JP3486171B2 - ミクロ構造キャリア上における細胞単体および再構成膜系のポジショニングおよび電気生理学的特性決定 - Google Patents
ミクロ構造キャリア上における細胞単体および再構成膜系のポジショニングおよび電気生理学的特性決定Info
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Description
【０００１】
【関連出願】本出願は１９９７年１２月１７日に出願さ
れたスイス国出願第２９０３／９７号の優先権を請求す
る。
れたスイス国出願第２９０３／９７号の優先権を請求す
る。
【０００２】
【技術分野】本発明は細胞および小胞ないし脂質膜に関
する測定装置ならびに膜の検査を可能とする前記対象の
ポジショニング法、特に、チャネル形成蛋白質と、チャ
ネル形成蛋白質を介しまたはチャネル形成蛋白質と結合
したレセプターとをチャネル形成蛋白質の電気的特性の
測定を通じて検査するための電気生理学的方法に関す
る。本発明に基づく測定方法は、特に、古典的なパッチ
クランプ技法の感度と選択性とを有すると同時にミクロ
構造キャリアに生体細胞または小胞をポジショニングす
るための同じく本発明に基づく方法によってパッチ膜の
より容易な作製ならびに高い信号雑音比を可能とする
（マルチアレイ）パッチクランプ法に関する。さらに本
発明はポジショニングならびに電気生理学的測定のいず
れにも適した測定装置に関する。
する測定装置ならびに膜の検査を可能とする前記対象の
ポジショニング法、特に、チャネル形成蛋白質と、チャ
ネル形成蛋白質を介しまたはチャネル形成蛋白質と結合
したレセプターとをチャネル形成蛋白質の電気的特性の
測定を通じて検査するための電気生理学的方法に関す
る。本発明に基づく測定方法は、特に、古典的なパッチ
クランプ技法の感度と選択性とを有すると同時にミクロ
構造キャリアに生体細胞または小胞をポジショニングす
るための同じく本発明に基づく方法によってパッチ膜の
より容易な作製ならびに高い信号雑音比を可能とする
（マルチアレイ）パッチクランプ法に関する。さらに本
発明はポジショニングならびに電気生理学的測定のいず
れにも適した測定装置に関する。
【０００３】
【従来の技術】多くの生物学的に重要なシグナル導入プ
ロセスたとえば神経伝達は細胞膜上または細胞膜内で生
ずる。それゆえ、膜蛋白質一般および神経性レセプター
の生物学的機能が特に薬理作用を有する作用物質によっ
て影響されるということは驚くべきことではない（J.-
P. Changeux(1993), “Chemical signalling in the br
ain”、Sci. Ａm. Nov. p.30以下; A. G. Gilman(1995),
Angew. Chem. Int. Ed.Engl., 34:1406-1428; M.Rodbe
ll(1995), Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34:1420-142
8）。
ロセスたとえば神経伝達は細胞膜上または細胞膜内で生
ずる。それゆえ、膜蛋白質一般および神経性レセプター
の生物学的機能が特に薬理作用を有する作用物質によっ
て影響されるということは驚くべきことではない（J.-
P. Changeux(1993), “Chemical signalling in the br
ain”、Sci. Ａm. Nov. p.30以下; A. G. Gilman(1995),
Angew. Chem. Int. Ed.Engl., 34:1406-1428; M.Rodbe
ll(1995), Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34:1420-142
8）。
【０００４】レセプターに関する分子レベルの相互作用
に関する機能知見ならびに作用物質スクリーニングに際
するそうしたレセプターの使用は現代の医薬品開発にお
いて中心的な役割を果たしている。作用物質に関する既
知の標的レセプター（ターゲットレセプターとも称され
る）の数の増大および組み合わせの化学からする潜在的
作用物質の数の急速な増大と共に、大量の単位時間処理
量で多数の各種物質の分析を可能とする高感度のスクリ
ーニング法（“high through-put screening”＝ＨＴ
Ｓ）に対する需要が増大している。
に関する機能知見ならびに作用物質スクリーニングに際
するそうしたレセプターの使用は現代の医薬品開発にお
いて中心的な役割を果たしている。作用物質に関する既
知の標的レセプター（ターゲットレセプターとも称され
る）の数の増大および組み合わせの化学からする潜在的
作用物質の数の急速な増大と共に、大量の単位時間処理
量で多数の各種物質の分析を可能とする高感度のスクリ
ーニング法（“high through-put screening”＝ＨＴ
Ｓ）に対する需要が増大している。
【０００５】現在、薬理学的作用物質スクリーニングに
際してはなお相対的に伝統的な方途が採用されており、
時間のかかるリガンド結合テストとレセプター機能テス
トとが別々に実施されている（J. Hodgson (1992) Bio/
Technology 9:973）。他方、膜蛋白質、たとえばＧ蛋白
質と結合したレセプターおよびチャネル形成レセプター
は能動作用物質にとっての最重要な標的蛋白質に数え入
れられる（J. Knowles(1997) “Medicine for the new
millennium hunting down deseases” Odyssey Vol.3
(1)）。この点で、古典的なパッチクランプ法は依然と
して機能的なレセプターテスト法として使用される。こ
の電気生理学的方法の長所は、当該チャネル形成蛋白質
またはチャネル形成蛋白質と結合したレセプターの機能
を、該チャネル形成蛋白質の電気的特性の測定を介して
直接知ることができる点にある。この方法は非常に特異
的且つ極めて敏感であり、基本的に個々のレセプター分
子のチャネル活動度を測定することができる。この場
合、典型的には１〜０，１μｍの開口直径を有したガラ
ス毛細管が１個の生体細胞の表面に密着させられる。こ
の毛細管によって覆われる膜面は「パッチ」と称され
る。ガラス毛細管電極と細胞膜表面との接触が電気的に
十分にシールされていれば、一方はガラス毛細管内に置
かれ、他方は膜対向環境内に置かれたマイクロ電極を利
用して当該膜パッチを通るイオン流を電気的に測定する
ことができる（O. P. Hamill, A. Martyら(1981)。“Imp
roved patch-clamp techniques for high-resolution c
urrent recording from cells and cell-free membrane
patches.” Pflugers Arch 391(2):85-100）。
際してはなお相対的に伝統的な方途が採用されており、
時間のかかるリガンド結合テストとレセプター機能テス
トとが別々に実施されている（J. Hodgson (1992) Bio/
Technology 9:973）。他方、膜蛋白質、たとえばＧ蛋白
質と結合したレセプターおよびチャネル形成レセプター
は能動作用物質にとっての最重要な標的蛋白質に数え入
れられる（J. Knowles(1997) “Medicine for the new
millennium hunting down deseases” Odyssey Vol.3
(1)）。この点で、古典的なパッチクランプ法は依然と
して機能的なレセプターテスト法として使用される。こ
の電気生理学的方法の長所は、当該チャネル形成蛋白質
またはチャネル形成蛋白質と結合したレセプターの機能
を、該チャネル形成蛋白質の電気的特性の測定を介して
直接知ることができる点にある。この方法は非常に特異
的且つ極めて敏感であり、基本的に個々のレセプター分
子のチャネル活動度を測定することができる。この場
合、典型的には１〜０，１μｍの開口直径を有したガラ
ス毛細管が１個の生体細胞の表面に密着させられる。こ
の毛細管によって覆われる膜面は「パッチ」と称され
る。ガラス毛細管電極と細胞膜表面との接触が電気的に
十分にシールされていれば、一方はガラス毛細管内に置
かれ、他方は膜対向環境内に置かれたマイクロ電極を利
用して当該膜パッチを通るイオン流を電気的に測定する
ことができる（O. P. Hamill, A. Martyら(1981)。“Imp
roved patch-clamp techniques for high-resolution c
urrent recording from cells and cell-free membrane
patches.” Pflugers Arch 391(2):85-100）。
【０００６】ただし作用物質スクリーニングと関連して
伝統的なパッチクランプ技法は決定的な短所も有してい
る。パッチクランプ測定はきわめて時間がかかると共に
この分野での長い経験を有した特別に訓練された要員を
要し、しかもそれは実際にはＨＴＳに使用することがで
きない。生体細胞膜の電気特性および誘電特性を測定す
る方法はＵＳ−Ａ−４ ０５５７９９より周知である。
公開された前記装置は１つの容器であり、該容器は電位
差用の２つの測定電極、電圧／電流パルス送出用の２つ
の電極、容器を２つのチャンバに分割すると共に１個も
しくは複数個の穴を有した１枚の隔壁、生理的溶液用の
接続口および電解液供給用の接続口を含んでいる。測定
のため細胞は部分的に隔壁の穴内に置かれ、その結果、
穴を覆うフラットな膜は形成されない。ＥＰ−Ａ−０
０９４ １９３とＷＯ−Ａ−８ ５０２ ２０１もキャリ
アの穴内への細胞の固定を開示している。この場合の固
定はキャリアの帯電によって行われるが、これは測定対
象たる細胞または小胞の直径よりも小さな直径を有する
前以って定められた点（開口）上への測定対象の必然的
に正確なポジショニングを結果するものではない。
伝統的なパッチクランプ技法は決定的な短所も有してい
る。パッチクランプ測定はきわめて時間がかかると共に
この分野での長い経験を有した特別に訓練された要員を
要し、しかもそれは実際にはＨＴＳに使用することがで
きない。生体細胞膜の電気特性および誘電特性を測定す
る方法はＵＳ−Ａ−４ ０５５７９９より周知である。
公開された前記装置は１つの容器であり、該容器は電位
差用の２つの測定電極、電圧／電流パルス送出用の２つ
の電極、容器を２つのチャンバに分割すると共に１個も
しくは複数個の穴を有した１枚の隔壁、生理的溶液用の
接続口および電解液供給用の接続口を含んでいる。測定
のため細胞は部分的に隔壁の穴内に置かれ、その結果、
穴を覆うフラットな膜は形成されない。ＥＰ−Ａ−０
０９４ １９３とＷＯ−Ａ−８ ５０２ ２０１もキャリ
アの穴内への細胞の固定を開示している。この場合の固
定はキャリアの帯電によって行われるが、これは測定対
象たる細胞または小胞の直径よりも小さな直径を有する
前以って定められた点（開口）上への測定対象の必然的
に正確なポジショニングを結果するものではない。
【０００７】そこで本発明の目的は、古典的なパッチク
ランプ技法の感度と選択性とを備えつつ、同時に、生体
細胞または小胞ないし当該脂質膜を自動ポジショニング
するための本発明に基づく方法と測定装置の固有な表面
性状とによって古典的なパッチクランプ技法の短所を取
除いた特に（マルチアレイ）パッチクランプ法向けの、
取扱いが容易でスピーディーな検査を可能とする測定法
／ポジショニング法を提供することであった。本発明は
さらに本発明に基づく方法の実施に特に適したフラット
なポジショニング装置／測定装置に関する。
ランプ技法の感度と選択性とを備えつつ、同時に、生体
細胞または小胞ないし当該脂質膜を自動ポジショニング
するための本発明に基づく方法と測定装置の固有な表面
性状とによって古典的なパッチクランプ技法の短所を取
除いた特に（マルチアレイ）パッチクランプ法向けの、
取扱いが容易でスピーディーな検査を可能とする測定法
／ポジショニング法を提供することであった。本発明は
さらに本発明に基づく方法の実施に特に適したフラット
なポジショニング装置／測定装置に関する。
【０００８】
［発明の詳細な説明］本発明に基づく方法は電気的にシ
ールされたパッチ膜の作製ならびにそれに続く測定にあ
たっての極度の容易性を特徴としている；この新しい技
術は最新のマイクロテクノロジー法とのコンビネーショ
ンによって“high through-put screening”（ＨＴＳ）
へのあらゆる使用可能性を供する。さらに本発明に基づ
くポジショニング・測定装置ならびに本発明に基づく方
法は電気的測定と光学的測定とのコンビネーションに適
しており、該コンビネーションによって本発明に基づく
ポジショニング法で得られたフラットな膜で検査対象レ
セプターに関する新しい重要な情報を得ることができ
る。
ールされたパッチ膜の作製ならびにそれに続く測定にあ
たっての極度の容易性を特徴としている；この新しい技
術は最新のマイクロテクノロジー法とのコンビネーショ
ンによって“high through-put screening”（ＨＴＳ）
へのあらゆる使用可能性を供する。さらに本発明に基づ
くポジショニング・測定装置ならびに本発明に基づく方
法は電気的測定と光学的測定とのコンビネーションに適
しており、該コンビネーションによって本発明に基づく
ポジショニング法で得られたフラットな膜で検査対象レ
セプターに関する新しい重要な情報を得ることができ
る。
【０００９】本発明に基づく、細胞および小胞ないし当
該脂質膜のポジショニング法は２つの電極の間に電気絶
縁材料製の隔壁―以下ではキャリアと称される―が配置
されていることを特徴としている。該キャリアは開口な
らびに、膜が固定される面を有している。このキャリア
は一体から成る必要はなく、たとえば、膜結合と膜ポジ
ショニングとに本来関係した材料がその上に固定されて
いるか、または該材料がその中に嵌め込まれているホル
ダから構成することが可能であり、この場合、該材料は
膜の結合ないしポジショニング用に少なくとも１個の開
口を有している。膜の固定は、たとえば負に帯電した膜
表面と正に帯電したキャリア表面との間の静電相互作用
に基づかせることができる。キャリア表面がそうしたも
のとして所望の電荷を有していない場合には、それを適
切に修飾することが可能である。細胞および小胞は、そ
れらが懸濁液として一方の電極の通例直径０，２〜２ｍ
ｍ、好ましくは０，５〜１ｍｍの添加穴を介して、また
は開口近傍に設けられたチューブを介して、またはピペ
ットによって装置に与えられ、その際、それぞれキャリ
アの上側と下側とに配置された２つの電極が電気泳動に
よって細胞または小胞を開口に向かって移動させるだけ
の電位差を有している場合に、非常に良好にポジショニ
ングされ得ることが明らかとなった。添加穴は任意の形
状であってよいが、それは通例楕円形、特に円形である
ことから、開口上にたとえば同心的に配置することがで
きる。
該脂質膜のポジショニング法は２つの電極の間に電気絶
縁材料製の隔壁―以下ではキャリアと称される―が配置
されていることを特徴としている。該キャリアは開口な
らびに、膜が固定される面を有している。このキャリア
は一体から成る必要はなく、たとえば、膜結合と膜ポジ
ショニングとに本来関係した材料がその上に固定されて
いるか、または該材料がその中に嵌め込まれているホル
ダから構成することが可能であり、この場合、該材料は
膜の結合ないしポジショニング用に少なくとも１個の開
口を有している。膜の固定は、たとえば負に帯電した膜
表面と正に帯電したキャリア表面との間の静電相互作用
に基づかせることができる。キャリア表面がそうしたも
のとして所望の電荷を有していない場合には、それを適
切に修飾することが可能である。細胞および小胞は、そ
れらが懸濁液として一方の電極の通例直径０，２〜２ｍ
ｍ、好ましくは０，５〜１ｍｍの添加穴を介して、また
は開口近傍に設けられたチューブを介して、またはピペ
ットによって装置に与えられ、その際、それぞれキャリ
アの上側と下側とに配置された２つの電極が電気泳動に
よって細胞または小胞を開口に向かって移動させるだけ
の電位差を有している場合に、非常に良好にポジショニ
ングされ得ることが明らかとなった。添加穴は任意の形
状であってよいが、それは通例楕円形、特に円形である
ことから、開口上にたとえば同心的に配置することがで
きる。
【００１０】電極間へのキャリアの固定は、それぞれの
電極とキャリアとの間にそれぞれ１個のスペーサを設け
ることによって行なうことができ、該スペーサはキャリ
ア自体と同様に電気絶縁材料から成ると共に、開口と電
極との間に配置されてこれらと接触している通路を有し
ている。これらの通路は導電性液で満たされて基準チャ
ンバまたは試料チャンバとして利用することができる。
この場合、基準チャンバはその中に含まれている基準緩
衝液が毛管力によってその中に固定されるようなわずか
なサイズを有しているのが好適である旨が判明した。極
端な場合には、基準液を物理的境界なしにもっぱら毛管
力のみでチップ表面と電極との間に保持することが可能
である。試料区画（試料チャンバ）はチップ表面と添加
電極との間に形成される。これは側方境界を持たず、毛
管力によって保持される。ただし、この方法を統合する
意図で、試料チャンバに側方境界を設けることも可能で
ある。本発明の測定装置は物理的側方境界のない試料チ
ャンバならびに物理的側方境界のある試料チャンバのい
ずれも備えた実施形態を包括している。
電極とキャリアとの間にそれぞれ１個のスペーサを設け
ることによって行なうことができ、該スペーサはキャリ
ア自体と同様に電気絶縁材料から成ると共に、開口と電
