue de fa c ilita r m e d ia n te la ing e n ie ría q u ím ic a de la in te rfaz líp id o /só lid o . P o r e je m p lo , la su p e rfic ie só lid a se p u e d e fu n c io n a liz a r con c ia n o p ro p il s ilano , c o le s te ro l, p o lim e riza c ió n R A F T u o tro s m a te ria le s q u e se u nan o se a dh ie ra n a líp id os y /o M S P . Los m a te ria le s y m é to d o s e je m p la re s p a ra la fu n c io n a liz a c ió n de las s u p e rfic ie s se e xp o n e n en W h ite y co l., J A m C h e m S o c 129, 11766 -11775 (2007 ) y K w ok y co l., P L O S O n e D O I: 10.1371 /jo u rn a l.p o n e .0092880 (2014 ). De m a n e ra s im ila r, el n a n o d isco de líp ido (M S P o líp id o ) se p u e d e m o d ific a r m e d ia n te in g e n ie ría p a ra q ue c o n te n g a m o lé cu la s a d a p ta d o ra s o de a co p la m ie n to q u e p e rm ita n e l a co p la m ie n to con la fu n c io n a liz a c ió n en la s u p e rfic ie d e l n an op o ro de e s ta d o só lido . D ich a m o d ifica c ió n m e d ia n te in g e n ie ría p ue de p ro p o rc io n a r un a is la m ie n to s u p e r io r a 100 G Q e n tre e l n a n o d isco de líp ido y e l n a n o p o ro de e s ta d o só lid o . Estos n ive les de a is la m ie n to p ue de n fa c ilita r a lto s n ive les de d is c rim in a c ió n de b ases p a ra a p lica c io n e s de tra n s lo c a c ió n y secu e n c ia c ió n de á c id o s n uc le ico s . Los n a n o d isco s de líp ido ta m b ié n se p ue de n a co p la r a un n a n o p o ro de e s ta d o só lid o u sa n d o re ac tivos y m é to d o s e xp u e s to s en el p re se n te d o cu m e n to en el co n te x to de a n c la r líp id os a e le c tro d o s . En co n se cu e n c ia , los a n c la je s q u e se u san p a ra u n ir líp id os a los e le c tro d o s se p ue de n u sa r p a ra a co p la r un n a n o d isco a un p oro de e s ta d o só lido .
El p ro ce so p a ra la fo rm a c ió n de n a n o d isco s de líp id os se p ue de lle va r a ca b o co m o se e je m p lific a en la Fig. 3 y m ás d e ta lla d o en B aas "C a ra c te riza c ió n d e l c ito c ro m o P 450 3A 4 h u m a n o m o n o m é rico y la re d u c ta sa d e l c ito c ro m o P450 en d isco s de b ica p a de fo s fo líp id o s a n a n o e sca la ", U n ive rs id a d de Illino is en U rb a n a -C h a m p a ig n , E E .U U . (2006 ), ISBN 0542987236 , 9780542987236 A . C om o se m u e s tra en la fig u ra , la p ro te ín a de e s tru c tu ra de m e m b ra n a se p ue de a u to e n s a m b la r con fo s fo líp id o s so lu b iliza d o s con d e te rg e n te p a ra fo rm a r n a n o d isco s . El a u to e n sa m b la je se p ro d u ce a m e d id a q u e se e lim in a e l d e te rg e n te , p o r e je m p lo , u tiliza n d o B io-B eads® (B io -R ad , H é rcu le s C A ). A c o n tin u a c ió n , el p ro d u c to de la re acc ión de e n s a m b la je se p u e d e p u rif ic a r con c ro m a to g ra fía de e xc lu s ió n p o r ta m a ñ o s . La o p tim iza c ió n de la re lac ión líp id o /p ro te ín a d a co m o re su lta d o n a n o d isco s m o n o d isp e rso s con un ta m a ñ o d e te rm in a d o p o r la long itud de la p ro te ín a de e s tru c tu ra de m e m bran a .
La inse rc ión de p ro te ín a s ú n ica s e inc lu so m ú ltip le s en los n a n o d isco s se p ue de lo g ra r a tra vé s de u n a e ta p a de p u rifica c ió n a d ic io n a l q ue u sa u na m a triz de a fin ida d b a sa d a en n íq ue l p a ra u n ir e sp e c ífica m e n te u n a e tiq u e ta de a fin id a d de p o lih is tid in a en la p ro te ín a n a n o p o ro sa , p o r e je m p lo , u sa n d o m é to d o s s im ila re s a los d e m o s tra d o s en Baas "C a ra c te riza c ió n d e l c ito c ro m o P 450 3A 4 h u m a n o m o n o m é rico y la re d u c ta sa de l c ito c ro m o P 450 en d is co s de b ica pa de fo s fo líp id o s a n a n o e sca la ", U n ive rs id a d de Illino is en U rb a n a -C h a m p a ig n , E E .U U . (2006 ), ISBN 0542987236 , 9780542987236 A . En la Fig. 4 se m u e s tra u na re p re se n ta c ió n e s q u e m á tic a de un m é to do ú til p a ra la sep a ra c ió n b a sa d a en la a fin ida d de n a n o d isco s q u e llevan b io p o ro s .
La m u ta g é n e s is b io ló g ica de p o ro s se p ue de u sa r p a ra o p tim iz a r los p o ro s de p ro te ín a s p a ra e l e n s a m b la je o uso en u na co m p o s ic ió n o m é to d o e xp u e s to en el p re se n te d o cu m e n to . C om o se e xp u so a n te rio rm e n te , e l p ro ce so de in co rp o ra c ió n de un can a l de p ro te ín a en e l n a n o d isco p ue de b e n e fic ia rse de u na e tiq u e ta de a fin id a d de p o lih is tid in a en la p ro te ín a y de la p u rifica c ió n de la p ob lac ión m ix ta de n a n o d isco en u n a c o lu m n a de a fin id a d de Ni. Las té cn ica s de m o d ifica c ió n m e d ia n te in g e n ie ría y m u ta g é n e s is de p ro te ín a s se p ue de n u tiliz a r p a ra m u ta r p o ro s b io ló g ico s y a d a p ta r sus p ro p ie d a d e s p a ra a p lica c io n e s e sp e c ífica s . M sp A con u na e tiq u e ta 6 xH is C -te rm in a l p u e d e e xp re sa rse , re co n s titu irse y p u rifica rse co m o lo d e m u e s tra e l ge l S D S -P A G E q u e se m u e s tra en la Fig. 5 (ca rril M, e sca le ra s de p ro te ín a s ; ca rril S, fra cc ió n so lu b le de lisado de c é lu la s q u e e xp re sa n M sp A m a rca d a con H is; ca rril F, flu jo a tra vé s de la c o lu m n a de ce n tr ifu g a c ió n N i-N T A ; ca rril W , fra cc ió n de p rim e r lava do de la c o lu m n a de ce n tr ifu g a c ió n N i-N T A ; c a rril E, e lu c ió n de M spA m a rca d a con H is de la c o lu m n a de ce n tr ifu g a c ió n N i-N T A ). S e e n co n tró q u e la fu n c io n a lid a d b io ló g ic a de la M sp A e tiq u e ta d a con H is p u rif ica d a e ra s im ila r a la de u na M sp A no e tiq u e ta d a . T a m b ié n se p ueden in tro d u c ir o tra s m u ta c io n e s con fin e s de p u rifica c ió n . P o r e je m p lo , un re s to de c is te ín a p u e d e in tro d u c irse en la se c u e n c ia de la p ro te ín a m e d ia n te m u ta g é n e s is y u sa rse p a ra la co n ju g a c ió n q u ím ica con res tos tio l re a c tivo s (p. ej., m a le im id a s o yo d o a c e ta m id a s ) de e tiq u e ta s de a fin ida d . E je m p lo s de e tiq u e ta s de a fin id a d inc lu ye n b io tin a (que p uede m e d ia r en la p u rifica c ió n m e d ia n te e s tre p ta v id in a de fa se só lid a ), A D N y A R N (que p ue de n m e d ia r en la p urificac ió n m e d ia n te á c id o s n u c le ico s de fa s e só lid a q u e tie n e n s e cu e n c ia s co m p le m e n ta ria s ), e p íto p o s (que p u e d e n m e d ia r en la p u rifica c ió n m e d ia n te a n ticu e rp o s o fra g m e n to s de a n ticu e rp o s de fa se só lid a ) u o tro s lig a n d o s (que p u e d e n m e d ia r en la p u rifica c ió n a tra vé s de re ce p to re s de fa se só lid a p a ra e so s liga n do s).
Las e tiq u e ta s de a fin ida d (p. e j., e tiq u e ta s H is y o tra s e xp u e s ta s en el p re se n te d o cu m e n to ) y las té c n ica s de c o n ju g a c ió n q u ím ic a (p. e j., m o d ifica c io n e s de c is te ín a s e s ta b le c id a s a n te r io rm e n te ) se p ue de n u sa r p a ra u n ir a nc la je s a n a n o p o ro s p a ra su uso en u n a v a r ie d a d de m é to do s , co m p o s ic io n e s o a p a ra to s e xp u e s to s en el p re se n te d o cu m e n to . P o r e je m p lo , los a n c la je s re su lta n te s se p ue de n u sa r p a ra a tra e r o u n ir un n a n o d isco q u e c o n tie n e n a n o p o ro s en o c e rca de un n a n o p o ro de e s ta d o só lid o . Los a n c la je s ta m b ié n se p u e d e n u sa r p a ra u n ir un n a n o p o ro a un e le c tro d o u o tro so p o rte de fa se só lid a .
Un s is te m a e je m p la r fu e ra de l a lca n ce de la p re se n te inve n c ió n se m u e s tra en la Fig . 6. En e s te e je m p lo , e l n an op o ro de e s ta d o só lid o se inse rta en la u b ica c ió n in d ica d a y se se lla en su lu g a r m e d ia n te u na ju n ta tó rica . Los e le c tro d o s de A g /A g C l co n v e n c io n a le s en e l lado c is y tra n s d e l p o ro p ro p o rc io n a n la fu e n te de co rrie n te . Los d a to s de l nan op oro se p u e d e n a d q u ir ir con un a m p lif ic a d o r A xo p a tch 200B . Los d a to s p re lim in a re s de u n a m e m b ra n a de S iN a u to p o rta n te s ó lid a (s in n a n o p o ro s ) han d e m o s tra d o u n a re s is te n c ia s u p e r io r a 100 G ü , lo q ue ind ica u na ce ld a de f lu jo só lid a m e n te se lla d a (co rrie n te de fu g a in fe rio r a 0.9 pA con u n a p o la riza c ió n de 200 m V). Este tip o de c o n fig u ra c ió n es co h e re n te con las co n fig u ra c io n e s "e s tá n d a r" b ien e s ta b le c id a s q u e se u tilizan p a ra e v a lu a r las ca p a c id a d e s a n a lítica s en la té c n ic a de los n an op o ros . Los d a to s re p re se n ta tivo s de un A D N de 91 n u c le ó tid o s q u e se tra n s lo c ó a tra vé s de un n a n o p o ro b io ló g ico en m o do de d e sp la z a m ie n to de ca d e n a se m u es tra n en la F ig . 7.
T a l co m o se u sa en el p re se n te d o cu m e n to , e l té rm in o "n a n o d isco de líp ido" se re fie re a u n a h o ja de b ica p a lip íd ica q u e o cu p a un á re a e n tre a p ro x im a d a m e n te 3 nm 2 y 3 mm2. P o r e je m p lo , el á re a o cu p a d a p u e d e s e r de al m enos a p ro x im a d a m e n te 5 nm 2, 10 nm 2, 50 nm 2, 100 nm 2, 1,000 nm 2, 10 ,000 n m 2, 100 ,000 n m 2, o m ás. A lte rn a tiv a m e n te o a d ic io n a lm e n te , e l á re a o cu p a d a p u e d e s e r co m o m á x im o a lre d e d o r de 100 ,000 nm 2, 10 ,000 nm 2, 1,000 nm 2, 100 nm 2, 50 nm 2, 10 nm 2, 5 nm 2, o m e no s. Un n a n o d isco de líp ido p ue de , p e ro no n e ce sa ria m e n te , o c u p a r un á re a c ircu la r. El á re a c irc u la r o cu p a d a p o r un n a n o d isco p ue de te n e r un d iá m e tro e n tre a p ro x im a d a m e n te 1 nm y 1 |um. S in e m ba rg o , son p o s ib le s á rea s o d iá m e tro s m ás g ra n d e s o m ás p e q u e ñ o s . Un n a n o d isco de líp ido p uede , p e ro no n e ce sa ria m e n te , s e r p la n o o p la n ar. En co n d ic io n e s p a rticu la re s , un n a n o d isco de líp ido p ue de d is tin g u irs e de u n a v e s ícu la o lip o so m a d e b id o a la a u s e n c ia de un lum en a cu o so p a ra e l n a n o d isco y p ue de d is tin g u irse de u n a m ice la d e b id o a la p re se n c ia de u n a b ica p a en e l n an od isco . En el p re se n te d o c u m e n to se e je m p lifica n v a r ia s re a liza c io n e s u sa n d o n a n o d isco s de líp ido . Se e n te n d e rá q u e un n a n o d isco ta m b ié n p u e d e fa b rica rse a p a rt ir de o tros m a te ria le s . P o r e je m p lo , se p uede fo rm a r un n a n o d isco a p a rtir de u n a m e m b ra n a no lip íd ica co m o las q u e se e xp o n e n a co n tin u a c ió n .
