JP2021524281A - 酵素活性の直接電気測定用のデバイス、システムおよび方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、国立衛生研究所によって付与されたHG910080に基づく政府の支援によりなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
天然タンパク質の機能の基礎となる運動の電気的読み出しは、標識化なしで多くの新しいタイプの分析測定を可能にし得る。例えば、酵素の機能的変動をモニターすることは、薬物分子候補のスクリーニングの迅速で簡便な方法を提供する。バイオポリマーを処理するタンパク質の変動をモニターすることは、それらの組成物およびコンフォメーションに関する情報を明らかにするのであろう。
本開示は、タンパク質活性の直接電気測定(direct electrical measurement)用のデバイス、システムおよび方法に関する。いくつかの実施形態において、デバイスが提供される。当該デバイスは、第1の電極および第2の電極を含み、第1の電極および第2の電極はギャップによって離れている。当該デバイスは、一方または両方の電極に付着したタンパク質を含む。第1の電極および第2の電極は分析対象試料と接触するように構成されている。
図1は、Chenらによる、公知のポリメラーゼ変動用の検出システムを示す。
本開示は、少なくとも以下の(1)〜(43)を含む。
(a)誘電体基材;
(b)誘電体基材上に配置された第1の電極;
(c)第1の電極上に配置された絶縁性誘電体層;
(d)絶縁性誘電体層上に配置された第2の電極;
(e)第2の電極上に配置されたパッシベーション層;
(f)一方または両方の電極に付着したタンパク質;を含み、
第1の電極、絶縁性誘電体層、第2の電極およびパッシベーション層には、それらを通過する開口が形成されている、デバイス。
(a)同一平面上にあり、ギャップによって離れている、第1の電極および第2の電極;
(b)少なくとも一方の電極に付着したタンパク質;を含み、
第1の電極および第2の電極は分析対象試料と接触するように構成されている、デバイス。
(a)誘電体基材;
(b)誘電体基材上に配置された第1の電極;
(c)誘電体基材上に配置された第2の電極であって、第1の電極および第2の電極は1nm〜10nmのギャップによって離れている、第2の電極;
(d)電極の上に配置されたパッシベーション層;
(e)一方または両方の電極に付着したタンパク質;を含み、
第1の電極と第2の電極との間のギャップに試料が移動できる位置に、パッシベーション層を通過する開口が形成されている、デバイス。
(a)上記(5)〜(7)のいずれかのデバイス;
(b)タンパク質と相互作用することができる化学物質を導入する手段;
(c)第1の電極と第2の電極との間にバイアスを印加する手段;
(d)化学物質がタンパク質と相互作用するときに生じる変動をモニターする手段;を含む、システム。
(a)上記(18)のシステムとタンパク質分子を相互作用させることができる化学物質を導入する工程;
(b)2つの電極間に定常DC電流が観察されるように選択されたバイアスを印加する工程;
(c)化学物質がタンパク質と相互作用するときに生じる2つの電極間の電流の変動を観察する工程;を含む、方法。
(a)プライムDNAテンプレートを上記(18)のシステムに導入する工程;
(b)4つのdNTPを含む溶液を導入する工程;
(c)2つの電極間に定常DC電流が観測されるように選択されたバイアスを印加する工程;
(d)新しいヌクレオチドそれぞれがプライマーに組み込まれたときに生じる2つの電極間の電流の変動を検出する工程;
(e)組み込まれている各ヌクレオチドのアイデンティティ(identity)を決定する工程;を含む方法。
(a)上記(18)のシステムにバイオポリマーを導入する工程;
(b)2つの電極間に定常DC電流が観測されるように選択されたバイアスを印加する工程;
(c)モノマーがバイオポリマーの末端から除去されるときに生じる2つの電極間の電流の変動を検出する工程;