極との間に配置されてこれらと接触している通路を有し
ている。これらの通路は導電性液で満たされて基準チャ
ンバまたは試料チャンバとして利用することができる。
この場合、基準チャンバはその中に含まれている基準緩
衝液が毛管力によってその中に固定されるようなわずか
なサイズを有しているのが好適である旨が判明した。極
端な場合には、基準液を物理的境界なしにもっぱら毛管
力のみでチップ表面と電極との間に保持することが可能
である。試料区画（試料チャンバ）はチップ表面と添加
電極との間に形成される。これは側方境界を持たず、毛
管力によって保持される。ただし、この方法を統合する
意図で、試料チャンバに側方境界を設けることも可能で
ある。本発明の測定装置は物理的側方境界のない試料チ
ャンバならびに物理的側方境界のある試料チャンバのい
ずれも備えた実施形態を包括している。
【００１１】分析目的に応じ膜の両側を測定液と接触さ
せることが有意的であることから、検査される物質の添
加は通例基準側として利用される側から行なうことがで
きることは言うまでもない。また、たとえば基準緩衝剤
を泥膏様のゲルと成し、ゲル内に貯蔵されている基準緩
衝剤の組成を変化させることなくゲルの外部にある液体
を交換することも可能である。こうしたゲルとして適し
ているのはたとえばアガロースおよびポリアクリルアミ
ドである。
せることが有意的であることから、検査される物質の添
加は通例基準側として利用される側から行なうことがで
きることは言うまでもない。また、たとえば基準緩衝剤
を泥膏様のゲルと成し、ゲル内に貯蔵されている基準緩
衝剤の組成を変化させることなくゲルの外部にある液体
を交換することも可能である。こうしたゲルとして適し
ているのはたとえばアガロースおよびポリアクリルアミ
ドである。
【００１２】本発明に基づく測定方法は特にイオンチャ
ネル電流の測定を信頼度の高い、再現性ある方法で且つ
高い信号雑音比を以って可能とする。これを実現するた
めの基礎は、正確なポジショニングとそれに続く、直径
ｄＭ＜１５μｍ、好ましくは＜１０μｍ、特に０，３〜
７μｍ、特に好ましくは０，３〜５μｍ、特に極めて好
ましくは１〜５μｍのミクロ構造穴（以下では開口とも
称する）への小胞、細胞またはその他の生体オルガネラ
ないし同様な起源の膜の電気的に密な結合である。小胞
または細胞ないしそれらの膜の電気的に密な結合はキャ
リア表面と膜表面との間の強い静電引力によって実現さ
れる。
ネル電流の測定を信頼度の高い、再現性ある方法で且つ
高い信号雑音比を以って可能とする。これを実現するた
めの基礎は、正確なポジショニングとそれに続く、直径
ｄＭ＜１５μｍ、好ましくは＜１０μｍ、特に０，３〜
７μｍ、特に好ましくは０，３〜５μｍ、特に極めて好
ましくは１〜５μｍのミクロ構造穴（以下では開口とも
称する）への小胞、細胞またはその他の生体オルガネラ
ないし同様な起源の膜の電気的に密な結合である。小胞
または細胞ないしそれらの膜の電気的に密な結合はキャ
リア表面と膜表面との間の強い静電引力によって実現さ
れる。
【００１３】本発明に基づく方法にとって、膜をできる
かぎりフラットなキャリアに載置するのが好適である旨
判明した。当該キャリアは多様な材料から構成すること
が可能である；ただし適切な材料として好ましいのは、
それが微視的にフラットであるのみならず、分子レベル
でも相対的に平らであることである。適切な材料は、さ
らに、システム中で不活性で導電性を持たず且つ好まし
くは化学的に修飾可能でなければならない。
かぎりフラットなキャリアに載置するのが好適である旨
判明した。当該キャリアは多様な材料から構成すること
が可能である；ただし適切な材料として好ましいのは、
それが微視的にフラットであるのみならず、分子レベル
でも相対的に平らであることである。適切な材料は、さ
らに、システム中で不活性で導電性を持たず且つ好まし
くは化学的に修飾可能でなければならない。
【００１４】特に好適であると判明したのは、ミクロ構
造化されたケイ素／酸化ケイ素・キャリアまたはケイ素
／オキシ窒化ケイ素・キャリアであって、すぐれた静電
引力を供するために所望の表面電荷を付与する物質でコ
ーティングされたキャリアであった。これに適している
のは、たとえば、Mazia,Schattenらが記述しているよう
なポリカチオンである（以下参照：D. Mazia, G. Schat
ten et al., (1975),“Adhesion of cells to surfaces
coated with polylysine”, J. Cell. biol.66:198-20
0）。こうしたポリカチオンとは、たとえばポリ−Ｌ−
リシンおよびポリエチレンイミンである。
造化されたケイ素／酸化ケイ素・キャリアまたはケイ素
／オキシ窒化ケイ素・キャリアであって、すぐれた静電
引力を供するために所望の表面電荷を付与する物質でコ
ーティングされたキャリアであった。これに適している
のは、たとえば、Mazia,Schattenらが記述しているよう
なポリカチオンである（以下参照：D. Mazia, G. Schat
ten et al., (1975),“Adhesion of cells to surfaces
coated with polylysine”, J. Cell. biol.66:198-20
0）。こうしたポリカチオンとは、たとえばポリ−Ｌ−
リシンおよびポリエチレンイミンである。
【００１５】既述したように、適切なキャリアチップ材
料自体の選択に際しては、小胞もしくは生体細胞ないし
当該膜または膜片と表面との静電結合、または場合によ
りファンデルワールス力結合または共有結合が可能とな
るように、表面の十分な修飾可能性が顧慮されなければ
ならない。また前記以外に一定の状況下では、疎水−親
水相互作用に基づく結合も可能である（Radler, J., H.
Strey et al., (1995), “Phenomenology and Kinetics
Of Lipid Bilayer Spreading On HydrophilicSurface
s”, Langmuir 11(11):4539-4548）。さらにキャリアチ
ップ材料は加工性を有し、すなわち所望のサイズの開口
ないし窓を設けることが可能でなければならず、また開
口上への電界の集束を可能としなければならない。
料自体の選択に際しては、小胞もしくは生体細胞ないし
当該膜または膜片と表面との静電結合、または場合によ
りファンデルワールス力結合または共有結合が可能とな
るように、表面の十分な修飾可能性が顧慮されなければ
ならない。また前記以外に一定の状況下では、疎水−親
水相互作用に基づく結合も可能である（Radler, J., H.
Strey et al., (1995), “Phenomenology and Kinetics
Of Lipid Bilayer Spreading On HydrophilicSurface
s”, Langmuir 11(11):4539-4548）。さらにキャリアチ
ップ材料は加工性を有し、すなわち所望のサイズの開口
ないし窓を設けることが可能でなければならず、また開
口上への電界の集束を可能としなければならない。
【００１６】特に好適なキャリアは、Ｓｉ／ＳｉＯ２・
チップまたはケイ素／オキシ窒化ケイ素・チップであ
り、これは通例Ｄ＞２００ ｎｍの厚さの酸化物層を備
えた取引通例のＳｉウェーハから作製することができ
る。こうしたキャリアは容易にミクロ構造化することが
可能であり、そうした構造はたとえばホトリソグラフィ
ーないし、ｄ＜１，５μｍの開口の場合には、電子線照
射リソグラフィーを行なった後、ＫＯＨ含有溶媒中での
ケイ素の異方性エッチングならびに石英層の反応性イオ
ンエッチングによって得ることができる。石英以外にガ
ラス層、固体ポリマーないしゲル状ポリマーなども適切
な修飾可能表面を形成する。さらに、プラストマーおよ
びエラストマー（たとえばポリイミド、ポリメタクリル
酸メチル、ポリカーボネート）、シリカゲル（たとえば
シルガード）なども適当である。
チップまたはケイ素／オキシ窒化ケイ素・チップであ
り、これは通例Ｄ＞２００ ｎｍの厚さの酸化物層を備
えた取引通例のＳｉウェーハから作製することができ
る。こうしたキャリアは容易にミクロ構造化することが
可能であり、そうした構造はたとえばホトリソグラフィ
ーないし、ｄ＜１，５μｍの開口の場合には、電子線照
射リソグラフィーを行なった後、ＫＯＨ含有溶媒中での
ケイ素の異方性エッチングならびに石英層の反応性イオ
ンエッチングによって得ることができる。石英以外にガ
ラス層、固体ポリマーないしゲル状ポリマーなども適切
な修飾可能表面を形成する。さらに、プラストマーおよ
びエラストマー（たとえばポリイミド、ポリメタクリル
酸メチル、ポリカーボネート）、シリカゲル（たとえば
シルガード）なども適当である。
【００１７】こうした構造において重要なのは開口のサ
イズであり、これは＜１５μｍ、多くの場合に＜１０μ
ｍ、特に＜７μｍ、好ましくは＜５μｍであることが必
要であり、また同じく重要なのは表面層たとえば石英層
の窓のサイズであり、これは好ましくは＜５０μｍであ
る。ただし、理想的には、一定の状況下（緩衝剤導電率
が低い場合）において開口上への電界の高度な集束を補
強すると共に、特に機械的応力（破壊の危険）を低下さ
せる開口サイズに減少されていることが必要であろう。
Ｅ界の強度な不均質性（Ｅは開口への接近と共に増大す
る）に応じた強度な電界集束はＦeletrisch〜Ｅ（Ｆ＝
力のベクトル、Ｅ＝電界）によって開口上への小胞の相
応した正確な移動を可能にする。１つのキャリアが逐次
または平行して測定に利用される多数の開口を有するこ
とができるのは言うまでもない。
イズであり、これは＜１５μｍ、多くの場合に＜１０μ
ｍ、特に＜７μｍ、好ましくは＜５μｍであることが必
要であり、また同じく重要なのは表面層たとえば石英層
の窓のサイズであり、これは好ましくは＜５０μｍであ
る。ただし、理想的には、一定の状況下（緩衝剤導電率
が低い場合）において開口上への電界の高度な集束を補
強すると共に、特に機械的応力（破壊の危険）を低下さ
せる開口サイズに減少されていることが必要であろう。
Ｅ界の強度な不均質性（Ｅは開口への接近と共に増大す
る）に応じた強度な電界集束はＦeletrisch〜Ｅ（Ｆ＝
力のベクトル、Ｅ＝電界）によって開口上への小胞の相
応した正確な移動を可能にする。１つのキャリアが逐次
または平行して測定に利用される多数の開口を有するこ
とができるのは言うまでもない。
【００１８】フラットな、少なくとも１個の開口を備え
たキャリアチップは２つの電極の間に配置される。適切
な電極はたとえばＡｇ／ＡｇＣｌ、Ｐｔである；ただし
製作が容易であることからＡｇ／ＡｇＣｌ電極が好まし
い。電極は電位固定（voltage clamp）の他に、特に小
胞および細胞ないし当該膜のポジショニングにも利用さ
れる。電極はキャリアから通例０，５〜３ｍｍ、多くの
場合０，５〜１ｍｍの間隔を置いて配置されるが、もっ
と引き離すことも可能である。シンメトリックな配置を
必要としないのが好ましい。
たキャリアチップは２つの電極の間に配置される。適切
な電極はたとえばＡｇ／ＡｇＣｌ、Ｐｔである；ただし
製作が容易であることからＡｇ／ＡｇＣｌ電極が好まし
い。電極は電位固定（voltage clamp）の他に、特に小
胞および細胞ないし当該膜のポジショニングにも利用さ
れる。電極はキャリアから通例０，５〜３ｍｍ、多くの
場合０，５〜１ｍｍの間隔を置いて配置されるが、もっ
と引き離すことも可能である。シンメトリックな配置を
必要としないのが好ましい。
【００１９】たとえばフラットな点化された電極、ない
し開口を通る垂線の外側に配置された点電極を使用する
際の、フラットな構成および垂線方向において容易に実
現される光学的に明晰な構成により、前記システムは同
時的な電気的・光学的（蛍光）測定に適している。新し
い蛍光技法たとえば蛍光相関分光法ならびに共焦点ＣＣ
Ｄ観察により個々のレセプターへのリガンド結合を光学
的に検知することが可能になった。こうした光学的技法
と此処に紹介した方法とのコンビネーションによって初
めてリガンド結合事象とチャネル活動度との区別ないし
分解が可能である。これによりたとえばリガンド結合に
よるレセプターのコンフォメーション変化の安定化に関
する重要な情報ならびにレセプターのリガンド結合部位
の機能的相違に関する重要な情報を得ることができる。
（J. Edelstein, O. Schaad, J.-P. Changeux(1997),
“Single Binding versus Single Channel Recordings:
A new Approach to Study Ionotropic Receptors”, Bi
ochemistry 36:13755-13760）。これらの結果はアゴニ
ストおよびアンタゴニストの作用態様の理解と共に新薬
の開発にとっても重要である。
し開口を通る垂線の外側に配置された点電極を使用する
際の、フラットな構成および垂線方向において容易に実
現される光学的に明晰な構成により、前記システムは同
時的な電気的・光学的（蛍光）測定に適している。新し
い蛍光技法たとえば蛍光相関分光法ならびに共焦点ＣＣ
Ｄ観察により個々のレセプターへのリガンド結合を光学
的に検知することが可能になった。こうした光学的技法
と此処に紹介した方法とのコンビネーションによって初
めてリガンド結合事象とチャネル活動度との区別ないし
分解が可能である。これによりたとえばリガンド結合に
よるレセプターのコンフォメーション変化の安定化に関
する重要な情報ならびにレセプターのリガンド結合部位
の機能的相違に関する重要な情報を得ることができる。
（J. Edelstein, O. Schaad, J.-P. Changeux(1997),
“Single Binding versus Single Channel Recordings:
A new Approach to Study Ionotropic Receptors”, Bi
ochemistry 36:13755-13760）。これらの結果はアゴニ
ストおよびアンタゴニストの作用態様の理解と共に新薬
の開発にとっても重要である。
【００２０】本発明に基づく測定装置の多様な適用可能
性はマルチアレイ設計によってさらに向上させることが
できる。ミクロ構造化によってきわめて小さなスペース
に、同一の電極に連結されているかまたは、たとえばＡ
ｇ／ＡｇＣｌ電極も同じく容易にミクロ構造化し得るこ
とから、別個の測定区画を表わすかする多様な開口を設
けることが可能である。
性はマルチアレイ設計によってさらに向上させることが
できる。ミクロ構造化によってきわめて小さなスペース
に、同一の電極に連結されているかまたは、たとえばＡ
ｇ／ＡｇＣｌ電極も同じく容易にミクロ構造化し得るこ
とから、別個の測定区画を表わすかする多様な開口を設
けることが可能である。
【００２１】さらに、区画をチューブを介してポンプシ
ステムと結び付けるかあるいは静水圧差またはピエゾド
ロップ方式ないしインクジェット方式またはコンタクト
トランスファー方式または電気浸透方式または温度制御
方式または毛管電気泳動（ＣＥ）またはＨＰＬＣ（High
Pressure Liquid Chromatography）によって作動する
装置と結びつけることにより、本発明に基づく測定装置
を試料添加・交換装置、試料分離装置および測定調整装
置と連結することができる。
ステムと結び付けるかあるいは静水圧差またはピエゾド
ロップ方式ないしインクジェット方式またはコンタクト
トランスファー方式または電気浸透方式または温度制御
方式または毛管電気泳動（ＣＥ）またはＨＰＬＣ（High
Pressure Liquid Chromatography）によって作動する
装置と結びつけることにより、本発明に基づく測定装置
を試料添加・交換装置、試料分離装置および測定調整装
置と連結することができる。
【００２２】膜活性物質の添加たとえば孔形成剤、プロ
テオリポソームおよび膜蛋白質の添加によって測定に影
響をおよぼすことができる。
テオリポソームおよび膜蛋白質の添加によって測定に影
響をおよぼすことができる。
【００２３】以下図面に基づいて本発明を詳細に説明す
る。
る。
【００２４】
【発明の実施の形態】本発明の方法ないし装置（測定装
置）は従来のパッチクランプ技法に代わるものとして作
用物質スクリーニングに際する使用に特に適しており且
つたとえば環境分析用のポータブル・バイオセンサとし
て特に好適である。以下に測定装置の例ならびに該装置
の適用領域を若干詳しく説明する。
置）は従来のパッチクランプ技法に代わるものとして作
用物質スクリーニングに際する使用に特に適しており且
つたとえば環境分析用のポータブル・バイオセンサとし
て特に好適である。以下に測定装置の例ならびに該装置
の適用領域を若干詳しく説明する。
【００２５】本発明に基づく測定装置は少なくとも２つ
の電極６、９と、液体の収容に適した分離した区画とを
有し、それぞれ少なくとも１つの区画内に達するかまた
は１つの区画に接するかする任意の形状の対向した２つ
のレドックス電極６、９の間に１つのキャリア１が存在
し、該キャリアは少なくとも１個の開口３を有し且つそ
れぞれ少なくとも２つの区画を互いに切離していること
を特徴としている。
の電極６、９と、液体の収容に適した分離した区画とを
有し、それぞれ少なくとも１つの区画内に達するかまた
は１つの区画に接するかする任意の形状の対向した２つ
のレドックス電極６、９の間に１つのキャリア１が存在
し、該キャリアは少なくとも１個の開口３を有し且つそ
れぞれ少なくとも２つの区画を互いに切離していること
を特徴としている。