T a l co m o se u sa en el p re se n te d o cu m e n to , e l té rm in o "m e m b ra n a " se re fie re a u na lá m in a u o tra b a rre ra q ue im p ide el p aso de co rr ie n te e lé c tr ic a o flu id o s . La m e m b ra n a es n o rm a lm e n te fle x ib le o co m p rim ib le en co n tra s te con los s o p o rte s só lid o s e xp u e s to s en e l p re se n te d o cu m e n to . La m e m b ra n a p u e d e e s ta r h echa de m a te ria l lip íd ico , p o r e je m p lo , p a ra fo rm a r u n a b ica p a lip íd ica , o la m e m b ra n a p u e d e e s ta r h echa de m a te ria l no lip íd ico . La m e m bran a p u e d e e s ta r en fo rm a de u n a m e m b ra n a de co p o lím e ro , p o r e je m p lo , fo rm a d a p o r p o lím e ro s de d ib lo q u e o p o lím e ro s de trib lo q u e , o en fo rm a de u na m o no ca p a , p o r e je m p lo , fo rm a d a p o r un b o la líp id o . V é a se p o r e je m p lo , R a kh m a tu llin a y co l., L a n g m u ir: the A C S J o u rn a l o f S u rfa ce s a n d C o llo id s 24 :6254 -6261 (2008).
T a l co m o se u sa en el p re se n te d o cu m e n to , e l té rm in o "reg ión in te rs tic ia l" se re fie re a un á re a en un su s tra to o en u na su p e rfic ie q u e se p a ra o tras á rea s d e l su s tra to o sup e rfic ie . P o r e je m p lo , u n a re g ión in te rs tic ia l p ue de se p a ra r un n a n o p o ro de u n a m a triz de o tro n a n o p o ro de la m a triz . Las d o s re g io n e s q u e e s tá n se p a ra d a s e n tre s í p ue de n se r d is c re ta s , s in co n ta c to e n tre sí. En m u ch a s re a liza c io n e s , la re g ión in te rs tic ia l es co n tin u a , m ie n tra s q ue las c a ra c te rís tic a s son d isc re ta s , p o r e je m p lo , co m o es e l ca so de u n a m a triz de p o ro s o a b e rtu ra s en u na su p e rfic ie p o r lo d e m á s co n tin u a . La se p a ra c ió n p ro p o rc io n a d a p o r u na reg ión in te rs tic ia l p u e d e s e r u n a se p a ra c ió n p a rc ia l o to ta l. Las re g io n e s in te rs tic ia le s n o rm a lm e n te te n d rá n un m a te ria l de s u p e rfic ie q ue d ifie re d e l m a te ria l de s u p e rfic ie de las c a ra c te rís tic a s en la sup e rfic ie . P o r e je m p lo , las ca ra c te rís tic a s de u na m a triz p ue de n te n e r u na ca n tid a d o c o n ce n tra c ió n de m a te ria l lip íd ico o m a te ria l p ro te ico q u e e xc e d a la ca n tid a d o c o n ce n tra c ió n p re se n te en las re g io ne s in te rs tic ia le s . En a lg u n a s re a liza c io n e s , e l m a te ria l lip íd ico o e l m a te ria l p ro te ico p ue de n no e s ta r p re se n te s en las re g io n e s in te rs tic ia les .
Las re g io n e s in te rs tic ia le s p ue de n s e p a ra r n a n o d isco s de líp ido en al m e no s 1 nm , 5 nm , 10 nm , 100 nm , 1000 nm o m á s en un a p a ra to q u e se e xp o n e en e l p re se n te d o cu m e n to . A lte rn a tiv a m e n te o a d ic io n a lm e n te , la se p a ra c ió n puede s e r de no m ás de 1000 nm , 100 nm , 50 nm , 10 nm o 5 nm.
C o m o se usa aqu í, e l té rm in o "n a n o p o ro de p ro te ín a " se re fie re a un p o lip é p tid o , fo rm a d o co m o u na o m ás su b u n id a d e s , p a ra c re a r u na a b e rtu ra a tra vé s de u na m e m b ra n a o so p o rte só lid o . Los n a n o p o ro s de p ro te ín a e je m p la re s inc lu ye n a -h e m o lis in a , p o rin a A de M yco b a c te riu m sm e g m a tis (M sp A ), g ra m ic id in a A, m a lto p o rin a , O m pF , O m pC , P hoE , Tsx, F -p ilus, SP1 (W ang y co l., C hem . C om m u n., 49 :1741 -1743 , 2013 ) y p o rin a m ito co n d ria l (V D A C )X x , T o m 40 , (p a te n te e s ta d o u n id e n s e n.° 6 ,015 ,714 y D e rring ton y co l., P roc. N atl. A cad . Sci. USA, 107 :16060 (2010 )). "P o rin a A de M yco b a c te riu m sm e g m a tis (M sp A )" es u n a p o rin a de m e m b ra n a p ro d u c id a p o r M yco b a c te ria , q u e p erm ite q u e las m o lé cu la s h id ro fílica s ing re sen a la b a c te ria . M spA fo rm a un o c tá m e ro e s tre c h a m e n te in te rco n e c ta d o y un b a rr il b e ta tra n s m e m b ra n a q u e se a se m e ja a u n a c o p a y c o n tie n e un c a n a l/p o ro ce n tra l. O tros p o ro s ú tile s se e xp on en en e l d o c u m e n to US 8 ,673 ,550.
T a l co m o se u sa en el p re se n te d o cu m e n to , e l té rm in o "a n c la d o " se re fie re al e s ta d o de d os e le m e n to s q u e se u nen a tra vé s de un re s to e n la za d o r. La u n ión p u e d e se r co va le n te , p o r e je m p lo , de m o do q ue u na ca d e n a in in te rru m p id a de e n la ce s c o v a le n te s u ne los d os e le m e n to s . A lte rn a tiva m e n te , la u n ión p u e d e e s ta r m e d ia d a p o r al m e no s un e n la ce no co va le n te , co m o u na in te ra cc ió n de u n ión e sp e c ífica e n tre un re ce p to r y un liga n do . P ares e je m p la re s de re ce p to rlig a n d o inc lu ye n , s in lim itac ió n , e s tre p ta v id in a (y a n á lo g o s de la m ism a) y b io tin a (o a n á lo g o s de la m ism a); a n ticue rp o (o fra g m e n to s fu n c io n a le s de l m ism o) y e p íto p o s ; lec tina s y ca rb o h id ra to s ; á c id os n u c le ico s c o m p le m e n ta rio s , p ro te ín a s de un ión a á c id o s n u c le ico s y sus su s tra to s de á c id o s n uc le icos .
Un "a n c la je " es un re s to e n la z a d o r q ue se p ue de u sa r o p c io n a lm e n te p a ra u n ir d o s e le m e n to s . En a lg u na s c o n fig u ra c io n e s , un a n c la je se u ne a un so lo e le m e n to , com o un n an op oro , un líp ido , un m a te ria l de m e m b ra n a o un so p o rte só lid o . Un a n c la je q ue e s tá u n id o a un a rtícu lo p ue de u n irse o p c io n a lm e n te a un se g u n d o a rtícu lo o usa rse p a ra o tro s fine s . Un a n c la je p ue de in c lu ir n u c le ó tid o s o m a te ria l de á c id o n uc le ico . A lte rn a tiva m e n te , un a n c la je p ue de e s ta r h echo de un m a te ria l d is tin to de un m a te ria l de á c ido n uc le ico o p ue de e s ta r d e sp ro v is to de nuc leó tido s .
Un apa ra to de d e tecc ión de la p rese n te invenc ión p uede usa rse p ara d e te c ta r cu a lq u ie ra de una va rie d a d de a na litos que inc luyen, pero no se lim itan a, iones, ác id os nuc le icos , nuc leó tidos, p o lipép tidos , m o lécu la s p eq ue ña s b io ló g icam e n te activas , líp idos, azú care s o s im ila res . En co n secue nc ia , uno o m ás de e stos a na litos pueden e s ta r p rese n te s o p a sa r a tra vé s de la a be rtu ra de un nanoporo de p ro te ína en un apa ra to e xp u e s to en el p rese n te docum e n to .
En re a liza c io n e s p a rticu la re s , un a p a ra to de d e te cc ió n p ue de in c lu ir un d e p ó s ito c is en co n ta c to con la m a triz de n a n o p o ro s de e s ta d o só lid o y un d e p ó s ito tra n s en co n ta c to con la m a triz d e n a n o p o ro s de e s ta d o só lid o . Los d e p ó s ito s c is y tra n s p ue de n c o n te n e r e le c tro d o s u b ica d o s p a ra a p lic a r u na co rr ie n te a tra vé s de las a b e rtu ra s fo rm a d a s p o r los n a n o p o ro s de p ro te ín a . Un d e p ó s ito c is, un d e p ó s ito tra n s o a m b o s p ue de n co n fig u ra rs e p a ra m a n te n e r un líqu ido en co m u n ica c ió n flu id a m a s iva con u na p lu ra lida d de n a n o p o ro s en un a p a ra to e xp u e s to en e l p re se n te d o cu m e n to . A lte rn a tiva m e n te , u no o a m b o s d e p ó s ito s p ue de n e s ta r en co n ta c to con so lo uno o so lo un su b co n ju n to de los n a n o p o ro s q ue se e n cu e n tra n en u na m a triz o a p a ra to e xp u e s to en el p re se n te d o cu m e n to .
Un n an od isco de líp ido se p uede fa b ric a r a p a rtir de u na va rie d a d de m e m bran as o líp idos. Las b icapas lip íd icas a de cu a d a s y los m é todos p ara fa b ric a r u o b te n e r b icapas lip íd icas son b ien con oc id os en la té cn ica y se d escribe n , p o r e je m p lo , en los d ocum e n to s US 2010 /0196203 y W O 2006 /100484. Las b icapas lip íd icas a de cu ad as inc luyen, p o r e je m p lo , u na m e m bran a de u na cé lu la , u na m e m b ra n a de un o rgánu lo , un liposom a, u na b ica pa lip íd ica p lana y una b ica pa lip íd ica soportada . U na b ica pa lip íd ica se p uede fo rm ar, p o r e je m p lo , a p a rtir de d os cap as o pu es tas de fos fo líp ido s , q ue están d isp ue s ta s de ta l m a ne ra q ue sus g rupos de co la h id ro fób ico s m iran uno h ac ia e l o tro p ara fo rm a r un in te rio r h id ro fób ico , m ien tras q ue los g rupos de ca b e za h id ro fílicos de los líp idos m iran hac ia e l a m b ie n te acu oso a ca d a lado de la b icapa . Las b icapas lip íd icas ta m b ié n se pueden fo rm ar, p o r e je m p lo , p o r e l m é todo de M onta l y M u e lle r (P roc. Natl. A cad . Sci. USA ., 1972; 69: 3561-3566 ), en e l q ue u na m o no ca p a de líp idos se tra n sp o rta en la in te rfaz de so luc ión a cu osa /a ire m ás a llá de cad a lado de u na a be rtu ra q ue es p e rp e n d icu la r a e sa in terfaz. El líp ido norm a lm ente se a g re g a a la sup erfic ie de u na so luc ión e le c tro lítica a cu osa d iso lv ié n d o lo p rim e ro en un d iso lve n te o rgá n ico y luego p e rm itie nd o q ue una g o ta de l so lven te se e va po re en la sup erfic ie de la so luc ión a cu osa a cad a lado de la abe rtu ra . Una ve z q ue el d iso lve n te o rgá n ico se ha e va po ra do , las in te rfaces so lu c ió n /a ire a cad a lado de la a be rtu ra se m ueven fís ica m e n te h ac ia a rrib a y hac ia a ba jo m ás a llá de la a be rtu ra h asta q ue se fo rm a u na b icapa . O tros m é to do s com unes de fo rm ac ió n de b ica pa s inc luyen la inm ers ión de pun tas, la p in tu ra de b icapas y la fijac ión de parch es de b icapas de liposom as. U na va ried ad de o tros m é to do s p ara o b te n e r o g e n e ra r m e m bran as son b ien con oc id os en la té cn ica y son igu a lm en te a p licab les p ara su uso en las co m p o s ic io n e s y m é todos de la p rese n te invenc ión re lac io na do s con nanoporos a nc lad os . Los reactivos y m é to do s e xp ue s to s an te rio rm en te pueden usa rse en com b ina c ión con n an op oros a nc lad os o en re a liza c io ne s en las que los m a te ria les de m e m b ra n a e stán a nc lad os a un e lec trodo .
