JP2022513574A - ポリヌクレオチドを配列決定する方法 - Google Patents
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- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/103—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties luminescence
Abstract
Description
1. 4種の塩基を標識するために4種の蛍光色素が使用されている。異なる蛍光シグナルを区別するために、シーケンシング装置には少なくとも2種の単色励起光源と2台のカメラとが装備され、これにより、シーケンシングデバイスの製造費用が高く、且つ容積の大型化をもたらす。
(a)標的ポリヌクレオチドを用意するステップと、
(b)プライマーが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、それにより、標的ポリヌクレオチドとプライマーとの部分二重鎖を形成するように、標的ポリヌクレオチドをプライマーと接触させるステップと、
(c)ヌクレオチドがプライマーへ組み込まれるように、ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を実行することを可能にする条件下で、部分二重鎖をポリメラーゼ及びヌクレオチドと接触させるステップであり、
前記ヌクレオチドが、第1のヌクレオチド、第2のヌクレオチド、第3のヌクレオチド、及び第4のヌクレオチドのうちの1つ又は複数から選択され、第1のヌクレオチドが、第1の標識で標識された第1のヌクレオチド、及び任意選択で非標識の第1のヌクレオチドを含み、第2のヌクレオチドが、第2の標識で標識された第2のヌクレオチド、及び任意選択で非標識の第2のヌクレオチドを含み、第3のヌクレオチドが:(1)第1の標識で標識された第3のヌクレオチド、及び第2の標識で標識された第3のヌクレオチド、又は(2)第1の標識及び第2の標識で同時に標識された第3のヌクレオチドから選択され、且つ第4のヌクレオチドが、非標識の第4のヌクレオチドを含み、
各ヌクレオチドが、2’又は3’酸素原子を介して結合した保護基を含有するリボース又はデオキシリボース部分を有する、ステップと、
(d)ステップ(c)の部分二重鎖の第1の標識の存在を検出するステップと、
(e)ステップ(c)の部分二重鎖の第2の標識の存在を検出するステップと、
(f)任意選択で、ステップ(c)の部分二重鎖に組み込まれたヌクレオチドの保護基及び標識を除去するステップと、
(g)ステップ(c)~(f)を1回又は複数回任意選択で繰り返して、標的ポリヌクレオチドの配列情報を取得するステップと
を含み、
第1の標識及び第2の標識の存在が、同一の発光シグナルによって検出される。
本発明は、異なるヌクレオチドを区別することができるように、個別に、又は組み合わせて、異なる標識でヌクレオチドを標識することに関し、異なる標識は、同一の発光シグナルによって検出することができる。
単独で、又は組み合わせで本発明の異なる標識で標識されたヌクレオチドは、様々な核酸シーケンシング法において使用することができる。好ましくは、単独で、又は組み合わせで本発明の異なる標識で標識されたヌクレオチドは、合成によるシーケンシングに適している。本明細書で使用されるとおり合成によるシーケンシングは、当技術分野で周知の合成方法による様々なシーケンシングである。基本的に、合成によるシーケンシングは、最初に、シーケンシング対象の核酸分子をシーケンシングプライマーとハイブリダイズさせ、次いで、ポリメラーゼの存在下で、鋳型としてシーケンシング対象の核酸分子を使用することによってシーケンシングプライマーの3’末端で本明細書に記載されるとおり標識ヌクレオチドを重合することに関与する。重合後、標識ヌクレオチドは、この標識を検出することにより同定される。標識(すなわち、本明細書に記載のとおりの化学発光標識)が標識ヌクレオチドから除去された後、次の重合のシーケンシングサイクルが開始する。
特定の実施形態では、本発明は、標的ポリヌクレオチドの配列を決定する方法に関し、該方法は:
(a)標的ポリヌクレオチドを用意するステップと、
(b)プライマーが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、それにより、標的ポリヌクレオチドとプライマーとの部分二重鎖を形成するように、標的ポリヌクレオチドをプライマーと接触させるステップと、
(c)ヌクレオチドがプライマーへ組み込まれるように、ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を実行することを可能にする条件下で、部分二重鎖をポリメラーゼ及びヌクレオチドと接触させるステップであって、