【００２６】前記装置はキャリア１の片側または両側
に、液体添加、液体貯蔵および場合により液体交換を可
能にすると共にキャリアと電極との間に細胞、小胞、そ
の他の生体オルガネラまたはそれらの一部を添加するこ
とを可能とする手段を有しているのが好ましい。開口３
はチップ上に電位差が存在する場合に電極６、９を介
し、開口に接近するにしたがって徐々に強くなり、開口
近傍において小胞、細胞、細胞片または生体オルガネラ
を電気泳動によって開口に向かって移動させることので
きる不均質な電界が開口の周囲に形成されるような直径
を有している。さらにその他に、キャリア１は生体膜を
引き付ける帯電した表面５を有するかまたは表面と細
胞、小胞、膜片または生体オルガネラとの分子固有の結
合もしくは多価イオンを介した結合を可能にする表面５
を有しているのが好ましい。こうしたキャリアはたとえ
ば酸化層またはオキシ窒化層でコーティングされたシリ
コンキャリアチップである。帯電した表面５は修飾、特
にポリカチオンおよび／またはシランたとえばアミノシ
ランによる修飾によってもつくりだすことが可能であ
り、あるいはキャリアを帯電した表面５でコーティング
２することも可能である。キャリア１はさらにその表面
の修飾前にまたはその直接の利用前に酸素プラズマ中で
浄化され、部分的または全面的に親水化することができ
る。
に、液体添加、液体貯蔵および場合により液体交換を可
能にすると共にキャリアと電極との間に細胞、小胞、そ
の他の生体オルガネラまたはそれらの一部を添加するこ
とを可能とする手段を有しているのが好ましい。開口３
はチップ上に電位差が存在する場合に電極６、９を介
し、開口に接近するにしたがって徐々に強くなり、開口
近傍において小胞、細胞、細胞片または生体オルガネラ
を電気泳動によって開口に向かって移動させることので
きる不均質な電界が開口の周囲に形成されるような直径
を有している。さらにその他に、キャリア１は生体膜を
引き付ける帯電した表面５を有するかまたは表面と細
胞、小胞、膜片または生体オルガネラとの分子固有の結
合もしくは多価イオンを介した結合を可能にする表面５
を有しているのが好ましい。こうしたキャリアはたとえ
ば酸化層またはオキシ窒化層でコーティングされたシリ
コンキャリアチップである。帯電した表面５は修飾、特
にポリカチオンおよび／またはシランたとえばアミノシ
ランによる修飾によってもつくりだすことが可能であ
り、あるいはキャリアを帯電した表面５でコーティング
２することも可能である。キャリア１はさらにその表面
の修飾前にまたはその直接の利用前に酸素プラズマ中で
浄化され、部分的または全面的に親水化することができ
る。
【００２７】特別な配置に基づき本発明に基づく測定装
置は物理的境界を備えた区画を有する必要がない。
置は物理的境界を備えた区画を有する必要がない。
【００２８】好ましい実施形態の測定装置においてそれ
ぞれ１つの電極とキャリア１の少なくとも１個の開口３
とはスペーサ７，１０に設けられた通路またはチャンバ
８を経て、開いたもしくは閉じた区画を形成しつつ互い
に連結されている。
ぞれ１つの電極とキャリア１の少なくとも１個の開口３
とはスペーサ７，１０に設けられた通路またはチャンバ
８を経て、開いたもしくは閉じた区画を形成しつつ互い
に連結されている。
【００２９】また３つ以上の電極６、９と２個以上の開
口３とを設け、少なくとも１つの電極たとえば１つの基
準電極が２個以上の開口３を介した測定に利用されるか
または測定装置が２個以上の開口３と開口３の倍の数の
電極６、９とを有し、それぞれ２つの電極６、９の間に
１個の開口３が配置されるようにすることもできる。
口３とを設け、少なくとも１つの電極たとえば１つの基
準電極が２個以上の開口３を介した測定に利用されるか
または測定装置が２個以上の開口３と開口３の倍の数の
電極６、９とを有し、それぞれ２つの電極６、９の間に
１個の開口３が配置されるようにすることもできる。
【００３０】さらに区画をチューブを経てポンプシステ
ムまたは、静水圧ベースまたはピエゾドロップ方式ない
しインキジェット方式またはコンタクトトランスファー
方式または電気浸透方式または温度制御方式で作動する
器具と連結し、液体ないし試料を任意の区画に添加しも
しくは交換し得るようにすることができる。
ムまたは、静水圧ベースまたはピエゾドロップ方式ない
しインキジェット方式またはコンタクトトランスファー
方式または電気浸透方式または温度制御方式で作動する
器具と連結し、液体ないし試料を任意の区画に添加しも
しくは交換し得るようにすることができる。
【００３１】また本発明に基づく測定装置を試料の分
離、特に毛管電気泳動（ＣＥ）およびＨＰＬＣを行なう
装置と連結して、分離された物質の分析に利用し、また
は該測定装置に区画内液位を連続的もしくは定期的にチ
ェックするための手段ならびに前以って適宜調整された
注入パラメータを再調整するための手段を装備すること
も可能である。
離、特に毛管電気泳動（ＣＥ）およびＨＰＬＣを行なう
装置と連結して、分離された物質の分析に利用し、また
は該測定装置に区画内液位を連続的もしくは定期的にチ
ェックするための手段ならびに前以って適宜調整された
注入パラメータを再調整するための手段を装備すること
も可能である。
【００３２】さらに別途の実施形態においてキャリア１
の表面５を親水性領域と疎水性領域とが生ずるように構
造化し且つ親水性領域が好ましくは開口周囲に位置する
ようにすることが可能である。
の表面５を親水性領域と疎水性領域とが生ずるように構
造化し且つ親水性領域が好ましくは開口周囲に位置する
ようにすることが可能である。
【００３３】前記測定装置はたとえば以下に詳細に述べ
る測定に使用することができる： 作用物質スクリーニング： 本発明は組合わせの化学によってそれぞれ少量で作製可
能な多数の潜在的リガンドのプロービングに特に適して
いる。他方、多くのレセプター蛋白質、特にリガンド制
御レセプターおよびＧ蛋白質結合レセプターも非常に限
定された量であれ入手可能である。本発明に基づく方法
ないし本発明に基づく測定レイアウト／測定装置によっ
て、直接にかまたは小胞ないし脂質膜のレセプター蛋白
質を前以って単離／再構成した後に非常にわずかな細胞
で作業を行なうことが可能である。アレイ中のセンサエ
レメントの配列が複雑でないことから種々の物質または
レセプターを時間的に同時にセレクトすることが可能で
ある。またその他に、脂質小胞のレセプター純化および
再構成を本発明に基づく装置にオプショナルに組入れる
ことのできるオンチップ・コンテナ中でマイクロクロマ
トグラフィーによって行なうことが可能である。
る測定に使用することができる： 作用物質スクリーニング： 本発明は組合わせの化学によってそれぞれ少量で作製可
能な多数の潜在的リガンドのプロービングに特に適して
いる。他方、多くのレセプター蛋白質、特にリガンド制
御レセプターおよびＧ蛋白質結合レセプターも非常に限
定された量であれ入手可能である。本発明に基づく方法
ないし本発明に基づく測定レイアウト／測定装置によっ
て、直接にかまたは小胞ないし脂質膜のレセプター蛋白
質を前以って単離／再構成した後に非常にわずかな細胞
で作業を行なうことが可能である。アレイ中のセンサエ
レメントの配列が複雑でないことから種々の物質または
レセプターを時間的に同時にセレクトすることが可能で
ある。またその他に、脂質小胞のレセプター純化および
再構成を本発明に基づく装置にオプショナルに組入れる
ことのできるオンチップ・コンテナ中でマイクロクロマ
トグラフィーによって行なうことが可能である。
【００３４】＜従来のパッチクランプ技法の代替：＞
すでに冒頭で言及したように従来のパッチクランプ技法
は膜レセプターの機能性検査ならびに細胞内の信号プロ
セス／代謝プロセスに対する応答としての膜特性変化の
検査の基礎を形成している。たとえば形質転換細胞の場
合がしばしばそうであるように、均質な細胞集団の単離
された細胞が検査対象として利用される場合には、本発
明に基づく方法をパッククランプ技法と少なくとも同等
な代替法として使用することができる。この方法の検査
対象として適しているのはたとえば解離されたニューロ
ン、培養された哺乳動物細胞系ならびに植物プロトプラ
ストである。
は膜レセプターの機能性検査ならびに細胞内の信号プロ
セス／代謝プロセスに対する応答としての膜特性変化の
検査の基礎を形成している。たとえば形質転換細胞の場
合がしばしばそうであるように、均質な細胞集団の単離
された細胞が検査対象として利用される場合には、本発
明に基づく方法をパッククランプ技法と少なくとも同等
な代替法として使用することができる。この方法の検査
対象として適しているのはたとえば解離されたニューロ
ン、培養された哺乳動物細胞系ならびに植物プロトプラ
ストである。
【００３５】＜ポータブルバイオセンサ／環境分析：＞
本発明に基づく測定システムの卓越した機構的安定性な
いし実際に自動的な膜構成によりバイオセンサでの該シ
ステムの使用が可能である。適切な形質転換細胞または
小胞中で再構成されたレセプターまたはチャネル形成蛋
白質の使用によって、非常にさまざまな物質ないし代謝
産物に対して敏感なセンサを構成することができる。こ
の場合、本発明に基づく装置によって達成されるよう
に、膜シール（seal formation）が非常に良好であれ
ば、感度は基本的にレセプターの結合定数のみに依存
し、たとえばＧ蛋白質結合レセプターの場合には１ナノ
モル以下、イオノトロープレセプター（たとえば、５
ＨＴ３、ｎＡＣｈＲ、ＧＡＢＡＡＲ、グリシンＲ、Ｇｌ
ｕＲ）の場合にはナノモル範囲内にあり得る（North,
R.A. (1994), Ligand-and voltage-gated ion channel
s, CRC Press; Peroutka, S. J. (1991), Serotonin re
ceptor subtypes―Basic and clinical aspects, New Y
ork, John Willey & Sons; Peroutka, S. J. (1994), G
Protein coupled receptors、CRC Press; Conley,E.C.
(1996), The ion channel facts book, Academic Pres
s）。
いし実際に自動的な膜構成によりバイオセンサでの該シ
ステムの使用が可能である。適切な形質転換細胞または
小胞中で再構成されたレセプターまたはチャネル形成蛋
白質の使用によって、非常にさまざまな物質ないし代謝
産物に対して敏感なセンサを構成することができる。こ
の場合、本発明に基づく装置によって達成されるよう
に、膜シール（seal formation）が非常に良好であれ
ば、感度は基本的にレセプターの結合定数のみに依存
し、たとえばＧ蛋白質結合レセプターの場合には１ナノ
モル以下、イオノトロープレセプター（たとえば、５
ＨＴ３、ｎＡＣｈＲ、ＧＡＢＡＡＲ、グリシンＲ、Ｇｌ
ｕＲ）の場合にはナノモル範囲内にあり得る（North,
R.A. (1994), Ligand-and voltage-gated ion channel
s, CRC Press; Peroutka, S. J. (1991), Serotonin re
ceptor subtypes―Basic and clinical aspects, New Y
ork, John Willey & Sons; Peroutka, S. J. (1994), G
Protein coupled receptors、CRC Press; Conley,E.C.
(1996), The ion channel facts book, Academic Pres
s）。
【００３６】本発明に基づく測定方法は以下の周知の測
定原理を基礎としている： 膜透過イオンチャネルまたはイオノトロープレセプター
の電気的特性は一般にいわゆる電位固定技法（たとえ
ば、古典的な電位固定、パッチクランプおよび卵母細胞
電位固定）で特徴づけられる（以下参照、Hamill, Mart
y et al., 1981 a.a.o; J. G. Nicholls, A. R. Martin
et al. (1992), From neuron to brain:acellular and
molecular approach to the function of the nervous
system、Sunderland, Ma., Sinauer Associates, In
c.）。このため当該イオンチャネルを含む膜に電位差が
印加され、同時に、この電位差を保持するために必要な
電流が分析される。この分析は、Ｖ＝Ｉ×ＲないしＩ＝
Ｖ／Ｒで表わされるオームの法則にしたがい、導電率に
関するデータおよび、それと―ただし一義的ではないが
―結びついて、チャネル形成蛋白質のコンフォメーショ
ン状態に関するデータをもたらす。これからリガンド結
合結果、電圧依存性などを求めることができる。
定原理を基礎としている： 膜透過イオンチャネルまたはイオノトロープレセプター
の電気的特性は一般にいわゆる電位固定技法（たとえ
ば、古典的な電位固定、パッチクランプおよび卵母細胞
電位固定）で特徴づけられる（以下参照、Hamill, Mart
y et al., 1981 a.a.o; J. G. Nicholls, A. R. Martin
et al. (1992), From neuron to brain:acellular and
molecular approach to the function of the nervous
system、Sunderland, Ma., Sinauer Associates, In
c.）。このため当該イオンチャネルを含む膜に電位差が
印加され、同時に、この電位差を保持するために必要な
電流が分析される。この分析は、Ｖ＝Ｉ×ＲないしＩ＝
Ｖ／Ｒで表わされるオームの法則にしたがい、導電率に
関するデータおよび、それと―ただし一義的ではないが
―結びついて、チャネル形成蛋白質のコンフォメーショ
ン状態に関するデータをもたらす。これからリガンド結
合結果、電圧依存性などを求めることができる。
【００３７】イオノトロープ膜蛋白質を通過するイオン
流は膜電圧ＶＭ＝−６０ｍＶにて０．１〜５０ｐＡと一
般に非常にわずかであることから、信号雑音比が許容可
能であるためには発生する漏れ電流の分散は測定される
信号を５〜１０倍下回っていなければならない。この漏
れ電流は基本的に膜とその固定物との間に発生し、あら
ゆる電位固定技法における根本的な重要問題を表わして
いる。
流は膜電圧ＶＭ＝−６０ｍＶにて０．１〜５０ｐＡと一
般に非常にわずかであることから、信号雑音比が許容可
能であるためには発生する漏れ電流の分散は測定される
信号を５〜１０倍下回っていなければならない。この漏
れ電流は基本的に膜とその固定物との間に発生し、あら
ゆる電位固定技法における根本的な重要問題を表わして
いる。
【００３８】この問題はさまざまな方法で解決すること
が可能であり、たとえば測定される膜領域の拡大および
それと共に合算によるイオン電流の増加によって解決す
ることが可能である。但しその際には、まさに生体シス
テムにおいて、特異性が失われることとなる。したがっ
て一般に、たとえばリガンド添加に際し、一義的な判定
データまたはまったく人為の加わらない判定データを得
ることはもはや不可能であろう。
が可能であり、たとえば測定される膜領域の拡大および
それと共に合算によるイオン電流の増加によって解決す
ることが可能である。但しその際には、まさに生体シス
テムにおいて、特異性が失われることとなる。したがっ
て一般に、たとえばリガンド添加に際し、一義的な判定
データまたはまったく人為の加わらない判定データを得
ることはもはや不可能であろう。
【００３９】だが十分な信号雑音差の問題は膜と電極と
の間に非常に高いシール抵抗（ｓｅａｌ）が形成される
ことによっても解決することが可能である。この方式は
本発明に採用されている。このため細胞と小胞に対して
非常に付着力のある表面を有したフラットなキャリアチ
ップが使用される。このチップは測定に際して異なった
電位に固定される２つの区画を分離しており、その中央
には（半）マイクロメーター大の穴が配置されている。
この穴もしくは孔（開口）は基準緩衝液で満たされてお
り、測定のあいだ表面への細胞ないし小胞の強固な結合
によって電気的に密にシールされる。この非常に密な結
合によって非常にわずかな（０．１ｐＡ）イオン電流の
測定も可能となる。
の間に非常に高いシール抵抗（ｓｅａｌ）が形成される
ことによっても解決することが可能である。この方式は
本発明に採用されている。このため細胞と小胞に対して
非常に付着力のある表面を有したフラットなキャリアチ
ップが使用される。このチップは測定に際して異なった
電位に固定される２つの区画を分離しており、その中央
には（半）マイクロメーター大の穴が配置されている。
この穴もしくは孔（開口）は基準緩衝液で満たされてお
り、測定のあいだ表面への細胞ないし小胞の強固な結合
によって電気的に密にシールされる。この非常に密な結
合によって非常にわずかな（０．１ｐＡ）イオン電流の
測定も可能となる。
【００４０】脂質膜を用いた類似の手法―ただしこれは
本発明に基づく表面要件ないし本発明に基づく表面修飾
を備えたキャリアなしで行われた―は膜のシール抵抗が
小さすぎて高感度測定に使用することはできなかった。
ＬＢトランスファーもこれに属している（R. Coronado
and R. Latorre (1983), "Phospholipid bilayers made
from monolayers on patch-clamp pipettes", Biophy.
