KR20240067097A - 나노공극을 사용한 폴리뉴클레오타이드 시퀀싱 - Google Patents
나노공극을 사용한 폴리뉴클레오타이드 시퀀싱 Download PDFInfo
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Abstract
나노공극을 사용한 폴리뉴클레오타이드 시퀀싱이 본원에 제공된다. 폴리뉴클레오타이드는 3' 말단이 나노공극의 제1 측에 있고 5' 말단이 나노공극의 제2 측에 있도록 나노공극의 개구부를 통해 배치된다. 나노공극의 제1 측에는, 3' 말단을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 이중체가 형성된다. 이중체는 이중체의 3' 말단에 뉴클레오타이드를 부가하는 방식으로 나노공극의 제1 측에서 연장된다. 이중체의 3' 말단을 개구부 내에 배치하는 제1 힘이 가해지고, 나노공극은 이중체의 3' 말단이 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해한다. 이중체의 3' 말단과 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 전기적 특성 값이 측정된다. 측정값을 사용하여 이중체의 3' 말단에 있는 뉴클레오타이드가 식별된다.
Description
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2021년 9월 22일자 출원된 "Sequencing Polynucleotides Using Nanopores"라는 발명의 명칭의 미국 임시출원 제63/247,155호를 우선권 주장하며, 상기 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로 인용된다.
서열목록
첨부된 서열목록의 자료는 본 출원에 참고로 포함된다. "G1094_IP_2048_PCT.xml"라는 파일명의 첨부된 서열목록 XML 파일은 2022년 9월 16일자에 생성되었으며, 크기는 8 kB이다.
기술분야
본 출원은 일반적으로 나노공극(nanopore)을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 것에 관한 것이다.
폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하기 위해 나노공극을 사용하는 데 상당한 양의 학문적 및 기업적 시간과 에너지가 투자되었다. 예를 들어, 인가된 전기장에서 나노공극 꼭대기에 있는 DNA 폴리머라아제 I의 Klenow 단편(KF)과 DNA의 복합체에 대한 체류 시간이 측정되었다. 또는, 예를 들어, α-헤몰리신 나노공극에 포획된 DNA와 관련된 실험에 전류 또는 유속 측정 센서가 사용되었다. 또는, 예를 들어, α-헤몰리신 나노공극 맨 위의 전기장에서 포획될 때의 특성에 기반하여 KF-DNA 복합체가 구별되었다. 또 다른 예에서, 폴리뉴클레오타이드 시퀀싱은 나노공극에 근접하게 부착된 주형 핵산과 폴리머라아제 효소를 포함하는 단일 폴리머라아제 효소 복합체, 및 용액 중 뉴클레오타이드 유사체를 사용하여 수행된다. 뉴클레오타이드 유사체는, 뉴클레오타이드 유사체가 합성되는 폴리뉴클레오타이드에 혼입될 때 전하 차단 표지가 절단되도록 뉴클레오타이드 유사체의 폴리포스페이트 부분에 부착된 전하 차단 표지를 포함한다. 전하 차단 표지는 나노공극에 의해 검출되어 혼입된 뉴클레오타이드의 존재와 정체성을 결정하고, 이에 따라 주형 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정한다. 또 다른 예에서, 작제물은 막관통 단백질 나노공극 서브유닛과 핵산 처리 효소를 포함한다.
문헌[Olasagasti et al., "Replication of individual DNA molecules under electronic control using a protein nanopore," Nature Nanotechnology 5(11): 798-806 (2010)]에는, 나노공극을 통해 DNA 주형을 배치하는 것이 개시되어 있다. DNA 주형-폴리머라아제 복합체는 α-헤몰리신 나노공극의 제1 측에 형성되며, DNA 이중체와 폴리머라아제를 포함한다. DNA 주형은 초기에 α-헤몰리신 나노공극의 제2 측에 배치되는 무염기성 리포터 뉴클레오타이드를 포함한다. 폴리머라아제를 사용하여 DNA 주형의 서열에 기반하여 이중체에 뉴클레오타이드를 부가하는 동안, 나노공극을 통한 이온 전류가 측정된다(IEBS, 여기서 EBS는 효소 결합된 상태를 나타냄). 이러한 뉴클레오타이드가 부가됨에 따라, 무염기성 리포터 뉴클레오타이드는 α-헤몰리신을 향해, 이어서 α-헤몰리신을 통해 끌려가게 되며, 이는 IEBS에 변화를 일으킨다.
하지만, 이러한 이전에 알려진 조성물, 시스템 및 방법은 충분히 견고하거나, 재현성이 있거나 또는 민감하다고 할 수 없으며, 실제 구현을 위한, 예를 들어 비용 효율적이고 고도로 정확한 작업을 요구하는 임상 및 기타 설정에서 게놈 시퀀싱과 같은 요구 조건이 많은 상업적 적용을 위한 처리량이 충분히 높지 않을 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드 시퀀싱을 위한 개선된 조성물, 시스템 및 방법이 필요하다.
나노공극을 사용한 폴리뉴클레오타이드 시퀀싱이 본원에 제공된다.
본원의 일부 예는, 제1 측, 제2 측, 및 제1 측과 제2 측을 통해 연장되는 개구부(aperture)를 포함하는 나노공극을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단이 나노공극의 제1 측에 있고, 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단이 나노공극의 제2 측에 있도록 나노공극의 개구부를 통해 폴리뉴클레오타이드를 배치하는 작업 (a)를 포함할 수 있다. 상기 방법은 나노공극의 제1 측에 폴리뉴클레오타이드로 3' 말단을 포함하는 이중체를 형성하는 작업 (b)를 포함할 수 있다. 상기 방법은 이중체의 3' 말단에 제1 뉴클레오타이드를 부가하는 방식으로 나노공극의 제1 측에서 이중체를 연장시키는 작업 (c)를 포함할 수 있다. 상기 방법은 연장된 이중체의 3' 말단을 개구부 내에 배치하는 제1 힘을 가하는 작업 (d)를 포함할 수 있다. 상기 방법은, 제1 힘이 가해지는 동안, 나노공극을 사용하여 연장된 이중체의 3' 말단이 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해하고, 연장된 이중체의 3' 말단과 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 전기적 특성 값을 측정하는 작업을 포함할 수 있다. 상기 방법은 작업 (d)에서 측정된 값을 사용하여 제1 뉴클레오타이드를 식별하는 작업 (e)를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 작업 (d)에서 측정된 값은 나노공극에 걸친 전류, 이온 전류, 전기 저항 또는 전압 강하를 포함한다. 일부 예에서, 작업 (d)에서 측정된 값은 나노공극에 걸친 전류, 이온 전류, 전기 저항 또는 전압 강하의 노이즈(noise)를 포함한다. 일부 예에서, 작업 (d)에서 측정된 값은 노이즈의 표준편차를 포함한다.
일부 예에서, 작업 (d)에서 측정된 값은 적어도 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 M개의 뉴클레오타이드와 연장된 이중체의 D개의 혼성화된 뉴클레오타이드 쌍을 기반으로 한다. 일부 예에서, M은 2 이상이고, D는 1 이상이다. 일부 예에서, M은 3 이상이다. 일부 예에서, D는 2 이상이다. 일부 예에서, 단일 가닥 부분의 M개의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 변형된 염기를 포함하며, 상기 방법은 작업 (d)에서 측정된 값을 사용하여 변형된 염기를 식별하는 작업을 포함한다. 일부 예에서, 변형된 염기는 메틸화된 염기를 포함한다.
일부 예에서, 상기 방법은 작업 (d)에서 제1 힘이 가해지는 동안 연장된 이중체의 3' 말단에 또 다른 뉴클레오타이드가 부가되는 것을 저해하는 작업을 추가로 포함한다. 일부 예에서, 나노공극은 또 다른 뉴클레오타이드의 부가를 저해한다.
일부 예에서, 나노공극은, 나노공극의 제1 측이 개구부의 대부분을 포함하도록 배향된다. 일부 예에서, 나노공극은, 나노공극의 제2 측이 개구부의 대부분을 포함하도록 배향된다.
일부 예에서, 상기 방법은 연장된 이중체의 3' 말단을 개구부 내에 다시 배치하는 변형된 제1 힘을 가하는 작업 (f)를 추가로 포함한다. 상기 방법은, 변형된 제1 힘을 가하는 동안, 나노공극을 사용하여 연장된 이중체의 3' 말단이 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해하고, 연장된 이중체의 3' 말단과 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 전기적 특성 값을 측정하는 작업을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 작업 (f)에서 측정된 값을 사용하여 제1 뉴클레오타이드를 식별하는 작업 (g)를 추가로 포함할 수 있다.
일부 예에서, 제1 뉴클레오타이드는 이중체의 3' 말단과 접촉하고 있는 폴리머라아제를 사용하여 부가된다. 일부 예에서, 상기 방법은 폴리머라아제가 연장된 이중체의 3' 말단에 제2 뉴클레오타이드를 부가하는 것을 가역적으로 저해하는 작업을 추가로 포함할 수 있다. 일부 예에서, 차단 모이어티는 폴리머라아제가 연장된 이중체의 3' 말단에 제2 뉴클레오타이드를 부가하는 것을 가역적으로 저해한다. 일부 예에서, 제1 뉴클레오타이드는 차단 모이어티에 커플링된다. 일부 예에서, 차단 모이어티는 3'-차단기를 포함한다. 일부 예에서, 차단 모이어티는 연장된 이중체와 가역적으로 회합된다. 일부 예에서, 상기 방법은 차단 모이어티와 연장된 이중체의 회합을 검출하는 작업을 추가로 포함한다. 일부 예에서, 상기 방법은 연장된 이중체에서 차단 모이어티의 부재를 검출하는 작업을 추가로 포함한다. 일부 예에서, 상기 방법은 폴리머라아제가 연장된 이중체의 3' 말단에 제2 뉴클레오타이드를 부가할 수 있도록 차단 모이어티를 제거하는 작업을 추가로 포함한다.
일부 예에서, 작업 (d)에서 가해진 제1 힘은 연장된 이중체의 3' 말단과의 접촉에서 폴리머라아제를 제거한다. 일부 예에서, 상기 방법은 연장된 이중체의 3' 말단과의 접촉에서 폴리머라아제를 제거하기 위해 제2 힘을 가하는 작업으로서, 여기서 제2 힘이 제1 힘보다 큰 작업을 포함한다.
일부 예에서, 상기 방법은 이중체의 3' 말단과 접촉하고 있는 폴리머라아제를 나노공극의 제1 측의 개구부 내부 또는 근처에 배치하는 제3 힘을 가하는 작업 (f)를 포함한다. 상기 방법은, 제3 힘을 가하는 동안, 나노공극을 사용하여 폴리머라아제가 개구부 안으로 또는 개구부 더 안쪽으로 이동하는 것을 저해하고, 폴리머라아제의 전기적 특성 값을 측정하는 작업을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 작업 (f)에서 측정된 값을 사용하여 이중체의 3' 말단과 폴리머라아제의 접촉을 식별하는 작업 (g)를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 제3 힘은 제1 힘보다 작다. 일부 예에서, 작업 (f)는 작업 (c) 이후에, 작업 (d) 이전에 수행된다. 일부 예에서, 제1 뉴클레오타이드는 차단 모이어티와 회합된다. 일부 예에서, 작업 (g)는 작업 (f)에서 측정된 값을 사용하여 제1 뉴클레오타이드와 회합된 차단 모이어티의 존재를 확인하는 작업을 추가로 포함한다.
일부 예에서, 폴리머라아제는 DNA 폴리머라아제를 포함한다. 일부 예에서, 폴리머라아제는 RNA 폴리머라아제를 포함한다. 일부 예에서, 폴리머라아제는 역전사효소를 포함한다.
일부 예에서, 제1 뉴클레오타이드는 차단 모이어티와 회합되며, 작업 (e)는 작업 (d)에서 측정된 값을 사용하여 뉴클레오타이드와 회합된 차단 모이어티의 존재를 확인하는 작업을 추가로 포함한다. 일부 예에서, 상기 방법은 작업 (d) 후에 제1 뉴클레오타이드에서 차단 모이어티를 제거하는 작업을 포함한다. 일부 예에서, 상기 방법은, 차단 모이어티를 제거한 후, 연장된 이중체의 3' 말단을 개구부 내에 배치하고 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분을 개구부 내에 배치하는 제1 힘을 다시 가하는 작업 (f)를 포함한다. 상기 방법은, 제1 힘을 다시 가하는 동안, 나노공극을 사용하여 연장된 이중체의 3' 말단이 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해하고, 연장된 이중체의 3' 말단과 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 전기적 특성 값을 측정하는 작업을 포함할 수 있다. 상기 방법은 작업 (f)에서 측정된 값을 사용하여 제1 뉴클레오타이드를 다시 식별하는 작업 (g)를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 상기 방법은 작업 (d) 전에 제1 뉴클레오타이드에서 차단 모이어티를 제거하는 작업을 포함한다.
일부 예에서, 연장된 이중체는 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체를 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체는 천연 뉴클레오타이드에 비해 연장된 이중체의 안정성을 증강시킨다. 일부 예에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체는 하나 이상의 잠금 핵산(LNA)을 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체는 하나 이상의 2'-메톡시(2'-OMe) 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체는 하나 이상의 2'-플루오린화된(2'-F) 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체는 천연 뉴클레오타이드와 비교하여 전기적 특성 값을 변경시킨다. 일부 예에서, 제1 뉴클레오타이드는 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체 중 하나를 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체는 2' 변형을 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체는 염기 변형을 포함한다.
일부 예에서, 제1 힘은 연장된 이중체의 해리를 야기할 만큼 충분히 강하지 않다.
일부 예에서, 제1 힘은 제1 전압을 포함한다.
일부 예에서, 작업 (b)와 작업 (c)는 제1 힘의 부재 하에서 수행된다.
일부 예에서, 작업 (c)는 제1 힘에 반대되는 제4 힘의 존재 하에서 수행된다.
일부 예에서, 제1 잠금 구조는 나노공극의 제1 측에 있는 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단에 커플링된다. 제1 잠금 구조는 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단이 개구부를 통해 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해할 수 있다. 일부 예에서, 제1 잠금 구조는 제거 가능하다.
일부 예에서, 제2 잠금 구조는 나노공극의 제2 측에 있는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단에 커플링된다. 제2 잠금 구조는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단이 개구부를 통해 나노공극의 제1 측으로 전위되는 것을 저해할 수 있다. 일부 예에서, 제2 잠금 구조는 제거 가능하다.
일부 예에서, 상기 방법은, 작업 (d) 후에, 폴리뉴클레오타이드에서 연장된 이중체를 해리시키고, 나노공극의 제1 측에 폴리뉴클레오타이드로 새로운 3' 말단을 포함하는 새로운 이중체를 형성하는 작업을 추가로 포함한다.
일부 예에서, 작업 (a)는 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오타이드에 혼성화된 폴리뉴클레오타이드와 나노공극을 접촉시키고, 폴리뉴클레오타이드에서 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 탈혼성화시키는 제6 힘을 가하는 작업을 포함한다.
일부 예에서, 나노공극은 고체 상태 나노공극을 포함한다. 일부 예에서, 나노공극은 생물학적 나노공극을 포함한다. 일부 예에서, 생물학적 나노공극은 MspA를 포함한다.
일부 예에서, 폴리뉴클레오타이드는 RNA를 포함한다. 일부 예에서, 폴리뉴클레오타이드는 DNA를 포함한다.
일부 예에서, 연장된 이중체는 폴리뉴클레오타이드에 혼성화된 프라이머를 포함한다.
본원의 일부 예는 시퀀싱 시스템을 제공한다. 시퀀싱 시스템은 제1 측, 제2 측, 및 제1 측과 제2 측을 통해 연장되는 개구부를 포함하는 나노공극을 포함할 수 있다. 시퀀싱 시스템은 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단이 나노공극의 제1 측에 있고, 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단이 나노공극의 제2 측에 있도록 나노공극의 개구부를 통해 배치된 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 시퀀싱 시스템은 나노공극의 제1 측에 배치된 폴리뉴클레오타이드의 이중체로서, 제1 뉴클레오타이드가 배치되는 3' 말단을 포함하는 이중체를 포함할 수 있다.
시퀀싱 시스템은 이중체의 3' 말단을 개구부 내에 배치하는 제1 힘을 가하도록 구성된 회로를 포함할 수 있다. 회로는 또한 제1 힘을 가하는 동안 이중체의 3' 말단과 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 전기적 특성 값을 측정하도록 구성될 수 있다. 회로는 또한 측정값을 사용하여 제1 뉴클레오타이드를 식별하도록 구성될 수 있다. 나노공극은 제1 힘이 가해지는 동안 이중체의 3' 말단이 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해할 수 있다.
일부 예에서, 회로에 의해 측정된 값은 나노공극에 걸친 전류, 이온 전류, 전기 저항 또는 전압 강하를 포함한다. 일부 예에서, 회로에 의해 측정된 값은 나노공극에 걸친 전류, 이온 전류, 전기 저항 또는 전압 강하의 노이즈를 포함한다. 일부 예에서, 회로에 의해 측정된 값은 노이즈의 표준편차를 포함한다.
일부 예에서, 회로에 의해 측정된 값은 적어도 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 M개의 뉴클레오타이드와 이중체의 D개의 혼성화된 뉴클레오타이드 쌍을 기반으로 한다. M은 2 이상일 수 있고, D는 1 이상일 수 있다. 일부 예에서, M은 3 이상이다. 일부 예에서, D는 2 이상이다. 일부 예에서, 단일 가닥 부분의 M개의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 변형된 염기를 포함하며, 회로는 회로에 의해 측정된 값을 사용하여 변형된 염기를 식별하도록 구성되어 있다. 일부 예에서, 변형된 염기는 메틸화된 염기를 포함한다.
일부 예에서, 제1 힘이 가해지는 동안 이중체의 3' 말단에 또 다른 뉴클레오타이드가 부가되는 것이 저해된다. 일부 예에서, 나노공극은 또 다른 뉴클레오타이드의 부가를 저해한다.
일부 예에서, 나노공극은, 나노공극의 제1 측이 개구부의 대부분을 포함하도록 배향된다. 일부 예에서, 나노공극은, 나노공극의 제2 측이 개구부의 대부분을 포함하도록 배향된다.
일부 예에서, 회로는 이중체의 3' 말단을 개구부 내에 다시 배치하는 변형된 제1 힘을 가하도록 추가로 구성되어 있다. 회로는 변형된 제1 힘을 가하는 동안 이중체의 3' 말단과 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 전기적 특성 값을 측정하도록 추가로 구성될 수 있다. 회로는 측정값을 사용하여 제1 뉴클레오타이드를 식별하도록 추가로 구성될 수 있다. 나노공극은 변형된 제1 힘이 가해지는 동안 이중체의 3' 말단이 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해할 수 있다.
일부 예에서, 상기 시스템은 이중체의 3' 말단과 접촉하고 있으며 제1 뉴클레오타이드를 부가하도록 구성된 폴리머라아제를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 폴리머라아제는 이중체의 3' 말단에 제2 뉴클레오타이드를 부가하는 것이 가역적으로 저해된다. 일부 예에서, 상기 시스템은 폴리머라아제가 이중체의 3' 말단에 제2 뉴클레오타이드를 부가하는 것을 가역적으로 저해하는 차단 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 제1 뉴클레오타이드는 차단 모이어티에 커플링된다. 일부 예에서, 차단 모이어티는 3'-차단기를 포함한다. 일부 예에서, 차단 모이어티는 이중체와 가역적으로 회합된다. 일부 예에서, 회로는 이중체와 차단 모이어티의 회합을 검출하도록 추가로 구성되어 있다. 일부 예에서, 회로는 이중체에서 차단 모이어티의 부재를 검출하도록 추가로 구성되어 있다. 일부 예에서, 차단 모이어티는 폴리머라아제가 이중체의 3' 말단에 제2 뉴클레오타이드를 부가할 수 있도록 제거 가능하다.
일부 예에서, 제1 힘은 이중체의 3' 말단과의 접촉에서 폴리머라아제를 제거한다. 일부 예에서, 회로는 이중체의 3' 말단과의 접촉에서 폴리머라아제를 제거하기 위해 제2 힘을 가하도록 추가로 구성되어 있으며, 여기서 제2 힘은 제1 힘보다 크다. 일부 예에서, 회로는 이중체의 3' 말단과 접촉하고 있는 폴리머라아제를 나노공극의 제1 측의 개구부 내부 또는 근처에 배치하는 제3 힘을 가하도록 추가로 구성되어 있다. 회로는 제3 힘을 가하는 동안, 폴리머라아제의 전기적 특성 값을 측정하도록 구성될 수 있다. 회로는 측정값을 사용하여 이중체의 3' 말단과 폴리머라아제의 접촉을 식별하도록 구성될 수 있다. 나노공극은 폴리머라아제가 개구부 안으로 또는 더 안쪽으로 이동하는 것을 저해할 수 있다. 일부 예에서, 제3 힘은 제1 힘보다 작다. 일부 예에서, 회로는 제1 힘이 가해지기 전에 제3 힘을 가하도록 구성되어 있다. 일부 예에서, 제1 뉴클레오타이드는 차단 모이어티와 회합된다. 일부 예에서, 회로는 측정값을 사용하여 제1 뉴클레오타이드와 회합된 차단 모이어티의 존재를 확인하도록 구성되어 있다.
일부 예에서, 폴리머라아제는 DNA 폴리머라아제를 포함한다. 일부 예에서, 폴리머라아제는 RNA 폴리머라아제를 포함한다. 일부 예에서, 폴리머라아제는 역전사효소를 포함한다.
일부 예에서, 제1 뉴클레오타이드는 차단 모이어티와 회합되며, 회로는 측정값을 사용하여 뉴클레오타이드와 회합된 차단 모이어티의 존재를 확인하도록 추가로 구성되어 있다. 일부 예에서, 차단 모이어티는 제1 힘을 가한 후에 제1 뉴클레오타이드에서 제거된다. 일부 예에서, 회로는, 차단 모이어티가 제거된 후, 이중체의 3' 말단을 개구부 내에 배치하고 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분을 개구부 내에 배치하는 제1 힘을 다시 가하도록 구성되어 있다. 회로는, 제1 힘을 다시 가하는 동안, 이중체의 3' 말단과 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 전기적 특성 값을 측정하도록 추가로 구성될 수 있다. 회로는 측정값을 사용하여 제1 뉴클레오타이드를 다시 식별하도록 추가로 구성될 수 있다. 나노공극은 이중체의 3' 말단이 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해할 수 있다. 일부 예에서, 차단 모이어티는 제1 힘이 가해지기 전에 제1 뉴클레오타이드에서 제거된다.
일부 예에서, 이중체는 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체를 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체는 천연 뉴클레오타이드에 비해 이중체의 안정성을 증강시킨다. 일부 예에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체는 하나 이상의 잠금 핵산(LNA)을 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체는 하나 이상의 2'-메톡시(2'-OMe) 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체는 하나 이상의 2'-플루오린화된(2'-F) 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체는 천연 뉴클레오타이드와 비교하여 전기적 특성 값을 변경시킨다. 일부 예에서, 제1 뉴클레오타이드는 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체 중 하나를 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체는 2' 변형을 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체는 염기 변형을 포함한다.
일부 예에서, 제1 힘은 이중체의 해리를 야기할 만큼 충분히 강하지 않다. 일부 예에서, 제1 힘은 제1 전압을 포함한다. 일부 예에서, 폴리뉴클레오타이드는 개구부를 통해 배치되며, 이중체는 제1 힘의 부재 하에서 나노공극의 제1 측에 배치된다. 일부 예에서, 회로는 제1 힘에 반대되는 제4 힘을 가하도록 구성되어 있다.
일부 예에서, 제1 잠금 구조는 나노공극의 제1 측에 있는 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단에 커플링되며, 제1 잠금 구조는 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단이 개구부를 통해 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해한다. 일부 예에서, 제1 잠금 구조는 제거 가능하다.
일부 예에서, 제2 잠금 구조는 나노공극의 제2 측에 있는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단에 커플링되며, 제2 잠금 구조는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단이 개구부를 통해 나노공극의 제1 측으로 전위되는 것을 저해한다. 일부 예에서, 제2 잠금 구조는 제거 가능하다.
일부 예에서, 회로는, 제1 힘을 가한 후, 폴리뉴클레오타이드에서 이중체를 해리시키도록 구성되어 있다.
일부 예에서, 회로는 나노공극의 개구부를 통해 폴리뉴클레오타이드를 배치하기 위해 폴리뉴클레오타이드에서 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 탈혼성화시키는 제6 힘을 가하도록 구성되어 있다.
일부 예에서, 나노공극은 고체 상태 나노공극을 포함한다. 일부 예에서, 나노공극은 생물학적 나노공극을 포함한다. 일부 예에서, 생물학적 나노공극은 MspA를 포함한다.
일부 예에서, 폴리뉴클레오타이드는 RNA를 포함한다. 일부 예에서, 폴리뉴클레오타이드는 DNA를 포함한다.
일부 예에서, 이중체는 폴리뉴클레오타이드에 혼성화된 프라이머를 포함한다.
본원의 일부 예는 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 나노공극의 개구부 내의 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분과 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드의 이중체의 3' 말단의 전기적 특성의 복수의 측정값을 뉴클레오타이드 식별 모듈에 입력으로 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 뉴클레오타이드 식별 모듈을 사용하여 복수의 측정값을 데이터 구조(data structure) 내 값과 비교하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 데이터 구조는 상이한 측정값을, 나노공극의 개구부 내의 알려진 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분 내 뉴클레오타이드와 알려진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 알려진 이중체의 3' 말단 내 뉴클레오타이드의 상이한 조합과 상관시킨다. 상기 방법은 비교를 사용하여 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드 서열에서 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위해 뉴클레오타이드 식별 모듈을 사용하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 결정된 뉴클레오타이드 서열의 표현을 뉴클레오타이드 식별 모듈로부터의 출력으로 수신하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 뉴클레오타이드 식별 모듈은 훈련된 기계 학습 알고리즘을 포함한다. 일부 예에서, 뉴클레오타이드 식별 모듈은 훈련된 딥러닝(deep learning) 알고리즘을 포함한다. 일부 예에서, 데이터 구조는 훈련된 기계 학습 알고리즘의 뉴런(neuron)을 포함한다.
일부 예에서, 데이터 구조는 판독 맵(read map)을 포함한다. 일부 예에서, 판독 맵은 알려진 이중체의 3' 말단 내 뉴클레오타이드와 알려진 뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분 내 뉴클레오타이드의 상이한 조합의 상이한 측정값과 표현을 저장하는 룩업 테이블(look-up table)을 포함한다.
일부 예에서, 상기 방법은 나노공극의 개구부를 사용하여 복수의 측정값을 생성하기 위해 컴퓨터를 통해 측정 모듈을 사용하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 예에서, 상기 방법은 나노공극의 개구부를 사용하여 데이터 구조를 생성하기 위해 컴퓨터를 통해 뉴클레오타이드 부가 모듈, 측정 모듈 및 뉴클레오타이드 식별 모듈을 사용하는 단계를 추가로 포함한다.
본원의 일부 예는 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 시스템을 제공한다. 상기 시스템은 프로세서와, 적어도 하나의 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함할 수 있다. 컴퓨터 판독 가능한 매체는 나노공극의 개구부 내의 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분과 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 이중체의 3' 말단의 전기적 특성의 복수의 측정값을 저장할 수 있다. 컴퓨터 판독 가능한 매체는 상이한 측정값을, 나노공극의 개구부 내의 알려진 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분 내 뉴클레오타이드와 알려진 이중체의 3' 말단 내 뉴클레오타이드의 상이한 조합과 상관시키는 데이터 구조를 저장할 수 있다. 컴퓨터 판독 가능한 매체는 프로세서가 작업을 실행하도록 하는 명령을 저장할 수 있다. 작업은 복수의 측정값을 데이터 구조 내 값과 비교하는 것을 포함할 수 있다. 작업은 비교를 사용하여 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드 서열에서 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 작업은 결정된 뉴클레오타이드 서열의 표현을 출력하는 것을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 뉴클레오타이드 식별 모듈은 훈련된 기계 학습 알고리즘을 포함한다. 일부 예에서, 뉴클레오타이드 식별 모듈은 훈련된 딥러닝 알고리즘을 포함한다. 일부 예에서, 데이터 구조는 훈련된 기계 학습 알고리즘의 뉴런을 포함한다.
일부 예에서, 데이터 구조는 판독 맵을 포함한다. 일부 예에서, 판독 맵은 알려진 이중체의 3' 말단 내 뉴클레오타이드와 알려진 뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분 내 뉴클레오타이드의 상이한 조합의 상이한 측정값과 표현을 저장하는 룩업 테이블을 포함한다.
일부 예에서, 명령은 추가로, 프로세서가 나노공극의 개구부를 사용하여 복수의 측정값을 생성하도록 하기 위한 것이다.
일부 예에서, 명령은 추가로, 프로세서가 나노공극의 개구부를 사용하여 데이터 구조를 생성하도록 하기 위한 것이다.
본원의 일부 예는 제1 측, 제2 측, 및 제1 측과 제2 측을 통해 연장되는 개구부를 포함하는 나노공극에 폴리뉴클레오타이드를 잠그는 방법을 제공한다. 상기 방법은 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단에 제1 잠금기를 커플링시키는 작업 (a)를 포함할 수 있다. 상기 방법은 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단과 제1 잠금기가 나노공극의 제1 측에 있고, 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단이 나노공극의 제2 측에 있도록 나노공극의 개구부를 통해 폴리뉴클레오타이드를 배치하는 작업 (b)를 포함할 수 있다. 상기 방법은 나노공극의 제2 측에 있는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단에 제2 잠금기를 커플링시키는 작업 (c)를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 제1 잠금기는 잠금 핵산(LNA) 또는 펩타이드 핵산(PNA)을 포함한다.
일부 예에서, 제2 잠금기는 잠금 핵산(LNA) 또는 펩타이드 핵산(PNA)을 포함한다.
일부 예에서, 폴리뉴클레오타이드는 작업 (a) 전에 상보적 폴리뉴클레오타이드에 혼성화되며, 상기 방법은 작업 (b)와 작업 (c) 사이에 상보적 폴리뉴클레오타이드를 탈혼성화시키는 작업을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 개시내용의 각각의 양태의 임의의 각각의 특성/예는 임의의 적절한 조합으로 함께 구현될 수 있으며, 이러한 양태 중 임의의 하나 이상으로부터의 임의의 특성/예는 본원에 기재된 바와 같은 이점을 달성하기 위해 임의의 적절한 조합으로 본원에 기재된 바와 같은 다른 양태(들)의 임의의 특성과 함께 구현될 수 있음을 이해해야 한다.
도 1a 내지 도 1h는, 나노공극을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하기 위한 예시적인 시퀀싱 시스템의 사용과, 예시적인 조성물 및 작업을 개략적으로 예시한 것이다.
도 2a 내지 도 2e는, 나노공극을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하기 위한 예시적인 시퀀싱 시스템의 사용과, 추가의 예시적인 조성물 및 작업을 개략적으로 예시한 것이다.
도 3은, 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 예시적인 방법에서의 작업 흐름을 예시한 것이다.
도 4a 내지 도 4c(서열번호 3, 서열번호 4)는, 동일한 폴리뉴클레오타이드를 재시퀀싱하기 위한 도 1a 내지 도 1h의 시퀀싱 시스템의 사용을 개략적으로 예시한 것이다.
도 5a와 도 5b(서열번호 3, 서열번호 4)는, 상이한 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하기 위해 나노공극을 제조하기 위한 도 1a 내지 도 1h의 시퀀싱 시스템의 사용을 개략적으로 예시한 것이다.
도 6(서열번호 5, 서열번호 6)은, 시퀀싱 또는 폴리뉴클레오타이드 합성을 위해 폴리뉴클레오타이드를 생성하고 사용하기 위한 도 1a 내지 도 1h의 시퀀싱 시스템의 사용을 개략적으로 예시한 것이다.
도 7은, 도 1a 내지 도 1h의 시퀀싱 시스템의 대안적인 구성을 개략적으로 예시한 것이다.
도 8a 내지 도 8e는, 도 1a 내지 도 1h의 시스템을 사용하여 측정될 수 있는 예시적인 전기적 특성 값을 예시한 것이다.
도 9는, 도 1a 내지 도 1h의 시스템을 사용하여 뉴클레오타이드를 식별하는 데 사용될 수 있는 전기적 특성의 예시적인 N차원 판독 맵을 예시한 것이다.
도 10은, 도 1a 내지 도 1h의 시스템에서 사용될 수 있는 예시적인 회로를 개략적으로 예시한 것이다.
도 11은, 예시적인 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 동안 측정된 값의 플롯을 시간의 함수로 예시한 것이다.
도 12는, 특정 측정 조건 세트 하에서 예시적인 폴리뉴클레오타이드를 재시퀀싱하는 동안 측정된 값의 플롯을 예시한 것이다.
도 13a 내지 도 13c는, 상이한 측정 조건 세트 하에서 예시적인 폴리뉴클레오타이드를 재시퀀싱하는 동안 측정된 값의 플롯을 예시한 것이다.
도 14는, 상이한 측정 조건 세트 하에서 예시적인 폴리뉴클레오타이드를 재시퀀싱하는 동안 측정된 값의 플롯을 예시한 것으로, 여기서 시퀀싱 시스템은 도 7을 참조로 기재된 대안적인 구성을 갖는다.
도 15a와 도 15b(서열번호 2)는, 변형된 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 동안 측정된 값의 플롯을 예시한 것이다.
도 2a 내지 도 2e는, 나노공극을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하기 위한 예시적인 시퀀싱 시스템의 사용과, 추가의 예시적인 조성물 및 작업을 개략적으로 예시한 것이다.
도 3은, 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 예시적인 방법에서의 작업 흐름을 예시한 것이다.
도 4a 내지 도 4c(서열번호 3, 서열번호 4)는, 동일한 폴리뉴클레오타이드를 재시퀀싱하기 위한 도 1a 내지 도 1h의 시퀀싱 시스템의 사용을 개략적으로 예시한 것이다.
도 5a와 도 5b(서열번호 3, 서열번호 4)는, 상이한 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하기 위해 나노공극을 제조하기 위한 도 1a 내지 도 1h의 시퀀싱 시스템의 사용을 개략적으로 예시한 것이다.
도 6(서열번호 5, 서열번호 6)은, 시퀀싱 또는 폴리뉴클레오타이드 합성을 위해 폴리뉴클레오타이드를 생성하고 사용하기 위한 도 1a 내지 도 1h의 시퀀싱 시스템의 사용을 개략적으로 예시한 것이다.
도 7은, 도 1a 내지 도 1h의 시퀀싱 시스템의 대안적인 구성을 개략적으로 예시한 것이다.
도 8a 내지 도 8e는, 도 1a 내지 도 1h의 시스템을 사용하여 측정될 수 있는 예시적인 전기적 특성 값을 예시한 것이다.
도 9는, 도 1a 내지 도 1h의 시스템을 사용하여 뉴클레오타이드를 식별하는 데 사용될 수 있는 전기적 특성의 예시적인 N차원 판독 맵을 예시한 것이다.
도 10은, 도 1a 내지 도 1h의 시스템에서 사용될 수 있는 예시적인 회로를 개략적으로 예시한 것이다.
도 11은, 예시적인 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 동안 측정된 값의 플롯을 시간의 함수로 예시한 것이다.
도 12는, 특정 측정 조건 세트 하에서 예시적인 폴리뉴클레오타이드를 재시퀀싱하는 동안 측정된 값의 플롯을 예시한 것이다.
도 13a 내지 도 13c는, 상이한 측정 조건 세트 하에서 예시적인 폴리뉴클레오타이드를 재시퀀싱하는 동안 측정된 값의 플롯을 예시한 것이다.
도 14는, 상이한 측정 조건 세트 하에서 예시적인 폴리뉴클레오타이드를 재시퀀싱하는 동안 측정된 값의 플롯을 예시한 것으로, 여기서 시퀀싱 시스템은 도 7을 참조로 기재된 대안적인 구성을 갖는다.
도 15a와 도 15b(서열번호 2)는, 변형된 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 동안 측정된 값의 플롯을 예시한 것이다.
나노공극을 사용한 폴리뉴클레오타이드 시퀀싱이 본원에 제공된다.
보다 구체적으로, 하기에 보다 상세하게 기재되는 바와 같은 방식으로, 시퀀싱하고자 하는 단일 가닥 표적 폴리뉴클레오타이드는 나노공극의 개구부를 통해 배치된다. 나노공극의 제1 측에 표적 폴리뉴클레오타이드의 일부로 이중체가 형성된다. 이어서, 이중체를 나노공극의 개구부 내에 배치하는 힘이 가해지고, 전기적 측정이 이루어진다. 해당 측정의 특정 값은 나노공극의 개구부 내 이중체의 3' 말단에 위치한 특정 상보적 염기와 표적 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분에 있는 특정 염기 서열을 기반으로 한다. 따라서, 특정 측정값은 표적 폴리뉴클레오타이드에서 염기 서열을 결정할 수 있는 정보를 제공한다. 이어서, 이중체가 뉴클레오타이드에 의해 연장될 수 있도록 나노공극의 개구부 내에서 이중체를 제거하는 힘이 가해지고, 측정이 반복된다. 반복된 측정값은 표적 폴리뉴클레오타이드에서 염기 서열을 결정할 수 있는 추가 정보를 제공한다.
본 발명의 주제는 달리 비용, 중량 및 복잡성을 부가할 수 있는 광학적 구성요소를 필요로 하지 않고 상대적으로 적은 시약을 사용하여 폴리뉴클레오타이드(예컨대, DNA 또는 RNA)를 시퀀싱하는 데 사용될 수 있다고 이해될 것이다. 본 발명의 주제는 변형된 염기를 화학적으로 또는 효소적으로 변형시킬 필요 없이 메틸화된 염기와 같은 변형된 염기를 식별하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 주제는 상대적으로 긴 판독물, 예를 들어 최대 약 1,000개 염기, 또는 최대 약 2,000개 염기, 또는 최대 약 5,000개 염기, 또는 심지어 최대 10,000개 염기 또는 그 이상의 판독물에 사용 가능하다. 본 발명의 주제는 반복되는 뉴클레오타이드를 함유하는 시퀀싱 영역의 정확도를 개선시키기 위해 전통적으로 가닥 기반 나노공극 시퀀싱과 관련이 있는 동종중합체 문제를 극복한다. 본 발명의 주제는 나노공극을 통해 폴리뉴클레오타이드의 제어 가능한 전위를 제공하기 때문에, 너무 빨라서 검출될 수 없으며, 결실 오류 또는 정확도에 유해한 영향을 미치는 다른 유형의 오류로 이어질 수 있는 전위 사건을 저해하거나 방지한다. 이러한 및 다른 문제는 본 개시내용을 통해 이해되는 바와 같이 본 발명의 시스템, 조성물 및 방법에 의해 해결된다.