La p re se n te inve n c ió n p ro p o rc io n a un a p a ra to de d e te cc ió n q u e inc lu ye (a) un e le c tro d o ; (b) un n a n o p o ro de p ro te ín a a n c la d o al e le c tro d o ; y (c) u na m e m b ra n a q ue ro de a e l n an op o ro . T a m b ié n se p ro p o rc io n a n re a liza c io n e s m ú ltip les . P o r e je m p lo , un a p a ra to de d e te cc ió n de la p re se n te inve nc ión p u e d e in c lu ir (a) u n a p lu ra lid a d de e le c tro d o s ; (b) una p lu ra lid a d de n a n o p o ro s de p ro te ín a , ca d a u no de los n a n o p o ro s a n c la d o a un e le c tro d o en la p lu ra lid a d de e le c tro d o s ; y (c) u n a m e m b ra n a q ue ro de a ca d a uno de los nan op o ros .
Un e le c tro d o u sa do en un m é to d o o a p a ra to de la p re se n te inve n c ió n p ue de e s ta r h echo de cu a lq u ie ra de u na va rie d a d de m a te ria le s u sa d o s en d is p o s itivo s de d e te cc ió n de n a n o p o ro s u o tro s d is p o s itivo s p a ra p ro ce so s e le c tro q u ím ico s . En re a liza c io n e s p a rticu la re s , los e le c tro d o s e stán h echo s de un m eta l. Los e le c tro d o s se p u e d e n m o d e la r sob re un so p o rte só lid o de m o do q u e e l so p o rte in c lu ya u na p lu ra lid a d de e le c tro d o s . P o r e je m p lo , e l so p o rte só lid o p ue de in c lu ir al m e no s 1, 2, 10, 100, 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, o m ás e le c tro d o s . C om o a lte rn a tiva o a d ic io n a lm e n te , un so p o rte só lid o p ue de in c lu ir no m ás de 1 x 106, 1 x 105, 1 x 104, 1 x 103, 100, 10, 2 o 1 e le c tro d o s .
Los e le c tro d o s q ue e s tá n sob re un so p o rte só lid o p ue de n e s ta r s e p a ra d o s e n tre s í p o r re g io n e s in te rs tic ia le s q ue ca re ce n del m a te ria l d e l e le c tro d o o q u e no son co n d u c to ra s . En co n se cu e n c ia , los e le c tro d o s p ue de n s e r e sp a c ia l y fu n c io n a lm e n te d isc re to s . En a lg u n a s re a liza c io n e s , ca d a e le c tro d o e s tá u b ica d o d e n tro de un pozo u o tra ca ra c te rís tic a có n c a v a sob re un so p o rte só lid o y las p a re d e s de las ca ra c te rís tic a s có n ca va s fu n c io n a n co m o re g io ne s in te rs tic ia le s e n tre e le c tro d o s . Las re g io n e s in te rs tic ia le s p ue de n se p a ra r los e le c tro d o s en un so p o rte só lid o de m a n e ra q ue e l e sp a c ia d o de p aso p ro m e d io (ce n tro a ce n tro ) de los e le c tro d o s sea , p o r e je m p lo , de al m e no s 5 nm, 10 nm , 25 nm , 50 nm , 100 nm , 1 pm , 10 pm , 100 pm o m ás. De fo rm a a lte rn a tiva o a d ic io n a l, e l p aso p ue de ser, p o r e je m p lo , no s u p e r io r a 100 pm , 10 pm , 1 pm , 100 nm , 50 nm , 25 nm , 10 nm , 5 nm o m e no s. En a lg u n a s re a liza c io ne s , las re g io n e s in te rs tic ia le s ta m b ié n p u e d e n c a re c e r de líp id os o n a n o p o ro s u o tro s m a te ria le s d e sc rito s en e l p re se n te d o c u m e n to q u e se u nen a un e le c tro d o .
Los e le c tro d o s u sa d o s en un a p a ra to o m é to do e xp u e s to en el p re se n te d o c u m e n to p ue de n te n e r cu a lq u ie ra de una v a r ie d a d de ta m a ñ o s o fo rm a s q ue log ran un uso d e se a d o de l a p a ra to de d e te cc ió n . P o r e je m p lo , los e le c tro d o s p ue de n te n e r u n a h ue lla re donda , re c ta ng u la r, cu a d ra d a , p o lig o n a l, e tc . El á re a o cu p a d a p o r un e le c tro d o p ue de ser, p o r e je m p lo , de al m e no s 25 nm 2, 100 nm 2, 500 nm 2, 1 p m 2, 50 p m 2, 100 p m 2, 1 m m 2, o m ás g ra n d e . A lte rn a tiva m e n te o a d ic io n a lm e n te , e l á re a de los e le c tro d o s p ue de ser, p o r e je m p lo , co m o m á x im o de 1 m m 2, 100 p m 2, 50 p m 2, 1 p m 2, 500 nm 2, 100 n m 2, 25 n m 2, o m á s p eq ue ño .
En re a liza c io n e s p a rticu la re s , un e le c tro d o p ue de e s ta r cu b ie rto al m e no s p a rc ia lm e n te p o r u n a a lm o h a d illa d ie lé c trica . Las a lm o h a d illa s d ie lé c tr ica s p ue de n p ro p o rc io n a r re s to s re a c tivo s q u e in te ra c tú a n con m o lécu la s , ta le s com o m o lé cu la s de a nc la je , p a ra lo g ra r la u n ión de las m o lé cu la s a la a lm o h a d illa d ie lé c trica . La q u ím ica de a co p la m ie n to de s ilan o es p a rticu la rm e n te ú til p a ra e l a co p la m ie n to . Las q u ím ica s de a co p la m ie n to e je m p la re s se e xp o n e n en las p u b lica c io n e s de so lic itud de p a te n te e s ta d o u n id e n s e n.° 2014 /0200158 A1 o 2015 /0005447 A1. Las m o lé cu la s q ue e s tá n u n id as a las a lm o h a d illa s d ie lé c tr ic a s se u n irá n e fe c tiv a m e n te al e le c tro d o a tra vé s de la a lm o h a d illa d ie lé c trica .
U na a lm o h a d illa d ie lé c tr ic a u sa d a en un m é to d o o a p a ra to e xp u e s to en e l p re se n te d o c u m e n to p u e d e te n e r á rea s en el rango e je m p lific a d o a n te r io rm e n te p a ra e le c tro d o s . En a lg u n o s caso s, la a lm o h a d illa d ie lé c tr ic a o cu p a rá u na fra cc ió n de la su p e rfic ie de un e le c tro d o q u e es, co m o m á x im o , el 75 % , 50 % , 25 % , 10 % , 5 % , 1 % o m e no s de la su p e rfic ie d e l e le c tro d o . Las a lm o h a d illa s d ie lé c tr ic a s p a rticu la rm e n te ú tile s te n d rá n un á re a co m p a ra b le o m ás p e q u e ñ a q u e la h ue lla de un n an op oro . C om o ta l, la a lm o h a d illa d ie lé c tr ic a te n d rá ca p a c id a d p a ra u no y so lo un n an op oro . La e xc lu s ió n e s té ric a re su ltan te p e rm ite q u e u n a m a triz de e le c tro d o s q u e tie n e n las a lm o h a d illa s d ie lé c tr ica s e n tre en co n ta c to con un e xce so de n a n o p o ro s (es d ec ir, u na ca n tid a d de n a n o p o ro s m a yo r q ue la ca n tid a d de e le c tro d o s en la m a triz ) de m o do q u e to d o s o la m a yo ría de los e le c tro d o s se p ue da n u n ir a los n a n o p o ro s m ie n tra s se e v ita e l r iesgo de u n ir m ú ltip le s n a n o p o ro s a e le c tro d o s in d iv id u a le s q ue p o d ría o c u rr ir si no se log ra la e xc lu s ió n e s té rica .
C u a lq u ie ra de u na v a r ie d a d de n a n o p o ro s e xp u e s to s en el p re se n te d o c u m e n to o c o n o c id o s en la té c n ica de o tro m o do p ue de u sa rse en u n a re a liza c ió n de u n ión de a nc la je e x p u e s ta en e l p re se n te d o cu m e n to . Los n an op oros p a rtic u la rm e n te ú tile s son los n a n o p o ro s de p ro te ín a co m o M sp A.
Un n a n o p o ro se p ue de a n c la r a un e le c tro d o (p o r e je m p lo , a tra vé s de u na a lm o h a d illa d ie lé c tr ica ) u sa n d o res tos co v a le n te s o re s to s de u n ión no cova le n te s . Un e je m p lo de u na u n ión co va le n te es cu a n d o un a n c la je de á c ido n uc le ico se une co v a le n te m e n te al n a n o p o ro y se u ne co v a le n te m e n te a la a lm o h a d illa d ie lé c trica . Se p u e d e n u sa r o tros a n c la je s de m a n e ra s im ila r p a ra la u n ión co va le n te , inc lu ido s , p o r e je m p lo , a n c la je s q ue no son de á c id o n uc le ico ta le s co m o p o lie tile n g lico l u o tro s p o lím e ro s s in té ticos . Un e je m p lo de u n a u n ión no co va le n te es cu a n d o un n a n o p o ro tie n e un res to de a fin id a d u n ido , co m o u n a e tiq u e ta de p o lih is tid in a , S tre p -ta g u o tro re s to de a fin ida d co d ifica d o p o r a m in o á c id o . Los re s to s de a fin ida d p ue de n u n irse de fo rm a no co va le n te a lig a n d o s en u n a a lm o h a d illa d ie lé c trica , co m o n íque l u o tro s c a tio n e s d iva le n te s q ue se u nen a p o lih is tid in a o b io tin a (o a n á lo g o s de la m ism a) q ue se u nen a S tre p -ta g . En a lg u n a s re a liza c io n e s , no es n e ce sa rio u tiliz a r d ich o s re s to s de a fin ida d de a m in o á c id o s .
Un a p a ra to e xp u e s to en e l p re se n te d o c u m e n to p ue de in c lu ir c u a lq u ie r n ú m e ro de n a n o p o ro s a n c la d o s q ue se d esee . P o r e je m p lo , un a p a ra to p ue de in c lu ir al m e no s 1, 2, 10, 100, 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, o m ás n an o p o ro s a nc la d o s . C om o a lte rn a tiva o a d ic io n a lm e n te , un a p a ra to p ue de in c lu ir no m ás de 1 x 106, 1 x 105, 1 x 104, 1 x 103, 100, 10, 2 o 1 n a n o p o ro a nc lad o .
C u a lq u ie ra de u n a v a r ie d a d de m a te ria le s de m e m b ra n a p u e d e u sa rse en u na re a liza c ió n de a n c la je de n an op oros e x p u e s ta en e l p re se n te d o cu m e n to . Los líp id os e je m p la re s q u e se p ue de n u sa r inc lu ye n los e xp u e s to s en el p re se n te d o c u m e n to en el co n te x to de los e je m p lo s a n te r io re s fu e ra d e l a lca n ce de la p re se n te inve n c ió n , o en las re fe ren c ia s c ita d a s en e l m ism o . O tros m a te ria le s de líp id os ú tile s se e xp o n e n en la p a te n te e s ta d o u n id e n s e n.° 8 ,999 ,716.