J. 43(2):231-6; D.P. Nikolelis and C. G. Siontoro
u(1995), "Bilayer lipid membranes for flow injecti
on monitoring of acetylcholine, urea, and penicill
in "Anal. Chem. 67(5):936-44; T. D. Osborn and P.
Yager(1995), "Formation of planar solvent-free pho
spholipid bilayers by lnagmuir-blodgett transfer o
f monolayers to micromachined apertures in silico
n", Langmuir 11(1):8-12; T. D.Osborn and P. Yager
(1995), "Modeling success and failure of Langmuir-
Blodgett transfer of phospholipid bilayers to sili
con dioxide”, Biophys.J. 68(4):1364-73および小胞
展開(P. Nollert, H. Kiefer et al., (1995), “Lipid
vesicle adsorption versus formation of planar bil
ayers on solid surfaces”, Biophys. J. 69(4):1447-
55; J. Radler, H. Strey et al., (1995),“Phenomeno
logy and Kinetics Of Lipid Bilayers Spreading On H
ydrophilicSurfaces”, Langmuir 11(11):4539-4548)。
ミニチュア化された黒膜（ＢＬＭ）構成はEray, Dogan
et al., 1995によって報告されている（以下参照、M. E
ray, N. S. Dogan et al., (1995), “A highly stable
and selective biosensorusing modified nicotinic a
cetylcholine receptor(nAChR)”、Biosystems 35(2-3):
183-8）。
本発明に基づく表面要件ないし本発明に基づく表面修飾
を備えたキャリアなしで行われた―は膜のシール抵抗が
小さすぎて高感度測定に使用することはできなかった。
ＬＢトランスファーもこれに属している（R. Coronado
and R. Latorre (1983), "Phospholipid bilayers made
from monolayers on patch-clamp pipettes", Biophy.
J. 43(2):231-6; D.P. Nikolelis and C. G. Siontoro
u(1995), "Bilayer lipid membranes for flow injecti
on monitoring of acetylcholine, urea, and penicill
in "Anal. Chem. 67(5):936-44; T. D. Osborn and P.
Yager(1995), "Formation of planar solvent-free pho
spholipid bilayers by lnagmuir-blodgett transfer o
f monolayers to micromachined apertures in silico
n", Langmuir 11(1):8-12; T. D.Osborn and P. Yager
(1995), "Modeling success and failure of Langmuir-
Blodgett transfer of phospholipid bilayers to sili
con dioxide”, Biophys.J. 68(4):1364-73および小胞
展開(P. Nollert, H. Kiefer et al., (1995), “Lipid
vesicle adsorption versus formation of planar bil
ayers on solid surfaces”, Biophys. J. 69(4):1447-
55; J. Radler, H. Strey et al., (1995),“Phenomeno
logy and Kinetics Of Lipid Bilayers Spreading On H
ydrophilicSurfaces”, Langmuir 11(11):4539-4548)。
ミニチュア化された黒膜（ＢＬＭ）構成はEray, Dogan
et al., 1995によって報告されている（以下参照、M. E
ray, N. S. Dogan et al., (1995), “A highly stable
and selective biosensorusing modified nicotinic a
cetylcholine receptor(nAChR)”、Biosystems 35(2-3):
183-8）。
【００４１】本発明に基づく方法の重大な点は孔（開
口）上への細胞と小胞との正確なポジショニングであ
る。このポジショニングは本発明に基づく電極配置と電
界集束とによって実現される。測定電極と基準電極との
間の間隔は通例＜６ｍｍであるが、これはもっと大きく
てもよい。その際、測定電極と基準電極とはそれぞれ約
０，２〜３ｍｍ、好ましくは０，５〜２ｍｍ、特に０，
５〜１ｍｍの間隔でキャリアチップの下側と上側に配置
される。電気泳動による開口上への小胞ポジショニング
に効果的な電界をつくりだすクランプ電圧が使用され
る。この電圧は決定的なものではないが、Ｖｃ＝−３０
〜−３００ｍＶ、特に−６０〜−１００ｍＶ、特に好ま
しくは−６０〜−８０ｍＶの範囲内にあるのが通例であ
る。これに基づく電気泳動推進力により小胞および細胞
は、電界にしたがって、正確にチップ穴に向かって移動
させられる。電界Ｅは非常に不均質で、開口に近づくに
したがって非常に強くなることから、小胞は自動的に開
口上に移動させられる。電気泳動効果を有する電界の強
さは特に開口近傍で効果的となることから（開口との距
離＜２００μｍ）、細胞／小胞はこの領域に運び込まれ
るかまたは対流によって同所に達するかせざるを得な
い。このため測定電極にはキャリアチップ穴（開口）に
向かい合った穴（たとえばｄ＜１ｍｍ）を設けることが
できる。
口）上への細胞と小胞との正確なポジショニングであ
る。このポジショニングは本発明に基づく電極配置と電
界集束とによって実現される。測定電極と基準電極との
間の間隔は通例＜６ｍｍであるが、これはもっと大きく
てもよい。その際、測定電極と基準電極とはそれぞれ約
０，２〜３ｍｍ、好ましくは０，５〜２ｍｍ、特に０，
５〜１ｍｍの間隔でキャリアチップの下側と上側に配置
される。電気泳動による開口上への小胞ポジショニング
に効果的な電界をつくりだすクランプ電圧が使用され
る。この電圧は決定的なものではないが、Ｖｃ＝−３０
〜−３００ｍＶ、特に−６０〜−１００ｍＶ、特に好ま
しくは−６０〜−８０ｍＶの範囲内にあるのが通例であ
る。これに基づく電気泳動推進力により小胞および細胞
は、電界にしたがって、正確にチップ穴に向かって移動
させられる。電界Ｅは非常に不均質で、開口に近づくに
したがって非常に強くなることから、小胞は自動的に開
口上に移動させられる。電気泳動効果を有する電界の強
さは特に開口近傍で効果的となることから（開口との距
離＜２００μｍ）、細胞／小胞はこの領域に運び込まれ
るかまたは対流によって同所に達するかせざるを得な
い。このため測定電極にはキャリアチップ穴（開口）に
向かい合った穴（たとえばｄ＜１ｍｍ）を設けることが
できる。
【００４２】あらゆる測定にとって、穴直径ないし開口
直径が小胞または生体細胞の直径よりも遥かに小さい
（ｄZelle，ｄVesikel≫ｄApertur）ことが重要であ
る。したがってｄ＞２μｍの開口には直径ｄ＞２０μｍ
の小胞が使用されるのが好ましい。
直径が小胞または生体細胞の直径よりも遥かに小さい
（ｄZelle，ｄVesikel≫ｄApertur）ことが重要であ
る。したがってｄ＞２μｍの開口には直径ｄ＞２０μｍ
の小胞が使用されるのが好ましい。
【００４３】固有の電気的特性は数学的に以下のように
表わすことができる：環状脂質膜の熱雑音はＲＭ−１／
２に比例している（B. Sakmann and E. Neher (1983),
Single-channel recording, New York,London,Plenum P
ress.）：
表わすことができる：環状脂質膜の熱雑音はＲＭ−１／
２に比例している（B. Sakmann and E. Neher (1983),
Single-channel recording, New York,London,Plenum P
ress.）：
【数１】
【００４４】ＲＭ＝Ｒspec／（πｒＭ ２）であり、した
がって以下の式が導かれる：
がって以下の式が導かれる：
【数２】
【００４５】前記式中でσは実効雑音電流、ｒは半径、
ｆは周波数、ｋはボルツマン定数、Ｒは抵抗、Ｔは温度
を意味している。
ｆは周波数、ｋはボルツマン定数、Ｒは抵抗、Ｔは温度
を意味している。
【００４６】上記で述べたことから、測定目的に成功裏
に使用し得る膜に関する結論として、ｒＭ／（Ｒspec）
1/2は非常に小さくなければならないことが判明する。
これの極小化は本発明により２つの方途、すなわち一方
で膜半径ｒＭの極小化、または他方でさらに、使用され
る膜の電気的に密なシールによって行なうことができ
る。
に使用し得る膜に関する結論として、ｒＭ／（Ｒspec）
1/2は非常に小さくなければならないことが判明する。
これの極小化は本発明により２つの方途、すなわち一方
で膜半径ｒＭの極小化、または他方でさらに、使用され
る膜の電気的に密なシールによって行なうことができ
る。
【００４７】膜の機構的安定性は膜の大きさに依存して
いる。キャリア中の開口の大きさは形成される膜の直径
を制約する。開口および窓は同等な直径を有しているの
が好ましい。膜の偏向に必要とされる力はｒＭ−２に比
例していることから、ｄApertur＜５μｍ、したがって
ｄＭ＜５μｍの構造にあっては、在来のＢＬＭシステム
の場合のｄApertur＞１００μｍという典型的な穴径に
比較して極度の膜安定性向上が生ずることとなる。
いる。キャリア中の開口の大きさは形成される膜の直径
を制約する。開口および窓は同等な直径を有しているの
が好ましい。膜の偏向に必要とされる力はｒＭ−２に比
例していることから、ｄApertur＜５μｍ、したがって
ｄＭ＜５μｍの構造にあっては、在来のＢＬＭシステム
の場合のｄApertur＞１００μｍという典型的な穴径に
比較して極度の膜安定性向上が生ずることとなる。
【００４８】すでに先に論じたように、脂質膜用のキャ
リアは種々の材料から作製することが可能であるが、良
好且つ正確な加工性からしてＳｉ／ＳｉＯ２およびケイ
素／オキシ窒化ケイ素・キャリアが好ましい。
リアは種々の材料から作製することが可能であるが、良
好且つ正確な加工性からしてＳｉ／ＳｉＯ２およびケイ
素／オキシ窒化ケイ素・キャリアが好ましい。
【００４９】脂質膜用キャリア（図１）として使用され
るのが好ましいＳｉ／ＳｉＯ２チップは通例＞２００ｎ
ｍの厚さの酸化物層またはオキシ窒化物層２を有した取
引通例のシリコンウェーハ１から作製することができ
る。構造物はホトリソグラフィーまたは、ｄ＜１，５μ
ｍの開口３の場合には、電子線照射リソグラフィーを行
なった後、ＫＯＨ含有溶媒中でのシリコンの異方性エッ
チングならびに石英層の反応性イオンエッチングによっ
て得られる。図１は当該キャリアの見取り図を示し、図
２は開口を撮影した写真を示している。
るのが好ましいＳｉ／ＳｉＯ２チップは通例＞２００ｎ
ｍの厚さの酸化物層またはオキシ窒化物層２を有した取
引通例のシリコンウェーハ１から作製することができ
る。構造物はホトリソグラフィーまたは、ｄ＜１，５μ
ｍの開口３の場合には、電子線照射リソグラフィーを行
なった後、ＫＯＨ含有溶媒中でのシリコンの異方性エッ
チングならびに石英層の反応性イオンエッチングによっ
て得られる。図１は当該キャリアの見取り図を示し、図
２は開口を撮影した写真を示している。
【００５０】この構造物について重要なのは開口の大き
さであり、これは使用される小胞、細胞ないしオルガネ
ラよりも遥かに小さい必要があろう。開口サイズの減少
は高度なシールの形成にとって好適であるが、他方で開
口周囲の電気的引力圏の縮小を結果する。０．３〜７μ
ｍの開口によって卓越した水準のシール可能性が得られ
る。窓４（図１）のサイズは理想的な場合には開口３の
サイズに減少させられている。
さであり、これは使用される小胞、細胞ないしオルガネ
ラよりも遥かに小さい必要があろう。開口サイズの減少
は高度なシールの形成にとって好適であるが、他方で開
口周囲の電気的引力圏の縮小を結果する。０．３〜７μ
ｍの開口によって卓越した水準のシール可能性が得られ
る。窓４（図１）のサイズは理想的な場合には開口３の
サイズに減少させられている。
【００５１】適切なキャリアチップ材料の選択にあたっ
ては加工性以外にさらに表面の十分な修飾可能性にも配
慮し、表面への小胞または生体細胞の静電結合または所
定の共有結合を可能としなければならない。この点で、
本来の表面修飾を行なう前にキャリアチップを０２プラ
ズマ中で何分間かにわたって処理するのが表面特性の安
定化に非常に寄与することが判明した。
ては加工性以外にさらに表面の十分な修飾可能性にも配
慮し、表面への小胞または生体細胞の静電結合または所
定の共有結合を可能としなければならない。この点で、
本来の表面修飾を行なう前にキャリアチップを０２プラ
ズマ中で何分間かにわたって処理するのが表面特性の安
定化に非常に寄与することが判明した。
【００５２】小胞の強固な付着を保障するため、キャリ
アの表面は場合により定着剤たとえばポリカチオンでコ
ーティングされる（以下参照、Schatten et al., a. a.
O.1975）。物理吸着用にたとえばポリカチオンの水溶
液、たとえば０．１％ポリ−Ｌ−臭化リシン（σ）、Ｍ
Ｗ １０００００を測定直前に２〜５分間にわたってキ
ャリアに与え、続いて測定緩衝液で洗い流すことができ
る。ペプチドポリカチオンの共有結合は石英表面のあら
かじめ活性化されたヒジロキシル基を介し、たとえばト
シルクロリド（トリフェニルクロロメタン）によって行
われるのが好ましい（M. L. Williamson, D. H. Atha e
t al., (1989), “Anti-T2 monoclonalantibody immobi
lization on quartz fibers:stability and recognitio
n of T2mycotoxin”, Analytical Letters 22(4):803-8
16）。
アの表面は場合により定着剤たとえばポリカチオンでコ
ーティングされる（以下参照、Schatten et al., a. a.