먼저, 본원에 사용된 일부 용어가 간략하게 설명될 것이다. 이어서, 나노공극을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하기 위한 일부 예시적인 시스템, 조성물 및 방법이 기재될 것이다.
용어
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. "포함하는"이라는 용어뿐 아니라, "포함한다", "포함된다" 및 "포함된"과 같은 다른 형태의 사용은, 제한적이지 않다. "갖는"이라는 용어뿐 아니라, "갖는다", "가지다" 및 "가졌다"와 같은 다른 형태의 사용은, 제한적이지 않다. 본 명세서에 사용된 바, 전환구에서든 청구범위의 본문에서든, "포함하다"와 "포함하는"이라는 용어는, 개방적인 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 상기 용어는 "적어도 ~를 갖는" 또는 "적어도 ~를 포함하는"과 같은 어구와 동의어로 해석되어야 한다. 예를 들어, 프로세스의 맥락에서 사용될 때, "포함하는"이라는 용어는, 프로세스가 적어도 언급된 단계를 포함하지만, 추가의 단계를 포함할 수도 있음을 의미한다. 화합물, 조성물 또는 시스템의 맥락에서 사용될 때, "포함하는"이라는 용어는, 화합물, 조성물 또는 시스템이 적어도 언급된 특징 또는 구성요소를 포함하지만, 추가의 특징 또는 구성요소를 포함할 수도 있음을 의미한다.
본원에 사용된 단수 형태의 표현은, 달리 명백하게 지시되지 않는 한, 복수의 언급대상을 포함한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 "실질적으로", "대략" 및 "약"이라는 용어는, 처리과정에서의 변화로 인한 것과 같은 작은 변동을 기재하고 설명하는 데 사용된다. 예를 들어, 이는 ±10% 이하, 예컨대 ±5% 이하, 예컨대 ±2% 이하, 예컨대 ±1% 이하, 예컨대 ±0.5% 이하, 예컨대 ±0.2% 이하, 예컨대 ±0.1% 이하, 예컨대 ±0.05% 이하를 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 "뉴클레오타이드"라는 용어는, 당과 적어도 하나의 포스페이트기를 포함하는 분자를 의미하는 것으로 의도되며, 일부 예는 또한 핵염기를 포함한다. 핵염기가 결여된 뉴클레오타이드는 "무염기성"으로 지칭될 수 있다. 뉴클레오타이드에는, 데옥시리보뉴클레오타이드, 변형된 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 리보뉴클레오타이드, 펩타이드 뉴클레오타이드, 변형된 펩타이드 뉴클레오타이드, 변형된 포스페이트 당 백본 뉴클레오타이드, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 뉴클레오타이드의 예에는, 아데노신 모노포스페이트(AMP), 아데노신 디포스페이트(ADP), 아데노신 트리포스페이트(ATP), 티미딘 모노포스페이트(TMP), 티미딘 디포스페이트(TDP), 티미딘 트리포스페이트(TTP), 시티딘 모노포스페이트(CMP), 시티딘 디포스페이트(CDP), 시티딘 트리포스페이트(CTP), 구아노신 모노포스페이트(GMP), 구아노신 디포스페이트(GDP), 구아노신 트리포스페이트(GTP), 우리딘 모노포스페이트(UMP), 우리딘 디포스페이트(UDP), 우리딘 트리포스페이트(UTP), 데옥시아데노신 모노포스페이트(dAMP), 데옥시아데노신 디포스페이트(dADP), 데옥시아데노신 트리포스페이트(dATP), 데옥시티미딘 모노포스페이트(dTMP), 데옥시티미딘 디포스페이트(dTDP), 데옥시티미딘 트리포스페이트(dTTP), 데옥시시티딘 디포스페이트(dCDP), 데옥시시티딘 트리포스페이트(dCTP), 데옥시구아노신 모노포스페이트(dGMP), 데옥시구아노신 디포스페이트(dGDP), 데옥시구아노신 트리포스페이트(dGTP), 데옥시우리딘 모노포스페이트(dUMP), 데옥시우리딘 디포스페이트(dUDP) 및 데옥시우리딘 트리포스페이트(dUTP)가 포함된다.
본원에 사용된 "뉴클레오타이드"라는 용어는 또한, 자연 발생 뉴클레오타이드와 비교하여 변형된 핵염기, 당, 백본 및/또는 포스페이트 모이어티를 포함하는 뉴클레오타이드의 유형인 임의의 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 것으로 의도된다. 뉴클레오타이드 유사체는 "변형된 핵산"으로도 지칭될 수 있다. 예시적인 변형된 핵염기에는, 이노신, 잔타닌, 하이포잔타닌, 이소시토신, 이소구아닌, 2-아미노퓨린, 5-메틸시토신, 5-히드록시메틸시토신, 2-아미노아데닌, 6-메틸아데닌, 6-메틸 구아닌, 2-프로필구아닌, 2-프로필아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 2-티오시토신, 15-할로우라실, 15-할로시토신, 5-프로피닐우라실, 5-프로피닐시토신, 6-아조우라실, 6-아조시토신, 6-아조티민, 5-우라실, 4-티오우라실, 8-할로 아데닌 또는 구아닌, 8-아미노 아데닌 또는 구아닌, 8-티올 아데닌 또는 구아닌, 8-티오알킬 아데닌 또는 구아닌, 8-히드록실 아데닌 또는 구아닌, 5-할로 치환된 우라실 또는 시토신, 7-메틸구아닌, 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌, 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 3-데아자아데닌 등이 포함된다. 당업계에 알려진 바와 같이, 특정 뉴클레오타이드 유사체, 예를 들어 아데노신 5'-포스포설페이트와 같은 뉴클레오타이드 유사체는 폴리뉴클레오타이드에 혼입될 수 없다. 뉴클레오타이드는 임의의 적합한 수의 포스페이트, 예를 들어 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상의 포스페이트를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 유사체에는 또한, 잠금 핵산(LNA), 펩타이드 핵산(PNA) 및 5-히드록실부티닐-2'-데옥시우리딘("super T")이 포함된다.
본원에 사용된 "폴리뉴클레오타이드"라는 용어는, 서로 결합된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분자를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드는 중합체의 비제한적인 일례이다. 폴리뉴클레오타이드의 예에는, 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 및 이의 유사체, 예컨대 잠금 핵산(LNA)과 펩타이드 핵산(PNA)이 포함된다. 폴리뉴클레오타이드는 RNA 또는 단일 가닥 DNA와 같은 뉴클레오타이드의 단일 가닥 서열, 또는 이중 가닥 DNA와 같은 뉴클레오타이드의 이중 가닥 서열일 수 있거나, 뉴클레오타이드의 단일 가닥 서열과 이중 가닥 서열의 혼합물을 포함할 수 있다. 이중 가닥 DNA(dsDNA)에는, 게놈 DNA와, PCR 및 증폭 산물이 포함된다. 단일 가닥 DNA(ssDNA)는 dsDNA로 전환될 수 있으며, 그 반대로 마찬가지이다. 폴리뉴클레오타이드는 거울상이성질체 DNA, LNA 또는 PNA와 같은 비자연 발생 DNA를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 내 뉴클레오타이드의 정확한 서열은 알려져 있거나 알려져 있지 않을 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오타이드의 예이다: 유전자 또는 유전자 단편(예를 들어, 프로브, 프라이머, 발현된 서열 태그(EST) 또는 유전자 발현 연속 분석(SAGE) 태그), 게놈 DNA, 게놈 DNA 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 합성 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 프라이머, 또는 전술한 것들 중 임의의 것의 증폭된 카피.
본원에 사용된 "폴리머라아제"는, 뉴클레오타이드를 폴리뉴클레오타이드로 중합하는 방식으로 폴리뉴클레오타이드를 조립하는 활성 부위를 갖는 효소를 의미하는 것으로 의도된다. 폴리머라아제는 프라이머와 단일 가닥 표적 폴리뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 성장하는 프라이머에 뉴클레오타이드를 순차적으로 부가하여 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 갖는 "상보적 카피" 폴리뉴클레오타이드를 형성할 수 있다. DNA 폴리머라아제는 표적 폴리뉴클레오타이드에 결합한 다음, 표적 폴리뉴클레오타이드 아래로 이동하여 성장하는 폴리뉴클레오타이드 가닥의 3' 말단에 있는 유리 히드록실기에 뉴클레오타이드를 순차적으로 부가할 수 있다. DNA 폴리머라아제는 DNA 주형에서 상보적인 DNA 분자를 합성할 수 있다. RNA 폴리머라아제는 DNA 주형에서 RNA 분자를 합성할 수 있다(전사). 역전사효소와 같은 다른 RNA 폴리머라아제는 RNA 주형에서 cDNA 분자를 합성할 수 있다. RdRP와 같은 또 다른 RNA 폴리머라아제는 RNA 주형에서 RNA 분자를 합성할 수 있다. 폴리머라아제는 짧은 RNA 또는 DNA 가닥(프라이머)을 사용하여 가닥 성장을 시작할 수 있다. 일부 폴리머라아제는 이들이 사슬에 염기를 부가하는 부위의 업스트림에 있는 가닥을 대체할 수 있다. 이러한 폴리머라아제는 가닥 치환을 하는 것으로 불릴 수 있으며, 이는, 폴리머라아제에 의해 판독되는 주형 가닥에서 상보적인 가닥을 제거하는 활성을 갖는다는 것을 의미한다.
예시적인 DNA 폴리머라아제에는, Bst DNA 폴리머라아제, 9° Nm DNA 폴리머라아제, Phi29 DNA 폴리머라아제, DNA 폴리머라아제 I(대장균), DNA 폴리머라아제 I(대형), (Klenow) 단편, Klenow 단편(3'-5' 엑소-), T4 DNA 폴리머라아제, T7 DNA 폴리머라아제, Deep VentR™(엑소-) DNA 폴리머라아제, Deep VentR™ DNA 폴리머라아제, DyNAzyme™ EXT DNA, DyNAzyme™ II Hot Start DNA 폴리머라아제, Phusion™ High-Fidelity DNA 폴리머라아제, Therminator™ DNA 폴리머라아제, Therminator™ II DNA 폴리머라아제, VentR®DNA 폴리머라아제, VentR®(엑소-) DNA 폴리머라아제, RepliPHI™ Phi29 DNA 폴리머라아제, rBst DNA 폴리머라아제, rBst DNA 폴리머라아제(대형), 단편(IsoTherm™ DNA 폴리머라아제), MasterAmp™ AmpliTherm™ DNA 폴리머라아제, Taq DNA 폴리머라아제, Tth DNA 폴리머라아제, Tfl DNA 폴리머라아제, Tgo DNA 폴리머라아제, SP6 DNA 폴리머라아제, Tbr DNA 폴리머라아제, DNA 폴리머라아제 베타, ThermoPhi DNA 폴리머라아제 및 Isopol™ SD+ 폴리머라아제가 포함된다. 특정하고 비제한적인 예에서, 폴리머라아제는 Bst, Bsu 및 Phi29로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 폴리머라아제는 뒤에 있는 가닥을 분해하는 활성(3' 엑소뉴클레아제 활성)이 있다. 일부 유용한 폴리머라아제는 3' 및/또는 5' 엑소뉴클레아제 활성을 감소시키거나 제거하기 위해 돌연변이 또는 다른 방식으로 변형되었다.
예시적인 RNA 폴리머라아제는 소정의 RNA 주형에 상보적인 RNA 가닥의 합성을 촉진시키는 RdRp(RNA 의존성, RNA 폴리머라아제)를 포함한다. 예시적인 RdRp에는, 폴리오바이러스 3Dpol, 수포성 구내염 바이러스 L 및 C형 간염 바이러스 NS5B 단백질이 포함된다. 예시적인 RNA 역전사효소. 비제한적인 예시 목록에는, 조류 골수종 바이러스(AMV), 쥣과 몰로니 백혈병 바이러스(MMLV) 및/또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에서 유도된 역전사효소, 텔로머라아제 역전사효소, 예컨대 (hTERT), SuperScript™ III, SuperScript™ IV 역전사효소, ProtoScript® II 역전사효소가 포함된다.
본원에 사용된 "프라이머"라는 용어는, 유리 3' OH 기를 통해 뉴클레오타이드가 부가될 수 있는 폴리뉴클레오타이드로 정의된다. 프라이머는 차단기가 제거될 때까지 중합을 저해하는 3' 차단기를 포함할 수 있다. 프라이머는 커플링 반응을 가능하게 하거나 또 다른 모이어티에 프라이머를 커플링시키기 위해 5' 말단에 변형을 포함할 수 있다. 프라이머는 UV광, 화학물질, 효소 등과 같은 적합한 조건 하에서 절단될 수 있는 8-옥소-G와 같은 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다. 프라이머 길이는 임의의 적합한 수의 염기 길이일 수 있으며, 천연 뉴클레오타이드와 비천연 뉴클레오타이드의 임의의 적합한 조합을 포함할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오타이드는 프라이머에 혼성화되는(이에 상보적인 서열을 갖는) "증폭 어댑터" 또는 보다 간단하게 "어댑터"를 포함할 수 있으며, 프라이머의 유리 3' OH 기에 뉴클레오타이드를 부가하는 방식으로 상보적 카피 폴리뉴클레오타이드를 생성하도록 증폭될 수 있다.
본원에 사용된 "복수"라는 용어는, 둘 이상의 상이한 구성원의 집단을 의미하는 것으로 의도된다. 복수의 크기는 소형, 중형, 대형에서 초대형까지 다양할 수 있다. 소형 복수의 크기는, 예를 들어 수 개의 구성원에서 수십 개의 구성원 범위일 수 있다. 중형 크기의 복수는, 예를 들어 수십 개의 구성원에서 약 100개의 구성원 또는 수백 개의 구성원 범위일 수 있다. 대형 복수는, 예를 들어 약 수백 개의 구성원에서 약 1000개의 구성원, 수천 개의 구성원 및 최대 수만 개의 구성원 범위일 수 있다. 초대형 복수는, 예를 들어 수만 개의 구성원에서 약 수십만, 백만, 수백만, 수천만 및 최대 수억 개 이상의 구성원 범위일 수 있다. 따라서, 복수는 2개에서 1억개가 훨씬 넘는 구성원의 크기뿐 아니라, 구성원의 수로 측정 시, 상기 예시된 범위 사이와 상기 예시된 범위를 초과하는 모든 크기 범위일 수 있다. 예시적인 폴리뉴클레오타이드 복수에는, 예를 들어 약 1×105개 이상, 5×105개 이상 또는 1×106개 이상의 상이한 폴리뉴클레오타이드 집단이 포함된다. 따라서, 상기 용어의 정의는 2 초과의 모든 정수를 포함하는 것으로 의도된다. 복수의 상한은, 예를 들어 샘플 내 폴리뉴클레오타이드 서열의 이론적 다양성에 따라 설정될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드와 관련하여 사용될 때, 본원에 사용된 "이중 가닥"이라는 용어는, 폴리뉴클레오타이드 내 뉴클레오타이드의 전부 또는 실질적으로 전부가 상보적 폴리뉴클레오타이드 내 각각의 뉴클레오타이드에 수소 결합되어 있음을 의미하는 것으로 의도된다. 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드는 "이중체"로도 지칭될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드와 관련하여 사용될 때, 본원에 사용된 "단일 가닥"라는 용어는, 본질적으로 폴리뉴클레오타이드 내 뉴클레오타이드 중 어느 것도 상보적 폴리뉴클레오타이드 내 각각의 뉴클레오타이드에 수소 결합되어 있지 않음을 의미한다.
본원에 사용된 "표적 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는, 분석 또는 작용의 대상인 폴리뉴클레오타이드를 의미하는 것으로 의도되며, "라이브러리 폴리뉴클레오타이드", "주형 폴리뉴클레오타이드" 또는 "라이브러리 주형"과 같은 용어를 사용하여 지칭될 수도 있다. 분석 또는 작용에는, 폴리뉴클레오타이드를 증폭, 시퀀싱 및/또는 다른 절차에 적용하는 것이 포함된다. 표적 폴리뉴클레오타이드는 분석되는 표적 서열에 추가로 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오타이드는 분석하고자 하는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열을 플랭킹하는, 프라이머 결합 부위로 기능하는 증폭 어댑터를 포함하는 하나 이상의 어댑터를 포함할 수 있다. 특정예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 서로 상이한 서열을 가질 수 있지만, 서로 동일한 제1 어댑터와 제2 어댑터를 가질 수 있다. 특정 표적 폴리뉴클레오타이드 서열을 플랭킹할 수 있는 2개의 어댑터는 서로 동일한 서열 또는 서로 상보적인 서열을 가질 수 있거나, 2개의 어댑터는 상이한 서열을 가질 수 있다. 따라서, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드에서 종(species)은, 예를 들어 시퀀싱(예를 들어, SBS)에 의해 평가하고자 하는 알려지지 않은 서열의 영역을 플랭킹하는 알려진 서열의 영역을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 단일 말단에 증폭 어댑터를 가지며, 이러한 어댑터는 표적 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단 또는 5' 말단 중 어느 하나에 위치할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오타이드는 어떠한 어댑터도 없이 사용될 수 있으며, 이러한 경우, 프라이머 결합 서열은 표적 폴리뉴클레오타이드에서 발견되는 서열에서 직접 유래할 수 있다.
"폴리뉴클레오타이드"와 "올리고뉴클레오타이드"라는 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 상이한 용어는, 달리 구체적으로 지시되지 않는 한, 크기, 서열 또는 다른 특성에 있어서 임의의 특정한 차이를 나타내기 위한 것으로 의도되지 않는다. 기재의 명확성을 위해, 상기 용어는, 몇몇 폴리뉴클레오타이드 종을 포함하는 특정 방법 또는 조성물을 설명할 때, 하나의 종의 폴리뉴클레오타이드를 또 다른 종의 폴리뉴클레오타이드와 구별하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "기재(substrate)"라는 용어는, 본원에 기재된 조성물에 대한 지지체로서 사용되는 재료를 나타낸다. 예시적인 기재 재료는, 유리, 실리카, 플라스틱, 석영, 금속, 금속 산화물, 유기 규산염(예를 들어, 다면체형 유기 실세스퀴옥산(POSS)), 폴리아크릴레이트, 탄탈륨 산화물, 상보성 금속 산화물 반도체(CMOS), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. POSS의 예는, 문헌[Kehagias et al., Microelectronic Engineering 86 (2009), pp. 776-778]에 기재된 것일 수 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 일부 예에서, 본 출원에 사용되는 기재에는 유리, 용융 실리카 또는 다른 실리카 함유 재료와 같은 실리카 기반 기재가 포함된다. 일부 예에서, 실리카 기반 기재는 규소, 이산화규소, 질화규소 또는 수소화규소를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 본 출원에 사용되는 기재에는 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 폴리(비닐 클로라이드), 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및 폴리(메틸 메타크릴레이트)와 같은 플라스틱 재료 또는 구성요소가 포함된다. 예시적인 플라스틱 재료에는, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리스티렌 및 시클릭 올레핀 중합체 기재가 포함된다. 일부 예에서, 기재는 실리카 기반 재료 또는 플라스틱 재료, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 특정예에서, 기재는 유리 또는 규소 기반 중합체를 포함하는 적어도 하나의 표면을 갖는다. 일부 예에서, 기재는 금속을 포함할 수 있다. 일부 이러한 예에서, 금속은 금이다. 일부 예에서, 기재는 금속 산화물을 포함하는 적어도 하나의 표면을 갖는다. 하나의 예에서, 표면은 탄탈륨 산화물 또는 주석 산화물을 포함한다. 아크릴아미드, 에논 또는 아크릴레이트가 또한 기재 재료 또는 구성요소로 이용될 수 있다. 다른 기재 재료는, 비제한적으로, 갈륨 비소, 인듐 인화물, 알루미늄, 세라믹, 폴리이미드, 석영, 수지, 중합체 및 공중합체가 포함된다. 일부 예에서, 기재 및/또는 기재 표면은 석영이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 다른 예에서, 기재 및/또는 기재 표면은 GaAs 또는 ITO와 같은 반도체이거나 이를 포함할 수 있다. 전술한 목록은 본 출원을 제한하는 것이 아니라 예시하는 것으로 의도된다. 기재는 단일 재료 또는 복수의 상이한 재료를 포함할 수 있다. 기재는 복합체 또는 적층체일 수 있다. 일부 예에서, 기재에는 유기 규산염 재료가 포함된다.
기재는 편평형, 원형, 구형, 막대형 또는 임의의 적합한 형상일 수 있다. 기재는 강성이거나 가요성일 수 있다. 일부 예에서, 기재는 비드 또는 플로우 셀(flow cell)이다.
기재는 기재의 하나 이상의 표면 상에 패턴화되어 있지 않거나, 텍스쳐화되어 있거나 또는 패턴화되어 있을 수 있다. 일부 예에서, 기재는 패턴화되어 있다. 이러한 패턴은 포스트(post), 패드(pad), 웰(well), 리지(ridge), 채널 또는 다른 3차원 오목 또는 볼록 구조를 포함할 수 있다.
패턴은 기재의 표면에 걸쳐 규칙적이거나 불규칙적일 수 있다. 패턴은, 예를 들어 나노임프린트 리소그래피를 통해, 또는 예를 들어 비금속 표면 상에 특징을 형성하는 금속 패드를 사용하는 방식으로 형성될 수 있다.
일부 예에서, 본원에 기재된 기재는 플로우 셀의 적어도 일부를 형성하거나, 또는 플로우 셀 내에 위치하거나 이에 커플링된다. 플로우 셀은 복수의 레인 또는 복수의 섹터로 나누어진 플로우 챔버를 포함할 수 있다. 본원에 제시된 방법과 조성물에 사용될 수 있는 예시적인 플로우 셀과 플로우 셀의 제조를 위한 기재에는, 비제한적으로, Illumina, Inc.(San Diego, CA)에서 상업적으로 입수 가능한 것들이 포함된다.
본원에 사용된 "전극"이라는 용어는, 전기를 전도하는 고체 구조를 의미하는 것으로 의도된다. 전극은 금, 팔라듐 또는 백금, 또는 이들의 조합과 같은 임의의 적합한 전기 전도성 재료를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 전극은 기재에 배치될 수 있다. 일부 예에서, 전극은 기재를 한정할 수 있다.
본원에 사용된 "나노공극"이라는 용어는, 분자가 나노공극의 제1 측에서 나노공극의 제2 측으로 통과할 수 있게 하는 개구부를 포함하는 구조로서, 여기서 나노공극의 개구부 일부의 너비가 100 nm 이하, 예를 들어 10 nm 이하 또는 2 nm 이하인 구조를 의미하는 것으로 의도된다. 개구부는 나노공극의 제1 측과 제2 측을 통해 연장된다. 나노공극의 개구부를 통과할 수 있는 분자는, 예를 들어 아미노산 또는 뉴클레오타이드와 같은 이온 또는 수용성 분자를 포함할 수 있다. 나노공극은 장벽 내에 배치되거나, 기재를 통해 제공될 수 있다. 선택적으로, 개구부의 일부는 나노공극의 제1 측과 제2 측 중 하나 또는 둘 모두보다 더 좁을 수 있으며, 이러한 경우, 개구부의 해당 부분은 "수축부(constriction)"로 지칭될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 나노공극의 개구부 또는 나노공극의 수축부(존재하는 경우), 또는 둘 모두는, 0.1 nm, 0.5 nm, 1 nm, 10 nm 또는 그 이상보다 클 수 있다. 나노공극은 다수의 수축부, 예를 들어 적어도 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개, 또는 그 이상의 수축부를 포함할 수 있으며, 나노공극에는 생물학적 나노공극, 고체 상태 나노공극, 또는 생물학적 및 고체 상태 혼성 나노공극이 포함된다.
생물학적 나노공극에는, 예를 들어 폴리펩타이드 나노공극과 폴리뉴클레오타이드 나노공극이 포함된다. "폴리펩타이드 나노공극"은 하나 이상의 폴리펩타이드로 만들어진 나노공극을 의미하는 것으로 의도된다. 하나 이상의 폴리펩타이드는 단량체, 동종중합체 또는 이종중합체를 포함할 수 있다. 폴리펩타이드 나노공극의 구조에는, 예를 들어 α-나선 다발 나노공극과 β-배럴 나노공극뿐 아니라, 당업계에 널리 알려진 다른 모든 구조가 포함된다. 예시적인 폴리펩타이드 나노공극에는, α-헤몰리신, 마이코박테리움 스메그마티스 포린(Mycobacterium smegmatis porin) A, 그라미시딘(gramicidin) A, 말토포린(maltoporin), OmpF, OmpC, PhoE, Tsx, F-pilus, SP1, 미토콘드리아 포린(VDAC), Tom40, 외막 포스포리파아제 A, CsgG, 에어로리신(aerolysin) 및 네이세리아 자가수송 지질단백질(NaIP, Neisseria autotransporter lipoprotein)이 포함된다. 마이코박테리움 스메그마티스 포린 A(MspA)는 마이코박테리아에 의해 생산되는 막 포린으로, 이는 친수성 분자가 박테리아에 들어갈 수 있게 한다. MspA는 단단하게 상호연결된 팔량체와 술잔(goblet) 모양의 막관통 베타-배럴을 형성하며, 중심 수축부를 포함한다. α-헤몰리신에 관한 추가의 세부사항에 대해서는, 미국 특허 제6,015,714호를 참조하며, 상기 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로 인용된다. SP1에 관한 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌[Wang et al., Chem. Commun., 49: 1741-1743 (2013)]을 참조하며, 상기 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로 인용된다. MspA에 관한 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌[Butler et al., "Single-molecule DNA detection with an engineered MspA protein nanopore," Proc. Natl. Acad. Sci. 105: 20647-20652 (2008)]과 문헌[Derrington et al., "Nanopore DNA sequencing with MspA," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107:16060-16065 (2010)]을 참조하며, 상기 두 가지 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로 인용된다. 다른 나노공극에는, 예를 들어 노르카디아 파르시니카(Norcadia farcinica) 유래의 MspA 동족체와 리세닌(lysenin)이 포함된다. 리세닌에 관한 추가의 세부사항에 대해서는, PCT 공개공보 WO 2013/153359를 참조하며, 상기 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로 인용된다. 에어로리신에 관한 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌[Cao et al., "Single-molecule sensing of peptides and nucleic acids by engineered aerolysin nanopores," Nature Communications 10: Article number: 4918 (2019)]을 참조하며, 상기 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로 인용된다.
"폴리뉴클레오타이드 나노공극"은 하나 이상의 핵산 중합체로 만들어진 나노공극을 의미하는 것으로 의도된다. 폴리뉴클레오타이드 나노공극은, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드 오리가미(origami)를 포함할 수 있다.
"고체 상태 나노공극"은 생물학적 기원이 아닌 하나 이상의 재료로 만들어진 나노공극을 의미하는 것으로 의도된다. 고체 상태 나노공극은 무기 또는 유기 재료로 만들어질 수 있다. 고체 상태 나노공극에는, 예를 들어 질화규소(SiN), 이산화규소(SiO2), 탄화규소(SiC), 산화하프늄(HfO2), 이황화몰리브덴(MoS2), 육방정 질화붕소(h-BN) 또는 그래핀이 포함된다. 고체 상태 나노공극은 고체 상태 막, 예를 들어 임의의 이러한 재료(들)를 포함하는 막 내에 형성된 개구부를 포함할 수 있다.
"생물학적 및 고체 상태 혼성 나노공극"은 생물학적 기원과 비생물학적 기원 둘 모두의 재료로 만들어진 혼성 나노공극을 의미하는 것으로 의도된다. 생물학적 기원의 재료는 상기 정의된 바와 같으며, 이에는, 예를 들어 폴리펩타이드와 폴리뉴클레오타이드가 포함된다. 생물학적 및 고체 상태 혼성 나노공극에는, 예를 들어 폴리펩타이드-고체 상태 혼성 나노공극과 폴리뉴클레오타이드-고체 상태 나노공극이 포함된다.
본원에 사용된 "장벽"은 통상적으로 장벽의 한 측에서 장벽의 다른 측으로 분자가 이동하는 것을 저해하는 구조를 의미하는 것으로 의도된다. 이동이 저해되는 분자는, 예를 들어 뉴클레오타이드 및 아미노산과 같은 이온 또는 수용성 분자를 포함할 수 있다. 하지만, 나노공극이 장벽 내에 배치되는 경우, 나노공극의 개구부는 장벽의 한 측에서 장벽의 다른 측으로 분자가 이동하는 것을 허용할 수 있다. 하나의 특정예로서, 나노공극이 장벽 내에 배치되는 경우, 나노공극의 개구부는 장벽의 한 측에서 장벽의 다른 측으로 분자가 이동하는 것을 허용할 수 있다. 장벽에는 지질 이중층과 같은 생물학적 기원의 막과, 고체 상태 막 또는 기재와 같은 비생물학적 장벽이 포함된다.
본원에 사용된 "생물학적 기원"은, 유기체 또는 세포와 같은 생물학적 환경에서 유도되거나 단리된 재료, 또는 생물학적으로 이용 가능한 구조의 합성적으로 제조된 버전을 나타낸다.
본원에 사용된 "고체 상태"는 생물학적 기원이 아닌 재료를 나타낸다.
본원에 사용된 "차단 모이어티"는, 해당 모이어티가 제거될 때까지, 폴리머라아제가 이중체의 말단에 또 다른 뉴클레오타이드를 부가하는 것을 저해하는 모이어티를 의미하는 것으로 의도된다. "차단기"는 차단 모이어티의 비제한적인 일례로서, 화학기를 의미하는 것으로 의도된다. 일부 예에서, 뉴클레오타이드는 차단기에 커플링될 수 있다. 뉴클레오타이드에서 차단기를 제거하는 것은 해당 뉴클레오타이드를 "차단 해제하는" 것으로 지칭될 수 있다. 뉴클레오타이드의 3' 위치가 차단기에 커플링되는 예에서, 해당 차단기는 "3'-차단기"로 지칭될 수 있다. 3'-차단기는, 해당 모이어티가 제거되어 히드록실(OH) 기로 대체될 때까지, 폴리머라아제가 해당 뉴클레오타이드에 또 다른 뉴클레오타이드를 커플링시키는 것을 저해할 수 있다.
본원에 사용된 "메틸화된 염기"라는 용어는, 메틸기(-CH3 또는 -Me) 또는 유도체화된 메틸기를 포함하는 염기를 나타낸다. 예를 들어, "메틸시토신" 또는 "mC"는 메틸기를 포함하는 DNA 내 시토신(즉, 2'-데옥시시토신)을 나타내거나, 메틸시토신의 유도체이다. 또 다른 예로서, "메틸아데닌" 또는 "mA"는 메틸기를 포함하는 DNA 내 아데닌을 나타내거나, 메틸아데닌의 유도체이다. 유도체화된 메틸기의 비제한적인 일례는 산화된 메틸기이다. 산화된 메틸기의 비제한적인 일례는 히드록시메틸(-CH2OH)이다. 히드록시메틸기를 갖는 mC 유도체는 히드록시메틸시토신 또는 hmC로 지칭될 수 있다. 산화된 메틸기의 또 다른 비제한적인 예는 포르밀기(-CHO)이다. 포르밀기를 갖는 mC 유도체는 포르밀시토신 또는 fC로 지칭될 수 있다. 산화된 메틸기의 또 다른 비제한적인 예는 카르복실(-COOH)이다. 카르복실기를 포함하는 mC 유도체는 카르복실시토신 또는 caC로 지칭될 수 있다. 메틸시토신의 메틸기는 시토신의 5번 위치에 위치할 수 있으며, 이러한 경우, mC는 5mC로 지칭될 수 있다. 산화된 메틸기는 시토신의 5번 위치에 위치할 수 있으며, 이러한 경우, hmC는 5hmC로 지칭될 수 있거나, fC는 5fC로 지칭될 수 있거나, 또는 caC는 5caC로 지칭될 수 있다. 메틸아데닌의 메틸기는 아데닌의 6번 위치에 위치할 수 있으며, 이러한 경우, mA는 6mA로 지칭될 수 있다.
나노공극을 사용한 폴리뉴클레오타이드 시퀀싱
나노공극을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하기 위한 일부 예시적인 작업, 조성물 및 시스템이 이제, 도 1a 내지 도 1h, 도 2a 내지 도 2e, 도 3, 도 4a 내지 도 4c, 도 5a와 도 5b, 도 6, 도 7, 도 8a 내지 도 8e, 도 9, 및 도 10을 참조로 기재될 것이다.
이제 도 1a를 참조하면, 시퀀싱 시스템(100)은 나노공극(110), 시퀀싱하고자 하는(예를 들어, 알려져 있지 않을 수 있는) 폴리뉴클레오타이드(150), 폴리뉴클레오타이드(150)의 제1 부분(155)에 혼성화되어 이중체(154)를 형성하는 폴리뉴클레오타이드(140), 및 회로(160)를 포함할 수 있다.
나노공극(110)은 장벽(101) 내에 배치될 수 있고, 제1 측(111), 제2 측(112), 및 제1 측과 제2 측을 통해 연장되는 개구부(113)를 포함할 수 있다. 선택적으로, 일부 예에서, 나노공극(110)은 개구부(113) 내에 수축부(114)를 포함할 수 있다. 나노공극(110)의 개구부(113)는 유체(120) 및/또는 유체(120')가 장벽(101)을 통해 흐르는 경로를 제공할 수 있다. 나노공극(110)은 고체 상태 나노공극, 생물학적 나노공극(예를 들어, 도 1a에 예시된 바와 같은 MspA), 또는 생물학적 및 고체 상태 혼성 나노공극을 포함할 수 있다. 도 1a에 예시된 비제한적인 예에서, 나노공극(110)은 나노공극의 제1 측(111)이 개구부(113)의 대부분을 포함하도록 배향될 수 있으며, 따라서 이중체(154)의 3' 말단(153)은 상대적으로 유체(120)에 접근할 수 없도록 개구부(113) 내에 상대적으로 깊게 끼워질 수 있기 때문에 유체 내 임의의 폴리머라아제에 의해 작용하지 않을 수 있다. 대안적으로, 도 7에 예시된 바와 같이, 나노공극(110)은 나노공극의 제2 측(112)이 개구부(113)의 대부분을 포함하도록 배향될 수 있으며, 따라서 이중체(154)의 3' 말단은 개구부(113) 내에 상대적으로 얕게 끼워질 수 있지만 여전히 상대적으로 유체(120)에 접근할 수 없기 때문에 유체 내 임의의 폴리머라아제에 의해 작용하지 않을 수 있다. 본원의 예들 중 다수는 도 1a에 예시된 바와 같이 "정방향" 배향의 비대칭 나노공극을 참조하여 기재될 수 있지만, 모든 이러한 예에서, 나노공극(110)은 도 1a에 예시된 배향 또는 도 7에 예시된 "역방향" 배향 중 어느 하나를 가질 수 있음을 이해해야 한다.
나아가, 나노공극은 대칭일 수 있기 때문에, 반드시 "정방향" 또는 "역방향" 배향 중 어느 하나를 갖는 것으로 간주되지 않을 수 있다.
장벽(101)은 통상적으로 장벽의 한 측에서 장벽의 다른 측으로 분자가 이동하는 것을 저해하는, 예를 들어 통상적으로 유체(120)와 유체(120') 사이의 접촉을 저해는 임의의 적합한 구조를 가질 수 있다. 예를 들어, 도 1a에 예시된 바와 같이, 장벽(101)은 제1 층(107)과 제2 층(108)을 포함할 수 있으며, 이들 중 하나 또는 둘 모두는 분자가 해당 층을 가로질러 흐르는 것을 저해한다. 예시적으로, 장벽(101)은 지질층(107과 108)을 포함하는 지질 이중층을 포함할 수 있다. 하지만, 장벽(101)이 임의의 적합한 구조(들), 임의의 적합한 재료(들) 및 임의의 적합한 수의 층을 포함할 수 있다고 이해될 것이다. 예를 들어, 장벽(101)은 단일 층 또는 다수의 층을 포함할 수 있는 고체 상태 장벽을 포함할 수 있다. 장벽에 사용될 수 있는 재료의 비제한적인 예는 본원의 다른 곳에 제공되어 있다. 장벽과 나노공극의 비제한적인 예와 특성은 본원의 다른 곳뿐 아니라, 미국 특허 제9,708,655호에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로 인용된다.
폴리뉴클레오타이드(150)는, 예를 들어 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드(150)는 폴리뉴클레오타이드(150)의 제1 부분(155)이 선택적으로 나노공극의 제1 측(111)에 완전히 위치하도록 나노공극(110)의 개구부(113)를 통해 배치될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드(150)의 3' 말단은 나노공극(110)의 제1 측(111)에 위치할 수 있고, 폴리뉴클레오타이드(150)의 5' 말단은 나노공극(110)의 제2 측(112)에 위치할 수 있다. 선택적으로, 폴리뉴클레오타이드(150)의 3' 말단은 제1 입체형 잠금장치(151)에 커플링되거나 이를 포함할 수 있다. 제1 입체형 잠금장치(151)는 나노공극(110) 또는 이의 특징부(예를 들어, 수축부(114))를 통과할 수 없을 만큼 충분히 크기 때문에, 나노공극의 제1 측에 말단을 유지한다. 추가적인 또는 대안적인 옵션으로서, 폴리뉴클레오타이드(150)의 5' 말단은 나노공극(110)의 제2 측(112)에 위치할 수 있으며, 제2 입체형 잠금장치(152)에 커플링되거나 이를 포함할 수 있다. 제2 입체형 잠금장치(152)는 수축부(114)(예컨대 폴리뉴클레오타이드(150)에 혼성화된 올리고뉴클레오타이드)를 통과할 수 없을 만큼 충분히 크기 때문에, 나노공극의 제2 측에 폴리뉴클레오타이드(150)의 제2 말단을 유지한다. 이와 같이, 도 1a에 예시된 작동 모드 동안 회로(160)가 전극(102와 103)에 인가할 수 있는 바이어스 전압의 극성에 관계없이, 폴리뉴클레오타이드(150)는 이러한 작동 모드 동안 나노공극(110)과 회합된 상태를 유지할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드(140)는, 예를 들어 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드(140)는, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드(150)의 제1 부분에 혼성화되어 이중체(154)를 형성하는 프라이머를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드(140)와 폴리뉴클레오타이드(150)의 제1 부분 사이의 이중체(154)는 선택적으로 나노공극의 제1 측(111)에 완전히 위치할 수 있으며, 3' 말단(153)을 포함할 수 있다. 이러한 비제한적인 예에서, 3' 말단(153)은 GC 염기쌍을 포함하며, C가 폴리뉴클레오타이드(150) 내 다른 뉴클레오타이드 서열에 더하여 폴리뉴클레오타이드(150) 서열의 이러한 위치에 위치하는 것으로 식별하는 것이 바람직하다. G 뉴클레오타이드(121)는, 반드시 그럴 필요는 없지만, 도 1b를 참조로 하기에 보다 상세하게 기재되는 바와 같은 방식으로, 폴리머라아제를 사용하여 폴리뉴클레오타이드(150) 서열에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 혼입되었을 수 있다. 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 부분(156)(예를 들어, A 염기와 T 염기)은 개구부(113) 내에 있을 수 있지만, 폴리뉴클레오타이드(140)에는 혼성화되어 있지 않을 수 있다. 구체적으로 예시되거나 표지되지 않은 폴리뉴클레오타이드(140, 150)의 염기가 존재할 수 있지만, 설명의 단순성을 위해 생략되어 있을 수 있음을 이해해야 한다.