En re a liza c io n e s p a rticu la re s , u n a m e m b ra n a se p ue de a n c la r a un e le c tro d o . La m e m b ra n a se p u e d e a n c la r a un e le c tro d o al q ue ta m b ié n se a nc le un n an op oro (p o r e je m p lo , a tra vé s de u n a a lm o h a d illa d ie lé c tr ica ). Los a n c la je s u sa d o s p a ra u n ir el m a te ria l de m e m b ra n a a un e le c tro d o se p ue de n s e le cc io n a r de los q u e se e je m p lifica n en el p re se n te d o c u m e n to con re sp e c to a los a n c la je s de n an op oros . Los a n c la je s con tio le s re a c tivo s p ue de n se r e sp e c ia lm e n te ú tile s p a ra u n ir e le c tro d o s q u e co n tie n e n o ro . T a m b ié n son p o s ib le s o tro s a n c la je s q u e inc lu ye n , p o r e je m p lo , a n c la je s con g ru p o s re a c tivo s de s ilan o o fo s fo n a to q u e se p u e d e n u sa r p a ra u n irse a ó x id o s m e tá licos co n d u c to re s (vé ase , p o r e je m p lo , F o lke rs y co l., L a n g m u ir 11 :813 (1995 ). En a lg u n a s re a liza c io n e s , se u sa un m a te ria l de a n c la je d ife re n te p a ra el m a te ria l de m e m b ra n a en c o m p a ra c ió n con el a n c la je u sa d o p a ra un n an op oro . A lte rn a tiva m e n te , se p ue de u sa r e l m ism o tip o de a n c la je p ara n a n o p o ro s y m a te ria le s de m e m bran a . Se e n te n d e rá q u e en a lg u n a s re a liza c io n e s , o en a lg u n a s e ta p a s de p re p a ra c ió n de un a p a ra to de d e te cc ió n , e l m a te ria l de m e m b ra n a q u e ro de a un n an op oro no n e ce s ita e s ta r a n c la d o al e le c tro d o al q u e e s tá a n c la d o el nan op o ro .
En a lg u n o s a p a ra to s de d e te cc ió n , p a rticu la rm e n te a q u e llo s con m ú ltip le s e le c tro d o s , la m e m b ra n a q u e ro de a a cad a u no de los n a n o p o ro s p ue de fo rm a r un se llo p a ra e l e le c tro d o al q ue se une el n an op o ro . El se llo se p ue de h a ce r p ara e v ita r e l f lu jo de flu id o s o co rr ie n te e lé c tr ic a d e sd e el e le c tro d o al q ue e s tá a n c la d o e l n a n o p o ro a o tro s e le c tro d o s del a p a ra to de d e te cc ió n . P o r e je m p lo , e l e le c tro d o p ue de e s ta r d e n tro de un p ozo (u o tra ca ra c te rís tic a c ó n ca va ) y la m e m b ra n a p ue de se lla r e l p ozo fo rm a n d o u n a lám ina co n tin u a q ue co n ta c ta con las p a re d e s d e l pozo. A s í se fo rm a u na c á m a ra d e n tro d e l e sp a c io d e fin id o p o r e l e le c tro d o , las p a re d e s de l p ozo y la m e m bran a . La cá m a ra p uede fu n c io n a r co m o u n a c á m a ra c is o tra n s d e p e n d ie n d o de la o rie n ta c ió n re la tiva de los e le c tro d o s y la o rie n ta c ió n de l n a n o p o ro inse rtad o .
T a l co m o se e xp o n e con m a yo r d e ta lle a c o n tin u a c ió n , un a p a ra to de d e te cc ió n q u e tie n e n a n o p o ro s a n c la d o s p ue de s e r p a rtic u la rm e n te ú til p a ra la d e te cc ió n de á c id os n uc le icos , in c lu id a la d e te cc ió n de á c id os n u c le ico s en un m é to do de se cu e n c ia c ió n . C om o ta l, el a p a ra to de d e te cc ió n p ue de p re se n ta rse en un e s ta d o en e l q ue un a na lito de ácido n u c le ico se e n c u e n tra en u na a b e rtu ra fo rm a d a p o r e l nan op o ro . El á c id o n u c le ico q ue es un a na lito q u e se v a a d e te c ta r es d is tin to y d ife re n te de un á c id o n u c le ico q u e se p u e d e u sa r co m o un a n c la je en el a pa ra to .
El a p a ra to de d e te cc ió n p u e d e in c lu ir o tro h a rd w a re u tiliza d o p a ra la d e te cc ió n de n a n o p o ro s , co m o e le c tro d o s co n fig u ra d o s p a ra c re a r u na co rr ie n te a tra vé s de u n a m e m b ra n a y a tra vé s de un nan op oro , un a m p lif ic a d o r q ue e stá c o n fig u ra d o p a ra a m p lif ic a r las se ñ a le s e lé c trica s g e n e ra d a s en el nan op o ro , un o rd e n a d o r a co p la d o al a p a ra to p ara e v a lu a r se ñ a le s d e te c ta d a s de u no o m ás n an op oros , e tc . El h a rd w a re ú til p a ra d e te c ta r se ñ a le s de n a n o p o ro s y que p u e d e m o d ifica rse p a ra su u so en un m é to do e xp u e s to en e l p re se n te d o c u m e n to se d e sc rib e en la té cn ica , p o r e je m p lo , en las p a te n te s e s ta d o u n id e n s e s n.° 8 ,673 ,550 o 8 ,999 ,716 ; R osen s te in y co l., N a n o L e tt 13 ,2682 -2686 (2013 ); o U dd in y co l., N a n o te c h n o lo g y 24, 155501 (2013 ).
T a m b ié n se p ro p o rc io n a un m é to d o p a ra fa b r ic a r un a p a ra to de d e te cc ió n . El m é to do inc lu ye las e ta p a s d e : (a) p ro p o rc io n a r un so p o rte só lid o q u e te n g a u na m a triz de e le c tro d o s ; (b) p ro p o rc io n a r u n a p lu ra lid a d de n a n o p o ro s de p ro te ín a ; (c) p o n e r en co n ta c to la p lu ra lid a d de n a n o p o ro s con la m a triz de e le c tro d o s p a ra u n ir n a n o p o ro s in d iv id u a le s a e le c tro d o s in d iv id u a le s a tra vé s de un p rim e r a nc la je , c re a n d o a s í u n a m a triz de n a n o p o ro s q ue se a nc lan a e le c tro d o s en la p lu ra lid a d de e le c tro d o s ; y (d) p o n e r en co n ta c to la m a triz de n a n o p o ro s con m a te ria l de m e m b ra n a p a ra fo rm a r u na m e m b ra n a q ue ro de e a ca d a uno de los n a n o p o ro s de la m a triz .
En la Fig. 12 se m u es tra u na rea lización e je m p la r de un m é todo p ara a n c la r un nan op oro a un e lec trodo . S e p rop o rc ion a un e le c trod o de m eta l, p rese n ta nd o la sup erfic ie de l e le c trod o u na a lm oh ad illa d ie lé c trica que cu b re u na porc ión de la superfic ie . P or e je m p lo , la a lm oh ad illa d ie lé c trica p uede se r u na a lm oh ad illa a p ro x im ad am en te c ircu la r q ue tien e un d iá m e tro de a p ro x im a d a m e n te 10-50 nm. La a lm oh ad illa d ie lé c trica p uede te n e r s ilan os reactivos q ue son ca p a ce s de fo rm a r un e n la ce co va le n te con un resto q ue e s tá p rese n te en un a nc la je de nanoporos . Un n anoporo se p uede m o d ifica r q u ím ica m e n te p ara inc lu ir un a nc la je de ácido nuc le ico que te n g a el resto. El nan op oro q ue con tien e el anc la je puede e n to n ce s p on erse en con tac to con la a lm oh ad illa d ie lé c trica en con d ic ion e s p ara q ue el s ilano re acc ion e con el anc la je p ara u n ir co va le n te m e n te e l nanoporo a la a lm oh ad illa d ie léctrica . U na ve z q ue se ha un ido el nanoporo , los a nc la jes de m e m bran a pueden re a cc io n a r con la sup erfic ie m e tá lica de l e lec trodo . P or e je m p lo , los a nc la je s de m e m b ra n a pueden inc lu ir tio les q ue fo rm an e n la ce s cova le n te s con la sup erfic ie m etá lica . En la ú ltim a e ta pa que se m uestra , el m ate ria l de m e m bran a (p. ej., m a te ria l lip íd ico) se p uede p o n e r en con tac to con el s is te m a en co n d ic io n e s p ara fo rm a r u na m e m bran a (p. ej., b ica pa lip íd ica ) q ue rodea e l nanoporo anc lad o y p ara fo rm a r e n la ce s cova le n te s e n tre los anc la jes de m e m bran a y los líp idos en la b icapa . Así, la m e m bran a tam b ién e s tá a nc lad a al e lec trodo .
En la Fig. 13 se m u e s tra o tra re a liza c ió n . El m é to d o u sa c o m p o n e n te s s im ila re s a los u sa d o s en la Fig. 12. Sin e m b a rg o , a q u í los a n c la je s de m e m b ra n a se u nen a la s u p e rfic ie m e tá lica de l e le c tro d o a n tes de la u n ión al n an op o ro .
En la Fig. 14 se m u e s tra o tro e je m p lo de re a liza c ió n . En e s ta re a liza c ió n , el e le c tro d o de m e ta l no inc lu ye u na a lm o h a d illa d ie lé c trica . El e le c tro d o de m eta l se hace re a c c io n a r con a n c la je s de m e m b ra n a en u na p rim e ra e tapa . Luego , se u tiliza u n a te c n o lo g ía de n a n o im p re s ió n , co m o la litog ra fía , p a ra u n ir a n c la je s de n a n o p o ro s a la sup e rfic ie d e l e le c tro d o de m e ta l. Los a n c la je s de n a n o p o ro s se p ue de n im p rim ir en un á re a p e q u e ñ a (p o r e je m p lo , á reas a p ro x im a d a m e n te c ircu la re s q u e tie n e n un d iá m e tro de a p ro x im a d a m e n te 10-50 nm ). A c o n tin u a c ió n , un n an op oro p u e d e p o n e rse en co n ta c to con el e le c tro d o q ue c o n tie n e a n c la je en c o n d ic io n e s p a ra c re a r un e n la ce co va le n te e n tre e l n a n o p o ro y e l a nc la je . En la e ta p a fina l, se p ue de fo rm a r u na m e m b ra n a (p o r e je m p lo , u n a m e m b ra n a lip íd ica ) a lre d e d o r d e l n a n o p o ro a n c la d o y re a c c io n a r con los a n c la je s de m e m b ra n a p a ra u n irse al e le c trod o .
En re a liza c io n e s p a rticu la re s , u n a p lu ra lid a d de n a n o p o ro s se p one en co n ta c to con u n a p lu ra lid a d de e le c tro d o s en fo rm a m a siva . P o r e je m p lo , u na so lu c ió n q u e inc lu ye los n a n o p o ro s se p u e d e p o n e r en co n ta c to con un so p o rte só lid o q u e tie n e m ú ltip le s e le c tro d o s de m o do q ue los n a n o p o ro s en la so lu c ió n e s tén en co m u n ica c ió n flu id a con m ú ltip les e le c tro d o s . La ca n tid a d de n a n o p o ro s q ue se p on en en co n ta c to con la m a triz de e le c tro d o s p u e d e e xc e d e r la can tida d de e le c tro d o s en la m atriz . Esto se p u e d e hacer, p o r e je m p lo , p a ra a u m e n ta r la p ro b a b ilid a d de q u e la m a yo ría o to d o s los e le c tro d o s se a nc len a un n an op oro . Los e le c tro d o s se p u e d e n c o n fig u ra r p a ra q u e te n g a n u n a c a p a c id a d p a ra no m á s de un nan op oro . P o r e je m p lo , el e le c tro d o p ue de te n e r u na su p e rfic ie o u n a p arte de la s u p e rfic ie re la tiva m e n te p e q u e ñ a en c o m p a ra c ió n con e l ta m a ñ o d e l n an op o ro . C om o re su ltad o , u n a ve z q ue un p rim e r n a n o p o ro se ha un ido al e le c tro d o , un n a n o p o ro s u b s ig u ie n te q u e d a e s té rica m e n te e xc lu id o de u n irse al m ism o e le c tro d o . P o r lo ta n to , u na m a triz p ue de in c lu ir u n a ca n tid a d de e le c tro d o s q ue tie n e n un so lo n a n o p o ro q u e e xce d e la ca n tid a d q u e se e sp e ra ría de las e s ta d ís tica s típ ica s de P o isson . P o r e je m p lo , u na m a triz se p ue de c a rg a r con un so lo n a n o p o ro en c a d a u no de al m e no s e l 50 % , 65 % , 75 % , 90 % , 95 % , 99 % o m ás de los e le c tro d o s de la m atriz .
Los n a n o p o ro s q u e e s tá n en co n ta c to con el m a te ria l de m e m b ra n a p u e d e n so lu b iliza rse con d e te rg e n te . Luego , el d e te rg e n te se p ue de e lim in a r de los n a n o p o ro s de p ro te ín a p a ra p e rm itir q ue u n a m e m b ra n a (p o r e je m p lo , u n a b ica pa lip íd ica ) rodee los n an op o ros . P o r e je m p lo , la d iá lis is in s itu se p u e d e lle va r a cab o u n a ve z q u e los n a n o p o ro s se unen a la s u p e rfic ie de l e le c tro d o . Los m é to d o s de d iá lis is in s itu e je m p la re s y las c o m p o s ic io n e s de a n c la je se e xp o n e n en G ie ss y co l., B io p h y s ic a l J. 87 :3213 -3220 (2004).