前記ヌクレオチドは、第1のヌクレオチド、第2のヌクレオチド、第3のヌクレオチド、及び第4のヌクレオチドのうちの1つ又は複数から選択され、第1のヌクレオチドは、第1の標識で標識された第1のヌクレオチドを含み、第2のヌクレオチドは、第2の標識で標識された第2のヌクレオチドを含み、第3のヌクレオチドは:(1)第1の標識で標識された第3のヌクレオチド、及び第2の標識で標識された第3のヌクレオチド、又は(2)第1の標識及び第2の標識で同時に標識された第3のヌクレオチドから選択され、且つ第4のヌクレオチドは、非標識の第4のヌクレオチドを含み、
各ヌクレオチドは、2’又は3’酸素原子を介して結合した保護基を含有するリボース又はデオキシリボース部分を有し、
第1の標識は、発光標識である、ステップと、
(d)ステップ(c)の部分二重鎖の発光標識の存在を検出するステップと、
(e)その後に、発光標識で標識され、且つ第2の標識に特異的に結合するリガンドとステップ(c)の部分二重鎖を接触させ、次いで、部分二重鎖の発光標識の存在を検出するステップと、
(f)任意選択で、ステップ(c)の部分二重鎖に組み込まれたヌクレオチドの保護基及び標識を除去するステップと、
(g)任意選択で、標的ポリヌクレオチドの配列情報を取得するために、ステップ(c)~(f)を1回又は複数回繰り返すステップと
を含み、
複数の上記発光標識は、同一の発光標識である。
(a)標的ポリヌクレオチドを用意するステップと、
(b)プライマーが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、それにより、標的ポリヌクレオチドとプライマーとの部分二重鎖を形成するように、標的ポリヌクレオチドをプライマーと接触させるステップと、
(c)ヌクレオチドがプライマーへ組み込まれるように、ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を実行することを可能にする条件下で、部分二重鎖をポリメラーゼ及びヌクレオチドと接触させるステップであって、
前記ヌクレオチドは、第1のヌクレオチド、第2のヌクレオチド、第3のヌクレオチド、及び第4のヌクレオチドのうちの1つ又は複数から選択され、第1のヌクレオチドは、第1の標識で標識された第1のヌクレオチドを含み、第2のヌクレオチドは、第2の標識で標識された第2のヌクレオチドを含み、第3のヌクレオチドは:(1)第1の標識で標識された第3のヌクレオチド、及び第2の標識で標識された第3のヌクレオチド、又は(2)第1の標識及び第2の標識で同時に標識された第3のヌクレオチドから選択され、且つ第4のヌクレオチドは、非標識の第4のヌクレオチドを含み、
各ヌクレオチドは、2’又は3’酸素原子を介して結合した保護基を含有するリボース又はデオキシリボース部分を有する、ステップと、
(d)発光標識で標識され、且つ第1の標識に特異的に結合するリガンドとステップ(c)の部分二重鎖を接触させ、次いで、部分二重鎖の発光標識の存在を検出し、
次いで、部分二重鎖からリガンドを除去するステップと、
(e)発光標識で標識され、且つ第2の標識に特異的に結合するリガンドとステップ(c)の部分二重鎖を接触させ、次いで、部分二重鎖の発光標識の存在を検出するステップと、
(f)任意選択で、ステップ(c)の部分二重鎖に組み込まれたヌクレオチドの保護基及び標識を除去するステップと、
(g)任意選択で、標的ポリヌクレオチドの配列情報を取得するために、ステップ(c)~(f)を1回又は複数回繰り返すステップと
を含み、
複数の上記発光標識は、同一の発光標識である。
本発明を開発する過程において、本発明者らはまた、一部分の非標識ヌクレオチドを添加することにより、単一の標識ヌクレオチドによって生成されるシグナル値を制御できることを見出し、これは、異なるヌクレオチドの識別及びその後のデータ分析に有益であり、有意にシーケンシング結果を改善する。
本発明では、シーケンシングは、単一の励起蛍光検出に基づいてのみ実行される。4種又は2種の蛍光色素を使用して4種のヌクレオチドを標識する検出法と比較して、このシーケンシング法は、単一の励起光源及び単一のカメラを必要とするだけであり、これにより、シーケンシング装置の大きさ及び製造費用を削減することができる。
方法の簡単な説明
(1)支持体に接続されたシーケンシング対象の核酸分子を提供した、又はシーケンシング対象の核酸分子を支持体に接続した。
ヌクレオチドをビオチン及びジゴキシンで標識し、ストレプトアビジン抗体及びジゴキシン抗体を対応するリガンドとして使用した。
1).大腸菌
2).BGISEQ-500ハイスループットシーケンシングキット(SE100)
MGIEasy(商標)DNAライブラリー調製キット
3).デオキシリボヌクレオチド類似体及び重合反応混合溶液
(1)ビオチン修飾アデニンデオキシリボヌクレオチド類似体
(2)ビオチン修飾シトシンデオキシリボヌクレオチド類似体
(3)ジゴキシン修飾シトシンデオキシリボヌクレオチド類似体
(4)ジゴキシン修飾チミンデオキシリボヌクレオチド類似体
(5)グアニンデオキシリボヌクレオチド類似体