폴리뉴클레오타이드(140)와 폴리뉴클레오타이드(150)의 제1 부분 사이의 혼성화는, 특정 작동 모드 동안 회로(160)가 전극(102와 103)에 인가할 수 있는 임의의 바이어스 전압에 관계없이, 이중체가 실질적으로 온전한 상태를 유지할 수 있을 정도로 충분히 강할 수 있다. 하지만, 도 4a 내지 도 4c를 참조로 하기에 추가로 기재되는 바와 같은 방식으로, 회로(160)는 폴리뉴클레오타이드(150)에서 폴리뉴클레오타이드(140)를 해리시키고, 또 다른 폴리뉴클레오타이드(140)를 사용하여, 선택적으로 동일한 측정 조건 세트 또는 상이한 측정 조건 세트를 사용하여 폴리뉴클레오타이드(150)를 재시퀀싱할 수 있도록 충분히 강한 힘을 가하는 또 다른 작동 모드를 갖도록 구성될 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 도 5a와 도 5b를 참조로 하기에 추가로 기재되는 바와 같은 방식으로, 회로(160)는 나노공극(110)에서 폴리뉴클레오타이드(150)를 해리시키고, 나노공극(110)을 상이한 폴리뉴클레오타이드의 시퀀싱에 이용 가능하게 만들기에 충분히 강한 힘을 가하는 또 다른 작동 모드를 갖도록 구성될 수 있다.
도 1a에 예시된 작동 모드에서, 회로(160)는 이중체(154)의 3' 말단(153)을 개구부(113) 내에 배치하는 제1 힘(F1)을 가할 수 있다. 나노공극(110)은 제1 힘이 가해지는 동안 이중체(154)의 3' 말단(153)이 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해한다. 예를 들어, 도 1a에 예시된 특정 순간에서, 회로(160)는 나노공극(110)의 제2 측(112)을 향해 이중체(154)를 이동시키는 제1 힘(F1)(예컨대 나노공극(110)에 걸친 제1 전압)을 가하지만, 나노공극(110)의 수축부(114) 또는 다른 특징부는 이중체의 3' 말단(153)이 나노공극의 제2 측으로 이동하는 것을 저해한다. 도 1a에 예시된 예에서, 이중체(154)는 수축부(114)보다 더 넓을 수 있기 때문에, 수축부(114)를 통과하는 것이 입체적으로 방해될 수 있다. 하지만, 나노공극(110)의 임의의 적합한 부분(들)이 이중체(154)의 3' 말단(153)이 나노공극의 제2 측으로 이동하는 것을 저해하는 데 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
도 1a에 예시된 작동 모드 동안 이중체(154)의 존재를 통해 이해해야 하는 바와 같이, 제1 힘(F1)은 이중체(154)의 해리, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드(150)에서 폴리뉴클레오타이드(140)의 탈혼성화를 야기하기에 충분하지 않도록 선택된다. 유사하게, 이중체가 예시된 본원의 다른 도면에서, 회로(160)가 가하는 힘은 기재된 작동 모드에서 해당 이중체의 해리를 야기할 만큼 충분하지 않지만, 다른 작동 모드를 사용하여 이중체를 의도적으로 해리시킬 수 있음을 이해해야 한다. 일부 예에서, 이중체(154)는 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드 유사체(들)는, 예를 들어 천연 뉴클레오타이드에 비해 이중체(154)의 안정성을 증강시킬 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 유사체(들)는 하나 이상의 잠금 핵산(LNA)을 포함할 수 있거나, 하나 이상의 2'-메톡시(2'-OMe) 뉴클레오타이드를 포함할 수 있거나, 하나 이상의 2'-플루오린화된(2'-F) 뉴클레오타이드를 포함할 수 있거나, 또는 하나 이상의 펩타이드 핵산(PNA)을 포함할 수 있다. 이러한 유사체(들)는, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드(140)에 포함될 수 있다. 예시적으로, 이러한 유사체(들)는 합성되는 시점에 프라이머에 부가될 수 있거나, 잠재적으로 이러한 변형을 갖는 트리포스페이트 뉴클레오타이드가 폴리머라아제에 의해 가닥(140)에 혼입될 수 있다. 이러한 유사체(들)는 이중체(154)의 Tm(용융 온도)을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, LNA 단량체의 부가는 이중체(154)의 Tm을 증가시키는 것을 도울 수 있으며, 이중체(154)의 Tm을 미세 조정하는 데 사용될 수 있다. 또는, 예를 들어, 2'-OMe는 RNA:RNA 이중체의 Tm을 증가시킬 수 있으며, RNA:DNA 안정성에는 작은 변화만 가져올 수 있다. 또는, 예를 들어, 2' 플루오로 염기는 결합 친화도(Tm)를 증가시키는 플루오린 변형된 리보오스를 가질 수 있으며, 또한 천연 RNA와 비교하여 어느 정도 상대적인 뉴클레아제 저항성을 부여할 수 있다.
회로(160)는 제1 힘(F1)을 가하는 동안 이중체(154)의 3' 말단(153)과 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 부분(예를 들어, 제2 부분(156))의 전기적 특성 값을 측정하고, 측정값을 사용하여 폴리뉴클레오타이드(150)에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 식별하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 회로(160)는 제1 및 제2 전극(102, 103)과 작동 가능하게 통신할 수 있으며, 제1 힘(F1)을 가하는 동안 나노공극(110)을 통한 이온 전류, 또는 나노공극(110)에 걸친 전류, 전기 저항 또는 전압 강하를 검출하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 유체(120)는 KCl, NaCl, 페로시안화포타슘, 페리시안화포타슘 또는 글루탐산포타슘과 같은 하나 이상의 염을 포함할 수 있다. 도 1a에 예시된 비제한적인 예에서, 이중체(154)의 3' 말단(153)에 있는 특정 염기쌍(예를 들어, GC)과, 단일 가닥 부분(156) 내 하나 이상의 염기 서열(예를 들어, A,T)은 유체(120) 내 염이 개구부(113)를 통해 유체(120')로 이동하는 속도를 변경시켜, 회로(160)에 의해 검출되는 방식으로 나노공극(110)에 걸친 전류, 이온 전류, 전기 저항 또는 전압 강하를 변경시킬 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 이중체(154)의 3' 말단(153)에 있는 특정 염기쌍(들)(예를 들어, GC)과, 단일 가닥 부분(156) 내 하나 이상의 염기 서열(예를 들어, A,T)은 측정 시 노이즈를 변경시킬 수 있으며, 예를 들어 유체(120) 내 염이 개구부(113)를 통해 유체(120')로 이동하는 속도에서 변동을 변경시켜, 회로(160)에 의해 검출되는 방식으로 나노공극(110)에 걸친 전류의 표준편차, 이온 전류의 표준편차, 전기 저항의 표준편차 또는 전압 강하의 표준편차를 변경시킬 수 있다. 일부 예에서, 이중체(154)는 천연 뉴클레오타이드에 비해 나노공극의 전기적 특성 값을 변경시키는 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체(들)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드(140)는 2' 변형 또는 염기 변형과 같은 뉴클레오타이드 유사체(들)를 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 유사체(들)는 회로(160)를 사용하여 식별될 수 있다.
도 1a에 예시된 작업 동안 회로(160)가 측정하는 값은 제1 부분(155)(이러한 부분은 폴리뉴클레오타이드(140)에 혼성화됨)과 제2 부분(156)(이러한 부분은 단일 가닥이며, 폴리뉴클레오타이드(140)에 혼성화되지 않음)에 있는 임의의 적합한 수의 뉴클레오타이드를 기반으로 할 수 있다. 예를 들어, 측정값은 적어도 단일 가닥 부분의 M개의 뉴클레오타이드와 이중체의 D개의 혼성화된 뉴클레오타이드 쌍을 기반으로 할 수 있으며, 여기서 M는 1 이상이고, D는 1 이상이다. M과 D는 임의의 적합한 값을 가질 수 있다. 예를 들어, M은 2 이상일 수 있거나, M은 3 이상일 수 있거나, 또는 M은 4 이상일 수 있다. 예시적으로, M은 약 1일 수 있다. 또는, 예시적으로, M은 약 2일 수 있다. 또는, 예시적으로, M은 약 3일 수 있다. 또는, 예시적으로, M은 약 4일 수 있다. 또는, 예시적으로, M은 약 5일 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, D는 2 이상일 수 있거나, D는 3 이상일 수 있거나, 또는 D는 4 이상일 수 있다. 예시적으로, D는 약 1일 수 있다. 또는, 예시적으로, D는 약 2일 수 있다. 또는, 예시적으로, D는 약 3일 수 있다. 또는, 예시적으로, D는 약 4일 수 있다. 또는, 예시적으로, D는 약 5일 수 있다.
회로(160)에 의해 측정된 값은 M개의 뉴클레오타이드와 D개의 혼성화된 뉴클레오타이드 쌍에 기반한 전류, 이온 전류, 전기 저항 또는 전압 강하를 포함할 수 있다. 회로(160)에 의해 측정된 값은 또한 또는 대안적으로, 나노공극에 걸친 전류, 이온 전류, 전기 저항 또는 전압 강하의 노이즈를 포함할 수 있고, 예를 들어 노이즈의 표준편차를 포함할 수 있으며, 여기서 노이즈는 M개의 뉴클레오타이드와 D개의 혼성화된 뉴클레오타이드 쌍을 기반으로 한다. 예를 들어, 이제 도 1f를 참조하면, 숫자는 소정의 힘(여기서, 제1 힘(F1)) 하에서 측정값에 영향을 미칠 수 있는 염기를 나타내기 위해 사용된다. 예시된 바와 같은 MspA 나노공극의 경우, 4번, 5번, 6번 및 4'번 염기가 주로 측정값에 영향을 미칠 수 있는 것으로 예상될 수 있지만, 이들에 인접한 염기도 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 방식으로, 측정값에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 3번 및 3'번 염기는 측정값에 영향을 미칠 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 7번 염기는 측정값에 영향을 미칠 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 8번 염기는 측정값에 영향을 미칠 수 있다. 하나의 비제한적인 예에서, 3번, 3'번, 4번, 4'번, 5번, 6번, 7번 및 8번 염기는 측정값에 영향을 미친다. 또 다른 비제한적인 예에서, 3번, 3'번, 4번, 4'번, 5번, 6번 및 7번 염기는 측정값에 영향을 미친다. 또 다른 비제한적인 예에서, 4번, 4'번, 5번, 6번, 7번 및 8번 염기는 측정값에 영향을 미친다. 또 다른 비제한적인 예에서, 3번, 3'번, 4번, 4'번, 5번 및 6번 염기는 측정값에 영향을 미친다. 또 다른 비제한적인 예에서, 4번, 4'번, 5번, 6번 및 7번 염기는 측정값에 영향을 미친다. 또 다른 비제한적인 예에서, 4번, 4'번, 5번 및 6번 염기는 측정값에 영향을 미친다.
측정값에 영향을 미치는 염기(들)의 특정 수와 위치는 사용되는 특정 나노공극 구성, 사용되는 특정 회로 및 측정이 수행되는 특정 조건에 따라 달라질 수 있다고 이해될 것이다. 예를 들어, 도 1g에 예시된 바와 같이, 변형된 제1 힘(F1') 하에서, 이중체(154)의 3' 말단은 나노공극(110)에 대해 상이한 위치에 배치될 수 있으며, 예를 들어 도 1g에 제시된 비제한적인 예에서, F1'가 F1보다 큰 경우에는 개구부(113) 내에 더 깊게 배치될 수 있고, F1'가 F1보다 작은 경우에는 개구부(113) 내에 더 얕게 배치될 수 있다. 개구부(113)를 통한 이온 전류는 상이한 힘에 대해 이중체(154) 내 염기와 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 부분(156)에 의해 상이하게 영향을 받을 수 있다. 도 8a 내지 도 8e, 도 9 및 도 10을 참조로 하기에 추가로 기재되는 바와 같은 방식으로, 상이한 힘 하에서 측정된 값을 비교하여 뉴클레오타이드를 식별하는 정확도를 추가로 증강시킬 수 있다.
일부 예에서, 회로(160)는 폴리뉴클레오타이드(150) 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드를, 비제한적으로, 메틸화된 염기와 같이 변형된 것으로 식별하도록 구성되어 있다. 예를 들어, 이제 도 1h를 참조하면, 여기서 숫자는 다시 측정값에 영향을 미칠 수 있는 염기를 나타내기 위해 사용되며, 5* 염기가 메틸화된(또는 달리 변형된) 경우, 이러한 기는 메틸화되지 않은(또는 달리 변형되지 않은) 염기와 상이하게 측정값에 영향을 미칠 수 있으므로, 메틸화된(또는 달리 변형된) 염기의 존재가 측정된 값에 대한 이의 영향을 통해 식별될 수 있다고 예상될 수 있다.
측정값을 사용하여 뉴클레오타이드를 식별하는 데 회로(160)가 사용될 수 있는 방식에 관한 추가의 세부사항은, 도 8a 내지 도 8e, 도 9 및 도 10을 참조로 하기에 제공되어 있다.
다시 도 1a를 참조로, 회로(160)를 사용하여 제1 힘(F1)이 가해지는 동안, 이중체(154)의 3' 말단(153)에 뉴클레오타이드의 부가가 저해될 수 있다. 예를 들어, 유체(120)는 나노공극(110)의 제1 측(111)과 접촉하고 있을 수 있으며, 복수의 뉴클레오타이드(121, 122, 123, 124, 예를 들어, 각각, G, T, A 및 C)를 포함할 수 있다. 유체(120) 내 뉴클레오타이드(121, 122, 123, 124)는 각각 선택적으로 하기에 보다 상세하게 기재되는 바와 같은 방식으로 변형될 수 있으며, 예를 들어 각각의 차단 모이어티에 커플링되거나 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 유체(120)는, 도 1b를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 폴리뉴클레오타이드(150)의 서열을 사용하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 뉴클레오타이드를 부가하는 데 사용될 수 있는 복수의 폴리머라아제(105)를 추가로 포함할 수 있다. 하지만, 도 1a에 예시된 특정 시점에, 나노공극(110)의 개구부(113)는 이중체(154)의 3' 말단(153)에 뉴클레오타이드가 부가되는 것을 저해할 수 있다. 예를 들어, 폴리머라아제(105)는, 3' 말단이 개구부(113) 내에 위치하는 동안, 3' 말단(153)에 결합하는 것이 입체적으로 방해될 수 있다.
하지만, 회로(160)는 뉴클레오타이드의 부가를 통해 이중체(154)의 3' 말단이 연장될 수 있는 작동 모드로 시스템(100)을 전환시키도록 구성될 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드 부가 작업은, 예를 들어 도 1a에 예시된 특정 시점 이전에 뉴클레오타이드(121)를 부가하기 위해, 예를 들어 이중체(154)를 형성한 후, 그리고 제1 힘(F1)이 가해지기 전에 수행될 수 있다. 도 1b는, 이중체(154)에 뉴클레오타이드를 부가하는 예시적인 모드를 개략적으로 예시한 것이다. 이러한 모드에서, 회로(160)는 이중체(154)의 3' 말단(153)을 개구부(113) 밖으로 이동시키는 제2 힘(F2)(예컨대, 제1 전압의 반대 방향으로 나노공극(110)에 걸친 제2 전압)을 가하도록 구성될 수 있으며, 이에 따라 폴리머라아제(105)는 이중체의 3' 말단과 접촉할 수 있고, 여기에 폴리뉴클레오타이드(150) 서열에서 다음 뉴클레오타이드(예를 들어, A)에 기반하여 뉴클레오타이드, 예를 들어 T(122)를 부가할 수 있다. 대신 회로(160)는 제1 힘(F1)을 방출하도록 구성될 수 있으며, 이러한 방출 후 이중체(154)의 3' 말단(153)이 자연적으로 개구부(113) 밖으로 확산되어, 이러한 동작을 유발하고 이중체의 3' 말단을 유체(120)에 이용 가능하게 만들 수 있는 힘을 적극적으로 가하기 위해 회로를 사용할 필요 없이, 폴리머라아제(105)는 이중체의 3' 말단과 접촉할 수 있고, 제1 뉴클레오타이드를 부가할 수 있다고 이해될 것이다.
임의의 적합한 유형의 폴리머라아제(105)가 임의의 적합한 유형의 폴리뉴클레오타이드(150)에 기반하여 임의의 적합한 유형의 폴리뉴클레오타이드(140)를 합성하는 데 사용될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 예를 들어, DNA 폴리머라아제(105)는 DNA 폴리뉴클레오타이드(150)를 카피하여 DNA 폴리뉴클레오타이드(140)를 형성하는 데 사용될 수 있다. 또는, 예를 들어, RNA 폴리머라아제(105)는 DNA 폴리뉴클레오타이드(150)를 카피하여 RNA 폴리뉴클레오타이드(140)를 형성하는 데 사용될 수 있다. 또는, 예를 들어, RdRP(RNA 의존성 RNA 폴리머라아제)(105)는 RNA 폴리뉴클레오타이드(150)를 카피하여 RNA 폴리뉴클레오타이드(140)를 형성하는 데 사용될 수 있다. 또는, 예를 들어, 역전사효소(105)는 RNA 폴리뉴클레오타이드(150)를 카피하여 DNA 폴리뉴클레오타이드(140)를 형성하는 데 사용될 수 있다. 임의의 DNA 변형은 3' 말단을 포함하는 염기 또는 당에서 발생할 수 있다. 임의의 RNA 변형은 2' 말단을 포함하는 염기 또는 당에서 발생할 수 있다. 예시적이며 비제한적인 2' 말단에 대한 변형에는, 2'-O-메톡시에틸, 2'-OMe, 2'-F 및 잠금 핵산(LNA)이 포함된다.
회로(160)는 시스템(100)을 뉴클레오타이드 부가 모드(도 1b)와 측정 모드(도 1a) 사이에서 반복적으로 전환시키도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 도 1a를 참조로 기재된 측정을 수행한 후, 또 다른 뉴클레오타이드가 도 1b를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로 부가될 수 있으며, 또 다른 측정이 수행될 수 있다. 측정 모드 동안, 나노공극(110)의 개구부 또는 다른 특징부는 폴리머라아제(105)가 또 다른 뉴클레오타이드를 부가하는 것을 저해할 수 있다. 이와 같이, 뉴클레오타이드 측정의 각 사이클은 임의의 목적하는 기간을 갖도록 제어될 수 있으며, 예를 들어 수행되는 측정 유형에 적절한 신호 대 노이즈 비(SNR)를 제공하도록 회로(160)를 사용하여 전자적으로 제어될 수 있다. 일반적으로, 측정 사이클이 더 길수록, 더 나은 SNR을 얻을 수 있다. 일부 적용에서, 회로(160)는 처리량(단위 시간당 염기 수)이 더 낮을 수 있음에도 불구하고 충분히 높은 SNR(예를 들어, 선결된 임계값을 초과하는 SNR)을 얻기 위해 측정 모드의 길이를 조정하도록 구성될 수 있다. 다른 적용에서, 회로(160)는 SNR이 더 낮을 수 있음에도 불구하고 충분히 높은 처리량(예를 들어, 선결된 임계값을 초과하는 처리량)을 얻기 위해 측정 모드의 길이를 조정하도록 구성될 수 있다.
회로(160)는 뉴클레오타이드 부가 및 측정의 사이클을 임의의 적합한 횟수만큼 반복 수행하도록 추가로 구성될 수 있다. 예를 들어, 도 1c에 예시된 바와 같이, 뉴클레오타이드가 부가되는 동안 제2 힘(F2)을 가한 후, 회로(160)는 다시 제1 힘(F1)을 가할 수 있다. 제1 힘(F1)은, 일부 예에서, 이중체(154)의 3' 말단(153)과의 접촉에서 폴리머라아제(105)를 제거하고, 이제 연장된 이중체(154)의 3' 말단(153)을 나노공극(110)의 개구부(113)로 이동시킬 수 있으며, 여기서 나노공극(110)의 수축부(114) 또는 다른 특징부는, 도 1a를 참조로 기재된 바와 유사한 방식으로, 3' 말단이 나노공극의 제2 측(112)으로 전위되는 것을 저해한다. 대안적으로, 제1 힘(F1)은 이중체(154)의 3' 말단(153)과의 접촉에서 폴리머라아제(105)를 제거하기에 충분하지 않을 수 있으며, 회로(160)는 이중체의 3' 말단과의 접촉에서 폴리머라아제를 제거하기 위해 제1 힘보다 클 수 있는 또 다른 힘을 가하도록 구성될 수 있다.
일부 예에서, 회로(160)는 폴리머라아제가 실제로 이중체에 뉴클레오타이드를 부가하는 과정에 있거나, 이미 이중체에 뉴클레오타이드를 부가했다는 것을 확인하는 방식으로 이중체(154)의 3' 말단(153)에 대한 폴리머라아제(105)의 결합을 측정하도록 구성되어 있다. 이러한 확인은, 예를 들어 서로 동일하거나 유사한 전기적 특성 값을 산출할 수 있어, 이러한 해당 값에만 기반하여 서로를 구별하는 데에는 어려움이 있을 수 있는 후속 뉴클레오타이드가 부가되는 경우에 유용할 수 있다. 예를 들어, 도 1d에 예시된 바와 같은 방식으로, 회로(160)는 이중체의 3' 말단과 접촉하고 있는 폴리머라아제를 나노공극의 제1 측의 개구부 내부 또는 근처에 배치하는 제3 힘(F3)을 가할 수 있다. 제3 힘(F3)이 가해지는 동안, 나노공극(110)은 폴리머라아제(105)가 개구부 안으로 또는 더 안쪽으로 이동하는 것을 저해할 수 있다. 예를 들어, 폴리머라아제(105)는 개구부(113)에 들어가는 것이 완전히 또는 제한된 양보다 큰 정도로 입체적으로 방해될 수 있다(실제 폴리머라아제는 본 출원에 개략적으로 예시된 것들보다 유의하게 더 클 수 있으며, 일부 예에서는 실제로 나노공극(110)과 대략 동일한 직경일 수 있음에 유의해야 함). 제3 힘(F3)은 폴리뉴클레오타이드(150)에서 폴리뉴클레오타이드(140)를 스트리핑하지 않는 방식으로 가해질 수 있다. 이는 F3을 이러한 스트리핑 힘보다 낮게 유지하는 방식으로 달성될 수 있거나, F3이 스트리핑에 필요한 힘보다 큰 경우에는, 이중체(154)가 해리되는 시간을 허용하지 않도록 F3이 일시적인 방식으로 가해진다.
도 1d에 예시된 작동 모드 동안, 회로(160)는 제3 힘(F3)을 가하는 동안 폴리머라아제(150)의 전기적 특성 값을 측정하고, 측정값을 사용하여 이중체의 3' 말단과 폴리머라아제의 접촉을 식별할 수 있다. 예를 들어, 폴리머라아제(105)와 3' 말단(153)의 회합은 유체(120) 내 염이 개구부(113)를 통해 유체(120')로 이동하는 속도를 변경시킬 수 있으며, 이에 따라 회로(160)에 의해 검출되는 방식으로 나노공극(110)에 걸친 전류, 이온 전류, 전기 저항(이온 흐름에 대한 저항) 또는 전압 강하, 또는 임의의 이러한 전기적 특성의 표준편차를 변경시킬 수 있다. 제3 힘(F3)은 폴리머라아제(105)와 3' 말단(153)을 포함하는 복합체를 나노공극(110)을 향해 그리고 이와 접촉하도록 이동시키는 데 충분할 수 있으며, 3' 말단(153)에서 폴리머라아제를 제거하지 않을 정도로 충분히 낮을 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 회로(160)는 폴리머라아제(105)가 이중체의 3' 말단(153)에 여전히 결합되어 있는지를 결정할 수 있는 데, 왜냐하면 결합되어 있는 경우, 이중체의 3' 말단이 너무 커서 공극에 들어갈 수 없는 폴리머라아제에 의해 공극의 상단에 고정되기 때문에 주로 단일 가닥 DNA가 개구부(113) 내에 있을 것이기 때문이다. 측정이 수행된 후, 회로(160)는 이중체의 3' 말단에서 폴리머라아제(105)를 제거하는 데 적합한 힘을 가하고, 이중체의 3' 말단이 공극에 들어갈 때 신호의 이동을 관찰하여 폴리머라아제의 제거를 확인할 수 있다. 일부 예에서, F1은 F3 보다 더 강하며, F3과 동일한 방향일 수 있다. 회로(160)는 도 1e에 예시된 바와 같은 측정을 위해 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 부분(156)을 개구부(113) 내에 배치하는 방식으로 힘(F1)을 가할 수 있으며, 새롭게 연장된 3' 말단(153)과 새롭게 이동된 단일 가닥 제2 부분(156)에 대해서만 도 1a를 참조로 기재된 측정을 반복한다. 3' 말단(153)에 뉴클레오타이드를 부가하고, 선택적으로 3' 말단(153)과 접촉하고 있는 폴리머라아제(105)를 검출하고, 폴리머라아제를 제거하고, 이중체(154)의 3' 말단(153)과 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 부분(156)의 전기적 특성 값(이러한 값으로부터 적어도 하나의 뉴클레오타이드가 식별될 수 있음)을 측정하는 작업은, 임의의 적합한 횟수만큼 반복될 수 있으며, 예를 들어 실질적으로 폴리뉴클레오타이드(150)를 시퀀싱하기 위해 실질적으로 폴리뉴클레오타이드(150)의 전체 길이를 따라 반복될 수 있다.
수축부(114)를 포함하는 예에서, 이러한 수축부(114)는 나노공극(110)의 길이 중 일부만 점유하지만, 수축부는 가장 큰 전압 강하가 발생하는 부분이기 때문에(전극(102)과 전극(103) 사이에서 가장 큰 저항을 나타냄) 염기 식별에 가장 민감한 영역일 수 있다는 점에 유의해야 한다. 전형적인 나노공극 수축부는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 단일 DNA 뉴클레오타이드보다 길기 때문에, 나노공극이 생성할 수 있는 전류 신호는 하나 초과의 뉴클레오타이드, 전형적으로 3개, 4개, 5개 또는 심지어 6개, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드에 따라 달라질 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드는 "K-mer"로 지칭될 수 있는 것을 형성한다. 4개의 DNA 염기에 대해 가능한 K-mer의 수는 4K개 이다. 일부 이전에 알려진 가닥 시퀀싱 방법은 MspA 또는 CsgG와 같은 나노공극의 수축부(즉, "감지 영역")를 통해 DNA의 단일 가닥을 전위시키고, 각각의 K-mer에 의해 생성된 전류를 K-mer 서열과 연관시키려고 시도하는 방식으로 작동한다. 이러한 연관을 수행하는 하나는 방법은 임의의 시점에 나노공극 수축부에 존재하는 각각의 가능한 K-mer와 이것이 생성하는 연관된 전류의 표를 생성한 후, 룩업 테이블을 사용하여 측정된 전류에 해당하는 K-mer를 찾는 방식이다. 연관을 수행하는 또 다른 방법은 기계 학습 알고리즘의 사용을 통해 이루어진다. 실제로, 임의의 K-mer 기반 가닥 시퀀싱 방법에는 몇 가지 제한사항이 있다.
예를 들어, 고유한 K-mer에 해당하는 2개의 전류는 동일한 것으로 보일 수 있거나, 소정의 실험 설정 범위 내에서 서로 구별될 수 없을 만큼 충분히 유사할 수 있다. K-mer가 클수록, 이러한 "축퇴" 사례가 발생할 가능성이 높을 수 있다. 이러한 이유로, α-헤몰리신 나노공극은, K-mer가 약 10개 뉴클레오타이드 정도로 크며, 이에 따라 약 410개의 가능한 신호가 존재하기 때문에(현실적으로 디콘볼루션하기에 너무 많음) 가닥 시퀀싱에 어려움이 있다. K-mer가 약 6개 뉴클레오타이드로 다소 짧은 축퇴 사례의 경우, 때때로 K-mer를 구별하기 위해 다른 방법이 사용되어 왔다. 예를 들어 전위 효소(예컨대, 헬리카아제 또는 폴리머라아제)를 사용하여 각각의 뉴클레오타이드에 대한 전기적 값을 연속으로 측정할 수 있는 시간을 허용하면서, 한번에 하나의 뉴클레오타이드씩 공극을 통해 DNA를 전위시키면, K-mer 문제가 완화된다. 이러한 소위 단일 염기 라체팅(ratcheting)은, 소정의 K-mer가 단 4가지 가능성 중 하나로 전환될 수 있기 때문에, 감지 영역을 벗어나는 염기는 A, C, G 또는 T로 대체되고, 나머지 다른 염기는 감지 영역 내에 변하지 않은 채로 유지되기 때문에, K-mer 문제를 완화시킨다. 예를 들어, ACGT와 같은 4량체의 경우, A가 벗어나면, CGT가 레지스터를 변경하여 새로운 염기가 들어오게 되고, 새로운 4량체는 CGTT, CGTA, CGTC 또는 CGTG만 될 수 있지만, 실제로 4가지 뉴클레오타이드 유형에서 형성될 수 있는 K-mer는 44(256)개가 된다. 따라서, 새로운 K-mer에 대한 가능성 목록은 256개에서 단 4개로 감소되어, 축퇴 신호 가능성이 감소하게 된다.
또한, 주형 DNA 내 동종중합체 스트레치가 나노공극 감지 영역(예를 들어, 특정 나노공극 유형에 대한 K-mer 길이)보다 긴 나노공극을 통해 전위하는 경우, 현재 가닥 시퀀싱 방법은 주형 DNA가 전위되었다는 표시가 없기 때문에 동종중합체 길이를 정확하게 결정할 수 없다. 이러한 경우, 동종중합체가 나노공극을 통과하는 시간의 길이가 동종중합체의 길이를 추론하는 데(단위 시간당 평균 뉴클레오타이드 수를 시간과 곱하는 방식으로) 사용되도록 시도되어 왔다. 하지만, 전위 효소는 일정한 속도로 이동하지 않기 때문에, 시간만으로는 동종중합체의 길이를 결정하는 데 충분한 정확도를 제공하지 못할 수 있다. 실제로, 전위 효소가 이동하는 속도는 충분히 제어될 수 없고, 뉴클레오타이드당 시간은 일정하지 않을 수 있기 때문에, 일부 전위 사건은 극도로 빠르게 발생할 수 있고, 가닥 시퀀싱을 사용하여 검출하기에는 너무 짧을 수 있다. 결과적으로, 결실 오류가 발생할 수 있다.
본 발명의 주제는 가닥 시퀀싱과 관련된 이러한 임의의 및 모든 문제를 완화시키며, 실제로 가닥 시퀀싱과 비교하여 크게 증강된 정확도, 제어 가능성 및 반복성을 제공하는 것으로 여겨진다.
예를 들어, 도 1a 내지 도 1h를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 회로(160)는 이중체(154)와 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 부분(156)의 조합뿐 아니라, 사용되는 특정 측정 조건 세트에 기반한 신호를 측정한다. 따라서 측정되는 정보는, 예를 들어 가닥 시퀀싱의 경우에서와 같이 단일 측정 조건 세트 하에서의 배타적으로 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 대한 정보보다 훨씬 더 풍부하다.
3' 말단(153)에의 뉴클레오타이드의 부가를 확인하기 위해 본원에 기재된 방법을 사용함으로써, 동종중합체 문제가 해결된다. 예를 들어, 새로운 염기가 이중체(154)의 3' 말단(153)에 부가될 때마다(예를 들어, 도 1b와 도 1d를 참조로 기재된 바와 같음), 식별 가능한 신호가 생성되며(예를 들어, 도 1a, 도 1c 및 도 1e를 참조로 기재된 바와 같음), 이를 통해 단일 뉴클레오타이드가 부가되었다는 것을 확인할 수 있다. 상이하고, 순차적으로 부가된 뉴클레오타이드의 신호가 충분히 유사하거나 동일한 경우, 폴리뉴클레오타이드(150)의 동종중합체 스트레치가 시퀀싱되고 있다고 추론할 수 있다. 나아가, 폴리뉴클레오타이드(150)의 소정의 동종중합체 스트레치 내 상이한 뉴클레오타이드는 상이한 전기적 특성 측정값을 산출할 수 있는 데, 이러한 뉴클레오타이드가 각각 동종중합체 스트레치 외부의 다른 상이한 뉴클레오타이드와 상이한 근접성을 가질 수 있기 때문이다. 따라서, 동종중합체 내 동일한 유형의 뉴클레오타이드인 경우에도 회로(160)가 측정하는 값을 사용하여 개별적으로 식별될 수 있다.
나아가, 도 1a를 참조로 기재된 바와 같은 본 발명의 측정 동안, 회로(160)가 3' 말단(153)을 개구부(113)에서 유리시키고, 3' 말단(153)에 또 다른 뉴클레오타이드를 부가하는 데 사용하기 위해 3' 말단을 유체, 폴리머라아제 및 뉴클레오타이드에 접근 가능하게 만드는 반대되는 힘을 가할 때까지, 3' 말단(153)(폴리뉴클레오타이드(140)의 3' 말단 포함)은 개구부(113) 내에서 격리될 수 있거나, 다르게는 또 다른 뉴클레오타이드의 부가를 위해 접근이 불가능할 수 있다.
본 발명의 시스템과 방법이 시퀀싱 과정의 탁월한 제어를 제공하기 때문에, 효소 속도 문제도 해결된다. 예를 들어, 회로(160)는 폴리머라아제(105)가 또 다른 뉴클레오타이드를 부가하는 것을 저해하면서, 목적하는 SNR(예를 들어, 선결된 임계값을 초과하는 SNR)을 달성하도록 측정 작업의 기간을 전자적으로 제어할 수 있다. 나노공극(110)을 통한 폴리뉴클레오타이드(150)의 전위 또한 회로(160)를 사용하여 전자적으로 제어되기 때문에, 가닥 시퀀싱의 경우에서와 같이 매우 빠른 전위 사건을 검출할 수 없으며, 결실 또는 정확도에 영향을 미치는 다른 유형의 오류로 이어질 수 있는 전위 효소의 가변적인 동역학에 영향을 받지 않는다.
예를 들어, 도 8a 내지 도 8e는, 도 1a 내지 도 1h의 시스템을 사용하여 측정될 수 있는 예시적인 전기적 특성 값을 예시한 것이다. 보다 구체적으로, 도 8a는, 각각, 도 1a, 도 1c 및 도 1e를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 염기쌍 G(153) C(150에 있으며, 153과 쌍을 이룸)(본원에서 "GC"로 지칭됨), T(153) A(150에 있으며, 153과 쌍을 이룸)(본원에서 "TA"로 지칭됨) 및 A(153) T(150에 있으며, 153과 쌍을 이룸)(본원에서 "AT"로 지칭됨)가 각각 이중체(154)의 3' 말단(153)에 위치하게 되어, 뉴클레오타이드 서열 A-T, T-G 및 G-C가 각각 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 부분(156)에 위치하게 되는 바와 같이, 제1 측정 조건 세트 하에서 측정될 수 있는 예시적인 일련의 값을 예시한 것이다. 도 8a에 예시된 바와 같이, 첫 번째 값은 GC와 A-T의 조합에 대해 측정된 것이고(도 1a), 두 번째 값은 TA와 T-G의 조합에 대해 측정된 것이고(도 1c), 세 번째 값은 AT와 G-C의 조합에 대해 측정된 것이다(도 1e). 이중체(154)의 3' 말단(153)에 있는 특정 유형의 뉴클레오타이드와 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 부분(156)에 위치한 뉴클레오타이드 서열은 나노공극(110)을 통한 이온 전류(및/또는 이온 전류의 변동)에 영향을 미칠 수 있기 때문에 측정값에 영향을 미칠 수 있다.
실제로, 이중체(154) 내에 있고 이중체(154)의 3' 말단(153)에서 이격되어 있는 특정 유형의 쌍을 이룬 뉴클레오타이드, 및/또는 폴리뉴클레오타이드(150) 내에 있고 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 부분(156)에서 이격되어 있는 특정 유형의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드도 나노공극(110)을 통한 이온 전류(및/또는 이온 전류 또는 다른 노이즈의 변동)에 영향을 미칠 수 있기 때문에 측정값에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 도 8b는, 각각, 도 1a, 도 1c 및 도 1e를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로(단, C*는 뉴클레오타이드 유사체, 예를 들어 메틸화된 시토신임), 염기쌍 GC, TA 및 AT가 각각 이중체(154)의 3' 말단(153)에 위치하게 되어, 뉴클레오타이드 서열 A-T, T-G 및 G-C*가 각각 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 부분(156)에 위치하게 되는 바와 같이, 제1 측정 조건 세트 하에서 다시 측정될 수 있는 예시적인 일련의 값을 예시한 것이다. 도 8b에 예시된 바와 같이, 첫 번째 값은 GC와 A-T의 조합에 대해 측정된 것이고(도 1a), 두 번째 값은 TA와 T-G의 조합에 대해 측정된 것이고(도 1c), 세 번째 값은 AT와 G-C*의 조합에 대해 측정된 것이다(도 1e). 도 8b에서의 첫 번째 값은, 예를 들어 C*가 3개 염기만큼 이중체의 3' 말단에서 분리되어 있어 나노공극(110)을 통한 이온 전류에 유의한 영향을 미치지 않을 수 있기 때문에, 도 8a에서의 첫 번째 값과 유사할 수 있다. 도 8b에서의 두 번째 값은, 예를 들어 C*가 2개 염기만큼 이중체의 3' 말단에서 분리되어 있지만, 메틸화되지 않은 C가 이러한 전류에 영향을 미칠 수 있는 정도에 비해 나노공극(110)을 통한 이온 전류에 다소 영향을 미칠 수 있기 때문에, 도 8a에서의 두 번째 값과 다소 상이할 수 있다. 도 8b에서의 세 번째 값은, 예를 들어 C*가 이중체의 3' 말단에 바로 인접하여, 메틸화되지 않은 C가 이러한 전류에 영향을 미칠 수 있는 정도에 비해 나노공극(110)을 통한 이온 전류에 유의하게 영향을 미칠 수 있기 때문에, 도 8a에서의 세 번째 값과 유의하게 상이할 수 있다.