En a lg u n a s re a liza c io n e s , los n a n o p o ro s p u e d e n a tra e rse e lé c tr ic a m e n te a los e le c tro d o s p a ra fa c ilita r la u n ió n . Un n a n o p o ro p u e d e a tra e rse en fu n c ió n de la c a rg a in trín seca . S in e m b a rg o , ta m b ié n es p o s ib le u tiliz a r un a nc la je ca rg a d o , co m o un á c id o n uc le ico , y a tra e r e l a n c la je al e le c tro d o . Los m é to d o s e je m p la re s p a ra la lo ca liza c ió n a s is tid a e lé c tr ic a m e n te de á c id o s n u c le ico s en e le c tro d o s se e xp o n e n en la p a te n te e s ta d o u n id e n se n.° 8 ,277 ,628.
C u a lq u ie ra de u n a v a r ie d a d de a n c la je s d e sc rito s en e s te d o c u m e n to o c o n o c id o s en la té c n ica p ue de u sa rse en un m é to d o e xp u e s to en e l p re se n te d o cu m e n to . Un a n c la je p a rticu la rm e n te ú til es un a nc la je de á c id o n uc le ico . En a lg u n a s re a liza c io n e s , co m o las e je m p lifica d a s en la Fig. 12 y la Fig. 13, se p ue de u n ir un a n c la je a un n a n o p o ro a n tes de u n ir e l a n c la je a un e le c tro d o . A lte rn a tiva m e n te , p o r e je m p lo , co m o se m u e s tra en la Fig. 14, p rim e ro se p u e d e u n ir un a n c la je de n a n o p o ro s a un e le c tro d o y luego e l n a n o p o ro se hace re a c c io n a r con e l a n c la je de n a n o p o ro s p ara c re a r u n a u n ión e n tre el n a n o p o ro y e l a nc la je .
Un m é to d o e xp u e s to en e l p re se n te d o c u m e n to p u e d e in c lu ir u na e ta p a de u n ir e l m a te ria l de m e m b ra n a a u no o m ás e le c tro d o s a tra vé s de un a nc la je . Los a n c la je s de m e m b ra n a p a rtic u la rm e n te ú tile s son m o lé cu la s b ifu n c io n a le s que tie n e n un d o m in io lipo fílico y un e sp a c ia d o r h id ro fílico . El d o m in io lipo fílico (p. e j., fo s fo líp id o , c o le s te ro l o fita n ilo ) se in se rta en u n a m e m b ra n a y e l e sp a c ia d o r h id ro fílico se p ue de u n ir a un so p o rte só lid o , co m o un e le c tro d o . S e e xp on en a n c la je s de m e m b ra n a e je m p la re s , p o r e je m p lo , en G ie ss y co l., B io p h y s ic a l J. 87 :3213 -3220 (2004).
La p re se n te inve n c ió n p ro p o rc io n a a d e m á s un m é to d o de se cu e n c ia c ió n de á c id os n u c le ico s q u e inc lu ye las e ta p a s d e : (a) p ro p o rc io n a r un a p a ra to de d e te cc ió n q u e inc lu ye (i) u n a p lu ra lida d de e le c tro d o s , (ii) u n a p lu ra lid a d de n a n o p o ro s , ca d a u no de los n a n o p o ro s a n c la d o a un e le c tro d o en la p lu ra lid a d de e le c tro d o s , y (iii) u na m e m b ra n a q u e ro de a ca d a u no de los n a n o p o ro s ; y (b) d e te c ta r el paso, a tra vé s de c a d a uno de los n a n o p o ro s , de (i) un ácido n uc le ico , (ii) u n a se rie de n u c le ó tid o s e x tra íd o s d e l á c id o n uc le ico , o (iii) u n a se rie de so n d a s d e riva d a s de n uc leó tido s in co rp o ra d o s en el á c ido n uc le ico , d e te rm in a n d o a s í la se cu e n c ia de l á c id o n uc le ico .
Un á c id o n u c le ico d e te c ta d o en los m é to d o s de la p re se n te inve n c ió n p ue de s e r m o n o ca te n a rio , b ica te n a rio o c o n te n e r u n a se cu e n c ia ta n to m o n o ca te n a ria co m o b ica te n a ria . Las m o lé cu la s de á c id o n u c le ico se p ue de n o r ig in a r en una fo rm a b ic a te n a ria (p o r e je m p lo , A D N b c) y, o p c io n a lm e n te , se p u e d e n c o n v e rt ir en u n a fo rm a m o n o ca te n a ria . Las m o lé cu la s de á c id o n uc le ico ta m b ié n se p u e d e n o rig in a r en u n a fo rm a m o n o ca te n a ria (p. e j., A D N m c, A R N m c), y el A D N m c se p ue de c o n v e rtir o p c io n a lm e n te en u n a fo rm a b ica te n a ria . Los m o do s e je m p la re s de tra n s lo ca c ió n de p o lin u c le ó tid o s a tra vé s de un p o ro se e xp o n e n en el d o c u m e n to W O 2013 057495.
En a lg u n a s re a liza c io n e s , la se cu e n c ia c ió n se p ue de lle va r a ca b o p a sa n d o un á c ido n u c le ico a tra vé s de un n an op oro de p ro te ín a y d e te c ta n d o se ñ a le s e lé c trica s in d ica tiva s d e l p aso de un n u c le ó tid o p a rt ic u la r o u na se rie de n u c le ó tid o s (p o r e je m p lo , u n a "p a la b ra " q u e c o n s ta de 2, 3, 4, 5 o m ás n uc le ó tid o s). En a lg u n a s re a liza c io n e s , se p u e d e lo g ra r un c ie rto n ive l de tra n s lo c a c ió n c o n tro la d a de un p o lin u c le ó tid o a tra vé s de un n a n o p o ro b a jo la g u ía de un m o to r m o le cu la r, com o u na h e licasa , tra n s lo c a sa o p o lim e ra sa co n tra u n a d ife re n c ia de p o te n c ia l e lé c trico . Los m o to re s m o le cu la re s p ue de n m o ve r e l p o lin u c le ó tid o p aso a p aso , n o rm a lm e n te con uno o m ás n u c le ó tid o s p o r paso. Este tr in q u e te c o n tro la d o ra le n tiza la tra n s lo c a c ió n de l p o lin u c le ó tid o a tra vé s de l n a n o p o ro d e sd e u n a v e lo c id a d n a tiva de p s /n u c le ó tid o a m s /n u c le ó tid o .
Un m é to d o de d e te cc ió n p u e d e u tiliz a r u n a d ife re n c ia de p o te n c ia l a tra vé s de u n a b a rre ra (p o r e je m p lo , u na m e m b ra n a ). La d ife re n c ia de p o te n c ia l p ue de s e r u n a d ife re n c ia de p o te n c ia l e lé c trico , u na d ife re n c ia de p o te n c ia l q u ím ico o u n a d ife re n c ia de p o te n c ia l e le c tro q u ím ico . Se p ue de im p o n e r u na d ife re n c ia de p o te n c ia l e lé c tr ico a tra vé s de la b a rre ra (p o r e je m p lo , m e m b ra n a ) a tra vé s de u n a fu e n te de v o lta je q u e in ye c ta o a d m in is tra co rr ie n te a al m e no s u no de los d e p ó s ito s de líqu ido . Se p ue de im p o n e r un p o te n c ia l q u ím ico a tra vé s de la b a rre ra p o r m e d io de una d ife re n c ia en la co m p o s ic ió n ión ica de los d o s d e p ó s ito s . Se p ue de e s ta b le c e r u n a d ife re n c ia de p o te n c ia l e le c tro q u ím ic o m e d ia n te u na d ife re n c ia en la co m p o s ic ió n ió n ica de los d o s d e p ó s ito s en co m b in a c ió n con un p o ten c ia l e lé c trico . La d ife re n te co m p o s ic ió n ión ica p ue de ser, p o r e je m p lo , d ife re n te s iones en c a d a d e p ó s ito o d ife re n te s c o n c e n tra c io n e s de los m ism os iones en ca d a d e p ó s ito .
La a p lica c ió n de un p o te n c ia l e lé c tr ico a tra vé s de un p o ro p a ra fo rz a r la tra n s lo c a c ió n de un á c id o n u c le ico a tra vé s d e l p o ro es b ien co n o c id a en la té c n ic a y p u e d e u sa rse de a cu e rd o con e l p re se n te a p a ra to y m é to d o s (D e a m e r y col., T ren ds B io te ch n o l., 18 :147-151 (2000 ); D e a m e r y co l., A c c C h e m Res., 35 :817 -825 (2002 ); y Li y co l., N a t M ate r., 2 (9 ) :611 -615 (2003 ). Un m é to do e xp u e s to en el p re se n te d o cu m e n to se p ue de lle va r a ca b o con un v o lta je a p lica d o a tra vé s de un p oro . El in te rva lo p a ra el v o lta je se p ue de s e le cc io n a r d e sd e 40 m V h as ta m ás de 1 V. N o rm a lm e n te , un m é to d o e xp u e s to en e l p re se n te d o c u m e n to se e je c u ta rá en e l in te rva lo de 100 a 200 m V. En ca so s e sp e c ífico s , el m é to d o se e je c u ta a 140 m V o 180 m V. No se re qu ie re q ue los v o lta je s sea n e s tá tico s d u ra n te e l m o v im ie n to del m o to r. La p o la rid a d de v o lta je se a p lica n o rm a lm e n te de ta l m a n e ra q ue el á c id o n uc le ico ca rg a d o n e g a tiva m e n te es im p u lsa d o e le c tro fo ré tic a m e n te h ac ia el in te rio r d e l poro . En a lg u n o s caso s, se p ue de re d u c ir e l v o lta je o in ve rtir la p o la rid a d p a ra fa c ilita r e l fu n c io n a m ie n to a de cu a d o .
En a lg u n o s ca so s , se p u e d e u tiliz a r la a p lica c ió n de d ife re n c ia le s de p res ió n p a ra fo rz a r la tra n s lo c a c ió n de un ácido n u c le ico a tra vé s de un poro . P ueden u sa rse d ife re n c ia le s de p res ió n en lu g a r de p o te n c ia le s e lé c trico s u o tras d ife re n c ia s de p o te n c ia l en los m é to d o s e je m p lific a d o s en e l p re se n te d o cu m e n to . A lte rn a tiva m e n te , se p ue de u sa r un d ife re n c ia l de p re s ió n en co m b in a c ió n con p o te n c ia le s e lé c trico s u o tra s d ife re n c ia s de p o te n c ia l en los m é to do s e je m p lific a d o s en el p re se n te d o cu m e n to .
Los m é to d o s de la p re se n te inve nc ión p ue de n p ro d u c ir u na o m ás se ñ a le s q ue co rre sp o n d e n a la tra n s lo c a c ió n de u no o m ás n u c le ó tid o s a tra vé s de un poro . En co n se cu e n c ia , a m e d id a q ue un p o lin u c le ó tid o o b je tivo , o a m e d id a q ue un m o n o n u c le ó tid o o so n d a d e riv a d a d e l p o lin u c le ó tid o o m o n o n u c le ó tid o o b je tivo , tra n s ita a tra vé s de un poro , la co rr ie n te a tra vé s de la b a rre ra ca m b ia d e b id o al b lo q u e o de la co n s tr icc ió n d e p e n d ie n te de la b ase (o d e p e n d ie n te de la son da ), p o r e je m p lo . La se ñ a l de e se ca m b io en la co rr ie n te se p u e d e m e d ir u sa n d o cu a lq u ie ra de u n a v a r ie d a d de m é to d o s co m o se d e sc rib e en e l p re se n te d o c u m e n to o co m o se co n o ce p o r lo d e m á s en la té cn ica . C ad a se ñ a l es ú n ica p a ra la e sp e c ie de n u c le ó tid o (s ) (o son da ) en e l poro , de m o do q u e la señ a l re su lta n te p ue de u sa rse para d e te rm in a r u na c a ra c te rís tic a d e l p o lin u c le ó tid o . P o r e je m p lo , p u e d e d e te rm in a rs e la ide n tid ad de u n a o m ás e sp e c ie s de n u c le ó tid o (s ) (o so n d a ) q ue p ro d u ce u na señ a l c a ra c te rís tica . Las se ñ a le s ú tile s en los m é to d o s de la p re se n te inve n c ió n inc lu ye n , p o r e je m p lo , se ñ a le s e lé c tr ic a s y se ñ a le s ó p tica s . En a lg u n o s a sp e c to s , la se ñ a l e lé c tr ic a p uede s e r u n a m e d id a de co rr ie n te , vo lta je , tu n e liza c ió n , re s is te nc ia , vo lta je , co n d u c ta n c ia ; o m e d id a e lé c tr ic a tra n sve rsa l (vé ase e l d o c u m e n to W O 2013 /016486 ). En a lg u n o s a sp ec tos , la señ a l e lé c tr ic a es u na co rr ie n te e lé c tr ica q u e p a sa a tra vé s de un poro .
