CN110914291A - 用于分子表征的纳米孔匹配的蛋白质穿梭物 - Google Patents

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Abstract

提供了用于将分子捕捉在纳米孔传感器中并且电监测纳米孔传感器中的分子的系统和方法。所述纳米孔传感器包括支撑结构与第一流体室和第二流体室，流体连接至两个室的至少一个纳米孔，以及蛋白质穿梭物。所述蛋白质穿梭物包含带电荷的蛋白质分子，例如亲和素。纳米孔可以是细胞溶素A(Clytosolin A)。方法可以包括施加跨过所述纳米孔的电压以将蛋白质穿梭物朝所述纳米孔牵引。可以同时测量通过纳米孔中的每一个或所有的离子电流。基于所述测量的离子电流，可以检测阻塞事件。每一个阻塞事件表明蛋白质穿梭物被至少一个纳米孔捕获。可以通过总离子电流的变化或特定纳米孔的离子电流的变化检测每一个阻塞事件。

Description

用于分子表征的纳米孔匹配的蛋白质穿梭物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年7月17日提交并且标题为“用于分子表征的纳米孔匹配的蛋白质穿梭物(shuttle)”的第62/533,227号美国临时专利申请的优先权和权益，其内容通过引用整体并入本文，如同在本文中完全阐述一样。
领域
本发明涉及纳米孔匹配的蛋白质穿梭物，并且更具体地，涉及用电压偏置的纳米孔捕捉蛋白质穿梭物的系统和方法。
背景
分子可以经由纳米孔捕捉并且进行电监测。特别地，可以诱导通常包括蛋白质分子和与蛋白质分子连接的其他目标分子的蛋白质穿梭物与电压偏置的纳米孔结合。蛋白质穿梭物可以实现对目标分子的监测。然而，由于蛋白质穿梭物中蛋白质分子的复杂的几何结构和电荷结构，分子的基于纳米孔的研究具有挑战性。复杂的结构使得在纳米孔中难以稳定地捕捉蛋白质分子。另外，人工再现的纳米孔和拥有纳米孔的结构通常在纳米孔的尺寸设定，纳米孔与蛋白质分子之间的键的稳定性，噪声特性以及其他化学、机械、电和热约束方面遭遇困难。
因此，需要用电压偏置的纳米孔稳定地捕捉蛋白质穿梭物的系统和方法。
发明内容
本公开内容的各种实施例涉及纳米孔传感器。所述纳米孔传感器可以包括支撑结构、至少一个纳米孔和蛋白质穿梭物。所述支撑结构可以分隔第一流体室与第二流体室。所述至少一个纳米孔可以被设置在所述支撑结构中。所述至少一个纳米孔可以具有流体连接至所述第一流体室的入口和流体连接至所述第二流体室的出口。蛋白质穿梭物可以包含带电荷的蛋白质分子。所述带电荷的蛋白质分子可以具有至少与所述至少一个纳米孔的孔腔的最小直径一样长的径向范围。
在一些实例中，所述蛋白质穿梭物可以还包含至少一个连接物。所述连接物可以附接至所述蛋白质分子。所述连接物可以将所述蛋白质穿梭物连接到至少一个靶分子。
在一些实例中，所述连接物可以是生物素。在一些实例中，所述至少一个纳米孔可以是细胞溶素A(Cytolysin A)纳米孔。在一些实例中，所述支撑结构可以是脂质双层。在一些实例中，所述带电荷的蛋白质分子可以是亲和素。在一些实例中，所述至少一个靶分子可以包括蛋白质，所述蛋白质包括酶和/或DNA序列、RNA序列和Cas9蛋白质中的至少一种。
在一些实例中，所述纳米孔传感器可以还包括第一电极和第二电极。所述第一电极可以处于所述第一流体室中。所述第二电极可以处于所述第二流体室中。所述第一电极和所述第二电极可以被配置成在所述第一流体室与所述第二流体室之间施加电压。
在一些实例中，所述第二流体室中的第二流体相对于所述第一流体室中的第一流体可以具有负电压。
在一些实例中，所述纳米孔传感器可以包括在所述第一电极与所述第二电极之间连接的电路。所述电路可以被配置成测量通过在所述第一流体室与所述第二流体室之间的所述至少一个纳米孔的离子电流。
在一些实例中，所述至少一个纳米孔的内部孔腔可以具有第一直径。所述出口可以具有第二直径。所述入口可以具有第三直径。所述第一直径、所述第二直径和所述第三直径可以彼此不同。在一些实例中，所述第二直径可以小于所述第三直径。
在一些实例中，所述第一流体室可以包括多个所述至少一个靶分子。靶分子可以在阻塞事件期间至少部分地阻塞所述至少一个纳米孔。
在一些实例中，所述第二流体室可以包括多个所述至少一个靶分子。靶分子可以在阻塞事件期间至少部分地阻塞所述至少一个纳米孔。
本公开内容的第二实施方案可以提供分析捕捉在一个或多个纳米孔中或一个或多个纳米孔处的分子的方法。所述纳米孔可以延伸穿过分隔第一流体室和第二流体室的支撑结构。所述方法可以包括施加跨过所述一个或多个纳米孔的电压以将蛋白质穿梭物朝所述一个或多个纳米孔中的至少一个牵引。所述蛋白质穿梭物中的每一个可以包含带电荷的蛋白质分子。然后，所述方法可以包括测量在所述施加期间通过所述一个或多个纳米孔中的每一个或所有的离子电流。然后，所述方法可以包括基于所述一个或多个纳米孔中的每一个或所有的所述离子电流，检测所述一个或多个纳米孔中的任一个是否与阻塞事件相关。所述阻塞事件中的每一个可以表明所述蛋白质穿梭物被所述一个或多个纳米孔中的至少一个捕获。可以通过总离子电流的变化或者所述一个或多个纳米孔中的具体一个的离子电流的变化来检测所述阻塞事件中的每一个。
在一些实例中，所述离子电流的所述变化可以包括所述离子电流的降低。
在一些实例中，所述方法可以还包括在阻塞事件发生之后维持所述电压。
在一些实例中，所述方法可以还包括在所述阻塞事件期间减小所述电压。
在一些实例中，所述方法可以还包括在所述阻塞事件期间增加所述电压。
在一些实例中，所述方法可以还包括在阻塞事件发生之后改变所述电压的极性。
在一些实例中，所述方法可以还包括在所述阻塞事件期间改变所述电压的极性。
在一些实例中，所述方法可以还包括测量所述阻塞事件中的每一个的持续时间，以及确定每一个阻塞事件期间通过所述一个或多个纳米孔的平均离子电流。
在一些实例中，所述方法可以还包括通过反转所述电压的极性诱导从阻塞事件中排出特定的蛋白质穿梭物。
在一些实例中，所述蛋白质穿梭物中的每一个或子集还包含至少一个连接物。所述连接物可以附接至所述蛋白质分子并且可以被构造成将特定的蛋白质穿梭物连接到至少一个靶分子。
在一些实例中，所述连接物可以是或包括生物素。在一些实例中，所述至少一个纳米孔可以是细胞溶素A纳米孔。在一些实例中，所述支撑结构可以是脂质双层。在一些实例中，所述带电荷的蛋白质分子可以是亲和素。
本公开内容的第三实施方案可以包括制备用于分析的靶分子。所述方法可以包括提供纳米孔传感器。所述纳米孔传感器可以包括支撑结构和至少一个纳米孔。所述支撑结构可以分隔第一流体室与第二流体室。所述至少一个纳米孔可以被设置在所述支撑结构中，所述纳米孔的入口流体连接至所述第一流体室并且所述纳米孔的出口流体连接至所述第二流体室。然后，所述方法可以包括将蛋白质穿梭物引入所述纳米孔传感器的第一流体室中。所述蛋白质穿梭物可以包括蛋白质分子，其中所述蛋白质分子是带电荷的。然后，所述方法可以包括施加电压以使所述蛋白质穿梭物被所述至少一个纳米孔捕获。
在一些实例中，所述方法可以还包括通过反转所述电压的极性来诱导所述蛋白质穿梭物从所述至少一个纳米孔中排出。
在一些实例中，所述蛋白质穿梭物可以还包含至少一个连接物。所述连接物可以附接至所述蛋白质分子并且可以被构造成将所述蛋白质穿梭物连接到至少一个靶分子。
本公开内容的第四实施方案可以提供制备用于分析的靶分子的方法。所述方法可以包括提供纳米孔传感器。所述纳米孔传感器可以包括支撑结构和至少一个纳米孔。所述支撑结构可以分隔第一流体室与第二流体室。所述至少一个纳米孔可以被设置在所述支撑结构中，所述纳米孔的入口流体连接至所述第一流体室并且所述纳米孔的出口流体连接至所述第二流体室。然后，所述方法可以包括将带电荷的蛋白质分子引入所述纳米孔传感器的所述第一流体室中。然后，所述方法可以包括施加电压以使所述带电荷的蛋白质分子被所述至少一个纳米孔捕获。然后，所述方法可以包括检测电流由于所述带电荷的蛋白质分子被所述至少一个纳米孔捕获而相对于所述至少一个纳米孔的初始电流的变化。