상이한 측정 조건 세트는 또한 이중체(154)의 3' 말단(153) 내 뉴클레오타이드와 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 부분(156) 내 뉴클레오타이드의 상이한 조합에 대해 측정된 값에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 도 1g를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 회로(160)를 사용하여 상이한 힘을 가하면 이중체(154)의 3' 말단(153)과 폴리뉴클레오타이드(150)의 제2 부분(156)이 나노공극(110)에 대해 상이한 위치로 이동할 수 있으며, 이러한 위치에서 이중체(154)와 폴리뉴클레오타이드(150) 내 뉴클레오타이드는 또 다른 위치에(또 다른 힘 하에) 있는 것들과 상이하게 이온 전류(및/또는 이온 전류 또는 다른 노이즈의 변동)에 영향을 미칠 수 있다. 측정 조건의 변화는 측정값에 선형으로 또는 비선형으로 영향을 미칠 수 있으며, 실제로 이중체(154)의 3' 말단(153) 내 뉴클레오타이드와 폴리뉴클레오타이드(150)의 제2 부분(156) 내 뉴클레오타이드의 상이한 조합에 대해 상이한 방향으로 측정값을 변경시킬 수 있다.
예를 들어, 도 8c는, 각각, 도 1a, 도 1c 및 도 1e를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 염기쌍 GC, TA 및 AT가 각각 이중체(154)의 3' 말단(153)에 위치하게 되어, 뉴클레오타이드 서열 A-T, T-G 및 G-C가 각각 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 부분(156)에 위치하게 되는 바와 같이, 제1 측정 조건 세트와 상이한 제2 측정 조건 세트 하에서 측정될 수 있는 예시적인 일련의 값을 예시한 것이다. 도 8c에 예시된 바와 같이, 첫 번째 값은 GC와 A-T의 조합에 대해 측정된 것이고(도 1a), 두 번째 값은 TA와 T-G의 조합에 대해 측정된 것이고(도 1c), 세 번째 값은 AT와 G-C의 조합에 대해 측정된 것이다(도 1e). 서열이 동일한 경우에도 도 8c에서의 첫 번째 값은 도 8a에서의 첫 번째 값과 상이할 수 있고, 도 8c에서의 두 번째 값은 도 8a에서의 두 번째 값과 상이할 수 있고, 도 8c에서의 세 번째 값은 도 8a에서의 세 번째 값과 상이할 수 있는 데, 이는, 예를 들어 제2 측정 조건 세트가 각각의 뉴클레오타이드 조합에 대해 제1 측정 조건 세트와 상이한 방식으로 나노공극(110)을 통한 이온 전류에 영향을 미치기 때문이다. 이러한 비제한적인 예에서, 제2 측정 조건 세트는 제1 측정 조건 세트 하에서의 값과 비교하여 첫 번째 값을 감소시키고, 두 번째 값을 증가시키며, 세 번째 값을 증가시킨다.
측정값이 재현성이 높고 정확하기 때문에, 둘 이상의 상이한 측정 조건 세트 하에서 동일한 폴리뉴클레오타이드(150)를 시퀀싱하는 경우에도 사용되는 특정 측정 조건과 비선형적으로 관련이 있을 수 있는 일련의 상이한 측정값을 제공할 수 있지만, 각각의 이러한 일련의 측정값이 폴리뉴클레오타이드(150)에서 뉴클레오타이드 서열을 식별하는 데 신뢰할 만하게 사용될 수 있다고 예상된다. 실제로, 도 9를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 폴리뉴클레오타이드(150)는 상이한 측정 조건 세트 하에서 수차례 시퀀싱될 수 있고/있거나, 단일 회차의 폴리뉴클레오타이드(150) 시퀀싱 동안 다수의 조건 세트를 사용하여 시퀀싱될 수 있으며, 서열을 서로 비교하여 서열의 정확도를 추가로 개선시킬 수 있다.
상기에 추가로 언급된 바와 같이, 본 발명의 시스템과 방법의 다수의 양태는 동종중합체 문제를 다룬다. 하나의 이러한 양태는, 중합체의 소정의 부분 내에서 얻을 수 있는 특정 신호 값에 대한, 이중체와 주변 뉴클레오타이드로부터의 신호의 기여이다. 예를 들어, 도 8d는, GC 염기쌍이 초기에 이중체의 3' 말단에 위치하고, 여기에 뉴클레오타이드 TTT가 순차적으로 부가되어 염기쌍 TA, TA, TA가 순차적으로 이중체의 3' 말단에 위치하게 되고, 폴리뉴클레오타이드 서열 A-A, A-A 및 A-G가 순차적으로 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 부분(156) 내에 위치하게 되는, 폴리뉴클레오타이드(150) 내 폴리뉴클레오타이드 서열 CAAAG에 대해 측정될 수 있는 예시적인 일련의 값을 예시한 것이다. 도 8d에 예시된 바와 같이, 제1 측정 조건 세트 하에서, 첫 번째 값은 GC와 A-A의 조합에 대해 측정된 것이고, 두 번째 값은 TA와 A-A의 조합에 대해 측정된 것이고, 세 번째 값은 TA와 A-A의 조합에 대해 측정된 것이고, 네 번째 값은 TA와 A-G의 조합에 대해 측정된 것이다. 이중체(154)의 3' 말단(153)에 있는 특정 유형의 뉴클레오타이드와 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 부분(156)에 위치한 뉴클레오타이드 서열은 나노공극(110)을 통한 이온 전류(및/또는 이온 전류의 변동)에 영향을 미칠 수 있기 때문에 측정값에 영향을 미칠 수 있다. 실제로, 이중체(154) 내에 있고 이중체(154)의 3' 말단(153)에서 이격되어 있는 특정 유형의 쌍을 이룬 뉴클레오타이드, 및/또는 폴리뉴클레오타이드(150) 내에 있고 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 부분(156)에서 이격되어 있는 특정 유형의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드도 나노공극(110)을 통한 이온 전류(및/또는 이온 전류의 변동)에 영향을 미칠 수 있기 때문에 측정값에 영향을 미칠 수 있다.
예를 들어, 제1 측정과 제2 측정 동안, A-A는 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 부분(156) 내에 위치하지만, 이중체(154)의 3' 말단(153)에 있는 상이한 염기쌍 GC 및 TA의 존재는 첫 번째 A-A를 두 번째 A-A와 용이하게 구별할 수 있게 하는 신호 기여를 제공한다. 나아가, 제2 측정과 제3 측정 동안, TA는 이중체(154)의 3' 말단(153)에 위치하고 A-A는 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 부분(156) 내에 위치하지만, 이중체(154) 내에 있고 이중체(154)의 3' 말단(153)에서 이격되어 있는 위치에 있는 상이한 염기쌍, 및/또는 폴리뉴클레오타이드(150) 내에 있고 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 부분(156)에서 이격되어 있는 상이한 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드의 존재는, TA와 A-A의 첫 번째 조합을 TA와 A-A의 두 번째 조합과 용이하게 구별할 수 있게 하는 신호 기여를 제공한다.
따라서, 이중체(154)의 상이한 부분 및/또는 폴리뉴클레오타이드(150) 서열 내 추가의 쌍을 이루지 않은 염기로부터의 신호 기여는 동종중합체 서열에서 서로 상이한 뉴클레오타이드를 구별하는 데 사용될 수 있다고 이해될 것이다. 이와 관련하여, 다시 도 1f와 도 1g를 참조로, M 및/또는 D의 값이 클수록, 소정의 시간에 판독될 수 있는 서열 또는 "단어"가 길수록, 용이하게 판독될 수 있는 동종중합체 스트레치가 길수록, 동종중합체의 뉴클레오타이드를 서로 구별할 수 있는 신호에 더 많은 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드 및/또는 이중체 염기쌍이 기여할 수 있다. 도 8d에 예시된 일련의 측정이 상이한 측정 조건 세트 하에서 반복되어, 동종중합체 서열 내 뉴클레오타이드를 상이한 방식으로 서로 구별할 수 있는 상이한 값의 세트를 얻을 수 있다고 이해될 것이다.
뉴클레오타이드 및/또는 이중체 염기쌍의 상이한 조합이 나노공극을 통한 이온 전류의 크기에 영향을 미칠 수 있지만, 이러한 조합은 또한 또는 대안적으로 나노공극을 통한 이온 전류의 변동 또는 노이즈에 영향을 미칠 수 있다. 회로(160)는 이러한 변동 또는 노이즈를 측정하고, 이러한 변동 또는 노이즈의 측정값을 뉴클레오타이드를 식별하는 데 사용할 수 있다. 이와 같이, 변동은 이중체(154)의 3' 말단(153)과 폴리뉴클레오타이드(150)의 제2 부분(156)의 전기적 특성인 것으로 간주될 수 있지만, 이러한 변동에서 얻은 정보와 측정의 크기에서 얻은 정보 사이의 특정 차이점에 대한 논의를 용이하게 하기 위해 이러한 변동은 때때로 또 다른 측정 크기의 "표준편차"로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 도 8e는, 도 8d를 참조로 기재된 동일한 서열에 대해 측정될 수 있는 예시적인 일련의 표준편차 값을 예시한 것이다. 도 8e에 예시된 바와 같이, 제1 측정 조건 세트 하에서, 첫 번째 표준편차 값은 GC와 A-A의 조합에 대해 측정된 것이고, 두 번째 표준편차 값은 TA와 A-A의 조합에 대해 측정된 것이고, 세 번째 표준편차 값은 TA와 A-A의 조합에 대해 측정된 것이고, 네 번째 표준편차 값은 TA와 A-G의 조합에 대해 측정된 것이다. 이중체(154)의 3' 말단(153)에 있는 특정 유형의 뉴클레오타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 부분(156)에 위치한 뉴클레오타이드 서열 내 특정 유형의 뉴클레오타이드는 나노공극(110)을 통한 이온 전류의 변동에 영향을 미칠 수 있기 때문에 측정된 표준편차 값에 영향을 미칠 수 있다. 실제로, 이중체(154) 내에 있고 이중체(154)의 3' 말단(153)에서 이격되어 있는 특정 유형의 뉴클레오타이드, 및/또는 폴리뉴클레오타이드(150) 내에 있고 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 부분(156)에서 이격되어 있는 특정 유형의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드도 이온 전류의 변동에 영향을 미칠 수 있기 때문에 측정된 표준편차 값에 영향을 미칠 수 있다. 이와 같이, 측정값의 표준편차는 폴리뉴클레오타이드(150)의 서열을 식별하기 위해 단독으로 사용되거나 측정값의 크기와 함께 사용될 수 있다. 도 8e에 예시된 일련의 측정이 상이한 측정 조건 세트 하에서 반복되어, 동종중합체 서열(또는 임의의 다른 서열) 내 뉴클레오타이드를 상이한 방식으로 서로 구별할 수 있는 상이한 표준편차 값의 세트를 얻을 수 있다고 이해될 것이다.
예를 들어, 본원에 제공된 바와 같이, 도 8a 내지 도 8e를 참조로 기재된 바와 같은 측정은 측정값(이들은 각각 임의의 목적하는 정확도 수준을 가질 수 있고 임의의 적합한 측정 조건 세트 하에서 얻을 수 있음)을 이중체(154) 내 서열과 폴리뉴클레오타이드(150)의 제2 부분 내 서열의 상이한 조합과 상관시키는 N차원 "판독 맵"과 같은 데이터 구조를 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 9는, 도 1a 내지 도 1h의 시스템을 사용하여 뉴클레오타이드를 식별하는 데 사용될 수 있는 전기적 특성의 예시적인 N차원 판독 맵을 예시한 것이다. 도 9에 예시된 비제한적인 예에서, 판독 맵(900)은 제1 유형의 측정값에 해당하는 제1 축, 제2 유형의 측정값에 해당하는 제2 축(예를 들어, 제1 축과 동일한 유형의 측정값의 표준편차), 및 상이한 측정 사이에서 달라질 수 있는 소정의 측정 조건에 해당하는 제3 축을 포함한다. 예시적으로, 측정 조건은 도 1a, 도 1c, 도 1e 및 도 1f를 참조로 기재된 바와 같이 제1 힘(F1)을 가하는 것이거나 이를 포함할 수 있고, 측정 조건은 도 1g를 참조로 기재된 바와 같이 변형된 제1 힘(F1')을 가하는 방식으로 달라질 수 있으며(도 9의 각각의 축에 따라 변경됨), 이는 나노공극(110)에 대해 이중체(154)의 3' 말단(153)을 상이하게 위치시켜 하나 이상의 측정값 및/또는 이온 전류의 노이즈 또는 변동, 예를 들어 동일하거나 상이한 하나 이상의 측정값의 표준편차의 변화를 야기한다.
도 9에 예시된 N차원 판독 맵(900)은, 선험적으로 알려진 서열인 충분한 수의 상이한 폴리뉴클레오타이드가 도 1a 내지 도 1e를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로 측정 작업과 뉴클레오타이드 부가 작업을 사용하여 시퀀싱되는 보정 절차를 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 보정 절차는 시스템별로 수행될 수 있거나, 판독 맵(900) 내 포인트가 복수의 시스템 각각에 대략 동일하게 적용되는 방식으로 수행될 수 있기 때문에, 각각의 시스템은 자체 판독 맵을 생성하기 위해 개별적으로 보정될 필요가 없다. 예를 들어, 제1 측정 조건에서, 회로(160)는 뉴클레오타이드 부가 단계 사이에서, 이중체(154)의 3' 말단(153)과 폴리뉴클레오타이드(150)의 제2 부분(156)의 하나 이상의 전기적 특성 값, 예컨대 나노공극(110)에 걸친 전류, 이온 전류, 전기 저항 또는 전압 강하, 및/또는 이러한 전기적 특성 중 하나 이상의 표준편차를 측정할 수 있다. 회로(160)는 측정값과 측정 조건을 비휘발성 컴퓨터 판독 가능한 매체(예를 들어, 메모리)에 저장할 수 있으며, 이러한 정보 세트는 판독 맵(900) 내 포인트의 제1 평면을 채우는 것으로 간주될 수 있다. 이어서, 제2(상이한) 측정 조건에서, 회로(160)는 뉴클레오타이드 부가 단계 사이에서, 이중체(154)의 3' 말단(153)과 폴리뉴클레오타이드(150)의 제2 부분(156)의 하나 이상의 전기적 특성 값, 및/또는 이러한 전기적 특성 중 하나 이상의 표준편차를 측정할 수 있다. 회로(160)는 측정값과 측정 조건을 컴퓨터 판독 가능한 매체(예를 들어, 메모리)에 저장할 수 있으며, 이러한 정보 세트는 판독 맵(900) 내 포인트의 제2 평면을 채우는 것으로 간주될 수 있다. 측정값 및 각각의 측정 조건을 측정하고 저장하는 이러한 작업은 판독 맵(900)을 목적하는 수의 차원으로 제공하기 위해 임의의 적합한 횟수만큼 반복될 수 있다.
판독 맵(900)에 저장되는 각각의 포인트에 대해, 회로(160)는 또한 폴리뉴클레오타이드의 서열이 선험적으로 알려져 있기 때문에 해당 신호에 기여할 수 있는 것으로 알려진 뉴클레오타이드(들) 서열의 정체성과 각각의 위치를 저장할 수 있다. 예를 들어, 판독 맵(900)에 저장되는 각각의 포인트에 대해, 회로(160)는 적어도 도 1f에 예시된 4번, 4'번, 5번 및 6번 뉴클레오타이드 서열의 정체성과 위치를 저장할 수 있다. 선택적으로, 회로(160)는 또한 3번 및 3'번 뉴클레오타이드의 정체성을 저장할 수 있다. 추가 옵션으로서, 회로(160)는 또한 2번 및 2'번 뉴클레오타이드 서열의 정체성과 위치를 저장할 수 있다. 또 다른 추가 옵션으로서, 회로(160)는 또한 1번 및 1'번 뉴클레오타이드 서열의 정체성과 위치를 저장할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 회로(160)는 또한 7번 뉴클레오타이드 서열의 정체성과 위치를 저장할 수 있다. 추가 옵션으로서, 회로(160)는 또한 8번 뉴클레오타이드 서열의 정체성과 위치를 저장할 수 있다. 측정된 신호에 기여할 수 있으며, 따라서 판독 맵(900) 내에 저장될 수 있는 뉴클레오타이드의 수와 위치의 비제한적인 예는, 도 1f와 도 1g를 참조로 기재되어 있다.
순수하게 예시적인 예로서, 제1 측정 조건 세트(예를 들어, 도 1a에 예시된 제1 힘(F1))에서 나노공극(110)을 통한 전류의 측정값 및 표준편차에 의해 정의되는 판독 맵 내 포인트(911)와, 제2 측정 조건 세트(예를 들어, 도 1g를 참조로 기재된 변형된 제1 힘(F1'))에서의 동일한 측정에 해당하는 포인트(911')의 경우, 회로(160)는 뉴클레오타이드와 이의 위치를 G C A T와 같은 형식으로 저장할 수 있으며, 여기서 관례상, 첫 번째 열거된 뉴클레오타이드는 이중체(154)의 3' 말단(153)에 위치한 4'번 뉴클레오타이드에 해당하고, 두 번째 열거된 뉴클레오타이드는 4'번 뉴클레오타이드의 염기쌍인 4번 뉴클레오타이드에 해당하고, 세 번째 열거된 뉴클레오타이드는 쌍을 이루지 않고 있으며 염기쌍에 인접한 5번 뉴클레오타이드에 해당하고, 네 번째 열거된 뉴클레오타이드는 쌍을 이루지 않고 있으며 5번 뉴클레오타이드에 인접한 6번 뉴클레오타이드에 해당하는 것으로 정의된다. 유사하게, 제1 측정 조건 세트(예를 들어, 도 1c에 예시된 제1 힘(F1))에서 나노공극(110)을 통한 전류의 측정값 및 표준편차에 의해 정의되는 판독 맵 내 포인트(912)와, 제2 측정 조건 세트(예를 들어, 도 1g를 참조로 기재된 변형된 제1 힘(F1'))에서의 동일한 측정에 해당하는 포인트(912')의 경우, 회로(160)는 동일한 관례를 사용하여 뉴클레오타이드와 이의 위치를 T A T G와 같은 형식으로 저장할 수 있다. 물론, 임의의 다른 적합한 형식이 사용될 수 있고, 임의의 적합한 수의 뉴클레오타이드가 포함될 수 있으며, 이의 정체성과 위치는 임의의 적합한 방식으로 나타낼 수 있다.
메틸화된 염기 또는 다른 변형된 뉴클레오타이드가 폴리뉴클레오타이드 내 선험적으로 알려진 위치에 포함될 수 있으며, 보정 절차가 수행될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 도 1h와 도 8c를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 이러한 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 서열에서 측정된 값 중 하나 이상은 변형되지 않은 뉴클레오타이드를 포함하는 서열에서 측정된 값과 상이할 수 있다. 회로(160)가 저장하는 뉴클레오타이드의 정체성은 뉴클레오타이드가 변형되었는지 여부와 변형된 방식의 적합한 표시를 포함할 수 있다. 예를 들어, 판독 맵(900) 내 포인트(913)는 3' 말단에 AT, 5번 위치에 G 및 6번 위치에 메틸시토신(C*)을 포함하는 서열에 대한, 제1 측정 조건 세트(예를 들어, 제1 힘(F1))에서의 나노공극(910)을 통한 전류의 측정값 및 표준편차에 의해 정의될 수 있다. 포인트(913)는 판독 맵(900)에서 시토신이 변형되지 않은 또 다른 포인트와 상이한 위치를 가질 수 있을 뿐 아니라, 시토신이 상이한 유형의 변형을 포함하는 또 다른 포인트와 상이한 위치를 가질 수 있다.
판독 맵(900)에 복수의 측정값 축(예를 들어, 측정값과 표준편차 둘 모두)을 포함시키면 회로(160)가 뉴클레오타이드를 식별하는 정확도를 증강시킬 수 있지만, 일부 예에서는 단일 유형의 측정값에 해당하는 단일의 이러한 축만 판독 맵(900)에 포함된다고 이해될 것이다. 반대로, 판독 맵(900)은 임의의 적합한 차원의 수, 예를 들어 측정값의 임의의 적합한 수와 유형, 측정값의 표준편차, 측정 조건(예컨대, 온도, 염 농도 및/또는 pH와 같은 유체 조성, 플로우 셀 내 위치), 나노공극의 유형(예를 들어, 이의 변이체), 폴리머라아제의 유형(예를 들어, 이의 변이체), 뉴클레오타이드 변형 등에 해당하는 축을 포함할 수 있다.
판독 맵(900)(또는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 다른 적합한 데이터 구조)는 회로(160)와 작동 가능하게 통신하는 비휘발성 컴퓨터 판독 가능한 메모리에 저장될 수 있으며, 회로(160)는, 예를 들어 뉴클레오타이드가 이중체(154)의 3' 말단(153)에 부가됨에 따라, 폴리뉴클레오타이드(150)의 서열에서 개별 뉴클레오타이드를 식별하기 위해 반복적으로 판독 맵을 사용할 수 있다. 예를 들어, 도 1a, 도 1c 및 도 1e를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 회로(160)는 소정의 측정 조건 세트 하에서 이중체(154)의 3' 말단(153)과 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 부분(156)의 하나 이상의 전기적 특성 값을 측정할 수 있다. 일부 예에서, 회로(160)는 알려지지 않은 서열에 대해 측정된 값을 선험적으로 알려진 서열에 대해 이전에 측정되었던 값과 비교하는 것을 용이하게 하기 위해, 판독 맵(900)이 포인트를 함유하는 측정 조건 세트를 사용하여 프로그래밍될 수 있다. 일부 예에서, 회로(160)는 판독 맵에서 해당 측정 조건 세트에 해당하는 포인트 세트(예를 들어, 평면)를 찾을 수 있고, 측정값(들)을 판독 맵 내 해당 값의 세트와 비교할 수 있으며, 이러한 비교에 기반하여 측정값에 근접한 해당 세트 내 값 또는 값의 조합을 선택할 수 있다. 이어서, 선택된 값(들)에 대하여, 회로(160)는 보정 단계 동안 값(들)을 생성하는 뉴클레오타이드의 정체성과 위치를 검색할 수 있다. 예시적으로, 회로(160)는 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 측정값(들)이 판독 맵(900) 내 포인트(911)에 대한 값(들)에 크기가 가장 근접하다고 결정할 수 있다. 이러한 비교에 기반하여, 회로(160)는 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드 서열이 이중체(154)의 3' 말단(153)에 GC 염기쌍(각각, 4'번 및 4번 위치), 5번 위치에 A 및 6번 위치에 T를 포함한다고 결정할 수 있다. 이러한 결정은 "염기 호출(base call)"로 지칭될 수 있다.
하지만, 선택사항이기는 하지만, 회로(160)는 염기 호출을 생성하기 위해 판독 맵(900)에서 단일 포인트를 사용하는 것에 제한되지 않는다는 점에 유의해야 한다. 대신, 회로(160)는 염기 호출의 정확도를 유의하게 증강시키기 위해 판독 맵 내 다수의 포인트를 사용할 수 있다. 예를 들어, 도 1a, 도 1b 및 도 1c의 비교를 통해 이해할 수 있는 바와 같이, 이중체(154)의 3' 말단(153)에 부가되는 뉴클레오타이드는 단일 뉴클레오타이드만큼 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 부분(156)을 위쪽으로 이동시킨다. 이와 같이, 도 1a 내 단일 가닥 제2 부분(156)의 서열과 도 1c 내 단일 가닥 제2 부분(156)의 서열은 적어도 하나의 뉴클레오타이드만큼(이러한 예에서, 도 1a 내 6번 위치에서 도 1c 내 5번 위치로 이동하는 T) 서로 중첩된다. 회로(160)는 도 1a의 시점에서 이루어진 측정의 염기 호출을 도 1c의 시점에서 이루어진 측정의 염기 호출과 비교하여, 동일한 뉴클레오타이드(들)가 존재하지만 단일 뉴클레오타이드만큼 위치가 이동되었는지 여부를 확인할 수 있으며, 단 (i) 도 1b에 예시된 작업에서 단일 뉴클레오타이드가 부가되었던 경우와 (ii) 도 1a와 도 1c에 대해 생성된 염기 호출이 모두 정확했던 경우이여야 한다. 이러한 비교에 기반하여, 회로(160)가, 뉴클레오타이드의 부가 사이의 염기 호출이 서로 일치한다고 결정하는 경우(예를 들어, 하나의 뉴클레오타이드만큼 이동된 서열을 함유함), 회로(160)는 시퀀싱 과정으로 진행할 수 있다. 반면, 회로(160)가, 이러한 염기 호출이 서로 일치하지 않는다고 결정하는 경우, 회로는 서열의 이러한 부분을 오류를 함유하는 것으로 표시할 수 있으며, 염기 호출을 다시 생성하거나, 또는 심지어 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 방식으로 폴리뉴클레오타이드를 재시퀀싱하도록 시도할 수 있다. 충분히 긴 동종중합체 스트레치의 경우, 신호의 임의의 변화가 반드시 있지 않을 수도 있다는 점에 유의해야 한다. 이러한 경우, 본 발명의 시스템 및 방법에 의해 제공된 다른 정보는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 방식으로 여전히 뉴클레오타이드의 개별 부가를 확인하는 데 사용될 수 있다.
회로(160)는 또한 또는 대안적으로, 판독 맵(900) 내 가장 가까운 포인트의 위치를 찾기 위해 다수의 측정을 사용할 수 있다. 예를 들어, 회로(160)는 선험적으로 알려진 서열에 대해 이전에 측정되었던 값과 알려지지 않은 서열에 대해 측정된 값을 비교하는 것을 용이하게 하기 위해, 동일한 서열에 대한 것이지만, 판독 맵(900)이 포인트를 함유하는 제2의 상이한 측정 조건 세트를 사용하여 또 다른 염기 호출을 생성할 수 있다. 회로(160)는 제1 측정 조건 세트를 부과한 직후 제2 측정 조건 세트를 부과할 수 있으며, 예를 들어 제1 힘(F1)을 가하고 난 후, 또 다른 뉴클레오타이드를 부가하기 전에 변형된 제1 힘(F1')을 가할 수 있다. 대안적으로, 회로(160)는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 방식으로 폴리뉴클레오타이드(150)를 재시퀀싱하는 동안 제2 측정 조건 세트를 부과할 수 있다. 회로(160)는 제1 측정 조건 세트로 수행된 측정의 염기 호출을 동일한 측정 조건 세트로 수행된 측정의 염기 호출과 비교하여, 동일한 뉴클레오타이드(들)가 두 개의 염기 호출에서 모두 동일한 위치에 존재하는지 여부를 확인할 수 있으며, 단, 이는 두 개의 염기 호출이 모두 정확했던 경우이어야 한다. 예를 들어, 판독 맵(900) 내 포인트(911과 911')를 사용하여 생성된 염기 호출은 일관될 것이며, 포인트(911)를 사용하여 생성된 염기 호출과 포인트(912')를 사용하여 생성된 염기 호출은 일관될 것이다. 이러한 비교에 기반하여, 회로(160)가, 상이한 측정 조건에 대한 염기 호출이 서로 일치한다고 결정하는 경우(예를 들어, 동일한 서열을 함유함), 회로(160)는 시퀀싱 과정으로 진행할 수 있다. 반면, 회로(160)가, 이러한 염기 호출이 서로 일치하지 않는다고 결정하는 경우, 회로는 서열의 이러한 부분을 오류를 함유하는 것으로 표시할 수 있으며, 염기 호출 중 하나 또는 둘 모두를 다시 생성하거나, 또는 심지어 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 방식으로 폴리뉴클레오타이드를 재시퀀싱하도록 시도할 수 있다.
판독 맵(900)이 설명의 목적으로 그래픽으로 예시되어 있지만, 판독 맵 내 포인트는 적합하게는, 비휘발성 컴퓨터 판독 가능한 매체 내에, 소정의 측정 조건을, 해당 조건 하에서 측정되었던 하나 이상의 값 및 이러한 값을 생성하는 데 사용되었던 이중체 서열과 단일 가닥 서열의 조합과 상관시키는 임의의 적합한 형식으로 저장될 수 있음을 이해해야 한다. 룩업 테이블(LUT)은 측정값과, 이러한 값을 생성하는 데 사용되었던 이중체 서열과 단일 가닥 서열의 알려진 조합 사이의 상관관계를 저장하는 데 사용될 수 있는 형식의 비제한적인 일례이다. 하지만, 측정값과, 이러한 값을 생성하는 데 사용되었던 이중체 서열과 단일 가닥 서열의 알려진 조합 사이의 상관관계를 저장하는 데 임의의 적합한 데이터 구조가 사용될 수 있다고 이해될 것이다. 예를 들어, 데이터 구조는 기계 학습 알고리즘에 의해 생성될 수 있으며, 사용을 위해 기계 학습 알고리즘에 의해 적절하게 저장될 수 있다. 예를 들어, 데이터 구조는 각각의 해당하는 소정의 측정 조건 세트 하에서 얻어지며 이중체 서열과 단일 가닥 서열의 각각의 조합에 해당하는 것으로 선험적으로 알려진 값을 인식하는 기계 학습 알고리즘을 훈련시키는 방식으로 생성될 수 있으며, 비휘발성 컴퓨터 판독 가능한 매체 내에 임의의 적합한 형식으로 저장될 수 있다. 이어서, 데이터 구조는 회로(160)에 의해 구현되는 훈련된 기계 학습 알고리즘에 의해 사용되어, 도 1a 내지 도 1h를 참조로 기재된 바와 같이 뉴클레오타이드 부가 단계 사이에서 측정되는 값의 입력에 기반하여, 폴리뉴클레오타이드(150)의 서열에서 뉴클레오타이드를 식별하는 출력을 생성할 수 있다. 기계 학습 알고리즘을 훈련시키기 위해 회로(160)가 사용될 수 있거나, 이후에 회로(160)에 의해 구현되는 기계 학습 알고리즘을 훈련시키기 위해 상이한 회로가 사용될 수 있다고 이해될 것이다. 특정예에서, 데이터 구조는 딥러닝 알고리즘과 같은 신경망에 의해 생성될 수 있으며, 사용을 위해 딥러닝 알고리즘과 같은 신경망에 의해 적절하게 저장될 수 있다. 예를 들어, 데이터 구조는 각각의 해당하는 측정 조건 세트 하에서 얻어지며 이중체 서열과 단일 가닥 서열의 각각의 조합에 해당하는 것으로 선험적으로 알려진 값을 인식하는 신경망(예를 들어, 딥러닝 알고리즘)을 훈련시키는 방식으로 생성될 수 있으며, 비휘발성 컴퓨터 판독 가능한 매체 내에 임의의 적합한 형식으로 저장될 수 있다. 따라서, 데이터 구조는 신경망(예를 들어, 딥러닝 알고리즘)의 뉴런을 포함할 수 있다. 이어서, 데이터 구조는 회로(160)에 의해 구현되는 훈련된 신경망(예를 들어, 딥러닝 알고리즘)에 의해 사용되어, 도 1a 내지 도 1h를 참조로 기재된 바와 같이 뉴클레오타이드 부가 단계 사이에서 측정되는 값의 입력에 기반하여, 폴리뉴클레오타이드(150)의 서열에서 뉴클레오타이드를 식별하는 출력을 생성할 수 있다. 신경망(예를 들어, 딥러닝 알고리즘)을 훈련시키기 위해 회로(160)가 사용될 수 있거나, 이후에 회로(160)에 의해 구현되는 신경망(예를 들어, 딥러닝 알고리즘)을 훈련시키기 위해 상이한 회로가 사용될 수 있다고 이해될 것이다.
본원에 기재된 바와 같은 작업, 예를 들어 값을 측정하고, 뉴클레오타이드를 부가하고, 뉴클레오타이드를 식별하는 작업은 하드웨어와 소프트웨어의 임의의 적합한 조합을 사용하여 실행될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 예를 들어, 도 10은, 본원에 제공된 바와 같은 방식으로 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하기 위한 예시적인 회로(160)를 예시한 것이다. 회로(160)는 프로세서(1040)와 적어도 하나의 컴퓨터 판독 가능한 매체(1030)를 포함할 수 있다. 컴퓨터 판독 가능한 매체(1030)는 나노공극의 개구부 내의 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드의 제1 부분을 포함하는 이중체의 3' 말단과 알려진 폴리뉴클레오타이드의 제2 부분의 전기적 특성의 복수의 측정값(1031)을 저장할 수 있다. 컴퓨터 판독 가능한 매체(1030)는 데이터 구조(1032)(예를 들어, 판독 맵(900) 또는 훈련된 뉴런)를 저장할 수 있으며, 여기서 데이터 구조는 상이한 측정값을, 나노공극(110)의 개구부(113) 내의 알려진 폴리뉴클레오타이드의 제1 부분(155)을 포함하는 이중체(154)의 3' 말단(153) 내 뉴클레오타이드와 알려진 폴리뉴클레오타이드의 제2 부분(156) 내 뉴클레오타이드의 상이한 조합과 상관시킨다. 데이터 구조(1032)는 측정값이 얻어지는 각각의 측정 조건, 예를 들어 측정 동안 제1 힘(F1) 또는 변형된 제1 힘(F1')을 부과하는 데 사용되는 바이어스 전압의 크기를 추가로 식별할 수 있다. 데이터 구조(1032)는 각각의 측정값을 제공한 뉴클레오타이드의 조합(예를 들어, 적어도 도 1f에 예시된 이중체(154)의 3' 말단(153)에서 4번 및 4'번 위치와, 5번 및 6번 위치)을 추가로 식별할 수 있다.
컴퓨터 판독 가능한 매체(1030)는 또한 프로세서(1040)가 본원에 제공된 바와 같은 작업을 실행하도록 하는 명령을 저장할 수 있다. 예를 들어, 명령은 프로세서(1040)가 복수의 측정값을 데이터 구조(예컨대, 판독 맵(900) 또는 훈련된 뉴런) 내 값과 비교하고, 비교를 사용하여 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드 서열에서 뉴클레오타이드 서열을 결정하고, 결정된 뉴클레오타이드 서열의 표현을 출력하기 위한 것일 수 있다. 예시적으로, 명령은 시퀀싱 모듈(1033) 내에 제공될 수 있다. 시퀀싱 모듈(1033)은, 도 1b와 도 1d를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 프로세서(1040)가 이중체(154)의 3' 말단(153)에 뉴클레오타이드를 부가하도록 구성된 뉴클레오타이드 부가 모듈(1034)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 회로(160)는 전극(102와 103)에 작동 가능하게 커플링될 수 있다. 뉴클레오타이드 부가 모듈(1034)은 전극(102와 103)에 걸쳐 적합한 바이어스 전압을 인가하는 방식으로 프로세서(1040)가 제2 힘(F2)을 가하게 할 수 있다. 시퀀싱 모듈(1033)은, 프로세서(1040)가 뉴클레오타이드 부가 작업 사이에, 도 1a, 도 1c 및 도 1e를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 나노공극의 개구부 내의 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드의 제1 부분을 포함하는 이중체(154)의 3' 말단(153)과 알려진 폴리뉴클레오타이드의 제2 부분의 전기적 특성 값을 측정하고, 측정값을 컴퓨터 판독 가능한 매체(1031) 내에 저장하도록 구성된 측정 모듈(1035)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 측정 모듈(1035)은, 프로세서(1040)가 전극(102와 103)에 걸쳐 적합한 바이어스 전압을 인가하는 방식으로 제1 힘(F1) 또는 변형된 제1 힘(F1')을 가하고, 이러한 힘을 가하는 동안 전기적 특성 값을 측정하게 할 수 있다.
회로(160)는 각각 하나 이상의 전기적 특성 값을 측정하도록 구성된 하나 이상의 센서(들)(1010)를 포함할 수 있다. 각각의 센서(1010)는, 예를 들어 나노공극(110)에 걸친 전압 강하, 나노공극(110)을 통한 전류 또는 나노공극(110)에 걸친 전기 저항, 또는 나노공극(110)을 통한 이온 전류의 양에 반응하여 변하는 염료로부터 방출되는 광의 강도를 측정하도록 구성될 수 있다. 선택적으로, 각각의 센서(1010)는 측정 중인 미터법의 표준편차, 예를 들어 나노공극(110)에 걸친 전압 강하의 표준편차, 나노공극(110)을 통한 전류의 표준편차 또는 나노공극(110)에 걸친 전기 저항의 표준편차, 또는 나노공극(110)을 통한 이온 전류의 양에 반응하여 변하는 염료로부터 방출되는 광의 강도의 표준편차를 측정하도록 추가로 구성될 수 있다. 대안적으로, 측정 모듈(1035)은 측정값(1031)의 통계 분석에 기반하여 이러한 미터법의 표준편차를 결정하도록 구성될 수 있다. 측정값(1031)은 측정값이 얻어지는 측정 조건, 예를 들어 측정 동안 제1 힘(F1) 또는 변형된 제1 힘(F1')을 부과하는 데 사용되는 바이어스 전압의 크기를 추가로 식별할 수 있다.
측정값이 본질적으로 전기인 예에서, 센서(1010)는 전극(102와 103) 중 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있거나, 각각, 유체(120) 및/또는 유체(120')와 접촉하고 있는 하나 이상의 추가 전극 또는 다른 회로 구성요소(들)를 포함할 수 있다. 측정값이 본질적으로 전기인 예에서, 유체(120) 및/또는 유체(120')와 접촉하고 있는 회로 구성요소(들)는 유체(120)와 유체(120')에 걸친 전압 강하를 감지하도록 구성된 전계 효과 트랜지스터를 포함할 수 있다. 측정값이 본질적으로 광학인 예에서, 센서(1010)는 광검출기에 의해 수신된 광에 기반하여 전기 신호를 생성하도록 구성된 증폭된 광검출기의 어레이를 포함하는 활성 픽셀 센서(APS)와 같은 임의의 적합한 광학 검출기를 포함할 수 있다. APS는 당업계에 알려진 상보성 금속 산화물 반도체(CMOS, complementary metal oxide semiconductor) 기술을 기반으로 할 수 있다. CMOS 기반 검출기는 전계 효과 트랜지스터(FET), 예를 들어 금속 산화물 반도체 전계 효과 트랜지스터(MOSFET)를 포함할 수 있다. 특정예에서, 단일 광자 애벌런치 다이오드(CMOS-SPAD)를 갖는 CMOS 이미저(imager)는, 예를 들어 형광 수명 이미징(FLIM)을 수행하는 데 사용될 수 있다. 다른 예에서, 광학 검출기는 포토다이오드, 예컨대 애벌런치 포토다이오드, 전하 결합 소자(CCD), 극저온 광자 검출기, 역 바이어스 발광 다이오드(LED), 포토레지스터, 포토트랜지스터, 광전지, 광전자 증배관(PMT), 양자점 광전도체 또는 포토다이오드 등을 포함할 수 있다. 각각의 센서(1010)는 측정값에 해당하는 전기 신호를 생성하고, 해당 신호를 1031에 저장하기 위해 메모리(1030)에 제공한다. 선택적으로, 회로(160)는 해당 신호가 1031에 저장되기 전 각각의 센서(들)(210)에서 전기 신호(들)를 증폭시키도록 각각 구성된 증폭기(들)(1020)를 포함하며, 추가 옵션으로서, 각각의 센서(1010) 내에 증폭기(1020)가 포함될 수 있다.