(d)バイオポリマーから除去された各モノマーのアイデンティティを決定する工程;を含む、方法。
(a)キナーゼ阻害剤候補を上記(20)のシステムに導入する工程;
(b)2つの電極間に定常DC電流が観測されるように選択されたバイアスを印加する工程;
(c)キナーゼがキナーゼ阻害剤候補分子と相互作用するときに生じる2つの電極間の電流の変動を検出する工程;
(d)キナーゼ阻害剤候補分子の存在下でキナーゼが活性を有するか否かを決定する工程;を含む、方法。
(a)誘電体基材;
(b)誘電体基材上に配置された第1の電極;
(c)第1の電極上に配置された絶縁性誘電体層;
(d)絶縁性誘電体層上に配置された第2の電極;
(e)第2の電極上に配置されたパッシベーション層;
(f)第1の電極および第2の電極に付着したポリメラーゼ分子;を含み、
第1の電極、絶縁性誘電体層、第2の電極およびパッシベーション層には、それらを通過する開口が形成されている、アレイ。
デバイスは、
(a)誘電体基材;
(b)誘電体基材上に配置された第1の電極;
(c)誘電体基材上に配置された第2の電極;
(d)電極の上に配置されたパッシベーション層;
(e)一方または両方の電極に付着したポリメラーゼ分子;を含み、
パッシベーション層を通過する開口が形成されている、アレイ。
デバイスは、
(a)同一平面上にあり、ギャップによって離れている、第1の電極および第2の電極;
(b)少なくとも一方の電極に付着したポリメラーゼ;を含み、
第1の電極および第2の電極は分析対象試料と接触するように構成されている、アレイ。
(a)本明細書に記載のアレイ;
(b)任意に、溶液をアレイに導入し除去する手段;
(c)第1の電極および第2の電極間にバイアスを印加する手段;
(d)第1の電極および第2の電極間に生成される電流をモニターする手段;を含む、アレイ。
(a)本明細書に記載のシステムにDNAテンプレートを含む溶液を導入する工程;
(b)本明細書に記載のシステムにバイアスを印加するときに生成する第1の電流を測定する工程;
(c)DNAテンプレートに相補的なdNTPの組み込みを可能にする条件下において、dNTPを含む溶液をシステムに導入する工程;
(d)工程(c)において生成する第2の電流を測定する工程;
(e)組み込まれていないdNTPを含む溶液を除去する工程;
(f)工程(c)において使用されなかった残りの3つの種類のdNTPの各々を用いて工程(c)〜(e)を繰り返す工程;
(g)工程(c)〜(f)を繰り返す工程;を含み、
生成した電流シグナルからDNAの配列を決定する、方法。
(a)本明細書に記載のシステムにDNAテンプレートを含む溶液を導入する工程;
(b)本明細書に記載のシステムにバイアスを印加するときに生成する第1の電流を測定する工程;
(c)DNAテンプレートに相補的なdNTPの組み込みを可能にする条件下において、少なくとも2種類のdNTPを含む溶液をシステムに導入する工程であって、各種類のdNTPが異なる濃度において溶液に存在している、工程;
(d)工程(b)において生成する第2の電流を測定する工程;
(e)組み込まれていないdNTPを含む溶液を除去する工程;
(f)工程(c)において使用されなかった残りの種類のdNTPの各々を用いて工程(c)〜(e)を繰り返す工程;
(g)工程(c)〜(f)を繰り返す工程;を含み、
生成した電流シグナルからDNAの配列を決定する、方法。
別段の定義がない同様、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。材料、方法および例は、例示にすぎず、限定を意図するものではない。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および他の文献は、その全体が参照により組み込まれる。
本開示は、タンパク質活性の直接測定用デバイスを提供する。一実施形態において、デバイスは、第1の電極および第2の電極と、一方または両方の電極に付着されたタンパク質と、を含む。第1の電極および第2の電極はギャップによって離れている。第1の電極および第2の電極には、それらを通過する開口が形成されている。