在一些实例中，所述方法可以还包括反转所述施加的电压的极性以排出所述带电荷的蛋白质分子。
在一些实例中，所述方法可以还包括将蛋白质穿梭物引入所述纳米孔传感器的所述第一流体室中，其中所述蛋白质穿梭物包括所述带电荷的蛋白质分子和靶分子。然后，所述方法可以规定检测电流由于所述带电荷的蛋白质分子被所述至少一个纳米孔捕获而相对于所述至少一个纳米孔的初始电流的变化。
在一些实例中，所述蛋白质穿梭物还包括至少一个连接物，其中所述连接物附接至所述带电荷的蛋白质分子并且被构造成将所述带电荷的蛋白质分子连接到至少一个靶分子。在一些实例中，所述连接物可以是或包括生物素。在一些实例中，所述至少一个纳米孔可以是细胞溶素A纳米孔。在一些实例中，所述支撑结构可以是脂质双层。在一些实例中，所述带电荷的蛋白质分子可以是亲和素。
术语“蛋白质穿梭物”在本文中与术语“分子穿梭物”可互换地使用。
附图简述
附图例示出本发明的实施方案，并且连同描述一起用于解释和说明本发明的原理。附图旨在以图解的方式说明示例性实施方案的大多数特征。附图并非旨在描绘实际实施方案的每一个特征以及所描绘的元件的相对尺寸，并且未按比例绘制。
图1A示出了示例性ClyA纳米孔。
图1B示出了蛋白质亲和素的第一透视图。
图1C示出了蛋白质亲和素的第二透视图。
图1D示出了蛋白质亲和素的第三透视图。
图1E示出了根据本公开内容的实施方案的被捕捉在ClyA纳米孔中的示例性亲和素的剖视图。
图1F示出了根据本公开内容的实施方案的被捕捉在ClyA纳米孔中的示例性蛋白质穿梭物的剖视图。
图2A示出了根据本公开内容的实施方案的示例性纳米孔传感器系统。
图2B示出了根据本公开内容的实施方案的用于测量纳米孔电导率的示例性装置。
图3A示出了根据本公开内容的实施方案的用于使用纳米孔传感器的示例性方法。
图3B示出了根据本公开内容的实施方案的用于捕捉和释放蛋白质穿梭物的示例性方法。
图4示出了根据本公开内容的实施方案的示例性靶分子的结构。
图5A至图5B示出了根据本公开内容的实施方案的示例性纳米孔和蛋白质分子结构。
详述
参考附图描述本发明，其中所有附图使用相同的参考数字来表示相似或等同的元件。附图未按比例绘制，并且提供它们仅是为了例示本发明。以下参考用于例示的示例性应用来描述本发明的若干方面。应理解，阐述了许多具体细节、关系和方法以提供对本发明的全面理解。然而，相关领域的普通技术人员将容易地认识到，可以在没有一个或多个具体细节的情况下或在使用其他方法的情况下实施本发明。在其他情况下，未详细示出公知的结构或操作，以避免模糊本发明。本发明不受例示的动作或事件的顺序限制，因为某些动作可以以不同的顺序和/或与其他动作或事件同时发生。此外，并非所有例示的动作或事件都是实施根据本发明的方法必需的。
本公开内容涉及包括配置成捕捉和研究分子的纳米孔传感器的分析系统。纳米孔传感器可以具有分隔第一流体室和第二流体室的支撑结构，例如脂质膜。纳米孔可以被配置在脂质膜中以便流体连接两个室。例如，纳米孔可以是细胞溶素A(clytosolin A,“ClyA”)。分析系统可以使用蛋白质穿梭物，其中蛋白质穿梭物含有带电荷的蛋白质分子，例如亲和素。由于亲和素的正电荷，施加跨过纳米孔的电压可以将亲和素牵引进入纳米孔。纳米孔传感器可以被配置成同时测量通过纳米孔的电流以检测亲和素何时被纳米孔捕捉。此后，可以分析典型的蛋白质穿梭物。
如以上所述，本公开内容提供了包括具有ClyA纳米孔和基于亲和素的蛋白质穿梭物的纳米孔传感器的分析系统。亲和素是带正电荷的蛋白质分子，并且ClyA生物纳米孔可以捕获蛋白质分子。ClyA具有尺寸上接近亲和素的径向范围的内部孔腔直径。ClyA沿着分子的内环还具有负电荷的环，当亲和素被捕捉在孔中时，所述负电荷的环可以吸引带正电荷的亲和素。因此，ClyA纳米孔与亲和素之间的这种匹配可以在ClyA与亲和素之间产生稳定的键，以及其中亲和素在孔中具有良好取向的键。蛋白质穿梭物还可包括靶分子和连接至亲和素的连接子。ClyA与亲和素之间的稳定的键使研究靶分子变得容易。另外，通过施加或反转跨过纳米孔的电压，可以选择性地捕捉或排出带正电荷的蛋白质穿梭物。
本公开内容提供了用于通过监测在纳米孔处分子捕捉期间纳米孔的离子电导率来观察和测量单独的带电荷的生物分子在它们被捕捉在脂质膜中的电压偏置的纳米孔中或纳米孔处时的系统和方法。这些测量为这些分子的生物物理学和/或其与纳米孔的相互作用提供了新的见解。当连接至蛋白质穿梭物的DNA链作为靶分子时，本公开内容的实施方案可以被使用在用于测序DNA的实用的便携式仪器中。
平台允许单分子研究。例如，纳米孔传感器装置可以研究与其进行的酶促反应相关的酶和酶动力学。蛋白质(包括酶)可以是靶分子。当靶分子是蛋白质时，可以探测蛋白质动力学，包括靶分子(蛋白质)的构象动力学。还可以探测与酶促反应相关的动力学。如果连接的酶穿梭并且保持在孔处，则可以将用于该酶的试剂(或底物)添加到第一(或第二)流体室中，以研究在酶促反应期间酶的动力学(dynamics)和运动学(kinetics)。应用包括药物筛选，其中可以测试酶的动力学和运动学，以查看当药物被添加到第一流体室或第二流体室时是否发生变化。
图1A示出了具有入口直径112、内部孔腔直径114、出口直径116和长度118的示例性纳米孔110的蛋白质结构。
示例性纳米孔110可以包含ClyA十二聚体。ClyA是在大肠杆菌(Escherichiacoli)和肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)的几种致病菌株中表达的成孔细胞溶解毒素。ClyA具有12个可溶性单体。在到达靶细胞膜时，可溶性单体经历包括一半单体的氨基酸残基的显著的构型变化，并且随后组装成膜结合的低聚体。所得的横跨膜的ClyA孔形成膜中的纳米尺寸的圆形洞。图1A示出了在ClyA被配置成孔之后，ClyA的示例性横截面视图。横截面视图显示了在ClyA纳米孔形成圆形洞之后，ClyA纳米孔的12倍旋转对称轴。一旦ClyA配置成细胞的脂质膜中的孔，脂质膜作为细胞屏障的功能丧失，并且这最终导致细胞死亡。纳米尺寸的圆形洞在本文中被称为纳米孔。
ClyA纳米孔对于纳米孔的不同内部部分可以具有不同的直径。例如，如图1A中所示，纳米孔110的入口直径112可以具有与内部孔腔直径114不同的宽度，并且两者都可以与出口直径116不同。在一些实例中，内部孔腔直径114可以小于入口直径。此外，出口直径116可以小于入口直径112和内部孔腔直径114。通常，内部孔腔直径114沿着孔腔的长度不是恒定的。例如，ClyA内部孔腔可以为4.1nm的出口直径116至6.5纳米(nm)的入口直径112。另外，示例性内部孔腔直径114可以是5.4nm。ClyA纳米孔112当配置在脂质膜或其它支撑结构中时可以具有开孔电导率。
尽管ClyA十二聚体在本申请中被示出并且称为示例性纳米孔，但存在许多不同的ClyA低聚物。也可以使用ClyA 8’聚体、ClyA 13’聚体、ClyA 14’聚体、四聚体ClyA和其他低聚体。每种低聚形式可以具有不同的直径112、114和116，并且由于其几何尺寸和特定纳米孔中单体的电荷，可以具有独特的开孔电导率。因此，图1A中以及随后在本公开内容中提及的纳米孔的特征不限于特定的ClyA低聚体或具体限于ClyA。只要纳米孔可以捕捉包括蛋白质穿梭物的目标分子，可以使用任何纳米孔。
图1B至图1D示出了具有第一尺寸122、第二尺寸124、第三尺寸126和第四尺寸128的蛋白质120的各种透视图。例如，图1B示出了第一取向、图1C示出了第二取向，并且图1D示出了第三取向。蛋白质120可以包括市售的亲和素(Avidin)(例如皮尔斯亲和素(PierceAvidin)，ThermoFisher Scientific)，并且可以从鸡蛋清中纯化。
