JP2021524281A - 酵素活性の直接電気測定用のデバイス、システムおよび方法 - Google Patents

酵素活性の直接電気測定用のデバイス、システムおよび方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、単一のタンパク質分子に少なくとも一方の電極を直接付着させることによって、当該タンパク質分子の機能的運動を感知するデバイス、システムおよび方法に関する。本開示はまた、アレイを含むシステムおよびアレイを使用してバイオポリマーの配列を決定する方法に関する。

Description

発明の詳細な説明
〔連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載〕
本発明は、国立衛生研究所によって付与されたHG910080に基づく政府の支援によりなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
〔背景技術〕
天然タンパク質の機能の基礎となる運動の電気的読み出しは、標識化なしで多くの新しいタイプの分析測定を可能にし得る。例えば、酵素の機能的変動をモニターすることは、薬物分子候補のスクリーニングの迅速で簡便な方法を提供する。バイオポリマーを処理するタンパク質の変動をモニターすることは、それらの組成物およびコンフォメーションに関する情報を明らかにするのであろう。
酵素機能の電気的読み出しはChoiら(Choi, Moody et al. 2012)によって実証された。Choiらは、カーボンナノチューブ電界効果トランジスタに誘起されたテレグラフノイズが、基質であるペプチドグリカンに作用するときの酵素リゾチームの機能的運動を反映していることを示した。このように、DNAポリメラーゼなどのプレセッシブ酵素(precessive enzyme)の変動をモニターすることで、DNA配列を決定する方法が得られる可能性があることが分かった。一つの例が、議論の余地のある論文で与えられた。Huangのグループは、ヌクレオチドが伸長鎖に組み込まれるときにポリメラーゼにおける電気的変動を測定し、伸長しているテンプレートの配列を高精度で伝えるシグナルを測定することを報告した(Chen, Lee et al. 2013)。その後、この論文は撤回された(Nature Nanotechnology 8, 452-458 (2013);2013年5月5日にオンラインで公開され;2013年7月11日および2013年8月28日に印刷後の修正がなされ;2015年6月3日に印刷後の撤回がなされた)。しかしながら、タンパク質の構造的変動が電気的読み出しによってモニターされ得る場合にシグナル検出が可能であり得ることを示す。より重要なことは、上記論文での提案の実用的な実現は、ポリメラーゼが繋がれたカーボンナノチューブ電界効果トランジスタを使用したCollinsのグループによってほぼ同時に実証された(Olsen, Choi et al. 2013)。シグナルは、ヌクレオチドが組み込まれたときにポリメラーゼの開閉に関連することが示されたテレグラフノイズから構成された。重要なことは、ノイズの特性は組み込まれている特定のヌクレオチドを反映し、DNA配列の電気的な単一分子の読み出しへの道を開いた。
Olsen, Choi et al. 2013において、タンパク質の変動は生成する電界変動を介して間接的に検出され、電界変動はポリメラーゼまたはリゾチームに近接した電界効果トランジスタチャネルによって感知された。図1はChoiらの提案を示す。溶液3中のヌクレオチド三リン酸塩の存在下において、プライムDNAテンプレート(primed DNA template)2と結合したポリメラーゼ1が抗体4によって、電界効果トランジスタのソース6とドレイン7との間のギャップにわたる金ビーズ5に結合し、電界効果トランジスタのチャネル8はゲート電極9の上に形成される。最初の報告の撤回を考慮すると、その発明が実際に機能したかは明らかではないが、コリンズのグループによる成功した発明の要素の多くを含んでいる。この発明は図2Aに示されている。電界効果トランジスタのソース21およびドレイン22が、トランジスタのチャネルを形成するカーボンナノチューブ23によって連結されている。このカーボンナノチューブには酵素(ここではリゾチーム)24が付着している。半導体バックゲート25を使用して、トランジスタをその最も感受性がある動作点に設定し、ターンオンとターンオフの中間にし、FET電流のゆらぎを介して酵素活性を検出する。後の論文において同じグループがカーボンナノチューブチャネル23に付着し、プライムDNAテンプレート27によって結合されたポリメラーゼ26がノイズスパイクをどのように生成したかを示し、ノイズスパイクの各々はポリメラーゼによるヌクレオチドの取り込みに関連していたかを示した(図2B)。得られたシグナル列の2つの例を図2Cに示す(ポリ(dA)28およびポリ(dC)29)。CNT FETからのノイズバックグラウンド30がシグナルレベル31と比較して有意であるが、シグナルにおける明確な違いによって配列決定が可能であることを示している。MerrimanおよびMolaによって、かなり類似した方法が提案されている(Merriman and Mola, 2016)。この提案を図2Cに示す。ポリメラーゼ436は、リンカー437を介して、電界効果トランジスタのソース438およびドレイン439に連結される分子ワイヤ433に化学的に連結される。分子ワイヤの下には、ゲート電極440が配置されている。これらの特許出願に提示されたデータは、Olsenらのデバイスで得られたものよりもさらに低いシグナルレベルを示すように思われる。
明らかに、試験中の酵素へのより直接的な電気的連結を行うことが望ましいであろう。本発明者らは認識トンネリング(recognition tunneling)と呼ばれる技術を開発し、認識分子を使用して、近接して配置された一対の電極のうちの少なくとも1つにタンパク質を結合させた(Zhang, Song et al. 2017)。このアプローチを図3に示す。このデバイスは、薄い誘電体層43によって離れている第1の電極41と第2の電極42とからなる。認識分子44は例えば、チオール−金属結合によって各電極に強く付着している。分子は、標的タンパク質45によって特異的に認識されて結合されるように選択される。これらの認識事象は一般に可逆的であるので、タンパク質の機能の研究のためにギャップ中に目的のタンパク質を保持するのに不適切である。したがって、本発明者らの以前の認識トンネリング技術は、未知のタンパク質の到達を検出するために測定デバイスを使用するのではなく、測定デバイスに連結された既知のタンパク質を保持する必要があるので、本発明の問題に適用できず、当該問題に不適切である。さらに限定的には、バイアス自体が電流(47)のテレグラフノイズ変動が発生するモードにタンパク質を駆動するように、これらのデバイスが十分に高バイアス(V、46)で操作される必要がある。タンパク質がインテグリンであり、認識分子がRGDペプチドであったこの公開された作業の場合、タンパク質結合は比較的高いバイアス(>100mV)でデバイスを操作し、印加されたバイアスによって誘導される変動を観察することによって検出される。タンパク質結合の検出器としての電圧誘起変動の使用はタンパク質の重要な生体分子機能を可能にするタンパク質の構造およびコンフォメーションの変動を測定するためのこのデバイスの使用を完全に排除する。なぜなら、機能的運動にかかわらず、十分に高い電位差に曝露されたすべてのタンパク質において、これらの電圧誘起変動が生じるからである。よって、上述した技術では、これらの重要な機能的運動からのシグナルが電圧誘起変動と区別することができない。したがって、電圧誘導コンダクタンス変動を排除し、重要で測定可能な機能的変動を生成する化学的刺激に曝露されている間にタンパク質を適所に保持する条件下で、一対の電極にわたるタンパク質分子の結合を検出し、候補薬物またはバイオポリマーなどの他の化学物質に対するそれらの変動の応答を測定するためのシステムおよび方法を見出すことが望ましい。
本セクションにおける任意の参考文献の引用は、これらの参考文献が本開示の先行技術であることを容認するものとして解釈されるべきではない。
〔要約〕
本開示は、タンパク質活性の直接電気測定(direct electrical measurement)用のデバイス、システムおよび方法に関する。いくつかの実施形態において、デバイスが提供される。当該デバイスは、第1の電極および第2の電極を含み、第1の電極および第2の電極はギャップによって離れている。当該デバイスは、一方または両方の電極に付着したタンパク質を含む。第1の電極および第2の電極は分析対象試料と接触するように構成されている。
いくつかの実施形態において、タンパク質は一方の電極に付着している。他の実施形態において、タンパク質は2つの電極に付着している。
いくつかの実施形態において、デバイスはさらに、ギャップ内に配置された絶縁性誘電体層を含む。
いくつかの実施形態において、タンパク質は、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアソーム、グリコペプチダーゼ、グリコシダーゼ、キナーゼ、および、エンドヌクレアーゼからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、タンパク質は一方の電極に付着している。他の実施形態において、タンパク質は両方の電極に付着している。
いくつかの実施形態において、タンパク質はリンカーを介して電極に付着している。
いくつかの実施形態において、デバイスは第1の電極および第2の電極を含む。第1の電極および第2の電極はギャップによって離れている。デバイスは一方または両方の電極に付着したタンパク質を含む。タンパク質が化学物質と相互作用するとき、電流変動が生成する。
いくつかの実施形態において、デバイスが提供される。当該デバイスは、(a)誘電体基材;(b)誘電体基材上に配置された第1の電極;(c)第1の電極上に配置された絶縁性誘電体層;(d)絶縁性誘電体層上に配置された第2の電極;(e)第2の電極上に配置されたパッシベーション層;(f)一方または両方の電極に付着したタンパク質;を含む。第1の電極、絶縁性誘電体層、第2の電極およびパッシベーション層には、それらを通過する開口が形成されている。
いくつかの実施形態において、デバイスは、第1の電極および第2の電極を含む。第1および第2の電極はギャップによって離れている。デバイスは一方または両方の電極に付着したタンパク質を含む。第1の電極および第2の電極には、それらを通過する開口が形成されている。
いくつかの実施形態において、デバイスは、第1の電極および第2の電極を含む。第1の電極および第2の電極は同一平面上にあり、ギャップによって離れている。デバイスは一方または両方の電極に付着したタンパク質を含む。第1の電極および第2の電極は分析対象試料と接触するように構成される。
いくつかの実施形態において、デバイスは、ギャップ内に配置された絶縁性誘電体層をさらに含む。
いくつかの実施形態において、タンパク質は一方の電極に付着している。本実施形態のいくつかの態様において、タンパク質はポリメラーゼである。本実施形態のいくつかの態様において、ポリメラーゼはリンカーを介して電極に付着している。いくつかの態様において、ポリメラーゼはビオチン化ポリメラーゼである。いくつかの態様において、ポリメラーゼはビオチン化ポリメラーゼであり、ストレプトアビジンを介して電極に付着している。