(a)誘電体基材;
(b)誘電体基材上に配置された第1の電極;
(c)第1の電極上に配置された絶縁性誘電体層;
(d)絶縁性誘電体層上に配置された第2の電極;
(e)第2の電極上に配置されたパッシベーション層;
(f)一方または両方の電極に付着したタンパク質;を含む。
第1の電極、絶縁性誘電体層、第2の電極およびパッシベーション層には、それらを通過する開口が形成されている。
(a)誘電体基材;
(b)誘電体基材上に配置された第1の電極;
(c)絶縁性誘電体層上に配置された第2の電極;
(d)一方または両方の電極に付着したタンパク質;を含む。
パッシベーション層を通過する開口が形成されている。
(a)同一平面上にあり、ギャップによって離れており、第2の電極と共に平面内にある、第1の電極および第2の電極;
(b)少なくとも一方の電極に付着したタンパク質;を含む。
第1の電極および第2の電極は分析対象試料と接触するように構成されている。
本開示のデバイスは、Au、Pt、またはPdなどの貴金属元素の層を、ケイ素、ガラス、またはサファイアウェハ(または他の誘電体基材)上に堆積させ、次いで、接着用である反応性金属(クロムまたはチタンなど)の薄層(典型的には1nm)を堆積させ、次いで、貴金属元素の1〜10nm、または1〜20nm、または1〜50nmの層を堆積させることによって容易に製造することができる。この下部電極は絶縁性誘電体層、好ましくはアルミナで覆われているが、SiO2または酸化ハフニウムなどの他の酸化物を使用してもよい。この層の厚さは2〜10nmであるべきである。貴金属元素の底部電極を1〜1.5nmのアルミニウムで被覆し、それを大気中で酸化させることによって、厚さが2〜3nmであるAl2O3層が形成し、2nmの層を堆積させることができる。さらに厚い誘電体が必要とされる場合、本技術分野で周知のように、水/トリメチルアルミニウムサイクルを用いた原子層堆積によって、さらなるAl2O3を加えることができる。
タンパク質がポリメラーゼであるとき、phi29ポリメラーゼなどの、連続反応性が高いポリメラーゼであるべきである。当該ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ機能は以下に述べるように不能であるべきである。
本開示の重要なポイントは、ポリメラーゼを介して良好な電子コンダクタンスを得ることができることである。図9は、チオール結合を介して基質に連結したストレプトアビジンによるコンダクタンスの分布を示す(左パネル)。これらのデータは、2.5nmの電極ギャップで得られた。ギャップを3.5nmに増加させた場合、読み取りはほとんど起こらない。ギャップをさらに4.5nmに増加させると、全く読み取りが得られない。この結果は、表面上に平坦に存在するストレプトアビジン分子の高さが約4nmであるという事実と一致する。図9の右側は、Pd電極上のストレプトアビジンとビオチン化phi29ポリメラーゼとの複合体についてのデータを示す。これらのデータは、3.5nmのギャップサイズで得られた。複合体について4.5nmのギャップサイズで同様のデータを記録した(ストレプトアビジンについてコンダクタンスが記録されなかったギャップ)。これらの距離はストレプトアビジン単独が強固なシグナルを与えるギャップよりも大きいので、これらの結果はストレプトアビジンと直列に配線されたポリメラーゼを介して伝導が起こっていることを示す。コンダクタンスの分布がストレプトアビジン単独と比較して複合体においてどのように変化するかに注目されたい。
図10は、ストレプトアビジン単独(左パネル)およびビオチンへの曝露後のストレプトアビジンについての、測定したコンダクタンス分布を示す。ストレプトアビジンがビオチンに結合した後に測定されたコンダクタンスの分布が変化した。この結果は、タンパク質のコンダクタンスがタンパク質のコンフォメーション変化に感受性があることを示している。