图1B至图1D示出了如何亲和素通常是糖蛋白四聚体，其进一步包含带状结构的四个β桶123。选择的取向的亲和素可以具有在亲和素的每一个端部处开放的开放的β桶123。亲和素也可以是单体、二聚体和三聚体，并且所有这些形式均可以如本文所述使用。亲和素可以在每个单体中包含一个天冬酰胺糖基化结合位点121。亲和素具有连接至四个结合位点121中的每一个的多糖。除了核GlcNAc之外，多糖还具有4个至5个甘露糖和2个GlcNAc。亲和素在pH为7.5时具有大约7个正电荷的电荷。在其他实现方式中，可以使用去糖基的亲和素。
亲和素的正电荷允许亲和素与带负电荷的分子结合。另外，蛋白质分子120的尺寸122、124、126和128可以配对以匹配纳米孔的内径，使得蛋白质分子120可以配合在纳米孔内。例如，第一尺寸122可以是6.8nm，第二尺寸124可以是5.5nm，第三尺寸126可以是6.7nm，并且第四尺寸128可以是7.1nm。
尽管为了本申请的目的，亲和素被称为示例性蛋白质分子，但可以使用任何蛋白质分子，只要蛋白质分子可以连接至纳米孔并且阻塞至少一些通过纳米孔的电流。
图1E是图1A的纳米孔110的横截面示意图，其中蛋白质120位于纳米孔110中。在各种实施方案中，蛋白质的横截面范围可以大于纳米孔的最小内径；即，蛋白质横截面范围至少与沿着纳米孔长度的最小纳米孔直径一样大。此外，蛋白质的横截面范围也可以大于沿着纳米孔长度除了最小内径的位点的其他位点处的内部纳米孔直径的范围。
例如，参考图1C，蛋白质亲和素的横截面范围大于4.1nm的最小ClyA内径和具有5.4nm的内径的ClyA纳米孔的中截面直径。即使具有这种较大的径向直径，示例性蛋白质120可以借助于例如蛋白质120的结构中的机械柔性进入纳米孔110。此外，纳米孔110的一个端部或两个端部可以具有大于蛋白质120的范围的内径，从而如果蛋白质120不能以其他方式进入纳米孔110，则能够使蛋白质120至少部分地进入纳米孔110。使用这种布置，蛋白质120可以进入纳米孔110并且在沿着纳米孔110的长度的一个或多个位点处紧密地配合在纳米孔110内。这导致纳米孔110与蛋白质120之间的匹配，例如ClyA纳米孔与亲和素的情况。
在一些实例中，亲和素可以用于构建可以被ClyA十二聚体纳米孔捕捉的蛋白质穿梭物。对于蛋白质穿梭物，亲和素可以被构造成进入纳米孔110的蛋白质120，如图1E所示。蛋白质穿梭物可以具有连接至蛋白质穿梭物的其他分子，如参考图1F进一步所示。
再参考图1E，蛋白质120的横截面范围在尺寸上与纳米孔110的内部孔腔直径基本类似。例如，横截面范围可以是5.5nm，内部孔腔直径可以是5.4nm。亲和素-ClyA是示例性的蛋白质-纳米孔对，其显示出径向几何结构，其中蛋白质120具有至少约为纳米孔110的直径或略大于纳米孔110的直径的横截面范围，所述纳米孔110的直径是沿着纳米孔长度的一个或多个位点处的纳米孔110的直径。此外，ClyA纳米孔包括6.5nm的入口直径，其大于至少亲和素蛋白质的横截面范围，由此亲和素蛋白质可以进入ClyA纳米孔，并且然后沿着纳米孔长度紧密地配合在纳米孔内的位点处。
另外，纳米孔110的内部孔腔直径可以阻止蛋白质120以某些构型进入纳米孔110。例如，亲和素可以定向，使得第四尺寸128(7.8nm)进入纳米孔110的入口。亲和素的第四尺寸远大于图1A的ClyA入口直径114(6.5nm)。如果亲和素以其中第四尺寸128沿入口直径114延伸的取向进入ClyA纳米孔，则亲和素不会完全进入ClyA纳米孔。因此，图1E示出了纳米孔直径与蛋白质横截面范围之间的尺寸匹配如何使得能够以特定的取向和/或在纳米孔的位置处或纳米孔中的位置处进行对接。此外，或作为替代，纳米孔孔腔中和/或蛋白质上的电荷使得能够以特定的取向和/或在纳米孔的位置处或纳米孔中的位置处(未示出)进行对接。
亲和素在ClyA12纳米孔中的配合是紧密配合并且可以产生稳定的键。稳定的键使得能够研究与亲和素连接的任何靶分子。图1E示出了蛋白质亲和素和十二聚ClyA12纳米孔的具有尺寸的分子模型。对于各种明确限定的亲和素取向和沿着ClyA12纳米孔的长度的不同点，本申请采用亲和素的横截面范围与ClyA12纳米孔内部孔腔直径之间的这种紧密匹配。因此，这种对是作为用于如本文提供的纳米孔匹配的蛋白质穿梭物的布置的具体可行的实施方案。在一些情况下，deglycolitaed亲和素可以用作蛋白质穿梭物。
尽管在本申请中讨论了亲和素与ClyA纳米孔，但可以使用任何其他的蛋白质穿梭物和纳米孔的组合，其中蛋白质穿梭物的横截面范围为至少约纳米孔的内部孔腔的最小直径的范围。在一个实例中，纳米孔孔腔的最小直径不大于配合在纳米孔孔腔中的蛋白质穿梭物的横截面范围。在另一个实现方式中，也可以使用尺寸小于孔腔直径的蛋白质穿梭物，只要最小的孔腔直径小于蛋白质穿梭物的横截面范围，并且只要蛋白质穿梭物可以稳定地捕捉在特定的位置处并且具有相对于纳米孔的特定的取向即可。
图1F是纳米孔110和蛋白质分子120的横截面示意图，所述蛋白质分子120包括通过初级连接物140和次级连接物150附接至纳米孔110中的蛋白质分子120的靶分子160，所述初级连接物140和次级连接物150连接在靶分子160与纳米孔110中的蛋白质分子120之间。这种蛋白质穿梭物能够通过利用蛋白质分子120将靶分子160牵引至纳米孔110和/或至少部分地牵引进入纳米孔110中进行靶分子160的基于纳米孔的研究。如图1F中所示，蛋白质穿梭物可以具有更多或更少的组分，只要蛋白质穿梭物具有蛋白质分子120即可。
初级连接物140可以将蛋白质分子120连接至次级连接物150。初级连接物140也可以将次级连接物150连接至靶分子160。在一些实例中，可以存在与初级连接物140、次级连接物种150、初级连接物种140和另一个蛋白质分子120连接的蛋白质分子120的多个链。然而，不需要多于一个的蛋白质分子120。
在一些实例中，蛋白质分子120可以带正电荷并且构造成连接至带负电荷的纳米孔110。例如，ClyA沿内环带负电荷。
如以下进一步讨论，通过用控制电压将蛋白质120从纳米孔110中确定性地清除，经判断选择的蛋白质-孔对可以用作蛋白质120的研究平台。返回参考图1F，还可以研究宽范围的靶分子160及其与溶液中分析物的相互作用(未示出)。通过初级连接物140或次级连接物150连接至蛋白质穿梭物上的靶分子160可以借助于它们与蛋白质穿梭物的连接被牵引至纳米孔110并且在纳米孔110处被研究。如上所解释，蛋白质穿梭物可以与特定纳米孔110的大小相匹配。可以利用蛋白质穿梭物的性质(例如电荷)将蛋白质穿梭物吸引至纳米孔110。具有匹配的蛋白质穿梭物的纳米孔能够研究蛋白质穿梭物和靶分子160。其他分子可以连接至蛋白质穿梭物或可以与靶分子反应或在靶分子处反应，并且这些分子也可以经由纳米孔110研究。例如，由于蛋白质分子120与纳米孔110之间的牢固连接，可以研究由靶分子160催化的反应的底物和产物。
蛋白质穿梭物可以具有一个或多个特征，这些特征使得蛋白质分子120能够与靶分子160一起被驱动至纳米孔110和/或至少部分地被驱动进入选择的纳米孔110中。例如，蛋白质亲和素在大多数靶分子蛋白质的天然环境的pH下具有大量的正电荷。因此，为了研究靶分子蛋白质，亲和素可以被电泳、电渗或以其他方式被电吸引并且被牵引进入纳米孔110中，其中靶分子160以分子穿梭物构型连接至亲和素用于研究纳米孔110处的靶分子160。