デバイスのいくつかの実施形態において、第1の電極および/または第2の電極は、金、白金、パラジウム、およびルテニウムからなる群から選択される金属を含む。いくつかの実施形態において、金属はパラジウムである。
いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約1.0nm〜約20.0nmである。いくつかの実施形態では、ギャップの幅は約1.0nm〜約10.0nmである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約2.0nm〜約10.0nmである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約1.0nm〜約7.5nmである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約1.0nm〜約5.0nmである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約4.0nm〜約5.0nmである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約5.0nm〜約6.0nmである。
いくつかの実施形態において、デバイスは単一の分子を検出するために使用され得る。
いくつかの実施形態において、システムが提供される。当該システムは、本明細書に記載のデバイスと、タンパク質と相互作用することができる化学物質を導入する手段と、重要である第1の電極と第2の電極との間にバイアスを印加する手段と、化学物質がタンパク質と相互作用するときに生じる変動をモニターする手段とを含む。
いくつかの実施形態において、バイアスは1mV〜50mVである。
いくつかの実施形態において、バイアスが1mV〜100mVである。
いくつかの実施形態において、方法が提供される。当該方法は、(a)本明細書に記載のシステムを提供する工程と、(b)タンパク質を化学物質と接触させる工程と、(c)電極間の電流の自然変動が生じないように、重要である第1の電極と第2の電極との間にバイアスを印加する工程と、(d)化学物質がタンパク質と相互作用するときに生じる変動を検出する工程と、を含む。
本開示の方法は、単一のタンパク質分子の活性を検出するために使用され得る。当該方法はまた、バイオポリマーの配列を決定するために使用され得る。当該方法はまた、薬物スクリーニングアッセイにおいて使用され得る。有利には、当該方法は標識または特殊な化学作用を必要としない。
バイオポリマーの配列を決定する方法は長い読み取り(>10kB)を提供し、ポリメラーゼは天然ポリメラーゼの速度(100nt/s)で処理する。
本開示のデバイスは簡易なデバイス形状を有する。このことによって、容易なスケールアップを可能にする。
本開示は、単一のプロセッシブタンパク質(processive protein)についての直接電気測定によってバイオポリマーの配列を決定するアレイ、システム、および方法に関する。
一実施形態において、本開示は、本明細書に記載の複数のデバイスの配置を含む、バイオポリマーの配列を決定するアレイを提供する。本実施形態の一態様において、アレイはDNAの配列を決定する。
本開示は、タンパク質活性の直接測定用のシステムを提供する。当該システムは、(a)本明細書に記載のアレイ、(b)任意に、溶液をアレイに導入し除去する手段、(c)第1の電極および第2の電極間にバイアスを印加する手段、(d)第1の電極および第2の電極間に生成される電流をモニターする手段を含む。本実施形態の一態様において、本システムは、ポリメラーゼ活性の直接測定用である。
本開示はまた、バイオポリマーの配列を決定する方法を提供する。一実施形態において、当該方法はDNAの配列を決定する方法である。この方法は(a)DNAテンプレートを含む溶液を本明細書に記載のシステムに導入する工程;(b)本明細書に記載のシステムにバイアスを印加するときに生成する第1の電流を測定する工程;(b)DNAテンプレートに相補的なdNTPの組み込みを可能にする条件下において、dNTPを含む溶液をシステムに導入する工程;(c)工程(b)において生成する第2の電流を測定する工程;(d)組み込まれていないdNTPを含む溶液を除去する工程;(e)工程(b)において使用されなかった残りの3つの種類のdNTPの各々を用いて工程(b)〜(d)を繰り返す工程;(f)工程(b)〜(e)を繰り返す工程;を含む。この方法において、生成した電流シグナルからDNAの配列が決定される。
別の実施形態において、本方法は、(a)DNAテンプレートを含む溶液を本明細書に記載のシステムに導入する工程;(b)本明細書に記載のシステムにバイアスを印加するときに生成する第1の電流を測定する工程;(b)DNAテンプレートに相補的なdNTPの組み込みを可能にする条件下において、少なくとも2種類のdNTPを含む溶液をシステムに導入する工程であって、各種類のdNTPが異なる濃度において溶液に存在している、工程;(c)工程(b)において生成する第2の電流を測定する工程;(d)組み込まれていないdNTPを含む溶液を除去する工程;(e)工程(b)において使用されなかった残りの種類のdNTPを用いて工程(b)〜(d)を繰り返す工程;(f)工程(b)〜(e)を繰り返す工程;を含む。この方法において、生成した電流シグナルからDNAの配列が決定される。
〔図面の簡単な説明〕
図1は、Chenらによる、公知のポリメラーゼ変動用の検出システムを示す。
図2AはChoiらによる、公知のリソチーム変動用の検出システムを示す。図2BはOlsenらによる、公知のポリメラーゼ変動用の検出システムを示す。図2CはOlsonらによる、ヌクレオチド配列依存性データを示す。図2Dは、MerrimanおよびMolaによる、公知のポリメラーゼ変動用の検出システムを示す。
図3は、公知のタンパク質検出用デバイスを示す。
図4は、本開示の実施形態の概略図を示す。
図5Aは、図4に示すように、タンパク質が2点で結合しているときに得られる直線電流電圧特性を示す。図5Bは、多数の単一分子測定の直線領域の勾配の分布を示す。
図6は、タンパク質変動を表すシグナルを示す。
図7は、タンパク質がポリメラーゼである、本開示の実施形態の概略図を示す。
図8Aは、ポリメラーゼ活性を測定するために使用される蛍光活性アッセイの原理を示す。ポリメラーゼ活性が存在しない限り、FAM(F)蛍光は消光する。図8Bは、野生型酵素、エキソヌクレアーゼを含まない酵素(D12A、E14A)または、ストレプトアビジンに結合したエキソヌクレアーゼを含まない酵素と60分間インキュベート後の基板上のFAMの蛍光強度を示す。
図9は、チオール化ストレプトアビジン(左)およびビオチン化phi29ポリメラーゼの付着後(右)について測定したコンダクタンスの分布を示す。ストレプトアビジン測定を2.5nmのギャップで行い、ストレプトアビジン+phi29の測定を3.5nmのギャップで行った。
図10は、コンフォメーションによるコンダクタンス変化を示す。左のパネルはチオ−ストレプトアビジンについてであり、右のパネルはビオチンを添加した後の分子の同じフィルムから得られたデータである。コンダクタンス変化は、ビオチン結合によって誘導されるコンフォメーション変化に感受性であることを示す。
図11は、STMギャップ(左)および固体チップ(右)におけるタンパク質変動の高コントラスト、高時間分解能記録を示す。試料は、電極上にDNPを有する抗DNP IgEである。デバイスは4.6nmのギャップで200mVにて操作した。
図12は、一定のギャップで収集された電流(各パネルの左下にマークされている)およびphi29−ストレプトアビジン複合体における50mNバイアスが、テンプレートDNAおよびdNTPの非存在下での接触変動(A、B、C)、ならびに、テンプレートDNAおよびdNTPが添加されるときに見られる追加のテレグラフノイズ(D、E、F)を示す。右の挿入図は、20〜40秒の持続時間のフル走行を示す。赤い円は、左図のトレースにおいて拡大された高電流点を示す。
図13は約4.5nmのギャップでPd電極上のペプチドリガンド(表1に列挙されている)に結合した3つの抗体およびインテグリンについて測定したコンダクタンス(対数スケール)の分布を示す。約2.5nmのギャップでデータが取得された、チオール結合によって電極に結合したストレプトアビジンについてのデータは除く。分布を明確にするために、垂直方向に任意に分布を移動させている。挿入図は、電極に付着するペプチドの2つの結合部位を有する抗体がどのようにしてギャップを埋めることができるかを示している。その結果、第2の高いコンダクタンスのピーク(「2」と表示)が生じた。単一の連結も起こり得る(「1」)。これらのデータは、2つの化学的連結がタンパク質と電極との間で発生する場合(各電極に対して1つ)、長い距離(抗体の結合部位間の13nm)にわたって、どれほど高いコンダクタンス(約2nS)を得ることができるかを示す。
図14は、マークを付したように、異なるギャップサイズで採取したストレプトアビジン(左)およびストレプトアビジン−ポリメラーゼ複合体(右)のコンダクタンス分布のギャップ距離依存性を示す。コンダクタンス分布はギャップサイズによってほとんど変化せず、これらのタンパク質における伝導は非局在化輸送メカニズムによることを示した。挿入図はタンパク質の高さの推定値を示しており、ストレプトアビジンの高さは約4nmであり、ストレプトアビジンと結合したphi29の複合体の高さは約9nmである。シグナルは5.5nmほどの大きなギャップから得られる。このことは、プローブがこれらのデータセットにおいてポリメラーゼ内部とほぼ確実に接触しているが、伝導経路が部分的にはphi29を通っているに違いないことを示す。
図15は、5nm離れた、ポリメラーゼ上の2つのビオチン化部位を介するポリメラーゼの、電極上の2つのストレプトアビジン分子への結合を示す。ストレプトアビジン分子は、チオール部分を介して電極に結合する。
図16は、DNAテンプレートと結合したポリメラーゼ分子のアレイを示し、各ポリメラーゼは個々に整列された電極対に連結している。
図17は、各部位における各テンプレート分子の配列を決定するための、ヌクレオチド三リン酸への配列の曝露およびすすぎを示す。
図18は、同一の塩基を含む部位における2つの同一のヌクレオチドの連続的な取り込みに特徴的な2つのテレグラフノイズのバーストを示す。
〔詳細な説明〕
本開示は、少なくとも以下の(1)〜(43)を含む。
(1)実質的に図示および記載される、デバイス。
(2)図示および記載される、タンパク質活性の直接電気測定用システム。
(3)図示および記載される、タンパク質活性を検出する方法。
(4)図示および記載される、バイオポリマーの配列を決定する方法。
(5)タンパク質活性の直接測定用デバイスであって、第1の電極および第2の電極と、一方または両方の電極に付着したタンパク質と、を含み、第1の電極および第2の電極はギャップによって離れており、第1の電極および第2の電極には、それらを通過する開口が形成されている、デバイス。
(6)ギャップの幅が約1.0nm〜約20.0nmである、上記(5)のデバイス。
(7)タンパク質活性の直接測定用デバイスであって、
(a)誘電体基材;
(b)誘電体基材上に配置された第1の電極;
(c)第1の電極上に配置された絶縁性誘電体層;
(d)絶縁性誘電体層上に配置された第2の電極;
(e)第2の電極上に配置されたパッシベーション層;
(f)一方または両方の電極に付着したタンパク質;を含み、
第1の電極、絶縁性誘電体層、第2の電極およびパッシベーション層には、それらを通過する開口が形成されている、デバイス。
(8)タンパク質活性の直接測定用デバイスであって、