Las se ñ a le s ó p tica s ú tile s en los m é to d o s de la p re se n te d ivu lg a c ió n inc lu ye n , p o r e je m p lo , se ñ a l de f lu o re sc e n c ia y R am an. Las se ñ a le s ó p tica s p u e d e n g e n e ra rse a co p la n d o e l n u c le ó tid o o b je tivo con un m a rc a d o r g e n e ra d o r de se ñ a le s ó p tica s , p o r e je m p lo , un res to flu o re sc e n te o un re s to g e n e ra d o r de se ñ a le s R am an. P or e je m p lo , en de la T o rre y co l., N a n o te ch n o lo g y , 23 (38 ):385308 (2012 ), se e m p le ó e l e s q u e m a ó p tico de m ic ro sco p ía de flu o re sc e n c ia de re flex ión in te rn a to ta l (T IR F) p a ra ilu m in a r u na a m p lia á re a de la m e m b ra n a re cu b ie rta con T iO 2. En S on i y col., R e v S c i Ins trum ., 81 (1 ):014301 (2010 ), se u tilizó un m é to do p a ra in te g ra r d os m o d a lid a d e s de m e d ic ió n de u n a so la m o lé cu la , a saber, m ic ro sco p ía de re flex ión in te rn a to ta l y d e te cc ió n e lé c tr ic a de b io m o lé cu la s u sa n d o nan op oros .
C om o se d e sc rib e en el p re se n te d o cu m e n to , los n a n o p o ro s a n c la d o s se p u e d e n a co p la r con un c ircu ito de d e tecc ión , q ue inc luye , p o r e je m p lo , un c ircu ito de a b ra za d e ra de p a rch e , un c irc u ito de e le c tro d o de tu n e liz a c ió n o un c ircu ito de m e d ic ión de c o n d u c ta n c ia tra n s v e rsa l (com o u n a n a n o c in ta de g ra fe n o o un n a n o h u e co de g ra fe n o ), p a ra re g is tra r las se ñ a le s e lé c tr ic a s en los m é to d o s de la p re se n te d ivu lg a c ió n . A d e m á s, e l p o ro ta m b ié n se p u e d e a co p la r con un s e n so r ó p tico q u e d e te c ta e tiq u e ta s , p o r e je m p lo , un res to flu o re sc e n te o un res to g e n e ra d o r de se ñ a le s R am an, en los p o lin u c le ó tid o s .
Los m o to re s m o le cu la re s p ue de n u tiliz a r la e n e rg ía de la h id ró lis is de n u c le ó tid o s p a ra im p u ls a r la tra n s lo c a c ió n de un p o lin u c le ó tid o o b je tivo a tra vé s de un nan op oro . U na h e lica sa es un e je m p lo en el q u e la h id ró lis is de A T P es la fu e n te de e n e rg ía p a ra la tra n s lo ca c ió n de p o lin u c le ó tid o s . P o r e je m p lo , en un m o de lo , un p o lin u c le ó tid o m o n o ca te n a rio se m a n tie n e en u na h e n d id u ra c a rg a d a n e g a tiva m e n te q ue se p a ra los d o s d o m in io s R ecA de u n a h e lica sa de un te rc e r d o m in io . En a u se n c ia de A T P , un re s idu o de tip o su je ta lib ro s (p o r e je m p lo , T rp501 en la h e lica sa d e l V H C ) y un res iduo de a b ra za d e ra (p o r e je m p lo , A rg 393 en la h e lica sa d e l V H C ) e v ita n q ue el p o lin u c le ó tid o m o n o ca te n a rio se d e s lice a tra vé s de u na h en d id u ra . T ras la u n ión de A T P , los d o m in io s R ecA g iran , m o v ie n d o la a b ra za d e ra A rg ca rg a d a p o s itiva m e n te . La a b ra za d e ra A rg a tra e el p o lin u c le ó tid o m o n o ca te n a rio ca rg a d o n e g a tiva m e n te , q u e a su ve z e lim in a el re s idu o de tip o su je ta lib ro s . El p o lin u c le ó tid o m o n o ca te n a rio se re pe le e n to n ce s p o r la h e n d id u ra c a rg a d a n e g a tiva m e n te , y el p o lin u c le ó tid o m o n o ca te n a rio se tra n s lo c a a tra vé s de la h e lica sa h as ta q u e se h id ro liza e l A TP . P o r lo ta n to , en e s te m o d e lo de e je m p lo , la tra n s lo c a c ió n de l p o lin u c le ó tid o a tra vé s de u na h e lica sa im p lica al m enos d o s e ta p a s : u na p rim e ra e ta p a d o n d e la h e lica sa se u ne al A T P y e x p e r im e n ta un ca m b io c o n fo rm a c io n a l, y una s e g u n d a e ta p a d o n d e e l A T P se h id ro liza y e l p o lin u c le ó tid o se tra n s lo c a a tra vé s de la h e licasa .
O tra s té c n ica s de d e te cc ió n q ue se p ue de n a p lic a r a un a p a ra to e xp u e s to en el p re se n te d o c u m e n to inc lu ye n , p e ro sin lim ita rse a, a co n te c im ie n to s de d e te cc ió n , com o e l m o v im ie n to de u na m o lé cu la o u n a p o rc ió n de e sa m o lécu la , p a rtic u la rm e n te si la m o lé cu la es A D N o u na e n z im a q u e se u ne al A D N , co m o u na p o lim e ra sa . P o r e je m p lo , O lse n y co l., J A C S 135: 7855 -7860 (2013 ), d e sc rib e n la b io c o n ju g a c ió n de m o lé cu la s se n c illa s de l fra g m e n to K le n o w (KF) de la A D N p o lim e ra sa I en n a n o c ircu ito s e le c tró n ico s p a ra p e rm itir re g is tro s e lé c tr ic o s de la fu n c ió n e n z im á tic a y la va r ia b ilid a d d in á m ica con la re so lu c ió n de a co n te c im ie n to s de in co rp o ra c ió n de n u c le ó tid o s in d iv id u a le s . O, p o r e je m p lo , H urt y co l., J A C S 131: 3772 -3778 (2009 ), d e sc rib e la m e d ic ión d e l tie m p o de p e rm a n e n c ia p a ra co m p le jo s de A D N con el K F e n c im a de un n a n o p o ro en un ca m p o e lé c trico a p licad o . O, p o r e je m p lo , K im y co l., S ens. A c tu a to rs B C hem . 177: 1075 -1082 (2012 ), d e sc rib e e l uso de un s e n s o r de m e d ic ión de co rr ie n te en e xp e rim e n to s q ue invo luc ra n A D N c a p tu ra d o en un n an op oro de a -h e m o lis in a . O, p o r e je m p lo , G a ra ld e y co l., J. B io l. C hem . 286 : 14480 ­ 14492 (2011 ), d e sc rib e la d is tin c ió n de co m p le jo s de K F -A D N en fu n c ió n de sus p ro p ie d a d e s cu a n d o se ca p tu ra n en un ca m p o e lé c tr ico e n c im a de un p oro de a -h e m o lis in a . O tras re fe re n c ia s q ue d ivu lg a n m e d ic io n e s q ue invo luc ra n ah e m o lis in a inc lu ye n las s ig u ie n te s , to d a s p ara H o w o rka y co l.: P N A S 98: 12996 -13301 (2001 ); B io p h y s ic a l J o u rn a l 83: 3202 -3210 (2002 ); y N a tu re B io te c h n o lo g y 19: 636 -639 (2001).
La p a te n te e s ta d o u n id e n s e n.° 8 ,652 ,779 co n c e d id a a T u rn e r y co l. d e sc rib e co m p o s ic io n e s y m é to d o s de s e cu e n c ia c ió n de á c id os n u c le ico s u sa nd o un so lo co m p le jo de e n z im a p o lim e ra sa q ue inc lu ye u n a e n z im a p o lim e ra sa y un á c ido n uc le ico m o lde u n id o p ro x im a lm e n te a un n an o p o ro y a n á lo g o s de n u c le ó tid o s en so lu c ió n . Los a ná lo g o s de n u c le ó tid o s inc lu ye n e tiq u e ta s de b lo q u e o de c a rg a q u e se u nen a la p o rc ió n de p o lifo s fa to d e l a n á lo g o de nuc leó tido de m a n e ra q u e las e tiq u e ta s de b lo q u e o de ca rg a se e sc in d e n cu a n d o el a n á lo g o de n u c le ó tid o se in co rp o ra a un á c id o n u c le ico en c re c im ie n to . S eg ú n T u rn e r, e l m a rc a d o r de b lo q u e o de c a rg a es d e te c ta d o p o r e l n a n o p o ro p ara d e te rm in a r la p re se n c ia y la ide n tid ad d e l n u c le ó tid o in co rp o ra d o y, p o r lo ta n to , d e te rm in a r la s e cu e n c ia de un á c ido n u c le ico m o lde . La p u b lica c ió n de p a te n te e s ta d o u n id e n s e n.° 2014 /0051069 se re fie re a co n s tru c c io n e s q u e inc lu ye n u n a su b u n id a d de p o ro de p ro te ín a tra n s m e m b ra n a y u na e n z im a de m a ne jo de á c id o nuc le ico .
E J E M P L O I (n o re iv in d ic a d o )
Los d o s e je s p rin c ip a le s de l d ise ñ o e xp e rim e n ta l son : (a) m o d ific a r m e d ia n te ing e n ie ría , s in te tiz a r y p u rif ic a r el c o m p le jo de p ro te ín a -n a n o d isco ; y (b) e n s a m b la r e l co m p le jo en la p la ta fo rm a de n a n o p o ro s de e s ta d o só lid o m e d ia n te fu e rz a s e le c tro fo ré tica s . La fu e rz a im p u lso ra e le c tro fo ré tic a se p u e d e m e jo ra r u n ie n d o p o lie le c tro lito o m o lé cu la de A D N en el d is co o p ro te ín a fo rm a d o ra de p oros . Es p o s ib le q u e se re q u ie ra un tra ta m ie n to de su p e rfic ie a d ic io n a l p a ra m e jo ra r el a is la m ie n to en la in te rfaz de d isco de líp ido y n an o p o ro só lid o .
OBJETIVO ESPECÍFICO n.° 1: demostrar la incorporación de nanoporos de MspA en nanodiscos de lípido
H ito s : (a) e n s a m b la r y c a ra c te r iza r e l n a n o d isco de líp ido en b la n co ; (b) m o d ific a r m e d ia n te in g e n ie ría p ro te ín a M spA con e tiq u e ta de H is con e l p ro p ó s ito de se p a ra c ió n y p u rif ica c ió n ; (c) in c o rp o ra r la p ro te ín a M sp A en el n a n o d isco de líp ido , p u rif ic a r e l p ro d u c to y c a ra c te r iz a r la m o rfo lo g ía .
Sintetizar nanodisco de lípido incorporado en bioporos
Los n a n o d isco s de líp ido en b la n co se s in te tiza n m e d ia n te la t itu la c ió n de la p ro p o rc ió n de líp ido y M S P . El e n fo q u e e xp e rim e n ta l se rev isó a n te r io rm e n te en re lac ió n con la Fig. 3. Se p re p a ra n m u ta n te s de b io p o ro s con e tiq u e ta s His en el e x tre m o C te rm in a l. Los m u ta n te s de b io p o ro s e tiq u e ta d o s con H is se a g re g a n a la m e zc la de p re cu rso re s de n a n o d isco s a n tes de q u e se e lim in e el d e te rg e n te p a ra q u e la in co rp o ra c ió n de b io p o ro s te n g a lu g a r d u ra n te e l p roce so de a u to e n sa m b la je de n a n o d isco s de líp ido . Se u tiliza u na ca n tid a d en e xce so de c o m p o n e n te de n a n o d isco p ara g a ra n tiz a r un a lto re n d im ie n to de in co rp o ra c ió n . El c o m p le jo de n a n o p o ro -n a n o d isco se se p a ra de los n an od isco s v a c ío s m e d ia n te u na co lu m n a de a fin ida d de e tiq u e ta de H is. T o d o el p ro ce so se c o n tro la y a n a liza m e d ia n te c ro m a to g ra fía de e xc lu s ió n p o r ta m a ñ o (S E C ) y e le c tro fo re s is en ge l de p o lia c r ila m id a con d o d e c ilsu lfa to de sod io (S D S -P A G E ), y se c a ra c te r iza a d e m á s m e d ia n te m ic ro sco p ía de fu e rz a a tó m ica en fa se líq u id a y m ic ro sco p ía e le c tró n ic a de tra n sm is ió n .