在本公开内容的一些实例中，蛋白质分子120可以是亲和素，并且初级连接物140可以是生物素。图1B至图1C显示亲和素的每一个β桶123在一个端部处是开口的。这允许初级连接物140进入并且结合β桶123内的残基。返回参考图1F，生物素可以是被构造成与亲和素的β桶123内的残基结合的示例性连接物。生物素与亲和素的结合表示在自然界中发现的最强的非共价配体键，其中解离常数为10M至15M。可以利用蛋白质亲和素与其配体生物素之间的强键合使得通过与亲和素键合的生物素将连接物连接至亲和素，从而靶分子160可以与次级连接物150一起构造成分子穿梭物布置，用于研究纳米孔110处的靶分子160。生物素对亲和素具有强并且特异性的亲和力。生物素可以结合在亲和素的生物素结合口袋中。亲和素在每个单体具有一个结合口袋。由于亲和素是四聚体，每个亲和素存在四个结合口袋。
连接物140可以包括在一个位置处具有生物素的分子。例如，连接物140可以是具有多个聚乙二醇(PEG)单元以调节长度的直链分子。生物素可以在一个端部处而马来酰亚胺可以在另一个端部处。例如，生物素可以在一个端部上与亲和素结合。马来酰亚胺可以在另一个端部处与靶分子160上的天然存在的或工程化的半胱氨酸残基结合。可以不需要次级连接物。
次级连接物150可以提供为，例如聚合物分子、蛋白质、DNA、Cas9、赖氨酸、肽或可以附接至靶分子160的其他合适的物质。次级连接物150通过与亲和素和次级连接物键合的生物素来连接至亲和素。次级连接物150的生物素化由此使得亲和素-生物素复合物与次级连接物150之间能够形成强键。次级连接物150与靶分子160的连接提供了用于通过纳米孔110研究靶分子160的亲和素-生物素-连接物-靶分子布置。
蛋白质穿梭物可以包括许多初级连接物140和次级连接物150，它们本身是蛋白质，例如中性亲和素、链霉亲和素，或其他合适的物质，它们可以被利用来使附接的靶分子160确定性地取向。
在一些实例中，靶分子160可以包含DNA序列、RNA序列、Cas9或用于研究的任何其他分子。在一些实例中，可以存在多于一个的靶分子160。在一些实例中，靶分子160可以是穿梭物的任何部分，包括蛋白质分子120或初级连接物140或次级连接物150。
考虑到当穿梭物(例如亲和素)以其稳定的捕捉状态(对接状态)被捕获时穿梭物(例如亲和素)在纳米孔中的确定的取向，如果与靶蛋白质的连接点是已知的(例如当胱氨酸在特定的残基位置被工程化至靶蛋白质中时)并且为了所述靶分子适当地选择连接子的长度，靶分子160的取向也将是确定的。在一些实例中，初级连接物140和/或次级连接物150可以在纳米孔110中具有形状配合布置。因此，初级连接物140和/或次级连接物150可以使蛋白质穿梭物以延伸至靶分子160的确定性布置在纳米孔110中取向。由此，以相对于纳米孔110的确定的方向提供靶分子160。在这样的一个实例中，考虑到例如针对生物素的四个结合位点，对于四聚体亲和素，使用一个至四个的亲和素连接子。在这种蛋白质穿梭物布置中，物质中的仅一种(例如前导亲和素)需要提供能够将穿梭物驱动至纳米孔110的性质。例如，只有前导亲和素需要带电荷以能够现实穿梭物的电泳或电渗驱动。连接的亲和素物质可以是中性亲和素或链霉亲和素。可以使用其他蛋白质和其他连接物。
对于以上描述的任何蛋白质穿梭物布置，可以使任何合适的靶分子160穿梭，包括PSII分子。PSII是催化水分子分裂的酶，每两个水分子分裂成四个质子、四个电子和一个氧分子。可以研究四步催化过程期间的构象动力学和变化。所述过程由阳光(光子)驱动，因此在这种情况下，用于酶促过程的试剂(底物)是两个水分子和4个光子，并且产物是四个质子、四个电子和一个氧分子。
穿梭蛋白质可以稳定地与靶分子160连接。连接物140可以对蛋白质分子120和靶分子160上的特定位置是特异性的。连接物140可以具有可变的长度以匹配特定靶分子的需要。例如，对于PEG单元，连接物140的长度用生物素与马来酰亚胺之间的PEG单元的数量来调整。蛋白质分子120可以连接至广泛种类的重要的靶分子160。蛋白质(包括酶)可以作为靶分子160与适当的连接子(例如生物素-PEG单元-马来酰亚胺连接子)连接。
任何合适的分子可以作为靶分子进行研究。
图2A示出了根据本公开内容的实施方案的示例性纳米孔传感器系统200A。纳米孔传感器系统200A可以包括第一电极210A、第二电极210B、第一流体室212、第二流体室214、蛋白质分子216、纳米孔218、支撑结构220、电流222、电流传感器224、连接物226、靶分子228和生物素230。尽管在图2A中未示出，但系统200A可以包括冲洗系统，由此分子可以根据需要与第一流体室和第二流体室分开冲洗。在一些情况下，这种系统也可以用于将分子注入第一流体室和/或第二流体室中。
第一电极210A可以设置在第一流体室212中。第二电极210B可以设置在第二流体室214中。电极210A、电极210B可以被配置成在室212、电极214之间施加电压。流体室212、流体室214可以在其中具有流体。例如，第二流体室214可以具有相对于第一流体室212中的流体带负电压的流体。支撑结构220可以包括脂质双层或被配置成引起室212、室214流体分离的其他材料。
施加的偏置电压极性可以产生电流222，所述电流222可以基于选择的蛋白质216的电荷来设置，以使蛋白质从其中一个室被电驱动进入纳米孔218中。例如，为了将亲和素牵引进入纳米孔中，第二流体室214相对于第一流体室212保持在负电压下，并且在第一流体室212中提供亲和素。因此，蛋白质穿梭物216的特性(例如电荷和/或电偶极矩)能够实现蛋白质穿梭物216的电压控制的对接、去对接、捕获和去捕获。
在正好将带电蛋白质216(例如，亲和素，更一般地不含靶蛋白质的穿梭物)对接在孔中或孔处之后，可能存在通过孔的非零残余电流，并且残余电流应该具有低噪声背景。例如，1kHz带宽的均方根电流噪声可以是残余电流的10％或更少。亲和素二聚体或亲和素单体也可以用作与纳米孔组合的穿梭物，例如，纳米孔可以是ClyA或耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋白A(MSPA)。
转到系统200A的其他细节，可以以任何合适的方式在支撑结构220中提供纳米孔218。例如，可以通过将ClyA添加至系统200A的第一流体室212中在脂质双层中提供ClyA纳米孔。如200A中所示，当单一一个ClyA纳米孔自身插入膜中时，则在200A的电流传感器224中测量的离子电流222由于离子电流流经在两个室的溶液之间的纳米孔而增加。一旦纳米孔218在支撑结构220中就位，蛋白质216或基于蛋白质的分子穿梭物可以被电泳或以其他方式驱动进入纳米孔218中。在这一步骤之前，可以从第一流体室212冲洗保持在溶液中的纳米孔。
在本公开内容的一些实例中，纳米孔传感器系统200A可以包括特定的组件。支撑结构220可以是悬浮跨过电解缓冲溶液(150mM NaCl、15mM TRIS pH7.5)中的40微米铁氟龙框架的脂质双层膜。可以将银/氯化银电极210A、210B放置在每一个贮存器中，并且可以施加跨过膜的几十mV的电流222。所述膜电隔离两个贮存器，并且最初没有电流222在电极210A与电极210B之间流动。可以将预先形成的ClyA孔添加至第一流体室212中，并且当单个孔110插入膜中时(在电流阶跃变化至稳定的开孔电流时观察)，立即用缓冲电解质溶液冲洗第一流体室212以防止附加的ClyA孔插入膜中。一旦单个孔在膜中就位，可以将10pmol的亲和素添加至第一流体室212中。当单独的带正电荷的亲和素分子被纳米孔218捕捉并且随后从纳米孔218中逃逸或排出时，电流222被瞬时阻塞。
在蛋白质216插入第一流体室212之前，可以测量和分析通过单独的电压偏置的纳米孔218的离子电导率。对于示例性ClyA纳米孔，发现在30mV偏压下测量的1.66nS的电导率是常见的，并且可以用于亲和素的捕获。具有在该值的一定百分比内的电导率的ClyA纳米孔是在插入膜中时观察到的最常见的纳米孔，并且随时间是最稳定的。