(a)同一平面上にあり、ギャップによって離れている、第1の電極および第2の電極;
(b)少なくとも一方の電極に付着したタンパク質;を含み、
第1の電極および第2の電極は分析対象試料と接触するように構成されている、デバイス。
(9)タンパク質が、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアソーム、グリコペプチダーゼ、グリコシダーゼ、キナーゼおよびエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、上記(5)〜(8)のいずれかのデバイス。
(10)タンパク質がポリメラーゼである、上記(9)のデバイス。
(11)ポリメラーゼが一方の電極に付着している、上記(10)のデバイス。
(12)ポリメラーゼがリンカーを介して電極に結合している、上記(10)または(11)のデバイス。
(13)タンパク質がビオチン化ポリメラーゼである、上記(10)〜(12)のいずれかのデバイス。
(14)ビオチン化ポリメラーゼが、チオ−ストレプトアビジンリンカーを介して電極に結合している、上記(13)のデバイス。
(15)第1の電極および/または第2の電極が、金、白金、パラジウム、およびルテニウムからなる群から選択される金属を含む、上記(5)〜(14)のいずれかのデバイス。
(16)第1の電極および/または第2の電極がパラジウムを含む、上記(15)のデバイス。
(17)タンパク質活性の直接測定用デバイスであって、
(a)誘電体基材;
(b)誘電体基材上に配置された第1の電極;
(c)誘電体基材上に配置された第2の電極であって、第1の電極および第2の電極は1nm〜10nmのギャップによって離れている、第2の電極;
(d)電極の上に配置されたパッシベーション層;
(e)一方または両方の電極に付着したタンパク質;を含み、
第1の電極と第2の電極との間のギャップに試料が移動できる位置に、パッシベーション層を通過する開口が形成されている、デバイス。
(18)タンパク質活性の直接電気測定用システムであって、
(a)上記(5)〜(7)のいずれかのデバイス;
(b)タンパク質と相互作用することができる化学物質を導入する手段;
(c)第1の電極と第2の電極との間にバイアスを印加する手段;
(d)化学物質がタンパク質と相互作用するときに生じる変動をモニターする手段;を含む、システム。
(19)タンパク質がポリメラーゼである、上記(18)のシステム。
(20)タンパク質がエキソヌクレアーゼ、プロテアソーム、またはグリカンである、上記(18)のシステム。
(21)タンパク質がキナーゼである、上記(18)のシステム。
(22)単一のタンパク質分子の活性を検出する方法であって、
(a)上記(18)のシステムとタンパク質分子を相互作用させることができる化学物質を導入する工程;
(b)2つの電極間に定常DC電流が観察されるように選択されたバイアスを印加する工程;
(c)化学物質がタンパク質と相互作用するときに生じる2つの電極間の電流の変動を観察する工程;を含む、方法。
(23)タンパク質が、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアソーム、グリコペプチダーゼ、グリコシダーゼ、キナーゼおよびエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、上記(22)の方法。
(24)化学物質が、ヌクレオチド三リン酸、核酸、ペプチド、グリカンおよびキナーゼからなる群から選択される、上記(22)または(23)の方法。
(25)DNAの配列を決定する方法であって、
(a)プライムDNAテンプレートを上記(18)のシステムに導入する工程;
(b)4つのdNTPを含む溶液を導入する工程;
(c)2つの電極間に定常DC電流が観測されるように選択されたバイアスを印加する工程;
(d)新しいヌクレオチドそれぞれがプライマーに組み込まれたときに生じる2つの電極間の電流の変動を検出する工程;
(e)組み込まれている各ヌクレオチドのアイデンティティ(identity)を決定する工程;を含む方法。
(26)溶液が、互いにおおよそ同じ濃度である4つのdNTPを含む、上記(25)の方法。
(27)dNTPの濃度がテンプレートに結合するポリメラーゼの飽和濃度とおおよそ同じ濃度以上である、上記(25)または(26)の方法。
(28)工程(d)が、1つ以上の電流スパイクの存在を検出する工程を含む、上記(25)〜(27)のいずれかの方法。
(29)工程(e)が、各スパイクの特性を使用する工程を含む、上記(25)〜(27)のいずれかの方法。
(30)バイオポリマーの配列を決定する方法であって、
(a)上記(18)のシステムにバイオポリマーを導入する工程;
(b)2つの電極間に定常DC電流が観測されるように選択されたバイアスを印加する工程;
(c)モノマーがバイオポリマーの末端から除去されるときに生じる2つの電極間の電流の変動を検出する工程;
(d)バイオポリマーから除去された各モノマーのアイデンティティを決定する工程;を含む、方法。
(31)バイオポリマーが、DNA、ペプチド、またはグリカンである、上記(30)の方法。
(32)キナーゼの活性を検出する方法であって、
(a)キナーゼ阻害剤候補を上記(20)のシステムに導入する工程;
(b)2つの電極間に定常DC電流が観測されるように選択されたバイアスを印加する工程;
(c)キナーゼがキナーゼ阻害剤候補分子と相互作用するときに生じる2つの電極間の電流の変動を検出する工程;
(d)キナーゼ阻害剤候補分子の存在下でキナーゼが活性を有するか否かを決定する工程;を含む、方法。
(33)本明細書に記載される、バイオポリマーの配列を決定するアレイ。
(34)本明細書に記載される、DNAの配列を決定するアレイ。
(35)DNAの配列を決定するアレイであって、
(a)誘電体基材;
(b)誘電体基材上に配置された第1の電極;
(c)第1の電極上に配置された絶縁性誘電体層;
(d)絶縁性誘電体層上に配置された第2の電極;
(e)第2の電極上に配置されたパッシベーション層;
(f)第1の電極および第2の電極に付着したポリメラーゼ分子;を含み、
第1の電極、絶縁性誘電体層、第2の電極およびパッシベーション層には、それらを通過する開口が形成されている、アレイ。
(36)DNAの配列を決定するアレイであって、複数のデバイスの配置を含み、
デバイスは、
(a)誘電体基材;
(b)誘電体基材上に配置された第1の電極;
(c)誘電体基材上に配置された第2の電極;
(d)電極の上に配置されたパッシベーション層;
(e)一方または両方の電極に付着したポリメラーゼ分子;を含み、
パッシベーション層を通過する開口が形成されている、アレイ。
(37)DNAの配列を決定するアレイであって、複数のデバイスの配置を含み、
デバイスは、
(a)同一平面上にあり、ギャップによって離れている、第1の電極および第2の電極;
(b)少なくとも一方の電極に付着したポリメラーゼ;を含み、
第1の電極および第2の電極は分析対象試料と接触するように構成されている、アレイ。
(38)配置が格子状である、上記(33)〜(37)のいずれかのアレイ。
(39)ポリメラーゼ活性の直接測定用システムであって、
(a)本明細書に記載のアレイ;
(b)任意に、溶液をアレイに導入し除去する手段;
(c)第1の電極および第2の電極間にバイアスを印加する手段;
(d)第1の電極および第2の電極間に生成される電流をモニターする手段;を含む、アレイ。
(40)DNAの配列を決定する方法であって、
(a)本明細書に記載のシステムにDNAテンプレートを含む溶液を導入する工程;
(b)本明細書に記載のシステムにバイアスを印加するときに生成する第1の電流を測定する工程;
(c)DNAテンプレートに相補的なdNTPの組み込みを可能にする条件下において、dNTPを含む溶液をシステムに導入する工程;
(d)工程(c)において生成する第2の電流を測定する工程;
(e)組み込まれていないdNTPを含む溶液を除去する工程;
(f)工程(c)において使用されなかった残りの3つの種類のdNTPの各々を用いて工程(c)〜(e)を繰り返す工程;
(g)工程(c)〜(f)を繰り返す工程;を含み、
生成した電流シグナルからDNAの配列を決定する、方法。
(41)DNAの配列を決定する方法であって、
(a)本明細書に記載のシステムにDNAテンプレートを含む溶液を導入する工程;
(b)本明細書に記載のシステムにバイアスを印加するときに生成する第1の電流を測定する工程;
(c)DNAテンプレートに相補的なdNTPの組み込みを可能にする条件下において、少なくとも2種類のdNTPを含む溶液をシステムに導入する工程であって、各種類のdNTPが異なる濃度において溶液に存在している、工程;
(d)工程(b)において生成する第2の電流を測定する工程;
(e)組み込まれていないdNTPを含む溶液を除去する工程;
(f)工程(c)において使用されなかった残りの種類のdNTPの各々を用いて工程(c)〜(e)を繰り返す工程;
(g)工程(c)〜(f)を繰り返す工程;を含み、
生成した電流シグナルからDNAの配列を決定する、方法。
(42)工程(c)の溶液が4種類のdNTPを含む、上記(41)の方法。
(43)工程(c)の溶液が少なくとも2種類のdNTPを含む、上記(41)の方法。
〔定義〕
別段の定義がない同様、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。材料、方法および例は、例示にすぎず、限定を意図するものではない。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および他の文献は、その全体が参照により組み込まれる。
本明細書を通して、「含む(comprise)」という用語または「含む(comprises)」もしくは「含む(comprising)」などのバリエーションは一定の整数または整数の一群を含むが、他の整数または整数の一群を除外するものではないことを意味すると理解されるであろう。
「a」または「an」という用語は、1つ以上の項目を意味することがある。
「および(and)」および「または(or)」という用語は、接続詞または離接的接続詞のいずれかを指し、「および/または(and/or)」を意味することがある。
「約(about)」という用語は、規定値の±10%以内を意味する。例えば、「約100」は、90〜110の任意の数字を示す。
「ヌクレオチド」という用語は、塩基−糖−リン酸の組合せを示し、リボヌクレオシド三リン酸ATP、UTP、CTG、GTPおよびdATP、dCTP、dITP、dUTP、dTTPまたはそれらの誘導体などのデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む。
〔タンパク質活性の直接測定用であるデバイスおよびシステム〕
本開示は、タンパク質活性の直接測定用デバイスを提供する。一実施形態において、デバイスは、第1の電極および第2の電極と、一方または両方の電極に付着されたタンパク質と、を含む。第1の電極および第2の電極はギャップによって離れている。第1の電極および第2の電極には、それらを通過する開口が形成されている。
別の実施形態において、デバイスは、第1の電極および第2の電極と、一方または両方の電極に付着されたタンパク質と、を含む。第1の電極および第2の電極はギャップによって離れている。
いくつかの実施形態において、デバイスは、
(a)誘電体基材;
(b)誘電体基材上に配置された第1の電極;
(c)第1の電極上に配置された絶縁性誘電体層;
(d)絶縁性誘電体層上に配置された第2の電極;