第1の群:A-ビオチン+A-コールド(A-ビオチン:A-コールドは、4:1であり、A-ビオチン+A-コールド=1μM)
第2の群:C-ビオチン+C-ジゴキシン(C-ビオチン:C-ジゴキシンは、2:1であり、C-ビオチン+C-ジゴキシン=2μM)
第3の群:T-ジゴキシン+T-コールド(T-ジゴキシン:T-コールドは、4:1であり、T-ジゴキシン+T-コールド=1μM)
第4の群:G-コールド(1μM)
上記の濃度及び比率に従って、ヌクレオチド類似体の4つの群を混合溶液に配合した。
第1の群:A-ビオチン(1μM)
第2の群:C-ビオチン+C-ジゴキシン(C-ビオチン:C-ジゴキシンは、2:1であり、C-ビオチン+C-ジゴキシン=2μM)
第3の群:T-ジゴキシン(1μM)
第4の群:G-コールド(1μM)
上記の濃度及び比率に従って、ヌクレオチド類似体の4つの群を混合溶液に配合した。
この試薬を、抗体リガンド緩衝液及び溶出試薬の両方として使用した。
1)大腸菌のゲノムDNAを、以下の文献を参照して抽出した。
So A、Pel J、Rajan S、Marziali A、Efficient genomic DNA extraction for low target concentration bacterial cultures using SCODA DNA extraction technology、 Cold Spring Harb Protoc.2010年(10):pdb.prot5506。
バーコード配列分析ソフトウェアの分析によれば、バーコードの解像効率は82%であった。
方法の簡単な説明
(1)支持体に接続されたシーケンシング対象の核酸分子を提供した、又はシーケンシング対象の核酸分子を支持体に接続した。
1.実験材料
1)大腸菌
2)BGISEQ-500ハイスループットシーケンシングキット(SE100)
MGIEasy(商標)DNAライブラリー調製キット
3)デオキシリボヌクレオチド類似体及び重合反応混合溶液
(1)蛍光AF532修飾アデニンデオキシリボヌクレオチド類似体
(2)蛍光AF532修飾シトシンデオキシリボヌクレオチド類似体
(3)ビオチン修飾シトシンデオキシリボヌクレオチド類似体
(4)ビオチン修飾チミンデオキシリボヌクレオチド類似体
(5)グアニンデオキシリボヌクレオチド類似体
第1の群:A-AF532+A-コールド(A-ビオチン:A-コールドは、4:1であり、A-ビオチン+A-コールド=1μM)
第2の群:C-ビオチン+C-AF532(C-ビオチン:C-AF532は、2:1であり、C-ビオチン+C-AF532=2μM)
第3の群:T-ビオチン+T-コールド(T-ビオチン:T-コールドは、4:1であり、T-ビオチン+T-コールド=1μM)
第4の群:G-コールド(1μM)
上記の濃度及び比率に従って、ヌクレオチド類似体の4つの群を混合溶液に調製した。
第1の群:A-AF532(1μM)
第2の群:C-ビオチン+C-AF532(C-ビオチン:C-AF532は、2:1であり、C-ビオチン+C-AF532=2μM)
第3の群:T-ビオチン(1μM)
第4の群:G-コールド(1μM)
上記の濃度及び比率に従って、ヌクレオチド類似体の4つの群を混合溶液に配合した。
この試薬を、抗体リガンド緩衝液及び溶出試薬の両方として使用した。
上記の蛍光標識抗体を、全てPBSを用いて配合した。
1)大腸菌のゲノムDNAは、以下の文献を参照して抽出した。
So A、Pel J、Rajan S、Marziali A、Efficient genomic DNA extraction for low target concentration bacterial cultures using SCODA DNA extraction technology、Cold Spring Harb Protoc.2010年(10):pdb.prot5506。
バーコード配列分析ソフトウェアの分析によれば、バーコードの解像効率は83.6%であった。
Claims (15)
- 標的ポリヌクレオチドの配列を決定する方法であって、
(a)標的ポリヌクレオチドを用意するステップと、
(b)プライマーが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、それにより、標的ポリヌクレオチドとプライマーとの部分二重鎖を形成するように、標的ポリヌクレオチドをプライマーと接触させるステップと、
(c)ヌクレオチドがプライマーへ組み込まれるように、ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を実行することを可能にする条件下で、部分二重鎖をポリメラーゼ及びヌクレオチドと接触させるステップであり、