시퀀싱 모듈(1033)은 또한, 예를 들어 도 8a 내지 도 8e, 및 도 9를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 프로세서(1040)가 측정값(1031)을 데이터 구조(1032) 내 값과 비교하는 방식으로 뉴클레오타이드를 식별하도록 구성된 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은 프로세서(1040)가 1031로부터 측정값을 사용하고(예시적으로, 얻어진 시간 순서에 해당하는 순서로), 측정값과 동일한 작동 조건 하에서 얻었던 데이터 구조(1032)의 적어도 일부를 사용하게 할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은 프로세서(1040)가 측정값(1031) 내에 저장된 측정 조건의 식별을 데이터 구조(1032) 내에 저장된 측정 조건의 식별과 비교하고, 측정값(1031)의 측정 조건과 일치하지 않는 데이터 구조(1032) 내 임의의 값을 무시하게 할 수 있다. 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은, 예를 들어 측정값과 데이터 구조 내 값 사이의 차이를 취하고, 측정값과 데이터 구조 내 값 사이의 비를 취하고, T-검정 등과 같은 통계 비교를 수행하는 방식으로 프로세서(1040)가 측정값을 데이터 구조 내 값과 비교하는 작업을 수행하게 할 수 있다. 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은 프로세서(1040)가 비교에 기반하여 측정값과 가장 유사한 데이터 구조(1032) 내 값을 선택하고, 데이터 구조(1032)에서 이전에 해당 측정값을 제공했던 뉴클레오타이드의 조합(예를 들어, 적어도 도 1f에 예시된 이중체의 3' 말단에서 4번 및 4'번 위치와, 5번 및 6번 위치)을 선택하게 할 수 있다.
뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은 측정값(1031)에 해당하는 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드(150) 내 뉴클레오타이드의 물리적 서열에 해당하는 뉴클레오타이드의 전자 서열을 구축하기 위해, 프로세서(1040)가 선택된 뉴클레오타이드 조합을 사용하게 할 수 있다. 예를 들어, 도 1f에 예시된 표지를 사용하면, 각각의 측정값(1031)은 4번, 4'번 염기쌍뿐 아니라, 쌍을 이루지 않은 5번 및 6번 뉴클레오타이드로부터의 기여도를 포함한다. 따라서, 일부 예에서, 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은 프로세서(1040)가 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드(150) 내 뉴클레오타이드의 물리적 서열에 해당하는 뉴클레오타이드의 전자 서열 내 4번, 5번 및 6번 위치의 뉴클레오타이드를 포함하게 할 수 있다. 이와 관련하여, 이러한 뉴클레오타이드 중 적어도 일부는 이미 전자 서열에 포함되어 있을 수 있는 데, 이러한 뉴클레오타이드 중 적어도 일부가 또한 측정 단계(즉, 단일 뉴클레오타이드의 부가 전) 직전에 측정값에 기여했지만, 단일 뉴클레오타이드만큼 위치가 이동되었기 때문이다. 이와 같이, 전자 서열은 이제 4번 및 5번 위치에 있지만, 이전 측정 단계에서는 5번 및 6번 위치에 있었던 뉴클레오타이드를 이미 포함하고 있을 수 있다. 이제 6번 위치에 있는 뉴클레오타이드가 전자 서열에 부가될 수 있으며, 예를 들어 이전 측정 단계에서 7번 위치에 있었다면, 해당 단계 동안 식별 가능하게 되는 방식으로 이전 측정 단계에서 값에 충분히 기여하지 못했을 수 있지만, 이제는 식별 가능하다. 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은, 예를 들어 서열을 메모리(1030)에 저장하고, 서열을 또 다른 장치 또는 시스템(구체적으로 예시되지 않음)에 전자적으로 전송하고, 서열 또는 이의 일부를 회로(160)에 작동 가능하게 커플링된 디스플레이 스크린(구체적으로 예시되지 않음) 상에 디스플레이하는 등의 방식으로 프로세서(1040)가 뉴클레오타이드의 전자 서열을 출력하게 할 수 있다.
뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은 선택적으로 프로세서(1040)가 다수의 유형의 값의 측정을 사용하여 뉴클레오타이드를 식별하거나, 뉴클레오타이드의 정체성을 확인하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 도 8a 내지 도 8e, 및 도 9를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 뉴클레오타이드의 임의의 소정의 조합에 대해, 데이터 구조(1032)는 선택적으로 각각 상이한 측정 조건에 해당하는 특정 유형의 상이한 값을 포함할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 뉴클레오타이드의 임의의 소정의 조합에 대해, 데이터 구조(1032)는 선택적으로 상이한 유형의 측정값을 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은 뉴클레오타이드를 식별하거나 뉴클레오타이드의 정체성을 확인하기 위해, 프로세서(1040)가 상이한 유형의 측정 및/또는 상이한 측정 조건을 사용하여 얻은 임의의 값의 조합을 사용하게 할 수 있다. 하나의 예시적인 예로서, 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은 이중체 염기쌍과 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드의 특정 조합에 해당하는 데이터 구조(1032) 내 포인트를 식별하기 위해, 프로세서(1040)가 소정의 값과, 이러한 또는 상이한 값의 표준편차를 모두 사용하게 할 수 있다. 또 다른 예시적인 예로서, 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은 이중체 염기쌍과 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드의 특정 조합에 해당하는 데이터 구조(1032) 내 포인트를 식별하기 위해, 프로세서(1040)가 2개의 다른 상이한 유형의 측정으로부터의 값을 사용하게 할 수 있다.
일부 예에서, 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은 부가적으로 또는 대안적으로, 더 이른 및/또는 더 늦은 측정 단계(들)는 아니더라도 적어도 직전 또는 직후 측정 단계를 사용하여 프로세서(1040)가 식별의 정확도를 확인하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 도 8a 내지 도 8e를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 소정의 측정 단계에 대해, 프로세서(1040)는 4번, 5번 및 6번 위치의 뉴클레오타이드 A, C 및 G를 식별하며, 이러한 식별이 정확한 경우, 다음 측정 단계(뉴클레오타이드 부가 모듈(1034)을 사용한 단일 뉴클레오타이드의 부가 후)에서, 프로세서는 4번 및 5번 위치의 뉴클레오타이드 C 및 G를 식별해야 한다. 반면, 현재 또는 이전 식별이 부정확한 경우, 하나의 측정 단계에서 4번 및 5번 위치의 뉴클레오타이드 중 하나 또는 둘 모두는 직전 측정 단계에서 5번 및 6번 위치의 뉴클레오타이드와 일치하지 않을 수 있다. 얻어진 전자 서열의 정확도를 증강시키기 위해, 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은 프로세서(1040)가 소정의 측정 단계에 대해 식별된 뉴클레오타이드를 적어도 하나의 다른(예를 들어, 이전 또는 이후 단계) 측정 단계에 대해 식별된 뉴클레오타이드와 비교하고, 서로 동일해야 하는 식별된 뉴클레오타이드 사이의 임의의 차이에 기반하여 오류를 나타내게(표시하게) 할 수 있다.
뉴클레오타이드 식별 오류 표시에 응답하여, 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은 프로세서(1040)가 하나 이상의 시정 조치를 취하게 할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은, 예를 들어 오류가 있는 식별을 서로 일치하는 다른 측정 단계에서 올바른 것으로 알려진 식별로 대체하거나(예를 들어, 각각의 소정의 뉴클레오타이드는 3개 이상의 순차적 측정값에 기여할 수 있기 때문에), 뉴클레오타이드를 식별되지 않은 것으로 표시하는 방식으로(예를 들어, 뉴클레오타이드의 정체성이 알려지지 않았음을 나타내기 위해 "X"와 같은 임시 부호를 사용함) 프로세서(1040)가 오류가 있는 하나 이상의 뉴클레오타이드 식별을 무시하게 할 수 있다. 또 다른 시정 조치에 더하여 또는 이에 대한 대안으로서 구현될 수 있는 또 다른 예로서, 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은 프로세서(1040)가 저장된 측정값(1031)과 데이터 구조(1032)를 사용하여 뉴클레오타이드를 다시 식별하려는 시도를 하게 할 수 있다. 또 다른 시정 조치에 더하여 또는 이에 대한 대안으로서 구현될 수 있는 또 다른 예로서, 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은 프로세서(1040)가 상이한 측정 조건(예를 들어, 변형된 제1 힘(F1'))과 데이터 구조(1032)를 사용하여 새로운 측정값(1031)을 얻는 방식으로 뉴클레오타이드를 다시 식별하려는 시도를 하게 할 수 있다. 또 다른 시정 조치에 더하여 또는 이에 대한 대안으로서 구현될 수 있는 또 다른 예로서, 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은 프로세서(1040)가 상이한 측정 유형(예를 들어, 처음 사용된 측정 유형의 표준편차)과 데이터 구조(1032)를 사용하여 새로운 측정값(1031)을 얻는 방식으로 뉴클레오타이드를 다시 식별하려는 시도를 하게 할 수 있으며, 이와 관련하여, 예를 들어 표준편차는 저장된 측정값(1031)에서 얻을 수 있기 때문에, 별도의 측정 단계가 반드시 수행될 필요가 없다는 점에 유의해야 한다. 또 다른 시정 조치에 더하여 또는 이에 대한 대안으로서 구현될 수 있는 또 다른 예로서, 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은 프로세서(1040)가 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 방식으로 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드(150)를 재시퀀싱하게 할 수 있다. 이러한 시정 조치(들)에 대안으로 구현될 수 있거나, 이러한 시정 조치(들)가 시도되었지만 성공하지 못한 경우에 구현될 수 있는 또 다른 예로서, 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은 프로세서(1040)가 전자 서열에 뉴클레오타이드가 식별되지 않았음을 나타내게 할 수 있다(예를 들어, 뉴클레오타이드의 정체성이 알려지지 않았음을 나타내기 위해 "X"와 같은 임시 부호를 사용함). 일부 예에서, 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은 프로세서(1040)가 오류의 명백한 특성과 오류가 식별되는 시점에 이용 가능한 옵션에 기반하여 이러한 또는 다른 작업 중에서 선택하게 할 수 있다.
일부 예에서, 데이터 구조(1032)와 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은 적절하게는 기계 학습을 사용하여 구현될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 예를 들어, 데이터 구조(1032)는 측정값, 이러한 측정값에 해당하는 것으로 선험적으로 알려진 뉴클레오타이드의 조합, 및 측정값이 얻어졌던 측정 조건을 사용하여 신경망(예를 들어, 딥러닝 알고리즘)과 같은 임의의 적합한 기계 학습 알고리즘을 훈련시키는 방식으로 생성될 수 있다. 이와 관련하여, 데이터 구조(1032)는 측정값을 사용하여 뉴클레오타이드의 조합을 식별하기 위해 훈련된 기계 학습 알고리즘, 예를 들어 훈련된 딥러닝 알고리즘(프로세서(1040)에 의해 구현되는 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036))과 같은 훈련된 신경망에 의해 용이하게 사용 가능한 구성을 가질 수 있지만, 이러한 구성은 측정값과 알려지지 않은 뉴클레오타이드 조합 사이의 상관관계를 결정하기 위해 임의의 다른 소프트웨어, 모듈 또는 알고리즘에서 반드시 사용할 수 있는 것은 아니다. 예를 들어, 기계 학습 알고리즘(예컨대, 신경망, 예를 들어 딥러닝 알고리즘)은 염기 호출을 생성하기 위해 회로(160)의 신호 출력을 사용하여 훈련될 수 있다. 기계 학습 알고리즘의 비제한적인 예는, 지도식(supervised), 반-지도식(semi-supervised), 비지도식(unsupervised) 및 강화 알고리즘이다. 신경망 알고리즘은 기계 학습 알고리즘의 서브세트이며, 딥러닝 알고리즘, 컨볼루션 신경망, 순환 신경망, 생성적 적대 신경망 및 재귀 신경망을 포함할 수 있다. 따라서, 데이터 구조(1032)의 특정 구성은, 예를 들어 벡터 공간, 그래프 공간, 신경망의 뉴런 등을 포함할 수 있다. 대안적으로, 데이터 구조(1032)는 룩업 테이블(LUT), 매트릭스, 플랫-파일 데이터베이스 구조, SQL 데이터베이스 구조 등과 같은 뉴클레오타이드 식별 모듈을 사용하여 질의될 수 있는 임의의 적합한 데이터 구조를 사용하여 구현될 수 있다. 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은 프로세서(1040)가 알려지지 않은 뉴클레오타이드 조합에 대한 측정값에 해당하는 알려진 뉴클레오타이드 조합에 대한 측정값을 이용하여 데이터 구조(1032) 내 포인트를 적절하게 식별하게 할 수 있다.
회로(160)는 디지털 전자 회로, 집적 회로, 주문형 직접 회로(ASIC), 필드 프로그래밍 가능한 게이트 어레이(FPGA), 중앙처리장치(CPU), 그래픽처리장치(GPU), 컴퓨터 하드웨어, 펌웨어, 소프트웨어 및/또는 이들의 조합의 임의의 적합한 조합을 사용하여 구현될 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 회로(160)의 하나 이상의 기능은 저장 시스템, 적어도 하나의 입력 장치 및 적어도 하나의 출력 장치로부터 데이터와 명령을 수신하고, 이러한 장치에 데이터와 명령을 전송하도록 커플링된 전용 또는 범용일 수 있는, 적어도 하나의 프로그래밍 가능한 프로세서를 포함하는 프로그래밍 가능한 시스템에서 실행 가능하고/하거나 해석 가능한 하나 이상의 컴퓨터 프로그램으로 구현될 수 있다. 프로그래밍 가능한 시스템 또는 컴퓨팅 시스템은 클라이언트와 서버를 포함할 수 있다. 클라이언트와 서버는 일반적으로 서로 멀리 떨어져 있으며, 전형적으로 통신 네트워크를 통해 상호작용한다. 클라이언트와 서버의 관계는 각각의 컴퓨터에서 실행되고 서로 클라이언트-서버 관계를 갖는 컴퓨터 프로그램에 의해 발생한다.
모듈, 프로그램, 소프트웨어, 소프트웨어 어플리케이션, 어플리케이션, 구성요소 또는 코드로도 지칭될 수 있는 이러한 컴퓨터 프로그램은, 프로그래밍 가능한 프로세서에 대한 기계 명령을 포함할 수 있고/있거나, 고급 절차적 언어, 객체 지향 프로그래밍 언어, 함수형 프로그래밍 언어, 논리 프로그래밍 언어 및/또는 어셈블리/기계 언어로 구현될 수 있다. 본원에 사용된 "메모리" 및 "컴퓨터 판독 가능한 매체"라는 용어는, 기계 명령을 컴퓨터 판독 가능한 신호로 수신하는 기계 판독 가능한 매체를 포함하는 프로그래밍 가능한 데이터 프로세서에 기계 명령 및/또는 데이터를 제공하는 데 사용되는 자기 디스크, 광 디스크, 고체 상태 저장 장치, 메모리 및 프로그래밍 가능한 논리 장치(PLD)와 같은 임의의 컴퓨터 프로그램 제품, 장비 및/또는 장치를 나타낸다. "컴퓨터 판독 가능한 신호"라는 용어는, 프로그래밍 가능한 데이터 프로세서에 기계 명령 및/또는 데이터를 제공하는 데 사용되는 임의의 신호를 나타낸다. 컴퓨터 판독 가능한 매체는 비일시적 고체 상태 메모리 또는 자기 하드 드라이브 또는 임의의 동등한 저장 매체와 같이 이러한 기계 명령을 비일시적으로 저장할 수 있다. 컴퓨터 판독 가능한 매체는 대안적으로 또는 부가적으로, 예를 들어 하나 이상의 물리적 프로세서 코어와 결합된 프로세서 캐시(cache) 또는 다른 랜덤 액세스 메모리와 같이 이러한 기계 명령을 일시적 방식으로 저장할 수 있다.
본원에 기재된 컴퓨터 구성요소, 소프트웨어 모듈, 기능, 데이터 저장소 및 데이터 구조는 작업에 필요한 데이터의 흐름을 허용하기 위해 서로 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 또한, 모듈 또는 프로세서는, 비제한적으로, 소프트웨어 작업을 수행하는 코드 단위를 포함하며, 예를 들어 코드의 서브루틴 단위, 또는 코드의 소프트웨어 기능 단위, 또는 객체(객체 지향 패러다임에서와 같이), 또는 애플릿(applet), 또는 컴퓨터 스크립트 언어, 또는 또 다른 유형의 컴퓨터 코드로 구현될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 소프트웨어 구성요소 및/또는 기능은 단일 컴퓨터에 위치하거나, 당시 상황에 따라 다수의 컴퓨터 및/또는 클라우드에 걸쳐 분산될 수 있다.
하나의 비제한적인 예에서, 도 10을 참조로 기재된 회로(160)는 컴퓨팅 장치 아키텍쳐를 사용하여 구현될 수 있다. 이러한 아키텍쳐에서, 버스(bus)(구체적으로 예시되지 않음)는 하드웨어의 다른 예시된 구성요소를 상호연결하는 정보 고속도로 역할을 할 수 있다. 시스템 버스는 또한 컴퓨팅 시스템에 물리적으로 연결되어 있거나, 유선 또는 무선 네트워크를 통해 외부에서 이용 가능한 외부 장치와 통신할 수 있도록 적어도 하나의 통신 포트(예컨대, 네트워크 인터페이스)를 포함할 수 있다. 프로세서(1040)는 프로그램을 실행하는 데 필요한 계산과 논리 작업을 수행할 수 있는 CPU(중앙처리장치)(예를 들어, 소정의 컴퓨터 또는 다수의 컴퓨터에 있는 하나 이상의 컴퓨터 프로세서/데이터 프로세서)를 사용하여 구현될 수 있다. 메모리(1030)는 프로세서(1040)와 통신하는 읽기 전용 메모리(ROM) 및/또는 랜덤 액세스 메모리(RAM)와 같은 비일시적 프로세서 판독 가능한 저장 매체를 포함할 수 있고, 본원에 제공된 작업을 위한 하나 이상의 프로그래밍 명령, 예를 들어 시퀀싱 모듈(1033) 및 이의 구성요소를 포함할 수 있으며, 측정값(1031)과 데이터 구조(1032)를 저장할 수 있다. 선택적으로, 메모리(1030)는 자기 디스크, 광 디스크, 기록 가능한 메모리 장치, 플래시 메모리 또는 다른 물리적 저장 매체를 포함할 수 있다. 사용자와의 상호작용을 제공하기 위해, 회로(160)는 사용자에게 얻은 정보를 디스플레이하기 위한 디스플레이 장치(예를 들어, CRT(음극선관) 또는 LCD(액정 디스플레이) 모니터)와, 사용자가 컴퓨터에 입력을 제공할 수 있는 키보드 및/또는 포인팅 장치(예를 들어, 마우스 또는 트랙볼(trackball)) 및/또는 터치스크린과 같은 입력 장치를 갖는 컴퓨팅 장치를 포함하거나, 이러한 장치에서 구현될 수 있다.
시퀀싱 모듈(1033)은 도 2a 내지 도 2e, 도 3, 도 4a 내지 도 4c, 도 5a와 도 5b, 및 도 6을 참조로 기재되는 바와 같이 프로세서(1040)가 추가의 작업을 수행하도록 추가로 구성될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 이러한 작업은 도 10에 구체적으로 예시되지 않은 추가의 모듈을 사용하여 구현되거나, 뉴클레오타이드 부가 모듈(1034), 측정 모듈(1035) 및/또는 뉴클레오타이드 부가 모듈(1036)에 대한 적합한 변형을 사용하여 구현될 수 있다.
도 1a 내지 도 1h를 참조로 기재된 시스템, 조성물 및 작업은 적합하게는 이루어진 측정의 정확도를 추가로 증강시키기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 도 2a 내지 도 2e는, 나노공극을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하기 위한 예시적인 시퀀싱 시스템의 사용과, 추가의 예시적인 조성물 및 작업을 개략적으로 예시한 것이다. 이제 도 2a 내지 도 2e를 참조로 기재된 시스템(200)은, 도 1a 내지 도 1h를 참조로 기재된 시스템(100)과 유사하게 구성되고 사용될 수 있다. 예를 들어, 시스템(200)은, 각각 도 1a 내지 도 1h를 참조로 기재된 바와 유사하게 구성될 수 있는, 제1 전극과 제2 전극(102, 103), 선택적으로 제1 층과 제2 층(107, 108)을 포함하는 장벽(101), 나노공극(110), 폴리뉴클레오타이드(140, 150), 폴리머라아제(105), 뉴클레오타이드(121, 122, 123, 124) 및 회로(160)를 유사하게 포함할 수 있다. 하지만, 이중체(254)는 차단 모이어티(234)가 이중체와 가역적으로 회합될 수 있고, 폴리머라아제(105)가 제2 뉴클레오타이드를 부가하는 것을 가역적으로 저해할 수 있다는 점에서, 이중체(154)에 비해 변형될 수 있다. 예를 들어, 도 2a에 예시된 특정 시점에, 회로(160)는 도 1b를 참조로 기재된 바와 유사한 방식으로 폴리머라아제(105)가 3' 말단(253)에 뉴클레오타이드(122)를 부가할 수 있도록 제2 힘(F2)을 가할 수 있다. 차단 모이어티(234)는 차단 모이어티(234)가 의도적으로 제거될 때까지, 유체(220) 내 폴리머라아제(105)가 3' 말단(253)에 또 다른 뉴클레오타이드를 부가하는 것을 저해할 수 있다. 일부 예에서, 차단 모이어티(234)는 유체(220) 내 각각의 뉴클레오타이드(121, 122, 123, 124)에 커플링된 3'-차단기를 포함할 수 있다.
회로(160)는 차단 모이어티(234)와 이중체(254)의 회합을 검출하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 도 2b에 예시된 바와 같이, 제1 힘(F1)을 가하는 동안, 회로는 또한 도 1a, 도 1c 및 도 1e를 참조로 기재된 바와 유사한 방식으로 전기적 특성 값을 측정할 수 있다. 도 1a, 도 1f, 도 1g 및 도 1h를 참조로 논의된 바와 유사한 방식으로, 차단 모이어티(234)의 존재와 조합된 이중체(254)의 3' 말단(253)에 있는 특정 염기쌍(예를 들어, TA)과 단일 가닥 제2 부분(156) 내 하나 이상의 염기 서열(예를 들어, T,G)은, 사용되는 특정 측정 조건 하에서 유체(120) 내 염이 개구부(113)를 통해 유체(120')로 이동하는 속도를 변경시켜, 회로(160)에 의해 검출되는 방식으로 나노공극(110)에 걸친 전류, 이온 전류, 전기 저항(이온 흐름에 대한 저항) 또는 전압 강하, 또는 임의의 이러한 전기적 특성의 표준편차를 변경시킬 수 있다. 따라서, 회로(160)는 측정값을 사용하여 차단 모이어티(234)의 존재를 검출할 수 있으며, 또한 측정값을 사용하여 폴리뉴클레오타이드(150)에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 식별할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 회로(160)는 이중체(254)에서 차단 모이어티(234)의 부재를 검출할 수 있다. 예를 들어, 차단 모이어티(234)가 존재하지 않는 경우, 이러한 부재는 차단 모이어티(234)의 존재 하에서의 속도와 비교하여 유체(120) 내 염이 개구부(113)를 통해 유체(120')로 이동하는 속도를 변경시킬 수 있으며, 이에 따라 회로(160)에 의해 검출되는 방식으로 나노공극(110)에 걸친 전류, 이온 전류, 전기 저항(이온 흐름에 대한 저항) 또는 전압 강하, 또는 임의의 이러한 전기적 특성의 표준편차를 변경시킬 수 있다. 이와 관련하여, 데이터 구조(1032)의 추가적인 차원(들)은 이중체(254)의 3' 말단(253)에 있는 뉴클레오타이드에 커플링된 차단 모이어티(234)의 존재에 해당하는 측정값을 추가로 포함할 수 있다는 점에 유의해야 한다.
차단 모이어티(234)는, 예를 들어 차단 모이어티의 존재가 도 2b를 참조로 기재된 바와 같은 작업을 사용하여 확인된 후, 폴리머라아제(105)가 제2 뉴클레오타이드를 부가할 수 있게 하는 방식으로 변경 가능하거나 제거 가능할 수 있다. 도 2c에 예시된 비제한적인 예에서, 유체(220)는 폴리머라아제를 함유하지 않으며 차단된 뉴클레오타이드를 함유하지 않는 유체로 대체되며, 회로(160)는 3' 말단(253)이 차단 모이어티(234)를 변경하거나 제거하여, 예를 들어 더 이상 3' 말단(253)과 회합되지 않을 수 있는 변형된 차단 모이어티(234')를 생성할 수 있는 반응물(235)을 포함하는 변형된 유체(220')에 접근 가능하도록 제2 힘(F2)을 가한다. 예시적으로, 차단 모이어티(234)가 3'-차단기를 포함하는 예에서, 뉴클레오타이드(221)에서 차단 모이어티(234)를 제거하는 것은 차단 모이어티를, 도 2d에 예시된 -OH 기(225)와 같은 또 다른 화학적 모이어티로 대체하는 것을 포함한다. 차단 모이어티(234)가 제거된 후, 회로(160)는 도 2e에 예시된 바와 같은 방식으로, 이중체(254)의 3' 말단(253)(이는 이제 차단 모이어티(234)와 회합되어 있지 않아, 이중체(154)의 3' 말단(153)에 해당할 수 있음)을 개구부(112) 내에 배치하고, 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 부분(156)을 개구부 내에 배치하는 제1 힘(F1)을 다시 가할 수 있다. 회로(160)가 제1 힘(F1)을 다시 가하는 동안, 수축부(114)는 이중체(254)의 3' 말단(253)이 나노공극(110)의 제2 측(112)으로 이동하는 것을 다시 저해할 수 있으며, 회로는 나노공극의 전기적 특성 값을 측정하여 차단 모이어티가 제거되었다는 것을 확인할 수 있다. 이어서, 유체(220')는 선택적으로 또 다른 유체, 예를 들어 차단기가 제거되지 않는 유체로 대체될 수 있다. 유체(220')가 이러한 시점에 대체되는지 여부에 관계없이, 차단 모이어티(234)가 이중체(254)의 3' 말단(253)에 존재하지 않기 때문에, 차단 모이어티의 부재는 차단 모이어티(234)의 존재 하에서의 속도와 비교하여 유체(120) 내 염이 개구부(113)를 통해 유체(120')로 이동하는 속도를 변경시키며, 이에 따라 회로(160)에 의해 검출되는 방식으로 나노공극(110)에 걸친 전류, 이온 전류, 전기 저항 또는 전압 강하, 및/또는 임의의 이러한 전기적 특성의 표준편차를 변경시킬 수 있다. 따라서, 뉴클레오타이드(122)는, 예를 들어 도 1a, 도 1c, 도 1e, 도 8a 내지 도 8e, 도 9, 및 도 10을 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 측정값을 사용하여 식별될 수 있다. 유체(220')는 이중체(254)의 말단에 차단된 뉴클레오타이드를 부가하고(도 2a), 이중체의 말단에서 차단된 뉴클레오타이드를 사용하여 신호를 생성하고(도 2b), 차단기(234)를 제거하고(도 2c와 도 2d), 이중체의 말단에서 차단 해제된 뉴클레오타이드를 사용하여 신호를 생성하는(도 2e) 과정을 반복하기 위해 폴리머라아제와 차단된 뉴클레오타이드를 함유하는 유체(220)로 대체될 수 있다. 이러한 작업은, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드(150)의 적어도 일부를 시퀀싱하여, 예를 들어 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 방식으로 신호를 사용하여 부가된 뉴클레오타이드를 식별하기 위해 임의의 적합한 횟수만큼 반복될 수 있다.
따라서, 도 2b를 참조로 기재된 바와 같은 측정은 차단된 뉴클레오타이드가 혼입되었다는 것을 확인하는 데 사용될 수 있다고 이해될 것이다. 차단 모이어티는 차단 모이어티(234)가 제거될 때까지 이중체(254)가 임의의 추가 뉴클레오타이드에 의해 연장되는 것을 저해하기 때문에(도 2c), 다수의 뉴클레오타이드의 제어되지 않고 관찰되지 않은 부가로 인해 발생할 수 있는 결실 오류가 저해된다. 도 2e를 참조로 기재된 바와 같은 측정은 뉴클레오타이드를 식별하는 것에 더하여, 뉴클레오타이드가 적절하게 차단 해제되었다는 것을 확인하는 데 사용될 수 있다. 전자적으로 제어되고 단계적인 방식으로 이러한 반복된 측정을 수행하는 능력은, 예를 들어 가닥 시퀀싱에 사용되는 효소에 의한 전위와 비교하여 정확도의 현저한 증강을 제공할 수 있다고 이해될 것이다.
하나의 예시적인 예에서, 이중체(254)의 3' 말단(253)을 나노공극(110)에서 유체(220)로 배출하기 위해 제2 힘(F2)이 사용되며(도 2a), 폴리머라아제가 뉴클레오타이드를 부가하도록 적합한 시간 범위(예를 들어, 약 1 ms 내지 50 ms)가 제공된다. 이러한 시간 범위 동안 차단된 뉴클레오타이드가 부가되었을 가능성이 있다. 이는, 예를 들어 뉴클레오타이드 조합을 달리 식별하기 곤란한 환경에서 이러한 차단된 뉴클레오타이드가 실제로 부가되었는지를 확인하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 후속 뉴클레오타이드 조합이 서로 유사한 측정 신호를 생성하는 상대적으로 긴 동종중합체 영역이 시퀀싱된다. 또는, 예를 들어, 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은 알려지지 않은 조합에 대한 측정값이 데이터 구조(1032) 내 측정값 중 다수의 값과 매우 유사하다고 결정할 수 있다. 차단된 뉴클레오타이드가 부가되었다는 것을 확인하는 정보는 적절하게 신호를 처리하는 데 있어 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)에 유용한 도움을 제공할 수 있다. 예를 들어, 이중체(254)의 3' 말단(253)에 있는 차단된 뉴클레오타이드의 존재 확인에 응답하여, 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은, 염기 호출의 품질이 낮거나 식별되지 않는 것으로 표시되는 경우에도, 프로세서(1040)가 뉴클레오타이드를 전자 서열에 포함시키도록 할 수 있다. 또는, 예를 들어, 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은 프로세서(1040)가 변형된 제1 힘(F1')을 사용하여 측정을 반복하는 것과 같은 임의의 다른 적합한 시정 조치를 구현하게 할 수 있다. 또는, 예를 들어, 이중체(254)의 3' 말단(253)에 있는 뉴클레오타이드가 차단 모이어티(234)를 포함하지 않았다고 결정한 것에 응답하여, 뉴클레오타이드 식별 모듈(1036)은, 프로세서(1040)가, 폴리머라아제가 뉴클레오타이드를 부가하지 않았다고 가정하여, 이중체(254)의 3' 말단을 다시 배출하고, 폴리머라아제가 차단된 뉴클레오타이드를 부가할 수 있는 시간 범위를 다시 기다리게 할 수 있다. 따라서, 특정 시간 범위 후 차단 모이어티(234)가 이중체의 3' 말단에 존재하지 않음을 나타내는 측정은 통상적으로 해당 시간 범위 동안 폴리머라아제가 이중체에 작용하지 않았음을 의미하는 것으로 해석될 수 있다. 이러한 표시에 응답하여, 회로(160)는 폴리뉴클레오타이드(150)의 서열에서 다음 뉴클레오타이드를 식별하는 것(또는 이의 정체성을 확인하는 것)을 다시 시도하기 위해 뉴클레오타이드 부가 작업과 시퀀싱 작업을 반복할 수 있다.
도 2a 내지 도 2e를 참조로 기재된 바와 같은 측정 및 작업은, 예를 들어 폴리머라아제가 적절한 시점에 이중체의 3' 말단에 작용한다는 것을 추가로 확인하기 위해, 도 1d를 참조로 기재된 바와 같은 측정과 함께 적절하게 사용될 수 있다고 추가로 이해될 것이다. 이와 관련하여, 도 1d를 참조로 기재된 측정은 폴리머라아제가 작용하는 뉴클레오타이드에 커플링된 차단 모이어티를 검출하는 데 추가로 사용될 수 있다.
도 2a 내지 도 2e를 참조로 기재된 바와 같은 예에서, 뉴클레오타이드(121, 122, 123, 124)는 임의의 적합한 차단 모이어티(234)에 커플링될 수 있으며, 임의의 적합한 반응물(235)이 이중체(254)의 3' 말단(253)에서 뉴클레오타이드를 차단 해제하는 데(차단 모이어티를 제거하는 데) 사용될 수 있다. 하나의 비제한적인 예에서, 차단 모이어티(234)는 이중체(254)의 3' 말단에 존재할 때 나노공극(110)을 통한 전류 흐름을 변경시키는 것으로 예상될 수 있으며, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP) 또는 트리스(히드록시프로필)포스핀(THP)을 사용하여 제거되어, 폴리머라아제를 사용하여 또 다른 차단된 뉴클레오타이드에 의해 연장될 수 있는 3' OH 기를 남길 수 있는 아지도메틸(AZM) 기(-OCH2N3)를 포함한다. 다양한 다른 차단 모이어티와 이러한 차단 모이어티를 제거하는 반응물은 당업계에 알려져 있으며, 본 발명의 주제와 함께 사용하기 위해 적절하게 조정될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허출원 공개공보 제2020/0216891호(Francais et al.)를 참조하며, 상기 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로 인용된다.
도 2a 내지 도 2e는 이중체(254)의 3' 말단(253)이 나노공극(110)에서 배출되는 동안 차단 모이어티(234)를 제거하기 위해 반응물(235)이 나노공극(110)의 제1 측(111)에 있는 유체에 위치하는 예를 예시하지만, 반응물은 대신 이중체의 3' 말단이 나노공극 내에 있는 동안 차단 모이어티를 제거하기 위한 방식으로 위치할 수 있다. 이와 같이, 차단 모이어티의 존재는 도 2a 내지 도 2e를 참조로 기재된 바와 유사한 방식으로 측정될 수 있으며, 차단 모이어티의 제거는 실시간으로도 관찰될 수 있다. 예를 들어, 차단 모이어티의 존재가 측정값에 영향을 미치는 경우, 모이어티가 제거되기 때문에 측정값의 변화가 예상될 수 있다. 이러한 변화를 통해 차단 모이어티의 제거를 확인하는 것은, 모이어티가 제거되지 않았던 경우(변하지 않은 측정값으로 반영), 이중체가 나노공극에서 배출될 때(모이어티가 제거되었는지 여부에 관계없이 시계에 따라 발생할 수 있음), 회로(160)는 다음 "혼입"이 실제로 새로운 사이클로부터의 혼입이 아니었기 때문에 무시되어야 한다고 결정할 수 있기 때문에 유용한 정보이다.
유체 순환(특정 작업 사이에서 하나의 유체를 또 다른 유체로 교환)에 대한 필요성은, 도 2a 내지 도 2e를 참조로 기재된 바와 같은 예와 비교하여 도 1a 내지 도 1h를 참조로 기재된 바와 같은 예에서 감소될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 예를 들어, 도 2c를 참조로 기재된 작업 동안 뉴클레오타이드(122)에서 차단 모이어티(234)를 해리시키기 위해, 뉴클레오타이드와 폴리머라아제를 포함하는 유체(220)는 (예를 들어, 수성 용매를 이용한 플러싱을 통해) 제거된 후 시약(235)을 포함하는 유체(220')로 대체될 수 있다. 이후에, 차단 해제된 뉴클레오타이드(122)에 또 다른 뉴클레오타이드를 부가하기 위해, 유체(220')는 (예를 들어, 수성 용매를 이용한 플러싱을 통해) 제거된 후 유체(220)로 대체될 수 있다. 도 2a 내지 도 2e를 참조로 기재된 예에서, 뉴클레오타이드 차단 해제 단계와 뉴클레오타이드 부가 단계는 동일한 구획(나노공극의 동일한 제1 측(111)) 내에서 일어나고, 해당 구획 내 뉴클레오타이드 차단 해제 구성요소와 뉴클레오타이드 부가 구성요소 사이의 직접 접촉은 뉴클레오타이드 부가 과정의 제어를 감소시킬 수 있는 뉴클레오타이드의 조기 차단 해제(예를 들어, 부가 전)를 야기할 수 있기 때문에, 다수의 유체 사이클이 사용된다. 이에 비해, 도 1a 내지 도 1h를 참조로 기재된 뉴클레오타이드 부가 단계 전반에 걸쳐, 폴리머라아제(105)는 유체 순환 필요 없이 자유롭게 이동할 수 있다. 예를 들어, 도 1a 내지 도 1h는, 폴리머라아제가 뉴클레오타이드를 유체(120)에서 이중체의 3' 말단(153)으로 자유롭게 부가할 수 있고, 이러한 뉴클레오타이드는 도 8a 내지 도 8e, 도 9 및 도 10과, 하기 추가로 제공되는 작업 실시예를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로 서로 구별될 수 있기 때문에, 차단 해제 작용제의 부가와 제거의 필요성을 제거한다.
도 1a 내지 도 1h, 도 2a 내지 도 2e, 도 7, 도 8a 내지 도 8e, 도 9, 및 도 10를 참조로 기재된 바와 같은 작업의 임의의 적합한 조합이 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드(150)를 시퀀싱하는 데 사용될 수 있다고 추가로 이해될 것이다. 예를 들어, 도 3은, 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 예시적인 방법에서의 작업 흐름을 예시한 것이다. 방법(300)은, 예를 들어 도 1a 내지 도 1h, 및 도 7을 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 제1 측, 제2 측, 및 제1 측과 제2 측을 통해 연장되는 개구부를 포함하는 나노공극을 사용할 수 있다. 방법(300)은 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단이 나노공극의 제1 측에 있고, 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단이 나노공극의 제2 측에 있도록 나노공극의 개구부를 통해 폴리뉴클레오타이드를 배치하는 작업(작업 310)을 포함할 수 있다. 이러한 방식으로 나노공극(110)의 개구부를 통해 폴리뉴클레오타이드(150)를 배치하는 예시적인 작업은 도 6을 참조로 하기에 제공되어 있다. 방법(300)은 나노공극의 제1 측에 폴리뉴클레오타이드로 3' 말단을 포함하는 이중체를 형성하는 작업(작업 320)을 포함할 수 있다. 이러한 이중체는, 예를 들어 도 6을 참조로 하기에 기재된 바와 같은 방식으로, 예를 들어 뉴클레오타이드(150)의 제1 부분(155)을 나노공극의 제1 측에 있는 프라이머(폴리뉴클레오타이드(140) 또는 이의 일부)에 혼성화함으로써 형성될 수 있다.