O.1975）。物理吸着用にたとえばポリカチオンの水溶
液、たとえば０．１％ポリ−Ｌ−臭化リシン（σ）、Ｍ
Ｗ １０００００を測定直前に２〜５分間にわたってキ
ャリアに与え、続いて測定緩衝液で洗い流すことができ
る。ペプチドポリカチオンの共有結合は石英表面のあら
かじめ活性化されたヒジロキシル基を介し、たとえばト
シルクロリド（トリフェニルクロロメタン）によって行
われるのが好ましい（M. L. Williamson, D. H. Atha e
t al., (1989), “Anti-T2 monoclonalantibody immobi
lization on quartz fibers:stability and recognitio
n of T2mycotoxin”, Analytical Letters 22(4):803-8
16）。
【００５３】キャリア表面の修飾によって負の表面電荷
による小胞の引き付けが実現されるが、これは膜とキャ
リア表面との間の電気的に非常に密なシールにとって完
全に十分なものである。
による小胞の引き付けが実現されるが、これは膜とキャ
リア表面との間の電気的に非常に密なシールにとって完
全に十分なものである。
【００５４】小胞結合ないし細胞結合は分子固有の相互
作用、たとえばビオチン−ストレプタビジンまたはヒス
チジン−ＮＴＡ（ヒスチジン−ニトリロ三酢酸）によっ
ても実現することができる。
作用、たとえばビオチン−ストレプタビジンまたはヒス
チジン−ＮＴＡ（ヒスチジン−ニトリロ三酢酸）によっ
ても実現することができる。
【００５５】前記のポリカチオンの使用に代えて所望の
ｐＨ範囲のカチオン特性を有したその他の化合物、たと
えば４−アミノブチル−ジメチル−メトキシシランによ
って表面を修飾することも可能である。
ｐＨ範囲のカチオン特性を有したその他の化合物、たと
えば４−アミノブチル−ジメチル−メトキシシランによ
って表面を修飾することも可能である。
【００５６】ＳｉＯ２表面と小胞との電気的に密な結合
をつくりだすもう一つの可能性は測定緩衝液にＣａ２＋
イオンを添加することである。この場合、小胞が開口上
に載置された後、Ｃａ２＋濃度が＞２ｍＭに引き上げら
れる。図１１は膜の即時の電気的シールを示している。
をつくりだすもう一つの可能性は測定緩衝液にＣａ２＋
イオンを添加することである。この場合、小胞が開口上
に載置された後、Ｃａ２＋濃度が＞２ｍＭに引き上げら
れる。図１１は膜の即時の電気的シールを示している。
【００５７】電圧が僅かな場合（Ｖｃ＜２００ｍＶ、特
に−２００〜２００ｍＶ）に小胞または細胞の電気泳動
ポジショニング用の強い電界をつくりだすためには、電
極間の間隔を小さくした（Ｄ＜５ｍｍ）構成が好適であ
ることが判明した。
に−２００〜２００ｍＶ）に小胞または細胞の電気泳動
ポジショニング用の強い電界をつくりだすためには、電
極間の間隔を小さくした（Ｄ＜５ｍｍ）構成が好適であ
ることが判明した。
【００５８】電極は区画液中にまで達する球状もしくは
任意の形状の空間域内で開口の周囲に電界強度＞１００
Ｖ／ｍが生ずるような間隔で互いに配置されるのが好適
であり、区画ならびに開口もそのようにして緩衝剤ない
し緩衝液で満たされるのが好適である。
任意の形状の空間域内で開口の周囲に電界強度＞１００
Ｖ／ｍが生ずるような間隔で互いに配置されるのが好適
であり、区画ならびに開口もそのようにして緩衝剤ない
し緩衝液で満たされるのが好適である。
【００５９】以下に平面電極を備えた本発明に基づく測
定システムの具体的な構成を述べることとする（図
３）：電極６、たとえば寸法２０×２０×２ｍｍ３の銀
板（たとえば、純度＞９９．９８％Ａｇ、ただしこれ以
下の純度も可能である）はセンサキャリアとして使用さ
れると同時に基準電極としても使用される。この電極上
に、たとえば厚さ０．５〜２ｍｍのシリコンゴムガスケ
ット（Sylgard 184, Dow Corning, USA）のスペーサ７
を介して正しい間隔で平行に本来の膜キャリアチップ１
がポジショニングされる。このスペーサは幅約１ｍｍ、
長さ＜６ｍｍの通路（ないしチャンバ）８―これはたと
えば押し抜きによってつくることができる―を有し、該
通路は緩衝液で満たされて開口３ないし膜と基準電極６
との間の接触をつくりだす。基準電極たとえば好ましく
はＡｇ／ＡｇＣｌ電極をつくりだすため、前記通路はた
とえば１ＭのＨＣｌで満たされ、通路内に露出している
銀が電圧下たとえばＶ＝０．８Ｖにて９０秒にわたって
塩素化される。キャリアチップ１はその下側を緩衝液で
濡らした後、基準緩衝液で満たされた通路８上に載置さ
れる。
定システムの具体的な構成を述べることとする（図
３）：電極６、たとえば寸法２０×２０×２ｍｍ３の銀
板（たとえば、純度＞９９．９８％Ａｇ、ただしこれ以
下の純度も可能である）はセンサキャリアとして使用さ
れると同時に基準電極としても使用される。この電極上
に、たとえば厚さ０．５〜２ｍｍのシリコンゴムガスケ
ット（Sylgard 184, Dow Corning, USA）のスペーサ７
を介して正しい間隔で平行に本来の膜キャリアチップ１
がポジショニングされる。このスペーサは幅約１ｍｍ、
長さ＜６ｍｍの通路（ないしチャンバ）８―これはたと
えば押し抜きによってつくることができる―を有し、該
通路は緩衝液で満たされて開口３ないし膜と基準電極６
との間の接触をつくりだす。基準電極たとえば好ましく
はＡｇ／ＡｇＣｌ電極をつくりだすため、前記通路はた
とえば１ＭのＨＣｌで満たされ、通路内に露出している
銀が電圧下たとえばＶ＝０．８Ｖにて９０秒にわたって
塩素化される。キャリアチップ１はその下側を緩衝液で
濡らした後、基準緩衝液で満たされた通路８上に載置さ
れる。
【００６０】測定ないし膜作製にあたって測定液ないし
小胞液は直接キャリアチップ１の上側の開口３ないし窓
４かまたは測定電極９の上側に、たとえば約５〜１０μ
ｌの体積Ｖにて与えられる。障害発生を極小化するため
開口３の周辺域をたとえばｒ＝１ｍｍの間隔でシリコン
リング１０（Sylgaard）によって囲むことができる。こ
のリング１０はチップと測定電極との間に形成されるメ
ニスカスと共に試料チャンバ（試料区画）を形成する。
たとえば厚さ０．８ｍｍの塩素化された正方形銀板（た
とえば４×４ｍｍ２）から成る測定電極９、特にリング
状銀板（たとえばｄ＝２ｍｍ）から成る測定電極９は好
ましくは約１ｍｍまでの間隔を置いて特にチップ表面と
平行にポジショニングされるが、その際、細胞液添加な
いし小胞液添加および測定液添加のために該電極に設け
られた好ましくは漏斗状の穴１１（ｄｍｉｎ＝０．４−
１ｍｍ）はキャリアチップ１のマイクロ開口３に対して
正確に同心的にポジショニングされるのが好適である。
この測定電極にはその上側と下側にそれぞれ、添加穴１
１の形成に寄与するスペーサ１２を設けることができ
る。
小胞液は直接キャリアチップ１の上側の開口３ないし窓
４かまたは測定電極９の上側に、たとえば約５〜１０μ
ｌの体積Ｖにて与えられる。障害発生を極小化するため
開口３の周辺域をたとえばｒ＝１ｍｍの間隔でシリコン
リング１０（Sylgaard）によって囲むことができる。こ
のリング１０はチップと測定電極との間に形成されるメ
ニスカスと共に試料チャンバ（試料区画）を形成する。
たとえば厚さ０．８ｍｍの塩素化された正方形銀板（た
とえば４×４ｍｍ２）から成る測定電極９、特にリング
状銀板（たとえばｄ＝２ｍｍ）から成る測定電極９は好
ましくは約１ｍｍまでの間隔を置いて特にチップ表面と
平行にポジショニングされるが、その際、細胞液添加な
いし小胞液添加および測定液添加のために該電極に設け
られた好ましくは漏斗状の穴１１（ｄｍｉｎ＝０．４−
１ｍｍ）はキャリアチップ１のマイクロ開口３に対して
正確に同心的にポジショニングされるのが好適である。
この測定電極にはその上側と下側にそれぞれ、添加穴１
１の形成に寄与するスペーサ１２を設けることができ
る。
【００６１】基準緩衝剤／測定緩衝剤の充填時および貯
蔵時の毛管力の利用により本システムは液体貯蔵に関す
るその開放性にもかかわらず機構的に非常に安定であ
る。閉鎖システムの場合にたとえば温度差によって発生
し得るような静水圧差による膜の障害はこの開放性によ
って排除される。
蔵時の毛管力の利用により本システムは液体貯蔵に関す
るその開放性にもかかわらず機構的に非常に安定であ
る。閉鎖システムの場合にたとえば温度差によって発生
し得るような静水圧差による膜の障害はこの開放性によ
って排除される。
【００６２】もう一つの実現形態は点状電極ないし線状
電極を使用している（図４）：この場合、表面修飾さ
れ、場合により特にフラットなホルダーたとえばガラス
ホルダーまたはテフロンホルダー上に固定されたチップ
１はチップ１の上側と下側とに配置され、場合により外
側に（端面を除いて）保護層１１特にテフロン層を備え
た、たとえば直径ｄ＝０．１〜２ｍｍ（保護層を除く）
の２本の銀線ないし銀電極６、９の塩素化された端面１
０の間に配置される（電極６−電極９の間隔はたとえば
４ｍｍ）。ピペットまたはチップ近傍に取付けられたチ
ューブまたは以下に挙げる試料ハンドリングシステムの
いずれかにより緩衝液がチップの両側に与えられ、毛管
力によってチップと電極との間に保持される。オフセッ
トキャリブレーションと通例Ｖ＝−６０〜−１００ｍＶ
の適切な電圧を印加した後、小胞／細胞がピペットまた
はさらに別なチューブまたは以下に挙げる試料ハンドリ
ングシステムのいずれかを用い、修飾されたチップ面に
与えられる。電気パラメータの変化に基づいて小胞結合
および膜形成が追跡される。
電極を使用している（図４）：この場合、表面修飾さ
れ、場合により特にフラットなホルダーたとえばガラス
ホルダーまたはテフロンホルダー上に固定されたチップ
１はチップ１の上側と下側とに配置され、場合により外
側に（端面を除いて）保護層１１特にテフロン層を備え
た、たとえば直径ｄ＝０．１〜２ｍｍ（保護層を除く）
の２本の銀線ないし銀電極６、９の塩素化された端面１
０の間に配置される（電極６−電極９の間隔はたとえば
４ｍｍ）。ピペットまたはチップ近傍に取付けられたチ
ューブまたは以下に挙げる試料ハンドリングシステムの
いずれかにより緩衝液がチップの両側に与えられ、毛管
力によってチップと電極との間に保持される。オフセッ
トキャリブレーションと通例Ｖ＝−６０〜−１００ｍＶ
の適切な電圧を印加した後、小胞／細胞がピペットまた
はさらに別なチューブまたは以下に挙げる試料ハンドリ
ングシステムのいずれかを用い、修飾されたチップ面に
与えられる。電気パラメータの変化に基づいて小胞結合
および膜形成が追跡される。
【００６３】一般的に述べた測定装置ならびに詳しく述
べた実現例は統合されて試料ハンドリングシステムが増
設されたシステムに基本的に適している。このハンドリ
ングシステムに数え入れられるのは、たとえばポンプ、
静水圧差、電気浸透効果、圧電効果および温度効果また
は機械的変位をベースとして定まった液量を記述した構
成の液体区画内におよび／または同区画外に輸送するこ
とのできる液体輸送システムである。同時に、多重開口
チップによるかまたは１個の開口を有した複数のキャリ
アチップを用い、記述した構成を容易に並列することが
可能である。
べた実現例は統合されて試料ハンドリングシステムが増
設されたシステムに基本的に適している。このハンドリ
ングシステムに数え入れられるのは、たとえばポンプ、
静水圧差、電気浸透効果、圧電効果および温度効果また
は機械的変位をベースとして定まった液量を記述した構
成の液体区画内におよび／または同区画外に輸送するこ
とのできる液体輸送システムである。同時に、多重開口
チップによるかまたは１個の開口を有した複数のキャリ
アチップを用い、記述した構成を容易に並列することが
可能である。
【００６４】膜として適した巨大一枚膜胞（Ｇｉａｎｔ
Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ，ＧＵ
Ｖ）は水和法によって作製することが可能である（H.
H. Hub,U. Zimmermann et al., (1982), “Preparation
of large unilamellar vesicles”, FEBS Lett. 140
(2):254-256; P. Mueller, T. F. Chien et al., (198
3),"Formation and properties of cell-size lipid bi
layer vesicles", Biophys. J. 44(3):375-81; K. Akas
hi, H. Miyata et al., (1996), "Preparation ofgiant
liposomes in physiological cnditions and their ch
aracterization under an optical microscope", Bioph
ys. J. 71(6):3242-50）。修飾が適切であればこの方法
によりプロテオリポソームを作製することも可能である
（M. Criado and B. U. Keller (1987), “A membrane
fusion strategy for single-channel recordings of m
embranes usually non-accessible to patch-clamp pip
etteelectrodes”, FEBS Lett. 224(1):172-6; B. U. K
eller, R.Hedrich et al.,(1988), “Single channel r
ecordings of reconstituted ion channel proteins:an
improved technique”, Pflugers Arch 411(1):94-10
0）。
Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ，ＧＵ
Ｖ）は水和法によって作製することが可能である（H.
H. Hub,U. Zimmermann et al., (1982), “Preparation
of large unilamellar vesicles”, FEBS Lett. 140
(2):254-256; P. Mueller, T. F. Chien et al., (198
3),"Formation and properties of cell-size lipid bi
layer vesicles", Biophys. J. 44(3):375-81; K. Akas
hi, H. Miyata et al., (1996), "Preparation ofgiant
liposomes in physiological cnditions and their ch
aracterization under an optical microscope", Bioph
ys. J. 71(6):3242-50）。修飾が適切であればこの方法
によりプロテオリポソームを作製することも可能である
（M. Criado and B. U. Keller (1987), “A membrane
fusion strategy for single-channel recordings of m
embranes usually non-accessible to patch-clamp pip
etteelectrodes”, FEBS Lett. 224(1):172-6; B. U. K
eller, R.Hedrich et al.,(1988), “Single channel r
ecordings of reconstituted ion channel proteins:an
improved technique”, Pflugers Arch 411(1):94-10
0）。
【００６５】チップに対する小胞の電気的に密な結合を
保障するため、キャリア表面とは逆の小胞表面の正味帯
電が必要である。小胞表面は、膜に組み込まれた蛋白質
の生理学的状態をできるだけ保障するために、たとえば
パルミトイルオレイルホスファチドイルグリセロール
（ＰＯＰＧ）によって負に帯電させることができる。
保障するため、キャリア表面とは逆の小胞表面の正味帯
電が必要である。小胞表面は、膜に組み込まれた蛋白質
の生理学的状態をできるだけ保障するために、たとえば
パルミトイルオレイルホスファチドイルグリセロール
（ＰＯＰＧ）によって負に帯電させることができる。
【００６６】ポジショニングの後、細胞ないし小胞は、
それらが自発的に破裂しない場合には、たとえば低張溶
媒たとえば純水での処理によって破壊することができ
る。
それらが自発的に破裂しない場合には、たとえば低張溶
媒たとえば純水での処理によって破壊することができ
る。
【００６７】本発明に基づくフラットタイプの測定装置
はそれと結びついた短い拡散時間によって「多孔パッ
チ」技法の使用にも特に適している（R. Horn and A. M
arty (1988), “Muscarinic activation of ionic curr
ents measured by a new whole-cell recording metho
d”, J. Gen. Physiol. 92(2):145-59; J. Rae, K. Coo
per et al., (1991), “Low access resistance perfor
ated patch recordings using amphotericin B.”, J.
Neurosci. Methods. 37(1):15-26）。これらの技法にお
いて、細胞内容（サイトゾル）への化学的結合は通例ガ
ラスピペットに付着している膜片に孔形成抗生物質を浸
透させることによって達成される。この方法のメリット
は同時に電気的な利用を実現しつつ測定緩衝液でサイト
ゾルを洗い流す必要がないということである。
はそれと結びついた短い拡散時間によって「多孔パッ
チ」技法の使用にも特に適している（R. Horn and A. M
arty (1988), “Muscarinic activation of ionic curr
ents measured by a new whole-cell recording metho
d”, J. Gen. Physiol. 92(2):145-59; J. Rae, K. Coo
per et al., (1991), “Low access resistance perfor
ated patch recordings using amphotericin B.”, J.