OBJETIVO ESPECÍFICO n.° 2: Conseguir un sellado de >100 GO de nanodisco de lípido insertado en nanoporo de estado sólido
H ito s : (a) e s ta b le c e r u na in fra e s tru c tu ra de n a n o p o ro s y e le c tro fo re s is ; (b) e n s a m b la r e le c tro fo ré tic a m e n te un n a n o d isco de líp ido en b la n co en un n a n o p o ro de e s ta d o só lid o ; (c) si es n ece sa rio , fu n c io n a liz a r q u ím ica m e n te el n a n o p o ro de e s ta d o só lid o p a ra g a ra n tiz a r un se lla d o de >100 G Q ; (d) d e m o s tra r la a c tiv id a d de p o ro s b io ló g ico s de M sp A en el s is te m a h íb rido .
Construir un sistema de nanoporos de estado sólido
Los m é to d o s de fa b rica c ió n de n a n o p o ro s de e s ta d o só lid o han u tiliza d o h is tó rica m e n te la p e rfo ra c ió n con haz e n e rg iza d o , p o r e je m p lo , con un haz de e le c tro n e s en un m ic ro sco p io e le c tró n ic o de tra n sm is ió n (T E M ) (vé ase , p o r e je m p lo , S torm y co l., N a tu re M a te ria ls 2, 537 -540 (2003 )), un haz de iones G a en un haz de iones e n fo c a d o (F IB ) (vé ase , p o r e je m p lo , P a tte rson y co l., N a n o te c h n o lo g y 19, 235304 (2008 )) o un haz de iones h e lio (H IB ) (vé ase , p o r e je m p lo , Y ang y co l., N a n o te c h n o lo g y 22, 285310 (2011 )). Se u tiliza rá un su m in is tro co m e rc ia l de n a n o p o ro s de 7 -10 nm p a ra la d e m o stra c ió n in ic ia l y e l d e sa rro llo de l s is te m a . La c re a c ió n de p ro to tip o s in ic ia le s de l e q u ip o re q u e rid o se lle va a ca b o co m o se e xp o n e a n te r io rm e n te en re lac ió n con la Fig. 6 A y F ig . 6 B . Las h e rra m ie n ta s de e le c tro fis io lo g ía , co m o e l a m p lif ic a d o r de a b ra za d e ra de p a rch e y las e s ta c io n e s de tra b a jo de e le c tro q u ím ica , y u na ins ta la c ión de sa la lim p ia se u tilizan p a ra el tra b a jo a d ic io n a l de n a n o fa b rica c ió n .
Conseguir un nanoporo sellado con nanodisco de lípido con una resistencia de >100 GO
La tra n s lo c a c ió n de b io m o lé cu la s im p u lsa d a p o r e le c tro fo re s is a tra vé s de n a n o p o ro s de e s ta d o só lid o se ha e s tu d ia d o a m p lia m e n te en la ú ltim a d é ca d a . Se p u e d e a p lic a r la m ism a e s tra te g ia p a ra se lla r e l n a n o p o ro de e s ta d o só lid o con un n a n o d isco de líp ido de ta m a ñ o re la tiva m e n te g ra n d e , d e ja n d o el n an op o ro de p ro te ín a in co rp o ra d o co m o la ú n ica v ía p a ra la co rr ie n te ión ica y la ú n ica v ía p a ra los a n a lito s q u e se d e te c ta rá n al p a s a r p o r e l poro . La e fic a c ia d e l se lla do se p ru e b a con n a n o d isco s de líp ido en b la n co (s in b io p o ro s ). D ado q u e e l n a n o d isco de líp ido e s tá lig e ra m e n te ca rg a d o , se p u e d e u tiliz a r u n a m o lé cu la de A D N d e riv a tiz a d a con co le s te ro l-T E G p a ra m e jo ra r el e fe c to de la e le c tro fo re s is de c a p tu ra r e l n a n o d isco de líp ido. El A D N m a rca d o con c o le s te ro l t ie n d e a u n irse a la m e m b ra n a lip íd ica in se rta n d o la u n idad h id ro fó b ica de co le s te ro l en la m e m b ra n a . En la Fig. 8 se m u e s tra u n a re p re se n ta c ió n e sq u e m á tic a de un n a n o d isco en b la n co q ue tie n e un a n c la je de á c id o n uc le ico .
El ca m p o e lé c tr ico g u ía el n a n o d isco q u e c o n tie n e el a n c la je ca p tu ra n d o la ca d e n a de A D N a lta m e n te ca rg a d a . La p ro b a b ilid a d de ca p tu ra ta m b ié n se ve a fe c ta d a p o r e l ta m a ñ o de l n an op o ro , la fu e rz a ión ica , e l v o lta je y la v isco s id a d , q ue se p ue de n a ju s ta r p a ra lo g ra r la ca rg a d e se a d a . En e s ta e ta p a in te rm e d ia son p o s ib le s m ú ltip le s in se rc io n e s de a n c la je s d e A D N en un so lo n an od isco , p e ro no d e b e ría n a fe c ta r la ca p a c id a d d e e v a lu a r la e fic ie n c ia d e se lla d o e n tre e l n a n o d isco y la su p e rfic ie d e l n a n o p o ro de e s ta d o só lido .
Se pueden u sa r m od ificac ion es ad ic ion a le s p ara log ra r un se lla do de >100 GQ, p o r e je m p lo , en re a liza c io ne s d on de un se lla do no se c re a com p le ta m e n te a tra vé s de la acc ión e le c tro fo ré tica . Si es necesario , e l nanoporo de e s tado só lido se p uede fu n c io n a liza r p a ra se lla r las v ía s de fu g a de la in te rfaz. G a ra n tiza r la h id ro fob ic id ad de la in te rfaz p uede e v ita r el tra n sp o rte de iones so lva ta do s . U na té cn ica cons is te en re cub rir la sup erfic ie su p e rio r del nanoporo de e s ta do só lido con d e riva d o s de l co le s te ro l q ue a se gu ran q ue la sup erfic ie sea h id ró foba, al m ism o tie m p o q ue se insertan sus g rupos te rm in a le s h id ró fobos en la m em brana . La q u ím ica superfic ia l e sp ec ífica q ue se p uede u sa r se m u es tra en la Fig. 9.
O tro e n fo q u e es e l a n c la je loca l de l n a n o d isco de líp ido, p o r e je m p lo , co m o se d e sc rib e en S ta ckm a n n S c ie n ce 271, 43 -48 (1996 ); S te in em y co l. B io ch im . B io p h ys . A c ta , 1279, 169 -180 (1996 ); V a lle jo , B io e le c tro c h e m is try 57, 1-7 (2002 ); y A va n ti P o la r L ip ids, Inc. (o c tu b re de 2013), ''P re p a ra tio n of L ip o so m e s", o b te n id o de h ttp ://a v a n tilip id s .c o m /in d e x .p h p ? o p tio n = c o m _ c o n te n t& id = 1384 & Ite m id = 372 If . A lte rn a tiv a m e n te o a d ic io n a lm e n te , to d a la su p e rfic ie d e l ch ip de Si3N4 se p u e d e re c u b rir con u n a m e m bran a , p o r e je m p lo , c o m o se d e sc rib e en Y u sko y co l., N a tu re N an o tech . 6, 253 (2011 ). El b io p o ro de M spA p u e d e e n to n c e s in se rta rse d ire c ta m e n te d e sp u é s de la fo rm a c ió n de e s te re cu b rim ie n to de m e m b ra n a . El im p e d im e n to e s té rico se p u e d e a p ro v e c h a r p a ra g a ra n tiz a r q u e so lo se p u e d a in se rta r u n a so la p o rin a en c a d a a be rtu ra , y la co n ve rs ió n e fe c tiva de la d ifu s ió n de 3 d im e n s io n e s (es dec ir, en s o lu c ió n ) a 2 d im e n s io n e s (es d ec ir, en la m e m b ra n a ) p u e d e p ro p o rc io n a r u na e fic ie n c ia de in se rc ió n a de cu ad a . S e p ue de n o b te n e r v e s ícu la s u n ila m in a re s g ra n d e s con un d iá m e tro de ~ 100 nm (vé ase , p o r e je m p lo , A va n ti P o la r L ip ids, Inc. (o c tu b re de 2013 ), "P re p a ra tio n o f L ip o so m e s", o b te n id o de h ttp ://a v a n tilip id s .c o m /in d e x .p h p ? o p tio n = c o m _ c o n te n t& id = 1384 & Ite m id = 372 If) y p ue de p u e n te a r n a n o p o ro s de e s ta do só lid o m ás p e q u e ñ o s (p o r e je m p lo , los n a n o p o ro s de ~10 nm d e sc rito s en e s te e je m p lo ).
A d e m á s, se p ue de re a liza r la fu n c io n a liz a c ió n q u ím ic a d e l n an o p o ro de e s ta d o só lid o p a ra e v ita r c u a lq u ie r v ía de fu g a re s idu a l a lo la rgo de la in te rfaz e n tre e l n a n o d isco de líp ido y e l n a n o p o ro de e s ta d o só lido . P o r lo ta n to , la su p e rfic ie s u p e r io r de l n an op o ro de e s ta d o só lid o , con el q ue e s ta rá en co n ta c to e l d isco de líp ido , se p u e d e fu n c io n a liz a r q u ím ic a m e n te con m o lé cu la s h id ro fó b ica s a u to e n sa m b la d a s . R es tos a m o do de e je m p lo q u e se p ue de n u sa r p a ra la fu n c io n a liz a c ió n son los d e riva d o s de l co le s te ro l q ue p ue de n in s e rta r su p o rc ió n h id ro fó b ica en la m e m b ra n a y, com o re su ltad o , e v ita r e l tra n s p o rte de iones h id ra ta d o s a lo la rgo de la in te rfaz . La q u ím ica de su p e rfic ie ú til p a ra c o n ju g a r e l d e riva d o de c o le s te ro l en un su s tra to só lid o se e je m p lific a en la F ig . 9.
La fu n c io n a liz a c ió n de la su p e rfic ie p u e d e a lte ra r la c a ra c te r ís tic a e lé c tr ic a de l n an op o ro de e s ta d o só lid o . El e fe c to p u e d e s e r b e n e fic io so al re d u c ir los a co n te c im ie n to s de a d h e re n c ia p o r la in te ra cc ió n d e l A D N con la su p e rfic ie só lida . S in e m b a rg o , e l a u m e n to de la h id ro fo b ic id a d de los n a n o p o ro s de e s ta d o só lid o p u e d e a fe c ta r sus p ro p ie d a d e s de tra n s p o rte (véase , p o r e je m p lo , P ow e ll y co l., N a tu re N a n o te c h n o lo g y 6, 798 -802 (2011 ). Los d o s e fe c to s se p ueden e q u ilib ra r p a ra lo g ra r un re n d im ie n to ó p tim o d e l s is te m a).
Someter a ensayo la actividad de los bioporos como parte a del dispositivo híbrido de nanoporos
El o b je tivo e sp e c ífico n.° 2b d e m o s tra rá e l e n s a m b la je de un c o m p le jo de n a n o d isco de líp id o /b io p o ro en un n an op oro de e s ta d o só lid o . La ca ra c te r iza c ió n e lé c tr ic a d e l n an op o ro h íb rid o , e l n ive l de ru ido y la e s ta b ilid a d se p ueden c a ra c te r iz a r en co n d ic io n e s de se cu e n c ia c ió n de á c id o s n uc le ico s . El n an op o ro h íb rid o p ue de p o s e e r un ru ido m ás a lto q ue un d isp o s itivo de n an o p o ro de p ro te ín a co n ve n c io n a l, p rin c ip a lm e n te co n tr ib u id o p o r e l a co p la m ie n to c a p a c itivo a tra vé s de l su s tra to de so p o rte de s ilic io . V éa se , p o r e je m p lo , W a g g o n e r y co l., J o u rn a l o f V acu um S c ie n ce & T e ch n o lo g y B 29, 032206 (2011 ). El n ive l de ru ido se p ue de o p tim iz a r m e d ia n te la p a s iva c ió n de re s ina de l á re a de co n ta c to flu íd ico , o a g re g a n d o S iÜ 2 con un e sp e s o r m ic ro m é tr ico e n tre la p e líc u la de Si3N4 y e l su s tra to de Si, p o r e je m p lo , u tiliza n d o té cn ica s y m a te ria le s e xp u e s to s en R osen s te in y co l., N a tu re M e th o d s 9, 487 -492 (2012 ). La q u ím ic a a c tu a l de se cu e n c ia c ió n de n a n o p o ro s c o n tie n e p o lim e ra sa , A T P y sa l en un ta m p ó n de pH ca s i neu tro , que no se e sp e ra q ue a fe c te la e s ta b ilid a d d e l c o m p le jo de d is co de líp id o /b io p o ro . El re n d im ie n to d e l n an op o ro h íb rid o se p u e d e c o m p a ra r con un b io p o ro so p o rta d o p o r líp id os co n v e n c io n a l p a ra c a ra c te r iz a r su re nd im ie n to .