在用于驱动蛋白质进入纳米孔的方法的一个实例中，亲和素被插入在ClyA纳米孔中。例如，在将10pmol(1微升体积)的亲和素添加至200A的250微升的第一流体室212中(其中1.66nS ClyA纳米孔位于脂质双层上)后，观察到当单独的亲和素蛋白质分子被纳米孔218捕获并且从纳米孔218中逃逸时，通过-35mV电压-偏置的纳米孔的电流从约58pA的开通-纳米孔值瞬时下降。在一些情况下，可以观察到亲和素在ClyA中的永久捕捉状态：这可以被称为穿梭蛋白质亲和素在ClyA中的对接状态。为了测量电流222，可以采用任意合适的电流传感器224，例如，Molecular Devices Axopatch膜片钳放大器。输出信号可以被处理，例如，通过10kHz、4极点贝塞尔(Bessel)滤波器，以最小化高频电流噪声，并且然后采样和数字化，以及存储用于处理。
连接物226可以经由生物素230连接至蛋白质分子216和靶分子228。靶分子228可以是PSII靶分子。
插入到系统200A中的纳米孔218中的亲和素可以被布置成蛋白质穿梭物，包括一个或多个连接物226和靶分子228。纳米孔系统200A的室212和室214中的蛋白质分子216和靶分子228，亲和素或其他前导蛋白质可以从第一流体室212被牵引至纳米孔218并且被捕捉在纳米孔218中，例如ClyA纳米孔。
也可以在将穿梭物结构单元注入第一流体室或第二流体室中之前预先形成具有蛋白质分子、靶分子和连接子的穿梭物结构。
在可替代的配置中，亲和素或穿梭物的其他前导结构被设置在两个流体室中的一个(例如，第一流体室212)中，并且靶分子被设置在两个流体室的另一个(例如，第二流体室214)中。在此的靶分子228可以例如被连接物226和与靶分子228相对的连接物226的端部处的生物素230生物素化。目标分子228可以从第二流体室214到达纳米孔218，并且通过纳米孔至第二流体室214的出口连接至已经被捕捉在纳米孔218中的蛋白质216。在这种连接发生之后，可以调节用于将蛋白质216驱动至纳米孔218的电压或其他刺激，例如，以减轻蛋白质216的捕捉、将蛋白质216牵引回第一流体室212，并且由此经由附接在蛋白质216与靶分子228之间的连接物226将靶分子228从第二流体室214进一步拉至纳米孔218。
因此，可以提供系统200A用于电泳驱动和捕获亲和素216，以及相应地将包括亲和素-生物素+连接物+靶分子布置的分子穿梭物捕获进入纳米孔218中。提供系统200A用于确定性控制经由生物素230和连接物226附接至靶分子228的亲和素蛋白质穿梭物，在此是PSII光合成酶，用于PSII靶分子228朝向以及至少部分进入纳米孔的可控方向和取向。
蛋白质分子216可以被捕捉在纳米孔218中，并且靶分子228可以部分地从第一流体室212进入纳米孔218。蛋白质分子216被纳米孔218以对接状态捕获并且靶分子连接至蛋白质分子可以被认为是阻塞事件。在这种情况下的电流信号与当仅对接蛋白质分子216时的电流信号的变化(当在两种情况下在流体室之间施加相同的施加电压时)是目标电流信号，并且含有与用传感器平台感测的靶分子对应的信号。在本公开内容的一些实例中，靶分子228可以设置在第二流体室214中，并且可以被纳米孔218捕获使得靶分子228在阻塞事件期间至少部分地阻塞至少一个纳米孔(未示出)。
图2A示出了纳米孔系统200A，其中设置在第一流体室212中的蛋白质216(例如亲和素)可以被电泳、电渗或以其他方式驱动至纳米孔218，至少部分地被带入纳米孔218中，在纳米孔218中保持选定的持续时间，并且然后随后从纳米孔218中释放返回第一流体室212中。然后可以将释放的蛋白质216重新牵引并且重新捕捉在纳米孔218中。可替代地，可以将来自第一流体室212或来自第二流体室214的不同蛋白质驱动至纳米孔218以进行捕捉。当被布置在分子穿梭物中时，亲和素由此可以作为推动穿梭物朝向、进入和离开纳米孔218的发动机进行控制。由此，与蛋白质216连接的靶分子228可以在纳米孔218处被捕获持续一段受控的捕获时间，以使得即使在单分子水平上也能够评估连接的靶分子228。根据靶分子228的大小，可以用亲和素将靶分子228完全拉入纳米孔218中，或者本文所示，可以部分地拉入纳米孔218中。可替代地，靶分子228可以被拉至纳米孔218的入口。对本文提供的亲和素-ClyA纳米孔平台以及生物素-亲和素-ClyA系统的无扰的电子性质的理解能够实现此类靶分子捕获和评估。
匹配的一对纳米孔和带电荷的蛋白质穿梭物可以导致穿梭蛋白质以特定且可重复的取向对接在纳米孔处或纳米孔中。例如，ClyA十二聚体可以与亲和素四聚体匹配。这种组合对于宽范围的pH值是理想的。形状配合可以用于确保带电荷的蛋白质穿梭物在孔中特定位置处对接并且具有相对于孔的特定取向。例如，可以使亲和素以导致通过纳米孔的电流阻塞的特定取向对接。施加的电压可以导致蛋白质穿梭物受控地对接和去对接。
图2A展示了蛋白质穿梭物的操作，在此，穿梭物包括亲和素-生物素+连接物+靶分子布置，用于可控地将靶分子引导至并且可能地进入纳米孔。系统200A允许在纳米孔中或在纳米孔处捕捉具有低净电荷或无净电荷的目标分子，并且允许捕捉相对于纳米孔具有受控的取向的目标分子。
图2B示出了根据本公开内容的实施方案的用于测量纳米孔电导率的示例性宏观纳米孔传感器装置200B。图2B包括许多与图2A相同的组件，并且还包括电压表232和变压器234。因此，纳米孔传感器装置200B可以测量通过第一流体室212与第二流体室214之间的纳米孔218的离子电流。
例如，可以将宏观纳米孔218胶合在薄的绝缘塑料片中以模拟脂质膜。所述片可以分隔两个150mM NaCl水溶液的贮存器，并且在每一个贮存器中，11.4cm的半径的半球形电极210A和半球形电极210B围绕孔。可以用10至50伏特均方根的60Hz AC电压对宏观孔系统200B进行电导率测量。电导率可以从I-V图的线性斜率计算。在观察的电流与施加的电压之间不应观察到相移。可以监测电解质的温度，并且可以将测量限制在持续几秒钟以最小化电解质焦耳加热。
将测量的电导率值缩放3/107获得2.87nS的纳米孔218的几何电导率。测量的几何孔电导率的倒数是单独的孔的电导率倒数和通路电阻的总和。通路电阻校正至无限电极半径可以使总电阻增加1.57％。通过排除氯离子对孔电导率的贡献的部分，这种测量并且缩放的电导率值将显著减小。为了评估减小因子，1.66nS ClyA纳米孔可以被捕获在两侧具有150mM缓冲盐溶液的脂质双层膜中。第一流体室212可以用20mM缓冲盐溶液再填充。这可以产生跨过纳米孔218的26mV的可测量的开路电位，这是由于在漂移扩散过程中钠离子与氯离子跨过孔的不相等转移。
来自离子通道生物物理学的戈德曼-霍奇金-卡茨(Goldman-Hodgkin-Katz，GHK)通量方程可以分析测量的跨过孔的开路电势。GHK方程可以计算出反映氯离子相对于钠离子被阻塞穿过纳米孔218的程度的渗透因子。靠近出口孔的孔腔中的负电荷可以排斥NaCl盐溶液中的负氯离子，并且导致穿过孔的氯离子的迁移率和扩散常数降低。通过施加跨过孔的盐梯度，迁移率和扩散常数的这种差异可以导致跨过孔的电压增加。通过在稳态下(即，当没有电流通过孔时)测量该电压，GHK方程可以推导出氯离子和钠离子的迁移率的比率，并且由此推导出通过孔的氯离子的相对电荷排阻。
GHK计算得到0.22的渗透因子，其小于在较高摩尔浓度下获得的0.33。由于在较低离子强度下较大的德拜屏蔽长度，在宏观装置200B中应预期较大的氯离子阻塞效应。获得的渗透因子从几何孔电导率值降低了纳米孔电导率。这种分析可以帮助预测在图2A中显示的系统的条件下ClyA12孔电导率，其中孔电导率因此应为1.75nS。