Neurosci. Methods. 37(1):15-26）。これらの技法にお
いて、細胞内容（サイトゾル）への化学的結合は通例ガ
ラスピペットに付着している膜片に孔形成抗生物質を浸
透させることによって達成される。この方法のメリット
は同時に電気的な利用を実現しつつ測定緩衝液でサイト
ゾルを洗い流す必要がないということである。
【００６８】本発明に基づき、生体細胞または、特別な
状況下にあっては小胞も（この場合、その機構的安定性
は十分に高度なものでなければならない）開口上側に結
合された後、孔形成剤たとえばアムホテリシンＢまたは
ニスタチンを基準区画内に与えることができる。この場
合、開口を覆う膜パッチの穿孔速度は同等なパッチクラ
ンプ技法の場合よりも遥かに大である。
状況下にあっては小胞も（この場合、その機構的安定性
は十分に高度なものでなければならない）開口上側に結
合された後、孔形成剤たとえばアムホテリシンＢまたは
ニスタチンを基準区画内に与えることができる。この場
合、開口を覆う膜パッチの穿孔速度は同等なパッチクラ
ンプ技法の場合よりも遥かに大である。
【００６９】さらに膜パッチの破壊に際しても、ホール
セル・パッチクランプ技法（ＷＣＲＴ）と同様に、基準
緩衝液を介してより大量の蛋白質を細胞質内に容易に添
加することが可能である。その根拠は測定システムのフ
ラットな構成であり、これがＷＣＲＴに比較してサイト
ゾルないし小胞内容中への大量のマクロ分子の遥かに迅
速な拡散を可能とする（Z. M. Pei, J.M.Ward et al.,
(1996), “A novel chloride channel in Vicia faba g
uard cell vacuoles activated by the serine/threoni
ne kinase,CDPK”, EMBO J. 15(23):6564-74）。
セル・パッチクランプ技法（ＷＣＲＴ）と同様に、基準
緩衝液を介してより大量の蛋白質を細胞質内に容易に添
加することが可能である。その根拠は測定システムのフ
ラットな構成であり、これがＷＣＲＴに比較してサイト
ゾルないし小胞内容中への大量のマクロ分子の遥かに迅
速な拡散を可能とする（Z. M. Pei, J.M.Ward et al.,
(1996), “A novel chloride channel in Vicia faba g
uard cell vacuoles activated by the serine/threoni
ne kinase,CDPK”, EMBO J. 15(23):6564-74）。
【００７０】本発明に基づく測定装置ないし本発明に基
づくポジショニング法は非常に広範な適用可能性を有し
ている。これらは、すでに先に論じた適用可能性以外
に、小胞ないし細胞の分離またはサイズ分析に、また、
たとえば純光学的な検査または顕微注射のための細胞の
ポジショニングにも使用することができる。本システム
により特にたとえばリガンド結合研究におけるイオノト
ロープ膜蛋白質の直接の機能分析が可能である。本シス
テムはそのシンプルな構成、結果の再現性ならびに膜シ
ールの機構的安定性と結びついて特にスクリーニング分
野のバイオセンサにも適しており、この点でパッチクラ
ンプ技法に代わる省コスト・省時間的代替法を表わして
いる。本システムの容易な並列可能性によって本システ
ムは基本的にＨＴＳにも適している。
づくポジショニング法は非常に広範な適用可能性を有し
ている。これらは、すでに先に論じた適用可能性以外
に、小胞ないし細胞の分離またはサイズ分析に、また、
たとえば純光学的な検査または顕微注射のための細胞の
ポジショニングにも使用することができる。本システム
により特にたとえばリガンド結合研究におけるイオノト
ロープ膜蛋白質の直接の機能分析が可能である。本シス
テムはそのシンプルな構成、結果の再現性ならびに膜シ
ールの機構的安定性と結びついて特にスクリーニング分
野のバイオセンサにも適しており、この点でパッチクラ
ンプ技法に代わる省コスト・省時間的代替法を表わして
いる。本システムの容易な並列可能性によって本システ
ムは基本的にＨＴＳにも適している。
【００７１】検査は細胞および小胞を使用して行なうこ
とができるが、また細胞片、細胞オルガネラおよび脂質
膜を使用しても可能である。
とができるが、また細胞片、細胞オルガネラおよび脂質
膜を使用しても可能である。
【００７２】本方法により信号雑音差に優れた、膜抵抗
の記録が可能である。
の記録が可能である。
【００７３】本発明に基づく方法において、測定液もし
くは基準液または双方の液を別の液と交換し、あるいは
分析される物質を測定側および／または基準側の液に加
えることが可能であり、たとえば孔形成剤を一方のまた
は双方の区画に添加し、膜の導電率ないし特定のイオン
に対する膜の透過性を高め、あるいは任意のサイズのプ
ロテオリポソームを同様にして添加し、これを開口３を
覆う膜と融合させ、こうしてその中に含まれている任意
の膜蛋白質の電気的測定または光学的測定を可能とする
ことができる。また開口（３）を覆う膜を構成した後に
膜蛋白質をその中に組み込むことも可能である。
くは基準液または双方の液を別の液と交換し、あるいは
分析される物質を測定側および／または基準側の液に加
えることが可能であり、たとえば孔形成剤を一方のまた
は双方の区画に添加し、膜の導電率ないし特定のイオン
に対する膜の透過性を高め、あるいは任意のサイズのプ
ロテオリポソームを同様にして添加し、これを開口３を
覆う膜と融合させ、こうしてその中に含まれている任意
の膜蛋白質の電気的測定または光学的測定を可能とする
ことができる。また開口（３）を覆う膜を構成した後に
膜蛋白質をその中に組み込むことも可能である。
【００７４】本方法の実施は開口３を覆う膜を光学的、
特に蛍光測定に利用し得るようにして膜の当該測定を実
施するように構成された装置を用いて行なうことも可能
である。
特に蛍光測定に利用し得るようにして膜の当該測定を実
施するように構成された装置を用いて行なうことも可能
である。
【００７５】また、一つのキャリアに設けられた複数の
開口３が使用され、測定が少なくとも２個の開口３を介
して逐次および／または平行して行なわれおよび／また
はキャリア１の一方の側のすべての電極または複数の電
極が一つの共通の電位を有するかもしくはそれらを単一
の電極にまとめるかすることも可能である。
開口３が使用され、測定が少なくとも２個の開口３を介
して逐次および／または平行して行なわれおよび／また
はキャリア１の一方の側のすべての電極または複数の電
極が一つの共通の電位を有するかもしくはそれらを単一
の電極にまとめるかすることも可能である。
【００７６】以下に本方法をいくつかの例に基づいて詳
しく説明することとする。ただしこれらの例は決して本
発明の範囲を制限するものとして解されてはならない。
しく説明することとする。ただしこれらの例は決して本
発明の範囲を制限するものとして解されてはならない。
【００７７】
【実施例】＜小胞形成およびサイズ分離＞
１００μｌのアゾレクチン（Fluka）または卵レシチン
（ＥＰＣ）、５０μｌのパルミトイルオレイルホスファ
チドイルグリセロール（ＰＯＰＧ）、３μｌのジパルミ
トイルホスホチドイルエタノールアミン−ローダミン
（DPPE-Rhodamin）（Molecular Probes, USA）（すべて
クロロホルム中に１０ｍｇ／ｍｌ、アバンチ極性脂質）
と７０μｌのメタノールが回転気化器（Buchi Rotavapo
r R-114）中で４００ｍｍＨｇの低圧にて乾燥され、１
０ｍｌの丸形フラスコ中で膜とされた。続いて真空中に
て１時間培養された後、１０ｍｌのＨ２Ｏまたは、＜１
５０ｍＭ ＫＣｌおよび／または＜６００ｍＭのスクロ
ースまたは好ましくはソルビトールを含んだ１０ｍｌの
緩衝液が加えられた。この過程で形成された小胞は３７
℃にて約１６ｈ後にほぼ透明なミストとして現われた。
小胞は１ｍｌのピペットで吸引され、アジ化ナトリウム
（ＮａＮ３、最終濃度０，２重量％）の（オプショナル
な）添加後４℃にて爾後の使用まで貯蔵保管された。
（ＥＰＣ）、５０μｌのパルミトイルオレイルホスファ
チドイルグリセロール（ＰＯＰＧ）、３μｌのジパルミ
トイルホスホチドイルエタノールアミン−ローダミン
（DPPE-Rhodamin）（Molecular Probes, USA）（すべて
クロロホルム中に１０ｍｇ／ｍｌ、アバンチ極性脂質）
と７０μｌのメタノールが回転気化器（Buchi Rotavapo
r R-114）中で４００ｍｍＨｇの低圧にて乾燥され、１
０ｍｌの丸形フラスコ中で膜とされた。続いて真空中に
て１時間培養された後、１０ｍｌのＨ２Ｏまたは、＜１
５０ｍＭ ＫＣｌおよび／または＜６００ｍＭのスクロ
ースまたは好ましくはソルビトールを含んだ１０ｍｌの
緩衝液が加えられた。この過程で形成された小胞は３７
℃にて約１６ｈ後にほぼ透明なミストとして現われた。
小胞は１ｍｌのピペットで吸引され、アジ化ナトリウム
（ＮａＮ３、最終濃度０，２重量％）の（オプショナル
な）添加後４℃にて爾後の使用まで貯蔵保管された。
【００７８】この方法に基づく脂質小胞の作製は大部分
（＞９０％）が２５０μｍまでのサイズの一枚膜小胞を
結果した（図５）。小胞の一部はさらにより小さな小胞
を含んでいたが、これらは膜形成に関係していなかっ
た。表面を電気的に密にシールする膜の構成に純化され
た小胞を使用するにはいっさいの小胞と１０μｍ以下で
あった脂質不純物との分離が必要であった。分離が不十
分な場合には開口近傍における小さな小胞の結合によっ
て反発効果が生じ、これが大きな小胞（＞１０μｍ）に
よる電気的に密な開口シールを妨げた。小胞は孔径２０
μｍのナイロンネットによる＞２０ｈの透析によってサ
イズ分離された；必要な場合には、脂質組成が適切であ
れば、温度を≦４℃、特に１℃に降下させることによっ
て小胞膜の流動性を低下させることができる。小胞膜の
単層性は調整が適切であればアラメチシンの添加（これ
については以下参照、R. B. Gennis (1989), “Biomemb
ranes: molecular structcure and function”, New Yo
rk, Berlin, Heidelberg, Springer Verlag）（図１２
に図示）と共焦点顕微鏡分析によって補強することがで
きる（図６）。
（＞９０％）が２５０μｍまでのサイズの一枚膜小胞を
結果した（図５）。小胞の一部はさらにより小さな小胞
を含んでいたが、これらは膜形成に関係していなかっ
た。表面を電気的に密にシールする膜の構成に純化され
た小胞を使用するにはいっさいの小胞と１０μｍ以下で
あった脂質不純物との分離が必要であった。分離が不十
分な場合には開口近傍における小さな小胞の結合によっ
て反発効果が生じ、これが大きな小胞（＞１０μｍ）に
よる電気的に密な開口シールを妨げた。小胞は孔径２０
μｍのナイロンネットによる＞２０ｈの透析によってサ
イズ分離された；必要な場合には、脂質組成が適切であ
れば、温度を≦４℃、特に１℃に降下させることによっ
て小胞膜の流動性を低下させることができる。小胞膜の
単層性は調整が適切であればアラメチシンの添加（これ
については以下参照、R. B. Gennis (1989), “Biomemb
ranes: molecular structcure and function”, New Yo
rk, Berlin, Heidelberg, Springer Verlag）（図１２
に図示）と共焦点顕微鏡分析によって補強することがで
きる（図６）。
【００７９】＜小胞の電気泳動ポジショニング＞
変法１：
各測定の前に電極間のオフセット電圧ＶOffsetが修正さ
れた。このため５μｌの緩衝液が直接開口上に与えら
れ、続いて測定電極がチップ表面に１ｍｍまで接近させ
られた。チップ表面と電極との間に液体メニスカスが形
成された後、オフセット電圧とシステム容量が補償され
た。
れた。このため５μｌの緩衝液が直接開口上に与えら
れ、続いて測定電極がチップ表面に１ｍｍまで接近させ
られた。チップ表面と電極との間に液体メニスカスが形
成された後、オフセット電圧とシステム容量が補償され
た。
【００８０】続いて小胞を含有した分散液１０μｌが測
定電極の上側に与えられ、小胞は測定電極に設けられた
円形穴を通って沈降した。前記測定電極穴を通って移動
した小胞は印加された電極電圧ＶＭ＝−５０〜−８０ｍ
Ｖに対応する電界の影響下で直接開口上に加速移動させ
られた。この場合、達成された集束は無修飾の表面の開
口を通る小胞通過数で測定して窓サイズに依存していた
（窓と称されるのはエッチングによって露出したＳｉＯ
２層部分のことである）（図２）。小さなＳｉＯ２窓
（＜４５×４５μｍ２）が存在する場合には小胞流量は
著しく増加していた。
定電極の上側に与えられ、小胞は測定電極に設けられた
円形穴を通って沈降した。前記測定電極穴を通って移動
した小胞は印加された電極電圧ＶＭ＝−５０〜−８０ｍ
Ｖに対応する電界の影響下で直接開口上に加速移動させ
られた。この場合、達成された集束は無修飾の表面の開
口を通る小胞通過数で測定して窓サイズに依存していた
（窓と称されるのはエッチングによって露出したＳｉＯ
２層部分のことである）（図２）。小さなＳｉＯ２窓
（＜４５×４５μｍ２）が存在する場合には小胞流量は
著しく増加していた。
【００８１】変法２：
各測定の前に電極間のオフセット電圧ＶOffsetが修正さ
れた。このため、チップと測定電極ないし参照電極との
間に５μｌの緩衝液が添加された後、電流フローが消失
する、すなわちＩ（ＶOffset）＝０ｐＡ時の電圧が求め
られた。
れた。このため、チップと測定電極ないし参照電極との
間に５μｌの緩衝液が添加された後、電流フローが消失
する、すなわちＩ（ＶOffset）＝０ｐＡ時の電圧が求め
られた。
【００８２】続いて小胞を含有した分散液３μｌが開口
近傍の測定区画に与えられ、小胞は平行平面電極配置に
おいて測定電極に設けられた円形穴を通って沈降した。
開口近傍（＜２００μｍ）の非常に強い電界（数ｋＶま
でに達する）領域内に達した小胞は電界分布にしたがっ
て直接開口上に加速移動させられ、チップ表面と電気的
に密に結合した後電気分析された。
近傍の測定区画に与えられ、小胞は平行平面電極配置に
おいて測定電極に設けられた円形穴を通って沈降した。
開口近傍（＜２００μｍ）の非常に強い電界（数ｋＶま
でに達する）領域内に達した小胞は電界分布にしたがっ
て直接開口上に加速移動させられ、チップ表面と電気的
に密に結合した後電気分析された。
【００８３】変法１と変法２に述べた電気的ポジショニ
ング法は同様にテストされた細胞／小胞重力沈降法を以
下の点すなわち―必要とされる小胞数ないし細胞数、全
体としての膜形成速度および膜構成ないし細胞結合が成
功する確率―において凌駕していた。
ング法は同様にテストされた細胞／小胞重力沈降法を以
下の点すなわち―必要とされる小胞数ないし細胞数、全
体としての膜形成速度および膜構成ないし細胞結合が成
功する確率―において凌駕していた。
【００８４】＜ＳｉＯ２表面への小胞結合および吸着＞
ポリリシン修飾されたＳｉＯ２表面への前記小胞の結合
が検査された。これは非常に強固で、適切な接近後に
０．５秒以内で生じた。電気的に密なポジショニングの
成功確率は開口サイズ、ＳｉＯ２窓サイズならびに小胞
の数、サイズおよびサイズ分布に非常に依存していた。
ｄApertur＜２μｍの開口と＜４０μｍの窓とを備えた
キャリアチップはｄVersikel＞４０μｍの小胞懸濁液と
コンビネーションされると電気的に密な膜シールの確率
＞９０％（ｎ＞１５、ｎはテスト回数を表わしている）
を結果した。チップ毎および小胞懸濁液の相違毎に生ず
る密な開口シール形成のわずかな変動から、開口サイズ
の縮小ならびに小胞懸濁液の純化の向上に伴って有効開
口シールの高まりが認められるということを推定するこ
とができる。
が検査された。これは非常に強固で、適切な接近後に
０．５秒以内で生じた。電気的に密なポジショニングの
成功確率は開口サイズ、ＳｉＯ２窓サイズならびに小胞
の数、サイズおよびサイズ分布に非常に依存していた。
ｄApertur＜２μｍの開口と＜４０μｍの窓とを備えた
キャリアチップはｄVersikel＞４０μｍの小胞懸濁液と
コンビネーションされると電気的に密な膜シールの確率
＞９０％（ｎ＞１５、ｎはテスト回数を表わしている）
を結果した。チップ毎および小胞懸濁液の相違毎に生ず
る密な開口シール形成のわずかな変動から、開口サイズ
の縮小ならびに小胞懸濁液の純化の向上に伴って有効開
口シールの高まりが認められるということを推定するこ
とができる。
【００８５】表面への小胞の結合に際しこれは引き延ば
されて完全にフラットな形成物となされた（図６および
７）。小胞膜は０．５％ローダミンでマーキングされ