図11は、4.5nmのギャップを用いて、走査型トンネリング顕微鏡で記録した電圧誘起コンフォメーション変動(左側のパネル)と、固体チップで記録した電圧誘起コンフォメーション変動(右側のパネル)の記録を示す。バイアスはVCより高い、200mV、100mVであった。タンパク質は、電極に接着した抗ジニトロフェノール分子結合ジニトロフェノール(DNP)である。ミリ秒タイムスケールでの非常に大きなコンダクタンスの変化は、優れたシグナル対ノイズ比で容易に記録される。図12D、EおよびFはバイアスがVC未満に低下し(この場合50mVまで)、基質の添加によってタンパク質が活性化されたときに生じる電流の変動を示す。テレグラフノイズは、シグナル対ノイズ比が非常に高いmsタイムスケールで発生する。
本開示は、バイオポリマーの配列を決定する方法を提供する。図7は、ポリメラーゼによって伸長される核酸鎖の特定の場合について説明する。図7では、ポリメラーゼ96が2つの点53、52において修飾されている。特定の一例は、phi29ポリメラーゼにおいて利用可能な2つの表面露出システインである。別の一例は、図15に示すビオチン官能基化である。マレイミド修飾アルカンまたはPEGリンカー54、55は、強力なチオール結合(例えば)56を介して電極57、58にポリメラーゼを結合させるために使用される。電極ギャップにおけるポリメラーゼの結合は、V<VC(59)のときに定常DC電流60によって確認される。ポリメラーゼ96がプライムテンプレート91と複合体を形成し、4つのヌクレオチド三リン酸92、93、94、95の各々を含む溶液に曝露されるとき、特徴的な電流変動は、所与のヌクレオチドの取り込みをシグナル伝達する。代替の実施形態において、表面システインを使用して、直接接着の1つを作製し得る。
本開示は、ヌクレアーゼ、プロテアソーム、グリコペプチダーゼ、グリコシダーゼ、キナーゼおよびエンドヌクレアーゼなどの分子テンプレートと連続的に相互作用する酵素のいずれかを用いて、バイオポリマーの配列を決定するアレイを提供する。以下の実施形態は、ポリメラーゼを使用してDNAの配列を決定するアレイを例示する。アレイ中のポリメラーゼの代わりに、任意のプロセッシブ酵素を用いることができることを理解されたい。
本開示はまた、本明細書に記載のアレイのシステムを使用する、DNA配列を決定する方法を提供する。
以下の参考文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる:
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本発明は、国立衛生研究所によって付与されたHG009180に基づく政府の支援によりなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
Claims (35)
- タンパク質活性の直接測定用デバイスであって、
同一平面上にあり、ギャップによって離れている、第1の電極および第2の電極;
一方または両方の電極に付着したタンパク質;を含み、
前記第1の電極および前記第2の電極は分析対象試料と接触するように構成されている、デバイス。 - 前記ギャップの幅が約1.0nm〜約20.0nmである、請求項1に記載のデバイス。
- タンパク質活性の直接測定用デバイスであって、
(a)誘電体基材;
(b)前記誘電体基材上に配置された第1の電極;
(c)前記第1の電極上に配置された絶縁性誘電体層;
(d)前記絶縁性誘電体層上に配置された第2の電極;
(e)前記第2の電極上に配置されたパッシベーション層;
(f)一方または両方の電極に付着したタンパク質;を含み、
前記第1の電極、前記絶縁性誘電体層、前記第2の電極および前記パッシベーション層には、それらを通過する開口が形成されている、デバイス。 - 前記タンパク質が、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアソーム、グリコペプチダーゼ、グリコシダーゼ、キナーゼおよびエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項1または3に記載のデバイス。
- 前記タンパク質がポリメラーゼである、請求項4に記載のデバイス。
- 前記ポリメラーゼが一方の電極に付着している、請求項5に記載のデバイス。