(e)第2の電極上に配置されたパッシベーション層;
(f)一方または両方の電極に付着したタンパク質;を含む。
第1の電極、絶縁性誘電体層、第2の電極およびパッシベーション層には、それらを通過する開口が形成されている。
いくつかの実施形態において、デバイスは、
(a)誘電体基材;
(b)誘電体基材上に配置された第1の電極;
(c)絶縁性誘電体層上に配置された第2の電極;
(d)一方または両方の電極に付着したタンパク質;を含む。
パッシベーション層を通過する開口が形成されている。
いくつかの実施形態において、デバイスは、
(a)同一平面上にあり、ギャップによって離れており、第2の電極と共に平面内にある、第1の電極および第2の電極;
(b)少なくとも一方の電極に付着したタンパク質;を含む。
第1の電極および第2の電極は分析対象試料と接触するように構成されている。
電極が平面にある実施形態において、有利にはデバイスは誘電体層を必要としない。誘電体層を必要とするデバイスは、欠点を有する可能性がある。誘電体層は、電極に接着するために接着層を必要とする。これらの接着層は空気に曝されると酸化され、実際には、電極間のギャップのサイズを増大させる。この影響を補償するために、誘電体層をより薄くし得る。しかしながら、誘電体層が薄いとピンホールの影響を受け易く、当該影響を除去することは困難である。
本明細書中に記載されるデバイスの実施形態の各々において、タンパク質は、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアソーム、グリコペプチダーゼ、グリコシダーゼ、キナーゼおよびエンドヌクレアーゼからなる群から選択される。
タンパク質は、一方の電極に直接または間接的に付着し得る。いくつかの実施形態において、リンカーを介してタンパク質は電極に付着する。いくつかの実施形態において、電極に付着したリガンドとの相互作用を介して、タンパク質は間接的に電極に付着する。いくつかの実施形態において、タンパク質がリガンド結合部位を組み込むように改変される。
一実施形態において、デバイスは第1の電極および第2の電極と、一方または両方の電極に付着したポリメラーゼと、を含む。第1の電極および第2の電極はギャップによって離れている。第1の電極および第2の電極には、それらを通過する開口が形成されている。
いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは一方の電極に付着している。本実施形態のいくつかの態様において、リンカーを介してポリメラーゼは電極に付着している。いくつかの態様において、ポリメラーゼはビオチン化ポリメラーゼである。いくつかの態様において、ポリメラーゼはビオチン化ポリメラーゼであり、ストレプトアビジンを介して電極に付着している。
本明細書に記載のデバイスの実施形態のそれぞれにおいて、第1の電極および/または第2の電極は、金、白金、パラジウム、およびルテニウムからなる群から選択される金属を含む。いくつかの実施形態において、金属はパラジウムである。
いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約1.0nm〜約20.0nmである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約1.0nm〜約10.0nmである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約1.0nm〜約7.5nmである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約1.0nm〜約5.0nmである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約4.0nm〜約5.0nmである。
いくつかの実施形態において、デバイスは、単一の分子を検出するために使用され得る。
本開示はまた、タンパク質活性の直接測定用システムを提供する。本システムは、本明細書に記載のデバイスと、タンパク質と相互作用することができる化学物質を導入する手段と、第1の電極と第2の電極との間にバイアスを印加する手段と、化学物質がタンパク質と相互作用するときに第1の電極と第2の電極との間に生成する電流をモニターする手段と、を含む。
本明細書に記載のシステムの実施形態の各々において、タンパク質は、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアソーム、グリコペプチダーゼ、グリコシダーゼ、キナーゼおよびエンドヌクレアーゼからなる群から選択される。一実施形態において、タンパク質はポリメラーゼである。
タンパク質がポリメラーゼであるとき、ポリメラーゼは、一方の電極(好ましくは、両方の電極)に付着している。本実施形態のいくつかの態様において、1つ以上のリンカーを介して、ポリメラーゼは電極に付着している。いくつかの態様において、ポリメラーゼはビオチン化ポリメラーゼである。いくつかの態様において、ポリメラーゼはビオチン化ポリメラーゼであり、ストレプトアビジンを介して電極に付着している。
本明細書に記載のシステムの実施形態の各々において、第1の電極および/または第2の電極は、金、白金、パラジウム、およびルテニウムからなる群から選択される金属を含む。いくつかの実施形態において、金属はパラジウムである。
いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約1.0nm〜約20.0nmである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約1.0nm〜約10.0nmである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約1.0nm〜約7.5nmである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約1.0nm〜約5.0nmである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約4.0nm〜約5.0nmである。
図4は、本開示の一実施形態によるシステムの概略図を示す。タンパク質分子51は、特定の部位53および54で共有結合的に修飾されている。このような部位は、マレイミドとの反応によって修飾された表面システイン残基、NHSエステルによって、または、ニトリロトリ酢酸に結合するためのタンパク質のN末端もしくはC末端へのヒスチジンタグの挿入によって、または、タンパク質のビオチン化および電極に付着するチオール化ストレプトアビジン分子を介した結合によって修飾された表面リジン残基であり得る。本技術分野で周知のように、MycタグまたはGSTタグなどの他の結合手段も使用し得る。本実施形態の重要でありユニークな設計態様は、タンパク質自体が検出器として利用され、その目的のために、強力で永久的な化学的拘束(chemical tether)を使用してタンパク質を電極に付着させる。修飾部位は、可撓性リンカーに結合している。当該リンカーは、短い(1〜10反復)アルカンオリゴマーまたはポリエチレングリコールオリゴマーまたはタンパク質に組換え的に組み込まれる短いペプチド鎖であり得る。次に、これらは、リンカー分子を金属電極57および58に繋ぐ反応性基56によって終結される。種々の結合が可能であるが、チオール結合が好ましく、ビオチン−ストレプトアビジン結合が可能であるように、アミンも使用され得る。バイアス59が2つの電極間に印加され、電極間を通過する電流をモニター60する。本システムを、酵素機能に必要なイオンを含む緩衝液に浸漬し、化学物質61(酵素の基質および/または薬物など)の導入による影響を記録する。
本開示の基礎は、上記のようにタンパク質が2つの電極に強く繋がれているときに、大きなギャップ(約4.5nm)におけるタンパク質の挙動について、著しく予想外であって非常に最新の観察にある。テレグラフノイズシグナルの開始について以前に報告した臨界バイアス電圧未満で、単純な直線(抵抗)応答を見出した。これは、タンパク質が、電子輸送モードがトンネリングのみであるべき分子固体であると考えられるため、全く予想外である。しかしながら、トンネリングは、タンパク質が図4で説明した態様で繋がっているときに観察される直線電流−電圧を有する大きな電流を説明することができない。単一のタンパク質分子について測定した典型的な電流−電圧曲線の一例を図5に示す。以前に報告されたように約±100mV超で大きなノイズ変動が観測されるが、±100mV未満(図5Aにおいて71と標識された囲み領域)ではこの大きな(4.5nm)距離にわたってさえ、タンパク質に対して著しく高いDCコンダクタンスを意味する直線領域が存在する。この直線領域がフィットされ、得られたフィットコンダクタンス(fitted conductance)の分布が得られると、コンダクタンス分布は図5Bに示されるような指数分布によってフィットし得る(実線はフィットを示す)。この場合、平均コンダクタンスKは、1.5nSの値を有することに留意されたい。
多くの測定値の収集によって、図13に示すように、コンダクタンスのより複雑な分布を明らかにする。この図は、様々な手段によって電極に結合された一連のタンパク質について、所与のコンダクタンスの周波数対コンダクタンスのヒストグラムをプロットする。コンダクタンスのスケールは対数(ベース10)で、線で示されるようにフィットするピークはガウス分布であるため、これらのコンダクタンスは対数正規分布に従って分布する。(分布を明確にするために、垂直方向に任意に分布を移動させている。)特定のタンパク質に対する特定のリガンドに結合することによって、または、ストレプトアビジンの場合はチオール結合によって、タンパク質が電極に繋がる。リガンドは、チオール(システイン)結合を介して電極に化学的に付着させた。種々のタンパク質、それらのリガンド、タンパク質−リガンド複合体の解離定数、特異的結合を検証するために使用した対照(コントロール)、および分布をフィットすることによって得られるコンダクタンスのピーク値を表1に列挙する。
Figure 2021524281
電極を列挙した対照分子に曝露したときにコンダクタンスは観察されなかった。このことは、電子コンダクタンスを観察するためには、電極へのタンパク質の特定の化学的拘束が必要であることを示した。
3つの抗体の場合、2つの結合部位が利用可能であり、2つの結合ドメインの各1つずつ、13nm離れている。結果として、第2の、より高いコンダクタンスピークが、これらの3つの分子の分布において観察される。これにより、これらの分子について表1に列挙した第2のピークコンダクタンスが得られる。その結果、タンパク質が両方の電極に化学的に繋がっていれば、長い距離(13nm)にわたって高いコンダクタンスを得ることができる。
約100mVの電圧駆動変動の開始についてのこの閾値は、今日までに研究された多くのタンパク質について見出されている。したがって、自然的な変動の開始についてのこの閾値未満(すなわち、VCが約100mVである、図4におけるV<VC)の接合部を操作することによって、DC電流は、タンパク質がその静止状態で捕捉されていることを示すように作用する。このシグナルは非常に大きく、ここに示した一例では50mVのバイアスにおいて平均75pAであり、タンパク質が電極ギャップを架橋するように化学的に繋がれている場合には実質的にさらに大きい。