（レッド）、小胞内容はカルボキシフルオレセインでマ
ーキングされた（グリーン）。いっさいのカルボキシフ
ルオレセイン放出の消失（着色はもっぱらローダミンの
赤色を示しており、図６では膜片のグレーとして認めら
れる）はカルボキシフルオレセインの遊離と小胞の破
裂、したがってこれらの膜の単層性を示唆している。こ
の場合にキャリアチップで測定されたＲＭ＞６．４ＧΩ
（ｎ＝２６）という非常に高い膜シール抵抗（シンメト
リック８５ｍＭ ＫＣｌ中）から電気的に見て広範に欠
陥のない脂質膜の形成を推定することができる。ポリリ
シンコーティングされたガラス上での小胞の融合プロセ
スと融合結果とが共焦点顕微鏡（LSM510, Zeiss Jena,
Germany）を用いて検査された。
されて完全にフラットな形成物となされた（図６および
７）。小胞膜は０．５％ローダミンでマーキングされ
（レッド）、小胞内容はカルボキシフルオレセインでマ
ーキングされた（グリーン）。いっさいのカルボキシフ
ルオレセイン放出の消失（着色はもっぱらローダミンの
赤色を示しており、図６では膜片のグレーとして認めら
れる）はカルボキシフルオレセインの遊離と小胞の破
裂、したがってこれらの膜の単層性を示唆している。こ
の場合にキャリアチップで測定されたＲＭ＞６．４ＧΩ
（ｎ＝２６）という非常に高い膜シール抵抗（シンメト
リック８５ｍＭ ＫＣｌ中）から電気的に見て広範に欠
陥のない脂質膜の形成を推定することができる。ポリリ
シンコーティングされたガラス上での小胞の融合プロセ
スと融合結果とが共焦点顕微鏡（LSM510, Zeiss Jena,
Germany）を用いて検査された。
【００８６】シンメトリック１０ｍＭ ＫＣｌ中での同
様な測定シリーズに際し、適切に接近した後の０．２秒
以内の小胞の結合は＞７０％の確率（ｎ＞１５）で測定
され、またＲＭ＞１０ＧΩの膜抵抗が測定された。
様な測定シリーズに際し、適切に接近した後の０．２秒
以内の小胞の結合は＞７０％の確率（ｎ＞１５）で測定
され、またＲＭ＞１０ＧΩの膜抵抗が測定された。
【００８７】＜脂質膜の電気パラメータ＞
小胞と修飾表面との各融合の前に主として開口によって
規定される測定装置の抵抗が測定された。これは８５ｍ
Ｍ ＫＣｌ中で開口サイズに応じ１ＭΩまでに達した
（通常は＜４５０ｋΩ）。これ以上の抵抗は、開口下方
の気泡の封入と同様に、人為結果として評価された。
規定される測定装置の抵抗が測定された。これは８５ｍ
Ｍ ＫＣｌ中で開口サイズに応じ１ＭΩまでに達した
（通常は＜４５０ｋΩ）。これ以上の抵抗は、開口下方
の気泡の封入と同様に、人為結果として評価された。
【００８８】開口上での小胞融合または細胞結合に際し
て形成された膜は同一イオン濃度にてＲＭ＞６．４ＧΩ
の抵抗を有していた。この場合キャリアチップの容量は
わずかに変化したにすぎなかった。数ｐＦ。
て形成された膜は同一イオン濃度にてＲＭ＞６．４ＧΩ
の抵抗を有していた。この場合キャリアチップの容量は
わずかに変化したにすぎなかった。数ｐＦ。
【００８９】１ｍＭ ＫＣｌ中で同様にして実施された
テストにおいて同じく開口サイズに応じ通例１ＭΩまで
の膜構造の抵抗が測定された。同一イオン濃度にて、開
口上に形成された膜の抵抗は通例ＲＭ＞４０ＧΩに達
し、１０ｍＭ ＫＣｌ中では通例ＲＭ＞１０ＧΩに達し
た。キャリアチップの容量はこれらのテストに際しても
わずかに変化したにすぎなかった。１６０−２８０ｐ
Ｆ。
テストにおいて同じく開口サイズに応じ通例１ＭΩまで
の膜構造の抵抗が測定された。同一イオン濃度にて、開
口上に形成された膜の抵抗は通例ＲＭ＞４０ＧΩに達
し、１０ｍＭ ＫＣｌ中では通例ＲＭ＞１０ＧΩに達し
た。キャリアチップの容量はこれらのテストに際しても
わずかに変化したにすぎなかった。１６０−２８０ｐ
Ｆ。
【００９０】＜小胞のマイクロメータ孔通過＞
負に帯電した表面たとえば無修飾のＳｉＯ２層もしくは
開口周囲に融合した小胞が存在する場合には、小胞の開
口通過は抵抗変化に基づいて観察することができる（図
１０）。人為結果をチェックするため電圧は転極された
が、抵抗の変化は観察されなかった。
開口周囲に融合した小胞が存在する場合には、小胞の開
口通過は抵抗変化に基づいて観察することができる（図
１０）。人為結果をチェックするため電圧は転極された
が、抵抗の変化は観察されなかった。
【００９１】１８秒までの長い小胞通過は十分流動的な
膜を有した非常に大きな小胞の通過を推定させる。特
に、ｄ＞５０μｍ（ｎ＝４、ｎは測定数を表わしてい
る）の小胞集団およびｄ＝７μｍの開口を使用した場
合、小胞サイズに応じて振幅変化の固定したほぼ特有の
通過時間変化が観察された。これから、小胞は開口を通
過する際に引き伸ばされて、表面の閉じた、定まった直
径を有するチューブ状の形成物になると推定することが
できる。チューブ長さに反映される小胞サイズは振幅時
間として得ることができる。
膜を有した非常に大きな小胞の通過を推定させる。特
に、ｄ＞５０μｍ（ｎ＝４、ｎは測定数を表わしてい
る）の小胞集団およびｄ＝７μｍの開口を使用した場
合、小胞サイズに応じて振幅変化の固定したほぼ特有の
通過時間変化が観察された。これから、小胞は開口を通
過する際に引き伸ばされて、表面の閉じた、定まった直
径を有するチューブ状の形成物になると推定することが
できる。チューブ長さに反映される小胞サイズは振幅時
間として得ることができる。
【００９２】前記に基づき、大きな小胞（ｄVesikel≫
ｄApertur）に典型的な通過時間と小さな小胞（ｄ
Vesikel〜ｄApertur）に典型的な抵抗振幅変化とを分析
することにより溶液の小胞サイズ構成を決定することが
可能である。これにより本方法はさらに小胞集団および
細胞集団を分析する可能性を切り開くこととなる。
ｄApertur）に典型的な通過時間と小さな小胞（ｄ
Vesikel〜ｄApertur）に典型的な抵抗振幅変化とを分析
することにより溶液の小胞サイズ構成を決定することが
可能である。これにより本方法はさらに小胞集団および
細胞集団を分析する可能性を切り開くこととなる。
【００９３】＜アラメチシン孔とニコチン性アセチルコ
リンレセプターとの観察＞ 本発明に基づくシステムの生物学的機能態様を検証する
ため、８５ｍＭ ＫＣｌ中にて開口を覆う膜が形成され
た後、アラメチシン（緩衝剤中の最終濃度０．１μｇ／
ｍｌ）が測定区画に与えられた（R. B. Gennis (1989),
Biomembranes:molecular structure and function, Ne
w York, Berlin, Heidelberg, Springer Verlag）。ア
ラメチシンに典型的な電流変動（振幅および滞留時間）
の発生―これは約６００ｐＳというアラメチシン孔の導
電率に相当している―は本システムの機能性と高度な感
受性を証明している（図１２）。同じくレセプター蛋白
質たとえばｎＡＣｈＲも―たとえばＣａ２＋を介した―
小さな小胞（small, medium and large unilammelare v
esicles）との融合を経て膜中に取り込まれて測定が可
能である。このためｎＡＣｈＲは純化され、Schurholz
にしたがって小胞中で再構成された（Schurholz, T.,
J. Kehne et al., (1992), “Functional reconstituti
on of the nicotinic acetylcholine receptor by CHAP
S dialysisdepends on the concentrations of salt,li
pid,and protein”, Biochemistry31(21):5067-77; Sch
urholz,T. (1996), “Critical dependence of the sol
ubilization of lipid vesicles by the detergent CHA
PS on the lipid composition. Functional reconstitu
tion of the nicotinic acetylcholine receptor into
preformed vesicles above the critical micellizatio
n concentraion", Biophys Chem 58(1-2):87-96）。こ
れらの小胞は測定区画に与えられ、試料チャンバのＣａ
２＋濃度の＞１ｍＭへの引上げおよび場合により続いて
の一時的な浸透圧勾配の形成による補強（以下参照：Er
ay,Dogan et al., 1995 a.a.O.）によって膜と融合され
た。アゴニストが欠如している場合に典型的なレセプタ
ー開放が認められたが（図１３Ａ）、これはカルバモイ
ルコリン（２０μＭ最終濃度）の添加後短時間のうちに
（ｔ＜１００sec）広範に消失した（図１３Ｂ、脱感
作）。
リンレセプターとの観察＞ 本発明に基づくシステムの生物学的機能態様を検証する
ため、８５ｍＭ ＫＣｌ中にて開口を覆う膜が形成され
た後、アラメチシン（緩衝剤中の最終濃度０．１μｇ／
ｍｌ）が測定区画に与えられた（R. B. Gennis (1989),
Biomembranes:molecular structure and function, Ne
w York, Berlin, Heidelberg, Springer Verlag）。ア
ラメチシンに典型的な電流変動（振幅および滞留時間）
の発生―これは約６００ｐＳというアラメチシン孔の導
電率に相当している―は本システムの機能性と高度な感
受性を証明している（図１２）。同じくレセプター蛋白
質たとえばｎＡＣｈＲも―たとえばＣａ２＋を介した―
小さな小胞（small, medium and large unilammelare v
esicles）との融合を経て膜中に取り込まれて測定が可
能である。このためｎＡＣｈＲは純化され、Schurholz
にしたがって小胞中で再構成された（Schurholz, T.,
J. Kehne et al., (1992), “Functional reconstituti
on of the nicotinic acetylcholine receptor by CHAP
S dialysisdepends on the concentrations of salt,li
pid,and protein”, Biochemistry31(21):5067-77; Sch
urholz,T. (1996), “Critical dependence of the sol
ubilization of lipid vesicles by the detergent CHA
PS on the lipid composition. Functional reconstitu
tion of the nicotinic acetylcholine receptor into
preformed vesicles above the critical micellizatio
n concentraion", Biophys Chem 58(1-2):87-96）。こ
れらの小胞は測定区画に与えられ、試料チャンバのＣａ
２＋濃度の＞１ｍＭへの引上げおよび場合により続いて
の一時的な浸透圧勾配の形成による補強（以下参照：Er
ay,Dogan et al., 1995 a.a.O.）によって膜と融合され
た。アゴニストが欠如している場合に典型的なレセプタ
ー開放が認められたが（図１３Ａ）、これはカルバモイ
ルコリン（２０μＭ最終濃度）の添加後短時間のうちに
（ｔ＜１００sec）広範に消失した（図１３Ｂ、脱感
作）。
【００９４】＜細胞の結合＞
小胞を生体細胞によって置換する場合にもこれらを、使
用された小胞と同様に、ポジショニングし、電気的に特
性決定することが可能である。ただし細胞膜は細胞骨格
によって支持されていることから、細胞が自動的に破裂
するには至らない。したがってこれにより、チップ表面
に細胞が結合した後、セルアタッチド技法（CAT, Hamil
l, Marty et al., a.a.O., 1981）に類似した構成が実
現される。この場合、雑音のない測定を実現するための
前提条件はなかんずく膜表面が相対的にスムーズである
ことである。したがってたとえば植物細胞を使用する場
合には必ず細胞壁が取り去られなければならない。
用された小胞と同様に、ポジショニングし、電気的に特
性決定することが可能である。ただし細胞膜は細胞骨格
によって支持されていることから、細胞が自動的に破裂
するには至らない。したがってこれにより、チップ表面
に細胞が結合した後、セルアタッチド技法（CAT, Hamil
l, Marty et al., a.a.O., 1981）に類似した構成が実
現される。この場合、雑音のない測定を実現するための
前提条件はなかんずく膜表面が相対的にスムーズである
ことである。したがってたとえば植物細胞を使用する場
合には必ず細胞壁が取り去られなければならない。
【００９５】ＣＡＴを出発点として、たとえば開口を覆
う膜パッチの電気的破壊によって細胞膜全体におよぶ電
気的測定（Whole Cell Recording）を実施することがで
きる。孔形成剤たとえばアムホテリシンＢまたはニスタ
チンの添加と、したがって開口を覆う膜パッチの透過孔
形成は同じく全細胞測定にも使用することが可能である
（多孔パッチ技法）。
う膜パッチの電気的破壊によって細胞膜全体におよぶ電
気的測定（Whole Cell Recording）を実施することがで
きる。孔形成剤たとえばアムホテリシンＢまたはニスタ
チンの添加と、したがって開口を覆う膜パッチの透過孔
形成は同じく全細胞測定にも使用することが可能である
（多孔パッチ技法）。
【００９６】さらに、細胞溶解により、サイトゾル膜側
が測定液に曝露されているいわゆるウィズィン−ウィズ
アウト−構成による個別チャネル事象の記録が可能であ
る。 ［図面の簡単な説明］
が測定液に曝露されているいわゆるウィズィン−ウィズ
アウト−構成による個別チャネル事象の記録が可能であ
る。 ［図面の簡単な説明］
【図１】図１はＳｉ／ＳｉＯ２で製造されたキャリアチ
ップの見取り図であり、縮尺ならびに詳細は正確には表
現されていない。
ップの見取り図であり、縮尺ならびに詳細は正確には表
現されていない。
【図２】図２はＳｉＯ２層にエッチングされた開口をさ
まざまな側から撮影した電子顕微鏡写真である：（Ａ）
ＳｉＯ２表面側から撮影した開口（Ｂ）Ｓｉ側から撮影
した開口（Ｃ）ＳｉＯ２側の概観（Ｄ）異方性エッチン
グされたＳｉ側の概観
まざまな側から撮影した電子顕微鏡写真である：（Ａ）
ＳｉＯ２表面側から撮影した開口（Ｂ）Ｓｉ側から撮影
した開口（Ｃ）ＳｉＯ２側の概観（Ｄ）異方性エッチン
グされたＳｉ側の概観
【図３】図３は平行平面電極を備えた測定構成の断面図
であり、縮尺ならびに詳細は正確には表現されていな
い。
であり、縮尺ならびに詳細は正確には表現されていな
い。
【図４】図４は点状電極または線状電極を備えた測定構
成の断面図であり、縮尺ならびに詳細は正確には表現さ
れていない。
成の断面図であり、縮尺ならびに詳細は正確には表現さ
れていない。
【図５】図５は２４時間浄化後のローダミン・マーキン
グされた小胞（膜はナチュラルレッド、図上ではライト
グレー）を示しており、この場合小胞（ｄ＜５μｍ）の
数は非浄化液に比較して大幅に減少した。小胞はカルボ
キシフルオレセイン（ナチュラルグリーン、図上ではミ
ドルグレー）で蛍光マーキングされた２００ｍＭのソル
ビトール溶液を含んでいる。
グされた小胞（膜はナチュラルレッド、図上ではライト
グレー）を示しており、この場合小胞（ｄ＜５μｍ）の
数は非浄化液に比較して大幅に減少した。小胞はカルボ
キシフルオレセイン（ナチュラルグリーン、図上ではミ
ドルグレー）で蛍光マーキングされた２００ｍＭのソル
ビトール溶液を含んでいる。
【図６】図６は引き延ばされて非常にフラットな形成物
とされた、ポリ−Ｌ−リシン・コーティング表面に結合
した後の小胞を示しており、これはカルボキシフルオレ
セイン蛍光を有していない。
とされた、ポリ−Ｌ−リシン・コーティング表面に結合
した後の小胞を示しており、これはカルボキシフルオレ
セイン蛍光を有していない。
【図７】図７は融合された小胞の断面と５μｍの長さの
キャリブレーションバーを示している。
キャリブレーションバーを示している。
【図８】図８は平行電極間の４μｍの開口を備えたチッ
プ周囲の電界分布の有限要素シミュレーション（ＦＥ
Ｍ）を示している。以下がパラメータとして使用され
た：Ｃpuffer＝１０ ｍＭ ＫＣｌ、ｄApertur＝４μ
ｍ、チップ開口（４）―電極（６、９）の間隔＝１ｍ
ｍ。等電位線の間隔は４ｍＶであり、電極間の電位差は
８０ｍＶである。このシミュレーションでは磁力線はキ