简单的缩放参数表明，对于其他可能的低聚物候选物(稍大的13’聚体)的电导预期值将是1.97nS，这将其排除。较高的电导率表明纳米孔不适合蛋白质分子。例如，13’聚体孔的较大尺寸(直径)不再使其成为亲和素的形状配合的孔，因此亲和素不会在特定位置和以特定的取向对接在13’聚体孔中。存在少量的具有1.9nS的孔，但这些孔在插入膜220中时有些不稳定。因此，图2B示出了示例性宏观系统200B，其可以鉴定用于适当微观系统(例如，图2A的系统)的约束。
图3A示出了根据本公开内容的实施方案的使用纳米孔传感器的示例性方法300A。示例性方法300A可以使用如参考图2A至图2B所述的纳米孔传感器。方法300A可以提供分析在一个或多个纳米孔中和/或处的分子捕捉的方法。
所述方法可以通过施加跨过一个或多个纳米孔的电压在步骤310开始。电压可以将至少一个蛋白质穿梭物牵引向一个或多个纳米孔中的至少一个。蛋白质穿梭物可以包含带电荷的蛋白质分子。在一些情况下，蛋白质穿梭物可以还包含一个或多个连接物和靶分子。当施加电压时，方法可以规定在步骤312中测量通过一个或多个纳米孔中的至少一个的离子电流。
当测量离子电流时，方法还可以规定基于一个或多个纳米孔中的至少一个的离子电流来检测步骤314中的阻塞事件。阻塞事件指示蛋白质穿梭物被一个或多个纳米孔中的至少一个捕获。可以通过总离子电流的变化或者一个或多个纳米孔中的具体一个的离子电流的变化来检测阻塞事件。离子电流的变化可以包括离子电流的降低。
在步骤314的一些实例中，所述方法可以任选地包括在阻塞事件发生之后保持电压。在其他实例中，步骤314可以包括在阻塞事件发生之后降低电压。在其他实例中，步骤314可以包括在阻塞事件发生之后增加电压。在其他实例中，314可以包括在阻塞事件发生之后反转电压。
在检测到阻塞事件之后，方法300A可以进行至步骤316，其中测量阻塞事件的持续时间。在测量持续时间之后，所述方法可以还包括318确定在阻塞事件期间的平均离子电流。
在一些实例中，方法300A可以包括通过反转电压的极性来诱导捕获的蛋白质穿梭物的排出。例如，方法300A可以包括在某一选择的持续时间之后自动反转电压。例如，所述持续时间可以是测量的电流阻塞的1秒。这种电压极性反转将带正电荷的蛋白质从纳米孔中排出。然后可以将偏置电压返回到负值，之后再次观察到开通-纳米孔电流，随后是新的电流阻塞捕获事件。如果将具有连接的靶分子的蛋白质穿梭物最初提供在第一流体室中，则穿梭物和靶分子被送回至第一流体室。在一些情况下，通过在穿梭物被捕捉之后增加电压，即使穿梭物最初从第一流体室进入孔，也可以将穿梭物排出至第二流体室中。
这种方法可以用于一个或多个纳米孔、用于一个或多个蛋白质穿梭物和/或用于一个或多个阻塞事件。因此，例如根据图2C中显示的实例，方法300A提供了确定蛋白质穿梭物是否被纳米孔捕捉的手段。
图3B示出了根据本公开内容的实施方案的用于捕捉和释放蛋白质穿梭物的示例性方法300B。示例性方法300B包括在步骤322提供纳米孔传感器。纳米孔传感器可以根据参考图2A至图2C讨论的本公开内容的实施方案。
返回参考图3B，方法300B可以然后包括在步骤324引入蛋白质穿梭物。蛋白质穿梭物可以是如参考图1F和图2A讨论的蛋白质穿梭物。蛋白质穿梭物可以被引入到纳米孔传感器的第一流体室中。在本公开内容的一些实例中，蛋白质穿梭物可以被引入到纳米孔传感器的第二流体室中。
然后，方法300B可以包括在步骤326中施加电压以使蛋白质穿梭物被纳米孔捕捉。在步骤328中，方法可以规定通过反转电压的极性来诱导蛋白质穿梭物从至少一个纳米孔中排出。
因此，图3B提供了根据本公开内容的实施方案的用于捕获和释放蛋白质穿梭物的方法300B。
图4示出了根据本公开内容的实施方案的示例性靶分子400的结构。示例性靶分子可以包括脂质或清洁剂分子410；β-分泌酶裂解位点420；γ-分泌酶裂解位点430；以及连接子分子440。在一些实例中，靶蛋白质可以是APP，一种膜结合蛋白质。β-分泌酶可以结合APP蛋白质并且使APP蛋白裂解。连接子分子可以连接蛋白质分子，例如亲和素。裂解酶、β-分泌酶和γ-分泌酶可以顺序地结合APP蛋白质并且裂解APP蛋白质。通过在ClyA纳米孔中捕捉具有连接的APP蛋白质的穿梭物，可以将β-分泌酶和/或γ-分泌酶添加至纳米孔传感器的流体室中。可以监测得到的时间依赖性电流信号以检查与APP蛋白质结合并且裂解APP蛋白质的酶的动力学。因此，例如，使用这种示例性靶标的系统可以探测纳米孔传感器系统的动力学是否随着旨在抑制β-分泌酶或γ-分泌酶的裂解活性的靶向药物而改变。被β-分泌酶和γ-分泌酶切割的APP被认为对于阿尔茨海默氏病是重要的，因为通过这些酶裂解APP导致将形成β-淀粉样斑块的裂解片段Aβ的形成。APP是β-淀粉样前体蛋白质。Aβ是淀粉样β-肽。γ-分泌酶包括催化活性γ-分泌酶(例如含有活性γ-分泌酶复合物的PS1)和可溶性γ-分泌酶(例如用清洁剂酶增溶)，包括可溶性活性γ-分泌酶。β-分泌酶包括可溶性β-分泌酶。在图4中，连接子被示意性地显示为在一个位置连接至APP蛋白质。取决于连接子位置-例如连接子也可以连接至APP的相对端-可以对β-分泌酶和/或γ-分泌酶裂解APP的最大敏感性选择平台。
任何合适的靶分子可以在纳米孔平台上使用蛋白质穿梭物进行研究，例如，具有脂质或清洁剂分子的淀粉样前体蛋白质(APP)。图4示出了待探测的靶蛋白质400结构的实例，即在脂质中或具有清洁剂分子的APP蛋白质(其是膜结合蛋白质)。这种蛋白质可以与蛋白质穿梭物布置在一起，用于在纳米孔处研究这种蛋白质。例如，可以借助于纳米孔匹配的蛋白质穿梭物来研究切割酶(例如β分泌酶或γ分泌酶)的运作的动力学以及药物靶标对系统的影响，并且穿梭物可以包括如以上所述的任何数量的连接物。
图5A至图5B示出了根据本公开内容的实施方案的示例性宏观纳米孔510和蛋白质分子结构520。图5A至图5B示出了3D打印的宏观模型。图5A示出了亲和素-纳米孔结构，其中刚性亲和素分子520位于刚性ClyA12孔510的顶部，所述刚性ClyA12孔510定向成在宏观电导率实验中获得10％的最大电流阻塞。图5B示出了被最大程度地压入刚性ClyA12孔模型510中的弹性亲和素模型520，在宏观电导率实验中实现了20％的阻塞。对于实际的蛋白质和纳米孔尺寸，比例尺对应于3纳米。
对于1.66nS ClyA纳米孔，如果ClyA低聚物中的原体(protomer)的数量是已知的，以上描述的亲和素-ClyA相互作用的性质可以在分子水平上理解。为了解决这个问题，实验方法可以确定预期哪种低聚物具有观察到的1.66nS的电导率。存在决定电导率的两种现象。一种仅仅是纳米孔的几何结构。然后，通过在纳米孔的壁上带电氨基酸的存在来改变这种基于几何结构的电导率。事实上，在ClyA中，已知沿纳米孔长度的最小直径的极限位点具有高负电荷，其可以阻塞通过纳米孔的氯离子传导。几何和电荷选择性效应可以在不同的实验中确定并且组合以预测给定纳米孔的总电导率。
为了确定对纳米孔电导率的几何贡献，可以构建选择的纳米孔(例如ClyA)的模型(例如3D打印的模型)，将其以107/3的系数按比例放大至从蛋白质数据库获得的ClyA纳米孔的原子坐标。用于制备按比例放大的纳米孔的3D打印机是约50微米的分辨率的FormLabsForm2模型。将分子的尺寸按比例放大来自PDB数据库的107/3的系数。用于刚性模型的塑料是FormLabs Clear(部件#FLPGCL02、部件#FLPGCL03)。
为了模拟如本文提供的配合在纳米孔510中的蛋白质520，可以用与ClyA12 3D打印的纳米孔510使用的相同的比例制备3D打印的亲和素蛋白质520。用于柔性亲和素模型的3D打印塑料是具有80A的肖氏硬度的FormLabs Flexible(部件#FLFLGR02)。