タンパク質の変動は、電子輸送用のさらなるチャネルを開く。したがって、タンパク質がVC未満にバイアスされるが、基質分子を導入することによって刺激される場合、大きな電流変動が生じ得る。タンパク質変動によって誘導される電流シグナルの一例を図6に示す。図2Cと比較すると、ノイズ81に対するシグナル82が大きく改善されていることに留意されたい。誘導されたタンパク質変動のさらなる一例を図12に示す。この図は、電極表面に結合したチオール化ストレプトアビジン分子に結合するビオチン化N末端を介してパラジウム電極に結合したphi29ポリメラーゼの単分子層の上に、3.5または4.5nmの一定の高さに保持されたSTMプローブによって収集されたデータを示す。パネルA、BおよびCは、ポリメラーゼとの接触点の変動の結果として生じる電流の変動を示す。時間の経過と共に(右の挿入図)、電流の大きな変化につながり得るが、バイアスがVC未満である場合にはms−タイムスケールのテレグラフノイズが観察されない。左側の拡大した電流−時間トレースは、ピーク電流領域から得られる(右側に挿入した長時間スケールプロット上に赤色丸で囲まれている)。一本鎖プライムDNAテンプレートおよびdNTPを添加すると、パネルD、EおよびFに示すように、ms−タイムスケールのテレグラフノイズが誘発される。
図12に示すシグナルは、ポリメラーゼについての単一の化学的付着点を用いて得られた。結果として、第2の電極への連結は図12A、BおよびCの電流変動によって示されるように、非常に可変である。単一の化学的接触の別の重要な欠点は、タンパク質と第2の電極との間の物理的接触の不十分な性能である。これを図14に示す。この図は、電極ギャップがマークされたギャップ値について1nmずつ増加するときに、ストレプトアビジン単層(左側)にわたって、および、ビオチン化phi29ポリメラーゼ結合後の同じ単層(右側)にわたって測定されたコンダクタンス分布を示す(分布を明確にするために、垂直方向に任意に分布を移動させている。)。ストレプトアビジンの場合、3.5nmのギャップ距離で記録される曲線は非常に少ない。phi29がストレプトアビジンに結合している場合、曲線は4.5nmまで記録される(5.5nmでの数回の記録を伴う−図示せず)。しかしながら、この長さは、約9nmのポリメラーゼ−ストレプトアビジン複合体の全高よりも実質的に短い(挿入図に示す)。この結果は、2つの結合ドメインが分かれている13nmの経路にわたって高いコンダクタンスが得られた、図13に示す抗体データとは明らかに対照的である。この結果は、2つの化学的に明確な接触点を、対である各電極に1つずつ形成することが望ましいことを示している。
〔本開示のデバイスの製造方法〕
本開示のデバイスは、Au、Pt、またはPdなどの貴金属元素の層を、ケイ素、ガラス、またはサファイアウェハ(または他の誘電体基材)上に堆積させ、次いで、接着用である反応性金属(クロムまたはチタンなど)の薄層(典型的には1nm)を堆積させ、次いで、貴金属元素の1〜10nm、または1〜20nm、または1〜50nmの層を堆積させることによって容易に製造することができる。この下部電極は絶縁性誘電体層、好ましくはアルミナで覆われているが、SiOまたは酸化ハフニウムなどの他の酸化物を使用してもよい。この層の厚さは2〜10nmであるべきである。貴金属元素の底部電極を1〜1.5nmのアルミニウムで被覆し、それを大気中で酸化させることによって、厚さが2〜3nmであるAl層が形成し、2nmの層を堆積させることができる。さらに厚い誘電体が必要とされる場合、本技術分野で周知のように、水/トリメチルアルミニウムサイクルを用いた原子層堆積によって、さらなるAlを加えることができる。
次に、再度薄い接着層(クロムまたはチタン)を使用して第2の貴金属電極を堆積させるが、この接着層が酸化するデバイスのエッジに存在するギャップを著しく変化させないように、最大でも接着層は1nmである。
最後に、上部電極の上にパッシベーション層を配置する。この層は、アルミナ、SiO、酸化ハフニウム、またはPMMAもしくはSU8などのレジスト物質であり得る。
露出電極(exposed electrode)の領域が1つのポリメラーゼのみが付着するようなものであることを確実にするのに十分に小さいキャビティを作製するために、次いで、本技術分野で周知である反応性イオンエッチング(RIE)を使用して、小さい開口が作製される。この開口の直径は10〜500nmであってもよく、約50nmが好ましい。開口の深さは、パッシベーション層、上部電極、電極を分離する誘電体層、および下部電極を通り抜けるように十分に大きくすべきである。
露出電極の領域の量を制限する第2の方法は、電極のうちの1つ(上部電極または下部電極、上部電極が好ましい)を幅50〜100nmの細いワイヤにすることである。そして、露出電極が電極の小さな幅によって制限されるため、RIE開口ははるかに大きくすることができる(例えば、従来のリソグラフィを可能にするミクロンサイズ)。
第3の方法は、接合部がポリメラーゼ分子に曝露される時間および/またはポリメラーゼの濃度を制御することによって、化学的機能化(functionalization chemistry)を制御することである。印加バイアスが100mV超のとき、接触変動によって誘導されるテレグラフノイズをモニターすることによって各接合部のローディングを評価することができる。2つのシグナルレベルの存在は、単一の分子のみが捕捉されていることを示す。3つのレベルの存在は2つの分子が捕捉されていることを示し、以下同様である。このようにして、濃度および曝露時間は、部位の約30%が単独で占有される理想的なポアソンローディングに調整することができる。
酸素プラズマで洗浄した後、開口内の電極の露出領域をタンパク質で官能基化してもよい。これは、タンパク質の表面上の天然チオールを使用するかもしくはスルフヒドリル基をタンパク質に結合させる化学修飾を介することによって直接的な官能基化、または、チオール化ストレプトアビジンを結合させ次いでビオチン化タンパク質を捕捉することによる間接的な官能基化のいずれかであり得る。
デバイスを作るための第2のアプローチは、2つの電極の間に小さなギャップを有するように同一平面内に当該2つの電極を形成することである。この形成は、本技術分野で周知である、電子ビームリソグラフィーおよびリフトオフまたは反応性イオンエッチング(RIE)を使用して、単一ワイヤにわたってトレンチを開くことによって行うことができる。他のアプローチは、ヘリウムイオンミリング、すなわち、ギャップが自然に形成されるようにステップエッジにわたる金属の斜め堆積(angled deposition)を使用することである。次いで、電極対は電極ギャップが露出するように、パッシベーション層およびRIEによって形成された開口で覆われる。次いで、電極は、上記のように機能化され得る。
露出電極の幅は重要である。なぜなら、本明細書に記載のデバイスは一般に、ただ1つの分子に連結することに依存するからである。配列情報を抽出する場合、単一分子シグナルのこの要件は特に重要である。電極が単一の分子(5〜15nm)よりもあまり広くない場合、ギャップにわたる複数の分子の付着は不可能である。しかしながら、このような小さな電極の信頼性のある機能化および製造は非常に困難である。実際には、100nmまでの幅の電極が2つ以上のタンパク質分子を捕捉する可能性が低いことを本発明者らは見出した。特に、所望の(架橋)構成における結合の確率が低い場合、200nm、300nm、400nm、500nmの幅、または1000nmでさえの幅である幅広い電極を有することがさらに望ましい場合がある。一対の電極を架橋するのではなく、ただ一つの電極に結合したタンパク質分子は、比較的少量の電流を供給する。
〔ポリメラーゼの電極への付着方法〕
タンパク質がポリメラーゼであるとき、phi29ポリメラーゼなどの、連続反応性が高いポリメラーゼであるべきである。当該ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ機能は以下に述べるように不能であるべきである。
野生型(WT)ポリメラーゼは、(a)当該ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を消失し、(b)所望であれば化学的結合点(付着点)を付加するために改変を必要とする。本改変は、大腸菌(E.Coli)発現系を使用する組換えDNAによって改変ポリメラーゼを産生することによって達成される。
phi29のエキソヌクレアーゼ活性は、次の酸性アミノ酸を必要とする:D12、E14、D66およびD169。これらのいずれかを変異させると、エキソヌクレアーゼ活性が消失し、D12およびE14をアラニンに変異させた。
使用したクローンは、N末端に、hisタグとaviタグ(ビオチン化用)の両方を有する(すなわち、His−Aviタグ−Phi29)。その結果、以下の配列が酵素のN末端に付加された:MGSSHHHHHHSSGLVPRGSGLNDIFEAQKIEWHEGASS。
6つのヒスチジン残基がhisタグであり(所望の酵素製品の精製に使用される)、GLNDIFEAQKIEWHEはAviタグである。ビオチンは、ビオチンリガーゼBirA(Avidit, Lansing, MI)によってAviタグのKに結合している。活性アッセイは、ストレプトアビジンに結合したビオチン化酵素が依然として活性を有することを示す(図8B)。
本開示の別の有用であり予想外の特徴は、ストレプトアビジンおよびポリメラーゼの両方が導電性タンパク質であるため、以下に示すように、ポリメラーゼを電極に間接的に付着させることができることである。最初に、チオールで修飾されたストレプトアビジンを電極に結合させ、次いでビオチン化ポリメラーゼを導入する。このことによって、ストレプトアビジンに結合し、電極への伝導経路を提供する。
また、同じ組換え方法によってポリメラーゼのC末端が修飾され得る。aviタグに加えて、GSTタグ、MycタグおよびHisタグなどの他のペプチドをベースとした結合タグを使用し得る。これらのタグはすべて、ポリメラーゼのN末端またはC末端のいずれかに組み込まれ得る。C末端における組み込みは、プライムテンプレートが捕捉される部位の近くのタグ部位を配置するので、オリゴアラニンまたはグリシン−グリシン−セリンのスペーサー配列はC末端とタグとの間に組み込まれて、ポリメラーゼのテンプレート捕捉活性との干渉を減少させる。
同じ技術を使用して、本開示の方法を使用して活性をモニターすべき他のタンパク質(例えば、キナーゼ、プロテアーゼ、またはグリカンを処理する分子など)を付着させてもよい。
N末端またはC末端における修飾に加え、phi29には7つのシステインがある。ジスルフィド結合はないので、すべてのシステインがジスルフィド結合を形成する可能性を有し、電極への付着のためのさらなる部位を提供する。テンプレートおよびプライマーC448を有するphi29の構造に基づいて、C106およびC22は、最も表面に露出しており、マレイミドによるビオチン化またはスルフヒドリル基に結合する重金属への直接結合のいずれかのための良好な候補のように思われる。問題は特異性をどのように制御するかである。1つのシステイン以外のすべてのシステインを一度に変異させようとしたが、得られたタンパク質は不溶性タンパク質であった。しかしながら、4つまでは溶解度に影響を及ぼすことなく除去することができ、C448、C106およびC22を付着点の標的として残す。
本開示は一方の電極へのただ1つの化学的付着部位で機能し、第2の接触はタンパク質と金属との物理的接触によって行われるが、2つの電極間のギャップにわたる態様で2つの化学的に明確な接触を行うことが望ましい。C末端はN末端から約5nm離れており、aviタグによるビオチン化を用いると、同じポリメラーゼのN末端とC末端の両方による同じストレプトアビジン分子への付着はあり得ない。したがって、チオ−ストレプトアビジンで機能化された両方の電極を用いて、N末端が一方の電極に連結され、C末端が第2の電極に連結される構造を形成するための架橋の機会が存在する。