ャリアチップ周辺部における漏れ電流の仮定によって楕
円状に歪ませられている（正常：円形）。
プ周囲の電界分布の有限要素シミュレーション（ＦＥ
Ｍ）を示している。以下がパラメータとして使用され
た：Ｃpuffer＝１０ ｍＭ ＫＣｌ、ｄApertur＝４μ
ｍ、チップ開口（４）―電極（６、９）の間隔＝１ｍ
ｍ。等電位線の間隔は４ｍＶであり、電極間の電位差は
８０ｍＶである。このシミュレーションでは磁力線はキ
ャリアチップ周辺部における漏れ電流の仮定によって楕
円状に歪ませられている（正常：円形）。
【図９Ａ】図９Ａは、４μｍの開口（図９Ａ）および７
μｍの開口（図９Ｂ）ならびに１０ｍＭ ＫＣｌ、クラ
ンプ電圧−８０ｍＶ、ＰＬＬコーティングＳｉＯ２表面
（ＰＬＬ＝ポリ−Ｌ−臭化リシン）にて電気シール抵抗
が非常に高い場合の小胞結合と膜形成との時間カーブを
示している。
μｍの開口（図９Ｂ）ならびに１０ｍＭ ＫＣｌ、クラ
ンプ電圧−８０ｍＶ、ＰＬＬコーティングＳｉＯ２表面
（ＰＬＬ＝ポリ−Ｌ−臭化リシン）にて電気シール抵抗
が非常に高い場合の小胞結合と膜形成との時間カーブを
示している。
【図９Ｂ】図９Ｂは、４μｍの開口（図９Ａ）および７
μｍの開口（図９Ｂ）ならびに１０ｍＭ ＫＣｌ、クラ
ンプ電圧−８０ｍＶ、ＰＬＬコーティングＳｉＯ２表面
（ＰＬＬ＝ポリ−Ｌ−臭化リシン）にて電気シール抵抗
が非常に高い場合の小胞結合と膜形成との時間カーブを
示している。
μｍの開口（図９Ｂ）ならびに１０ｍＭ ＫＣｌ、クラ
ンプ電圧−８０ｍＶ、ＰＬＬコーティングＳｉＯ２表面
（ＰＬＬ＝ポリ−Ｌ−臭化リシン）にて電気シール抵抗
が非常に高い場合の小胞結合と膜形成との時間カーブを
示している。
【図１０】図１０はクランプ電圧ＶＣ＝−８０ｍＶ一定
時の７μｍの開口を通る小胞の通過を電流−時間−線図
による変化として表わしている。
時の７μｍの開口を通る小胞の通過を電流−時間−線図
による変化として表わしている。
【図１１】図１１は最終濃度４ｍＭを有したＣａ２＋の
添加が無修飾の開口（７μｍ）に小胞がドッキングした
後にチップ表面と小胞膜との間の電気的に非常に密なシ
ールを結果することを電流−時間−線図で表わしてい
る。
添加が無修飾の開口（７μｍ）に小胞がドッキングした
後にチップ表面と小胞膜との間の電気的に非常に密なシ
ールを結果することを電流−時間−線図で表わしてい
る。
【図１２】図１２は負のポテンシャル時の、チップ上に
作られた膜（ＣAlamethicin＝０．１μｇ／ｍｌ、８５
ｍＭ ＫＣｌ）中のアラメチシン孔の時間・電圧依存開
閉を示している。
作られた膜（ＣAlamethicin＝０．１μｇ／ｍｌ、８５
ｍＭ ＫＣｌ）中のアラメチシン孔の時間・電圧依存開
閉を示している。
【図１３】図１３はｎＡＣｈＲ（ニコチン性アセチルコ
リン受容体）を含んだ小胞との融合後のＳｉ／ＳｉＯ２
キャリアチップ上に作られた膜の膜抵抗の変化を表わし
ている。（Ａ）４００ｍＭ ＫＣｌおよび正のポテンシ
ャルにてリガンドが欠けている場合の偶然的なレセプタ
ー開放。（Ｂ）ｎＡＣｈＲアゴニスト、カルバモイルコ
リン（最終濃度２０μＭ）の添加１５０秒後にはもはや
レセプター開放は観察されない（脱感作）。
リン受容体）を含んだ小胞との融合後のＳｉ／ＳｉＯ２
キャリアチップ上に作られた膜の膜抵抗の変化を表わし
ている。（Ａ）４００ｍＭ ＫＣｌおよび正のポテンシ
ャルにてリガンドが欠けている場合の偶然的なレセプタ
ー開放。（Ｂ）ｎＡＣｈＲアゴニスト、カルバモイルコ
リン（最終濃度２０μＭ）の添加１５０秒後にはもはや
レセプター開放は観察されない（脱感作）。
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フロントページの続き
(72)発明者 フォーゲル、ホルスト
スイス国、シーエイチ − 1028 プレ
ベレンゲ、シュマン・デュ・クロースラ
ット ２
(72)発明者 シュミット、クリスチアン
スイス国、シーエイチ − 1024 エキ
ュブレン、シュマン・ドゥ・ラ・コカル
ド 11
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/483
G01N 33/48
G01N 37/00
C12M 1/34
Claims (30)
- 【請求項１】 少なくとも２つの電極（６、９）と、液
体の収容に適した分離した区画とを有する測定装置にお
いて、それぞれ少なくとも１つの区画内に達するかまた
は１つの区画に接するかする任意の形状の対向した２つ
のレドックス電極（６、９）の間に１つの電気絶縁キャ
リア（１）が存在し、該キャリアはそれぞれ少なくとも
２つの区画を互いに切離していると共に少なくとも１個
の開口（３）を有し、開口（３）は前記区画を連結する
と共に、前記キャリア上に電位差が存在する場合に電極
（６、９）を介し、開口に接近するにしたがって徐々に
強くなり、開口近傍において小胞、細胞、細胞片または
生体オルガネラを電気泳動によって開口上に移動させる
ことのできる不均質な電界が該開口周囲に形成されるよ
うな直径を有し、これによって正確なポジショニングと
同時に小胞、細胞およびその他の生体オルガネラないし
同様な起源の生体膜と前記開口との電気的に密な結合と
が可能にされることを特徴とする測定装置。 - 【請求項２】 前記キャリアは片側または両側に、液体
添加および／または液体貯蔵および／または液体交換お
よび／またはキャリアと電極との間に細胞、小胞、その
他の生体オルガネラまたはそれらの一部を添加すること
を可能にする手段を有することを特徴とする請求項１に
記載の測定装置。 - 【請求項３】 前記区画は互いに独立して物理的側方境
界を有しおよび／または物理的側方境界を有さず、基準
体積又は試料は毛管力によってそこに固定されているこ
とを特徴とする請求項１または２に記載の測定装置。 - 【請求項４】 キャリア（１）は生体膜を引き付ける帯
電した表面（５）を有するかまたは表面と細胞、小胞、
膜片または生体オルガネラとの分子固有の結合もしくは
多価イオンを介した結合を可能にする表面（５）を有し
ており、この結合は非常に密なため、発生する漏れ電流
の分散は、膜電圧Ｖ Ｍ ＝−６０ｍＶにて０．１〜５０ｐ
Ａである測定される信号を５〜１０倍下回っていること
を特徴する請求項１ないし３のいずれか１項に記載の装
置。 - 【請求項５】 前記キャリアは酸化層またはオキシ窒化
層でコーティングされたシリコンキャリアであることを
特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の測
定装置。 - 【請求項６】 帯電した表面（５）は修飾、特にポリカ
チオンおよび／またはシランたとえばアミノシランによ
る修飾によってつくりだされたことを特徴とする請求項
１ないし５のいずれか１項に記載の測定装置。 - 【請求項７】 前記キャリアは帯電した表面（５）を生
ずるコーティング層（２）を有することを特徴とする請
求項１ないし６のいずれか１項に記載の測定装置。 - 【請求項８】 キャリア（１）はその表面の修飾前にま
たはその直接の利用前に酸素プラズマ中で浄化され、部
分的または全面的に親水化されたことを特徴とする請求
項１ないし７のいずれか１項に記載の測定装置。 - 【請求項９】 それぞれ１つの電極とキャリア（１）に
設けられた少なくとも１個の開口（３）とはスペーサ
（７，１０）に設けられた通路またはチャンバ（８）を
経て、開いたもしくは閉じた区画を形成しつつ互いに連
結されていることを特徴とする請求項１ないし８のいず
れか１項に記載の測定装置。 - 【請求項１０】 小胞または細胞は対流または沈積によ
って開口近傍に達することができることを特徴とする請
求項１ないし９のいずれか１項に記載の測定装置。 - 【請求項１１】 ３つ以上の電極（６、９）と２個以上
の開口（３）とを設け、少なくとも１つの電極たとえば
基準電極が２個以上の開口（３）を介した測定に使用さ
れることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれか１
項に記載の測定装置。 - 【請求項１２】 キャリア（１）は２個以上の開口
（３）と開口（３）の倍の数の電極（６、９）とを有
し、それぞれ１個の開口がそれぞれ２つの電極の間に配
置されることを特徴とする請求項１ないし１１のいずれ
か１項に記載の測定装置。 - 【請求項１３】 前記区画はチューブを経てポンプシス
テムまたは、静水圧ベースまたはピエゾドロップ方式な
いしインキジェット方式またはコンタクトトランスファ
ー方式または電気浸透方式または温度制御方式で作動す
る器具と連結され、液体ないし試料を任意の区画に添加
しもしくは同所で交換できるように構成したことを特徴
とする請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の測定
装置。 - 【請求項１４】 試料の分離、特に毛管電気泳動（Ｃ
Ｅ）およびＨＰＬＣを行なう装置と連結され、分離され
た物質の分析に利用されることを特徴とする請求項１な
いし１３のいずれか１項に記載の測定装置。 - 【請求項１５】 区画内液位を連続的もしくは定期的に
チェックするための手段ならびに前以って適宜調整され
た注入パラメータを再調整するための手段を装備してい
ることを特徴とする請求項１ないし１４のいずれか１項
に記載の測定装置。 - 【請求項１６】 キャリア（１）の表面（５）は親水性
領域と疎水性領域とが生ずるように構造化され、親水性
領域は好ましくは前記開口周囲に形成されるように構成
したことを特徴とする請求項１ないし１５のいずれか１
項に記載の測定装置。 - 【請求項１７】 請求項１ないし１６のいずれか１項に
記載の測定装置によって細胞または小胞またはその他の
生体オルガネラの形の膜または膜片をポジショニングす
る方法において、細胞ないし小胞またはその他の生体オ
ルガネラは隔壁ないし前記キャリアと前記電極との間に
あって前以って緩衝剤で満たされたもしくは満たされて
いない空隙に与えられ、２つの前記電極の間に不均質な
電界の形成を結果する電位差特に−２００ｍＶ〜＋２０
０ｍＶの範囲内の電位差が存在し、前記電極は区画液中
にまで達する球状もしくは任意の形状の空間域内で前記
開口の周囲に電界強度＞１００Ｖ／ｍが生ずるような間
隔で互いに配置されると共に前記区画ならびに前記開口
も同様にして緩衝剤ないし液で満たされ、前記電界の影
響下で前記開口に向かう小胞または細胞の指向的運動が
生ずることを特徴とする方法。 - 【請求項１８】 小胞、細胞またはその他の生体オルガ
ネラないし膜または同様な起源の膜片と前記開口との電
気的に密な結合をつくりだす方法において、細胞ないし
小胞またはその他の生体オルガネラは請求項１７に記載
の方法によってポジショニングされ、前記キャリア表面
と膜表面との間の強力な静電引力によって電気的に密な
結合が実現されることを特徴とする方法。 - 【請求項１９】 天然のまたは人工の脂質膜、小胞、細
胞または生体オルガネラの電気分析法において、前記の
膜は請求項１７または１８に記載の方法に基づいてポジ
ショニングされて開口（３）上でキャリア（１）の表面
（５）と電気的に密に結合し、すぐれた信号雑音比によ
る膜抵抗の記録を可能にすることを特徴とする方法。 - 【請求項２０】 天然のまたは人工の脂質膜、小胞、細
胞または生体オルガネラに関する相互作用の電気的測定
法において、前記の膜は請求項１７または１８に記載の
方法に基づいて作製され、測定液または基準液または双
方の液が別の液と交換され、あるいは分析される物質が
測定側および／または基準側の液に加えられることを特
徴とする方法。 - 【請求項２１】 孔形成剤が一方のまたは双方の区画に
添加されて前記の膜の導電率ないし特定のイオンに対す
る膜の透過性が高められることを特徴とする請求項１９
または２０に記載の方法。 - 【請求項２２】 少なくとも１つの区画に任意のサイズ
のプロテリオリポソームが与えられて開口（３）上の膜
と融合させられ、これによって膜中に含まれている任意
の膜蛋白質の電気的測定または光学的測定を可能とする
ことを特徴とする請求項１９ないし２１のいずれか１項
に記載の方法。 - 【請求項２３】 膜蛋白質は開口（３）を覆う膜が構成
された後にその中に組み込まれることを特徴とする請求
項１９ないし２２のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２４】 開口（３）を覆う膜を光学的、特に蛍
光測定に利用し得るようにして膜の当該測定を実施する
ことを特徴とする請求項１９ないし２３のいずれか１項
に記載の方法。 - 【請求項２５】 １つのキャリアに複数の開口（３）を
備えた測定装置または測定システムが利用され、測定は
少なくとも２個の開口（３）を介して逐次および／また
は平行して行われることを特徴とする請求項１９ないし
２４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２６】 キャリア（１）の一方の側のすべての
電極は一つの共通の電位を有するかもしくはそれらが単
一の電極にまとめられることを特徴とする請求項２５に
記載の方法。 - 【請求項２７】 少なくとも１個の開口を種々の膜パラ
メータの測定に使用することが可能であって、チューブ
を介して任意の区画と連結されているポンプシステムに
よるかまたは静水圧をベースとした方式またはピエゾド
ロップ方式ないしインキジェット方式またはコンタクト
トランスファー方式または電気浸透方式または温度制御
方式によって液体ないし試料が任意の区画に添加されま
たは交換されることを特徴とする請求項１９ないし２６
のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２８】 試料分離プロセス、特に毛管電気泳動
（ＣＥ）およびＨＰＬＣと直接に連結されて実施され、
分離された物質の分析に利用されることを特徴とする請
求項１９ないし２７のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２９】 区画内液位が連続的または定期的にチ
ェックされ、前以って適宜調整された注入パラメータが
再調整されることを特徴とする請求項１９ないし２８の
いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項３０】 キャリア（１）の表面（５）は親水性
領域と疎水性領域とが生ずるように構造化され、親水性
領域は好ましくは前記開口周囲に形成されることを特徴
とする請求項１９ないし２９のいずれか１項に記載の方
法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH290397 | 1997-12-17 | ||
| CH2903/97 | 1997-12-17 | ||
| PCT/IB1998/001150 WO1999031503A1 (de) | 1997-12-17 | 1998-07-28 | Positionierung und elektrophysiologische charakterisierung einzelner zellen und rekonstituierter membransysteme auf mikrostrukturierten trägern |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family
ID=4244210
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000539350A Expired - Fee Related JP3486171B2 (ja) | 1997-12-17 | 1998-07-28 | ミクロ構造キャリア上における細胞単体および再構成膜系のポジショニングおよび電気生理学的特性決定 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP1040349B2 (ja) |
| JP (1) | JP3486171B2 (ja) |
| AT (1) | ATE205300T1 (ja) |
| AU (1) | AU746580B2 (ja) |
| CA (1) | CA2316966C (ja) |
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| DK (1) | DK1040349T4 (ja) |
| ES (1) | ES2163284T3 (ja) |
| HK (1) | HK1028450A1 (ja) |
| WO (1) | WO1999031503A1 (ja) |
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