- 前記ポリメラーゼがリンカーを介して前記電極に結合している、請求項5に記載のデバイス。
- 前記タンパク質がビオチン化ポリメラーゼである、請求項5に記載のデバイス。
- 前記ビオチン化ポリメラーゼが、チオ−ストレプトアビジンリンカーを介して前記電極に結合している、請求項8に記載のデバイス。
- 前記第1の電極および/または前記第2の電極が、金、白金、パラジウム、およびルテニウムからなる群から選択される金属を含む、請求項1に記載のデバイス。
- 前記第1の電極および/または前記第2の電極がパラジウムを含む、請求項10に記載のデバイス。
- タンパク質活性の直接測定用デバイスであって、
(a)誘電体基材;
(b)前記誘電体基材上に配置された第1の電極;
(c)前記誘電体基材上に配置された第2の電極であって、前記第1の電極および前記第2の電極は1〜20nmのギャップによって離れている、第2の電極;
(d)前記電極の上に配置されたパッシベーション層;
(e)一方または両方の電極に付着したタンパク質;を含み、
前記第1の電極と前記第2の電極との間の前記ギャップに試料が移動できる位置に、前記パッシベーション層を通過する開口が形成されている、デバイス。 - タンパク質活性の直接電気測定用システムであって、
(a)請求項1に記載のデバイス;
(b)前記タンパク質と相互作用することができる化学物質を導入する手段;
(c)前記第1の電極と前記第2の電極との間にバイアスを印加する手段;
(d)前記化学物質がタンパク質と相互作用するときに生じる変動をモニターする手段;を含む、システム。 - 前記タンパク質がポリメラーゼである、請求項13に記載のシステム。
- 前記タンパク質がエキソヌクレアーゼ、プロテアソーム、またはグリカンである、請求項13に記載のシステム。
- 前記タンパク質がキナーゼである、請求項13に記載のシステム。
- 単一のタンパク質分子の活性を検出する方法であって、
(a)請求項13に記載のシステムと前記タンパク質分子を相互作用させることができる化学物質を導入する工程;
(b)定常DC電流が観察されるように選択された2つの電極間にバイアスを印加する工程;
(c)前記化学物質が前記タンパク質と相互作用するときに生じる前記2つの電極間の電流の変動を観察する工程;を含む、方法。 - 前記タンパク質が、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアソーム、グリコペプチダーゼ、グリコシダーゼ、キナーゼおよびエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記化学物質が、ヌクレオチド三リン酸、核酸、ペプチド、グリカンおよびキナーゼからなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- DNAの配列を決定する方法であって、
(a)プライムDNAテンプレートを請求項13に記載のシステムに導入する工程;
(b)4つのdNTPを含む溶液を導入する工程;
(c)2つの電極間に定常DC電流が観測されるように選択されたバイアスを印加する工程;
(d)新しいヌクレオチドそれぞれがプライマーに組み込まれたときに生じる2つの電極間の電流の変動を検出する工程;
(e)組み込まれている各ヌクレオチドのアイデンティティを決定する工程;を含む方法。 - 前記溶液が、互いにおおよそ同じ濃度である4つのdNTPを含む、請求項20に記載の方法。
- 前記dNTPの濃度がテンプレートに結合するポリメラーゼの飽和濃度とおおよそ同じ濃度以上である、請求項20に記載の方法。
- 工程(d)が、1つ以上の電流スパイクの存在を検出する工程を含む、請求項20に記載の方法。
- 工程(e)が、各スパイクの特性を使用する工程を含む、請求項20に記載の方法。
- バイオポリマーの配列を決定する方法であって、
(a)請求項15に記載のシステムにバイオポリマーを導入する工程;
(b)2つの電極間に定常DC電流が観測されるように選択されたバイアスを印加する工程;
(c)モノマーが前記バイオポリマーの末端から除去されるときに生じる前記2つの電極間の電流の変動を検出する工程;