방법(300)은 이중체의 3' 말단에 뉴클레오타이드를 부가하는 방식으로 나노공극의 제1 측에서 이중체를 연장시키는 작업(작업 330)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 회로(160)는, 예를 들어 도 1b, 도 1d 및 도 2a를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 이중체의 3' 말단이 나노공극의 개구부 밖에 위치한다는 것에 응답하여, 폴리머라아제가 이중체의 3' 말단에 작용하여 뉴클레오타이드를 부가할 수 있도록 제2 힘(F2)을 가할 수 있다. 방법(300)은 이중체의 3' 말단을 개구부 내에 배치하는 제1 힘을 가하는 작업(작업 340)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 회로(160)는 도 1a, 도 1c, 도 1e, 도 2b 및 도 2e를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로 제1 힘(F1)을 가할 수 있다. 방법(300)의 작업 340은, 제1 힘을 가하는 동안, 나노공극을 사용하여 연장된 이중체의 3' 말단이 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해하는 작업(작업 341)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 나노공극(110)의 수축부(114) 또는 다른 특징부는, 도 1a, 도 1c, 도 1e, 도 2b 및 2e를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 나노공극(110)의 제1 측(111)에서 나노공극(110)의 제2 측(112)으로 이중체(154)의 3' 말단(153)의 이동 또는 이중체(254)의 3' 말단(253)의 이동을 저해할 수 있다. 방법(300)의 작업 340은 또한, 제1 힘을 가하는 동안, 이중체의 3' 말단과 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 전기적 특성 값을 측정하는 작업(작업 342)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 회로(160)는 도 1a, 도 1c, 도 1e, 도 2b 및 2e를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로 이러한 전기적 특성 값을 측정할 수 있다. 방법(300)은 작업 340에서 측정된 값을 사용하여 부가된 뉴클레오타이드를 식별하는 작업(작업 350)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 회로(160)는 도 8a 내지 도 8e, 도 9 및 도 10을 참조로 기재된 바와 같은 방식으로 폴리뉴클레오타이드(150)에서 하나 이상의 뉴클레오타이드를 식별할 수 있다. 도 3에 제시된 바와 같이, 작업 330 내지 작업 350은, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드(150)를 실질적으로 시퀀싱하기 위해 임의의 적합한 횟수만큼 반복될 수 있다.
방법(300)을 참조로 기재된 바와 같은 작업은 본원에 제공된 바와 같은 임의의 다른 작업과 호환 가능하며, 이러한 임의의 다른 작업과 함께 사용될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 예를 들어, 선택적으로 부가된 뉴클레오타이드는 각각의 차단 모이어티를 포함할 수 있으며, 이러한 차단 모이어티는 도 2a 내지 도 2e를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로 선택적으로 제거될 수 있다.
도 1a 내지 도 1h, 도 2a 내지 도 2e, 도 3, 도 7, 도 8a 내지 도 8e, 도 9 및 도 10을 참조로 기재된 바와 같은 다수의 상이한 일련의 작업에 동일한 나노공극이 사용될 수 있으며, 이러한 일련의 작업은 서로 동일한 폴리뉴클레오타이드(150)를 사용하거나 서로 상이한 폴리뉴클레오타이드(150)를 사용할 수 있다고 추가로 이해될 것이다. 예를 들어, 도 4a 내지 도 4c는, 예를 들어 공통 판독물을 생성하기 위해 동일한 폴리뉴클레오타이드(150)를 재시퀀싱하기 위한 도 1a 내지 도 1h의 시퀀싱 시스템의 사용을 개략적으로 예시한 것이다. 이제 도 4a를 참조하면, 폴리뉴클레오타이드(150)의 시퀀싱이 실질적으로 완료된 시점의 시스템(100)이 표시되어 있으며, 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드(150)의 시퀀싱은 부분적으로 완료될 수 있으며, 뉴클레오타이드 식별 모듈(1042)은 프로세서(1040)가 폴리뉴클레오타이드(150)를 재시퀀싱하는 시정 조치를 취하게 한다. 도 4a에 제시된 바와 같이 회로(160)가 제1 힘(F1)을 가하는 것에 응답하여, 폴리뉴클레오타이드(150)는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 방식으로 (이제 연장된) 폴리뉴클레오타이드(140)에 혼성화된 상태로 유지된다. 폴리뉴클레오타이드(150)를 재시퀀싱하기 위해, 회로는 이중체(154)를 해리시키거나 이중체(254)를 해리시키기에, 즉, 도 4b에 예시된 바와 같은 방식으로 폴리뉴클레오타이드(150)에서 연장된 폴리뉴클레오타이드(140)를 탈혼성화시키기에 충분히 높은 전압(F4)을 인가하도록 구성될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드(150)는, 예를 들어 도 4c에 예시된 바와 같은 방식으로, 폴리뉴클레오타이드(150)에 프라이머와 같은 새로운(더 짧은) 폴리뉴클레오타이드(140')를 혼성화시키는 것을 포함하는 작업을 사용하여 선택적으로 재시퀀싱될 수 있다. 예를 들어, 프라이머(140')는 유체(120)에 포함될 수 있다. 이어서, 폴리뉴클레오타이드(150)를 다시 부분적으로 또는 완전히 시퀀싱하기 위해 본원에 제공된 일련의 뉴클레오타이드 부가 작업과 측정 작업이 사용될 수 있다. 이와 같이, 나노공극의 제1 측에 형성된 새로운 이중체는 도 1a를 참조로 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드(150)의 동일한 제1 부분(155)을 포함할 수 있으며, 새로운 폴리뉴클레오타이드(140')의 말단을 포함하는 또 다른 3' 말단(153)을 가질 수 있다. 도 4a 내지 도 4c를 참조로 기재된 이러한 일련의 작업은, 예를 들어 서열에 목적하는 신뢰도를 제공하기 위해 목적하는 정확도 수준이 달성될 때까지 폴리뉴클레오타이드(150)를 반복해서 시퀀싱하기 위해 임의의 목적하는 횟수만큼 반복될 수 있다. 예를 들어, 정확도는, 오류가 무작위적이고 당업계에 알려진 합의 알고리즘의 사용을 통해 "평균화"될 수 있는 경우, 동일한 주형의 다수의 판독물을 조합하는 방식으로 개선된다.
폴리뉴클레오타이드(150)를 임의의 목적하는 횟수(들)만큼 완전히 또는 부분적으로 시퀀싱한 후, 또는 대안적으로 폴리뉴클레오타이드(150)를 한 번만 시퀀싱하거나 심지어 폴리뉴클레오타이드(150)를 부분적으로만 시퀀싱한 후, 회로(160)는 나노공극(110)이 상이한 폴리뉴클레오타이드와 함께 다시 사용될 수 있도록, 선택적으로 나노공극(110)과의 접촉에서 폴리뉴클레오타이드(150)를 배출할 수 있다. 예를 들어, 도 5a와 도 5b는, 상이한 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하기 위해 나노공극을 제조하기 위한 도 1a 내지 도 1g의 시퀀싱 시스템의 사용을 개략적으로 예시한 것이다. 도 5a에 예시된 바와 같은 방식으로, 회로(160)는 제1 입체형 잠금장치(151)를 폴리뉴클레오타이드(150)에서 해리시키기에 충분히 큰 힘(F5)(힘 F4보다 클 수 있음)을 가하도록 구성될 수 있다. 대안적으로, 도 5b에 예시된 바와 같은 방식으로, 회로(160)는 제2 입체형 잠금장치(152)를 폴리뉴클레오타이드(150)에서 해리시키기에 충분히 큰 힘(F6)을 가하도록 구성될 수 있다. 이어서, 나노공극은, 예를 들어 본원에 제공된 바와 같은 방식으로 시퀀싱(및 선택적으로 재시퀀싱)될 수 있는 상이한 폴리뉴클레오타이드(150)를 배치하는 방식으로 재순환될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드(150)는 임의의 적합한 구조(들)와 임의의 적합한 작업 조합을 사용하여 선택적으로 나노공극(110) 내에 배치되고, 선택적으로 나노공극(110)에 잠금될 수 있다. 예를 들어, 도 6은, 시퀀싱 또는 폴리뉴클레오타이드 합성을 위해 폴리뉴클레오타이드를 생성하고 사용하기 위한 도 1a 내지 도 1h의 시퀀싱 시스템의 사용을 개략적으로 예시한 것이다. 도 6에 예시된 작업 A에서, 제1 입체형 잠금장치(151)는 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단(150)에 커플링될 수 있으며, 선택적으로 해당 폴리뉴클레오타이드는 이의 자연 발생 상보 가닥(150')에 혼성화된다. 예시적으로, 폴리뉴클레오타이드(150)의 3' 말단은 비오틴화되거나 또는 달리 관능화될 수 있으며, 제1 입체형 잠금장치(151)는 폴리뉴클레오타이드(150)의 관능화된(예를 들어, 비오틴화된) 3' 말단에 결합하여, 도 5a를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로 충분히 강한 힘이 가해질 때까지 결합된 상태를 유지하는 관능기(예컨대, 뉴트라비딘(neutravidin) 또는 스트렙타비딘(streptavidin))를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 제1 입체형 잠금장치(151)는 폴리뉴클레오타이드(150)에 혼성화되고, 도 5a를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로 충분히 강한 힘이 가해질 때까지 폴리뉴클레오타이드(150)에 혼성화된 상태를 유지하도록 충분한 길이를 갖는 LNA 또는 PNA를 포함할 수 있다. 도 6에 예시된 작업 B에서, 나노공극(110)의 제1 측(111)은 이중체(150, 150')와 접촉하고 있을 수 있다. 도 6에 예시된 작업 C에서, 회로(160)는, 가닥(150)의 5' 말단이 나노공극(110)을 통해 전위되는 동안, 폴리뉴클레오타이드(150)에서 상보 가닥(150')을 해리시키는데 충분한 힘을 가한다. 이러한 힘을 가하는 동안, 제1 입체형 잠금장치(151)는 도 1a 내지 도 1e를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로 폴리뉴클레오타이드(150)의 3' 말단이 개구부를 통해 나노공극의 제2 측으로 이동하는 것을 저해할 수 있다. 이어서, 제2 입체형 잠금장치(152)는 폴리뉴클레오타이드(150)의 5' 말단에 커플링될 수 있다. 예시적으로, 제2 입체형 잠금장치(152)는 폴리뉴클레오타이드(150)에 혼성화되고, 도 5b를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로 충분히 강한 힘이 가해질 때까지 폴리뉴클레오타이드(150)에 혼성화된 상태를 유지하도록 충분한 길이를 갖는 LNA 또는 PNA를 포함할 수 있다. 도 6d에 예시된 작업 D에서, 폴리뉴클레오타이드(140)는 폴리뉴클레오타이드(150)에 혼성화되어 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 방식으로 폴리뉴클레오타이드(150)를 시퀀싱하는 데 사용될 수 있는 이중체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 도 6에 예시된 작업 E1와 E2에서, 폴리머라아제(105)는 폴리뉴클레오타이드(150)의 서열에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 뉴클레오타이드(121)를 부가할 수 있으며, 선택적으로, 도 6에 예시된 작업 E2에서, 뉴클레오타이드는 차단 모이어티(234)에 커플링될 수 있다. 뉴클레오타이드를 식별하고 추가의 뉴클레오타이드를 부가하는 작업은 본원의 다른 곳에 제공되어 있다. 작업 A에서 부가된 제1 입체형 잠금장치(151)는 도 5a를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로 폴리뉴클레오타이드(150)에서 제거될 수 있다. 작업 C에서 부가된 제2 입체형 잠금장치(152)는 도 5b를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로 폴리뉴클레오타이드(150)에서 제거될 수 있다.
도 1a 내지 도 1h, 도 2a 내지 도 2e, 도 3, 도 4a 내지 도 4c, 도 5a와 도 5b, 도 6, 도 7, 도 8a 내지 도 8e, 도 9, 및 도 10을 참조로 기재된 바와 같은 시스템, 조성물 및 작업은, 비제한적으로, 합성에 의한 시퀀싱(SBS)을 포함하는 다양한 폴리뉴클레오타이드 합성 방법에서의 사용을 위해 적절하게 조정될 수 있다고 추가로 이해될 것이다.
전술한 내용으로부터, 본 개시내용은 하기 조항에 인용된 것들을 제공함을 이해해야 한다:
조항 1. 제1 측, 제2 측, 및 제1 측과 제2 측을 통해 연장되는 개구부를 포함하는 나노공극을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단이 나노공극의 제1 측에 있고, 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단이 나노공극의 제2 측에 있도록 나노공극의 개구부를 통해 폴리뉴클레오타이드를 배치하는 작업 (a)를 포함한다. 상기 방법은 또한 나노공극의 제1 측에 폴리뉴클레오타이드로 3' 말단을 포함하는 이중체를 형성하는 작업 (b)를 포함한다. 상기 방법은 또한 이중체의 3' 말단에 제1 뉴클레오타이드를 부가하는 방식으로 나노공극의 제1 측에서 이중체를 연장시키는 작업 (c)를 포함한다. 상기 방법은 또한 연장된 이중체의 3' 말단을 개구부 내에 배치하는 제1 힘을 가하고, 제1 힘을 가하는 동안, 나노공극을 사용하여 연장된 이중체의 3' 말단이 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해하고, 연장된 이중체의 3' 말단과 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 전기적 특성 값을 측정하는 작업 (d)를 포함한다. 상기 방법은 또한 작업 (d)에서 측정된 값을 사용하여 제1 뉴클레오타이드를 식별하는 작업 (e)를 포함한다.
조항 2. 조항 1에 있어서, 작업 (d)에서 측정된 값이 나노공극에 걸친 전류, 이온 전류, 전기 저항 또는 전압 강하를 포함하는, 방법.
조항 3. 조항 1 또는 조항 2에 있어서, 작업 (d)에서 측정된 값이 나노공극에 걸친 전류, 이온 전류, 전기 저항 또는 전압 강하의 노이즈를 포함하는, 방법.
조항 4. 조항 3에 있어서, 작업 (d)에서 측정된 값이 노이즈의 표준편차를 포함하는, 방법.
조항 5. 조항 1 내지 조항 4 중 어느 하나에 있어서, 작업 (d)에서 측정된 값이 적어도 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 M개의 뉴클레오타이드와 연장된 이중체의 D개의 혼성화된 뉴클레오타이드 쌍을 기반으로 하며, 여기서 M은 2 이상이고, D는 1 이상인, 방법.
조항 6. 조항 5에 있어서, M이 3 이상인, 방법.
조항 7. 조항 5 또는 조항 6에 있어서, D가 2 이상인, 방법.
조항 8. 조항 5 내지 조항 7 중 어느 하나에 있어서, 단일 가닥 부분의 M개의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나가 변형된 염기를 포함하고, 상기 방법이 작업 (d)에서 측정된 값을 사용하여 변형된 염기를 식별하는 작업을 포함하는, 방법.
조항 9. 조항 8에 있어서, 변형된 염기가 메틸화된 염기를 포함하는, 방법.
조항 10. 조항 1 내지 조항 9 중 어느 하나에 있어서, 작업 (d)에서 제1 힘이 가해지는 동안 연장된 이중체의 3' 말단에 또 다른 뉴클레오타이드가 부가되는 것을 저해하는 작업을 추가로 포함하는 방법.
조항 11. 조항 10에 있어서, 나노공극이 또 다른 뉴클레오타이드의 부가를 저해하는, 방법.
조항 12. 조항 1 내지 조항 11 중 어느 하나에 있어서, 나노공극이, 나노공극의 제1 측이 개구부의 대부분을 포함하도록 배향되는, 방법.
조항 13. 조항 1 내지 조항 11 중 어느 하나에 있어서, 나노공극이, 나노공극의 제2 측이 개구부의 대부분을 포함하도록 배향되는, 방법.
조항 14. 조항 1 내지 조항 13 중 어느 하나에 있어서, 연장된 이중체의 3' 말단을 개구부 내에 배치하는 변형된 제1 힘을 가하고, 변형된 제1 힘을 가하는 동안, 나노공극을 사용하여 연장된 이중체의 3' 말단이 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해하고, 연장된 이중체의 3' 말단과 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 전기적 특성 값을 측정하는 작업 (f)와; 작업 (f)에서 측정된 값을 사용하여 제1 뉴클레오타이드를 식별하는 작업 (g)를 추가로 포함하는 방법.
조항 15. 조항 1 내지 조항 14 중 어느 하나에 있어서, 제1 뉴클레오타이드가 이중체의 3' 말단과 접촉하고 있는 폴리머라아제를 사용하여 부가되는, 방법.
조항 16. 조항 15에 있어서, 폴리머라아제가 연장된 이중체의 3' 말단에 제2 뉴클레오타이드를 부가하는 것을 가역적으로 저해하는 작업을 추가로 포함하는 방법.
조항 17. 조항 16에 있어서, 차단 모이어티가, 폴리머라아제가 연장된 이중체의 3' 말단에 제2 뉴클레오타이드를 부가하는 것을 가역적으로 저해하는, 방법.
조항 18. 조항 17에 있어서, 제1 뉴클레오타이드가 차단 모이어티에 커플링되는, 방법.
조항 19. 조항 18에 있어서, 차단 모이어티가 3'-차단기를 포함하는, 방법.
조항 20. 조항 17에 있어서, 차단 모이어티가 연장된 이중체와 가역적으로 회합되는, 방법.
조항 21. 조항 20에 있어서, 차단 모이어티와 연장된 이중체의 회합을 검출하는 작업을 추가로 포함하는 방법.
조항 22. 조항 20 또는 조항 21에 있어서, 연장된 이중체에서 차단 모이어티의 부재를 검출하는 작업을 추가로 포함하는 방법.
조항 23. 조항 17 내지 조항 22 중 어느 하나에 있어서, 폴리머라아제가 연장된 이중체의 3' 말단에 제2 뉴클레오타이드를 부가할 수 있도록 차단 모이어티를 제거하는 작업을 추가로 포함하는 방법.
조항 24. 조항 15 내지 조항 23 중 어느 하나에 있어서, 작업 (d)에서 가해진 제1 힘이 연장된 이중체의 3' 말단과의 접촉에서 폴리머라아제를 제거하는, 방법.
조항 25. 조항 15 내지 조항 23 중 어느 하나에 있어서, 연장된 이중체의 3' 말단과의 접촉에서 폴리머라아제를 제거하기 위해 제2 힘을 가하는 작업으로서, 여기서 제2 힘이 제1 힘보다 큰 작업을 추가로 포함하는 방법.
조항 26. 조항 15 내지 조항 25 중 어느 하나에 있어서, 이중체의 3' 말단과 접촉하고 있는 폴리머라아제를 나노공극의 제1 측의 개구부 내부 또는 근처에 배치하는 제3 힘을 가하고, 제3 힘을 가하는 동안 나노공극을 사용하여 폴리머라아제가 개구부 안으로 또는 개구부 더 안쪽으로 이동하는 것을 저해하고, 폴리머라아제의 전기적 특성 값을 측정하는 작업 (f)와; 작업 (f)에서 측정된 값을 사용하여 이중체의 3' 말단과 폴리머라아제의 접촉을 식별하는 작업 (g)를 추가로 포함하는 방법.
조항 27. 조항 26에 있어서, 제3 힘이 제1 힘보다 작은, 방법.
조항 28. 조항 26 또는 조항 27에 있어서, 작업 (f)가 작업 (c) 이후에, 작업 (d) 이전에 수행되는, 방법.
조항 29. 조항 26 내지 조항 28 중 어느 하나에 있어서, 제1 뉴클레오타이드가 차단 모이어티와 회합되는, 방법.
조항 30. 조항 29에 있어서, 작업 (g)가 작업 (f)에서 측정된 값을 사용하여 제1 뉴클레오타이드와 회합된 차단 모이어티의 존재를 확인하는 작업을 추가로 포함하는, 방법.
조항 31. 조항 15 내지 조항 30 중 어느 하나에 있어서, 폴리머라아제가 DNA 폴리머라아제를 포함하는, 방법.
조항 32. 조항 15 내지 조항 30 중 어느 하나에 있어서, 폴리머라아제가 RNA 폴리머라아제를 포함하는, 방법.
조항 33. 조항 15 내지 조항 30 중 어느 하나에 있어서, 폴리머라아제가 역전사효소를 포함하는, 방법.
조항 34. 조항 1 내지 조항 33 중 어느 하나에 있어서, 제1 뉴클레오타이드가 차단 모이어티와 회합되며, 작업 (e)가 작업 (d)에서 측정된 값을 사용하여 뉴클레오타이드와 회합된 차단 모이어티의 존재를 확인하는 작업을 추가로 포함하는, 방법.
조항 35. 조항 34에 있어서, 작업 (d) 후에 제1 뉴클레오타이드에서 차단 모이어티를 제거하는 작업을 추가로 포함하는 방법.
조항 36. 조항 35에 있어서, 차단 모이어티를 제거한 후, 연장된 이중체의 3' 말단을 개구부 내에 배치하고 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분을 개구부 내에 배치하는 제1 힘을 다시 가하고, 제1 힘을 다시 가하는 동안, 나노공극을 사용하여 연장된 이중체의 3' 말단이 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해하고, 연장된 이중체의 3' 말단과 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 전기적 특성 값을 측정하는 작업 (f)와; 작업 (f)에서 측정된 값을 사용하여 제1 뉴클레오타이드를 다시 식별하는 작업 (g)를 추가로 포함하는 방법.
조항 37. 조항 36에 있어서, 작업 (d) 전에 제1 뉴클레오타이드에서 차단 모이어티를 제거하는 작업을 추가로 포함하는 방법.
조항 38. 조항 1 내지 조항 37 중 어느 하나에 있어서, 연장된 이중체가 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는, 방법.
조항 39. 조항 38에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 천연 뉴클레오타이드에 비해 연장된 이중체의 안정성을 증강시키는, 방법.
조항 40. 조항 38 또는 조항 39에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 하나 이상의 잠금 핵산(LNA)을 포함하는, 방법.
조항 41. 조항 38 내지 조항 40 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 하나 이상의 2'-메톡시(2'-OMe) 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
조항 42. 조항 38 내지 조항 41 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 하나 이상의 2'-플루오린화된(2'-F) 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
조항 43. 조항 38 내지 조항 42 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 천연 뉴클레오타이드와 비교하여 전기적 특성 값을 변경시키는, 방법.
조항 44. 조항 38 내지 조항 43 중 어느 하나에 있어서, 제1 뉴클레오타이드가 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체 중 하나를 포함하는, 방법.
조항 45. 조항 45에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 2' 변형을 포함하는, 방법.
조항 46. 조항 44 또는 조항 45에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 염기 변형을 포함하는, 방법.
조항 47. 조항 1 내지 조항 46 중 어느 하나에 있어서, 제1 힘이 연장된 이중체의 해리를 야기할 만큼 충분히 강하지 않은, 방법.
조항 48. 조항 1 내지 조항 47 중 어느 하나에 있어서, 제1 힘이 제1 전압을 포함하는, 방법.
조항 49. 조항 1 내지 조항 48 중 어느 하나에 있어서, 작업 (b)와 작업 (c)가 제1 힘의 부재 하에서 수행되는, 방법.
조항 50. 조항 1 내지 조항 49 중 어느 하나에 있어서, 작업 (c)가 제1 힘에 반대되는 제4 힘의 존재 하에서 수행되는, 방법.
조항 51. 조항 1 내지 조항 50 중 어느 하나에 있어서, 제1 잠금 구조가 나노공극의 제1 측에 있는 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단에 커플링되며, 제1 잠금 구조가 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단이 개구부를 통해 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해하는, 방법.
조항 52. 조항 51에 있어서, 제1 잠금 구조가 제거 가능한 것인, 방법.
조항 53. 조항 1 내지 조항 52 중 어느 하나에 있어서, 제2 잠금 구조가 나노공극의 제2 측에 있는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단에 커플링되며, 제2 잠금 구조가 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단이 개구부를 통해 나노공극의 제1 측으로 전위되는 것을 저해하는, 방법.
조항 54. 조항 53에 있어서, 제2 잠금 구조가 제거 가능한 것인, 방법.
조항 55. 조항 1 내지 조항 54 중 어느 하나에 있어서, 작업 (d) 후에 폴리뉴클레오타이드에서 연장된 이중체를 해리시키고, 나노공극의 제1 측에 폴리뉴클레오타이드로 새로운 3' 말단을 포함하는 새로운 이중체를 형성하는 작업을 추가로 포함하는 방법.
조항 56. 조항 1 내지 조항 55 중 어느 하나에 있어서, 작업 (a)가, 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오타이드에 혼성화된 폴리뉴클레오타이드와 나노공극을 접촉시키고, 폴리뉴클레오타이드에서 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 탈혼성화시키는 제6 힘을 가하는 작업을 포함하는, 방법.
조항 57. 조항 1 내지 조항 56 중 어느 하나에 있어서, 나노공극이 고체 상태 나노공극을 포함하는, 방법.
조항 58. 조항 1 내지 조항 57 중 어느 하나에 있어서, 나노공극이 생물학적 나노공극을 포함하는, 방법.
조항 59. 조항 58에 있어서, 생물학적 나노공극이 MspA를 포함하는, 방법.
조항 60. 조항 1 내지 조항 59 중 어느 하나에 있어서, 제1 폴리뉴클레오타이드가 RNA를 포함하는, 방법.
조항 61. 조항 1 내지 조항 59 중 어느 하나에 있어서, 제1 폴리뉴클레오타이드가 DNA를 포함하는, 방법.
조항 62. 조항 1 내지 조항 61 중 어느 하나에 있어서, 연장된 이중체가 폴리뉴클레오타이드에 혼성화된 프라이머를 포함하는, 방법.
조항 63. 제1 측, 제2 측, 및 제1 측과 제2 측을 통해 연장되는 개구부를 포함하는 나노공극을 포함하는 시퀀싱 시스템이 제공된다. 상기 시스템은 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단이 나노공극의 제1 측에 있고, 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단이 나노공극의 제2 측에 있도록 나노공극의 개구부를 통해 배치된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 시스템은 나노공극의 제1 측에 배치된 폴리뉴클레오타이드의 이중체로서, 제1 뉴클레오타이드가 배치되는 3' 말단을 포함하는 이중체를 포함한다. 상기 시스템은 이중체의 3' 말단을 개구부 내에 배치하는 제1 힘을 가하고, 제1 힘을 가하는 동안 이중체의 3' 말단과 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 전기적 특성 값을 측정하고, 측정값을 사용하여 제1 뉴클레오타이드를 식별하도록 구성된 회로로서, 여기서 제1 힘이 가해지는 동안 나노공극은 이중체(154)의 3' 말단(153)이 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해하는 회로를 포함한다.
조항 64. 조항 63에 있어서, 회로에 의해 측정된 값이 나노공극에 걸친 전류, 이온 전류, 전기 저항 또는 전압 강하를 포함하는, 시스템.
조항 65. 조항 63 또는 조항 64에 있어서, 회로에 의해 측정된 값이 나노공극에 걸친 전류, 이온 전류, 전기 저항 또는 전압 강하의 노이즈를 포함하는, 시스템.
조항 66. 조항 65에 있어서, 회로에 의해 측정된 값이 노이즈의 표준편차를 포함하는, 시스템.
조항 67. 조항 63 내지 조항 66 중 어느 하나에 있어서, 회로에 의해 측정된 값이 적어도 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 M개의 뉴클레오타이드와 이중체의 D개의 혼성화된 뉴클레오타이드 쌍을 기반으로 하며, 여기서 M은 2 이상이고, D는 1 이상인, 시스템.
조항 68. 조항 67에 있어서, M이 3 이상인, 시스템.
조항 69. 조항 67 또는 조항 68에 있어서, D가 2 이상인, 시스템.
조항 70. 조항 67 내지 조항 69 중 어느 하나에 있어서, 단일 가닥 부분의 M개의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나가 변형된 염기를 포함하고, 회로가 회로에 의해 측정된 값을 사용하여 변형된 염기를 식별하도록 구성되어 있는, 시스템.
조항 71. 조항 70에 있어서, 변형된 염기가 메틸화된 염기를 포함하는, 시스템.
조항 72. 조항 63 내지 조항 71 중 어느 하나에 있어서, 제1 힘이 가해지는 동안 이중체의 3' 말단에 또 다른 뉴클레오타이드가 부가되는 것이 저해되는, 시스템.
조항 73. 조항 72에 있어서, 나노공극이 또 다른 뉴클레오타이드의 부가를 저해하는, 시스템.
조항 74. 조항 63 내지 조항 73 중 어느 하나에 있어서, 나노공극이, 나노공극의 제1 측이 개구부의 대부분을 포함하도록 배향되는, 시스템.
조항 75. 조항 63 내지 조항 73 중 어느 하나에 있어서, 나노공극이, 나노공극의 제2 측이 개구부의 대부분을 포함하도록 배향되는, 시스템.
조항 76. 조항 63 내지 조항 75 중 어느 하나에 있어서, 회로가, 변형된 제1 힘을 가하는 동안 이중체의 3' 말단을 개구부 내에 다시 배치하고, 변형된 제1 힘을 가하는 동안 이중체의 3' 말단과 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 전기적 특성 값을 측정하고, 측정값을 사용하여 제1 뉴클레오타이드를 식별하도록 추가로 구성되어 있으며, 여기서 변형된 제1 힘이 가해지는 동안 나노공극은 이중체(154)의 3' 말단(153)이 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해하는, 시스템.
조항 77. 조항 63 내지 조항 76 중 어느 하나에 있어서, 이중체의 3' 말단과 접촉하고 있으며 제1 뉴클레오타이드를 부가하는 폴리머라아제를 추가로 포함하는 시스템.
조항 78. 조항 77에 있어서, 폴리머라아제가 이중체의 3' 말단에 제2 뉴클레오타이드를 부가하는 것이 가역적으로 저해되는, 시스템.
조항 79. 조항 78에 있어서, 폴리머라아제가 이중체의 3' 말단에 제2 뉴클레오타이드를 부가하는 것을 가역적으로 저해하는 차단 모이어티를 추가로 포함하는 시스템.
조항 80. 조항 79에 있어서, 제1 뉴클레오타이드가 차단 모이어티에 커플링되는, 시스템.
조항 81. 조항 80에 있어서, 차단 모이어티가 3'-차단기를 포함하는, 시스템.
조항 82. 조항 79에 있어서, 차단 모이어티가 이중체와 가역적으로 회합되는, 시스템.
조항 83. 조항 82에 있어서, 회로가 이중체와 차단 모이어티의 회합을 검출하도록 추가로 구성되어 있는, 시스템.
조항 84. 조항 82 또는 조항 83에 있어서, 회로가 이중체에서 차단 모이어티의 부재를 검출하도록 추가로 구성되어 있는, 시스템.
조항 85. 조항 79 내지 조항 84 중 어느 하나에 있어서, 폴리머라아제가 이중체의 3' 말단에 제2 뉴클레오타이드를 부가할 수 있도록 차단 모이어티가 제거 가능한 것인, 시스템.
조항 86. 조항 78 내지 조항 85 중 어느 하나에 있어서, 제1 힘이 이중체의 3' 말단과의 접촉에서 폴리머라아제를 제거하는, 시스템.
조항 87. 조항 78 내지 조항 86 중 어느 하나에 있어서, 회로가 이중체의 3' 말단과의 접촉에서 폴리머라아제를 제거하기 위해 제2 힘을 가하도록 추가로 구성되어 있으며, 여기서 제2 힘이 제1 힘보다 큰, 시스템.
조항 88. 조항 78 내지 조항 87 중 어느 하나에 있어서, 회로가, 이중체의 3' 말단과 접촉하고 있는 폴리머라아제를 나노공극의 제1 측의 개구부 내부 또는 근처에 배치하는 제3 힘을 가하고, 제3 힘을 가하는 동안 폴리머라아제의 전기적 특성 값을 측정하고, 측정값을 사용하여 이중체의 3' 말단과 폴리머라아제의 접촉을 식별하도록 추가로 구성되어 있으며, 여기서 나노공극은 폴리머라아제가 개구부 안으로 또는 더 안쪽으로 이동하는 것을 저해하는, 시스템.
조항 89. 조항 88에 있어서, 제3 힘이 제1 힘보다 작은, 시스템.
조항 90. 조항 88 또는 조항 89에 있어서, 회로가 제1 힘을 가하기 전에 제3 힘을 가하도록 구성되어 있는, 시스템.
조항 91. 조항 88 내지 조항 90 중 어느 하나에 있어서, 제1 뉴클레오타이드가 차단 모이어티와 회합되는, 시스템.
조항 92. 조항 91에 있어서, 회로가 측정값을 사용하여 제1 뉴클레오타이드와 회합된 차단 모이어티의 존재를 확인하도록 구성되어 있는, 시스템.
조항 93. 조항 77 내지 조항 92 중 어느 하나에 있어서, 폴리머라아제가 DNA 폴리머라아제를 포함하는, 시스템.
조항 94. 조항 77 내지 조항 92 중 어느 하나에 있어서, 폴리머라아제가 RNA 폴리머라아제를 포함하는, 시스템.
조항 95. 조항 77 내지 조항 92 중 어느 하나에 있어서, 폴리머라아제가 역전사효소를 포함하는, 시스템.
조항 96. 조항 63 내지 조항 95 중 어느 하나에 있어서, 제1 뉴클레오타이드가 차단 모이어티와 회합되며, 회로가 측정값을 사용하여 뉴클레오타이드와 회합된 차단 모이어티의 존재를 확인하도록 추가로 구성되어 있는, 시스템.
조항 97. 조항 96에 있어서, 차단 모이어티가 제1 힘을 가한 후에 제1 뉴클레오타이드에서 제거되는, 시스템.
조항 98. 조항 97에 있어서, 회로가, 차단 모이어티가 제거된 후, 이중체의 3' 말단을 개구부 내에 배치하고 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분을 개구부 내에 배치하는 제1 힘을 다시 가하고, 제1 힘을 다시 가하는 동안 이중체의 3' 말단과 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 전기적 특성 값을 측정하고, 측정값을 사용하여 제1 뉴클레오타이드를 다시 식별하도록 구성되어 있으며, 여기서 나노공극은 이중체의 3' 말단이 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해하는, 시스템.
조항 99. 조항 98에 있어서, 차단 모이어티가 제1 힘이 가해지기 전에 제1 뉴클레오타이드에서 제거되는, 시스템.
조항 100. 조항 63 내지 조항 99 중 어느 하나에 있어서, 이중체가 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는, 시스템.
조항 101. 조항 100에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 천연 뉴클레오타이드에 비해 이중체의 안정성을 증강시키는, 시스템.
조항 102. 조항 100 또는 조항 101에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 하나 이상의 잠금 핵산(LNA)을 포함하는, 시스템.
조항 103. 조항 100 내지 조항 102 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 하나 이상의 2'-메톡시(2'-OMe) 뉴클레오타이드를 포함하는, 시스템.
조항 104. 조항 100 내지 조항 103 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 하나 이상의 2'-플루오린화된(2'-F) 뉴클레오타이드를 포함하는, 시스템.
조항 105. 조항 100 내지 조항 104 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 천연 뉴클레오타이드와 비교하여 전기적 특성 값을 변경시키는, 시스템.
조항 106. 조항 100 내지 조항 105 중 어느 하나에 있어서, 제1 뉴클레오타이드가 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체 중 하나를 포함하는, 시스템.
조항 107. 조항 106에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 2' 변형을 포함하는, 시스템.
조항 108. 조항 106 또는 조항 107에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 염기 변형을 포함하는, 시스템.
조항 109. 조항 63 내지 조항 108 중 어느 하나에 있어서, 제1 힘이 이중체의 해리를 야기할 만큼 충분히 강하지 않은, 시스템.
조항 110. 조항 63 내지 조항 109 중 어느 하나에 있어서, 제1 힘이 제1 전압을 포함하는, 시스템.
조항 120. 조항 63 내지 조항 110 중 어느 하나에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 개구부를 통해 배치되며, 이중체가 제1 힘의 부재 하에서 나노공극의 제1 측에 배치되는, 시스템.
조항 121. 조항 63 내지 조항 120 중 어느 하나에 있어서, 회로가 제1 힘에 반대되는 제4 힘을 가하도록 구성되어 있는, 시스템.
조항 122. 조항 63 내지 조항 121 중 어느 하나에 있어서, 제1 잠금 구조가 나노공극의 제1 측에 있는 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단에 커플링되며, 제1 잠금 구조가 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단이 개구부를 통해 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해하는, 시스템.
조항 123. 조항 122에 있어서, 제1 잠금 구조가 제거 가능한 것인, 시스템.
조항 124. 조항 63 내지 조항 123 중 어느 하나에 있어서, 제2 잠금 구조가 나노공극의 제2 측에 있는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단에 커플링되며, 제2 잠금 구조가 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단이 개구부를 통해 나노공극의 제1 측으로 전위되는 것을 저해하는, 시스템.
조항 125. 조항 124에 있어서, 제2 잠금 구조가 제거 가능한 것인, 시스템.
조항 126. 조항 63 내지 조항 125 중 어느 하나에 있어서, 회로가, 제1 힘을 가한 후, 폴리뉴클레오타이드에서 이중체를 해리시키도록 구성되어 있는, 시스템.
조항 127. 조항 63 내지 조항 126 중 어느 하나에 있어서, 회로가 나노공극의 개구부를 통해 폴리뉴클레오타이드를 배치하기 위해 폴리뉴클레오타이드에서 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 탈혼성화시키는 제6 힘을 가하도록 구성되어 있는, 시스템.
조항 128. 조항 63 내지 조항 127 중 어느 하나에 있어서, 나노공극이 고체 상태 나노공극을 포함하는, 시스템.
조항 129. 조항 63 내지 조항 128 중 어느 하나에 있어서, 나노공극이 생물학적 나노공극을 포함하는, 시스템.
조항 130. 조항 129에 있어서, 생물학적 나노공극이 MspA를 포함하는, 시스템.
조항 131. 조항 63 내지 조항 130 중 어느 하나에 있어서, 제1 폴리뉴클레오타이드가 RNA를 포함하는, 시스템.
조항 132. 조항 63 내지 조항 130 중 어느 하나에 있어서, 제1 폴리뉴클레오타이드가 DNA를 포함하는, 시스템.