前記ヌクレオチドが、第1のヌクレオチド、第2のヌクレオチド、第3のヌクレオチド、及び第4のヌクレオチドのうちの1つ又は複数から選択され、第1のヌクレオチドが、第1の標識で標識された第1のヌクレオチド、及び任意選択で非標識の第1のヌクレオチドを含み、第2のヌクレオチドが、第2の標識で標識された第2のヌクレオチド、及び任意選択で非標識の第2のヌクレオチドを含み、第3のヌクレオチドが、(1)第1の標識で標識された第3のヌクレオチド、及び第2の標識で標識された第3のヌクレオチド、又は(2)第1の標識及び第2の標識で同時に標識された第3のヌクレオチドから選択され、且つ第4のヌクレオチドが、非標識の第4のヌクレオチドを含み、
各ヌクレオチドが、2’又は3’酸素原子を介して結合した保護基を含有するリボース又はデオキシリボース部分を有する、ステップと、
(d)ステップ(c)の部分二重鎖の第1の標識の存在を検出するステップと、
(e)ステップ(c)の部分二重鎖の第2の標識の存在を検出するステップと、
(f)任意選択で、ステップ(c)の部分二重鎖に組み込まれたヌクレオチドの保護基及び標識を除去するステップと、
(g)ステップ(c)~(f)を1回又は複数回任意選択で繰り返して、標的ポリヌクレオチドの配列情報を取得するステップと
を含み、
第1の標識及び第2の標識の存在が、同一の発光シグナルによって検出される、方法。 - 第1の標識が、発光標識である、請求項1に記載の方法。
- ステップ(d)が、発光標識で標識され、且つ第1の標識に特異的に結合するリガンドとステップ(c)の部分二重鎖を接触させ、次いで、部分二重鎖の発光標識の存在を検出することを含み、
任意選択で、ステップ(c)の部分二重鎖に組み込まれたヌクレオチドの保護基及び標識を除去する場合に、リガンドが除去される、
請求項1に記載の方法。 - ステップ(e)が、発光標識で標識され、且つ第2の標識に特異的に結合するリガンドとステップ(c)の部分二重鎖を接触させ、次いで、部分二重鎖の発光標識の存在を検出することを含み、
例えば、ステップ(e)が、ステップ(d)の後に行われる、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。 - 複数の前記発光標識が、同一の発光標識である、請求項2~4のいずれか一項に記載の方法。
- 発光標識が、例えば、クマリン、AlexaFluor、Bodipy、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、フェノキサジン、アクリジン、Cy5、Cy3、AF532、Texas red及びそれらの誘導体から選択される、蛍光色素分子などの蛍光標識である、請求項2~5のいずれか一項に記載の方法。
- 第1のヌクレオチドについて、第1の標識で標識された第1のヌクレオチドと非標識の第1のヌクレオチドとは、比率が4:1~3:2である、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 第2のヌクレオチドについて、第2の標識で標識された第2のヌクレオチドと非標識の第2のヌクレオチドとは、比率が4:1~3:2である、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- ポリヌクレオチドを配列決定するキットであって、(a)第1のヌクレオチド、第2のヌクレオチド、第3のヌクレオチド及び第4のヌクレオチドから選択される1つ又は複数のヌクレオチドであり、第1のヌクレオチドが、第1の標識で標識された第1のヌクレオチド、及び任意選択で非標識の第1のヌクレオチドを含み、第2のヌクレオチドが、第2の標識で標識された第2のヌクレオチド、及び任意選択で非標識の第2のヌクレオチドを含み、第3のヌクレオチドが、(1)第1の標識で標識された第3のヌクレオチド、及び第2の標識で標識された第3のヌクレオチド、又は(2)第1の標識及び第2の標識で同時に標識された第3のヌクレオチドから選択され、且つ第4のヌクレオチドが、非標識の第4のヌクレオチドを含む、1つ又は複数のヌクレオチドと、(b)それらの包装材料とを含み、
前記ヌクレオチドが、それぞれ、2’又は3’酸素原子を介して結合した保護基を含有するリボース又はデオキシリボース部分を含む、
キット。 - 第1の標識が、発光標識である、請求項9に記載のキット。
- 発光標識で標識され、且つ第1の標識に特異的に結合するリガンドを更に含む、請求項9に記載のキット。
- 発光標識で標識され、且つ第2の標識に特異的に結合するリガンドを更に含む、請求項9~11のいずれか一項に記載のキット。
- 複数の前記発光標識が、同一の発光標識である、請求項9~12のいずれか一項に記載のキット。
- 発光標識が、例えば、クマリン、AlexaFluor、Bodipy、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、フェノキサジン、アクリジン、Cy5、Cy3、AF532、Texas red及びそれらの誘導体から選択される、蛍光色素分子などの蛍光標識である、請求項9~13のいずれか一項に記載のキット。
- 酵素、及び前記酵素が機能するのに適した緩衝液を更に含む、請求項9~14のいずれか一項に記載のキット。
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