別のアプローチは広く離間しているが、タンパク質の不活性領域にある2つの付着点を使用することである。D12とE14の変異によってエキソヌクレアーゼドメインが不能となったphi29ポリメラーゼの場合には、G111とK112の間、およびE279とD280の間が5nm超離れた、エキソヌクレアーゼドメインの2つの点が認められる。したがって、Aviタグ配列であるGLNDIFEAQKIEWHEをこれらの2点に挿入し、BirAによってビオチン化されたAviタグのリジンを用いて、図15に示すように、ポリメラーゼを一対の電極に結合させることができる。この図は、G111とK112の間およびE279とD280の間(1502と1503)に設定されたAviタグを用いてビオチン化されたphi29ポリメラーゼ1501を示す。硫黄結合1506および1507を介して電極1508および1509に接着するチオール化ストレプトアビジン分子1504および1505に、これらのビオチンが結合する。これらの付着点(図15の両方向矢印)間のギャップは5nmを少し超えるので、この付着点の形状(geometry)は5nmを少し満たないギャップ1510を必要とする。
ポリメラーゼに「導電性ウィスカー」を付加することによって、ポリメラーゼと電極との間に決定的な接触(deterministic contact)を作る。
N末端に次の配列を組換え的に付加する:CGSSHHHHHHSSFTLIELLIVVAIIGILAAIAIPQFSAYRVKAYNSAASSDRLNLKTALESAFADDQTYPPESGLVPRGSGASS−f29
末端のCは、第1の電極に接着するためのシステインである。
hisタグは、タンパク質抽出および精製のためである。
SSに続く61個のアミノ酸配列は、金属ワイヤとして作用する、ジオバクター・スルフェリダクタンス(geobacter sulferreductans)由来の線毛タンパク質の配列である。
C末端に次の配列を組換え的に付加する:f29−AAFTLIELLIVVAIIGILAAIAIPQFSAYRVKAYNSAASSDRLNLKTALESAFADDQTYPPESC
AAに続く61個のアミノ酸配列は、ジオバクター・スルフェリダクタンス由来の線毛タンパク質の配列である。
末端のCは、第1の電極に接着するためのシステインである。
〔複合体の導電性〕
本開示の重要なポイントは、ポリメラーゼを介して良好な電子コンダクタンスを得ることができることである。図9は、チオール結合を介して基質に連結したストレプトアビジンによるコンダクタンスの分布を示す(左パネル)。これらのデータは、2.5nmの電極ギャップで得られた。ギャップを3.5nmに増加させた場合、読み取りはほとんど起こらない。ギャップをさらに4.5nmに増加させると、全く読み取りが得られない。この結果は、表面上に平坦に存在するストレプトアビジン分子の高さが約4nmであるという事実と一致する。図9の右側は、Pd電極上のストレプトアビジンとビオチン化phi29ポリメラーゼとの複合体についてのデータを示す。これらのデータは、3.5nmのギャップサイズで得られた。複合体について4.5nmのギャップサイズで同様のデータを記録した(ストレプトアビジンについてコンダクタンスが記録されなかったギャップ)。これらの距離はストレプトアビジン単独が強固なシグナルを与えるギャップよりも大きいので、これらの結果はストレプトアビジンと直列に配線されたポリメラーゼを介して伝導が起こっていることを示す。コンダクタンスの分布がストレプトアビジン単独と比較して複合体においてどのように変化するかに注目されたい。
〔コンフォメーションによる伝導率の変化〕
図10は、ストレプトアビジン単独(左パネル)およびビオチンへの曝露後のストレプトアビジンについての、測定したコンダクタンス分布を示す。ストレプトアビジンがビオチンに結合した後に測定されたコンダクタンスの分布が変化した。この結果は、タンパク質のコンダクタンスがタンパク質のコンフォメーション変化に感受性があることを示している。
〔タンパク質コンフォメーションの動的モニタリング〕
図11は、4.5nmのギャップを用いて、走査型トンネリング顕微鏡で記録した電圧誘起コンフォメーション変動(左側のパネル)と、固体チップで記録した電圧誘起コンフォメーション変動(右側のパネル)の記録を示す。バイアスはVCより高い、200mV、100mVであった。タンパク質は、電極に接着した抗ジニトロフェノール分子結合ジニトロフェノール(DNP)である。ミリ秒タイムスケールでの非常に大きなコンダクタンスの変化は、優れたシグナル対ノイズ比で容易に記録される。図12D、EおよびFはバイアスがVC未満に低下し(この場合50mVまで)、基質の添加によってタンパク質が活性化されたときに生じる電流の変動を示す。テレグラフノイズは、シグナル対ノイズ比が非常に高いmsタイムスケールで発生する。
〔デバイスおよびシステムの使用方法〕
本開示は、バイオポリマーの配列を決定する方法を提供する。図7は、ポリメラーゼによって伸長される核酸鎖の特定の場合について説明する。図7では、ポリメラーゼ96が2つの点53、52において修飾されている。特定の一例は、phi29ポリメラーゼにおいて利用可能な2つの表面露出システインである。別の一例は、図15に示すビオチン官能基化である。マレイミド修飾アルカンまたはPEGリンカー54、55は、強力なチオール結合(例えば)56を介して電極57、58にポリメラーゼを結合させるために使用される。電極ギャップにおけるポリメラーゼの結合は、V<VC(59)のときに定常DC電流60によって確認される。ポリメラーゼ96がプライムテンプレート91と複合体を形成し、4つのヌクレオチド三リン酸92、93、94、95の各々を含む溶液に曝露されるとき、特徴的な電流変動は、所与のヌクレオチドの取り込みをシグナル伝達する。代替の実施形態において、表面システインを使用して、直接接着の1つを作製し得る。
使用に際しては、デバイスを調製したら、当該デバイスをすすいで、配列決定対象のプライムテンプレートDNAに曝露すべきである。本技術分野で周知である、ヘアピンプライマーを連結することによって、配列決定対象の試料からこのDNAを調製する。4つのdNTPおよびMg2+を含む緩衝液をデバイスに導入すべきである。dNTPは、緩衝液中においておおよそ等しい濃度で存在する。一実施形態において、dNTPの濃度が、第2の実施形態のテンプレート結合ポリメラーゼの飽和濃度においてテンプレート結合ポリメラーゼの飽和濃度にほぼ等しく、第3の実施形態の飽和濃度より高い。dNTPの濃度が飽和濃度以上であるとき、ポリメラーゼは素早く作動する(すなわち、毎秒100ヌクレオチドの取り込み)。
dNTPを含む緩衝液がデバイスに導入されると、重合反応が開始され、捕捉されたテンプレートがプライマーにコピーされ、一連の電流スパイクが生成する。各新しいヌクレオチドがプライマーに組み込まれるときに各スパイク(またはスパイクのクラスター)が生じ、各スパイクの特性(持続時間、振幅、形状)は組み込まれているヌクレオチドのアイデンティティを解読するために使用される。ヌクレオチドの飽和濃度(>30μM)における典型的な配列決定速度は、約100ヌクレオチド/秒である。テンプレートの飽和濃度は約10nMであり、新しいテンプレートは、前のテンプレートの完了のほぼ直後に組み込まれる。各分子は溶液中に利用可能なテンプレートが存在する限り、テンプレートを引き継ぎ続ける。したがって、デバイスが操作される限り、1つの分子は連続的に配列決定され得る。
デバイス形状はそれぞれの接合部に対して、離れている流体区画を有する必要がなく、極めて簡便である。したがって、1つの接合部は約1マイクロしか占有しない。相互接続、絶縁、およびオンチップ処理エレクトロニクスを可能にすると、単一の読み取りデバイスを100ミクロン×100ミクロンの領域に容易にフィットさせることができる。したがって、1cmの活性チップ領域は、10,000個のデバイスを収容することになる。1時間操作されるチップ上に10,000個の接合部を有するチップは、ヒトゲノム全体を配列決定する(10,000×3600×100=3.6×10)。より高密度であるデバイス形状またはより大きなチップはかなりの画分の不活性デバイスでさえも収容し、1時間以下の時間で1つの小さなデバイス上でのゲノムスケールの配列決定を依然として可能にする。
上記の例は核酸ポリマーの配列決定を例示するが、ポリマーを処理する他の酵素が使用され得るように適用することもできる。例えば、エキソヌクレアーゼにおける電流変動は、それらが分解している核酸の組成を反映する。ペプチドを消化するプロテアソームについても同様である。一例はプロテアソーム20S CPであり、図4のシステムに組み込まれ、ペプチド分子を供給し、低VCにバイアスされたときに生成される電気シグナルをモニターすることによって、単一分子ペプチド配列決定に当該プロテアソームを使用し得る。
グリコシダーゼと呼ばれる類似の酵素が、グリカンを消化するために存在する。図4のデバイスへのグリコシダーゼの組み込みは、グリカンの電子配列決定を可能にする。グリカンの結合のバリエーションは配列の直接的な直線読み出しの妨げとなり得るが、時間内の切断事象の組織化はグリカンの同定を可能にし得る。
さらに別の実施形態において、本開示は、キナーゼ活性を検出する方法を提供する。本実施形態において、キナーゼは、図4のデバイスに組み込まれ、その基板に曝露され、VC未満にバイアスされたときにキナーゼ活性は大きな電流変動の生成によってシグナル伝達される。その後、本システムは、変動がモニターされるときにキナーゼ阻害薬候補に曝露され、どの薬物がキナーゼの活性を「不活化させる(kill)」かを発見することができるのであろう。本技術分野において、蛍光標識方法の使用はタンパク質酵素とその基質の相互作用を阻害し、本開示はタンパク質の標識の必要性を除去する。
これらのすべての方法において、(FET構成とは対照的に)簡便な接合部を使用することにより、両方の製造が大幅に単純化され、デバイスの大規模な並列アレイへのスケールアップが可能になる。本開示のデバイスは以下に記載されるように、接合デバイスの大規模に実現可能な製造方法を使用して、大規模な並列製造において調製されてもよい。
〔DNAまたは他のポリマーの配列を決定するアレイおよびシステム〕
本開示は、ヌクレアーゼ、プロテアソーム、グリコペプチダーゼ、グリコシダーゼ、キナーゼおよびエンドヌクレアーゼなどの分子テンプレートと連続的に相互作用する酵素のいずれかを用いて、バイオポリマーの配列を決定するアレイを提供する。以下の実施形態は、ポリメラーゼを使用してDNAの配列を決定するアレイを例示する。アレイ中のポリメラーゼの代わりに、任意のプロセッシブ酵素を用いることができることを理解されたい。
アレイは、複数のデバイスの配置を含む。本開示のアレイに使用されるデバイスは以下を含む。
一実施形態において、デバイスは第1の電極および第2の電極を含み、第1の電極および第2の電極はギャップによって離れている。デバイスはさらに、一方または両方の電極に付着したポリメラーゼを含む。第1の電極および第2の電極には、それらを通過する開口が形成されている。
別の実施形態において、デバイスは第1の電極および第2の電極を含み、第1の電極および第2の電極はギャップによって離れている。デバイスはさらに、第1の電極および第2の電極の両方に付着したポリメラーゼを含む。