不管取向如何，3D打印的蛋白质510稍大而不能完全进入3D打印的ClyA纳米孔孔腔，大部分被亲和素520的外表面上的几个残基阻止进入。在宏观电导率实验中将分子放置在孔510的边缘上(如图3A中所示)仅使电导率降低10％。通过将亲和素520深深地插入图5B中所示的孔的孔腔中，观察到仅20％的电导率降低。
在几何学上，蛋白质和/或纳米孔的弹性可以允许蛋白质更深地进入纳米孔，并且在由施加的偏置电压产生的电场提供的力下更紧密地接触。此外，当蛋白质520接近纳米孔510的底部时，纳米孔孔腔中的静电荷可以在短距离处与蛋白质上的静电荷强烈地相互作用。并且，当蛋白质520在纳米孔510中时，电导率的离子电荷选择性效应可能变得更强，也导致更深的电流阻塞。基于这些考虑，因此优选的是，选择的蛋白质520具有径向直径，所述径向直径至少约与其中配合了蛋白质520的纳米孔510的内部孔腔直径相同。
实施例
重要地，最近的数据显示，当亲和素以永久捕捉状态(AC80)被捕捉时，孔明显更稳定(较少或没有门控事件)。对于低于100mV的电压，孔具有很少或没有门控事件。没有亲和素的孔可能以其他方式具有不受控制的电流跃变(门控事件)。
ClyA单体表达和纯化
除非另有说明，否则所有试剂可以从飞世尔科技(Fisher Scientific)和/或波士顿生物制品(Boston Bioproducts)购买。苯基甲烷磺酰氟(PMSF)和氯化镁购自西格玛(Sigma)。梯度4％至15％凝胶购自伯乐(Bio-rad)，并且清洁剂正十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷(DDM)购自EMD密理博(EMD Millipore)。
在BL21(DE3)细胞中表达C-末端His6标记的ClyAwt蛋白质。具体地，pT7-ClyAwt-CHis6质粒在BL21(DE3)化学感受态细胞中转化，并且在LB-Amp琼脂板上生长。将一个菌落接种在含有100μg/ml氨苄青霉素抗生素的起子LB培养基中，并且在37℃下生长，以200rpm摇动。起子培养物用于接种含有100μg/ml氨苄青霉素的250ml LB培养基。培养物在37℃下生长直至OD600为0.5至0.65。然后将培养物在冰上冷却，并且通过添加IPTG至最终浓度0.5mM来诱导，并且然后在15℃下在摇动下孵育16小时。16小时后，以3100x g收获培养物，并且将球粒重新悬浮在15ml的50mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA缓冲液中，并且在-20℃下冷冻直至准备使用。
随后将冷冻的球粒在室温下解冻，并且加入0.5mM的最终浓度的PMSF。将混合物在冰上超声以裂解细胞。将MgCl2以10mM的最终浓度添加至裂解物中，并且然后将混合物在20,000x g下离心20分钟。将上清液通过0.22μm过滤膜过滤，并且负载至用缓冲液A(150mMNaCl、50mM Tris-HCl pH8)平衡的重力NiNTA柱上。随后用缓冲液A洗涤柱以去除未结合的蛋白质。用缓冲液A1(150mM NaCl、50mM Tris-HCl、50mM咪唑)洗涤弱结合的蛋白质，并且然后洗脱ClyA蛋白质并且在缓冲液A2(150mM NaCl、50mM Tris-HCl、150mM咪唑)中收集。
将洗脱的ClyA蛋白质使用6kDa至8kDa截留膜在透析缓冲液(150mM NaCl、50mMTris-HCl、5mM EDTA)中在4℃持续搅拌下透析两个循环。然后使用10kDa截留centricon将蛋白质浓缩至约3ml，并且负载至150mM NaCl、20mM磷酸钠pH7.0缓冲液中平衡的凝胶过滤柱上以去除聚集的蛋白质。收集ClyA单体并且在4℃下保持2周或在-80℃下长期储存。
ClyA低聚物(纳米孔)的制备和纯化
然后将纯化的ClyA单体以0.6mg/mL悬浮在含有50mM NaCl、10mM磷酸钠pH7.4的缓冲溶液中(具有缓冲液交换柱)。通过添加正十二烷基β-D-麦芽糖苷(DDM，Calbiochem/EMD密理博；在水中10％w/v)至1％的最终浓度并且在室温下孵育20分钟，由单体形成低聚体ClyA。
通过使用4％至16％聚丙烯酰胺梯度凝胶(NativePAGE，Invitrogen/Novex LifeTechnologies)的蓝色天然凝胶电泳进行ClyA纳米孔纯化。通常，将10μg的ClyA低聚物与电泳负载的缓冲液组合并且应用于凝胶的1.0mm×5.0mm样品孔。电泳后从凝胶中切下低聚体ClyA的主要条带，并且通过扩散到含有150mM NaCl、0.2％DDM、50mM Tris-Cl pH8.0的洗脱缓冲液中从凝胶切片中回收纳米孔。
亲和素制备
将来自鸡蛋清的冻干纯化的亲和素(皮尔斯/赛默科技(Pierce/ThermoScientific)产品#21121)称量并且溶解在去离子水中至2mg/mL浓度。为了随后在4℃下储存，将具有20％甘油的等体积的2X磷酸盐缓冲盐水添加至悬浮液中，以使亲和素储备溶液浓度为标称1mg/mL。在ClyA纳米孔实验中使用之前，将亲和素储备溶液的等分试样应用于用150mM NaCl、15mM Tris-Cl pH7.5平衡的Bio-Spin 30旋转柱(伯乐实验室(Bio-RadLaboratories))进行缓冲液交换。
d-生物素的制备
通过每mL 20mM KCl、50mM Tris-Cl pH7.5溶解0.2mg d-生物素(西格玛奥德里奇/密理博西格玛(Sigma-Aldrich/Millipore Sigma))来制备约1mM生物素溶液。
以上描述的纳米孔匹配的蛋白质穿梭物不限于亲和素-ClyA蛋白质-纳米孔实例。蛋白质和靶分子结构、动力学和酶活性的研究在本文中更一般地通过对于一些蛋白质构型和对于沿着纳米孔长度的至少一个位点，具有基本上等于或小于蛋白质的直径的内部孔腔直径的纳米孔来实现。蛋白质在纳米孔中的永久捕获在本文中是可行的，并且可以用于分子穿梭物中提供的蛋白质和靶分子的研究。在相应的方法中，蛋白质穿梭物和靶分子被捕获在纳米孔中或至少部分地捕获在纳米孔中，进行研究，然后从纳米孔中排出。对于深度捕捉的亲和素和亲和素-生物素复合物观察到的低电流噪声表明，该系统提供了用于研究由靶分子和/或底物与靶分子相互作用和/或由此类相互作用产生的产物诱导的电信号的安静背景。因此，在分子穿梭物中采用的亲和素-生物素复合物能够将靶分子研究控制在迄今无法达到的水平。
虽然以上已经描述了本发明的各种实施例，但应理解，它们仅作为实例提出，而不是限制性的。在不背离本发明的主旨或范围的情况下，可以根据本文中的公开内容对公开的实施例进行各种改变。因此，本发明的广度和范围不应受到任何以上描述的实施例限制。相反，本发明的范围应根据以下权利要求及其等同来限定。
尽管已经参考一个或多个实现方式说明和描述了本发明，但本领域技术人员在阅读和理解本说明书和附图后将会想到等同的改变和修改。此外，虽然已经参考若干实现方式中的仅一个公开了本发明的具体特征，但在可能期望并且有利于任意给定的或特定的应用中时，此类特征可以与其他实现方式的一个或多个其他特征组合。
本文使用的术语仅出于描述具体实施例的目的，而非旨在限制本发明。如本文使用，单数形式“一(a)”、“一(an)”以及“所述/该(the)”旨在还包括复数形式，除非上下文另外明确指出。此外，就术语“包括(including)、”“包括(includes)、”“具有(having)、”“具有(has)、”“具有(with)”或其变体在详细描述和/或权利要求中使用而言，此类术语旨在以类似于术语“包含(comprising)”的方式包括在内。