(d)前記バイオポリマーから除去された各モノマーのアイデンティティを決定する工程;を含む、方法。 - 前記バイオポリマーが、DNA、ペプチド、またはグリカンである、請求項25に記載の方法。
- キナーゼの活性を検出する方法であって、
(a)キナーゼ阻害剤候補分子を請求項16に記載のシステムに導入する工程;
(b)2つの電極間に定常DC電流が観測されるように選択されたバイアスを印加する工程;
(c)キナーゼが前記キナーゼ阻害剤候補分子と相互作用するときに生じる前記2つの電極間の電流の変動を検出する工程;
(d)前記キナーゼ阻害剤候補分子の存在下でキナーゼが活性を有するか否かを決定する工程;を含む、方法。 - DNAの配列を決定するアレイであって、
(a)誘電体基材;
(b)前記誘電体基材上に配置された第1の電極;
(c)前記第1の電極上に配置された絶縁性誘電体層;
(d)前記絶縁性誘電体層上に配置された第2の電極;
(e)前記第2の電極上に配置されたパッシベーション層;
(f)前記第1の電極および前記第2の電極に付着したポリメラーゼ分子;を含み、
前記第1の電極、前記絶縁性誘電体層、前記第2の電極および前記パッシベーション層には、それらを通過する開口が形成されている、アレイ。 - DNAの配列を決定するアレイであって、複数のデバイスの配置を含み、
前記デバイスは、
(a)誘電体基材;
(b)前記誘電体基材上に配置された第1の電極;
(c)前記誘電体基材上に配置された第2の電極;
(d)前記電極の上に配置されたパッシベーション層;
(e)一方または両方の電極に付着したポリメラーゼ分子;を含み、
前記パッシベーション層を通過する開口が形成されている、アレイ。 - 前記配置が格子状である、請求項28または29に記載のアレイ。
- ポリメラーゼ活性の直接測定用システムであって、
(a)請求項28または29に記載のアレイ;
(b)任意に、溶液を前記アレイに導入し除去する手段;
(c)前記第1の電極および前記第2の電極間にバイアスを印加する手段;
(d)前記第1の電極および前記第2の電極間に生成される電流をモニターする手段;を含む、アレイ。 - DNAの配列を決定する方法であって、
(a)請求項31に記載のシステムにDNAテンプレートを含む溶液を導入する工程;
(b)本明細書に記載のシステムにバイアスを印加するときに生成する第1の電流を測定する工程;
(c)前記DNAテンプレートに相補的なdNTPの組み込みを可能にする条件下において、dNTPを含む溶液を前記システムに導入する工程;
(d)工程(c)において生成する第2の電流を測定する工程;
(e)組み込まれていないdNTPを含む溶液を除去する工程;
(f)工程(c)において使用されなかった残りの3つの種類のdNTPの各々を用いて工程(c)〜(e)を繰り返す工程;
(g)工程(c)〜(f)を繰り返す工程;を含み、
生成した電流シグナルからDNAの配列を決定する、方法。 - DNAの配列を決定する方法であって、
(a)請求項31に記載のシステムにDNAテンプレートを含む溶液を導入する工程;
(b)本明細書に記載のシステムにバイアスを印加するときに生成する第1の電流を測定する工程;
(c)前記DNAテンプレートに相補的なdNTPの組み込みを可能にする条件下において、少なくとも2種類のdNTPを含む溶液をシステムに導入する工程であって、各種類のdNTPが異なる濃度において溶液に存在している、工程;
(d)工程(c)において生成する第2の電流を測定する工程;
(e)組み込まれていないdNTPを含む溶液を除去する工程;
(f)工程(c)において使用されなかった残りの種類のdNTPの各々を用いて工程(c)〜(e)を繰り返す工程;
(g)工程(c)〜(f)を繰り返す工程;を含み、
生成した電流シグナルからDNAの配列を決定する、方法。 - 工程(c)の溶液が4種類のdNTPを含む、請求項33に記載の方法。
- 工程(c)の溶液が少なくとも2種類のdNTPを含む、請求項33に記載の方法。
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