いくつかの実施形態において、デバイスは、(a)誘電体基材;(b)誘電体基材上に配置された第1の電極;(c)第1の電極上に配置された絶縁性誘電体層;(d)絶縁性誘電体層上に配置された第2の電極;(e)第2の電極上に配置されたパッシベーション層;(f)第1の電極および第2の電極に付着したタンパク質;を含む。第1の電極、絶縁性誘電体層、第2の電極およびパッシベーション層には、それらを通過する開口が形成されている。
いくつかの実施形態において、デバイスは、(a)誘電体基材;(b)誘電体基材上に配置された第1の電極;(c)誘電体基材上に配置された第2の電極;(d)電極の上に配置されたパッシベーション層;(e)一方または両方の電極に付着したポリメラーゼ分子;を含み、パッシベーション層を通過する開口が形成されている。
いくつかの実施形態において、デバイスは、(a)同一平面上にあり、ギャップによって離れている、第1の電極および第2の電極;(b)少なくとも一方の電極に付着したタンパク質;を含み、第1の電極および第2の電極は分析対象試料と接触するように構成されている。
本明細書に記載のデバイスの実施形態のそれぞれにおいて、第1の電極および/または第2の電極は、金、白金、パラジウム、およびルテニウムからなる群から選択される金属を含む。いくつかの実施形態において、金属はパラジウムである。
いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約1.0nm〜約20.0nmである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約1.0nm〜約10.0nmである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約1.0nm〜約7.5nmである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約1.0nm〜約5.0nmである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約4.0nm〜約5.0nmである。
デバイスのアレイは任意の適切な様式(例えば、格子状)に配置され得る。
いくつかの実施形態において、アレイは、テンプレートDNAと結合したポリメラーゼ分子を含む。このようなテンプレートは、本技術分野で周知である、ゲノムDNA断片(例えば、超音波処理によって生成される)とポリメラーゼによる結合用のニックを含むプライマー配列とを連結することによって作製することができる。結果は必要であれば、全ゲノムにわたるテンプレートのライブラリーである。次いで、各テンプレートは、アレイ中の1つのポリメラーゼにランダムに結合する。
次に、図16を参照すると、格子の接触点101、102が、本技術分野で周知である、誘電体によって離れている2層の接触金属から形成され、パッシベーション層によって覆われる。次に、パッシベーションを選択的に除去することによって各交差部を露出させ、ポリメラーゼ分子103が各接合部に結合する。これらの生体分子接合は、前述のセクションで論じた方法によって調製することができる。電極を十分に狭くする(約1ミクロンの幅)ことによって、通常、1つのポリメラーゼのみ(または全く)が結合する。2つまたは少数が結合する場合、シグナルは依然としてデコンボリューションすることができる。
本開示はまた、ポリメラーゼ活性の直接測定用のアレイのシステムを提供する。本システムは、本明細書に記載のアレイ;任意に、溶液をアレイに導入し除去する手段;第1の電極および第2の電極間にバイアスを印加する手段;第1の電極および第2の電極間に生成される電流をモニターする手段;を含む。
再び図16を参照すると、手段106は、小さなバイアス(典型的には50mV)を印加し、それぞれの接合部から電流を読み取って、コンピュータストレージシステムによって記録するために設けられている。
〔アレイのシステムを用いたDNAの配列を決定する方法〕
本開示はまた、本明細書に記載のアレイのシステムを使用する、DNA配列を決定する方法を提供する。
配列決定は、1つのヌクレオチド一リン酸(例えば、dATP、dGTP、dCTP、dTTPのうちの1つ)を含む溶液をマグネシウムと共にアレイに導入することによって進行する。相補的ヌクレオチドと結合した各ポリメラーゼはシグナルを生成し、シグナルは、各ポリメラーゼが結合したユニークな電極対によって読み取られる。例えば、付加したヌクレオチドがdCTPである場合、G塩基に結合したすべてのテンプレートは伸長鎖にCを組み込み、シグナルを生成する。一方、他の配列は、明確に異なるシグナルを生成する。例えば、ミスマッチ塩基が捕捉されるときは、非マッチ塩基を有するポリメラーゼは短いバーストのシグナルを生成する。しかしながら、ミスマッチが拒絶され、重合および転位のプロセスが中止するときは、シグナル列は早期に終結する。対照的に、組み込みおよび転位のプロセスが完了するときは、一致する塩基の組み込みは、はるかに長いパルス列を生じる。第2の工程として、アレイをすすいで過剰のヌクレオチドを除去し、次のヌクレオチドを含む溶液を導入する(例えば、dATP、その結果、Tを有するすべての部位がシグナルを生成する)。このサイクルは、すべての4つのdNTPがデバイスを通って循環するまで続き、その後このサイクルが繰り返される。このサイクルはすべてのテンプレートDNAが使い果たされるまで繰り返すことができ、断片のライブラリー全体についての配列データが生成される。
図17は、DNAの配列を決定する方法を示す。アレイ201にdATPを添加すると、Aが伸長鎖に組み込まれるときに、図示される分子はシグナル204を生成する。次にアレイをすすいでdATP202を除去し、次のヌクレオチド(ここではdTTPとして示す)を添加する(203)。図示のようにサイクルは継続する。dATP、次いでdCTP、次いでdATPの付加はすべて、塩基取り込みのシグナル204を与える一方、他のヌクレオチドの存在はない205。したがって、その特定の位置におけるシーケンスは、TGTとして記録される。
本アプローチが、dNTPの循環(cycling)を使用する現在の配列決定ストラテジーに対して2つの主要な利点を有することが、認識される。1つ目は、ポリメラーゼの塩基取り込み速度よりも速いタイムスケールで単一の分子読み取りを利用することによって、同じ塩基の反復を計数することが容易になることである。したがって、配列AAAAAは、dTTPの存在下において5つの別個のバーストのシグナルを与え、以下同様である。2つ目は、既知の光学読み出し方式とは対照的に、読み出されるテンプレートの長さが実装基板からの距離によって制約されないので、潜在的な読み出しの長さはポリメラーゼの処理性(phi29の場合は10kB)と同程度に高い。
図18は、個々の連続的な取り込みを読み取る能力、したがって、配列のホモポリマーランを読み取る能力を示す。電流対時間記録300は、2つの連続する塩基の組み込みを示す(ここで、電気データは2つの連続するA部位に組み込まれているdTTPについて示す)。各シグナルは約20msの持続時間のテレグラフノイズのバースト301からなり、バースト間のギャップによって離れており、ヌクレオチド三リン酸のマイクロモル濃度で平均約10〜20msである。したがって、図17に示す化学循環の任意の所与の工程において、ただ1つのヌクレオチド三リン酸が存在する場合、テンプレート鎖におけるその相補体の反復塩基の数は単に、このようなテレグラフノイズのバーストの数を記録することによってカウントされ得る。
別の実施形態において、溶液は2つ以上のdNTPを含み、dNTPは異なる濃度で存在する。例えば、溶液は、1mMのdATP、100μMのdGTP、10μMのdCTP、および0.1μMのdTTPを含む。本実施形態において、アレイ中のポリメラーゼは、各テンプレートが伸長するときに連続的にシグナルを生成する。TがテンプレートDNA中に存在する点において、取り込みのシグナルは、テレグラフノイズの以前のバーストに迅速に(一般に10ms以内に)続く。次の塩基がCであったテンプレートDNAは低濃度によるdGTPのより遅い到達のために、より遅いテレグラフノイズのバーストを示す。同様に、Gを含むテンプレートは、dCTPの濃度がさらに低いため、より長い遅延が先行する。dTTPの濃度が最も低いので、最も長い遅延はA塩基に先行する。
さらに別の実施形態において、2サイクルのすすぎを使用し、第1のサイクルで等しくない濃度のヌクレオチドの一方の対を使用して、次いで、第2のサイクルで等しくない濃度の他方の2つのヌクレオチドを使用して、2つのアプローチを組み合わせることができる。
前述のセクションはポリメラーゼを含むアレイのシステムを使用してDNAの配列を決定する方法が記載されているが、アレイのシステムは他のポリマーの配列を決定するために容易に改変され得る。
本発明は前述の例示的な実施形態において説明および例示されているが、本開示は例としてのみ示されたものであり、本発明の実施の詳細における多くの変更は本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。開示される実施形態の特徴は、様々な方法で組み合わされまたは再配置されてもよい。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および他の文献は、その全体が参照により組み込まれる。
〔参考文献〕
以下の参考文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる:
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Chenらによる、公知のポリメラーゼ変動用の検出システムを示す。 Choiらによる、公知のリソチーム変動用の検出システムを示す。 Olsenらによる、公知のポリメラーゼ変動用の検出システムを示す。 Olsonらによる、ヌクレオチド配列依存性データを示す。 MerrimanおよびMolaによる、公知のポリメラーゼ変動用の検出システムを示す。 公知のタンパク質検出用デバイスを示す。 本開示の実施形態の概略図を示す。 タンパク質が2点で結合しているときに得られる直線電流電圧特性を示す。 多数の単一分子測定の直線領域の勾配の分布を示す。 タンパク質変動を表すシグナルを示す。 タンパク質がポリメラーゼである、本開示の実施形態の概略図を示す。 ポリメラーゼ活性を測定するために使用される蛍光活性アッセイの原理を示す。 野生型酵素、エキソヌクレアーゼを含まない酵素(D12A、E14A)または、ストレプトアビジンに結合したエキソヌクレアーゼを含まない酵素と60分間インキュベート後の基板上のFAMの蛍光強度を示す。 チオール化ストレプトアビジン(左)およびビオチン化phi29ポリメラーゼの付着後(右)について測定したコンダクタンスの分布を示す。 コンフォメーションによるコンダクタンス変化を示す。 STMギャップ(左)および固体チップ(右)におけるタンパク質変動の高コントラスト、高時間分解能記録を示す。 一定のギャップで収集された電流(各パネルの左下にマークされている)およびphi29−ストレプトアビジン複合体における50mNバイアスが、テンプレートDNAおよびdNTPの非存在下での接触変動(A、B、C)、ならびに、テンプレートDNAおよびdNTPが添加されるときに見られる追加のテレグラフノイズ(D、E、F)を示す。 約4.5nmのギャップでPd電極上のペプチドリガンド(表1に列挙されている)に結合した3つの抗体およびインテグリンについて測定したコンダクタンス(対数スケール)の分布を示す。 マークを付したように、異なるギャップサイズで採取したストレプトアビジン(左)およびストレプトアビジン−ポリメラーゼ複合体(右)のコンダクタンス分布のギャップ距離依存性を示す。 5nm離れた、ポリメラーゼ上の2つのビオチン化部位を介するポリメラーゼの、電極上の2つのストレプトアビジン分子への結合を示す。 DNAテンプレートと結合したポリメラーゼ分子のアレイを示す。 各部位における各テンプレート分子の配列決定するための、ヌクレオチド三リン酸への配列の曝露およびすすぎを示す。 同一の塩基を含む部位における2つの同一のヌクレオチドの連続的な取り込みに特徴的な2つのテレグラフノイズのバーストを示す。