조항 133. 조항 63 내지 조항 132 중 어느 하나에 있어서, 이중체가 폴리뉴클레오타이드에 혼성화된 프라이머를 포함하는, 시스템.
조항 134. 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 나노공극의 개구부 내의 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분과 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드의 이중체의 3' 말단의 전기적 특성의 복수의 측정값을 뉴클레오타이드 식별 모듈에 입력으로 제공하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 뉴클레오타이드 식별 모듈을 사용하여 복수의 측정값을 데이터 구조 내 값과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 데이터 구조는 상이한 측정값을, 나노공극의 개구부 내의 알려진 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분 내 뉴클레오타이드와 알려진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 알려진 이중체의 3' 말단 내 뉴클레오타이드의 상이한 조합과 상관시킨다. 상기 방법은 또한 비교를 사용하여 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드 서열에서 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위해 뉴클레오타이드 식별 모듈을 사용하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 결정된 뉴클레오타이드 서열의 표현을 뉴클레오타이드 식별 모듈로부터의 출력으로 수신하는 단계를 포함한다.
조항 135. 조항 134에 있어서, 뉴클레오타이드 식별 모듈이 훈련된 기계 학습 알고리즘을 포함하는, 방법.
조항 136. 조항 135에 있어서, 뉴클레오타이드 식별 모듈이 훈련된 딥러닝 알고리즘을 포함하는, 방법.
조항 137. 조항 135 또는 조항 136에 있어서, 데이터 구조가 훈련된 기계 학습 알고리즘의 뉴런을 포함하는, 방법.
조항 138. 조항 134 내지 조항 137 중 어느 하나에 있어서, 데이터 구조가 판독 맵을 포함하는, 방법.
조항 139. 조항 138에 있어서, 판독 맵이 알려진 이중체의 3' 말단 내 뉴클레오타이드와 알려진 뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분 내 뉴클레오타이드의 상이한 조합의 상이한 측정값과 표현을 저장하는 룩업 테이블을 포함하는, 방법.
조항 140. 조항 134 내지 조항 139 중 어느 하나에 있어서, 나노공극의 개구부를 사용하여 복수의 측정값을 생성하기 위해 컴퓨터를 통해 측정 모듈을 사용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
조항 141. 조항 134 내지 조항 140 중 어느 하나에 있어서, 나노공극의 개구부를 사용하여 데이터 구조를 생성하기 위해 컴퓨터를 통해 뉴클레오타이드 부가 모듈, 측정 모듈 및 뉴클레오타이드 식별 모듈을 사용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
조항 142. 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 시스템이 제공된다. 상기 시스템은 프로세서와, 나노공극의 개구부 내의 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분과 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 이중체의 3' 말단의 전기적 특성의 복수의 측정값을 저장하는 적어도 하나의 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함한다. 적어도 하나의 컴퓨터 판독 가능한 매체는 상이한 측정값을, 나노공극의 개구부 내의 알려진 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분 내 뉴클레오타이드와 알려진 이중체의 3' 말단 내 뉴클레오타이드의 상이한 조합과 상관시키는 데이터 구조를 추가로 저장한다. 적어도 하나의 컴퓨터 판독 가능한 매체는 프로세서가, 복수의 측정값을 데이터 구조 내 값과 비교하고, 비교를 사용하여 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드 서열에서 뉴클레오타이드 서열을 결정하고, 결정된 뉴클레오타이드 서열의 표현을 출력하는 것을 포함하는 작업을 실행하게 하도록 하는 명령을 추가로 저장한다.
조항 143. 조항 142에 있어서, 뉴클레오타이드 식별 모듈이 훈련된 기계 학습 알고리즘을 포함하는, 시스템.
조항 144. 조항 143에 있어서, 뉴클레오타이드 식별 모듈이 훈련된 딥러닝 알고리즘을 포함하는, 시스템.
조항 145. 조항 143 또는 조항 144에 있어서, 데이터 구조가 훈련된 기계 학습 알고리즘의 뉴런을 포함하는, 시스템.
조항 146. 조항 142 내지 조항 145 중 어느 하나에 있어서, 데이터 구조가 판독 맵을 포함하는, 시스템.
조항 147. 조항 146에 있어서, 판독 맵이 알려진 이중체의 3' 말단 내 뉴클레오타이드와 알려진 뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분 내 뉴클레오타이드의 상이한 조합의 상이한 측정값과 표현을 저장하는 룩업 테이블을 포함하는, 시스템.
조항 148. 조항 142 내지 조항 147 중 어느 하나에 있어서, 명령이 추가로, 프로세서가 나노공극의 개구부를 사용하여 복수의 측정값을 생성하도록 하기 위한 것인, 시스템.
조항 149. 조항 142 내지 조항 148 중 어느 하나에 있어서, 명령이 추가로, 프로세서가 나노공극의 개구부를 사용하여 데이터 구조를 생성하도록 하기 위한 것인, 시스템.
조항 150. 제1 측, 제2 측, 및 제1 측과 제2 측을 통해 연장되는 개구부를 포함하는 나노공극에 폴리뉴클레오타이드를 잠그는 방법이 제공된다. 상기 방법은 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단에 제1 잠금기를 커플링시키는 작업 (a)를 포함한다. 상기 방법은 또한 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단과 제1 잠금기가 나노공극의 제1 측에 있고, 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단이 나노공극의 제2 측에 있도록 나노공극의 개구부를 통해 폴리뉴클레오타이드를 배치하는 작업 (b)를 포함한다. 상기 방법은 또한 나노공극의 제2 측에 있는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단에 제2 잠금기를 커플링시키는 작업 (c)를 포함한다.
조항 151. 조항 150에 있어서, 제1 잠금기가 잠금 핵산(LNA) 또는 펩타이드 핵산(PNA)을 포함하는, 방법.
조항 152. 조항 150 또는 조항 151에 있어서, 제2 잠금기가 잠금 핵산(LNA) 또는 펩타이드 핵산(PNA)을 포함하는, 방법.
조항 153. 조항 150 내지 조항 152 중 어느 하나에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 작업 (a) 전에 상보적 폴리뉴클레오타이드에 혼성화되며, 상기 방법이 작업 (b)와 작업 (c) 사이에 상보적 폴리뉴클레오타이드를 탈혼성화시키는 작업을 추가로 포함하는, 방법.
작업 실시예
하기 실시예는 제한하려는 것이 아니라 순수하게 예시하기 위한 것으로 의도된다.
도 11은, 예시적인 주형 폴리뉴클레오타이드를 사용한 혼입 동안 측정된 값의 플롯을 시간의 함수로 예시한 것이다. 보다 구체적으로, 도 1a 내지 도 1h를 참조로 기재된 시스템(100)을 사용하였으며, 여기서 MspA는 나노공극(110)으로 사용하였다. 폴리뉴클레오타이드 140과 150은, 각각, 도 11에 제시된 서열을 가졌다. 보다 구체적으로, 폴리뉴클레오타이드 140은 서열 5'-TGGTCAGGTG TTTGCGTA(서열번호 5)를 가졌고, 폴리뉴클레오타이드 150은 서열 3'-ACCAGTCCAC AAACGCATAT TTCGTGTCGG ATAAACGAGT CTTGAXXXA CCCCCCCCC, 또는 동등하게, 5'-CCCCCCCCCA XXXAGTTCTG AGCAAATAGG CTGTGCTTTA TACGCAAACA CCTGACCA(서열번호 6)를 가졌으며, 여기서 "X"는 무염기성 뉴클레오타이드(무염기성 부위)를 나타내고, 볼드체는 도 11에 제시된 바와 같이 신호가 얻어진 폴리뉴클레오타이드 150 내 뉴클레오타이드를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드(150)는 무염기성 뉴클레오타이드를 포함하고 있었지만, 무염기성 뉴클레오타이드는 시퀀싱되지 않았던 폴리뉴클레오타이드(150)의 부분에 위치하였고, 무염기성 뉴클레오타이드는 사이클의 임의의 부분 동안 신호를 생성하는 데 사용되지 않았다는 점에 유의해야 한다.
회로(160)를 사용하여, 화살표(141)로 표시된 방향으로, 도 1b와 도 1d를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 폴리뉴클레오타이드(150)의 서열에 기반하여, 폴리머라아제(105)가 폴리뉴클레오타이드(140)에 변형되지 않은 뉴클레오타이드 dTTP, dATP, dCTP 및 dGTP를 부가하는 동안 제2 힘(F2)을 가하였다(여기서, 플롯 1101에서 40 ms 동안 및 플롯 1101의 연속에서 60 ms 동안 -50 mV 바이어스 전압을 인가함). 회로(160)를 사용하여, 도 1a, 도 1c 및 도 1e를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 이중체의 3' 말단(153)과 폴리뉴클레오타이드(140)의 단일 가닥 제2 부분(156)을 나노공극의 개구부 내에 배치하는 제1 힘(F1)을 또한 가하였다(여기서, 100 ms 동안 85 mV 바이어스 전압을 인가함). 회로(160)는 제1 힘과 제2 힘을 교대로 가하였다. 제1 힘을 가하는 동안, 회로(160)는 도 11의 플롯 1101에 제시된 바와 같이 나노공극을 통한 전류를 측정하였다. 평균 전류의 표준편차는 도 11의 플롯 1102에 제시되어 있다. 플롯 1101과 1102에서, 폴리뉴클레오타이드(150)에서 볼드체로 표시된 뉴클레오타이드 서열에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 부가된 것으로 추정된 뉴클레오타이드에 해당하는 상이한 값 수준이 표시되어 있다. 도 11의 각각의 포인트는 제1 힘이 가해졌던 100 ms 사이클 중 하나 동안 측정된 평균 전류(또는 이의 표준편차)에 해당한다.
먼저 플롯 1101로 돌아가면, 0초 시점에서 약 10 pA의 평균 전류는 폴리뉴클레오타이드(140)에 혼성화되지 않은 나노공극(110) 내에 배치된 폴리뉴클레오타이드(150)에 해당한다. 이어서, 평균 전류는 약 5초 내지 15초에 약 15.5 pA까지 증가하는데, 이는 폴리뉴클레오타이드(150)에 폴리뉴클레오타이드(140)(프라이머)가 어닐링된 것에 해당한다. 이어서, 평균 전류는 약 15초 내지 70초에 약 17 pA까지 증가하는데, 이는 아마도 폴리뉴클레오타이드(150) 내 다음 뉴클레오타이드 A에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 뉴클레오타이드 T가 부가된 것에 해당한다. 이어서, 평균 전류는 약 70초 내지 80초에 약 14 pA까지 감소하는데, 이는 아마도 폴리뉴클레오타이드(150) 내 다음 뉴클레오타이드 T에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 뉴클레오타이드 A가 부가된 것에 해당한다. 이어서, 평균 전류는 약 80초 내지 150초에 약 14 pA로 유지되는데, 이는 아마도 폴리뉴클레오타이드(150) 내 다음 뉴클레오타이드 T에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 또 다른 뉴클레오타이드 A가 부가된 것에 해당한다. 이어서, 평균 전류는 약 150초 내지 160초에 약 17 pA까지 증가하는데, 이는 아마도 폴리뉴클레오타이드(150) 내 다음 뉴클레오타이드 T에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 또 다른 뉴클레오타이드 A가 부가된 것에 해당한다. 이어서, 평균 전류는 약 160초 내지 162초에 약 16.5 pA까지 감소하는데, 이는 아마도 폴리뉴클레오타이드(150) 내 뉴클레오타이드 C에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 뉴클레오타이드 G가 부가된 것에 해당한다. 이어서, 평균 전류는 약 162초 내지 170초에 약 15.5 pA까지 감소하는데, 이는 아마도 폴리뉴클레오타이드(150) 내 뉴클레오타이드 G에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 뉴클레오타이드 C가 부가된 것에 해당한다. 이어서, 평균 전류는 약 170초 내지 185초에 약 11.5 pA까지 감소하는데, 이는 아마도 폴리뉴클레오타이드(150) 내 뉴클레오타이드 T에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 뉴클레오타이드 A가 부가된 것에 해당한다. 이어서, 평균 전류는 약 185초 내지 200초에 약 18 pA까지 증가하는데, 이는 아마도 폴리뉴클레오타이드(150) 내 뉴클레오타이드 G에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 뉴클레오타이드 C가 부가된 것에 해당한다. 이어서, 평균 전류는 약 200초 내지 240초에 약 14.5 pA까지 증가하는데, 이는 아마도 폴리뉴클레오타이드(150) 내 뉴클레오타이드 T에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 뉴클레오타이드 A가 부가된 것에 해당한다. 이어서, 평균 전류는 약 240초 내지 250초에 약 25 pA까지 증가하는데, 이는 아마도 폴리뉴클레오타이드(150) 내 뉴클레오타이드 C에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 뉴클레오타이드 G가 부가된 것에 해당한다. 유사한 방식으로, 추가의 뉴클레오타이드가 부가됨에 따라, 평균 전류는 측정 동안 이중체의 3' 말단에 있는 뉴클레오타이드와 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 영역(156) 내 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드의 특정 조합에 기반하여 계속 증가하거나 감소하였다.
플롯 1101로부터, 측정값의 변화를 시간의 함수로 사용하여 폴리뉴클레오타이드(140)(프라이머)가 초기에 폴리뉴클레오타이드(150)에 혼성화되는 시기를 확인할 수 있음을 이해할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드(150)에의 폴리뉴클레오타이드(140)의 혼성화에 응답하여 평균 전류가 약 10 pA에서 약 15.5 pA로 증가(약 50% 초과의 증가)하는 것으로 관찰되었다. 플롯 1101로부터, 뉴클레오타이드는 이중체의 3' 말단(153)에서 폴리뉴클레오타이드(140)에 부가될 수 있으며, 측정값의 변화를 시간의 함수로 사용하여 뉴클레오타이드가 폴리뉴클레오타이드(140)에 부가되는 시기를 확인할 수 있음을 또한 이해할 수 있다. 예를 들어, 평균 전류는 첫 번째 T의 부가에 따라 약 15.5 pA에서 약 17 pA로 증가하고, 이어서 첫 번째 A의 부가에 따라 약 17 pA에서 약 14 pA로 감소하는 것 등으로 관찰되었다. 평균 전류는 약 210% 초과의 변화로, 약 11.5 pA(네 번째 A) 내지 약 25 pA(두 번째 G) 범위로 관찰되었다.
플롯 1101로부터, 측정값의 변화는 이중체의 3' 말단(153)에 부가되는 특정 뉴클레오타이드뿐 아니라 다른 뉴클레오타이드도 기반으로 할 수 있음을 또한 이해할 수 있다. 예를 들어, 상기 언급된 5개의 상이한 A에 대한 각각의 평균 전류는 약 14 pA, 약 14 pA, 약 17 pA, 약 11.5 pA 및 약 14.5 pA였다(약 45% 초과의 변동). 측정된 평균 전류가 단지 A의 부가에만 기반한 것이라면, 각각의 이러한 부가에 대해 동일한 값이 예상될 것이다. 뉴클레오타이드의 일부 조합에서, 동일한 추가 뉴클레오타이드(예를 들어, 첫 번째 A와 두 번째 A)에 대해 유사한 측정값이 관찰되었지만, 뉴클레오타이드의 다른 조합에서는, 동일한 추가 뉴클레오타이드(예를 들어, 세 번째 A와 네 번째 A, 또는 첫 번째 G와 두 번째 G)에 대해 상이한 측정값이 관찰되었다.
이제 플롯 1102로 돌아가면, 표준편차는 플롯 1101을 참조로 기재된 평균 전류의 표준편차이다. 0초 시점에서 약 0.9 pA의 표준편차는 폴리뉴클레오타이드(140)에 혼성화되지 않은 나노공극(110) 내에 배치된 폴리뉴클레오타이드(150)에 해당한다. 이어서, 표준편차는 약 5초 내지 15초에 약 1.3 pA까지 증가하는데, 이는 폴리뉴클레오타이드(150)에 폴리뉴클레오타이드(140)(프라이머)가 어닐링된 것에 해당한다. 이어서, 표준편차는 약 15초 내지 70초에 약 1.3 pA로 유지되는데, 이는 아마도 폴리뉴클레오타이드(150) 내 다음 뉴클레오타이드 A에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 뉴클레오타이드 T가 부가된 것에 해당한다. 이어서, 표준편차는 약 70초 내지 80초에 약 1.4 pA까지 증가하는데, 이는 아마도 폴리뉴클레오타이드(150) 내 다음 뉴클레오타이드 T에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 뉴클레오타이드 A가 부가된 것에 해당한다. 이어서, 표준편차는 약 80초 내지 150초에 약 1.8 pA까지 증가하는데, 이는 아마도 폴리뉴클레오타이드(150) 내 다음 뉴클레오타이드 T에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 또 다른 뉴클레오타이드 A가 부가된 것에 해당한다. 이어서, 표준편차는 약 150초 내지 160초에 약 1.9 pA까지 증가하는 데, 이는 아마도 폴리뉴클레오타이드(150) 내 다음 뉴클레오타이드 T에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 또 다른 뉴클레오타이드 A가 부가된 것에 해당한다. 이어서, 표준편차는 약 160초 내지 162초에 약 1.4 pA까지 감소하는데, 이는 아마도 폴리뉴클레오타이드(150) 내 뉴클레오타이드 C에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 뉴클레오타이드 G가 부가된 것에 해당한다. 이어서, 표준편차는 약 162초 내지 170초에 약 1.3 pA까지 감소하는데, 이는 아마도 폴리뉴클레오타이드(150) 내 뉴클레오타이드 G에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 뉴클레오타이드 C가 부가된 것에 해당한다. 이어서, 표준편차는 약 170초 내지 185초에 약 1.3 pA로 유지되는데, 이는 아마도 폴리뉴클레오타이드(150) 내 뉴클레오타이드 T에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 뉴클레오타이드 A가 부가된 것에 해당한다. 이어서, 표준편차는 약 185초 내지 200초에 약 1.4 pA까지 증가하는데, 이는 아마도 폴리뉴클레오타이드(150) 내 뉴클레오타이드 G에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 뉴클레오타이드 C가 부가된 것에 해당한다. 이어서, 표준편차는 약 200초 내지 240초에 약 1.1 pA까지 감소하는데, 이는 아마도 폴리뉴클레오타이드(150) 내 뉴클레오타이드 T에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 뉴클레오타이드 A가 부가된 것에 해당한다. 이어서, 표준편차는 약 240초 내지 250초에 약 1.9 pA까지 증가하는데, 이는 아마도 폴리뉴클레오타이드(150) 내 뉴클레오타이드 C에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 뉴클레오타이드 G가 부가된 것에 해당한다. 유사한 방식으로, 추가의 뉴클레오타이드가 부가됨에 따라, 표준편차는 측정 동안 이중체의 3' 말단에 있는 뉴클레오타이드와 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 영역(156) 내 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드의 특정 조합에 기반하여 계속 증가하거나 감소하였다.
플롯 1102로부터, 표준편차의 변화를 시간의 함수로 사용하여 폴리뉴클레오타이드(140)(프라이머)가 초기에 폴리뉴클레오타이드(150)에 혼성화되는 시기를 확인할 수 있음을 이해할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드(150)에의 폴리뉴클레오타이드(140)의 혼성화에 응답하여 표준편차가 약 0.9 pA에서 약 1.3 pA로 증가(약 40% 초과의 증가)하는 것으로 관찰되었다. 플롯 1102로부터, 뉴클레오타이드는 이중체의 3' 말단(153)에서 폴리뉴클레오타이드(140)에 부가될 수 있으며, 표준편차의 변화를 시간의 함수로 사용하여 뉴클레오타이드가 폴리뉴클레오타이드(140)에 부가되는 시기를 확인할 수 있음을 또한 이해할 수 있다. 예를 들어, 표준편차는 첫 번째 A의 부가와 두 번째 A의 부가 사이에 약 1.4 pA에서 약 1.9 pA로 증가하는 것으로 등으로 관찰되었다. 표준편차는 약 70% 초과의 변화로, 약 1.1 pA(다섯 번째 A) 내지 약 1.9 pA(두 번째 G) 범위로 관찰되었다.
플롯 1102로부터, 표준편차의 변화는 이중체의 3' 말단(153)에 부가되는 특정 뉴클레오타이드뿐 아니라 다른 뉴클레오타이드도 기반으로 할 수 있음을 또한 이해할 수 있다. 예를 들어, 상기 언급된 5개의 상이한 A에 대한 각각의 표준편차는 약 1.4 pA, 약 1.8 pA, 약 1.9 pA, 약 1.3 pA 및 약 1.1 pA였다(약 70% 초과의 변동). 표준편차가 단지 A의 부가에만 기반한 것이라면, 각각의 이러한 부가에 대해 동일한 값이 예상될 것이다. 뉴클레오타이드의 일부 조합에서, 동일한 추가 뉴클레오타이드(예를 들어, 두 번째 A와 세 번째 A, 또는 첫 번째 A와 네 번째 A)에 대해 유사한 표준편차가 관찰되었지만, 뉴클레오타이드의 다른 조합에서는, 동일한 추가 뉴클레오타이드(예를 들어, 첫 번째 A와 다섯 번째 A)에 대해 상이한 표준편차가 관찰되었다.
플롯 1101과 1102로부터, 다수의 상이한 유형의 측정값을 사용하여 상이한 뉴클레오타이드 사이를 구별할 수 있음을 또한 이해할 수 있다. 예를 들어, 일부 뉴클레오타이드는 특정 측정 유형에 대해 서로 유사한 값을 갖고, 또 다른 측정 유형에 대해 서로 상이한 값을 가질 수 있다. 이러한 유사한 측정값은, 뉴클레오타이드를 서로 구별하는 데 추가 정보가 필요할 수 있기 때문에, 본원에서 "축퇴"로 지칭될 수 있다. 도 8e를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 추가 정보는 이러한 측정값의 표준편차를 포함할 수 있다. 예시적으로, 플롯 1101에 예시된 바와 같이, 첫 번째 A와 두 번째 A는 서로 유사한 평균 전류를 가질 수 있기 때문에, 특정 조건 하에서 측정된 해당 미터법에 대하여 "축퇴"로 간주될 수 있다. 하지만, 플롯 1102에 제시된 바와 같이, 첫 번째 A에 대한 평균 전류의 표준편차는 두 번째 A에 대한 평균 전류의 표준편차와 용이하게 구별될 수 있다. 따라서, 평균 전류만으로 특정 뉴클레오타이드를 구별하는 데 충분하지 않을 수 있더라도, 표준편차(또는 다른 유형의 측정값)는 이러한 뉴클레오타이드를 구별하는 데 충분할 수 있음을 이해할 수 있다. 반대로, 플롯 1102에 예시된 바와 같이, T와 첫 번째 A는 서로 유사한 표준편차를 가질 수 있기 때문에, 특정 조건 하에서 측정된 해당 미터법에 대하여 "축퇴"로 간주될 수 있다. 하지만, 플롯 1101에 제시된 바와 같이, T에 대한 평균 전류는 첫 번째 A에 대한 평균 전류와 용이하게 구별될 수 있다. 따라서, 이러한 특정 조건 하에서 측정되는 표준편차만으로 특정 뉴클레오타이드를 구별하는 데 충분하지 않을 수 있더라도, 평균 전류(또는 다른 유형의 측정값)는 이러한 뉴클레오타이드를 구별하는 데 충분할 수 있음을 이해할 수 있다. 이중체의 3' 말단(153)에 있는 뉴클레오타이드와 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 부분(156) 내 뉴클레오타이드의 조합을 특징분석하기 위한 다수의 상이한 유형의 정보를 사용하여 임의의 축퇴를 용이하게 해결할 수 있음을 또한 이해할 수 있다. 이러한 상이한 유형의 정보를 얻으려면 반드시 다수의 유형의 측정을 수행해야 하는 것은 아니지만, 동일한 측정 세트에서 상이한 유형의 정보(예시적으로, 측정값과 이의 표준편차)를 얻는 것을 포함할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 보다 일반적으로, 상이한 측정 조건 세트(예를 들어, 상이한 전압, 상이한 염 농도와 같은 상이한 유체 조성 등)를 사용하여 뉴클레오타이드의 동일한 서열을 상이한 방식으로 특징분석할 수 있으며, 이 중 적어도 일부는 "축퇴"되지 않기 때문에 뉴클레오타이드를 서로 구별할 수 있게 한다고 예상된다.
플롯 1101과 1102로부터, 폴리머라아제와 나노공극(110) 사이의 상호작용이 폴리뉴클레오타이드(140)의 임의의 추가 연장을 저해할 수 있을 만큼 폴리뉴클레오타이드(140)가 충분히 멀리 연장될 수 있음을 또한 이해할 수 있다. 예를 들어, 도 11에 예시된 창 1132는, 도 1b와 도 1d를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 회로(160)가 제2 힘(F2)을 가하여 잠금부(152)가 나노공극(110)에 대해 배치될 때의 폴리뉴클레오타이드(150)에 대한 MspA 나노공극(110)의 대략적인 위치를 예시한 것이다. 도 11에 예시된 바와 같은 작업 실시예는 창 1132에서 무염기성 뉴클레오타이드를 보여주지만, 천연 뉴클레오타이드, 비천연 뉴클레오타이드, 무염기성 뉴클레오타이드, 다른 적합한 화학적 구성요소 및 이들의 조합과 같은 임의의 적합한 구성요소가 창 1132에 사용될 수 있다. 도 11에 예시된 창 1131은, 폴리머라아제가 나노공극에 대해 배치되어 더 이상 이중체의 3' 말단(153)에 근접할 수 없을 정도로 폴리뉴클레오타이드(140)가 충분히 연장되었을 때의 폴리머라아제(105)의 대략적인 위치를 예시한 것이다.
도 1g, 도 4a 내지 도 4c, 도 8a 내지 도 8e, 및 도 9를 참조로 상기 언급된 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드(150)는 동일한 측정 조건 세트 또는 상이한 측정 조건 세트 하에서 시퀀싱되고 재시퀀싱될 수 있다. 도 12는, 특정 측정 조건 세트 하에서 예시적인 폴리뉴클레오타이드를 재시퀀싱하는 동안 측정된 값의 플롯을 예시한 것이다. 보다 구체적으로, 도 1a 내지 도 1h를 참조로 기재되고 MspA가 나노공극(110)으로 사용된 시스템(100)을, 도 11을 참조로 기재된 바와 유사한 방식으로 사용하였다. 과량의 프라이머(폴리뉴클레오타이드(140))와 폴리머라아제를 나노공극의 제1 측에 있는 유체에 부가하고, 프라이머를 폴리뉴클레오타이드(150)에 혼성화시켰다. 폴리뉴클레오타이드 140과 150은, 각각, 도 12에 제시된 서열을 가졌다(폴리뉴클레오타이드 150의 경우 3'-ATTTCGT-5'와, 폴리뉴클레오타이드 140의 경우 5'-TAAA-3'). 회로(160)를 사용하여, 화살표(141)로 표시된 방향으로, 도 1b와 도 1d를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 폴리머라아제(105)가 폴리뉴클레오타이드(150)의 서열에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 변형되지 않은 뉴클레오타이드 dTTP 및 dATP를 부가했던 동안 제2 힘(F2)(여기서, -50 mV 바이어스 전압)을 가하였다. dCTP도 존재했지만, 서열 T-A-A-A 이후에는 폴리뉴클레오타이드(140)의 연장을 저해해기 위해 dGTP를 배제하였다. 회로(160)를 사용하여, 도 1a, 도 1c 및 도 1e를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 이중체의 3' 말단(153)과 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 부분(156)을 나노공극의 개구부 내에 배치하는 제1 힘(F1)(여기서, 80 mV 바이어스 전압)을 또한 가하였다. 회로(160)는 100 ms 간격으로 제1 힘과 제2 힘을 교대로 가하였다. 제1 힘을 가하는 동안, 회로(160)는 도 12의 플롯 1201에 제시된 바와 같이 나노공극을 통한 전류를 측정하였다. 뉴클레오타이드 T-A-A-A가 폴리뉴클레오타이드(140)에 부가된 후, 연장된 폴리뉴클레오타이드(140)는 폴리뉴클레오타이드(150)에서 자발적으로 해리되었다. 이어서, 회로를 사용하여 다시 100 ms 간격으로 제1 힘과 제2 힘을 교대로 가하였다. 제2 힘을 가하는 동안, 도 4c를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 새로운 프라이머(폴리뉴클레오타이드(140))를 폴리뉴클레오타이드(150)에 혼성화시킨 후, 이러한 프라이머를 연장시켜 폴리뉴클레오타이드(150)를 재시퀀싱하였다. 이러한 스트리핑 및 재시퀀싱 사이클을 수차례 반복하였다.
플롯 1200에서, 상이한 값 수준은 범례에 표시된 바와 같이 다음과 같이 코딩되어 있다: 주형 단독 = 1206, 프라이머(주형에 혼성화됨) = 1201, 프라이머+T(주형에 혼성화됨) = 1202, 프라이머+TA(주형에 혼성화됨) = 1203, 프라이머+TAA(주형에 혼성화됨) = 1204, 프라이머+TAAA(주형에 혼성화됨) = 1205. 도 12의 각각의 포인트는 제1 힘이 가해지는 100 ms 사이클 중 하나 동안 측정된 평균 전류에 해당한다. 플롯 1200에서 볼 수 있는 바와 같이, 약 15초, 120초, 170초, 220초 및 260초의 시점에서의 평균 전류는 프라이머(1205)가 없는 주형(폴리뉴클레오타이드(150))의 평균 전류에 해당한다. 각각의 이러한 시간 이후에는 주형(1201)에 대한 프라이머(폴리뉴클레오타이드(140))의 혼성화에 해당하는 평균 전류가 이어졌다. 이어서, 각각의 이러한 시간 이후에는 프라이머에의 T(1202), 이어서 A(1203), 이어서 또 다른 A(1204), 그리고 이어서 또 다른 A(1205)의 순차적 부가에 해당하는 일련의 평균 전류가 이어졌다. 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 A의 부가에 대한 평균 전류는 서로 상이하게 나타날 수 있지만(1203, 1204, 1205를 서로 비교), 각각의 재시퀀싱 사이클에서 이러한 A는 각각 다른 사이클에서와 같이 동일한 평균 전류를 갖는 것으로 나타날 수 있다. 따라서, 도 12로부터, 폴리뉴클레오타이드는 연장된 폴리뉴클레오타이드(140)를 스트리핑해내고, 새로운 폴리뉴클레오타이드(140)를 부가하여 연장시키는 방식으로 반복적으로 재시퀀싱될 수 있고, 각각의 재시퀀싱 사이클 동안의 값은 폴리뉴클레오타이드(140)에 부가된 뉴클레오타이드의 서열, 따라서 폴리뉴클레오타이드(150)의 서열과 신뢰할 만하게 상관관계가 있음을 이해할 수 있다.
도 13a 내지 도 13c는, 상이한 측정 조건 세트 하에서 예시적인 폴리뉴클레오타이드를 재시퀀싱하는 동안 측정된 값의 플롯을 예시한 것이다. 보다 구체적으로, 도 1a 내지 도 1h를 참조로 기재되고 MspA가 나노공극(110)으로 사용된 시스템(100)을, 도 11과 도 12를 참조로 기재된 바와 유사한 방식으로 사용하였다.
폴리뉴클레오타이드 140과 150은, 각각, 도 12에 제시된 서열을 가졌다. 회로(160)를 사용하여, 화살표(141)로 표시된 방향으로, 도 1b와 도 1d를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 폴리머라아제(105)가 폴리뉴클레오타이드(150)의 서열에 기반하여 폴리뉴클레오타이드(140)에 변형되지 않은 뉴클레오타이드 dTTP 및 dATP를 부가했던 동안, 제2 힘(F2)(여기서, -50 mV 바이어스 전압)을 가하였다. dCTP도 존재했지만, 서열 T-A-A-A 이후에는 폴리뉴클레오타이드(140)의 연장을 저해해기 위해 dGTP를 배제하였다. 회로(160)를 사용하여, 특정 바이어스 전압(여기서, 각각 100 ms 동안 인가된 75 mV, 80 mV, 85 mV 및 90 mV 바이어스 전압)에 의해 생성된 몇 가지 상이한(변조된) 제1 힘(F1, F1', F1", F1"')을 또한 순차적으로 가하였다. 각각의 제1 힘은 도 1a, 도 1c 및 도 1e를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 이중체의 3' 말단(153)과 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 부분(156)을 나노공극의 개구부 내에 배치하였다. 임의의 이론에 구애됨 없이, 도 1g를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 상이한 힘으로 인해 이중체 내 뉴클레오타이드와 폴리뉴클레오타이드(150)의 단일 가닥 제2 부분 내 뉴클레오타이드가 나노공극과 상이하게 상호작용하여, 상이한 측정값이 생성되었다고 여겨진다. 4개의 상이한 제1 힘을 가한 후, 회로(160)는 제2 힘(100 ms 동안 -50 mV)을 가하여 또 다른 뉴클레오타이드를 부가하고, 이어서 4개의 상이한 제1 힘을 순차적으로 가하였다.
본원의 다른 곳에 기재된 바와 유사한 방식으로, 각각의 제1 힘을 가하는 동안, 회로(160)는 도 13a의 플롯 1301, 1302, 1303, 1304 각각에 제시된 바와 같이, 나노공극을 통한 평균 전류를 측정하였다. 뉴클레오타이드 T-A-A-A가 폴리뉴클레오타이드(140)에 부가된 후, 연장된 폴리뉴클레오타이드(140)는 폴리뉴클레오타이드(150)에서 해리되었으며, 이어서 도 4c를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로 새로운 프라이머(폴리뉴클레오타이드(140))를 폴리뉴클레오타이드(150)에 혼성화시키고, 연장시켜 폴리뉴클레오타이드(150)를 재시퀀싱하였다. 본 실시예에서 각각의 제1 힘을 100 ms 동안 가하면, 예를 들어 (4개의 전압 각각에서의 판독에 대한) 400 ms의 판독 사이클이 생성된다는 점에 유의해야 한다. 상이한 판독 전압 값의 플롯은 수직으로 표시되기 때문에, 모두 동일한 판독 사이클의 시작 시점을 참조한다. 선택적으로, 뉴클레오타이드가 이러한 판독을 이용하여 충분히 특징분석된 것으로 결정된 후, 힘(F2)을 가하여 다음 뉴클레오타이드를 혼입시킬 수 있다. 따라서, 각각의 사이클에 대해 단일 F2가 가해질 수 있으며, 다수의 상이한 판독 전압을 목적하는 만큼의 기간 동안 임의의 목적하는 서열에 인가할 수 있다고 이해될 것이다. 이어서, 전체 주형을 거친 후, F4를 가하여 주형을 스트리핑할 수 있으며, 새로운 프라이머를 사용하여 목적하는 횟수만큼 시퀀싱 과정을 반복할 수 있다.
플롯 1301에서, 90 mV 제1 힘(F1)에 대응하여, 상이한 값 수준은 프라이머(폴리뉴클레오타이드(140)) 또는 뉴클레오타이드 서열 T-A-A-A의 혼성화에 해당하는 상이한 채우기 모양(fill)을 사용하여 코딩되어 있으며, 각각의 포인트는 90 mV 제1 힘(F1"')이 가해지는 동안 100 ms 사이클 중 하나 동안 측정된 시간의 함수로서의 평균 전류에 해당한다. 플롯 1302는 85 mV 제1 힘(F1")을 이용하여 유사하게 얻었다. 플롯 1303은 80 mV 제1 힘(F1')을 이용하여 유사하게 얻었다. 플롯 1304는 75 mV 제1 힘(F1)을 이용하여 유사하게 얻었다. 플롯 1301, 1302, 1303 및 1304 각각에서 볼 수 있는 바와 같이, 약 0초 시점에서의 평균 전류는 프라이머가 없는 주형(폴리뉴클레오타이드(150))의 평균 전류에 해당하였다. 이후에는 주형에 대한 프라이머(폴리뉴클레오타이드(140))의 혼성화에 해당하는 평균 전류가 이어졌다. 이어서, 프라이머에의 T, A, A 및 A의 순차적 부가에 해당하는 일련의 평균 전류가 이어졌다. 플롯 1301, 1302, 1303 및 1304로부터, 소정의 제1 힘(F1) 하에서, 각각, 프라이머 또는 상이한 뉴클레오타이드에의 혼성화에 해당하는 평균 전류는 어떤 면에서는 서로 유사하고, 다른 면에서는 서로 상이함을 볼 수 있다.
도 13b의 플롯 1311, 1312, 1313 및 1314는, 각각, 플롯 1301, 1302, 1303 및 1304 내에서 원시 데이터의 비교를 용이하게 하기 위해 도 13a의 평균 전류 각각의 평균 신호 수준을 단계의 함수(서열 인덱스로도 지칭됨)로 예시한 것이다. 표시된 신호 수준은 특정 염기가 이중체(154)의 3' 말단(153)에 있었던 전체 시간에 걸친 평균이다. 특정 뉴클레오타이드 혼입을 위한 시간의 양은 달라질 수 있으며, 예를 들어 소정의 혼입은 제1 힘과 제2 힘 사이에 한 사이클 미만으로 또는 다수의 이러한 사이클에 걸쳐 일어날 수 있다고 이해될 것이다. 플롯 1311, 1312, 1313 및 1314에서, 프라이머의 혼성화에 해당하는 신호 수준은 이러한 혼성화가 없는 폴리뉴클레오타이드(150)에 해당하는 신호 수준보다 높다. 플롯 1311, 1312 및 1313에서, T에 의한 프라이머의 연장에 해당하는 신호 수준은 프라이머의 혼성화에 해당하는 것보다 더 크지만, 플롯 1314에서, T에 의한 프라이머의 연장에 해당하는 신호 수준은 프라이머의 혼성화에 해당하는 신호 수준과 유사하다(하지만, 여전히 구별 가능함). 플롯 1311, 1312, 1313 및 1314에서, T에 의한 프라이머의 연장에 해당하는 신호 수준은 3개의 A 각각에 의한 연장에 해당하는 신호 수준과 상이하다. 플롯 1311, 1313 및 1314 각각에서, 3개의 A 각각에 의한 프라이머의 연장에 해당하는 신호 수준은 서로 상이하지만, 플롯 1312에서, 첫 번째 A와 두 번째 A에 의한 프라이머의 연장에 해당하는 신호 수준은 서로 거의 동일하다(축퇴).