除非另外限定，否则本文使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。还应理解，术语(例如通常使用的字典中定义的那些术语)应被解释为具有与相关领域的背景下他们的含义一致的含义，并且不应被解释为理想化的或过于正式的意义，除非本文明确如此定义。

Claims (39)

1.纳米孔传感器，包括：
支撑结构，其分隔第一流体室与第二流体室；
至少一个纳米孔，其设置在所述支撑结构中，所述至少一个纳米孔的入口流体连接至所述第一流体室并且所述至少一个纳米孔的出口流体连接至所述第二流体室；以及
蛋白质穿梭物，其包括带电荷的蛋白质分子，其中所述带电荷的蛋白质分子具有至少与所述至少一个纳米孔的孔腔的最小直径一样长的径向范围。
2.根据权利要求1所述的纳米孔传感器，其中所述蛋白质穿梭物还包括至少一个连接物，其中所述连接物附接至所述蛋白质分子并且被构造成将所述蛋白质穿梭物连接到至少一个靶分子。
3.根据权利要求1所述的纳米孔传感器，还包括所述第一流体室中的第一电极和所述第二流体室中的第二电极，其中所述第一电极和所述第二电极被配置成在所述第一流体室与所述第二流体室之间施加电压。
4.根据权利要求3所述的纳米孔传感器，其中所述第二流体室中的第二流体相对于所述第一流体室中的第一流体具有负电压。
5.根据权利要求2所述的纳米孔传感器，其中所述连接物包括生物素。
6.根据权利要求1所述的纳米孔传感器，其中所述至少一个纳米孔包括细胞溶素A(ClyA)纳米孔。
7.根据权利要求1所述的纳米孔传感器，其中所述支撑结构包括脂质双层。
8.根据权利要求1所述的纳米孔传感器，其中所述带电荷的蛋白质分子包括亲和素。
9.根据权利要求1所述的纳米孔传感器，还包括在所述第一电极与所述第二电极之间连接的电路，以测量通过在所述第一流体室与所述第二流体室之间的所述至少一个纳米孔的离子电流。
10.根据权利要求1所述的纳米孔传感器，其中所述至少一个纳米孔的内部孔腔具有第一直径，并且其中所述出口具有第二直径，并且其中所述入口具有第三直径，其中所述第一直径、所述第二直径、所述第三直径彼此不同。
11.根据权利要求10所述的纳米孔传感器，其中所述第二直径小于所述第三直径。
12.根据权利要求2所述的纳米孔传感器，其中所述第一流体室包括多个所述至少一个靶分子，并且其中在阻塞事件期间靶分子至少部分地阻塞所述至少一个纳米孔。
13.根据权利要求2所述的纳米孔传感器，其中所述第二流体室包括多个所述至少一个靶分子，并且其中在阻塞事件期间所述靶分子至少部分地阻塞所述至少一个纳米孔。
14.根据权利要求2所述的纳米孔传感器，其中所述至少一个靶分子包括DNA序列、RNA序列和Cas9蛋白质中的至少一种。
15.分析延伸穿过分隔第一流体室和第二流体室的支撑结构的一个或多个纳米孔中和/或一个或多个纳米孔处的分子捕捉的方法，所述方法包括：
施加跨过所述一个或多个纳米孔的电压，以将蛋白质穿梭物朝所述一个或多个纳米孔中的至少一个牵引，所述蛋白质穿梭物中的每一个包括带电荷的蛋白质分子；
测量在所述施加期间通过所述一个或多个纳米孔中的每一个纳米孔或所有纳米孔的离子电流；以及
基于所述一个或多个纳米孔中的每一个纳米孔或所有纳米孔的所述离子电流，检测所述一个或多个纳米孔中的任一个是否与阻塞事件相关，其中所述阻塞事件中的每一个表明所述蛋白质穿梭物被所述一个或多个纳米孔中的至少一个捕获，并且其中所述阻塞事件中的每一个通过所述总离子电流的变化或所述一个或多个纳米孔中的特定一个纳米孔的离子电流的变化来检测。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述离子电流的所述变化包括所述离子电流的降低。
17.根据权利要求15所述的方法，还包括在所述阻塞事件之后维持所述电压。
18.根据权利要求15所述的方法，还包括在所述阻塞事件期间减小所述电压。
19.根据权利要求15所述的方法，还包括在所述阻塞事件期间增加所述电压。
20.根据权利要求15所述的方法，还包括在检测到的阻塞事件之后，改变所述电压的极性。
21.根据权利要求15所述的方法，还包括在所述阻塞事件期间改变所述电压的极性。
22.根据权利要求15所述的方法，还包括：
测量所述阻塞事件中的每一个的持续时间；以及
确定每一个阻塞事件期间通过所述一个或多个纳米孔的平均离子电流。
23.根据权利要求15所述的方法，其中所述蛋白质穿梭物的每一个或子集还包括至少一个连接物，其中所述连接物附接至所述蛋白质分子并且被构造成将特定蛋白质穿梭物连接到至少一个靶分子。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述连接物包括生物素。
25.根据权利要求15所述的方法，其中所述一个或多个纳米孔包括细胞溶素A(ClyA)纳米孔。
26.根据权利要求15所述的方法，其中所述支撑结构包括脂质双层。
27.根据权利要求15所述的方法，其中所述带电荷的蛋白质分子包括亲和素。
28.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法还包括通过反转所述电压的极性诱导从阻塞事件中排出特定的蛋白质穿梭物。
29.制备用于分析的靶分子的方法，
提供纳米孔传感器，其中所述纳米孔传感器包括支撑结构，其分隔第一流体室与第二流体室；以及至少一个纳米孔，其设置在所述支撑结构中，所述纳米孔的入口流体连接至所述第一流体室并且所述纳米孔的出口流体连接至所述第二流体室；
将蛋白质穿梭物引入所述纳米孔传感器的所述第一流体室中，其中所述蛋白质穿梭物包括蛋白质分子，其中所述蛋白质分子是带电荷的；以及
施加电压以使所述蛋白质穿梭物被所述至少一个纳米孔捕获。
30.根据权利要求29所述的方法，还包括通过反转所述电压的极性诱导所述蛋白质穿梭物从所述至少一个纳米孔中排出。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述蛋白质穿梭物还包括至少一个连接物，其中所述连接物附接至所述蛋白质分子并且被构造成将所述蛋白质穿梭物连接到至少一个靶分子。
32.分析靶分子的方法，包括：
提供纳米孔传感器，其中所述纳米孔传感器包括支撑结构，其分隔第一流体室与第二流体室；以及至少一个纳米孔，其设置在所述支撑结构中，所述纳米孔的入口流体连接至所述第一流体室并且所述纳米孔的出口流体连接至所述第二流体室；
将带电荷的蛋白质分子引入所述纳米孔传感器的所述第一流体室中；
施加电压以使所述带电荷的蛋白质分子被所述至少一个纳米孔捕获；以及
检测电流由于所述带电荷的蛋白质分子被所述至少一个纳米孔捕获而相对于所述至少一个纳米孔的初始电流的变化。
33.根据权利要求32所述的方法，还包括反转所述施加的电压的极性以排出所述带电荷的蛋白质分子。
34.根据权利要求33所述的方法，还包括：
将蛋白质穿梭物引入所述纳米孔传感器的所述第一流体室中，其中所述蛋白质穿梭物包括所述带电荷的蛋白质分子和靶分子；以及
检测电流由于所述带电荷的蛋白质分子被所述至少一个纳米孔捕获而相对于所述至少一个纳米孔的初始电流的变化。
35.根据权利要求31所述的方法，其中所述蛋白质穿梭物还包括至少一个连接物，其中所述连接物附接至所述带电荷的蛋白质分子并且被构造成将所述带电荷的蛋白质分子连接到至少一个靶分子。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述连接物包括生物素。
37.根据权利要求31所述的方法，其中所述一个或多个纳米孔包括细胞溶素A(ClyA)纳米孔。
38.根据权利要求31所述的方法，其中所述支撑结构包括脂质双层。
39.根据权利要求31所述的方法，其中所述带电荷的蛋白质分子包括亲和素。
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