〔連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載〕
本発明は、国立衛生研究所によって付与されたHG009180に基づく政府の支援によりなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。

Claims (35)

  1. タンパク質活性の直接測定用デバイスであって、
    同一平面上にあり、ギャップによって離れている、第1の電極および第2の電極;
    一方または両方の電極に付着したタンパク質;を含み、
    前記第1の電極および前記第2の電極は分析対象試料と接触するように構成されている、デバイス。
  2. 前記ギャップの幅が約1.0nm〜約20.0nmである、請求項1に記載のデバイス。
  3. タンパク質活性の直接測定用デバイスであって、
    (a)誘電体基材;
    (b)前記誘電体基材上に配置された第1の電極;
    (c)前記第1の電極上に配置された絶縁性誘電体層;
    (d)前記絶縁性誘電体層上に配置された第2の電極;
    (e)前記第2の電極上に配置されたパッシベーション層;
    (f)一方または両方の電極に付着したタンパク質;を含み、
    前記第1の電極、前記絶縁性誘電体層、前記第2の電極および前記パッシベーション層には、それらを通過する開口が形成されている、デバイス。
  4. 前記タンパク質が、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアソーム、グリコペプチダーゼ、グリコシダーゼ、キナーゼおよびエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項1または3に記載のデバイス。
  5. 前記タンパク質がポリメラーゼである、請求項4に記載のデバイス。
  6. 前記ポリメラーゼが一方の電極に付着している、請求項5に記載のデバイス。
  7. 前記ポリメラーゼがリンカーを介して前記電極に結合している、請求項5に記載のデバイス。
  8. 前記タンパク質がビオチン化ポリメラーゼである、請求項5に記載のデバイス。
  9. 前記ビオチン化ポリメラーゼが、チオ−ストレプトアビジンリンカーを介して前記電極に結合している、請求項8に記載のデバイス。
  10. 前記第1の電極および/または前記第2の電極が、金、白金、パラジウム、およびルテニウムからなる群から選択される金属を含む、請求項1に記載のデバイス。
  11. 前記第1の電極および/または前記第2の電極がパラジウムを含む、請求項10に記載のデバイス。
  12. タンパク質活性の直接測定用デバイスであって、
    (a)誘電体基材;
    (b)前記誘電体基材上に配置された第1の電極;
    (c)前記誘電体基材上に配置された第2の電極であって、前記第1の電極および前記第2の電極は1〜20nmのギャップによって離れている、第2の電極;
    (d)前記電極の上に配置されたパッシベーション層;
    (e)一方または両方の電極に付着したタンパク質;を含み、
    前記第1の電極と前記第2の電極との間の前記ギャップに試料が移動できる位置に、前記パッシベーション層を通過する開口が形成されている、デバイス。
  13. タンパク質活性の直接電気測定用システムであって、
    (a)請求項1に記載のデバイス;
    (b)前記タンパク質と相互作用することができる化学物質を導入する手段;
    (c)前記第1の電極と前記第2の電極との間にバイアスを印加する手段;
    (d)前記化学物質がタンパク質と相互作用するときに生じる変動をモニターする手段;を含む、システム。
  14. 前記タンパク質がポリメラーゼである、請求項13に記載のシステム。
  15. 前記タンパク質がエキソヌクレアーゼ、プロテアソーム、またはグリカンである、請求項13に記載のシステム。
  16. 前記タンパク質がキナーゼである、請求項13に記載のシステム。
  17. 単一のタンパク質分子の活性を検出する方法であって、
    (a)請求項13に記載のシステムと前記タンパク質分子を相互作用させることができる化学物質を導入する工程;
    (b)定常DC電流が観察されるように選択された2つの電極間にバイアスを印加する工程;
    (c)前記化学物質が前記タンパク質と相互作用するときに生じる前記2つの電極間の電流の変動を観察する工程;を含む、方法。
  18. 前記タンパク質が、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアソーム、グリコペプチダーゼ、グリコシダーゼ、キナーゼおよびエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
  19. 前記化学物質が、ヌクレオチド三リン酸、核酸、ペプチド、グリカンおよびキナーゼからなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
  20. DNAの配列を決定する方法であって、
    (a)プライムDNAテンプレートを請求項13に記載のシステムに導入する工程;
    (b)4つのdNTPを含む溶液を導入する工程;
    (c)2つの電極間に定常DC電流が観測されるように選択されたバイアスを印加する工程;
    (d)新しいヌクレオチドそれぞれがプライマーに組み込まれたときに生じる2つの電極間の電流の変動を検出する工程;
    (e)組み込まれている各ヌクレオチドのアイデンティティを決定する工程;を含む方法。
  21. 前記溶液が、互いにおおよそ同じ濃度である4つのdNTPを含む、請求項20に記載の方法。
  22. 前記dNTPの濃度がテンプレートに結合するポリメラーゼの飽和濃度とおおよそ同じ濃度以上である、請求項20に記載の方法。
  23. 工程(d)が、1つ以上の電流スパイクの存在を検出する工程を含む、請求項20に記載の方法。
  24. 工程(e)が、各スパイクの特性を使用する工程を含む、請求項20に記載の方法。
  25. バイオポリマーの配列を決定する方法であって、
    (a)請求項15に記載のシステムにバイオポリマーを導入する工程;
    (b)2つの電極間に定常DC電流が観測されるように選択されたバイアスを印加する工程;
    (c)モノマーが前記バイオポリマーの末端から除去されるときに生じる前記2つの電極間の電流の変動を検出する工程;
    (d)前記バイオポリマーから除去された各モノマーのアイデンティティを決定する工程;を含む、方法。
  26. 前記バイオポリマーが、DNA、ペプチド、またはグリカンである、請求項25に記載の方法。
  27. キナーゼの活性を検出する方法であって、
    (a)キナーゼ阻害剤候補分子を請求項16に記載のシステムに導入する工程;
    (b)2つの電極間に定常DC電流が観測されるように選択されたバイアスを印加する工程;
    (c)キナーゼが前記キナーゼ阻害剤候補分子と相互作用するときに生じる前記2つの電極間の電流の変動を検出する工程;
    (d)前記キナーゼ阻害剤候補分子の存在下でキナーゼが活性を有するか否かを決定する工程;を含む、方法。
  28. DNAの配列を決定するアレイであって、
    (a)誘電体基材;
    (b)前記誘電体基材上に配置された第1の電極;
    (c)前記第1の電極上に配置された絶縁性誘電体層;
    (d)前記絶縁性誘電体層上に配置された第2の電極;
    (e)前記第2の電極上に配置されたパッシベーション層;
    (f)前記第1の電極および前記第2の電極に付着したポリメラーゼ分子;を含み、
    前記第1の電極、前記絶縁性誘電体層、前記第2の電極および前記パッシベーション層には、それらを通過する開口が形成されている、アレイ。
  29. DNAの配列を決定するアレイであって、複数のデバイスの配置を含み、
    前記デバイスは、
    (a)誘電体基材;
    (b)前記誘電体基材上に配置された第1の電極;
    (c)前記誘電体基材上に配置された第2の電極;
    (d)前記電極の上に配置されたパッシベーション層;
    (e)一方または両方の電極に付着したポリメラーゼ分子;を含み、
    前記パッシベーション層を通過する開口が形成されている、アレイ。
  30. 前記配置が格子状である、請求項28または29に記載のアレイ。
  31. ポリメラーゼ活性の直接測定用システムであって、
    (a)請求項28または29に記載のアレイ;
    (b)任意に、溶液を前記アレイに導入し除去する手段;
    (c)前記第1の電極および前記第2の電極間にバイアスを印加する手段;
    (d)前記第1の電極および前記第2の電極間に生成される電流をモニターする手段;を含む、アレイ。
  32. DNAの配列を決定する方法であって、
    (a)請求項31に記載のシステムにDNAテンプレートを含む溶液を導入する工程;
    (b)本明細書に記載のシステムにバイアスを印加するときに生成する第1の電流を測定する工程;
    (c)前記DNAテンプレートに相補的なdNTPの組み込みを可能にする条件下において、dNTPを含む溶液を前記システムに導入する工程;
    (d)工程(c)において生成する第2の電流を測定する工程;
    (e)組み込まれていないdNTPを含む溶液を除去する工程;
    (f)工程(c)において使用されなかった残りの3つの種類のdNTPの各々を用いて工程(c)〜(e)を繰り返す工程;
    (g)工程(c)〜(f)を繰り返す工程;を含み、
    生成した電流シグナルからDNAの配列を決定する、方法。
  33. DNAの配列を決定する方法であって、
    (a)請求項31に記載のシステムにDNAテンプレートを含む溶液を導入する工程;
    (b)本明細書に記載のシステムにバイアスを印加するときに生成する第1の電流を測定する工程;
    (c)前記DNAテンプレートに相補的なdNTPの組み込みを可能にする条件下において、少なくとも2種類のdNTPを含む溶液をシステムに導入する工程であって、各種類のdNTPが異なる濃度において溶液に存在している、工程;
    (d)工程(c)において生成する第2の電流を測定する工程;
    (e)組み込まれていないdNTPを含む溶液を除去する工程;
    (f)工程(c)において使用されなかった残りの種類のdNTPの各々を用いて工程(c)〜(e)を繰り返す工程;
    (g)工程(c)〜(f)を繰り返す工程;を含み、
    生成した電流シグナルからDNAの配列を決定する、方法。
  34. 工程(c)の溶液が4種類のdNTPを含む、請求項33に記載の方法。
  35. 工程(c)の溶液が少なくとも2種類のdNTPを含む、請求項33に記載の方法。
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