도 13c의 플롯 1321는, 각각, 플롯 1301, 1302, 1303 및 1304 내 원시 데이터의 비교를 용이하게 하기 위해 도 13b의 평균 신호(측정된 전류) 수준을 바이어스 전압의 함수로 예시한 것이다. 플롯 1321에서 볼 수 있는 바와 같이, 각각의 신호 수준은 측정 동안 인가된 바이어스 전압의 함수로서 증가하고, 신호 수준 중 적어도 일부는 서로 상이한 기울기를 갖는다. 플롯 1321에서 상이한 기울기의 비교를 용이하게 하기 위해, 도 13c의 플롯 1322는 도 13b의 정규화된 평균 신호 수준을 바이어스 전압의 함수로 예시한 것이며, 여기서 신호 수준은 부가된 뉴클레오타이드에 해당하는 평균 신호 수준을 프라이머의 혼성화에 해당하는 평균 신호 수준으로 나누어 정규화하였다. T에 대한 정규화된 신호 수준은 첫 번째 A에 대한 정규화된 신호 수준보다 유의하게 높으며, 상이한 방향으로 변하는 것을 볼 수 있다. 또한, 첫 번째 A에 대한 정규화된 신호 수준은 두 번째 A에 대한 정규화된 신호 수준과 유사하지만(여전히 구별 가능함), 상이한 방향으로 변하는 것을 볼 수 있다. 교차점(1331)은 첫 번째 A와 두 번째 A에 대한 정규화된 신호 수준이 서로 거의 동일한(축퇴) 대략적인 바이어스 전압(85 mV)에 해당한다. 세 번째 A에 대한 정규화된 신호 수준은 첫 번째 A와 두 번째 A에 대한 정규화된 신호 수준보다 유의하게 높으며, 첫 번째 A와는 동일한 방향으로 두 번째 A 및 T와는 상이한 방향으로 변하는 것을 볼 수 있다. 교차점(1332)은 T와 세 번째 A에 대한 정규화된 신호 수준이 서로 거의 동일한(축퇴) 대략적인 바이어스 전압(85 mV)에 해당한다.
따라서, 도 13a 내지 도 13c로부터, 일부 제1 힘(F1)에서, 뉴클레오타이드의 특정 조합에 대한 측정값은 축퇴일 수 있지만, 다른 제1 힘(F1', F1", F1"')(F2를 사용하여 뉴클레오타이드 부가 사이클 사이에 순차적으로 가해질 수 있음)에서, 뉴클레오타이드의 일부 또는 모든 조합에 대한 측정값은 용이하게 구별될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 같이, 측정값의 임의의 축퇴가 해결될 수 있는 측정값을 얻기 위해 임의의 적합한 수의 힘을 사용하여 측정을 수행할 수 있다고 이해될 것이다. 다른 예에서, 뉴클레오타이드의 각각의 가능한 조합이 이러한 제1 힘 중 적어도 하나 하에서 다른 조합과 용이하게 구별되는 측정값을 갖도록 선택된 상이한 제1 힘을 사용하여 측정을 수행할 수 있다. 도 13a 내지 도 13c로부터, 회로(160)를 사용하여 상이한 힘을 가하면 이중체의 3' 말단과 폴리뉴클레오타이드(150)의 제2 부분이 나노공극(110)에 대해 상이한 위치로 이동할 수 있으며, 이러한 위치에서 이중체 내 뉴클레오타이드와 폴리뉴클레오타이드(150) 내 뉴클레오타이드는 또 다른 위치에(또 다른 힘 하에) 있는 것들과 상이하게 측정값에 영향을 미칠 수 있음을 또한 이해할 수 있다. 도 1g와 도 8c를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로, 측정 조건의 변화는 측정값에 선형으로 또는 비선형으로 영향을 미칠 수 있으며, 실제로 이중체의 3' 말단 내 뉴클레오타이드와 폴리뉴클레오타이드(150)의 제2 부분 내 뉴클레오타이드의 상이한 조합에 대해 상이한 방향으로 측정값을 변경시킬 수 있다. 순차적으로 가해진 힘(F1, F1', F1", F1"')을 사용하여 폴리뉴클레오타이드(150)를 시퀀싱하는 동안 플롯 1301, 1302, 1303, 1304가 각각 얻어졌지만, 다른 구성에서, 회로(160)는 제1 힘 중 선택된 하나를 사용하여 폴리뉴클레오타이드(150)를 시퀀싱하고, 이어서 제1 힘 중 하나 이상의 다른 힘을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하도록 구성될 수 있다는 점에 유의해야 한다.
도 11, 도 12, 및 도 13a 내지 도 13c를 참조로 기재된 측정값은, 도 1a 내지 도 1h에 예시된 바와 같은 방식으로, 이중체(154)의 3' 말단(153)이 개구부(113) 내에 상대적으로 깊게 끼워질 수 있도록, 나노공극의 제1 측(111)이 개구부(113)의 대부분을 포함하도록 배향된 MspA 나노공극(110)을 사용하여 얻었다. 도 14는, 상이한 측정 조건 세트 하에서 예시적인 폴리뉴클레오타이드를 재시퀀싱하는 동안 측정된 값의 플롯을 예시한 것으로, 여기서 시퀀싱 시스템은 도 7을 참조로 기재된 대안적인 구성을 갖는다. 보다 구체적으로, MspA 나노공극(110)은, 이중체(154)의 3' 말단이 개구부(113) 내에 상대적으로 얕게 끼워질 수 있도록 나노공극의 제2 측(112)이 개구부(113)의 대부분을 포함하도록 배향되어 있었다. 도 11, 도 12 및 도 13a를 참조로 기재된 바와 유사한 방식으로, 폴리뉴클레오타이드(150) 내 28개의 뉴클레오타이드를 30 mV(추적 1401), 40 mV(추적 1402) 및 50 mV(추적 1403)의 제1 힘을 사용하여 재시퀀싱하였으며, 도 14에서 볼 수 있는 바와 같이, 상이한 제1 힘을 사용한 경우 이중체의 3' 말단(153)에 있는 뉴클레오타이드와 폴리뉴클레오타이드(150)의 제2 부분에 있는 뉴클레오타이드의 상이한 조합에 해당하는 상이한 전류 수준이 관찰되었다. 따라서, 도 14로부터, 나노공극의 배향에 관계없이, 폴리뉴클레오타이드(140)에의 뉴클레오타이드의 부가에 의해, 이중체의 3' 말단(153)에 있는 뉴클레오타이드와 폴리뉴클레오타이드(150)의 제2 부분에 있는 뉴클레오타이드의 생성되는 조합과 상관관계가 있는 측정값이 생성됨을 이해할 수 있다. 상기 추적 1403에 표시된 숫자는 부가된 상이한 뉴클레오타이드에 대한 상이한 신호 수준의 지정에 해당한다.
도 11, 도 12, 도 13a 내지 도 13c, 및 도 14를 참조로 기재된 예시적인 시스템을 사용하여, 메틸화된 염기와 같은 변형된 염기를 또한 식별할 수 있음을 입증하였다. 예를 들어, 도 15a와 도 15b는, 변형된 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 동안 측정된 값의 플롯을 예시한 것이다. 다음과 같은 폴리뉴클레오타이드(150)의 2개의 버전을 준비하였다: 하나는 서열 3'-GCATTTTTTACATTTTTTACATTTTTT-5'(서열번호 1)을 갖고, 다른 하나는 유사한 서열 3'-GCATTTTTTAC*ATTTTTTAC*ATTTTTT-5'(서열번호 2)을 가지며, 여기서 볼드체와 별표로 표시된 시토신은 일부 측정에서는 메틸화되었으며(5mC), 다른 측정에서는 메틸화되지 않았음. 도 15a에 예시된 방식으로 프라이머 5'-CGT를 이러한 서열의 폴리뉴클레오타이드(150)에 각각 혼성화시키고, 도 11을 참조로 기재된 바와 같은 방식으로 연장시켰으며, 여기서 회로(160)는 제1 힘 80 mV(판독 전압)과 제2 힘 -50 mV(혼입 전압)을 교대로 가하였다. 각각의 판독을 2회 수행하였다(T1 및 T2).
도 15a는, 도 13b에 대해 기재된 바와 유사하게, 특정 염기가 이중체(154)의 3' 말단(153)에 있었던 전체 시간에 걸친 평균 전류를 예시한 것이다. 도 15a의 플롯 위에 제시된 서열(서열번호 2)에 대해 나노공극의 감지 영역에 위치하는 것으로 여겨지는 대략적인 K-mer는, 측정된 각각의 신호 수준 아래 예시되어 있다. 하나의 측정 세트에서, 서열은 메틸시토신(5mC, C*로 표시됨)을 포함하였지만, 또 다른 측정 세트에서, 서열 내 메틸시토신은 시토신으로 대체되었다(즉, 서열에서 C*는 C로 대체되었음). K-mer 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 19, 20, 21, 22, 23 및 24의 경우, 2개의 서열에 대한 판독 전류는 서로 유사하다고 볼 수 있다. 이는, 시토신 또는 메틸시토신이 서로 유사하게 판독 전류에 영향을 미치거나, 판독 전류에 유의하게 영향을 미치지 않을 정도로 나노공극의 판독 헤드로부터 충분히 멀리 떨어져 있기 때문인 것으로 나타났다. 이에 비해, K-mer 7, 8, 15, 16, 17 및 18의 경우, 2개의 서열에 대한 판독 전류는 서로 유의하게 상이하였다. 이는, C*로 표시된 각 위치에 있는 시토신 또는 메틸시토신이 용이하게 구별 가능한 방식으로(예를 들어, 서열에서 첫 번째 메틸시토신의 경우 도 1f에 예시된 5번 및 4번 위치이고, 서열에서 두 번째 메틸시토신의 경우 도 1f에 예시된 6번, 5번, 4번 및 3번 위치임) 판독 전류에 서로 상이하게 영향을 미칠 만큼 나노공극의 판독 헤드에 충분히 근접해 있기 때문인 것으로 나타났다.
도 15b는, 동일한 서열(서열번호 2)에 대해 특정 염기가 이중체(154)의 3' 말단(153)에 있었던 동안 소정의 평균 전류가 관찰된 시간(수준 지속기간)의 차이를 예시한 것으로, 다시 C*로 표시된 위치에 시토신을 갖는 서열의 측정을 C*로 표시된 위치에 5mC를 갖는 서열과 비교한 것이다. 나노공극의 감지 영역에 위치하는 것으로 여겨지는 대략적인 K-mer는, 다시 측정된 각각의 신호 수준 아래 예시되어 있다. K-mer 0, 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 12 및 13의 경우, 2개의 서열에 대한 수준 지속기간은 서로 유사하다고 볼 수 있다. 이는, 시토신 또는 메틸시토신이 서로 유사하게 판독 전류에 영향을 미치거나, 판독 전류에 유의하게 영향을 미치지 않을 정도로 나노공극의 판독 헤드로부터 충분히 멀리 떨어져 있기 때문인 것으로 나타났다. 이에 비해, K-mer 5, 6, 7, 8, 14, 15, 16, 17의 경우, 2개의 서열에 대한 수준 지속기간은 서로 유의하게 상이하였다. 이는, 시토신 또는 메틸시토신이 용이하게 구별 가능한 방식으로(예를 들어, 서열에서 첫 번째 메틸시토신의 경우 도 1f에 예시된 7번, 6번, 5번 및 4번 위치이고, 서열에서 두 번째 메틸시토신의 경우 도 1f에 예시된 7번, 6번, 5번 및 4번 위치임) 수준 지속기간에 서로 상이하게 영향을 미칠 만큼 나노공극의 판독 헤드에 충분히 근접해 있기 때문인 것으로 나타났다.
도 11, 도 12, 도 13a 내지 도 13c, 도 14, 및 도 15a와 도 15b를 참조로 기재된 플롯으로부터, 회로(160)를 사용하여 각각의 뉴클레오타이드 부가에 대해 임의의 목적하는 수준의 정확도를 갖는 측정값을 얻을 수 있다고 추가로 이해될 것이다. 정확도의 수준은 다수의 상이한 제1 힘(F1, F1', F1")을 사용하여 축퇴를 해결하는 방식으로 증가될 수 있다. 예를 들어, 회로(160)가 임의의 적합한 수의 제1 힘(들)을 가하는 동안, 나노공극(110)은 도 1a, 도 1c 및 도 1c를 참조로 기재된 바와 같은 방식으로 폴리머라아제가 이중체의 3' 말단(153)에 또 다른 뉴클레오타이드를 부가하는 것을 저해한다. 본원의 다른 곳에 언급된 바와 같이, 회로(160)는 이러한 측정 동안 실질적으로 또 다른 뉴클레오타이드가 부가되는 위험 없이 시퀀싱 시스템 및 방법이 구현되는 특정 상황에 대해 충분한 SNR을 갖는 측정값을 얻기 위해, 임의의 적합한 시간 동안 임의의 적합한 수의 제1 힘(F1, F1', F1" 등)을 순차적으로 가하도록 구성될 수 있다. 따라서, 본원의 결과로부터, 단일 뉴클레오타이드의 단계적 부가 및 특징분석은 고도로 제어될 수 있으며, 임의의 적합한 속도 또는 정확도 수준으로 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 데 사용될 수 있음을 이해할 수 있다.
추가 의견
다양한 예시적인 실시예가 상기 기재되어 있지만, 본 발명을 벗어나지 않는 한 다양한 변경과 변형이 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 사상과 범위 내에 속하는 이러한 변경과 변형을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 기재된 바와 같은 개시내용의 각각의 양태의 임의의 각각의 특성/예는 임의의 적절한 조합으로 함께 구현될 수 있으며, 이러한 양태 중 임의의 하나 이상으로부터의 임의의 특성/예는 본원에 기재된 바와 같은 이점을 달성하기 위해 임의의 적절한 조합으로 본원에 기재된 바와 같은 다른 양태(들)의 임의의 특성과 함께 구현될 수 있음을 이해해야 한다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (153)
- 제1 측, 제2 측, 및 제1 측과 제2 측을 통해 연장되는 개구부(aperture)를 포함하는 나노공극(nanopore)을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 방법으로서,
(a) 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단이 나노공극의 제1 측에 있고, 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단이 나노공극의 제2 측에 있도록 나노공극의 개구부를 통해 폴리뉴클레오타이드를 배치하는 작업;
(b) 나노공극의 제1 측에 폴리뉴클레오타이드로 3' 말단을 포함하는 이중체를 형성하는 작업;
(c) 이중체의 3' 말단에 제1 뉴클레오타이드를 부가하는 방식으로 나노공극의 제1 측에서 이중체를 연장시키는 작업;
(d) 연장된 이중체의 3' 말단을 개구부 내에 배치하는 제1 힘을 가하고, 제1 힘을 가하는 동안,
나노공극을 사용하여 연장된 이중체의 3' 말단이 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해하고,
연장된 이중체의 3' 말단과 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 전기적 특성 값을 측정하는 작업; 및
(e) 작업 (d)에서 측정된 값을 사용하여 제1 뉴클레오타이드를 식별하는 작업을 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 작업 (d)에서 측정된 값이 나노공극에 걸친 전류, 이온 전류, 전기 저항 또는 전압 강하를 포함하는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 작업 (d)에서 측정된 값이 나노공극에 걸친 전류, 이온 전류, 전기 저항 또는 전압 강하의 노이즈(noise)를 포함하는, 방법.
- 제3항에 있어서, 작업 (d)에서 측정된 값이 노이즈의 표준편차를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 작업 (d)에서 측정된 값이 적어도 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 M개의 뉴클레오타이드와 연장된 이중체의 D개의 혼성화된 뉴클레오타이드 쌍을 기반으로 하며, 여기서 M은 2 이상이고, D는 1 이상인, 방법.
- 제5항에 있어서, M이 3 이상인, 방법.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, D가 2 이상인, 방법.
- 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 가닥 부분의 M개의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나가 변형된 염기를 포함하고, 상기 방법이 작업 (d)에서 측정된 값을 사용하여 변형된 염기를 식별하는 작업을 포함하는, 방법.
- 제8항에 있어서, 변형된 염기가 메틸화된 염기를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 작업 (d)에서 제1 힘이 가해지는 동안 연장된 이중체의 3' 말단에 또 다른 뉴클레오타이드가 부가되는 것을 저해하는 작업을 추가로 포함하는 방법.
- 제10항에 있어서, 나노공극이 또 다른 뉴클레오타이드의 부가를 저해하는, 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 나노공극이, 나노공극의 제1 측이 개구부의 대부분을 포함하도록 배향되는, 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 나노공극이, 나노공극의 제2 측이 개구부의 대부분을 포함하도록 배향되는, 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
(f) 연장된 이중체의 3' 말단을 개구부 내에 배치하는 변형된 제1 힘을 다시 가하고, 변형된 제1 힘을 가하는 동안,
나노공극을 사용하여 연장된 이중체의 3' 말단이 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해하고,
연장된 이중체의 3' 말단과 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 전기적 특성 값을 측정하는 작업; 및
(g) 작업 (f)에서 측정된 값을 사용하여 제1 뉴클레오타이드를 식별하는 작업을 추가로 포함하는 방법. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 뉴클레오타이드가 이중체의 3' 말단과 접촉하고 있는 폴리머라아제를 사용하여 부가되는, 방법.
- 제15항에 있어서, 폴리머라아제가 연장된 이중체의 3' 말단에 제2 뉴클레오타이드를 부가하는 것을 가역적으로 저해하는 작업을 추가로 포함하는 방법.
- 제16항에 있어서, 차단 모이어티가, 폴리머라아제가 연장된 이중체의 3' 말단에 제2 뉴클레오타이드를 부가하는 것을 가역적으로 저해하는, 방법.
- 제17항에 있어서, 제1 뉴클레오타이드가 차단 모이어티에 커플링되는, 방법.
- 제18항에 있어서, 차단 모이어티가 3'-차단기를 포함하는, 방법.
- 제17항에 있어서, 차단 모이어티가 연장된 이중체와 가역적으로 회합되는, 방법.
- 제20항에 있어서, 차단 모이어티와 연장된 이중체의 회합을 검출하는 작업을 추가로 포함하는 방법.
- 제20항 또는 제21항에 있어서, 연장된 이중체에서 차단 모이어티의 부재를 검출하는 작업을 추가로 포함하는 방법.
- 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라아제가 연장된 이중체의 3' 말단에 제2 뉴클레오타이드를 부가할 수 있도록 차단 모이어티를 제거하는 작업을 추가로 포함하는 방법.
- 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 작업 (d)에서 가해진 제1 힘이 연장된 이중체의 3' 말단과의 접촉에서 폴리머라아제를 제거하는, 방법.
- 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 연장된 이중체의 3' 말단과의 접촉에서 폴리머라아제를 제거하기 위해 제2 힘을 가하는 작업으로서, 여기서 제2 힘이 제1 힘보다 큰 작업을 추가로 포함하는 방법.
- 제15항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
(f) 이중체의 3' 말단과 접촉하고 있는 폴리머라아제를 나노공극의 제1 측의 개구부 내부 또는 근처에 배치하는 제3힘을 가하고, 제3힘을 가하는 동안,
나노공극을 사용하여 폴리머라아제가 개구부 안으로 또는 더 안쪽으로 이동하는 것을 저해하고,
폴리머라아제의 전기적 특성 값을 측정하는 작업; 및
(g) 작업 (f)에서 측정된 값을 사용하여 이중체의 3' 말단과 폴리머라아제의 접촉을 식별하는 작업을 추가로 포함하는 방법. - 제26항에 있어서, 제3 힘이 제1 힘보다 작은, 방법.
- 제26항 또는 제27항에 있어서, 작업 (f)가 작업 (c) 이후에, 그리고 작업 (d) 이전에 수행되는, 방법.
- 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 뉴클레오타이드가 차단 모이어티와 회합되는, 방법.
- 제29항에 있어서, 작업 (g)가 작업 (f)에서 측정된 값을 사용하여 제1 뉴클레오타이드와 회합된 차단 모이어티의 존재를 확인하는 작업을 추가로 포함하는, 방법.
- 제15항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라아제가 DNA 폴리머라아제를 포함하는, 방법.
- 제15항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라아제가 RNA 폴리머라아제를 포함하는, 방법.
- 제15항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라아제가 역전사효소를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 뉴클레오타이드가 차단 모이어티와 회합되며, 작업 (e)가 작업 (d)에서 측정된 값을 사용하여 뉴클레오타이드와 회합된 차단 모이어티의 존재를 확인하는 작업을 추가로 포함하는, 방법.
- 제34항에 있어서, 작업 (d) 후에 제1 뉴클레오타이드에서 차단 모이어티를 제거하는 작업을 추가로 포함하는 방법.
- 제35항에 있어서, 차단 모이어티를 제거한 후,
(f) 연장된 이중체의 3' 말단을 개구부 내에 배치하고 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분을 개구부 내에 배치하는 제1 힘을 다시 가하고, 제1 힘을 다시 가하는 동안,
나노공극을 사용하여 연장된 이중체의 3' 말단이 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해하고,
연장된 이중체의 3' 말단과 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 전기적 특성 값을 측정하는 작업; 및
(g) 작업 (f)에서 측정된 값을 사용하여 제1 뉴클레오타이드를 다시 식별하는 작업을 추가로 포함하는 방법. - 제36항에 있어서, 작업 (d) 전에 제1 뉴클레오타이드에서 차단 모이어티를 제거하는 작업을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 연장된 이중체가 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는, 방법.
- 제38항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 천연 뉴클레오타이드에 비해 연장된 이중체의 안정성을 증강시키는, 방법.
- 제38항 또는 제39항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 하나 이상의 잠금 핵산(LNA)을 포함하는, 방법.
- 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 하나 이상의 2'-메톡시(2'-OMe) 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
- 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 하나 이상의 2'-플루오린화된(2'-F) 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
- 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 천연 뉴클레오타이드와 비교하여 전기적 특성 값을 변경시키는, 방법.
- 제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 뉴클레오타이드가 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체 중 하나를 포함하는, 방법.
- 제45항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 2' 변형을 포함하는, 방법.
- 제44항 또는 제45항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 염기 변형을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 힘이 연장된 이중체의 해리를 야기할 만큼 충분히 강하지 않은, 방법.
- 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 힘이 제1 전압을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 작업 (b)와 작업 (c)가 제1 힘의 부재 하에서 수행되는, 방법.
- 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 작업 (c)가 제1 힘에 반대되는 제4 힘의 존재 하에서 수행되는, 방법.
- 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 잠금 구조가 나노공극의 제1 측에 있는 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단에 커플링되며, 제1 잠금 구조가 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단이 개구부를 통해 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해하는, 방법.
- 제51항에 있어서, 제1 잠금 구조가 제거 가능한 것인, 방법.
- 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 잠금 구조가 나노공극의 제2 측에 있는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단에 커플링되며, 제2 잠금 구조가 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단이 개구부를 통해 나노공극의 제1 측으로 전위되는 것을 저해하는, 방법.
- 제53항에 있어서, 제2 잠금 구조가 제거 가능한 것인, 방법.
- 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 작업 (d) 후에, 폴리뉴클레오타이드에서 연장된 이중체를 해리시키고,
나노공극의 제1 측에 폴리뉴클레오타이드로 새로운 3' 말단을 포함하는 새로운 이중체를 형성하는 작업을 추가로 포함하는 방법. - 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 작업 (a)가, 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오타이드에 혼성화된 폴리뉴클레오타이드와 나노공극을 접촉시키고,
폴리뉴클레오타이드에서 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 탈혼성화시키는 제6 힘을 가하는 작업을 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 나노공극이 고체 상태 나노공극을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 나노공극이 생물학적 나노공극을 포함하는, 방법.
- 제58항에 있어서, 생물학적 나노공극이 MspA를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 RNA를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 DNA를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 연장된 이중체가 폴리뉴클레오타이드에 혼성화된 프라이머를 포함하는, 방법.
- 시퀀싱 시스템으로서,
제1 측, 제2 측, 및 제1 측과 제2 측을 통해 연장되는 개구부를 포함하는 나노공극;
폴리뉴클레오타이드의 3' 말단이 나노공극의 제1 측에 있고, 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단이 나노공극의 제2 측에 있도록 나노공극의 개구부를 통해 배치된 폴리뉴클레오타이드;
나노공극의 제1 측에 배치된 폴리뉴클레오타이드의 이중체로서, 제1 뉴클레오타이드가 배치되는 3' 말단을 포함하는 이중체; 및
회로를 포함하며, 여기서 회로는
이중체의 3' 말단을 개구부 내에 배치하는 제1 힘을 가하고,
제1 힘을 가하는 동안 이중체의 3' 말단과 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 전기적 특성 값을 측정하고, 측정값을 사용하여 제1 뉴클레오타이드를 식별하도록 구성되어 있으며,
여기서 나노공극은 제1 힘이 가해지는 동안 이중체의 3' 말단이 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해하는, 시퀀싱 시스템. - 제63항에 있어서, 회로에 의해 측정된 값이 나노공극에 걸친 전류, 이온 전류, 전기 저항 또는 전압 강하를 포함하는, 시스템.
- 제63항 또는 제64항에 있어서, 회로에 의해 측정된 값이 나노공극에 걸친 전류, 이온 전류, 전기 저항 또는 전압 강하의 노이즈를 포함하는, 시스템.
- 제65항에 있어서, 회로에 의해 측정된 값이 노이즈의 표준편차를 포함하는, 시스템.
- 제63항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 회로에 의해 측정된 값이 적어도 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 M개의 뉴클레오타이드와 이중체의 D개의 혼성화된 뉴클레오타이드 쌍을 기반으로 하며, 여기서 M은 2 이상이고, D는 1 이상인, 시스템.
- 제67항에 있어서, M이 3 이상인, 시스템.
- 제67항 또는 제68항에 있어서, D가 2 이상인, 시스템.
- 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 가닥 부분의 M개의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나가 변형된 염기를 포함하고, 회로가 회로에 의해 측정된 값을 사용하여 변형된 염기를 식별하도록 구성되어 있는, 시스템.
- 제70항에 있어서, 변형된 염기가 메틸화된 염기를 포함하는, 시스템.
- 제63항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 힘이 가해지는 동안 이중체의 3' 말단에 또 다른 뉴클레오타이드가 부가되는 것이 저해되는, 시스템.
- 제72항에 있어서, 나노공극이 또 다른 뉴클레오타이드의 부가를 저해하는, 시스템.
- 제63항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 나노공극이, 나노공극의 제1 측이 개구부의 대부분을 포함하도록 배향되는, 시스템.
- 제63항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 나노공극이, 나노공극의 제2 측이 개구부의 대부분을 포함하도록 배향되는, 시스템.
- 제63항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 회로가,
이중체의 3' 말단을 개구부 내에 다시 배치하는 변형된 제1 힘을 가하고,
변형된 제1 힘을 가하는 동안 이중체의 3' 말단과 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 전기적 특성 값을 측정하고, 측정값을 사용하여 제1 뉴클레오타이드를 식별하도록 추가로 구성되어 있으며,
여기서 나노공극은 변형된 제1 힘이 가해지는 동안 이중체의 3' 말단이 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해하는, 시스템. - 제63항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 이중체의 3' 말단과 접촉하고 있으며 제1 뉴클레오타이드를 부가하는 폴리머라아제를 추가로 포함하는 시스템.
- 제77항에 있어서, 폴리머라아제가 이중체의 3' 말단에 제2 뉴클레오타이드를 부가하는 것이 가역적으로 저해되는, 시스템.
- 제78항에 있어서, 폴리머라아제가 이중체의 3' 말단에 제2 뉴클레오타이드를 부가하는 것을 가역적으로 저해하는 차단 모이어티를 추가로 포함하는 시스템.
- 제79항에 있어서, 제1 뉴클레오타이드가 차단 모이어티에 커플링되는, 시스템.
- 제80항에 있어서, 차단 모이어티가 3'-차단기를 포함하는, 시스템.
- 제79항에 있어서, 차단 모이어티가 이중체와 가역적으로 회합되는, 시스템.
- 제82항에 있어서, 회로가 이중체와 차단 모이어티의 회합을 검출하도록 추가로 구성되어 있는, 시스템.
- 제82항 또는 제83항에 있어서, 회로가 이중체에서 차단 모이어티의 부재를 검출하도록 추가로 구성되어 있는, 시스템.
- 제79항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라아제가 이중체의 3' 말단에 제2 뉴클레오타이드를 부가할 수 있도록 차단 모이어티가 제거 가능한 것인, 시스템.
- 제78항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 힘이 이중체의 3' 말단과의 접촉에서 폴리머라아제를 제거하는, 시스템.
- 제78항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 회로가 이중체의 3' 말단과의 접촉에서 폴리머라아제를 제거하기 위해 제2 힘을 가하도록 추가로 구성되어 있으며, 여기서 제2 힘이 제1 힘보다 큰, 시스템.
- 제78항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 회로가,
이중체의 3' 말단과 접촉하고 있는 폴리머라아제를 나노공극의 제1 측의 개구부 내부 또는 근처에 배치하는 제3 힘을 가하고,
제3 힘을 가하는 동안 폴리머라아제의 전기적 특성 값을 측정하고,
측정값을 사용하여 이중체의 3' 말단과 폴리머라아제의 접촉을 식별하도록 추가로 구성되어 있으며,
여기서 나노공극은 폴리머라아제가 개구부 안으로 또는 더 안쪽으로 이동하는 것을 저해하는, 시스템. - 제88항에 있어서, 제3 힘이 제1 힘보다 작은, 시스템.
- 제88항 또는 제89항에 있어서, 회로가 제1 힘을 가하기 전에 제3 힘을 가하도록 구성되어 있는, 시스템.
- 제88항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 뉴클레오타이드가 차단 모이어티와 회합되는, 시스템.
- 제91항에 있어서, 회로가 측정값을 사용하여 제1 뉴클레오타이드와 회합된 차단 모이어티의 존재를 확인하도록 구성되어 있는, 시스템.
- 제77항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라아제가 DNA 폴리머라아제를 포함하는, 시스템.
- 제77항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라아제가 RNA 폴리머라아제를 포함하는, 시스템.
- 제77항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라아제가 역전사효소를 포함하는, 시스템.
- 제63항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 뉴클레오타이드가 차단 모이어티와 회합되며, 회로가 측정값을 사용하여 뉴클레오타이드와 회합된 차단 모이어티의 존재를 확인하도록 추가로 구성되어 있는, 시스템.
- 제96항에 있어서, 차단 모이어티가 제1 힘을 가한 후에 제1 뉴클레오타이드에서 제거되는, 시스템.
- 제97항에 있어서, 회로가, 차단 모이어티가 제거된 후,
이중체의 3' 말단을 개구부 내에 배치하고 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분을 개구부 내에 배치하는 제1 힘을 다시 가하고,
제1 힘을 다시 가하는 동안 이중체의 3' 말단과 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분의 전기적 특성 값을 측정하고,
측정값을 사용하여 제1 뉴클레오타이드를 다시 식별하도록 구성되어 있으며,
여기서 나노공극은 이중체의 3' 말단이 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해하는, 시스템. - 제98항에 있어서, 차단 모이어티가 제1 힘이 가해지기 전에 제1 뉴클레오타이드에서 제거되는, 시스템.
- 제63항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 이중체가 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는, 시스템.
- 제100항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 천연 뉴클레오타이드에 비해 이중체의 안정성을 증강시키는, 시스템.
- 제100항 또는 제101항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 하나 이상의 잠금 핵산(LNA)을 포함하는, 시스템.
- 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 하나 이상의 2'-메톡시(2'-OMe) 뉴클레오타이드를 포함하는, 시스템.
- 제100항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 하나 이상의 2'-플루오린화된(2'-F) 뉴클레오타이드를 포함하는, 시스템.
- 제100항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 천연 뉴클레오타이드와 비교하여 전기적 특성 값을 변경시키는, 시스템.
- 제100항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 뉴클레오타이드가 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체 중 하나를 포함하는, 시스템.
- 제106항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 2' 변형을 포함하는, 시스템.
- 제106항 또는 제107항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 염기 변형을 포함하는, 시스템.
- 제63항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 힘이 이중체의 해리를 야기할 만큼 충분히 강하지 않은, 시스템.
- 제63항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 힘이 제1 전압을 포함하는, 시스템.
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- 제63항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 개구부를 통해 배치되며, 이중체가 제1 힘의 부재 하에서 나노공극의 제1 측에 배치되는, 시스템.
- 제63항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 회로가 제1 힘에 반대되는 제4 힘을 가하도록 구성되어 있는, 시스템.
- 제63항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 잠금 구조가 나노공극의 제1 측에 있는 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단에 커플링되며, 제1 잠금 구조가 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단이 개구부를 통해 나노공극의 제2 측으로 전위되는 것을 저해하는, 시스템.
- 제122항에 있어서, 제1 잠금 구조가 제거 가능한 것인, 시스템.
- 제63항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 잠금 구조가 나노공극의 제2 측에 있는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단에 커플링되며, 제2 잠금 구조가 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단이 개구부를 통해 나노공극의 제1 측으로 전위되는 것을 저해하는, 시스템.
- 제124항에 있어서, 제2 잠금 구조가 제거 가능한 것인, 시스템.
- 제63항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 회로가, 제1 힘을 가한 후, 폴리뉴클레오타이드에서 이중체를 해리시키도록 구성되어 있는, 시스템.
- 제63항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 회로가 나노공극의 개구부를 통해 폴리뉴클레오타이드를 배치하기 위해 폴리뉴클레오타이드에서 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 탈혼성화시키는 제6 힘을 가하도록 구성되어 있는, 시스템.
- 제63항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 나노공극이 고체 상태 나노공극을 포함하는, 시스템.
- 제63항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 나노공극이 생물학적 나노공극을 포함하는, 시스템.
- 제129항에 있어서, 생물학적 나노공극이 MspA를 포함하는, 시스템.
- 제63항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 RNA를 포함하는, 시스템.
- 제63항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 DNA를 포함하는, 시스템.
- 제63항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 이중체가 폴리뉴클레오타이드에 혼성화된 프라이머를 포함하는, 시스템.
- 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 방법으로서, 나노공극의 개구부 내의 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분과 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드의 이중체의 3' 말단의 전기적 특성의 복수의 측정값을 뉴클레오타이드 식별 모듈에 입력으로 제공하는 단계;
뉴클레오타이드 식별 모듈을 사용하여 복수의 측정값을 데이터 구조 내 값과 비교하는 단계로서, 여기서 데이터 구조가 상이한 측정값을, 나노공극의 개구부 내의 알려진 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분 내 뉴클레오타이드와 알려진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 알려진 이중체의 3' 말단 내 뉴클레오타이드의 상이한 조합과 상관시키는 단계;
비교를 사용하여 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드 서열에서 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위해 뉴클레오타이드 식별 모듈을 사용하는 단계; 및
결정된 뉴클레오타이드 서열의 표현을 뉴클레오타이드 식별 모듈로부터의 출력으로 수신하는 단계를 포함하는 방법. - 제134항에 있어서, 뉴클레오타이드 식별 모듈이 훈련된 기계 학습 알고리즘을 포함하는, 방법.
- 제135항에 있어서, 뉴클레오타이드 식별 모듈이 훈련된 딥러닝(deep learning) 알고리즘을 포함하는, 방법.
- 제135항 또는 제136항에 있어서, 데이터 구조가 훈련된 기계 학습 알고리즘의 뉴런(neuron)을 포함하는, 방법.
- 제134항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 데이터 구조가 판독 맵(read map)을 포함하는, 방법.
- 제138항에 있어서, 판독 맵이 알려진 이중체의 3' 말단 내 뉴클레오타이드와 알려진 뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분 내 뉴클레오타이드의 상이한 조합의 상이한 측정값과 표현을 저장하는 룩업 테이블(look-up table)을 포함하는, 방법.
- 제134항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 나노공극의 개구부를 사용하여 복수의 측정값을 생성하기 위해 컴퓨터를 통해 측정 모듈을 사용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제134항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 나노공극의 개구부를 사용하여 데이터 구조를 생성하기 위해 컴퓨터를 통해 뉴클레오타이드 부가 모듈, 측정 모듈 및 뉴클레오타이드 식별 모듈을 사용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 시스템으로서,
프로세서와,
적어도 하나의 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함하며, 여기서 컴퓨터 판독 가능한 매체는
나노공극의 개구부 내의 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분과 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 이중체의 3' 말단의 전기적 특성의 복수의 측정값;
상이한 측정값을, 나노공극의 개구부 내의 알려진 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분 내 뉴클레오타이드와 알려진 이중체의 3' 말단 내 뉴클레오타이드의 상이한 조합과 상관시키는 데이터 구조; 및 프로세서가 작업을 실행하도록 하는 명령을 저장하고, 여기서 명령은
복수의 측정값을 데이터 구조 내 값과 비교하고,
비교를 사용하여 알려지지 않은 폴리뉴클레오타이드 서열에서 뉴클레오타이드 서열을 결정하고,
결정된 뉴클레오타이드 서열의 표현을 출력하는 것을 포함하는 작업을 실행하도록 하는, 시스템. - 제142항에 있어서, 뉴클레오타이드 식별 모듈이 훈련된 기계 학습 알고리즘을 포함하는, 시스템.
- 제143항에 있어서, 뉴클레오타이드 식별 모듈이 훈련된 딥러닝 알고리즘을 포함하는, 시스템.
- 제143항 또는 제144항에 있어서, 데이터 구조가 훈련된 기계 학습 알고리즘의 뉴런을 포함하는, 시스템.
- 제142항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 데이터 구조가 판독 맵을 포함하는, 시스템.
- 제146항에 있어서, 판독 맵이 알려진 이중체의 3' 말단 내 뉴클레오타이드와 알려진 뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분 내 뉴클레오타이드의 상이한 조합의 상이한 측정값과 표현을 저장하는 룩업 테이블을 포함하는, 시스템.
- 제142항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 명령이 추가로, 프로세서가 나노공극의 개구부를 사용하여 복수의 측정값을 생성하도록 하기 위한 것인, 시스템.
- 제142항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 명령이 추가로, 프로세서가 나노공극의 개구부를 사용하여 데이터 구조를 생성하도록 하기 위한 것인, 시스템.
- 제1 측, 제2 측, 및 제1 측과 제2 측을 통해 연장되는 개구부를 포함하는 나노공극에 폴리뉴클레오타이드를 잠그는 방법으로서,
(a) 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단에 제1 잠금기를 커플링시키는 작업;
(b) 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단과 제1 잠금기가 나노공극의 제1 측에 있고, 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단이 나노공극의 제2 측에 있도록 나노공극의 개구부를 통해 폴리뉴클레오타이드를 배치하는 작업; 및
(c) 나노공극의 제2 측에 있는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단에 제2 잠금기를 커플링시키는 작업을 포함하는 방법. - 제150항에 있어서, 제1 잠금기가 잠금 핵산(LNA) 또는 펩타이드 핵산(PNA)을 포함하는, 방법.
- 제150항 또는 제151항에 있어서, 제2 잠금기가 잠금 핵산(LNA) 또는 펩타이드 핵산(PNA)을 포함하는, 방법.
- 제150항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 작업 (a) 전에 상보적 폴리뉴클레오타이드에 혼성화되며, 상기 방법이 작업 (b)와 작업 (c) 사이에 상보적 폴리뉴클레오타이드를 탈혼성화시키는 작업을 추가로 포함하는, 방법.
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