E J E M P L O II (n o re iv in d ic a d o )
E ste e je m p lo d e sc rib e e l p ro g re so en e l o b je tivo e sp e c ífico n.° 1 de l e je m p lo I. M ás e sp e c ífica m e n te , se e s ta b le c ie ro n p ro to co lo s p a ra (a) e n s a m b la r y c a ra c te r iz a r n a n o d isco s de líp ido en b la n co con un d iá m e tro de 10-13 nm y (b) in c o rp o ra r p ro te ín a s de n a n o p o ro s de M sp A en n a n o d isco s de líp ido y c a ra c te r iz a r la m o rfo lo g ía de l com p le jo .
Se u só c ro m a to g ra fía líq u id a de p ro te ín a rá p id a (F P LC ) p a ra o p tim iz a r la fo rm a c ió n de n a n o d isco s y la inse rc ión de M sp A co m o se m u e s tra en la F ig . 10. El tra zo in fe rio r (n eg ro ) es so lo p a ra n a n o d isco s y m u e s tra un p ico de e lu c ión b ien d e fin id o de un in s tru m e n to de FP LC . A g re g a r M spA a la m e zc la de p re cu rso re s d e se s ta b ilizó la re acc ión y d io co m o re su lta d o un se g u n d o p ico de e lu c ió n con un p eso m o le c u la r m ás a lto , co m o se m u e s tra en el tra zo cen tra l (ro jo ). El c o m p o rta m ie n to fu e s im ila r al de la s ín te s is p u ra de n a n o d isco s en p re se n c ia de un e xce so de líp ido . A u n q u e no n e ce sa ria m e n te con la in te nc ió n de e s ta r lim ita d o p o r la h ip ó te s is , el te n s io a c tiv o re q u e rid o p a ra e s ta b iliz a r la p ro te ín a M spA en so lu c ió n p a re ce e s ta r in te ra c tu a n d o con el p ro ce so de a u to e n sa m b la je de l n an od isco . A l re d u c ir la c a n tid a d de líp ido u tiliz a d o d u ra n te la s ín te s is en 1/3, se re cu p e ró el co m p o rta m ie n to n orm a l co m o se m u e s tra en la tra z a s u p e r io r (azu l).
A d e m á s, se re a lizó la ca ra c te r iza c ió n p o r m ic ro sco p ía e le c tró n ic a de tra n sm is ió n (T E M ) en las d os fra cc io n e s de e lu c ió n (A y B) de la Fig. 10. Las m u e s tra s se tiñ e ro n con a ce ta to de u ra n ilo a n te s de la fo rm a c ió n de im á g e n e s TE M p a ra m e jo ra r el co n tra s te . Las im á g e n e s T E M re su lta n te s se m u e s tra n en la F ig . 11. Se o b se rvó u n a in se rc ió n a p a re n te de M sp A (d isco s con p u n to s o scu ro s ) en a m b a s m u es tra s, con u n a fu e rte a g lo m e ra c ió n en la fra cc ió n de a lto p eso m o le c u la r co m o se e sp e ra b a . Las im á g e n e s T E M de n a n o d isco s en b la n co (no m o s tra d o s ) no e xh ib ie ro n ta le s c a ra c te rís tica s . Se p ue de o b te n e r u na co n firm a c ió n a d ic io n a l de la inse rc ión de M spA m e d ia n te e le c tro fo re s is de p ro te ín a s y m e d ia n te la p u rifica c ió n d e l p ro d u c to en co lu m n a de m eta l, co m o se d o c u m e n ta en el o b je tivo e sp e c ífico n.° 1 de l e je m p lo I.
Los re su lta d o s a n te r io re s c o n firm a n el e s ta b le c im ie n to de un p ro to co lo p a ra la s ín te s is de n a n o d isco s d e sn u d o s . A d e m á s, los re su lta d o s p ro p o rc io n a n u n a c o n firm a c ió n de p ru e b a de p rin c ip io de la inse rc ión de M sp A en n an od isco s a u to e n sa m b la d o s .
Se p re te n d e en el p re se n te d o c u m e n to q ue e l té rm in o q ue co m p re n d e se a ab ie rto , in c lu ye n d o no so lo los e le m e n to s e n u m e ra d o s , s ino q u e a d e m á s a b a rq u e c u a lq u ie r e le m e n to a d ic ion a l.
Se han d e sc rito va r ia s re a liza c io n e s . No o b s ta n te , se e n te n d e rá q ue p ue de n re a liza rse d ive rsa s m o d ifica c io n e s . En c o n se cu e n c ia , o tras re a liza c io n e s e s tá n d e n tro de l a lca n ce de las s ig u ie n te s re iv in d ica c io n e s .

Claims (15)

R E IV IN D IC A C IO N E S
1. Un a p a ra to de d e te cc ió n , q ue co m p re n d e
(a) un e le c tro d o ;
(b) un n a n o p o ro de p ro te ín a ; y
(c) u na m e m b ra n a q u e ro de a el n a n o p o ro de p ro te ín a ;
e s ta n d o e l a p a ra to de d e te cc ió n c a ra c te r iza d o p o r q u e e l n an op o ro de p ro te ín a e s tá u n id o al e le c trod o .
2. El a p a ra to de d e te cc ió n de la re iv in d ica c ió n 1, en el q ue e l n an op o ro e s tá u n id o al e le c tro d o a tra vé s de una a lm o h a d illa d ie lé c tr ic a q u e cu b re u n a p a rte d e l e le c tro d o ; o p c io n a lm e n te
en e l q u e la a lm o h a d illa d ie lé c tr ic a tie n e un á re a in fe rio r a 1 p m 2, y /o
el n a n o p o ro o cu p a un á re a m a yo r q u e e l á re a de la a lm o h a d illa d ie lé c trica .
3. El a p a ra to de d e te cc ió n de u n a cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 2, en el q ue la m e m b ra n a co m p re n d e líp idos en u na b ica p a y los líp id os en la b ica p a e s tá n u n id os al e le c tro d o .
4. El a p a ra to de d e te cc ió n de u n a cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 3, en el q u e el n a n o p o ro o cu p a un á re a en la m e m b ra n a de al m e no s 25 nm 2 y /o co m o m á x im o 1 p m 2.
5. El a p a ra to de d e te cc ió n de u na c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 4, q u e co m p re n d e a d e m á s un a n a lito de á c ido n u c le ico u b ica d o en u n a a b e rtu ra fo rm a d a p o r e l n an op o ro , y q u e co m p re n d e a d e m á s un a m p lif ic a d o r co n fig u ra d o p a ra a m p lif ic a r las se ñ a le s e lé c trica s g e n e ra d a s en el n an op o ro , y /o en el q u e e l n a n o p o ro e s tá u n id o al e le c tro d o p o r un a n c la je de á c ido nuc le ico .
6. El a p a ra to de d e te cc ió n de u n a c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 5, en el q ue e l e le c tro d o co m p re n d e m eta l.
7. Un a p a ra to de d e te cc ió n de a cu e rd o con la re iv in d ica c ió n 1, q u e co m p re n d e
(a) u n a p lu ra lid a d de e le c tro d o s ;
(b) u n a p lu ra lid a d de n a n o p o ro s de p ro te ín a , ca d a uno de los n a n o p o ro s u n id o a un e le c tro d o en la p lu ra lid a d de e le c tro d o s ; y
(c) u na m e m b ra n a q u e ro de a c a d a u no de los n an op o ros .
8. El a p a ra to de d e te cc ió n de la re iv in d ica c ió n 7, q ue co m p re n d e a d e m á s u na p lu ra lid a d de a lm o h a d illa s d ie lé c trica s , cu b rie n d o c a d a u na de las a lm o h a d illa s u na p o rc ió n de un e le c tro d o en la p lu ra lid a d de e le c tro d o s ; y o p c io n a lm e n te en e l q u e ca d a u na de las a lm o h a d illa s d ie lé c tr ic a s e s tá u n id a a no m ás de u no de los nan op o ros .
9. Un m é to do p a ra fa b r ic a r un a p a ra to de d e te cc ió n , q ue co m p re n d e :
(a) p ro p o rc io n a r un so p o rte só lid o q u e co m p re n d e u na m a triz de e le c tro d o s ;
(b) p ro p o rc io n a r u n a p lu ra lid a d de n a n o p o ro s de p ro te ín a ;
(c) p o n e r en co n ta c to la p lu ra lid a d de n a n o p o ro s con la m a triz de e le c tro d o s p a ra u n ir n a n o p o ro s in d iv id u a le s a e le c tro d o s in d iv id u a le s a tra vé s de un p rim e r a nc la je , c re a n d o a s í u n a m a triz de n a n o p o ro s q ue e s tá n u n id o s a e le c tro d o s en la p lu ra lid a d de e le c tro d o s ; y
(d) p o n e r en co n ta c to la m a triz de n a n o p o ro s con m a te ria l de m e m b ra n a p a ra fo rm a r u n a m e m b ra n a q u e ro de a a cad a u no de los n a n o p o ro s de la m atriz .
10. El m é to d o de la re iv in d ica c ió n 9, en e l q u e la ca n tid a d de n a n o p o ro s q ue se p onen en co n ta c to con la m a triz de e le c tro d o s en la e ta p a (c) e xce d e la ca n tid a d de e le c tro d o s en la m a triz .
11. El m é to d o de la re iv in d ica c ió n 9 o 10, q ue co m p re n d e a d e m á s u na e ta p a de u n ir e l m a te ria l de m e m b ra n a a los e le c tro d o s de la m a triz a tra vé s de un se g u n d o a n c la je ; y
o pc ion a lm e n te , en el q ue la un ión de l m a te ria l de m e m bran a a los e le c trod o s com p re nd e u n ir e l con jun to de e lec trodos al seg un do anc la je an tes de la e ta pa (c) y u n ir el seg un do anc la je al m ate ria l de m e m bran a d e sp u é s de la e ta p a (c); o
en el q ue la un ión d e l m a te ria l de m e m b ra n a a los e le c tro d o s co m p re n d e u n ir la m a triz de e le c tro d o s al se g u n d o a n c la je d e sp u é s de la e ta p a (c) y u n ir el se g u n d o a n c la je al m a te ria l de m e m b ra n a d e sp u é s de la e ta p a (c).
12. El m é to do de u na cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 10 a 11, en el q ue ca d a u no de los n a n o p o ro s q ue se pone en co n ta c to con la m a triz de e le c tro d o s en la e ta p a (c) se une p re v ia m e n te al p rim e r a nc la je
o
en el q ue ca d a u no de los e le c tro d o s q ue se p on e en co n ta c to con los n a n o p o ro s en la e ta p a (c) se u ne p re v ia m e n te al p rim e r a nc la je .
13. El m é to do de u n a c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 10 a 12, en el q ue los n a n o p o ro s se so lu b iliza n con d e te rg e n te y la e ta p a (d) co m p re n d e a d e m á s e lim in a r el d e te rg e n te de los n a n o p o ro s de p ro te ín a ; y
o pc ion a lm e n te , d icho m é todo com p re nd e a de m ás a tra e r e lé c trica m e n te los n an op oros a los e le c trod o s en la e ta p a (c).
14. El m é to d o de u n a cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 9 a 13, en e l q ue la p lu ra lid a d de n a n o p o ro s e s tá en co n ta c to m a s ivo con la m a triz de e le c tro d o s d u ra n te la e ta p a (c).
15. Un m é to do de secu e n c ia c ió n de á c id os nuc le icos , q ue co m p re n d e :
(a) p ro p o rc io n a r un a p a ra to de d e te cc ió n q ue c o m p re n d e :
(i) u na p lu ra lid a d de e le c tro d o s ,
(ii) u n a p lu ra lida d de n a n o p o ro s de p ro te ín a , ca d a u no de los n a n o p o ro s u n id o a un e le c tro d o en la p lu ra lid a d de e le c tro d o s , y
(iii) u na m e m b ra n a q ue ro de a c a d a u no de los n a n o p o ro s ; y
(b) d e te c ta r e l paso, a tra vé s de ca d a uno de los n an op o ros , de
(i) un á c id o n uc le ico ,
(ii) u n a se rie de n u c le ó tid o s e x tra íd o s de l á c id o n uc le ico , o (iii) u n a se rie de so n d a s d e riva d a s de n u c le ó tid o s in co rp o ra d o s en el á c id o n uc le ico , d e te rm in a n d o a s í la se cu e n c ia de l á c id o n uc le ico .
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